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Práctica 1

Principios básicos de laboratorio, uso de pipetas y cálculos de utilidad en Bioquímica

Objetivo: que el estudiante se familiarice con la metodología, equipo y forma de

trabajo dentro del curso de laboratorio de Bioquímica.

Fundamento 1. Algunos conceptos básicos utilizados en la bioquímica experimental

En el año de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de Pesas y Medidas con sede en París, Francia acordaron crear el Sistema Internacional de Pesas y Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de información cuantificable y universalizar su uso. El SI es básicamente una versión ampliada del sistema métrico decimal y consta de siete unidades básicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes físicas. En el Cuadro 1 se describen estas unidades, además de los símbolos que se deben utilizar cuando se hace mención a éstas.

Cuadro 1. Unidades básicas del SI

Magnitud física Nombre de la unidad Símbolo

Longitud metro m Masa kilogramo kg Tiempo segundo s Corriente eléctrica amperio A Temperatura kelvin K Intensidad luminosa candela cd Cantidad de sustancia mol mol

Dos o más unidades básicas pueden ser combinadas mediante multiplicación o

división para generar unidades SI derivadas. Algunas de estas unidades poseen nombres particulares en honor a científicos que contribuyeron al conocimiento de un tema en particular. En el Cuadro 2 se presentan algunos ejemplos de unidades SI derivadas.

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Cuadro 2. Unidades SI derivadas de uso común en medicina

Magnitud física Nombre Símbolo Unidades

Área Metro cuadrado m2

Volumen Metro cúbico m3

Velocidad Metro por segundo m/s o m.s-1

Concentración de sustancia Mol por metro cúbico mol/ m3 o mol.m3

Temperatura Celsius Grado Celsius oC K-273.16 Potencia Watt W J/s o J.s-1

Potencial eléctrico Volt V W/A o W.A-1 Resistencia Ohmio Ω V/A o V.A-1

Muchas veces las unidades básicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy

pequeñas para representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos que permiten formar múltiplos o submúltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se muestran en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Prefijos utilizados en el SI.

Prefijo Factor Símbolo Prefijo Factor Símbolo

Ato 10-18 a Deca 101 da

Femto 10-15 f Hecto 102 h

Pico 10-12 p Kilo 103 k

Nano 10-9 n Mega 106 M

Micro 10-6 μ Giga 109 G

Mili 10-3 m Tera 1012 T

Centi 10-2 c Peta 1015 P

Deci 10-1 d Exa 1018 E

Los prefijos se anteponen directamente al nombre o símbolo de la unidad en cuestión, por ejemplo nanogramo o ng y no nano-gramo o n-g.

Si bien es cierto, el uso del SI es la regla hoy en día, existen excepciones que la Oficina Internacional de Pesas y Medidas debió adoptar debido a su uso generalizado. Algunas de estas excepciones de uso en ciencias médicas se muestran en el Cuadro 4.

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Cuadro 4. Algunas unidades de uso común que no pertenecen al SI.

Magnitud física Unidad Símbolo Valor en SI

Tiempo día d 86400 s

hora h 3600 s

minuto min 60 s

Volumen litro l o L 10-3 m3

Masa tonelada t 1000 kg

dalton Da 1.66 x 10–27 kg

Área hectárea ha 10000 m2

Longitud ångström Å 0.1 nm

Energía caloría cal 1.1868 J

Debido a su uso rutinario en la bioquímica experimental, vale la pena mencionar

algunas normas sobre la expresión de concentraciones de sustancias. La concentración de sustancias cuya masa molecular se conoce, se expresa como cantidad de sustancia (moles o submúltiplos como mmol, nmol) por litro (l). Ejemplo: concentración de glucosa en suero humano: 3.6 mmol/l a 6.1 mmol/l. Los términos concentración molar, molaridad o M, normalidad o N son obsoletos y en su lugar debe usarse el término “cantidad de sustancia concentración de X” o más comúnmente, “concentración de X”. El término molal y su símbolo m no deben ser más utilizados y en su lugar se utiliza el término “cantidad molalidad del soluto X” con las unidades SI mol/kg.

La Conferencia General de Pesas y Medidas no recomienda el uso de la escala de pH y en su lugar, la concentración de iones hidronio en una solución debe ser reportada como nmol/l. Sin embargo, la eliminación de la escala de pH no ha sido aceptada por la mayoría de la comunidad científica. En el año 2002, la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada elaboró una propuesta para que dicha medida cumpliera con los requisitos solicitados por la Conferencia. A la fecha, esta propuesta se encuentra en discusión.

A continuación se enumeran algunas reglas para la consignación de símbolos y cifras del SI: -Los símbolos se escriben siempre en singular. Ejemplo: 2 mm y no 2 mms. -El nombre completo de una unidad se pluraliza si es necesario. Ejemplo: 35 kilogramos. -Los prefijos no deben usarse solos, sino siempre acompañados de una unidad. Ejemplo: 14 gigawatts y no 14 gigas. -El punto no debe usarse después de un símbolo, a menos que éste se encuentre al final de una frase. Ejemplo: 55 kg de masa y no 55 kg. de masa. -Siempre se deja un espacio entre el número que denota la cantidad y el símbolo de la unidad. Ejemplo: 15 s y no 15s.

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-Números muy grandes pueden ser separados en grupos de tres para facilitar su lectura, sin puntos o comas. Los puntos o comas se utilizan para las notaciones decimales. Ejemplo: 1 000 257, 35 y no 1.000.257,35. -Siempre se coloca un cero a la izquierda de la coma o el punto decimal para los números menores de uno. Ejemplo: 0.38 o 0,38 y no .38 o ,38. -Los símbolos de las unidades o sus nombres no deben ser modificados mediante adición de subíndices. Ejemplo: Vmax= 1000 V y no V= 1000 Vmax.

-La redacción de la información no debe ser mezclada con los símbolos de las unidades o sus nombres. Ejemplo: “el contenido de agua es de 20 ml/kg” y no “20 ml H2O/kg” o “20 ml de agua/kg”. -Debe quedar explícito cuál símbolo pertenece a cuál valor numérico y qué operación matemática debe ser aplicada a cada valor numérico. Ejemplos: 45 cm X 46 cm y no 45 X 46 cm 20 oC a 30 oC o (20 a 30) oC y no 20 oC-30 oC o 20 a 30 oC -Los símbolos de las unidades o sus nombres no pueden ser mezclados y las operaciones matemáticas no son aplicadas a los nombres de las unidades sino a los valores numéricos. Ejemplos: pueden ser usadas formas como: kg/l, kg • l o kilogramo por litro y no formas como: kilogramo/l, kg/litro, kilogramo/litro o kg por l. -Los valores de cantidades son expresados en forma numérica y con los símbolos de las unidades. Ejemplos: m= 5 kg y no m= cinco kilogramos o m= cinco kg, o “la corriente fue de 15 A” y no “la corriente fue de 15 amperios”.

2. Medición de volúmenes: pipetas y micropipetas.

Las mediciones y transferencias de volúmenes exactos y precisos son requisitos básicos de la bioquímica experimental. Estos procedimientos son hechos utilizando instrumentos como las pipetas manuales, las micropipetas, las buretas, las probetas o los balones de aforar. Cada uno de ellos cumple una función en particular dentro del laboratorio pero en algunos casos estas funciones pueden sobreponerse. El grado de precisión de los mismos puede variar considerablemente así que la escogencia del instrumento a utilizar para realizar una medición en particular es un paso crítico para obtener el resultado esperado. Debido al uso rutinario dentro de las prácticas a realizar en este curso, se introducirá el uso apropiado de las pipetas y micropipetas. Sin embargo, es recomendable que el estudiante realice una revisión de sus cursos de química anteriores para recordar el manejo y uso de otro tipo de instrumentos volumétricos.

2.1. Uso correcto de las pipetas.

Existen básicamente dos tipos de pipetas manuales: aquellas para contener y aquellas para verter. Aquellas para contener deben ser enjuagadas con el solvente después de haber dispensado la solución en cuestión. Estas pipetas contienen un volumen exacto de líquido, el cual debe ser transferido completamente para que la medida sea precisa. Algunas pipetas de contener de uso común en el laboratorio tienen nombres particulares como Micro-Folin, Sahli para medición de hemoglobina, Kirk Micro, White-Black Lambda entre otros.

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Figura 1. Tipos de pipetas de verter: de soplar (A) y no de soplar (B). Note las diferentes escalas y dónde terminan las graduaciones de la escala en cada tipo de pipeta.

Estas pipetas no pueden ser utilizadas para la preparación de soluciones y por lo tanto su uso en este curso es limitado. Nuestra atención se enfocará en las pipetas para verter que son de utilidad para la preparación de soluciones y mediciones durante el curso y de las cuales existen dos tipos. Aquellas pipetas para verter y que deben soplarse están calibradas hasta la punta por lo que deben llenarse con el líquido a medir, dispensarse, y el líquido remanente en la punta debe soplarse. Son también conocidas como pipetas Ostwald-Folin o pipetas serológicas (Figura 1). Estas pipetas pueden ser distinguidas fácilmente ya que sus graduaciones de escala se extienden hasta la punta de la pipeta. Además, poseen uno o dos anillos esmerilados cerca de la boquilla. El otro tipo de pipeta para verter es aquella que no se sopla ya que está calibrada entre dos marcas que no incluyen la punta. Por lo tanto, estas pipetas nunca deben soplarse sino que el

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volumen a dispensar debe ser regulado manualmente de forma tal que el líquido a dispensar se encuentre entre una marca y otra. Algunos nombres comunes que reciben este tipo de pipetas son: pipeta volumétrica, tipo Mohr o bacteriológica (Figura 1). 2.2. Técnica de pipeteo. El primer paso de una buena técnica de pipeteo es seleccionar la pipeta más apta para el volumen que se desea medir. Es precisamente este volumen el que determina la pipeta a utilizar: el volumen a pipetear debe ser lo más cercano posible a la capacidad máxima de la pipeta. Además, debe considerarse que el volumen mínimo que una pipeta puede dispensar con precisión es aproximadamente el 10 % de su capacidad. A continuación se describen algunos ejemplos. Usted tiene tres pipetas cuyas capacidades máximas son de 25 ml, 10 ml y 5 ml. ¿Cuál pipeta usaría para pipetear las siguientes cantidades: a) 10 ml, b) 15 ml y c) 5.5 ml? Si se tiene en cuenta el criterio mencionado anteriormente entonces para dispensar 10 ml se debe utilizar la pipeta de 10 ml, para dispensar 15 ml se debe utilizar la pipeta de 25 ml y para dispensar 5.5 ml se debe usar la pipeta de 10 ml. Usted tiene tres pipetas cuyas capacidades máximas son de 0.1 ml, 1 ml y 2 ml. ¿Cuál pipeta usaría para pipetear las siguientes cantidades: a) 100 μl, b) 200 μl y c) 1.1 ml? En este caso, es necesario tener claro que 100 μl equivalen a 0.1 ml y 200 μl equivalen a 0.2 ml (ver Cuadro 3). Por lo tanto, para dispensar 100 μl se utiliza la pipeta de 0.1 ml, para dispensar 200 μl se utiliza la pipeta de 1ml y para dispensar los 1.1 ml se utiliza la pipeta de 2 ml. Una vez seleccionada la pipeta, es necesario cerciorarse qué tipo de pipeta es, si es de soplar o no. Durante las prácticas de laboratorio se utilizarán pipetas con capacidades máximas que oscilan entre los 0.1 ml a los 25 ml que pueden ser de soplar o no. Es imperativo que se familiarice con estos tipos de pipetas y sus escalas.

El siguiente paso es ajustar en la boquilla de la pipeta el dispositivo que se utilizará para crear vacío y succión. En nuestro caso utilizaremos la pera de hule, cuyo funcionamiento se describe en la leyenda de la Figura 2.

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Figura 2. Dispositivo tipo pera para crear vacío y succión en la pipeta. Esta pera de hule cuenta con tres puntos rotulados con flechas o A, B y C o 1, 2 y 3. Al ejercer presión manual en uno de esos puntos, un balín interno permitirá la entrada o salida de aire para que la pipeta pueda succionar (A) o dispensar (B) el líquido que contiene. El punto C o 3 es útil para dispensar la última gota en aquellas pipetas que son de soplar (C). El uso correcto de este dispositivo requiere de práctica para ajustar la fuerza manual que debe usarse para ejercer presión. Si en algún momento su pera se humedece con el líquido a dispensar, dejará de funcionar pues no se podrá ejercer vacío. Para proceder, es necesario secar antes bien la pera. La pipeta se debe llenar hasta un poco más arriba del inicio de la graduación de la escala y luego poco a poco se ajusta, frente a los ojos y en posición vertical, al punto exacto de graduación de la escala (generalmente 0). Recuerde que para líquidos transparentes, el fondo del menisco del líquido se ajusta a la graduación, mientras que para líquidos no transparentes, los extremos del menisco se ajustan a la graduación de la escala. Una vez ajustado el volumen, la pipeta conteniendo el líquido a dispensar es transferida al recipiente donde se depositará el líquido. En este momento se presiona la pera suavemente en el punto que permitirá la salida del líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical y con la punta de la misma descansando en el recipiente. Una vez dispensado el volumen, se retira la pera y la pipeta se descarta cuidadosamente, con la punta hacia abajo en el recipiente para descartar pipetas. Si por algún motivo debe volver a utilizar una pipeta en la misma solución en la que fue utilizada, es recomendable dejar la pipeta en posición horizontal sobre la mesa de trabajo, con la punta de la misma unos centímetros fuera del borde de la mesa.

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2.3. Uso correcto de las micropipetas. Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños que van desde 1 μl hasta 1 ml o más. Al igual que las pipetas éstas pueden ser para contener o para verter volúmenes. Durante el curso utilizaremos micropipetas para verter, ya sea un volumen fijo o un volumen variable. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. La micropipeta más comúnmente usada en los laboratorios de análisis fue introducida por la compañía Eppendorf y este nombre se adoptó de forma genérica para estos dispositivos, aunque hoy en día existen una gran cantidad de compañías y modelos similares que funcionan bajo un mismo principio de pistones para operar. Por lo tanto, es aconsejable consultar las instrucciones del fabricante sobre el empleo correcto de cada modelo. Sin embargo, todas ellas utilizan puntas o “tips” descartables plásticos que se ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plástico es donde se deposita el líquido a medir.

Figura 3. Esquema general de las micropipetas marca BioRad a utilizar durante el curso. A1: botón pulsador, A2: tornillo del botón pulsador, B: rueda dentada de graduación del volumen, C: cono de la pipeta, D: expulsor de punta y E: punta o “tip” descartable. Tomado del manual de manejo de micropipetas Biorad, BR/06/05

Para absorber el líquido, el pistón es presionado hasta una primera posición, el tip es puesto en contacto con el líquido y luego, lentamente, se permite que el pistón vuelva a su posición original. Este paso permite el llenado del tip con el

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volumen correspondiente. El tip de plástico generalmente no se seca por fuera ya que se considera que su superficie no absorbe líquido. A continuación se describen las instrucciones específicas para los modelos de micropipetas que se utilizarán durante el curso (Figura 3).

1. Selección de la micropipeta a utilizar según el volumen a dispensar. Para este paso, se aplican las mismas reglas que se utilizan para el manejo de las pipetas. El Cuadro 5 muestra los rangos de volúmenes que se pueden pipetear con cada modelo de micropipeta de la marca Biorad, además de los usos más comunes. La mayoría de la micropipetas indican en el botón pulsador el rango o volumen máximo que pueden pipetear. Para prevenir un daño en el mecanismo interno de la micropipeta recuerde nunca sobrepasar los volúmenes máximos permitidos para cada micropipeta.

Cuadro 5. Modelo, rango de volúmenes y aplicaciones más comunes de las micropipetas marca Biorad a utilizar durante el curso

Modelo Rango de

volumen (μl) Uso más común

BR10 0.5-10 Medida y transferencia de microvolúmenes. Biología molecular y ensayos enzimáticos

BR20 2-20 Medida y transferencia de soluciones acuosas en general, ácidos y bases

BR200 20-200 Igual a BR20

BR1000 100-1000 Igual a BR20

2. Debido a que la micropipeta tiene un rango de volumen ajustable, es

necesario seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de volumen, compuesto de tres dígitos que se deben leer de arriba hacia abajo. En la parte más baja del indicador hay una escala que permite el ajuste del volumen al último dígito o decimal permitido según el caso. En las micropipetas de 2 hasta 200 μl, los dígitos negros indican microlitros y los dígitos rojos representan décimas de microlitro. En el Cuadro 6 se muestran ejemplos de cómo debe lucir el indicador de volumen para medir diferentes volúmenes.

3. Ajustar el volumen de la pipeta con el tornillo del botón pulsador (Figura 3, A2) o la rueda de graduación del volumen (Figura 3, B), hasta llegar a 1/3 por encima del valor deseado. Luego, lentamente, girando el tornillo o la rueda, disminuir el ajuste hasta el valor deseado prestando atención para no excederlo. Si se excede, es aconsejable repetir el procedimiento de ajuste. Siempre se debe ajustar el volumen deseado desde un volumen más alto disminuyendo las indicaciones del indicador.

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Cuadro 6. Disposición de los dígitos en el indicador según la micropipeta a usar.

Micropipeta con volumen máximo a dispensar*: 10 μl 20 μl 100 μl 200 μl 1000 μl 0 1 0 1 0 7 2 7 2 7 5 (rojo) 5 (rojo) 5 5 5 Volumen a dispensar: 7.5 μl 12.5 μl 75 μl 125 μl 750 μl

* todos los dígitos deben aparecer en negro, excepto cuando se indique lo contrario en paréntesis

4. Seleccionar la punta o tip plástico apropiado para la micropipeta: la punta debe ajustarse al cono de la micropipeta (Figura 3). Al insertar la punta en el cuerpo de la pipeta hay que aplicar una fuerte presión con movimiento giratorio para asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta con líquidos sin la punta colocada. Es posible que la punta plástica se encuentre en una caja también plástica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no está en caja, deberá ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estará en contacto con la solución a extraer.

5. Aspiración: apretar el botón pulsador hasta el primer tope (Figura 4A) 6. Con la pipeta en posición vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en

la muestra. 7. Lentamente se aspira el líquido al relajar la presión del dedo sobre el botón

pulsador (Figura 4B). Si este paso no se realiza con atención, puede entrar aire en la punta y la cantidad de muestra aspirada no es la adecuada.

8. Esperar un segundo y retirar la punta del líquido. 9. Dosificación: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del

recipiente donde se depositará el líquido, con un ángulo entre 10o y 40 o. 10. Apretar el botón pulsador suavemente hasta el primer tope (Figura 4C) y

esperar un segundo. 11. Apretar el botón pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del

líquido (Figura 4D). 12. Manteniendo apretado el botón pulsador en el segundo tope, retirar la

pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botón pulsador (Figura 4E).

13. Expulsar la punta apretando el botón del expulsor (Figura 4F y Figura 3, D).

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Figura 4. Posiciones de la micropipeta a la hora de medir un volumen específico. A: Botón pulsador en el primer tope, B: la punta de la micropipeta es sumergida entre 1 mm y 3 mm en la muestra para luego liberar el botón pulsador suavemente hasta su posición original, C: Forma correcta de dispensar el líquido medido en el recipiente correspondiente, D: Posición de la micropipeta al apretar el botón pulsador hasta el segundo tope, E: Vuelta a la posición inicial, F: Expulsión de la punta, la cual debe ser descartada en un recipiente apropiado. Tomado del manual de manejo de micropipetas Biorad, BR/06/05

Para no dañar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta: -el líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta -nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo -nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido -nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta

Con respecto a la micropipeta multicanal, éstas tienen la ventaja de que se

puede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la vez. Estas micropipetas fueron diseñadas principalmente para los ensayos en formato micro, donde se utiliza también un plato de plástico de 96 pozos para trabajar esa cantidad de ensayos de forma simultánea. Las micropipetas multicanal son dispositivos más complejos que las micropipetas unicanal ya que básicamente pueden repetir varias veces la función que realiza esta última en un solo momento. Para ello, poseen un solo mango, botón pulsador, etc pero un cono que permite la inserción de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo. En el curso se utilizarán micropipetas multicanales (12 canales) con un rango de volumen de 50 μl a 300 μl similares a las de la Figura 5. Para su uso, se deben tener los mismos cuidados que con las micropipetas unicanal, además de cerciorarse que todas las puntas estén bien colocadas, extrayendo la misma cantidad de solución y que no se observen burbujas de aire en ninguna.

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Figura 5. Micropipeta multicanal (8 canales), modelo Biohit de rango de volumen de 50 μl a 300 μl. Este tipo de micropipeta es muy útil para microensayos semi automatizados o automatizados en platos descartables de 96 pozos. 3. Cálculos básicos de utilidad en bioquímica experimental. 3.1. Preparación de soluciones Una solución es una mezcla homogénea de al menos dos sustancias, una que se conoce como soluto y otra que se conoce como solvente, disolvente o diluyente y que generalmente está en mayor proporción que la primera. El solvente universal es el agua y por lo tanto no es de extrañar que casi todas las soluciones utilizadas en bioquímica utilicen agua como disolvente.

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Como se mencionó anteriormente, la concentración de una solución debe ser expresada en unidades del SI, es decir en mol/l cuando el peso molecular del soluto se conoce, o en términos de peso (masa) por litro si el peso molecular del soluto se desconoce. Sin embargo, existen todavía algunas expresiones que no pertenecen al SI pero que su uso se ha mantenido, por razones históricas o prácticas. Aunque el uso de dichas expresiones en este manual no es estimulado, sí es necesario introducirlos ya que muchos de los protocolos a utilizar todavía son descritos con esta nomenclatura. Existen básicamente dos tipos de expresiones que prevalecen: aquellas que expresan la concentración de forma porcentual y aquellas que la expresan como molaridad. Las concentraciones expresadas de forma porcentual se refieren a partes de soluto por 100 partes de la solución, de ahí el término porcentaje o por cien. Estas pueden enunciarse como: -Peso por unidad de peso (o peso en peso o p/p): los dos, el soluto y el solvente son pesados en gramos y la proporción de soluto se expresa por 100 g de solución. Ejemplo: una solución de NaCl al 24% (p/p) contiene 24 g de NaCl por cada 100 g de solución, o 240 g de NaCl y 760 g de disolvente. -Volumen por unidad de volumen (o v/v): número de ml de soluto en 100 ml de solución. Ejemplo: una solución de HCl al 1% (v/v) contiene 1 ml de HCl puro por 100 ml de solución. -Peso por unidad de volumen (o p/v): número de g de soluto en 100 ml de solución. Si el porcentaje no especifica la forma de expresión, es decir, p/p, v/v o p/v, se asume que el porcentaje está expresado en peso por unidad de volumen. Ejemplo: una solución de MgCl2 al 7% contiene 7 g de MgCl2 por cada 100 ml de solución. Cabe destacar que al ser estas relaciones porcentuales, el volumen o peso final puede ser cualquier cantidad pero lo importante es mantener la relación entre las partes. A continuación algunos ejemplos: Calcule cuántos gramos de NaOH se pesaron para obtener 300 ml de una solución al 10 % Una solución al 10 % de NaOH contiene 10 g de NaOH por cada 100 ml de solución. Sin embargo el enunciado menciona que se tenía tres veces más solución (300 ml). Por lo tanto, conservando la proporción porcentual, se puede decir que se pesaron 30 g de NaOH para obtener 300 ml de solución al 10% o: 100 ml de solución tienen 10 g de NaOH 300 ml de solución tienen X g de NaOH X= 30 g de NaOH. Con respecto al término molaridad, éste expresa la concentración de una sustancia en particular en términos de número de moles por litro de solución y su símbolo es “M”. Este término también debe ser descontinuado y reemplazado por la expresión mol/l o mol/m3. Ejemplo: calcule cuántos gramos de NaOH se deben pesar para preparar 2.5 l de una solución de NaOH 0.1 M. El primer dato que se requiere para poder obtener lo solicitado es el peso molecular del NaOH, es decir, 40 g/mol. Posteriormente, es necesario saber que la expresión 0.1 M quiere decir que la solución posee 0.1 mol/l. En este caso en

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particular, se requiere no 1 l sino 2.5 l de solución, por lo tanto hay que pesar 0.1 X 2.5= 0.25 mol. Esta cantidad corresponde a 0.25 mol X 40 g/mol= 10 g. Entonces para preparar 2.5 l de una solución de NaOH 0.1 M se deben pesar 10 g de NaOH y llevar a 2.5 l con agua. 3.1.1 Cálculo y expresión de diluciones. Una dilución consiste en preparar una solución menos concentrada a partir de una más concentrada. Esta práctica es muy común en los laboratorios y de ella depende en gran parte el resultado final analítico que se obtenga. Por lo tanto es imperativo el manejo de este tipo de cálculos para cualquier persona que trabaje dentro de un laboratorio. Las diluciones generalmente se expresan como una razón matemática, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso de una dilución 1:5, ésta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volúmenes. Nótese que el volumen total o final estará compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4 volúmenes del disolvente. Para calcular la concentración final de una solución diluida, se multiplica la concentración de la solución original por la dilución expresada como fracción. Ejemplo: una solución de urea cuya concentración es de 5 mg/ml es diluída 1/10. La concentración final de la solución diluida es 5 X 1/10= 0.5 mg/ml.

La ecuación más comúnmente utilizada para preparar soluciones es: V1 X C1 = V2 X C2

donde V1 es el volumen de la solución concentrada que se debe añadir para preparar la solución diluida, C1 es la concentración de la solución concentrada V2 es el volumen de la solución diluida C2 es la concentración de la solución diluida. Al utilizar esta ecuación debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V1 y V2 así como las de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente. Ejemplo: prepare 500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l a partir de una solución de glucosa a 45 mol/l. Aplicando la ecuación antes presentada tenemos: x X 45 mol/l= 500 ml X 5 mol/l x= 55.56 ml de glucosa 45 mol/l

Entonces, para preparar 500 ml de una solución de glucosa 5 mol/l, se requieren 55.56 ml de glucosa 45 mol/l y llevar a 500 ml con agua. Nótese que la solución original fue diluida 1/9 o en otras palabras, se utilizó un factor de dilución de 9:

45 X 1/x= 5 x= 9

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El factor de dilución representa el número de veces que fue diluida la solución

concentrada. Si se hace no una sino una serie de diluciones, la concentración de la solución final se obtiene al multiplicar la concentración original por el producto de los factores de dilución. Ejemplo: si la solución de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentración final de la solución será 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilución de 900.

Las diluciones seriadas son también muy útiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilución. Ejemplo: para determinar la concentración de proteínas en un suero animal, la muestra es diluida 1/5 mediante la adición de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solución salina en el tubo número 1. Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solución salina como diluyente. La dilución seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar y transferir 0.5 ml del tubo 2 al tubo 3 y así sucesivamente hasta el tubo 8. La concentración de suero en los tubos 2 al 8 decrece por un factor de 2, siendo cada dilución: tubo 1:1/5, tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo 5: 1/80, tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y tubo 8: 1/640. Materiales y reactivos -Pipetas serológicas de varias graduaciones: 25 ml, 10 ml, 5 ml, 1 ml y 0.1 ml -Una pera de hule con número: esta pera será la que se le asignará y utilizará durante todo el curso. Asegúrese de que funcione correctamente. La pera debe ser devuelta al finalizar cada práctica en perfecto estado. -Un erlenmeyer o beaker lleno de agua destilada -Un erlenmeyer o beaker vacío -Una micropipeta de una de las siguientes graduaciones: de 100 a 1000 μl, de 20 μl a 200 μl o de 2 μl a 20 μl unicanal o multicanal de 50 a 300 μl. Usted recibirá en custodia una micropipeta para su uso durante todo el curso. Esta micropipeta deberá ser utilizada por sus compañeros también. Es su responsabilidad entregarla al final del curso en perfecto estado. -Puntas de plástico descartable que se ajusten a las diferentes micropipetas -Envases para descartar las puntas usadas (habrá uno por lado de mesa) -Envases para descartar las pipetas usadas (habrá uno por mesa) -Equipo general de laboratorio para demostración: balanza, agitadores, centrífuga, espectrofotómetro, etc.

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Procedimiento

Conozca el equipo con el que va a trabajar durante el curso: reciba y anote el número de pera que se le asignará. Esta pera deberá ser entregada al asistente al final de cada sesión. Reconozca el tipo de pipetas que le fueron administradas.

Reciba la micropipeta que se le asignará para su custodia durante el curso. Anote el número de micropipeta asignada. Es importante que se familiarice con la misma, conozca qué tipo de puntas debe utilizar, qué rango de volumen puede medir la micropipeta. Ensaye los puntos de tope de la micropipeta y luego siga el procedimiento para pipetear varios volúmenes de agua con la micropipeta correspondiente. Por ejemplo: 7.5 μl, 10 μl, 200 μl, 450 μl, etc.

Conozca el resto del equipo con el que trabajará durante el curso y que se

encuentra dentro del laboratorio como la centrífuga, los agitadores tipo vortex, el termociclador, el espectrofotómetro, etc.

Realice los cálculos para diluir una solución de NaCl al 0.145 mol/l para obtener: a) 1.1 ml de una solución 0.12 mol/l de NaCl b) 5 ml de una solución 0.045 mol/l de NaCl c) 3 ml de una solución 0.033 mol/l de NaCl d) una dilución seriada de 4 tubos con factor de dilución de 5. Describa detalladamente sus cálculos en la sección de resultados, así como el

factor de dilución utilizado en cada caso y el procedimiento que utilizaría para realizar cada dilución. Indique cuál pipeta, de las que se le suministraron utilizaría para realizar cada medición

Resultados 1) Escriba o haga un esquema de cómo distinguir los diferentes tipos de pipetas y micropipetas que se le suministraron. Indique cuáles pipetas son de soplar y cuáles no, además de cómo distinguir la escala tanto en las pipetas como en las micropipetas.

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2) Haga la descripción de los cálculos solicitados en la sección de procedimiento aquí:

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Bibliografía -Amato M, S y Granados P, F. Manual de Laboratorio. Cátedra de Bioquímica. Universidad Nacional, 1994 -Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999 -Kaplan, L et al. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. 2nd edition. CW. Mosby Company, 1989 -Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioquímica. Bioquímica y Biología Molecular. Objetivos del curso y manual de prácticas de laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, México, 2000. -Schosinsky, K et al. Manual de Técnicas de Laboratorio en Química Clínica. X Edición, Universidad de Costa Rica, 1997 -Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 -Manual de uso de micropipetas Biorad, versión BR0605 -http://www.bipm.fr/en/si/ consultado el 10 de enero del 2007

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EJERCICIOS (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio independiente)

1. Calcule las siguientes concentraciones:

• 10 M NaOH, diluido 1:20 = _____ M • 2 M HCl, diluido 1:5 = _____ M • 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = _____ mg/L • 250 ml de 5% NaCl contienen ____ g de NaCl • Cuánto CuSO4 ⋅ 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al

5%? PM del CuSO4 ⋅ 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol • Qué porcentaje de CuSO4 ⋅ 5 H2O es agua?

2. Cuántos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2⋅ 3 H2O? PM del MgCl2⋅ 3 H2O: 149

g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol

3. Cuántos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar 20 ml de una solución 0.2M?

4. Qué porcentaje de Mg contiene el MgCl2⋅ 3 H2O?

5. Cuánto CuSO4⋅ 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solución que

contenga 80 mg de CuSO4?

6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol , cuántos gramos son necesarios para preparar:

• 1 L de 0.1 M CaCO3? • 50 mg/L de CaCO3?

7. Una solución estándar de hemoglina contiene 200 g/L. Cuántos ml deben usarse

para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones:

• 200 g/L • 150 g/L • 100 g/L • 50 g/L 8. La solución salina normal tiene una concentración de 0.85%. Cuál es su

molaridad? (PM NaCl : 58.5 g/mol)

9. Cuántos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solución cuya concentración es de 50 mg/ml?

10. Cuál es la dilución final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 µl de

suero, 500 µl de solución salina y 300 µl de reactivo?

11. Cuál es la concentración en mol/l de una solución que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol

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RESPUESTAS A LOS EJERCICIOS

1. Calcule las siguientes concentraciones:

• 10 M NaOH, diluido 1:20 = ___0.5__ M • 2 M HCl, diluido 1:5 = __0.4___ M • 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = __50___ mg/L • 250 ml de 5% NaCl contienen __12.5__ g de NaCl • Cuánto CuSO4 ⋅ 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al

5%? PM del CuSO4 ⋅ 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol R/ 7.82 g • Qué porcentaje de CuSO4 ⋅ 5 H2O es agua? R/ 36 %

2. Cuántos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2⋅ 3 H2O? PM del MgCl2⋅ 3 H2O: 149

g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol R/ 0.64 g

3. Cuántos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar 20 ml de una solución 0.2M? R/ 10 ml

4. Qué porcentaje de Mg contiene el MgCl2⋅ 3 H2O? R/ 16.1%

5. Cuánto CuSO4⋅ 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solución que

contenga 80 mg de CuSO4? R/ 125 mg

6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol , cuántos gramos son necesarios para preparar:

• 1 L de 0.1 M CaCO3? R/ 10 g/l • 50 mg/L de CaCO3? R/ 0.05 g

7. Una solución estándar de hemoglina contiene 200 g/L. Cuántos ml deben usarse

para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones:

• 200 g/L R/ 6 ml • 150 g/L R/ 4.5 ml + 1.5 ml de diluyente • 100 g/L R/ 3 ml + 3 ml de diluyente • 50 g/L R/ 1.5 ml + 4.5 ml de diluyente 8. La solución salina normal tiene una concentración de 0.85%. Cuál es su

molaridad? (Peso molecular NaCl es 58.5 g/mol) R/ 0.145 mol/l

9. Cuántos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solución cuya concentración es de 50 mg/ml? R/ 94.4 g

10. Cuál es la dilución final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 µl de

suero, 500 µl de solución salina y 300 µl de reactivo? R/ 1:5

11. Cuál es la concentración en mol/l de una solución que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol R/ 25 mol/l