muerte de larvas de DE SISTEMAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y

PARASITOLOGÍA

Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus

thuringiensis producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de

muerte de larvas de Spodoptera frugiperda

TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO

AUTOR: Br. FERNANDO NIEVES RODRÍGUEZ

ASESORA: Dra. EVA ELIZABETH VILLANUEVA TARAZONA

Trujillo - Perú

2015

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

DIRECCIO

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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO

Dr. Orlando Gonzáles Nieves

RECTOR

Dr. Rubén Vera Véliz

VICERECTOR ACADÉMICO

Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas

VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN

Dr. Steban Ilich Zerpa

SECRETARIO GENERAL



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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Dr. José Mostacero León

DECANO

Dr. William Zelada Estraver

SECRETARIO

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.



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PRESENTACIÓN

Señores Miembros del Jurado:

En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos

de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de

Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración

y criterio el presente trabajo de tesis titulado:

“Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus thuringiensis

producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de muerte de larvas de

Spodoptera frugiperda” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de Biólogo

Microbiólogo.

Trujillo, Diciembre del 2015

Br. Fernando Nieves Rodríguez



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MIEMBROS DEL JURADO

Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en

concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y

Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.

_________________________________

Ms. C. Pedro Alvarado Salinas

PRESIDENTE

_________________________________

Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona

SECRETARIO

_________________________________

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

VOCAL



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente

Informe de Tesis titulado: “Efecto tóxico del cristal parasporales de cuatro cultivos

de Bacillus thuringiensis producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de

muerte de larvas de Spodoptera frugiperda”, ha cumplido con los requisitos formales y

fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.

_________________________________

Ms. C. Pedro Alvarado Salinas

PRESIDENTE

_________________________________


SECRETARIO

_________________________________

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

VOCAL



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CERTIFICACION DE LA ASESORA

El que suscribe, profesora asesora de la tesis titulada:

“Efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de Bacillus thuringiensis

producidos en dos medios de cultivo sobre el porcentaje de muerte de larvas de

Spodoptera frugiperda”

Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias

Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su

correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones

y sugerencias alcanzadas.

Por lo tanto, autorizo a Fernando Nieves Rodríguez continuar con el trámite del

reglamento correspondiente.

Trujillo, Diciembre del 2015

_________________________________


ASESORA



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DEDICATORIAS

A Dios por brindarme el apoyo espiritual hasta este momento tan importante de

mi formación profesional y por haberme dado las oportunidades necesarias para

desarrollarme como ser humano.

A mis padres Fernando y María Antonieta por enseñarme que los sueños se

logran a base de esfuerzo y dedicación; y por darme la oportunidad de crecer al lado

de ellos y ser mejor día a día.

A mis hermanos Rosa Melva y Julio, por enseñarme la fuerza y fortaleza que los

pasajes de la vida nos conllevan a afrontar, por compartir cada momento de alegría y

por ser parte de este camino profesional, que hace unos años decidí recorrer.

A mis Abuelos, Sebastián y José Manuel, los pilares de mi familia y quienes

espiritualmente están conmigo les agradezco su infinito amor, cariño y enseñanzas,

para ellos que siempre estarán en mis pensamientos, les dedico todo mi esfuerzo y a

mis abuelas Luisa e Isabel, por sus consejos y compañía a lo largo de mi vida.



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AGRADECIMIENTO

A mi asesora de tesis, Dra. Eva Elizabeth Villanueva Tarazona, por su dedicación,

apoyo incondicional y por haberme brindado la orientación necesaria para desarrollar de la

mejor manera la realización de esta investigación.

A los maestros MsC. Julio Arellano Barragán, Dr. Carlos León Torres y el Dr. Carlos

Nomberto Rodríguez, por su gran apoyo y motivación para la culminación de mis estudios

profesionales y por impulsar el desarrollo de mi formación profesional y científica.

A la Ing. Diana Ivonne Moreno Baca Gerente de la empresa Soluciones

Agrosostenibles S.A.C. quien me brindo toda su confianza y me dio la oportunidad de

desarrollarme profesionalmente y de realizar la tesis de la mejor manera; así mismo, a toda

la familia SolAgro con quienes compartí conocimientos y experiencias.

A Danitza Plasencia, Mirelly Silva, Carlos Rebaza, César Pérez y Luis Paredes, mis

amigos, por haberme permitido conocerlos y hacer de esta vida universitaria y profesional

una de las etapas más hermosas de mi vida.

Finalmente, a la Universidad Nacional Trujillo por abrirme sus puertas y permitirme

ser parte de ella, hoy y siempre. Gracias



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ÍNDICE

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ......................... ii

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ........................... iii

PRESENTACIÓN ............................................................................................................ iv

MIEMBROS DEL JURADO ............................................................................................. v

APROBACIÓN ................................................................................................................ vi

CERTIFICACIÓN DE LA ASESORA ............................................................................ vii

DEDICATORIA ............................................................................................................ viii

AGRADECIMIENTO ...................................................................................................... ix

ÍNDICE ............................................................................................................................. x

RESUMEN ..................................................................................................................... xii

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1

OBJETIVOS ..................................................................................................................... 4

MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................................... 5

1. Material biológico .................................................................................................... 5

2. Procedimiento .......................................................................................................... 5

2.1. Tratamiento de las semillas de Z. mays “maíz amarillo” y siembra en vivero ..... 5

2.2. Reactivación y verificación de la pureza de los cultivos de B. thuringiensis ....... 6



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2.3. Preparación y estandarización de los pre-inóculos de los cultivos de B.

thuringiensis ..................................................................................................... 6

2.4. Preparación de los inóculos de los cultivos de B. thuringiensis .......................... 7

2.5. Esterilización de los biorreactores...................................................................... 7

2.6. Preparación de los medios de cultivo ................................................................. 7

2.7. Inoculación en los biorreactores......................................................................... 8

2.8. Proceso de producción de cristales..................................................................... 9

2.9. Inoculación de los cultivos B. thuringiensis en las plantas de Z. mays “maíz

amarillo” ........................................................................................................... 9

2.10. Aplicación de S. frugiperda en estadio 3 en las plantas de Z. mays “maíz

amarillo” tratados con cristales de B. thuringiensis ........................................... 9

2.11. Recuperación de los cultivos de B. thuringiensis a partir de larvas de S.

frugiperda muertas ......................................................................................... 10

2.12. Análisis ........................................................................................................... 10

RESULTADOS ............................................................................................................... 11

DISCUSIÓN ................................................................................................................... 16

ENUNCIADO RESUMEN ............................................................................................. 19

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 20

ANEXOS ........................................................................................................................ 25



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RESUMEN

En esta investigación se determinó el efecto tóxico del cristal parasporal de Bacillus

thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A, producidos en Caldo nutritivo (CN) y Caldo harina de

soya (CHS) sobre el porcentaje de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda

en plantas de Zea mays “maíz amarillo”. Los pre-inóculos se prepararon en Plate Count

Agar y los inóculos en CN y CHS. Cada inóculo (40 mL) se adicionó a biorreactores

estériles conteniendo 360 mL de CN y CHS, se incubaron durante 72 horas a 30°C y en

agitación constante (130 rpm). Luego, los cultivos de B. thuringiensis, fueron aplicados en

plantas de Z. mays “maíz amarillo” a las que posteriormente se introdujo una larva de S.

frugiperda en estadio 3. Se logró producir cristales parasporales de B. thuringiensis 1K,

2K, 14B y 4A en CN y CHS; los cristales producidos en CN, ocasionaron el 40, 40, 50 y

30% de muerte de larvas de estadio 3 de S. frugiperda, y los producidos en CHS, el 70, 50,

80 y 50%. Los signos observado en las larvas de S. frugiperda aplicados en plantas de Z.

mays “maíz amarillo”, a lo largo de los nueve días de evaluación, fueron, movimiento

errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación. A partir de las larvas

muertas de S. frugiperda se recuperaron los cultivos de B. thuringiensis con características

iguales a las inoculadas.



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INTRODUCCIÓN

Los agentes de control biológico utilizados en el manejo integrado de plagas son

de gran importancia debido a que el uso indiscriminado de insecticidas químicos

además de producir un efecto residual en el ambiente genera resistencia y daño a

organismos no blancos, tales como predatores, polinizadores, etc. Así mismo, debido a

su bajo costo en el mercado, en comparación con los insecticidas químicos, resulta

económico para su producción a mayor escala 1, 2, 3, 4.

Entre los agentes que tienen capacidad de ser utilizados en el control biológico

con característica de entomopatógeno, existen aproximadamente 300 especies de

bacterias, de las cuales las más importantes desde el punto de vista comercial pertenecen

al género Bacillus, tales como B. popilliae, B. moritai, B. sphaericus y B. thuringiensis;

esta última, debido a su inocuidad para e1 hombre, los animales domésticos, la flora y

fauna silvestre; y al ataque específico al estado larvario de lepidópteros y dípteros

perjudiciales, a la velocidad de acción y ausencia de efectos sobre otros organismos no

blanco, representa el entomopatógeno de mayor producción en el mundo5 y se

constituye en una buena alternativa, en comparación al uso de los insecticidas

químicos1, 2.

B. thuringiensis es un bacilo Gram positivo que habita la flora normal del suelo,

mide de 3 a 5 µm de largo por 1 a 1,2 µm de ancho; además, presenta flagelos peritricos

y su espora elipsoidal central es no deformante6. Metabólicamente posee la capacidad

de utilizar como fuente de carbono glucosa, fructosa, trealosa, maltosa y ribosa, así

como hidrolizar almidón7. Como fuente de nitrógeno se ha reportado que requiere de



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aminoácidos esenciales y otras formas orgánicas de nitrógeno, tales como, harina de

maíz, extracto de levadura y caseína8; y como los minerales importantes para su

crecimiento y esporulación, se mencionan al magnesio, manganeso, hierro, zinc y

calcio9.

En relación al valor del pH, B. thuringiensis presenta un crecimiento óptimo

entre 5.6 – 8.5 siendo el valor promedio óptimo 7.0, durante el crecimiento este valor

decrece por la formación de ácidos como el ácido láctico10. Para la temperatura se

reportan valores entre 20 a 42°C, sin embargo, a temperaturas cercanas a 42°C se

produce una disminución en la producción de la delta – endotoxina, la cual forma parte

del cristal o inclusión parasporal11. En cuanto a la velocidad de agitación en el medio de

fermentación, se ha demostrado que una velocidad de 150 rpm produce una buena

esporulación y producción de cristales12, mientras que otros autores, recomiendan

utilizar una velocidad de agitación de 200 rpm, debido a que una velocidad de agitación

superior causa un decremento gradual en la producción de cristales13, 14.

Durante el proceso de esporulación B. thuringiensis presenta como principal

característica la producción de una inclusión parasporal que tiene efecto tóxico para

insectos específicos15. Estas inclusiones se sintetizan desde que ocurre el englobamiento

de la pre-espora hasta su maduración; se ubican en el interior de la célula, los cuales son

liberados cuando ocurre la lisis celular7, 15.

Entre las plagas ampliamente distribuidas en América se puede mencionar la

causada por Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae); esta plaga afecta

numerosos cultivos, siendo su hospedante preferencial el maíz, al que ataca con niveles

variables en las regiones tropicales y subtropicales de América Latina, constituyendo un

factor limitante del cultivo16, 17, 18, 19, 20.



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En los dos primeros estadios larvarios de S. frugiperda, las larvas se alimentan

de la epidermis de las hojas de maíz, dejando manchas translúcidas; a partir del tercer

estadio, consumen la mayor parte de la lámina foliar, produciendo orificios irregulares

en el follaje. Al cumplir el cuarto estadio, las larvas migran al cogollo de la planta de

maíz, donde encuentran protección y se desarrollan alimentándose del cogollo hasta los

estadios larvarios siete y ocho. En consecuencia, producen perforaciones transversales

que debilitan y quiebran las hojas, reduciendo la capacidad fotosintética de la planta;

siendo estos daños significativos21.

Considerando que B. thuringiensis es usado en el control biológico de plagas

debido a su capacidad de producir inclusiones parasporales o cristales que contienen

una proteína con capacidad insecticida contra insectos específicos14 y que la

composición del medio de cultivo afecta la capacidad toxica del cristal producido, es

necesario determinar el efecto tóxico del cristal parasporal de B. thuringiensis,

producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya sobre el porcentaje de muerte de

larvas de estadio 3 de S. frugiperda en plantas de Zea mays “maíz”.



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OBJETIVOS

- Producir cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus

thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A en

Caldo nutritivo y Caldo harina de soya.

- Determinar el porcentaje de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera

frugiperda por efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K,

Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A

producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de

Zea mays “maíz amarillo”.

- Registrar los signos que presentan las larvas de estadio 3 de Spodoptera

frugiperda por efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K,

Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis

4A, producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e inoculados en plantas

de Zea mays “maíz amarillo”.

- Recuperar los cultivos de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K,

Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A a partir de larvas muertas

de Spodoptera frugiperda por efecto de los cristales parasporales producidos en

Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de Zea mays “maíz

amarillo”.



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MATERIAL Y MÉTODOS

1. MATERIAL BIOLÓGICO

- Cultivo de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus

thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A, proporcionados por la empresa

Soluciones Agrosostenibles S.A.C.

- Larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda, proporcionados por el Área de

Crianza de la Empresa Soluciones Agrosostenibles S.A.C.

- Semillas de Zea mays “maíz amarillo” proporcionados por el Área de Crianza

de la Empresa Soluciones Agrosostenibles S.A.C.

2. MÉTODOS

2.1. Tratamiento de las semillas de Z. mays “maíz amarillo” y siembra en

vivero

Las semillas de maíz fueron colocadas en un beacker estéril y remojados en

agua corriente durante 24 horas. Posteriormente, se desinfectaron con el

fungicida agrícola “Homai” (metil tiofanato) durante un minuto, y después

se realizó un lavado de las semillas con ADE.

En bolsas de siembra de 4 Kg de capacidad, se agregó 2 Kg de arena de

duna y humus, a una proporción de 1.5:0.5 y se adicionó 250 mL de agua

corriente con la finalidad de humedecer la mezcla.

Luego de ello se sembraron cuatro semillas de maíz en cada bolsa de

siembra, bajo 2 cm de profundidad. El crecimiento de las plantas de maíz se

realizó en condiciones de vivero (Temperatura 27°C ± 2, Humedad relativa



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74%) durante 30 días. Por cada cultivo de B. thuringiensis en cada medio de

cultivo se utilizaron 10 plantas de maíz para el problema y 10 para el testigo

(sin inoculación de B. thuringiensis). Obteniendo finalmente 80 plantas para

el problema y 80 para el testigo.

2.2. Reactivación y verificación de la pureza de los cultivos de B.

thuringiensis

Los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A, conservados en

refrigeración a -4°C, fueron sembrados en placas de Petri, conteniendo Plate

Count Agar (PCA) e incubados a 30°C durante 48 horas. Culminado el

tiempo de incubación se realizaron observaciones de sus características

macromorfológicas, como aspecto, borde y color (Anexo 1) y

micromorfológicas, como tinción de Gram29 y forma del cristal parasporal

(Anexo 2).

2.3. Preparación y estandarización del pre-inóculo de los cultivos de B.

thuringiensis

Los cultivos puros de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A se sembraron por

agotamiento, en placas de Petri conteniendo PCA y se incubaron a 30°C

durante 24 horas. Después de la incubación, los cultivos se cosecharon con

5 mL de agua destilada estéril (ADE) por placa; dichas suspensiones fueron

estandarizadas en espectrofotómetro a una absorbancia de 0.7 a 600 nm

constituyendo los pre-inóculos. A estas suspensiones se le realizaron

recuentos de unidades formadoras de colonias en placa (UFC/mL) en PCA,

obteniendo un valor de 3.3 x 108 UFC/mL.



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2.4. Preparación y estandarización de los inóculos de los cultivos de B.

thuringiensis

Cada uno de los cuatro pre-inóculos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A

se adicionaron a matraces conteniendo 36 mL de los siguientes medios de

cultivo: Caldo nutritivo (CN) y Caldo harina de soya (CHS). Todos los

medios de cultivo fueron ajustados a un valor de pH: 7.0 y se incubaron a

30°C y 130 rpm en una incubadora con agitación constante durante 12

horas. Después de la incubación se realizaron recuentos de unidades

formadoras de colonias en placa (UFC/mL), de los cultivos de B.

thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A obteniéndose los siguientes recuentos: 5.07,

2.85, 4.35 y 4.65 x 108 UFC/mL respectivamente.

2.5. Esterilización de los biorreactores

Los ocho biorreactores de 1.0 L de capacidad, fueron esterilizados a 121°C

por 15 minutos; y divididos en dos grupos, de cuatro sistemas cada uno,

según el medio de cultivo, y rotulados como CN y CHS.

2.6. Preparación de los medios de cultivo

Los dos medios de cultivo se prepararon como se describe a continuación:

CALDO NUTRITIVO (CN)

CALDO HARINA DE SOYA (CHS)

Extracto de carne 3.0 g

Peptona de carne 5.0 g

Agua destilada 1.0 L

Harina de soya 2.9 g

Maltodextrina 2.0 g

KH2PO4 8.0 g

K2HPO4 2.0 g

Agua destilada 1.0 L



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El valor del pH se ajustó a 7.0; el medio de cultivo CN fue esterilizado a

121°C durante 15 minutos y el medio de cultivo CHS durante 20 minutos.

2.7. Inoculación en los biorreactores

Los inóculos de los cuatro cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A

preparados según lo descrito en el numeral 2.4, se adicionaron en cada uno

de los biorreactores como se describe a continuación:

Todos los biorreactores contuvieron 360 mL del medio de cultivo

correspondiente y 40 mL del inóculo de B. thuringiensis correspondiente,

haciendo un volumen final de 400 mL.

Biorreactor Medio de cultivo B. thuringiensis

1

2

3

4

CN

1K

2K

14B

4A

5

6

7

8

CHS

1K

2K

14B

4A



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2.8. Proceso de producción de cristales

Los ocho biorreactores, debidamente acondicionados e inoculados fueron

incubados a 30°C a 130 rpm en una incubadora con agitación constante

durante 72 horas.

Cumplidas las 72 horas de incubación se procedió a trasvasar el producto de

la fermentación, vertiéndolo en recipientes estériles rotulados con los

números correspondientes a los biorreactores (1 al 8), los cuales fueron

sellados herméticamente y se conservaron hasta el momento de su uso.

2.9. Inoculación de los cultivos B. thuringiensis en las plantas de Z. mays

“maíz amarillo”

De los ocho recipientes se extrajo 1.5 mL y se suspendió en 100 mL de agua

destilada estéril (ADE), luego se adicionó 0.02 mL del adherente “Break

thru” (Poliéter polimetilsiloxano copolímero). Se agitó hasta obtener una

solución homogénea, y con la ayuda de un rociador de gota fina, se inoculó

cuidadosamente en cada planta de Z. mays “maíz amarillo” obtenidos según

lo descrito en 2.1.

2.10. Aplicación de S. frugiperda en estadio 3 en las plantas de Z. mays “maíz

amarillo” tratados con cristales de B. thuringiensis.

Se aplicó una larva de estadio 3 de S. frugiperda por planta de maíz y

posteriormente se monitoreo durante nueve días; este monitoreo consistió en

realizar conteos del número de larvas muertas y registrar los signos

observados en cada una de ellas. Las larvas muertas fueron colectadas,

individualmente, en frascos estériles conteniendo solución salina fisiológica



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0.9% se rotularon y se llevaron al laboratorio para la posterior recuperación

de los cultivos de B. thuringiensis correspondientes.

2.11. Recuperación de los cultivos de B. thuringiensis a partir de larvas de S.

frugiperda muertas

Las larvas muertas de S. frugiperda se desinfectaron con una solución de

hipoclorito de sodio al 3% durante 2 minutos, y se enjuagaron tres veces con

ADE. Cada larva fue homogeneizada mediante un machacado utilizando

1.0 mL de ADE con la ayuda de una varilla de vidrio estéril; luego se

sometieron a tratamiento térmico a 80°C durante 10 minutos, seguido de 5

minutos en baño de hielo. Posteriormente fueron sembrados por estria en

placas de Petri conteniendo Plate Count Agar (PCA), e incubadas a 30° C

por 24 horas.

Cumplido el tiempo de incubación se compararon las características

macromorfológicas de las colonias que desarrollaron, con las características

de los cultivos originales (cultivos madres); así mismo, se realizaron

coloraciones de Gram con la finalidad de evaluar la similitud de las

características micromorfológicas.

2.12. Análisis de datos

Los porcentajes de muerte de las larvas de estadio 3 de S. frugiperda por

efecto de los cristales parasporales de cuatro cultivos de B. thuringiensis

producidos en los medios CN y CHS, fueron organizados en Tablas y

representados en figuras para su análisis correspondiente. Además se aplicó

el análisis estadístico, ANOVA22.



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RESULTADOS

Para determinar el efecto tóxico del cristal parasporal de cuatro cultivos de B.

thuringiensis producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya sobre el porcentaje

de muerte de larvas de estadio 3 de S. frugiperda, se produjeron en primer lugar, los

cristales parasporales de los cuatro cultivos en los dos medios de cultivo, antes

indicados, como se muestra en la Figura 1.

Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda aplicadas

en plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales

producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya se presentan en la Figura 2; se

observa que los valores varían con el cultivo de B. thuringiensis y con el medio de

producción. El mayor porcentaje de muerte se observa en B. thuringiensis 14B en Caldo

harina de soya y el menor porcentaje de muerte se observa en B. thuringiensis 4A en

Caldo nutritivo.

En la tabla 1, se describe los signos que presentan las larvas en estadio 3 de S.

frugiperda, por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K, B.

thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A, producidos en Caldo

nutritivo y Caldo harina de soya durante los nueve días de evaluación.

En la tabla 2, se describe las características macromorfológicas y

micromorfológicas de los cultivos originales de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A y los

cultivos de B. thuringiensis recuperados a partir de larvas muertas de S. frugiperda en

Plate Count Agar (PCA) e incubados a 30°C durante 24 horas.



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Figura 1. Cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K

(b), B. thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d) producidos en Caldo

nutritivo y Caldo harina de soya a las 72 horas de incubación a 30°C y 130

rpm.



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Figura 2. Porcentajes de muerte de larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda en

plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales

parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B.

thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A producidos en Caldo nutritivo y

Caldo harina de soya durante nueve días de evaluación.

Testigo: Sin aplicación de B. thuringiensis



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Tabla 1. Signos observados en las larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por

efecto de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus

thuringiensis 2K, Bacillus thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A,

producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e inoculados en

plantas de Zea mays “maíz amarillo”.

Signos

Movimiento errático

Inmovilidad

Diarrea

Cesamiento de la alimentación



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Tabla 2. Características macromorfológicas y micromorfológicas de los cultivos de

Bacillus thuringiensis 1K, Bacillus thuringiensis 2K, Bacillus

thuringiensis 14B y Bacillus thuringiensis 4A, recuperados a partir de

larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por efecto de los cristales

parasporales producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya e

inoculados en plantas de Zea mays “maíz amarillo”.

Cultivo de

Bacillus thuringiensis Características

Original Recuperado Macromorfológicas Micromorfológicas

1K 1K

Aspecto cremoso

Colonias blanquecinas,

opacas y de bordes

irregulares

Forma bacilar

Cristal bipiramidal

Gram positivo

2K 2K

Aspecto cremoso


opacas y de bordes

irregulares

Forma bacilar

Cristal bipiramidal

Gram positivo

14B 14B

Aspecto seco


opacas y de bordes

irregulares

Forma bacilar

Cristal bipiramidal

Gram positivo

4A 4A

Aspecto seco


opacas y de bordes

irregulares

Forma bacilar

Cristal bipiramidal

Gram positivo



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DISCUSIÓN

Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda aplicadas en

plantas de Zea mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales producidos

en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, varían con el cultivo de B. thuringiensis y

con el medio de producción. Tal es así, que se observó que los cristales parasporales de

los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A producidos en Caldo harina de soya

presentaron mayor toxicidad a diferencia de los que fueron producidos en Caldo

nutritivo, respaldando la teoría que el medio de cultivo a base de sales produce una

mayor toxicidad23.

Los cultivos de B. thuringiensis 1K y 14B producidos en Caldo harina de soya,

resultaron ser los ideales para su producción, debido al efecto toxico producido en

larvas de estadio 3 de S. frugiperda de un 70 y 80% respectivamente; esto debido a que

en su composición el Caldo harina de soya posee nutrientes tales como, harina de soya,

maltodextrina y sales. La harina de soya contiene alrededor del 40 % de proteína y la

mayoría de los nutrientes que requiere la bacteria para su crecimiento y desarrollo. Así

mismo, la maltodextrina como fuente de carbono, y sales minerales que son necesarias

en el medio de cultivo para la producción del cristal paraesporal23.

Los porcentajes de muerte de larvas en estadio 3 de S. frugiperda, en plantas de

Z. mays “maíz amarillo” por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K

y 4A producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, a través de los días se

observa que incrementan hasta los cuatro días, y las producidas por B. thuringiensis 14B

y 2K, hasta los cinco días (Anexo 3 y 4).



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Se observó que las larvas de estadio 3 de S. frugiperda entre el tercer y quinto

día de haber consumido las hojas de maíz con cristales parasporales de B. thuringiensis

1K, 2K, 14B y 4A producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, murieron, lo

que conlleva a concluir que una vez ingerido el alimento inoculado, tardan en hacer

efecto alrededor de cinco días.

Se observó que las larvas de estadio 3 de S. frugiperda presentaron signos, tales

como, movimiento errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación,

dichas características corresponden al efecto entomopatógenos de los cristales

parasporales de B. thuringiensis. Esto debido a que al ser ingeridos los cristales de B.

thuringiensis son solubilizados en el intestino medio del insecto, tras lo cual se liberan

las proteínas cristalinas en forma de protoxinas, que estas al ser procesadas por

proteasas intestinales, generaran las toxinas activas que llevarán a la muerte de la larva

de S. frugiperda24. Bajo su forma monomérica, las toxinas atraviesan la membrana

peritrófica y se unen de forma univalente a la caderina, con gran afinidad en la cara

apical de la membrana epitelial24, 25. Luego, de acuerdo con estudios realizados en

cultivos de células de insectos, se inicia una cascada de señalización dependiente del ion

magnesio que sería responsable de la muerte celular26, como consecuencia, el tejido

intestinal resulta dañado gravemente, lo que impide la asimilación y retención de

compuestos vitales para la larva y lleva a la muerte del insecto. La muerte puede

acelerarse al germinar las esporas y proliferar las células vegetativas en el hemocele del

insecto27, 28 (Anexo 5).

Al recuperar los cultivos de B. thuringiensis 1K, 2K, 14B y 4A a partir de larvas

muertas de S. frugiperda por efecto de los cristales parasporales de los cuatro cultivos

de B. thuringiensis producidos en Caldo nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en



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plantas de Zea mays “maíz amarillo”, se observa micromorfológicamente que los cuatro

cultivos de B. thuringiensis presentan forma bacteriana bacilar, forma del cristal

parasporal bipiramidal y tinción Gram positiva. Por otro lado, se observa

macromorfológicamente que los dos primeros cultivos antes mencionados de B.

thuringiensis presentan aspecto cremoso, y los dos últimos aspecto seco. Además, los

cuatro cultivos de B. thuringiensis presentan colonias blanquecidas y opacas y de bordes

irregulares.

La prueba estadística ANOVA detecto diferencia estadísticamente significativas

(p<0.05) (Anexo 6) entre los porcentajes de mortalidad de larvas de estadio 3 de S.

frugiperda por efecto de los cristales parasporales de B. thuringiensis 1K, B.

thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A producidos en Caldo

nutritivo y Caldo harina de soya, aplicados en plantas de Z. mays “maíz amarillo”.



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ENUNCIADO RESUMEN

En la presente investigación se logró producir cristales parasporales de B.

thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A en Caldo

nutritivo y Caldo harina de soya; los cristales producidos por estos cuatro cultivos de B.

thuringiensis, en Caldo nutritivo, ocasionaron el 40, 40, 50 y 30% de muerte de larvas de

estadio 3 de S. frugiperda, mientras que los producidos en Caldo harina de soya, el 70, 50,

80 y 50%. Los signos observado en las larvas de S. frugiperda aplicados en plantas de Z.

mays “maíz amarillo”, a lo largo de los nueve días de evaluación, fueron, movimiento

errático, inmovilidad, diarrea y cesamiento de la alimentación. A partir de las larvas

muertas de S. frugiperda se recuperaron los cultivos de B. thuringiensis con características

iguales a las inoculadas.



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ANEXOS



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Anexo 1. Colonias de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K (b), B.

thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d).

a) Aspecto cremoso, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.

b) Aspecto cremoso, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.

c) Aspecto seco, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.

d) Aspecto seco, Colonias blanquecinas, opacas y de bordes irregulares.



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Anexo 2. Tinción de Gram de Bacillus thuringiensis 1K (a), B. thuringiensis 2K (b), B.

thuringiensis 14B (c) y B. thuringiensis 4A (d), observado al microscopio con

objetivo de inmersión.

a) Gram positivo, forma bacilar.

b) Gram positivo, forma bacilar.

c) Gram positivo, forma bacilar.

d) Gram positivo, forma bacilar.



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28

Anexo 3. Porcentaje de mortalidad de larvas en estadio 3 de Spodoptera frugiperda en

plantas de Zea mays “maíz” por efecto de los cristales parasporales de

Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B.

thuringiensis 4A, producidos en Caldo nutritivo; durante nueve días de

evaluación.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

% M

uer

te

Tiempo (Días)

Testigo 1K 2K 14B 4A



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Anexo 4. Porcentaje de muerte de larvas en estadio 3 de Spodoptera frugiperda en

plantas de Zea mays “maíz” por efecto de los cristales parasporales de

Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K, B. thuringiensis 14B y B.

thuringiensis 4A, producidos en Caldo harina de soya; durante nueve días

de evaluación.



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Anexo 5. Signos presentados por larvas de estadio 3 de Spodoptera frugiperda por efecto

de los cristales parasporales de Bacillus thuringiensis 1K, B. thuringiensis 2K,

B. thuringiensis 14B y B. thuringiensis 4A, producidos en Caldo nutritivo y

Caldo harina de soya e inoculados en plantas de Zea mays “maíz amarillo”.

a) Diarrea

b) Parálisis

c) Cesamiento de la alimentación



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Anexo 06. Valor P análisis estadístico, ANOVA

FV SC GL CM F VALOR P

M 1.125 1 1.125 22.0909091 0.01821985 < 0.05

P 0.81944444 3 0.27314815 0.20921986 0.88965953

MP 0.15277778 3 0.05092593 0.03900709 0.98961616



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