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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Diversidad bacteriana del tracto digestivo de

larvas de cuatro especies del género

Anastrepha (Diptera:Tephritidae)

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN QUE PARA

OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

PRESENTA

MARLEN CORETY LUGO MORA

Dirección

Dr. Gerardo Zúñiga Bermúdez

Dra. Flor Nohemí Rivera Orduña

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Agradecimientos:

Quiero agradecer a mis asesores, el Dr. Gerardo Zúñiga Bermúdez y la Dra. Flor

Nohemí Rivera Orduña por abrirme las puertas de sus laboratorios y darme la

oportunidad de aplicar los conocimientos adquiridos durante mi formación, por sus

aportaciones y dedicación en la realización de este proyecto.

A mis compañeros de laboratorio Carmen Ventura por su apoyo en la colecta de

especímenes, por su orientación y contribuciones en este trabajo. A Salvador

Embarcadero por resolver esas pequeñas dudas y compartir sus conocimientos.

A mi compañero y amigo Iván Arroyo por sus enseñanzas, consejos y valiosas

aportaciones a este trabajo.

De igual manera agradezco el apoyo de los profesores de la academia de Ecología

Microbiana por las facilidades para realizar este trabajo.

3

Dedicatoria

A mis padres Martín y Angélica porque gracias a su apoyo y sacrificios pude cumplir

una de mis metas en vida, por ser mi inspiración y apoyo, por haberme enseñado a

no darme provecida y seguir adelante.

A mis hermanos Itzel y Alan por su paciencia para escucharme y tratar de

entenderme.

A mis abuelos Consuelo, Paulino, María y Pedro por todas las enseñanzas de vida

que me han dejado.

A Israel Hernández por ser mi colega, amigo, confidente, compañero, por haberme

acompañado durante todo este camino.

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Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Variación Biológica del

Departamento de Zoología y Laboratorio de Ecología Microbiana del

Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Bajo la dirección del Dr.

Gerardo Zúñiga y la Dra. Flor Noemí Rivera Orduña

5

La presente investigación formo parte del proyecto “Caracterización y comparación

de la diversidad bacteriana asociada a tracto digestivo de adultos de cuatro especies

de moscas del género Anastrepha”, financiando por la Secretaría de Investigación

y Posgrado- IPN (SIP-IPN 20141308)

Durante la realización del presente trabajo la que suscribe recibió apoyo económico

por parte de la Secretaría de Educación Pública mediante la beca de capacitación

en el año 2013 y 2014.

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Índice 1. Introducción 11

1.1 Ciclo de vida de las especies del género Anastrepha 12

1.2 Situación fitosanitaria actual 14

2. Bacterias simbiontes y la mosca de la fruta 16

3. Justificación 20

4. Hipótesis 21

5. Objetivos 21

5.1 Objetivos Específicos 22

6. Materiales y métodos 23

6.1 Material biológico 23

6.2 Aislamiento de comunidades bacterianas 23

6.3 Determinación taxonómica 25

6.3.1. Aislamiento de DNA bacteriano 26

6.3.2. Amplificación del 16s rRNA 26

6.3.3. Análisis de las secuencias 27

6.4 Comparación de las comunidades bacterianas 28

7. Resultados 29

7.1 Aislamiento de comunidades bacterianas 29

7.2 Aislamiento de DNA bacteriano y Amplificación del gen 16s rRNA 30

7.3 Asignación taxonómica 31

7.4 Comparación de las comunidades bacterianas de larvas de Anastrepha 35

8. Discusión 37

9. Conclusiones 43

10. Bibliografía 44

Anexo I 52

Anexo 2 54

7

Índice de figuras

Figura 1. Ciclo de vida del género Anastrepha 13

Figura 2A. Hembras ovipositando el fruto huésped 14

Figura 2B Larvas del género Anastrepha en un fruto huésped 14

Figura 3. Situación fitosanitaria actual 15

Figura 4. Morfología colonial de los aislados de las larvas Anastrepha 30

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1% del material genético 31

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de la amplificación

del gen16 rRNA

31

Figura 7. Árbol filogenético obtenido por el método de máxima

verosimilitud de los aislados de larvas del género Anastrepha

33

Figura 8. Análisis de componentes principales (PCoA) de las

comunidades aisladas del tracto digestivo de larvas de las cuatro

especies de larvas en estudio

36

8

Índice de tablas

Tabla1. Densidad bacteriana 29

Tabla 2. Morfología colonial observada en los aislados obtenidos de

las especies en estudio

30

Tabla 3. Porcentaje de similitud y asignación taxonómica de los

diferentes aislados del tracto digestivo de las cuatro especies del

género Anastrepha

34

9

Resumen

La familia Tephritidae comprende un grupo de moscas consideradas de gran importancia

debido al impacto económico que provocan en el sector agrícola a nivel mundial. En México,

se encuentra representada por moscas del género Anastrepha del cual se tienen cuatro

especies como las más abundantes: A. ludens, A. obliqua, A. serpentina y A. striata. La

presencia de bacterias asociadas a moscas de la fruta en otros géneros ha sido bien

documentada, reportando una gran diversidad de bacterias, principalmente en el intestino

de estos insectos. En algunos géneros de moscas como Ceratitis, Dacus y Bactrocera se

ha destacado la importancia de las bacterias en el ciclo de vida de su hospedero, tales

como: aporte de nutrientes, alteración en el desarrollo, reproducción y aumento de la

longevidad. Sin embargo, en moscas de la fruta del género Anastrepha poco se sabe acerca

de las asociaciones bacterianas que establece. En el presente estudio se realizó el

aislamiento e identificación molecular de bacterias presentes en el tracto digestivo de larvas

de A. ludens, A. obliqua, A. serpentina y A. striata. Encontrando que la microbiota cultivable

se compone en su mayoría por bacterias del phylum Proteobacteria y, en menor proporción,

a Firmicutes. Las Proteobacterias estuvieron conformadas por la familia Enterobacteriaceae

y los géneros Enterobacter, Citrobacter, Kluyvera, Providencia y Escherichia. Estos grupos

han sido identificados previamente en el tracto digestivo de Anastrepha ludens y en otros

géneros como Ceratitis y Batrocera. El Phylum Firmicutes sólo fue identificado en larvas de

A. ludens y corresponde Bacillus liqueniformis miembro de la familia Bacillaceae. Esta

especie bacteriana ha sido reportada en diversos insectos e inclusive en las moscas de la

fruta, en poca abundancia. La identificación taxonómica y comparación de los aislados en

tracto digestivo de larvas de las cuatro especies de moscas, sugiere que la diversidad

bacteriana es similar, ya que la mayoría de los géneros obtenidos son compartidos y

pertenecen al grupo de las Enterobacterias, sin embargo, a nivel de especie algunas fueron

exclusivas para una mosca de la fruta. Este estudio sienta las bases para poder determinar

el papel funcional de estos microorganismos en el intestino de la mosca de fruta del género

Anatrepha.

10

Abstract

The Tephritidae family that is a group of flies whith importance due to the economic impact

they cause in the agricultural sector worldwide. In Mexico, it is represented by flies of the

genus Anastrepha, of which four species are the most abundant species: A. ludens, A.

obliqua, A. serpentina and A. striata. The presence of bacteria associated with fruit flies has

been well documented, reporting a great diversity of bacteria, mainly in the intestine of these

insects. In some genera of flies such as Ceratitis, Dacus and Bactrocera, the importance of

bacteria in the host's life clicle has been emphasized, such as nutrient supply, altered

development, reproduction and increased longevity. However in fruit flies of the genus

Anastrepha little is known about the association is establishing bacterial.

In the present study the isolation and molecular identification of bacteria present in the

digestive tract of A. ludens, A. obliqua, A. serpentina and A. striata larvae were performed.

Finding that the cultivable microbiota is composed mostly of bacteria of the phylum

Proteobacteria and, to a lesser extent, Firmicutes. The Proteobacteria were conformed by

the family Enterobacteriaceae and the genera Enterobacter, Citrobacter, Kluyvera,

Providencia and Escherichia. These groups have been previously identified in the digestive

tract of Anastrepha ludens and in other genera such as Ceratitis and Batrocera. The Phylum

Firmicutes was only identified in larvae of A. ludens and corresponds to Bacillus

licheniformis, a member of the Bacillaceae family.

This bacterial species has been reported in various insects and fruit flies.

The taxonomic identification and comparison of the isolates in the digestive tract of larvae

of the four species of flies, suggests that the bacterial diversity is similar, since most genera

obtained are shared and belong to the group of Enterobacterias, however at the species

level some were unique to one of the fruit fly. This study aims to know the bacterial

community of larvae of Anastrepha species, to later identify the functional role of these

microorganisms in a probable symbiotic association.

11

1. Introducción

Las moscas de la fruta de la familia Tephritidae son una de las plagas de frutales

más importantes en el mundo (Aluja, 1994; Hallman, 2001); se encuentra distribuida

a nivel mundial y está integrada aproximadamente por 4223 especies (Aluja, 1993;

Hernández-Ortiz, 2007). A nivel mundial, destacan por su importancia económica

los géneros Ceratitis, Bactrocera, Rhagoletis y Anastrepha (SAGARPA-Senasica

2016), siendo éste último género considerado como una de las plagas más

devastadoras en la agricultura (Aluja, 1994; Pena 1998;), tanto por el daño que

ocasionan directamente a la fruta, como por las medidas cuarentenarias que

impiden la exportación de los productos frutales (Aluja, 1994; Hallman, 2001), las

cuales impactan en gran magnitud el mercado internacional (SAGARPA-Senasica,

2013).

El género Anastrepha está integrado por un total de 198 especies, situándolo

como el grupo más diverso de la familia Tephritidae. Y se encuentra distribuido en

las zonas subtropicales y trópicos de América (Hernández-Ortiz, 1992). Los

registros señalan que se extiende desde los Estados Unidos Americanos (EUA)

hasta el norte de Argentina.

En México se han reportado 37 especies pertenecientes al género

Anastrepha, de las cuales cuatro son las más importantes por su impacto

económico, incidencia y severidad en la fruticultura: la mosca mexicana de la fruta

Anastrepha ludens (Loew), la mosca de las indias occidentales Anastrepha obliqua

(Macquart), la mosca de la guayaba Anastrepha striata (Schiner) y la mosca del

12

zapote Anastrepha serpentina (Wiedemann) (Hernández-Ortiz 1992; Aluja, 1993;

Hernández-Ortíz, 2007). Los principales hospederos de estas especies son los

cítricos, entre los que se encuentran mango, durazno, guayaba, ciruela, naranja y

zapotes, no obstante hay una lista de al menos 54 especies de hospederos,

distribuidas en 18 familias vegetales (Hernández-Ortíz, 1992; SAGARPA-Senasica,

2016).

1.1 Ciclo de vida

La mosca de la fruta es un insecto holometábolo, por lo que el ciclo de vida

de estas especies consta de cuatro estadios de desarrollo: huevo, larva, pupa y

adulto. La duración de cada uno depende de la especie de mosca y de las

condiciones ambientales (Bateman, 1972). Las diferentes etapas de desarrollo de

estas moscas se lleva a cabo en diversos hábitats como el fruto, suelo y ambiente

dependiendo del estado de desarrollo (Figura 1).

El ciclo inicia cuando las hembras fertilizadas insertan su ovipositor en el fruto

y depositan sus huevos por debajo de la cáscara o en la pulpa de frutos casi

maduros (60-70% de madurez) o verdes (Aluja, 1993). La eclosión del huevo se

produce de 1 a 4 días después de la oviposición. Al eclosionar, las larvas se

alimentan de la pulpa del fruto. La larva tiene una duración de 10 a 25 días y pasa

por tres etapas (primero, segundo y tercer instar). El tercer estadio coincide, por lo

general, con la madurez del fruto y la caída del mismo, provocando que las larvas

abandonen el fruto y se desplacen hacia el suelo donde se introducen unos cuantos

centímetros hasta alcanzar el estado pupa con una duración de 15 a 19 días (Una

vez emergidos los adultos alcanzarán la madurez sexual aproximadamente a los 10

13

a 15 días de edad (Christenson y Foote, 1960; Boscán de Martínez, 1992;

Celedonio-Hurtado, 1988).

Figura 1. Ciclo de vida del género Anastrepha (Tomado de :SENASA, Perù)

Los machos se concentran en un punto referencial del árbol, formando un

grupo (leks) que danzan y liberan una feromona sexual para atraer a las hembras

para copular. Una vez realizada la cópula, la hembra localiza un fruto favorable para

el desarrollo de la progenie y oviposita (Figura 2), impregnando una feromona de

marcaje en la superficie que indica a otras moscas que en el fruto se ha ovipositado.

Se ha reportado que las especies del género Anastrepha tienen varias generaciones

por año, por ejemplo, A. striata, A. serpentina y A. obliqua presentan de 4 a 8

14

generaciones por año y su capacidad de oviposición es de 100-800 huevos

(Bateman, 1972; Celedodio-Huetado 1998).

Las larvas son el principal agente causante de daño a las frutos, ya que se

alimentan del mesocarpo produciendo una serie de galerías en la pulpa el fruto,

(Figura 2 A-B), lo que limita su comercialización en los mercados nacionales e

internacionales, ocasionando grandes pérdidas económicas al sector

agrícola.(Hernández-Ortíz, 1992; White y Elson-Harris, 1992).

A

B

Figura 2. Hembras ovipositando en el fruto huésped (A). Pudrición del fruto infestado por larvas (B). Tomado de Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Yucatán

1.2 Situación fitosanitaria actual

Debido al daño severo que causa a la producción frutícola, en 1992 se puso en

marcha la Campaña Nacional contra Moscas de la Fruta (CNMF) con el objeto de

controlar, suprimir y erradicar a estos insectos. Esta campaña ha impactado

positivamente al 51.10% (1,001,242.57 km2) del territorio nacional, declarando

varios estados libres de moscas de la fruta del género Anastrepha, de acuerdo a la

Norma Oficial Mexicana NOM-023-FITO-1995 (SAGARPA-Senasica, 2014).

Desafortunadamente, estas campañas no han sido efectivas en los estados del

centro, pacífico, golfo y sur del país (Figura 3), siendo la mosca de fruta un problema

15

crítico en el sector agrícola (SAGARPA-Senasica, 2016; Hernández-Ortíz, 2007).

Ente los métodos de erradicación de Anastrepha, se encuentran las actividades

basadas en control mecánico, químico y biológico (Norma Mexicana NOM.023-

FITO-1995). En los últimos 50 años, los estudios están enfocados en el control

biológico de estas moscas, lo cual ha implicado un conocimiento sobre su

comportamiento, biología y ecología, permitiendo mejorar las estrategias para el

control de sus poblaciones (Chistenson y Foote, 1960; Bateman, 1972).

Figura 3. Situación fitosanitaria actual moscas de la fruta del género Anastrepha (SAGARPA-

Senasica, 2016).

NORTE

GOLFO

CENTRO

PACIFICO

SUR

16

2. Bacterias simbiontes y la mosca de fruta

Las asociaciones microorganismos-insecto se consideran importantes en el

conocimiento global de la biología de los insectos, lo que demanda que se estudien

dentro de un contexto ecológico (Dillon and Dillon, 2004).

Dentro de los aspectos ecológicos, se ha encontrado que la mayor parte de los

hexápodos estudiados han establecido asociaciones simbióticas con los

microorganismos, las cuales van desde mutualistas hasta patógenas (Bourtziz y

Miller 2003; Rio et al., 2003; Baumann, 2005). Dentro de las mutualistas se ha

documentado que las bacterias confieren protección a su huésped contra enemigos

naturales e inmunidad, además juegan un papel crucial en los procesos digestivos

y de reproducción favoreciendo el desarrollo de los insectos. (Stouthamer et al.,

1999; Vargas-Jerez et al 2012; Rajagopal 2009).

En este sentido, la mosca de la fruta no ha sido la excepción, ya que diversos

estudios se han enfocado en identificar y explorar las posibles funciones que tiene

la microbiota bacteriana asociada a los géneros Ceratitis, Ragholetis y Bactrocera.

Estos estudios han caracterizado la comunidad bacteriana de diversas regiones

anatómicas como cabeza, bulbo esofágico, tracto digestivo y ovipositor por medio

de métodos dependientes e independientes de cultivo (Allen et al., 1934; Hagen et

al., 1966; Tsiropoulos, 1976; Howard et al., 1985; Drew y Lloyd et al., 1987; Lauzon

et al., 1998; Peloquin et al., 2000; Marchini et al., 2002; Capuzzo et al., 2005; Behar

et al., 2005; 2008a; Lauzon et al., 2009; Wang et al., 2014; Morrow et al., 2015).

Todos estos trabajos coinciden en que las Enterobacterias son el grupo

bacteriano dominante. En algunos casos, se ha documentado que algunas de estas

17

bacterias están relacionadas con procesos digestivos y nutricionales como

aportación de aminoácidos, fijación de nitrógeno y digestión de algunos

polisacáridos (Behar et al., 2005; 2008b; Ben-Yosef et al, 2008), lo que favorece

aspectos básicos del desarrollo, fecundidad, reproducción, longevidad, adaptación

climática y selección de la planta huésped (Aluja et al., 2001; Ben-Yosef et al.,

2008).

Particularmente, en las moscas del género Anastrepha pocos son los

trabajos que se han enfocado en identificar los microorganismos asociados.

Algunos de ellos se han centrado a analizar el potencial de las bacterias y sus

metabolitos para el control biológico (Martínez et al., 1994; Kuzina et al., 2001). En

ambos casos se emplearon métodos dependientes de cultivo, encontrando que la

comunidad bacteriana del intestino de adultos de A. ludens estuvo integrada por

miembros de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Vibrionaceae,

Micrococcaceae, Deinococaceae y Bacillaceae, asi como por algunos géneros

como Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Serratia, Proteus y

Pseudomonas.

Otro estudio caracterizó la microbiota del intestino de pupas, larvas y adultos

de Anastrepha fraterculus, por medio de un método independiente de cultivo (PCR-

RFLP del gen 16S rRNA). Sus resultados mostraron que la comunidad bacteriana

estuvó compuesta por las Phyla Actinobacteria, Bacteroperoidetes, Firmicutes y

Proteobacteria, los cuales estuvieron representados por las familias

Streptococcaceae, Micrococaceae, Flavobacteriaceae, Comamonadaceae,

Moraxellaceae y Enterobacteraceae (Appel, 2013).

18

Finalmente, en nuestro grupo de trabajo Ventura-González (2015), llevó a

cabo la caracterización de la diversidad de bacterias presentes en el tracto digestivo

de larvas y adultos de cuatro especies del género Anastrepha (A. ludens, A.

serpentina, A. striata y A. obliqua) a traves de la pirosecuenciación del gen 16S

rRNA. Los resultados mostraron que la comunidad bacteriana del tracto digestivo

estuvo integrada por las Phyla Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria y

Deinococcus-Thermi. Además, se identificaron un conjunto de géneros bacterianos

comunes en las cuatro especies de las moscas de la fruta, entre los que se

encontraron a Escherichia, Citrobacter, Leclercia, Raoultella, Klebsiella, Yokenella,

Kluyvera y Propionibacterium. Adicionalmente, se encontraron diferencias entre las

comunidades bacterianas de larvas y adultos de la misma especie, así como entre

especies de mosca. La diversidad bacteriana en adultos fue mayor que en las

larvas, lo que sugiere que estas diferencias podrían estar influenciadas por los

hábitos alimentarios de los diferentes estadios de desarrollo.

Estos estudios coinciden en que la familia Enterobacteriaceae es el grupo de

bacterias dominante en las diferentes especies del género Anastrepha,

independientemente del estadio de desarrollo, huésped y localidad geográfica de

donde provienen estos insectos y que además existen poblaciones que solo han

sido reportadas en alguna especie de estos insectos. Por lo tanto, la identificación

recurrente de estos microorganismos podría sugerir que tienen capacidades

fisiológicas y metabólicas indispensables en el desarrollo de estas especies del

género Anastrepha.

19

En este sentido, el aislamiento de algunos de los miembros bacterianos

dominantes es fundamental para evaluar y explorar el papel ecológico que pueden

estar llevando a cabo las bacterias del tracto digestivo. Por lo tanto, el objetivo de

este trabajo fue aislar e identificar las bacterias del intestino de larvas en cuatro

especies del género Anastrepha.

20

3. Justificación

Se ha reportado que las interacciones simbióticas que han establecido los

microorganismos particularmente las bacterias con miembros de la familia

Teprhitidae son clave en diversos procesos de nutrición, digestión, destoxificación,

protección contra enemigos naturales, inmunidad y reproducción, los cuales

impactan en el desarrollo de estos insectos. Sin embargo, poco se ha explorado

sobre las interacciones simbióticas que se han establecido con las especies del

género Anastrepha, a pesar de que ocasionan grandes pérdidas económicas en el

sector de la fruticultura en México. Estudios realizados con métodos independientes

de cultivo de algunas especies de este género de la mosca de la fruta, evidencian

la presencia de un conjunto de géneros o especies bacterianas recurrentes y

abundantes en su intestino. Estos resultados sugieren que estas poblaciones

bacterianas podrían tener capacidades fisiológicas y metabólicas indispensables en

el desarrollo de estos insectos.

Por tal motivo, es importante llevar a cabo el aislamiento y la caracterización de las

bacterias más abundantes del canal alimentario de algunas especies del género

Anastrepha. Esto sentará las bases para establecer el papel ecológico que pueden

estar llevando a cabo estos microorganismos en este sistema.

21

4. Hipótesis

Si las larvas de Anastrepha ludens, Anastrepha obliqua, Anastrepha striata, y

Anastrepha serpentina tienen como hábitat familias de fruto muy específicas

durante gran parte de su desarrollo entonces se esperaría que:

a) La diversidad bacteriana está condicionada por el tipo de fruto que habitan,

mostrando diferencias en su composición y estructura

b) La diversidad bacteriana del tracto digestivo de estas moscas fuera semejante,

no importando el fruto donde se desarrollan.

22

5. Objetivo General.

Determinar la diversidad bacteriana del tracto digestivo de larvas de cuatro especies

del género Anastrepha.

5.1 Objetivos específicos.

Aislar, purificar y conservar los diferentes aislados bacterianos provenientes

del tracto digestivo de larvas de cuatro especies de Anastrepha.

Identificar taxonómicamente los aislados bacterianos a través de

herramientas moleculares.

Comparar la diversidad bacteriana de larvas de las cuatro especies de

Anastrepha.

23

6. Material y Métodos

6.1 Material biológico

Se colectaron larvas 3er instar de mosca de la fruta de las especies: A.

obliqua, A. ludens, A. striata y A. serpentina en la región del soconusco Chiapas

(15° 19’ N, 92° 44’ O) de marzo a junio de 2013. Las larvas fueron colectadas de 20

a 30 frutos infestados directamente en campo, A. obliqua de mango (Mangifera

indica), A. ludens de naranja (Citrus grandis y Citrus aurantium), A. striata de

guayaba (Psidium guajava) y A. serpentina de chicozapote (Manilkara achras).

Los frutos infestados se colocaron en bolsas de papel para su traslado al

laboratorio, en donde se realizó la revisión cuidadosa de cada fruto para extraer

larvas de 3er instar. Posteriormente, se realizó la identificación de cada especie,

mediante la observación de las claves taxonómicas (Anexo1), las cuales consideran

los siguientes caracteres: esclerotización de ganchos bucales,

espiráculos anteriores y posteriores, lóbulos anales y carinas bucales (Insuasty

2007, Hernández-Ortiz, 2008; Manual Técnico para la identificación de moscas

nativas de la fruta, SAGARPA-SENASICA 2012).

6.2 Aislamiento de comunidades bacterianas

La disección de muestras se realizó en condiciones de esterilidad. Las larvas

fueron desinfectadas superficialmente sumergiéndolas por 1 min en agua destilada

estéril, después 1 min en solución de detergentes (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1

24

mM; NaCl 10 mM; SDS 1%; Tritón X-100 2%) y finalmente 1 min en solución de

hipoclorito de sodio al 10%. Posteriormente, se enjuagaron con agua o PBS estéril.

Para determinar si el proceso de desinfección fue adecuado, se tomaron alícuotas

de 100 µL del agua de lavado y se inocularon en placas de Agar soya tripticaseína

(TSA, Difco, USA) y se incubaron de 24 a 48 h a 28 ºC.

El tubo digestivo de las larvas se extrajo haciendo un corte longitudinal a lo largo

del cuerpo, una vez localizado el sistema digestivo se extrajo y fue colocado en un

tubo Epperndof 1.5 mL que contenía 1000 µL de solución reguladora de fosfatos

(PBS,10 mM a pH 7.2) estéril. Para cada especie de mosca de la fruta se utilizaron

un conjunto de 30 tractos digestivo por separado para el aislamiento de las bacterias

y un solo tracto para la cuantificación de las comunidades bacterianas. Todos los

tractos digestivos fueron macerados con ayuda de pistilos de plástico estériles.

Para el aislamiento y cuantificación de las comunidades bacterianas del tracto

digestivo de cada especie de mosca se realizaron diluciones seriadas (10-3 a 10-5).

A partir de cada dilución se sembraron 100 µL del macerado mediante la técnica de

dispersión en superficie en medio TSA por duplicado. Las placas fueron incubadas

a 28ºC de 24 a 48 h y se revisó el crecimiento cada 24 h.

La cuantificación de las comunidades bacterianas del tracto digestivo de cada

especie de mosca se reportó en UFC/intestino, para ello se seleccionó la dilución

que mostrará un crecimiento de bacterias entre 30 a 300 colonias. Por otro lado, se

seleccionaron 15 a 30 colonias obtenidas del macerado de 30 intestinos de acuerdo

a sus características morfológicas. Una vez seleccionada la colonia se realizaron

25

entre tres y cuatro resiembras en TSA, hasta la obtención de cultivos puros, los

cuales fueron conservados en agua y almacenados a 4ºC y en glicerol a -70ºC hasta

su utilización en análisis posteriores.

6.3 Determinación Taxonómica

6.3.1 Aislamiento de DNA bacteriano

Para la extracción de DNA se utilizó la técnica descrita por Hoffman y Winston

(1987) modificada. Para ello, a partir de un cultivo puro de cada uno de los aislados,

se crecieron en 20 mL de caldo nutritivo (Difco, USA) e incubados a 28ºC de 24 a

48 h con agitación (120 rpm). Transcurrido el tiempo, se tomó una alícuota de 2 mL,

se transfirió a un tubo Eppendorf estéril y se centrifugó a 8000 rpm por 5 min para

obtener el paquete celular. Una vez obtenido el paquete celular se adicionaron 200

µL de la solución de lisis (Tris-HCl 10mM, pH 8.0; EDTA 1 mM; NaCl 10 mM; SDS

1% y Tritón X-100 2%) para un rompimiento químico y perlas de vidrio para ejercer

un rompimiento mecánico aplicando agitación por 2 min en un vórtex. Después, se

añadieron 500 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), esta mezcla se agitó

nuevamente por 3 min en un vórtex. Se realizó un choque térmico dejando reposar

10 min en hielo y posteriormente se incubó a 65°C por 30 min. Al término de la

incubación se centrifugó a 14,000 rpm por 5 min. El sobrenadante se recolectó en

un tubo nuevo adicionando 1 mL de isopropanol y se incubó a -20 °C por 20 min,

transcurrido el tiempo se centrifugó a 10,000 rpm por 10 min, al finalizar este paso

se eliminó el sobrenadante y la pastilla se lavó con 500 µL de etanol al 70%, seguido

26

de una centrifugación a 14,000 rpm por 5 min, decantando el sobrenadante y

dejando evaporar a 45°C para eliminar las trazas de alcohol, la pastilla fue

resuspendida en 30 µL de agua inyectable .

La integridad, concentración y pureza del DNA se visualizó en un gel de

agarosa al 1%. El gel se tiñó con bromuro de etidio 0.2% y se observó en un

fotodocumentador AlphaImager EP (Alpha Innotech).

6.3.2 Amplificación del gen 16S rRNA de los aislados bacterianos

Se amplificó el gen 16S rRNA empleando los iniciadores universales 27F (5’

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’) y 1492R (5’ TACGGYTACCTTGTTACGACTT

3’) (Line et. al, 1985). La mezcla de reacción se preparó a un volumen final de 25

µL, se le agregaron 13.8 µL de agua inyectable, 2.0 µL de buffer, 2.0 µL de MgCl2,

2.0 µL de dNTPs, 1 µL de cada uno de los iniciadores (27F y 1492R), 0.2 µl Taq

polimerasa (Thermo Scientific, Walthman, MA) y 1 µL de DNA problema (≈50 ng/

µL). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial

de 94°C por 5 min, seguida de 30 ciclos de 94°C por 1 min; 57°C por 1 min, 72°C

por 1 min y una extensión final de 72°C por 5 min (Ventura-González, 2015). Los

productos de PCR se purificaron mediante el kit de purificación GeneJET PCR

(Thermo Scientific,Walthman, MA), utilizando las especificaciones establecidas por

el fabricante. Los amplicones purificados fueron enviados a secuenciar en ambas

direcciones a Macrogen, Inc (DNA Sequencing Service, Seúl, Corea).

27

6.3.3 Análisis de las secuencias

Se obtuvieron las secuencias consenso del gen 16S rRNA de cada aislado y

se editaron manualmente en el programa Seaview (Galtier,1996). Posteriormente,

a las secuencias consenso se les realizó un BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool) en la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Se descargaron las secuencias de referencias que mostraron un mayor porcentaje

de identidad con las secuencias problema. Se realizó un alineamiento múltiple con

estas secuencias en el programa Clustal X v.1.8 (Larkin et al., 2007) y

posteriormente, se homogenizó la longitud de estas secuencias con el programa

Seaview v.2.01 (Galtier, 1996). Se construyó un árbol filogenético por método de

Máxima Verosimilitud con el programa PhyML (Guindon y Gascuel, 2003), el mejor

modelo de sustitución nucleotídica se estimó mediante el programa JModelTest

(Posada, 2008), y la robustez de los árboles se valoró por medio de la prueba del

Bootstrap después de 100 pseudoréplicas. Xenorabdus nematophila fue utilizada

como grupo externo.

Para realizar la asignación taxonómica se consideraron dos criterios, uno fue

el posicionamiento filogenético y el segundo el grado de similitud siguiendo los

criterios de Roselló-Mora (2001) estimado mediante el programa MatGAT

(Campanella et al., 2003).

28

6.4 Comparación de las comunidades bacterianas

La comparación entre las comunidades microbianas de larvas de los cuatros

especies de la mosca se realizó mediante un análisis de coordenadas principales

PCoA (Gower, 1981), empleando tanto una matriz de riqueza y abundancia de las

especies identificadas para cada una de las especies de la mosca de la fruta y una

matriz de similitud fue construida mediante el índice de Jaccard.

29

7. Resultados

7.1 Aislamiento de comunidades bacterianas

En la tabla 1 se muestran los valores de cuenta viable de un intestino de cada

una de las especies de la mosca de fruta. A. striata mostró la mayor densidad

bacteriana con 9.4x105 UFC/intestino, mientras que las tres especies restantes

mostraron valores semejantes que oscilaron entre 3.0x103 para A. obliqua a

3.45x103 UFC/intestino para A. ludens.

Tabla 1. Abundancia de bacterias en el tracto de larvas del 3er instar de las cuatro especies del género Anastrepha.

Especie de mosca UFC/intestino Núm de aislados

Anastrepha ludens 3.45x103 11

Anastrepha obliqua 3.0x103 26

Anastrepha serpentina 3.3x103 14

Anastrepha striata 9.4x105 22

El número total de aislados bacterianos fue de 73, los cuales variaron

dependiendo de la especie de la mosca de la cual se aislaron. La mayor cantidad

de aislados bacterianos fueron obtenidos de A. obliqua con 26 aislados y de A.

Striata con 22, mientras que de A. ludens y A. serpentina fueron recuperados un

menor número de aislados 11 y 14 aislados, respectivamente (Tabla 2).

Del total de los aislados se identificaron tres morfologías coloniales

características de los géneros Enterobacer (A), Escherichia (B) y Bacillus (C) (Tabla

2 y Figura 5).

30

Tabla 2. Morfología colonial predominante de los aislados bacterianos del tracto digestivo de la mosca de la fruta

Característica Colonia A Colonia B Colonia C

Forma Circular Circular Irregular

Tamaño 5mm 3mm 3mm

Color Beige Blanco amarillento Blanco

borde Entero Entero Lobulado

apariencia Húmeda Húmeda Seca

superficie Lisa Lisa Rugosa

Elevación Convexa Plana Papilada

Luz Reflejada Brillante Brillante Opaca

Luz Transmitida Opaca Opaca Opaca

Pigmento No presenta No presenta No presenta

Morfología microscópica

Bacilos cortos Gram Negativos

Bacilos cortos Gram negativos

Bacilos largos Gram positivos

7.2 Aislamiento de DNA cromosómico y amplificación del gen16s rRNA

El DNA de todos los aislados fue de buena calidad e integridad (Figura 6),

mientras que los amplicones del gen 16s rRNA mostraron el tamaño esperado de

aproximadamente 1500 pb como se observa en la electroforesis realizada en

agarosa al 1%(Figura 7).

A.

B. C.

Figura 4. Morfologías coloniales de los aislados obtenidos de larvas de Anastrepha. A. Enterobacter

sp. B Escherichia sp y C. Bacillus sp.

31

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1%. Carril 1. Marcador de peso molecular 1kb; carriles

2-10 Muestras de DNA de algunos aislados bacterianos de Anastrepha obliqua y A.ludens.

Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1%. Carril 1. Marcador de peso molecular 100pb,

carril 2-12 productos de PCR del gen 16s rRNA de los aislados 1-11 de Anastrepha obliqua

7.3 Asignación taxonómica

Se obtuvieron un total de 73 secuencias de las cuatro especies de la mosca

de fruta. En la topología fue evidente la formación de dos grupos; en el primero se

<1500pb

32

agruparon la mayoría de los aislados bacterianos (72 aislados) con miembros de la

familia Enterobacteriaceae, y en el segundo integrado solo por el aislado ALD11

que se asoció a las especies de género Bacillus. En el primer grupo se formaron

cinco subgrupos, el primero conformado por las secuencias de referencia de

especies del género Providencia y 6 aislados bacterianos provenientes de A. striata,

A. striata y A. obliqua; un segundo subgrupo constituido por 4 aislados de A. ludens

y las secuencias de referencia de las especies del género Kluyvera; el aislado

AOBL11 se asoció únicamente con la secuencia de Enterobacter aerogenes

integrando el tercer subgrupo; el aislado AOBL5 con secuencias de las especies del

género Citrobacter formo el cuatro grupos, ambos aislados obtenidos de A. Obliqua;

el quinto grupo se integró por 45 aislados provenientes de las cuatros especies de

Anastrepha, las cuales se asociaron a las especies del género Enterobacter y un

total de 16 aislados que se agruparon solo con la especie Escherichia coli. Los

grupos y todos los subgrupos mostraron un soporte bootstrap > 50% (Figura 8).

Con base en el número de taxones terminales, los resultados indican que la

comunidad bacteriana del tracto digestivo de las cuatro especies Anatrepha estuvo

integrada por 13 especies asociados a los géneros Bacillus, Citrobacter,

Enterobacter, Escherichia, Kluvera y Providencia. Todos los aislados mostraron

valores de similitud >98% con alguna secuencia de referencia específica,

permitiendo identificar hasta especie a excepción del aislado AST17, el cual se

identificó hasta género, ya que mostró 98.8% de similitud con dos especies

Enterobacter hormaechei (HG421009) y Enterobacter asburiae (KC568144), por lo

que se asignó como Enterobacter sp. (Tabla 3).

33

Figura 7. Árbol filogenético construido con las secuencias del gen 16S rRNA, mediante el método de

Máxima Verosimilitud, empleando el modelo de sustitución nucleotídica GTR+I+G (In= 4942.3554).

Los valores en las ramas corresponden a los valores del Bootstrap, solo se muestran los que son

>50%. Grupo externo Xenorabdus nematophila.

34

Tabla 3. Porcentaje de similitud y asignación taxonómica de los diferentes aislados del

tracto digestivo de las cuatro especies del género Anastrepha

Especie de larva

Aislado Especie relacionada en el Gen Bank Porcentaje de similitud

Asignación taxonómica

Anastrepha ludens

ALD1, ALD8, ALD9, ALD 12

Kluyvera georgiana O248831 98.1 Kluyvera georgiana

ALD2, ALD4, ALD7 Enterobacter hormaechei HG421009 98.7-99.1 Enterobacter hormaechei

ALD3, ALD6 Enterobacter asburiae KC568144 98.3-99 Enterobacter asburiae

ALD11 Bacillus licheniformis HG800002 98.6 Bacillus licheniformis

Anastrepha obliqua

AOBL1, AOBL2 AOBL3, AOBL4,

AOBL6, AOBL11, AOBL12 AOBL13 AOBL14 AOBL15 AOBL16 AOBL17 AOBL19 AOBL20

AOB23

Escherichia coli HQ220158

97.2-98.9

Escherichia coli

AOBL5 AOBL7 AOBL8 Citrobacter werkmanii AF025373 97.7-99.2 Citrobacter werkmani

AOBL9 AOBL10 AOBL31 AOB32

Enterobacter asburiae KC568144 98.9-99.5 Enterobacter asburiae

Enterobacter aerogenes AB004750 98.9 Enterobacter aerogenes

AOBL18 Enterobacter ludwigi AJ853891 98.7 Enterobacter ludwiggi

AOBL21 AOBL24 Enterobacter hormaechei HG421009 98.9-99 Enterobacter hormaechei

AOB29 Providencia rettgeri JN644501 99.6 Providencia rettgeri

Anastrepha serpentina

ASR1 ASR8 Enterobacter hormaechei HG421009 99.4 Enterobacter hormaechei

ASR2 ASR3 ASR4 ASR5 ASR11 ASR12

ASR14

Enterobacter ludwigi AJ853891 99.3-99.9 Enterobacter ludwigii

ASR6 ASR8 ASR9 ASR13

Providencia rettgeri JN644501 98.7-99.4 Providencia rettgeri

ASR10 Escherichia coli HQ220158 99.4 Escherichia coli

Anastrepha striata

AST3, AST5, AST10, AST13, AST14,AST16,

AST21, AST22

Enterobacter asburiae KC568144

98.2-99.2 Enterobacter asburiae

AST1, AST2, AST6, AST15, AST18, AST20

Enterobacter cloacae HQ65184 98.7-99.7 Enterobacter cloacae

AST7, AST11 Enterobacter hormaechei HG421009 98.9-99 Enterobacter hormaechei

AST8 Enterobacter ludwigi AJ853891 98.9 Enterobacter ludwigii

AST17 Enterobacter hormaechei HG421009, Enterobacter asburiae KC568144

98.8 Enterobacter sp.

AST23 Escherichia coli HQ220158 97.7 Escherichia coli

AST12 Citrobacter murlinae AF025369 98.6 Citrobacter murlinae

AST4, AST19 Providencia rettgeri JN644501 99-99.6 Providencia rettgeri

35

7.4 Comparación de la comunidad bacteriana de las especies de Anastrepha

Las primeras tres coordenadas del análisis de componentes principales

PCoA, explicaron el 100% de la variación observada. El PCoA mostró diferencias

entre las comunidades bacteriana de A. ludens y A. striata; por el contrario, se

observó que las comunidades bacterianas de A. obliqua y A. serpentina fueron

similares (Figura 9).

Enterobacter hormaechei fue la única especie bacteriana identificada en el

tracto digestivo de las cuatro especies de larva, el resto de ellas se compartieron

entre las diferentes especies de mosca de la fruta. Por ejemplo, Providencia rettgeri,

Escherichia coli y Enterobacter ludwiggi fueron aisladas de A. serpentina, A. striata

y A. obliqua; y Enterobacter asburiae de A. ludens, A. striata y A. obliqua. Por el

contrario, algunas bacterias fueron exclusivas de una especie de mosca, como:

Kluyvera georgiana y Bacillus liqueniformis asiladas de A. ludens;. Enterobacter

cloacae y Citrobacter murlinae de A. striata; y Citrobacter werkmani, Enterobacter

aerogenes y Enterobacter sp. de A. obliqua (Figura 8 y Tabla 3). Por último, se

observó que la comunidad bacteriana de A. serpentina fue la misma que la de A.

obliqua.

36

Figura 8. Análisis de componentes principales (PCoA) de las comunidades aisladas del tracto

digestivo de larvas de las cuatro especies de larvas en estudio A. ludens, A. obliqua, A. serpentina y

A. striata.

37

8. Discusión

Las moscas de la fruta del género Anastrepha (Schiner) son un grupo de insectos

de importancia agrícola y económica en México, por el número de huéspedes que

infestan (SAGARPA-Senasica, 2016). Se ha documentado, en otros géneros de la

mosca de la familia Tephritidae, que las bacterias presentes en el tracto digestivo

participan o coadyuvan en procesos digestivos, de reproducción y desintoxicación

de compuestos endógenos y exógenos (Ben-Yosef 2014, Bourtiz et al 2015;

Hadapad, 2015), y algunos otros trabajos se han enfocado al control de estas

moscas. Este trabajo tuvo como objetivo la caracterización de la comunidad

bacteriana del canal alimentario de larvas de cuatro especies del género Anastrepha

empleando métodos dependientes de cultivo.

Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que densidad de la

comunidad bacteriana de A. ludens, A. obliqua y A. serpentina (3.0x103a 3.45x103

UFC/intestino) fue baja comparada con Ceratitis capitata (8.1x105 UFC) (Aharon,

2013), y semejante con A. striata (9.4x105UFC/intestino). Estas diferencias en la

densidad bacteriana podrían estar asociados con la alimentación de éstas moscas,

ya que todas provienen de un huésped diferente como guayaba, naranja, mango y

chicozapote cuya composición química en cuanto a la cantidad de carbohidratos,

proteínas, grasas, minerales y vitaminas es diferente (anexo 2). Estas

características seguramente condicionan el tipo y la abundancia de

microorganismos que estas moscas de la fruta pudieran mantener en el tracto

digestivo.

38

Además, se ha documentado que cambios en la densidad de la microbiota

intestinal de los insectos varía dependiendo de diversos factores como el pH,

potencial redox, estructura y fisiología del canal alimentario, huésped y hábitos

alimentarios (Engel et al 2013). Por ejemplo, una abeja adulta tiene 109

bacterias/tracto mientras que un saltamontes 106 UFC/tracto y en las moscas de

Drosophila melanogaster se han reportado alrededor de 105 células bacterianas por

tracto, lo que sugiere que el microambiente del canal alimentario de los insectos

condiciona la presencia de ciertos microorganismos (Engel et al., 2013).

Nuestros resultados mostraron que la comunidad bacteriana de las cuatro

especies de Anastrepha estuvo integrada en su mayoría por miembros de la familia

Enterobacteriaceae, los cual coincide con lo reportado previamente en otros

miembros de la familia Tephritidae (Lauzon, 2003; Behar et al., 2008; Wang et

al.,2011). Asimismo, se ha reportado la presencia de los géneros Enterobacter,

Providencia, Kluyvera, Escherichia, y Citrobacter, en el canal digestivo de larvas,

adultos y huevos de moscas de fruta de los géneros Anasthepha, Batrocera,

Ceratitis y Dacus empleando métodos dependientes e independientes de cultivo.

(Fitt y O´brien, 1985; Howard y Bush, 1989; Martínez et al., 1994; Kuzina et al.,

2001; Marchini, 2001; Behar et al., 2005; Ami et al., 2010; Wang et al., 2012; Morrow

et al., 2015; Ventura-González, 2015). Estas evidencias sugieren que estos géneros

son miembros característicos de la mosca de la fruta, los cuales pueden variar en

con respecto a su dominancia y abundancia.

La presencia de la familia Enterobacteriaceae como un simbionte abundante

en el canal alimentario de la mosca de fruta, puede explicarse debido a que estos

miembros bacterianos tienen una amplia distribución en agua, suelo, plantas y

39

animales (Torsvik 1996, Nannipieri 2003). Se ha planteado la hipótesis de que las

moscas de la fruta adquieren a sus microorganismos simbiontes mediante

trasferencia horizontal a través de la ingesta de alimento, ya que los adultos poseen

la capacidad de alimentarse de diferentes sustratos como son una amplia variedad

de frutos, suelo, agua y mieles de flores de donde adquieren los microorganismos

(Drew and Lloyd, 1987; Lauzon, 1991; Prokopy et al., 1993).

Otra hipótesis sugiere que las moscas de la fruta adquieren a sus bacterias

asociadas, particularmente a los miembros de la familia Enterobacteriaceae, por

transferencia vertical. Se ha documentado que algunas bacterias son capaces de

pasar del ovipositor de la hembra hacia el huevecillo al momento de ser depositado

en el fruto. De tal manera, que conforme transcurre el desarrollo de la larva y durante

su alimentación dentro de la fruta, las bacterias se localizan en los ciegos

intestinales (Capuzzo et al., 2005; Lauzon et al., 2009).

Ambas hipótesis tienen evidencia que las sustentan, ya que se ha

demostrado que especies de mosca de la fruta como B. dorsalis, B. oleae y C.

capitata adquieren algunas de las poblaciones bacterianas tanto por transferencia

vertical como horizontal (Behar et al., 2008b; Shi, 2012; Wang, 2014; Andongma et

al., 2015). Posiblemente, la comunidad bacteriana de las especies Anastrepha

pueda ser adquirida de manera semejante, sin embargo, es necesario realizar un

trabajo sistemático y exprofeso en la identificación de los microorganismos a través

de su ciclo de vida (Ventura-González, 2015).

Los resultados del estudio muestran que la abundancia de miembros del

género Bacillus es en las moscas de la fruta estudiadas es baja, ya que solo se

recuperó un asilado de B. liqueniformis de A. ludens. Este resultado coincide con

40

otros estudios, quienes también asilaron en baja frecuencia a miembros del género

Bacillus del mismo huésped (Kuzina et al., 2001; Ventura-González, 2015).

Igualmente, en otros estudios llevados a cabo con dípteros, las especies del género

Bacillus han sido reportados como miembros escasos o poco frecuentes (Rajopal,

2009; He, 2013, Azambuja et al., 2004, Behar, 2005 ; Wang et al., 2012 ).

Los resultados de este estudio muestran que existen diferencias en la

composición de las comunidades bacterianas de larvas de Anastrepha, con

excepción de A. serpentina quien compartió el 100% de su comunidad bacteriana

con A. obliqua. Ventura-González (2015) reportó que las larvas de éstas dos

especies presentan diferencias significativas en su diversidad bacteriana

empleando métodos independientes de cultivo. La discrepancia observada en estos

dos estudios puede ser explicada por la metodología empleada, ya que los métodos

dependientes de cultivo, a diferencia de los independientes, pueden condicionar el

crecimiento de ciertas poblaciones bacterianas por el medio de cultivo empleado

(nutrientes), pH, oxígeno, temperatura y otros factores, que favorecieron el

aislamiento de las bacterias dominantes o abundantes del canal alimentario de A.

serpentina. En el mismo, sentido, Amann et al. (1995) reportan que alrededor del

99% de los microorganismos presentes en muestras ambientales, plantas y

animales no pueden ser cultivadas, debido a las condiciones de crecimiento e

incubación que experimentan muchas bacterias no puede ser igualada en el

laboratorio. Por lo que las técnicas de biología molecular permiten reconocer un

mayor número de especies.

La única especie bacteriana compartida entre las cuatro especies de

Anastrepha fue Enterobacter hormaechei, la cual ha sido reportada como simbionte

41

en otros insectos (Savio, 2011), endófita (Martínez-Rodríguez et al., 2015) y en

hábitats de suelo rizosférico (Yadav et al., 2014). Entre las funciones que se

conocen de esta especies destacan, la capacidad de ser promotoras del crecimiento

de plantas (PGP) y solubilizadoras de fosfato (Mamta et al., 2012; Thokchom et al.,

2013; Martínez-Rodríguez et al., 2014; Yadav et al., 2014). Sin embargo, esta

misma especie ha sido reportada como una bacteria patógena en el humano

(Hurrell, 2009; Krzymińska, 2010). Desafortunadamente, no se ha explorado la

posible función que pudiera llevar a cabo en el intestino de la mosca de la fruta; sin

embargo su presencia en las cuatro especies estudiadas sugiere que podría estar

involucrada en procesos fisiológicos y metabólicos importantes.

Algunos estudios han documentado que algunas especies pertenecientes a

la familia Enterobacteriaceae presentes en el canal alimentario de C. capitata,

Bactrocera spp. y Ragolethis spp, juegan un papel importante en varios aspectos

biológicos y ecológicos de su huésped. Se ha demostrado que estos

microorganismos tienen la capacidad de fijar nitrógeno, hidrolizar pectina y

proteínas, aportar aminoácidos esenciales, degradar insecticidas e incrementan la

fecundidad (Fitt y O´brien, 1985; Howard y Bush, 1989; Lauzon et al., 2003; Behar,

2005; Lauzon et al., 2009; Aharon, et al 2013; Ben-Yosef et al., 2014; Ben-Yosef et

al., 2015). Asimismo, se ha determinado que algunos microorganismos como

Enterobacter sp y Providencia rettgeri impactan en la longevidad de su huésped,

disminuyendo el tiempo desarrollo entre las diferentes etapas del ciclo de vida

(Behar et al 2008a; Bourtziz et al 2015). También, se ha reportado que las bacterias

de los género Klebsiella, Citrobacter y Providencia del intestino de B. cucurbitae

42

tienen la capacidad de producir sustancias atrayentes particularmente para las

hembras (Hadapad et al., 2016). En este sentido, el haber identificado algunos de

estos géneros bacterianos en el tracto digestivo de las especies de Anastrepha

sugiere que funciones similares pudieran estar llevando a cabo en estos insectos.

Hasta el momento, la mayoría de los estudios se han centrado en investigar

el papel de las enterobacterias, y pocos se han enfocado a analizar el papel

funcional que pueden tener las especies del género Bacillus. Recientemente,

Hadapad et al., (2016) reportaron que el sobrenadante de los cultivos de Bacillus

cereus aislado de B. curcurbitae contiene sustancias químicas que ejercen un efecto

atrayente sobre machos y hembras de diferentes especies de Bactrocera.

Por último, este trabajo sienta las bases para explorar en futuro las funciones

que pueden tener estas bacterias simbiontes presentes en el tracto digestivo de las

moscas de frutas del género Anastrepha, lo cual permitirá conocer más acerca de

la biología de estos insectos, si consideramos que el conocimiento hasta este

momento es limitado. Por el contario, se esperaría que las larvas por desarrollarse

dentro del fruto, su alimentación giraría en torno al huésped que colonizó, lo que

permitiría asegurar que la microbiota adquirida proviniera exclusivamente del fruto;

sin embargo, una vez que el fruto cae al suelo inicia el proceso de putrefacción y

colonización por otros insectos, lo que favorece el crecimiento de microorganismos

no propios del fruto que la larva adquiere al alimentarse.

43

9. Conclusiones

1. La comunidad bacteriana del tracto digestivo de larvas de especies de

Anastrepha está integrada por las familias Enterobacteriaceae y Bacilliaceae.

2. La familia Enterobacteriaceae fue el grupo más abundante del tracto

digestivo de A. ludens, A. obliqua , A.serpentina y A. striata

3. Enterobacter hormaechei fue la única especie presente en el tracto digestivo

de las cuatro especies de la mosca de la fruta estudiadas.

4. La comunidad bacteriana del canal alimentario de A. ludens, A. obliqua y A.

striata mostraron diferencias en la composición y abundancia de sus

poblaciones bacterianas.

5. La diversidad bacteriana de cada comunidad pudo estar condicionada por los

hábitos alimenticios de cada especie de larva.

44

10. Bibliografía

.

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Anexo 1. Claves taxonómicas de identificación para larvas del género Anastrepha

La longitud de las larvasvaría de 2 a 15 mm, son de forma vermiforme y de color

blanco a amarillento (Boscán de Martínez, 1992).

Características de larvas de A. ludens: lóbulos anales bífidos, Numero de dígitos 15

a 21, Número de carinas bucales de 12 a 16. (SAGARPA-Senasica, 2010)

Características de larvas de A. obliqua. Lóbulos anales enteros. Número de dígitos

de 12-15. Numero de Carinas Bucales 7-9. (SAGARPA-Senasica, 2010)

53

Características de larvas de A. serpentina: Lóbulos anales bífidos. Numero de

dígitos de 16 a 19. Numero de carinas bucales de 14 a 18. (SAGARPA-Senasica,

2010)

Características de larvas de A. striata: Lóbulos anales semibífidos. Número de

dígitos de 11-17. Numero de carinas bucales de 14 a 18 (SAGARPA-Senasica,

2010)

54

Anexo 2. Cantidad de nutrientes en 100 g de los frutos huéspedes de Anastrepha sp.

Nutriente Guayaba Naranja Mango Zapote

Carbohidratos (g) 5.8 8.9 13.4 18.5

Proteínas (g) 0.88 0.87 0.6 0.8

Grasas (g) 0.5 0.2 0.19 0.2

Calcio (mg) 17 41 20 22

Fósforo 31 20 22 15

Hierro 0.75 - 1.2 1.5

Yodo -- 2.1 - -

Magnesio 13 15.2 - -

Zinc 0.56 0.15 0.1 -

Sodio (mg) 4 1.4 2 8

Potasio (mg) 290 165 150 284

Vitamina B1 (g) 0.03 0.08 0.03 0.03

Vitamina B2 0.04 0.04 0.05 0.09

Vitamina B3 (mg) 1.1 0.2 0.4 0.63

Vitamina B6 (mg) 0.12 0-02 0.08 0.06

Vitamina C (mg) 273 5.2 44 8.5

Vitamina A (mg) 122 2.7 67 44

Vitamina E (mg) 1.1 0.89 1.8 1.0

Aranceta 2006