MUERTE CELULAR MEDIADA POR RECEPTORES: ROL DE LAS HORMONAS...

INTRODUCCIÓN

El cáncer en Chile constituye la segunda causa de muerte en la población (~22%), siendo superado sólo por las enfermedades cardiovasculares. Los cánceres de endometrio y ovario, considerados como dependientes de hormonas esteroidales ováricas son causa de aproximadamente 500 muertes anuales, lo que corresponde a un 5 a 7% de todas las muertes por cánceres que afectan a la mujer (1). El aumento en la expectativa de vida y los cambios en la distribución etaria de la población chilena hace presumir que la incidencia de ambos cánceres aumentará en los próximos años y así también el número de muertes esperables (1). Durante las últimas tres décadas, se han hecho avances importantes en el tratamiento de estas entidades. En la actualidad, es ampliamente aceptado que la cirugía, la radioterapia, la quimioterapia o la combinación de éstas, tienen un impacto importante en el control y cura de la enfermedad cuando se diagnostica en etapa precoz. Diferente escenario es el de pacientes en etapa avanzada en donde, a pesar de modalidades combinadas de tratamiento, la mortalidad por enfermedad se mantiene elevada. Esta condición se presenta en 1 de cada 4

pacientes con cáncer de endometrio y en 3 de cada 4 casos de cáncer de ovario y la sobrevida a 5 años no supera el 10 a 20% y el 40%, respectivamente (2). A fin de encontrar nuevas terapias que mejoren los resultados hasta ahora alcanzados, los esfuerzos se han centrado en entender mejor los mecanismos que promueven y controlan el proceso de carcinogénesis. Del conocimiento que se obtenga sobre la célula cancerosa será posible identificar blancos moleculares para el desarrollo de nuevas terapias más efectivas e idealmente más selectivas en tratar el cáncer.

El presente artículo pretende resumir nuestro trabajo en pos de entender mejor las variables involucradas en la carcinogénesis del endometrio y ovario con especial énfasis en el rol de los defectos de la apoptosis. Tratándose de neoplasias consideradas hormonodependientes, ha sido de nuestro interés, el determinar como las hormonas pueden influir en dicha apoptosis defectuosa. Creemos que un blanco molecular en la cadena de la apoptosis, susceptible de modularse mediante hormonas, sería la familia de los receptores de muerte celular.

A fin de facilitar la lectura del manuscrito lo hemos dividido en cuatro secciones. La primera versa sobre que es la apoptosis y

su rol en la enfermedades, dentro de ellas el cáncer. La segunda parte se refiere a los mecanismos que controlan la apoptosis. La tercera parte aborda las alteraciones en el balance proliferación/apoptosis que ocurren en los cánceres ginecológicos. La última parte se refiere al rol de las hormonas esteroidales ováricas en cáncer de endometrio y ovario y su potencial efecto sobre la cascada apoptótica gatillada por receptores de muerte.

APOPTOSIS Y CÁNCER

Desde principios del siglo XX numerosos reportes fueron hechos sobre la existencia de una forma particular de muerte celular en ausencia de inflamación. No fue sino hasta la década de los setenta cuando se reconoció que las células sufren un proceso fisiológico de muerte in vivo caracterizado por ausencia de inflamación, contracción celular, irregularidad de la membrana citoplasmática, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear (3). Este proceso fue llamado apoptosis. Estudios posteriores indicaron que las células tumorales presentaban defectos en la apoptosis. De hecho, la pérdida del recambio celular natural inducido por apoptosis es considerado uno de los

1) Profesor Auxiliar. Departamento de Obstetricia y Ginecología

2) Investigador Asociado. Departamento de Obstetricia y Ginecología

3) Alumno del Programa de Doctorado. Depto. Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Biológicas

4) Investigador Asociado. Laboratorio de Hemostasia, Depto. Hematología y Oncología

5) Instructor Asociado. Departamento de Anatomía Patológica

6) Profesor Auxiliar . Depto. Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Biológicas

7) Laboratory of Cellular and Molecular Biology. Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EEUU

Financiamiento: FONDECYT: 1050744 y 1020715

Correspondencia : [email protected]

MUERTE CELULAR MEDIADA POR RECEPTORES: ROL DE LAS HORMONAS ESTEROIDALES OVÁRICAS EN LA APOPTOSIS

INDUCIDA POR EL LIGANDO “TRAIL” EN CÁNCERES GINECOLÓGICOS.

Mauricio Cuello F.(1), Sumie Kato C.(2), Anil Sadarangani K.(3), Claudia Saez S.(4), Roger Gejman E.(5), Gareth Owen(6), Stanley Lipkowitz (7)

BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE VOL. 31 Nº1 2006

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elementos centrales en la carcinogénesis (4). Con la caracterización de este fenómeno, el cáncer pasó de ser una enfermedad con alteraciones de la proliferación a una con desbalance entre proliferación y apoptosis. En los años siguientes se caracterizaron los componentes de la red que controla el proceso de apoptosis, identificándose las rutas que modulan la muerte celular. En la actualidad se sabe que alteraciones en este proceso no sólo se presentan en cáncer sino en una serie de otras enfermedades que afectan al ser humano (ej. enfermedades neurodegenerativas, autoinmunes, del desarrollo embrionario, daño isquémico, etc) (5). En el cáncer los defectos de la apoptosis favorecen la proliferación y crecimiento sin control que le caracteriza. Por contraste, en las enfermedades neurodegenrativas, la activación indebida de la cascada apoptótica conduce a la muerte prematura de las neuronas. Así, defectos en la apoptosis tanto de activación como de su inhibición o no ocurrencia son determinantes centrales de múltiples enfermedades.

A fines de los años noventa comenzaron a develarse los mecanismos moleculares que regulan la apoptosis. Esto motivó a diferentes grupos de investigadores a modular las vías de la apoptosis como una nueva estrategia terapéutica contra el cáncer mediante la restauración o la estimulación de la apoptosis. (6)

MECANISMOS MOLECULARES DE LA APOPTOSIS

Una red de señales de traducción celular controla en forma precisa el proceso de apoptosis (ver Figura nº 1). Los reguladores de la apoptosis pueden dividirse en forma amplia en tres categorías: inductores, efectores y ejecutores. Dentro de los

inductores de apoptosis están el retiro de factores de sobrevida como son las citoquinas o los factores de crecimiento, la exposición a agonistas de los receptores de muerte celular (tales como FAS/CD95L y el factor de necrosis tumoral) o la exposición a agentes genotóxicos tales como radiación, luz ultravioleta y quimioterapia. Los inductores son agentes o condiciones que gatillan los efectores (‘dan la orden’). Los efectores son las cascadas intracelulares que trasmiten la señal de muerte (‘buscan a quien debe cumplir la orden’), y los ejecutores son los eventos intracelulares al final de la vía que causan la apoptosis (‘ejecutan la orden’).

La inducción de apoptosis ocurriría a través de al menos dos rutas separadas y paralelas. Una de ellas es dependiente de la mitocondria y es modulada por la liberación de proteínas pro-apoptóticas desde ese organelo al citoplasma. Esta ruta es comúnmente referida como la “vía intrínseca” debido a que son moléculas internas las que generalmente

la activan. Agentes genotóxicos como quimioterapia y radiación determinan una respuesta de estrés celular que induce apoptosis a través de esta vía (7). La otra ruta conocida como la “vía extrínseca” involucra la activación de la cascada apoptótica a través de receptores en la membrana en respuesta a señales (ligandos) extracelulares (5). Inductores de esta vía son los miembros de la familia del factor de necrosis tumoral de receptores de muerte celular (8). Una vez activado el receptor se inicia la fase ejecutora intracelular. Durante dicha fase efectora, la señal apoptótica puede ser inhibida y la célula sobrevivir, o ser transmitida pasado un punto llamado ‘sin retorno’ en la cual la célula indefectiblemente va a morir. Esta fase efectora es regulada a diferentes niveles. La liberación mitocondrial de citocromo C parece estar cerca del punto sin retorno y es estrechamente regulada por moduladores pro- y anti-apoptóticos que incluyen a los miembros de la familia Bcl-2 (Ej. Bcl-xL, BAX y Bid). La ruta

Figura 1 : Esquema ilustrativo de las diferentes rutas de muerte celular. La vía extrínseca es gatillada por la unión de ligandos como FasL o TRAIL a sus respectivos receptores (FAS, TRAIL-R). La vía intrínseca es gatillada por fenómenos de stress celular como los generados por agentes genotóxicos y depende de la actividad mitcondrial. Factores de sobrevida (ej: EGF, IGF) modulan la muerte celular.


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de muerte celular que es independiente de la mitocondria también estimularía apoptosis y es regulada por moléculas como FADD (proteína asociada al dominio de muerte del ligando FAS). Interesantemente, las señales de sobrevida que gatillan la cascada de quinasas PI3/Akt/PKB, pueden inhibir tanto las vías dependientes como independientes de la mitocondria. Un evento que distingue a las células que sufrirán apoptosis es la activación de al menos una de las caspasas consideradas iniciadoras, las caspasas 8 y 9 (y recientemente caspasa 2). La fase ejecutora de la cascada de caspasas conlleva la activación de caspasas adicionales (caspasas efectoras) en una cascada auto-perpetua e irreversible, como también de nucleasas que subsecuentemente atacan sustratos celulares críticos llevando a la muerte celular (9).

DESBALANCE ENTRE PROLIFERACIÓN Y APOPTOSIS

EN CÁNCERES GINECOLÓGICOS

En la carcinogénesis del endometrio y del ovario se producen alteraciones que favorecen el crecimiento, la proliferación y diseminación del cáncer. Dichas alteraciones incluyen la expresión exagerada de receptores en la membrana celular para factores de crecimiento (por ej.: EGFR, erbB2) (10, 11), de receptores hormonales (por ej.: receptores para estrógenos, progesterona y andrógenos) (12-15) y la actividad exagerada de quinasas que favorecen la sobrevida y proliferación (ej. en cáncer de ovario la sobre-expresión de la actividad quinasa AKT y en cáncer de endometrio el defecto en su inactivación por pérdida de la actividad fosfatasa de PTEN) (16, 17). Además de estas alteraciones, existen defectos en los mecanismos que controlan la muerte celular determinando la

pérdida del potencial apoptótico. En desmedro de la apoptosis, en ambos cánceres se han reportado mutaciones del gen p53 (18, 19) como también la expresión de proteínas inhibitorias (ej.: IAPs y survivin) de la activación de las caspasas (enzimas cruciales en gatillar la cascada de la apoptosis)(20, 21) y la sobreexpresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 que afectan la función mitocondrial (ej.: Bcl-2 y Bcl-xL) (22, 23).

Las hormonas esteroidales (estrógenos, progesterona y andrógenos) participan en el proceso de carcinogénesis de estos cánceres (13, 24, 25). Estudios epidemiológicos muestran que condiciones hormonales como el embarazo, el uso de anticoncepción oral y la terapia hormonal de reemplazo pueden tener un rol que favorecería o impediría su ocurrencia (25-28). Más aún, los cambios hormonales que ocurren en la perimenopausia, harían incrementar la incidencia de ambos cánceres. Ambos tipos de cáncer expresan receptores para estrógenos y progesterona (25, 29). Estudios moleculares tienden a atribuir un papel protector a la progesterona al promover diferenciación e inhibir la proliferación celular. Por contraste los estrógenos y posiblemente los andrógenos (a través de su conversión periférica a estrógenos) favorecerían la proliferación celular e inhibirían la apoptosis (15, 30, 31). El aumento de su incidencia en la perimenopausia sería explicado en parte así, por cambios hormonales que favorecerían un ambiente estrogénico local tanto ovárico como endometrial (31). En la menopausia, los estrógenos son producidos por la conversión periférica de andrógenos de origen tanto adrenal como ovárico. Dicha conversión -a estrona- es mediada por la acción de una enzima aromatasa en tejidos

periféricos (piel, músculo, grasa y hueso). La actividad aromatasa también ocurre y está aumentada locamente en ambos cánceres. Los estrógenos intratumorales derivados desde dicha aromatización in situ favorecerían el crecimiento y proliferación (31).

APOPTOSIS MEDIADA POR RECEPTORES DE MUERTE

CELULAR: INFLUENCIA HORMONAL

Los receptores de muerte celular de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (por ej. los receptores de TNF y FAS) inducen apoptosis una vez unidos a sus ligandos específicos (ligandos TNF y FAS respectivamente) a través de la activación de la cascada de las caspasas (8, 32). La modulación de esta vía de apoptosis se ha considerado como un potencial tratamiento del cáncer. Sin embargo, esta idea se ha visto amenazada no sólo por la falta de eficacia sino por la toxicidad observada. Así, TNF no es capaz de inducir apoptosis en la mayoría de las células cancerosas (33) y FAS causa daño hepático letal (34). Un miembro de la familia TNF llamado TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) se une a los receptores TRAIL-R1 (DR4) y TRAIL-R2 (DR5) e induce apoptosis mediada por caspasas (35). A diferencia de otros ligandos de la familia TNF, TRAIL induciría apoptosis selectivamente en líneas celulares de cáncer respetando las células normales (36-39). Esto ha sido corroborado en modelos animales donde TRAIL induciría regresión de injertos tumorales sin toxicidad sobre tejidos normales (37, 40). Esta capacidad de inducir apoptosis selectivamente ha promovido el estudio de TRAIL para su uso como nueva terapia en cáncer (ver Figura N˚2).

MUERTE CELULAR MEDIADA POR RECEPTORES. - DR. MAURICIO CUELLO, et al.

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Sin embargo, no todas las células cancerosas sufren apoptosis cuando son expuestas a TRAIL. Previamente hemos demostrado que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama y ovario son resistentes a la inducción de apoptosis mediada por TRAIL (41, 42). Resultados similares han sido encontrados en otras líneas tumorales (38, 43-45). Varios mecanismos pueden controlar la

sensibilidad a TRAIL (46, 47). Dentro de ellos se incluyen la expresión de receptores llamados ‘decoy receptors’ (TRAIL-R3/DcR1 y TRAIL-R4/DcR2) o de formas mutadas de TRAIL-R1 los cuales se unen a TRAIL pero no activan la cascada de las caspasas (36, 48, 49), la expresión de moléculas inhibitorias en la vía de la apoptosis tales como FLIP, IAP-1, IAP-2, XIAP y survivin (50-53),

la actividad exagerada de quinasas que promueven sobrevida como Akt y la activación y translocación de factores de transcripción anti-apoptóticos tales como NF-KB (54, 55) (ver Figura N˚2). Nuestros estudios en cáncer de mama y ovario han fallado en identificar los determinantes más importantes para la sensibilidad a TRAIL (41, 42, 54). Recientemente reportamos que la combinación de diferentes agentes quimioterapeúticos y TRAIL es capaz de inducir apoptosis en líneas celulares que muestran resistencia con cada agente por separado (41, 42) (ver Figura N˚3). Esto ha sido corroborado por otros, particularmente en cáncer de ovario (56-58). Esta interacción se explicaría por una activación sinergística de la cadena de las caspasas por la combinación de estos agentes comparado con cada uno por separado. Recientemente, se ha reportado la existencia de diferentes vías de activación de la cadena de caspasas por efecto de TRAIL (59) (ver Figura N˚4). Como se ha descrito para el ligando FAS, existirían células cancerosas en las cuales para la activación efectiva de la cadena de caspasas bastaría sólo la unión del ligando a su receptor (células tipo I), en cambio en otras, sería indispensable la activación de la vía intrínseca de muerte celular (células tipo II) (60). En las células tipo II, el proceso de apoptosis requiere de la activación de la mitocondria y de la liberación de citocromo c para generar un mecanismo de autoamplificación en la cascada de caspasas (59). Los agentes quimioterapeúticos activan la vía intrínseca, en tanto que TRAIL, a través de los receptores de muerte celular, activa la vía extrínseca. La combinación es capaz de activar eficientemente la vía intrínseca llevando a un incremento significativo en la apoptosis (ver Figura N˚3). Esto nos ha llevado a considerar que tanto en cáncer de mama y ovario

Figura 2 : Esquema que ilustra la muerte celular gatillada por el ligando TRAIL. Una vez ligado a su receptor (TRAIL-R1, TRAIL-R2) gatilla la activación de la cascada de las caspasa lo que lleva a muerte celular. Cuando se une a receptores truncados (TRAIL-R3, TRAIL-R4) no se gatilla dicha señal


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las células cancerosas en su mayoría se comportarían como células tipo II.

Aunque TRAIL en combinación con quimioterapia efectivamente induce apoptosis en células cancerosas resistentes, este aumento de apoptosis también ocurren en células normales (41). Esto nos ha llevado a buscar otros agentes que selectivamente puedan aumentar la sensibilidad a TRAIL pero manteniendo la indemnidad de las células normales. Recientemente hemos encontrado que agentes que gatillan la vía mitocondrial de la apoptosis en líneas de cáncer de ovario, como fenretinide y resveratrol, incrementan la muerte mediada por TRAIL respetando las líneas celulares normales (61) (ver Figura N˚3).

En esta búsqueda de agentes que modulen selectivamente la activación

de la vía de TRAIL, probablemente las hormonas esteroidales ováricas sean otro blanco a considerar. Ya existe evidencia que demuestra la influencia que las hormonas ejercen en los mecanismos de apoptosis (62). Estudios en cánceres hormono-dependientes (mama, ovario y endometrio) y en otros tejidos (ej. tejido neural) han mostrado que los estrógenos tendrían un rol protector a la apoptosis al promover la expresión de proteínas antiapoptóticas tales como Bcl-2 y Bcl-xL (proteínas que controlan la vía apoptótica dependiente de la mitocondria) (63-66). Por contraste, la progesterona tendría un rol facilitador al inhibir dichas proteínas como también al inducir la expresión de otras que favorecen apoptosis (ej. BAX y p53) (67-70). Estudios en cáncer de mama y tejido neural muestran que los estrógenos inhibirían la apoptosis

mediada por otros receptores de muerte celular de la familia TNF tales como FAS y TNF (71, 72). Recientemente, estudios sobre el rol etiopatogénico de TRAIL en enfermedades desmielinizantes afectando oligodendrocitos sugerirían un rol protector de 17-ß-estradiol en la apoptosis mediada por TRAIL (73). El rol protector de los estrógenos en la muerte inducida por TNF y FAS sería mediado por aumento en la actividad de quinasas que promueven proliferación e inhiben apoptosis tales como Akt (74). Para TRAIL, la protección obedecería a un efecto de los estrógenos a distintos niveles: en la cascada de muerte celular gatillada por TRAIL, incluyendo inhibición de fosforilación de ciertas quinasas, induciendo un incremento en los niveles de Bcl-2 y Bcl-xL e inhibiendo el efecto de TRAIL sobre los niveles de

Figura 3 : Apoptosis inducida por TRAIL en cáncer de ovario. A) Aumento apoptosis mediada por TRAIL inducida por la adición de quimioterapia (adriamicina, paclitaxel, cisplatino) en la línea SKOV3 (medida por fracción sub G0/G1 mediante citometría de flujo). B) Muerte mediada por TRAIL con o sin Fenretinide (4HPR) en la línea A2780 parental (vector vacío PCDNA3) y transfectada con BCl-xL (2A3, 2B4). C) Western blot mostrando la inhibición de la liberación de citocromo c (cytosol cyt c) desde la mitocondria cuando se sobreexpresa Bcl-xL. D) Estabilización del potencial transmembrana de la mitocondria en clon (2A3) que sobre-expresa Bcl-xL (demostrado por citometría de flujo con tinción de DiCO6(3)). (figuras tomadas y modificadas de referencias (52) y (72) con permiso del autor).


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sus propios receptores (73). Dentro de las quinasas afectadas por los estrógenos, nosotros y otros, hemos demostrado previamente que la actividad quinasa de Akt es un mecanismo importante en determinar la sensibilidad a TRAIL tanto en cáncer de mama como ovario (55, 75). La actividad de dicha quinasa es modulada por factores de crecimiento extracelulares como por ejemplo la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (55, 76). La inhibición de dichas señales potencia la apoptosis inducida por TRAIL y sería mediada por la activación de la vía mitocondrial de la cascada de apoptosis (76). Interesantemente los tumores hormono-dependientes como el cáncer de mama, ovario y endometrio, coexpresan frecuentemente receptores para hormonas esteroidales y para factores de crecimiento de la familia EGF (77-79). Existen evidencias que indican una interacción entre estas dos vías en mama y endometrio. Entre

ellas, estudios que indican que tanto los estrógenos como la progesterona son capaces de modular la expresión de receptores para EGF (78). Así también existe evidencia que sugiere un papel de los receptores de la familia EGF en la actividad de los receptor de estrógenos que requeriría de la actividad de Akt (80). Por último ha sido descrito el papel del receptor erbB-2 en la modulación de los efectos de 17-ß estradiol sobre MAPK, efecto que favorece proliferación y metástasis en células de cáncer de mama (81). Esta conversación cruzada modularía los efectos observados con la estimulación de cada uno de estos receptores (82). Además, también existiría la convergencia de señales en pasos posteriores de la cascada de traducción lo cual determinaría la potenciación recíproca de señales (83).

Otros mecanismos además de los ya descritos podrían explicar la acción de

las hormonas sobre la cascada apoptótica mediada por TRAIL. Uno de ellos sería el efecto de las hormonas esteroidales, particularmente los estrógenos, sobre la actividad mitocondrial. Tal como señalamos previamente, la actividad mitocondrial (fenómeno de depolarización de la membrana mitocondrial) parece ser central en determinar la sensibilidad a TRAIL particularmente en líneas celulares de cáncer de ovario (61). Recientemente, ha sido demostrada la localización de receptores de estrógenos en la mitocondria (84). El rol exacto que juega la presencia de receptores de estrógenos en la mitocondria aun no se conoce. Estudios en cultivos de hepatocitos de origen murino sugieren la participación en la transcripción de genes codificados por DNA mitocondrial como son las subunidades citocromo oxidasa I, II y III, en un aumento de la actividad mitocondrial respiratoria con aumento de los niveles de ATP celular y un aumento en los niveles proteicos de Bcl-2. Dichos eventos han sido asociados a la inhibición de la apoptosis mediada por TGFß en estas células (85). Interesantemente un metabolito endógeno de los estrógenos, 2-metoxiestradiol (2-ME), induce apoptosis en líneas de cáncer de próstata a través de un mecanismo genómico mediado por p38 MAPK (incremento de niveles de p53) y uno no genómico mediado por c-jun NH2-terminal quinasa (JNK) (reducción de la fosforilación de Bcl-2) (86). El mecanismo no genómico se explicaría por activación de la cascada mitocondrial como se ha observado en células de sarcoma de Ewing (87). Abdollahi y cols. han sugerido un rol de p38-MAPK en la apoptosis mediada por TRAIL (88). Así también, Weldon y cols. han sugerido que la inhibición de p38-MAPK sensibilizaría células de cáncer de mama que son resistentes a TRAIL

Figura 4: Tipos de cascada de muerte celular gatillada por TRAIL. En células tipo I, la cascada se gatilla eficientemente independiente de la activación mitocondrial. En células tipo II, la cascada depende de la activación mitocondrial y de un mecanismo de reforzamiento entre caspasas.

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y TNF (89). Este mismo mecanismo -vía JNK/p38 MAPK- ha sido postulado como explicación del sinergismo observado entre TRAIL y quimioterapia (90).

Un mecanismo alternativo que puede explicar el efecto de las hormonas sobre la sensibilidad a TRAIL es el cambio de la comunicación celular inducido por hormonas esteroidales. Evidencia reciente sugiere que la señal de muerte celular inducida por TRAIL se trasmite entre células (fenómeno conocido como efecto “bystander”) y que dicho fenómeno requiere del contacto entre células (91). Dicho efecto se ha demostrado en células epiteliales y fibroblastos tratados con radioterapia (92-94). Interesantemente, cambios en la comunicación celular ocurren tanto en endometrio humano durante el ciclo menstrual como en ovario durante el estro de la oveja (95, 96). Así también se han descrito cambios en la comunicación celular en la carcinogénesis de ambos tejidos (97-99). Por lo tanto, resulta atractivo determinar el rol que juega la comunicación celular en la apoptosis mediada por TRAIL.

La Dra. Claudia Sáez y su grupo han observado que bajo ciertas condiciones hormonales, particularmente con la combinación de tamoxifeno y ácido all-trans-retinoico, pueden modificar la comunicación celular mediada por gap-junctions en cáncer de mama (100). Así también, junto a ella hemos observado

que condiciones que modifican la comunicación celular -como incubación con ácido retinoico en líneas de cáncer de mama- afectan la sensibilidad a TRAIL. Así por ejemplo, en células pobremente comunicadas, el hecho de aumentar la comunicación determinaría aumento de la apoptosis inducida por TRAIL (datos no publicados).

En suma, la dependencia hormonal de los cánceres de endometrio y de ovario, los efectos múltiples que las hormonas esteroidales tienen en proteínas de la cascada de apoptosis (particularmente a nivel de la mitocondria) y eventualmente en la transmisión entre células de la señal de apoptosis gatillada por TRAIL, hacen de las hormonas esteroidales un blanco propicio cuya modulación pueda selectivamente favorecer la muerte celular mediada por TRAIL en células cancerosas versus las normales.

Existe escasa información sobre los efectos que tienen los estrógenos, progesterona o sus derivados en la sensibilidad a apoptosis mediada por TRAIL. Prácticamente no hay información sobre los efectos que

Figura 5: Sobrevida observada -mediante ensayo colorimétrico de MTS (reducción mitocondrial de la sal de tetrazolium a formazan) en condiciones basales y luego de tratamiento con TRAIL (200 ng/ml durante 16 hrs) en células normales y cancerosas de cuello, endometrio y ovario. ECN, EEN y OVN se refieren a cultivos primarios de cuello, endometrio y ovario normal, respectivamente.

Figura 5: Diferentes técnicas para confirmar la apoptosis inducida por TRAIL. A) morfología de células A2780 con y sin tratamiento con TRAIL (200 ng/ml por 16 hrs). B) Escalera de DNA en células Ishikawa (IK) y MDA-MB-231 con (T) y sin (C) tto. con TRAIL. C) Western-Blot que muestra la forma clivada de PARP (p85) en células IK y endometriales normales (EEN) con (T) y sin (C) tto. con TRAIL . D) Actividad de caspasas in vitro en células IK con y sin tto. con TRAIL.


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las hormonas esteroidales tendrían en la expresión de las distintas proteínas que participan de esta cascada mediada por TRAIL, excepto los estudios en la expresión de Bcl-2, Bcl-xL y p53.

A la fecha, hemos observado que TRAIL induciría apoptosis en cáncer de endometrio, ovario y cuello uterino (ver Figuras N˚5 y 6). Datos preliminares obtenidos en nuestro laboratorio apoyarían la influencia de las hormonas esteroidales ováricas en la sensibilidad de TRAIL tanto para cáncer de endometrio como ovario. Hemos observado que la combinación de estrógenos más progesterona (en rango similar al observado en condiciones fisiológicas en plasma) incrementa la apoptosis mediada por TRAIL en cáncer de endometrio Mientras TRAIL solo induce apoptosis en células Ishikawa (variedad de células de cáncer de endometrio) en un rango no superior al 20% a 25%, la adición de esta combinación de hormonas esteroidales eleva la apoptosis observada al 40% a 50%. A la fecha hemos evaluado diferentes preparados hormonales. Interesantemente, un metabolito del estradiol (2-metoxiestradiol) ha

mostrado inducir la apoptosis mediada por TRAIL tanto en líneas celulares comercialmente disponibles (ej. A2780, Ishikawa, HEC-A1) como en cultivos primarios establecidos desde cáncer de ovario y endometrio. Más importante aún, ha mostrado toxicidad selectiva sobre cáncer sin afectar tejidos reproductivos normales (explantes y cultivos de epitelio del ovario, epitelio y estroma de endometrio, trompa uterina y cuello uterino) (ver Figura N˚7). Los mecanismos detrás de este fenómeno están en vías de ser elucidados. Del entendimiento que de ellos alcancemos dependerá la posibilidad de utilizar la apoptosis inducida por receptores de muerte celular y la modulación mediada por hormonas en el tratamiento del cáncer de endometrio y ovario.

Cabe señalar, que los hallazgos observados en líneas celulares tienen limitaciones. Se trata de un modelo in vitro, en el cual las condiciones son controladas y por ende no necesariamente reflejan lo que ocurrirá in vivo. La proliferación y apoptosis son procesos cuya regulación in vivo depende de variables intracelulares -dentro de ellas-, la comunicación

cruzada entre cascadas de señales, de estímulos extracelulares conocidos y otros inesperados, de la comunicación intercelular, de la influencia ejercida por otros tejidos vecinos (ej. VEGF y endotelio vascular) e incluso de otros órganos, así como también de variables ambientales a las que se expone el individuo (radiación, tabaquismo, drogas, etc). Por ello, ratificadas nuestras observaciones in vitro, y entendiendo mejor los mecanismos detrás de su ocurrencia, es un paso necesario futuro, el poder reproducir estos resultados en modelos que se acerquen más a las condiciones in vivo, vale decir, modelos animales y posteriormente a través de los estudios clínicos en humanos.

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