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Método 1 – Adsorción y elución para determinación de subgrupos de A y B

Principio y aplicación

Aunque algunos eritrocitos con subgrupos débiles de A o B no aglutinan en las pruebas

convencionales para grupo ABO, pueden adsorber y eluir el correspondiente anticuerpo.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Antisuero comercial (anti-A o anti-B)

2. 1-2 mL de GRs a estudiar

3. GRs reactivos de grupos A1, A2, B y O

4. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%

5. Suero Antiglobulina humana (AGH)

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo

9. Centrífuga apropiadamente calibrada

10. Incubador/baño térmico

11. Heladera/baño de hielo

Procedimiento

1. Lavar los GRs a estudiar 3 veces con salina.

2. Concentrar los GRs a estudiar por centrifugación a 1000 g durante 10 minutos y remover todo el

sobrenadante.

3. Diluir el antisuero comercial (anti-A o anti-B) al 1:2 con salina.

4. En un tubo, mezclar volúmenes iguales de GRs a estudiar con el anti-suero diluido.

5. Incubar a temperatura ambiente ó a 4 °C por 30 minutos.

6. Concentrar los GRs en estudio y descartar el antisuero. Lavar los GRs 4-6 veces con salina.

7. Trasladar a un nuevo tubo y lavar 3 veces más con salina. Guardar el último lavado.

8. Concentrar los GRs en estudio.

9. Agregarles un volumen igual de ASB al 6% a los GRs lavados y compactados.

10. Mezclar bien e incubar a 56 °C durante 10 minutos –agitando frecuentemente.

11. Centrifugar durante 5 minutos. Recoger el sobrenadante teñido de hemoglobina (eluato).

12. Estudiar el eluato y el sobrenadante del último lavado con 3 testigos conocidos, como mínimo, de

GRs del correspondiente grupo ABO (A1, A2, y/o B) y con GRs de grupo O para control. Estudiar

a temperatura ambiente, a 37 °C y finalizar en prueba antiglobulínica (PAG).

Interpretación

Negativo: Si las células no tienen suficientes antígenos A, B o ambos, el eluato no reaccionará con las

células A y/o B.

Positivo: Si las células estudiadas tienen suficiente expresión antigénica de A, de B o de ambos, el eluato

puede reaccionar con las células testigo A y/o B.

Inválido: cuando las células de grupo O reaccionan con el eluato.

Notas

1. Si el sobrenadante del último lavado reacciona con los GRs en estudio en el paso 12, se invalidan

los resultados de la prueba. El procedimiento de adsorción y elución se debe repetir con lavados

adicionales.

2. Algunos subgrupos muy débiles sólo pueden ser detectados a través de la adsorción con anti-A, B.

Referencias

1. Landsteiner K, Miller CP. Serological studies on the blood of primates. II. The blood groups in

anthropoid apes. J Exp Med 1925;42:853.

2. Schwedfeger D, Heal J. A novel weak subgroup of A (abstract) Transfusion 1989;29:14S.

Método 2 – Aglutinación secuencial

Principio

En algunas reacciones de aglutinación en campo mixto, los GRs aglutinados pueden ser removidos y los

GRs no aglutinados pueden ser tratados con antisueros específicos para producir la aglutinación. El

proceso se repite hasta que la mayoría de los GRs hubieren sido aglutinados.

Aplicación

La aglutinación secuencial es usada para determinar si los GRs en una reacción de campo mixto tienen

una simple o doble especificidad. La técnica es usada mayormente para definir GRs A3, Abantu, o Amos.


1. Antisuero comercial anti-A.

2. GRs testigo de grupo A1, suspendidos al 5% en salina.

3. GRs a estudiar

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Tubos de ensayo


8. Portaojetos

9. Cubreobjetos (opcional)

10. Microscopio

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 5% en solución salina de los GRs a estudiar.

2. En un tubo agregar 10 gotas de los GRs en estudio a 10 gotas de anti-A. Mezclar y centrifugar a

1000 g durante 15 segundos. Dispersar el botón de GRs y centrifugar nuevamente a la misma

velocidad y por el mismo tiempo.

3. Dispersar el botón nuevamente en forma delicada, llenar el tubo con salina, inclinando el tubo a

45º durante 30 segundos, luego colocarlo derecho durante otros 30 segundos. Los GRs

aglutinados, más pesados, caerán hacia el fondo más rápidamente que los GRs no aglutinados.

4. Aspirar los GRs no aglutinados. Colocar estos GRs en un tubo limpio. Centrifugar durante 1

minuto. Decantar completamente la solución salina.

5. Agregar 8-10 gotas del antisuero al botón de GRs y repetir los pasos 1-3.

6. Repetir el proceso completo hasta que todos los GRs hayan sido aglutinados o hasta que la

aglutinación no ocurra más y queden los GRs remanentes. Lavar 3 veces los GRs y hacer una

suspensión al 2-3 %.

7. Agregar a una gota de la suspensión de GRs no aglutinados 1 gota de GRs detectores de grupo A1.

Incubar 5 minutos a temperatura ambiente –agitando frecuentemente.

8. Centrifugar 15 segundos, resuspender suavemente, y entonces repetir una vez más.

9. Observar microscópicamente en busca de rosetas. Si aún hay GRs libres visibles, considerar la

posibilidad de una doble o múltiple población de GRs.

Interpretación

Si aún hay GRs libres, entonces debe considerarse una población de GRs doble o múltiple. Si no se

observan GRs libres, entonces los GRs expresan el mismo antígeno en grado variable, tal como puede ser

visto en algunos subgrupos débiles de A o B.

Referencias

1. Beattie KM. Identifying the causes of weak or “missing” antigens in ABO grouping tests. In:

Investigation of typing and compatibility problems caused by the red cell. Washington, DC:

AABB Workshop, 1977.

Método 3 – Investigación del carácter secretor ABH


Los antígenos ABH son secretados en forma hidrosoluble por alrededor del 80% de los individuos. Estos

antígenos solubles ABH pueden neutralizar las reacciones con el antisuero específico de los GRs que

poseen los variados antígenos ABH. Se pueden usar las pruebas basadas en este hecho para determinar el

estado secretor. En la mayoría de los casos, los secretores de grupo O secretan sustancia H, los de grupo

A secretan A y H, los de grupo B secretan B y H, y los secretores de grupo AB secretan A, B y H.


1. Saliva.

2. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%.

3. Anti-A y/o anti-B de donantes no hiperinmunizados (ver Nota 1)

4. Lectina anti-H de Ulex europaeus (disponible comercialmente de E-Y Laboratories, o preparada

de semillas obtenidas de compañías de semillas) (ver Nota 2 y M98, M99)

5. GRs testigos de grupo A2, B y O (ver Nota 3)

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo

9. Centrífuga debidamente calibrada

Preparación de reactivos

1. Seleccionar la mejor dilución de anti-A, anti-B, y/o anti-H para realizar una doble dilución en ASB

al 6% (ver M123). Estudiar las diluciones con los GRs adecuados. La dilución siguiente al último

tubo que con una reacción de 2+ es la dilución del antisuero a ser usada para la prueba. Es de

buena práctica reservar alícuotas de los anticuerpos estandarizados ya probados en el freezer ya

que ellos pueden ser diluidos cuando sean necesarios para estudios de neutralización.

Procedimiento

1. Recolectar 2-3 mL de saliva (ver Nota 4). Hervir la saliva 10 minutos para destruir la actividad

enzimática. Centrifugar la saliva a 1000 g durante 10 minutos. Remover el sobrenadante (ver Nota

5).

2. Diluir la saliva 1:2 o 1:4 en salina (ver Nota 6).

3. Lavar los GRs 3 veces con salina y resuspender al 3%.

4. Diluir en ASB al 6% el antisuero previamente estandarizado para obtener una reacción de 2+ con

los GRs testigos.

5. Rotular 3 tubos para cada antisuero: “prueba de neutralización”, “dilución de control” y “control

negativo”.

6. Agregar 2 gotas del antisuero diluido a los tubos apropiados.

7. Agregar 2 gotas de la saliva diluida a estudiar a los tubos. Mezclar y centrifugar por 1 minuto.

8. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

9. Agregar 1 gota de GRs testigos a los tubos “prueba” y “control”.

10. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

11. Centrifugar por 15 segundos. Leer macroscópicamente.

Controles

1. Control del reactivo: 2 gotas de salina en lugar de saliva. Estudiar en paralelo con la saliva. Estos

controles deben ser positivos con los GRs testigos.

2. Estudiar la saliva de un secretor y una de un no secretor conocidos en paralelo con saliva a prueba.

Interpretación

Ver Tabla 3-1.

1. Secretor- la ausencia de aglutinación indica que en la saliva hay sustancias grupo específicas.

2. No secretor- la aglutinación indica que en saliva no hay sustancias grupo específicas.

Tabla 3-1.: Interpretación de la Investigación del Carácter Secretor

Prueba en saliva Control: saliva de

un secretor

conocido

Control: saliva de

un No secretor

conocido

Control Dilución

salina

Interpretación

GRs Testigos de Grupo 0 y Anti-H

Negativo negativo 2+ 2+ Secretor H

2+ negativo 2+ 2+ No Secretor H

GRs Testigos de Grupo A2 y Anti-A

Negativo negativo 2+ 2+ Secretor A

2+ negativo 2+ 2+ No Secretor A

GRs Testigos de Grupo B y Anti-B

Negativo negativo 2+ 2+ Secretor B

2+ negativo 2+ 2+ No Secretor B

Notas

1. Es preferible utilizar sueros anti-A o anti-B de donantes no hiperinmunizados a los sueros

comerciales porque estos contienen más anticuerpos IgG, lo que dificulta la neutralización.

2. Excepto en casos de subgrupos débiles de A o B, la investigación sólo de sustancia H es

usualmente suficiente para determinar si la persona es secretora de ABH.

3. Para la neutralización de los GRs A2, son más sensibles los GRs A1,. Se usan GRs de grupo O para

determinar la neutralización del anti-H.

4. Para acelerar la producción de saliva se aconseja masticar parafina. Advertencia: masticar goma de

mascar u otros elementos que con sustancias proteicas o azucaradas pueden neutralizar el

antisuero.

5. La saliva hervida puede conservarse congelada en alícuotas.

6. La saliva no diluida contiene glicoproteínas no específicas, las que pueden neutralizar el antisuero

y conducir a interpretaciones erróneas acerca del estado secretor.

Referencias

1. Beattie KM. Identifying the causes of weak or “missing” antigens in ABO grouping tests. In:

Investigation of typing and compatibility problems caused by the red cell. Arlington, VA: AABB,

1977.

2. Race RR, Sanger R. Blood groups in man. 6th ed. Oxford: Blackwell, 1975.

3. Widmann FK, ed. Technical manual. 8th ed. Arlington, VA: AABB, 1981.

4. Mollison PL. Blood transfusion in clinical medicine. 7th ed. Oxford: Blackwell, 1983.

Método 4 – Detección de transferasas de los genes de A y B


Los genes del grupo A y B en las personas con fenotipos A o B, producen respectivamente N-D-

galactosaminil o α-D-galactosil-transferasas, en sus GRs y en el plasma. Estas transferasas son capaces de

transformar los GRs de grupo O en GRs de grupo A o B activos. La detección de las transferasas puede

ayudar en la resolución de discrepancias ABO.


1. Sustratos de nucleótidos de azúcares, para las transferasas A, difosfato de uridin-N-acetil-D-

galactosamina (UDP-GalNac), Sigma Chemical Co., número de catálogo U5252; para transferasas

B, difosfato de uridin galactosa (UDP-Gal), Sigma Chemical Co., número de catálogo U4500.

2. Cloruro de manganeso (MnCl2)

3. GRs de grupo O

4. Suero a estudiar

5. Suero de grupo A o B y de grupo O como controles positivos y negativos

6. Anti-A o anti-B comerciales

7. Solución salina

8. Pipetas

9. Tubos de ensayo


11. Incubador/baño térmico

12. Salina normal o tamponada con fosfato (PBS)

13. Varillas

Procedimiento

1. Lavar los GRs O 3 veces con salina y resuspender al 50%.

2. Agregar a 0.5 mL del suero a estudiar, 0.05 mL de la suspensión al 50% de GRs O, la cantidad de

sustratos de azúcares nucleótidos (UDP-GalNac o UDP-Gal) que quede adherida a la varilla al

remojarla, y la cantidad de MnCl2 que se adhiera al remojar la varilla. Remojar la punta de la

varilla con salina normal o PBS (ver Nota 1).

3. Tratar el suero de control de grupo A o B y de grupo O de la misma forma.

4. Incubar la prueba y los controles 3.5 horas a 37 °C.

5. Preparar diluciones dobles, desde 1:2 hasta 1:32, del anti-A o anti-B comercial.

6. Lavar los GRs 3 veces con solución salina después de la incubación.

7. Resuspender los GRs al 2%.

8. Incubar con las diluciones del suero anti-A o anti-B apropiado a temperatura ambiente por 20

minutos.

9. Centrifugar a 1000g durante 30 segundos y leer macroscópicamente.

Interpretación

1. En presencia de UDP-galactosa y MnCl2, los GRs de grupo O adquieren antígenos de

especificidad B durante la incubación con el suero de individuos de grupo B o AB.

2. En presencia de UDP-GalNac y MnCl2, los GRs de grupo O adquieren antígenos de especificidad

A durante la incubación con el suero de individuos de grupo A o AB.

Notas

1. Advertencia: El exceso de MnCl2 no se disolverá en el medio de prueba y puede causar

dificultades en la lectura de las reacciones.

Referencias

1. Valko DA, Rolih SD, Moulds JJ, Bridges MA. A simple method for detection of the B-gene

specified transferase enzyme. St. Charles, IL: American Red Cross Reference Laboratory

Workshop, March 1982.

2. Schenkel-Brunner H, Tuppy H. Enzymatic conversion of human O into A erythocytes and of B

into AB erythrocytes. Nature (London) 1969;223:1272.

Método 5 – Recuento de Ashby (Método manual modificado)

Principio

En una muestra de sangre que contiene una mezcla de dos o más grupos sanguíneos, una población de

GRs es aglutinada y la otra población de GRs que queda libre, no aglutinados, es contada por un equipo

automatizado. Restando el número de GRs libres del recuento total, se obtiene el número de GRs

aglutinados.

Aplicación

La aglutinación diferencial puede usarse para determinar la sobrevida de GRs transfundidos o para

investigar quimerismo de grupos sanguíneos.


1. Antisuero aglutinante potente o lectina, ABO o reactivos tipificadores M y N (ver Nota 1)

2. Suero de grupo AB

3. Solución salina

4. Tubos de ensayo

5. Contador automático de células (Couter Isoton)

6. Pipetas (Pasteur y una pipeta automática con punta de 100 ul)


8. Microscopio

9. Sangre entera a estudiar

Procedimiento

1. Dispensar 0.1 mL de la sangre entera a estudiar en 5 mL de salina para preparar una suspensión

globular al 1:51.

2. Preparación de un recuento de aglutinación diferencial: Agregar 1 volumen (se sugiere 0.2 mL) de

la suspensión de GRs al 1:51 a un volumen de suero aglutinante de alto título en un tubo y mezclar

bien. La dilución es ahora de 1:102. Preparar en duplicado.

3. Preparación del recuento total: Agregar 0.1 mL de la suspensión de GRs al 1:51 a 0.1 mL de suero

AB y mezclar bien.

4. El recuento total puede hacerse inmediatamente, pero los tubos que contienen el suero aglutinante

deben permanecer durante 15-30 minutos a temperatura ambiente.

5. Centrifugar los tubos que contienen el suero aglutinante a 1000 g durante 30 segundos, golpear

ligeramente los tubos contra la mesada para romper la aglutinación, centrifugar nuevamente

durante 15 segundos, golpear el tubo enérgicamente, y permitir que los aglutinatos decanten

durante 20 segundos.

6. Usando una pipeta fina, remover una pequeña cantidad del sobrenadante y usarlo para cargar las

placas de las cámaras de recuento. Realizar dos recuentos por cada tubo.

7. Para el recuento total, contar 5 cuadros de la cámara como en un recuento de GRs de rutina. En el

recuento de aglutinación diferencial, puede haber tan pocos GRs no aglutinados que deben

contarse grandes áreas (25 cuadros) para asegurar la precisión.

Cálculos

1. 10 x 5 (si se cuentan 5 cuadros) x 102 (dilución) x el número de GRs promedio contados en el

recuento duplicado de los tubos por duplicado.

o

10 x 1 (cuando se cuentan los 25 cuadros) x 102(dilución) x el número de GRs promedio contados

en el recuento duplicado de los tubos por duplicado.

2. Recuento total – recuento de aglutinación diferencial = recuento de aglutinatos.

3. Recuento de aglutinatos x 100 = % de GRs aglutinatos

Recuento total

Interpretación

En el caso de una quimera A-O en la cual el recuento diferencial fue realizado con anti-A y se halló un

promedio de 459 mientras que el promedio del recuento total fue de 510, la diferencia de 51 entre los dos

valores representará los GRs aglutinados. En este ejemplo los cálculos serán:

(10 x 5 x 102 x 510) – (10 x 5 x 102 x 459) = 51

51 x 100 = 10% de los GRs totales son de grupo A

510

Aunque existen métodos más sofisticados, puede medirse la sobrevida de los GRs de forma

simple luego de la transfusión de GRs seleccionados por poseer un antígeno que estaba ausente en la

sangre del receptor. Por ejemplo, puede escogerse sangre M positiva para un paciente M negativo. El

recuento de sangre tomada 10 minutos después de la transfusión, a la hora y a las 24 horas puede ser

indicativo. Los cálculos se deben hacer en la misma forma que en el ejemplo anterior. El recuento de

células aglutinadas (GRs M positivos con anti-M) representará los GRs transfundidos sobrevivientes.

Notas

1. Si el antisuero o la lectina no producen una aglutinación completa de todos los GRs antígeno

positivos o no se unen lo suficiente en forma firme como para resistir una agitación enérgica, no se

obtendrán resultados precisos.

2. Se pueden obtener recuentos en blanco de menos de 20.000 por mm3 con el antisuero aglutinante.

Por ejemplo, el recuento de GRs libres después de la aglutinación de GRs de grupo A1 o A2

conocidos con anti-A brindará información sobre la efectividad del antisuero en producir una

aglutinación completa.

3. El coeficiente de variación esperado en este método es del 5%, el mismo que se encuentra con el

método de recuento de GRs manual.

Referencias

1. Ashby W. The determination of the length of life of transfused blood corpuscles in man. J Exp

Med 1919;29:267.

2. Mollison PL. Blood transfusion in clinical medicine. 3rd ed. Oxford: Blackwell, 1961.

Método 6 – Recuento de Ashby (Método automático modificado)

Principio

En sangre que contiene una mezcla de dos o más grupos sanguíneos, una población de GRs es aglutinada

y la otra población de GRs libres, no aglutinados es contada por un aparato de recuento automático

(Coulter Counter). Restando el número de GRs libres del recuento total, se obtiene el número de GRs

aglutinados.

Aplicación

La aglutinación diferencial puede usarse para determinar la sobrevida de GRs transfundidos o para

investigar el quimerismo de grupos sanguíneos.


1. Antisuero aglutinante potente o lectina, ABO o reactivos tipificadores M y N (ver Nota 1)

2. Coulter Isoton

3. Pipetas (Pasteur y una pipeta automática con punta de 100uL)

4. Tubos de ensayo (16 x 100 mm)

5. Coulter Counter

6. Frascos de Coulter Counter

7. Sangre entera a estudiar

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

Procedimiento

1. Diluir 0.01 mL de sangre entera en 10 mL de Isoton para obtener una dilución de 1:500 de GRs.

2. Hacer en duplicado.

a. Prueba: Usando una pipeta automática, colocar en un tubo de 16 x 100 mm 0.1 mL de

antisuero (o lectina) y 0.1 mL de GRs diluidos (dilución 1:500) .

b. Control: Usando una pipeta automática colocar en un tubo 0.1 mL de Isoton y 0.1 mL de GRs

diluidos.

c. Mezclar y dejar los tubos 15 minutos a temperatura ambiente.

3. Centrifugar todos los tubos a 1000 g durante 15 segundos, resuspender el botón y centrifugar

nuevamente durante 15 segundos. Agitar el botón de GRs “control” para remover todos los GRs

del fondo. Resuspender el botón de GRs “control” lo suficientemente fuerte como para asegurarse

que los aglutinatos permanezcan siempre luego de posteriores diluciones y que sedimentarán

rápidamente.

4. Agregar 10 mL de Isoton al “control” y a la “prueba”. Mezclar con cuidado por inversión. No

sacudir.

5. Dispensar el tercio superior de cada tubo “control” en frascos de Coulter Counter y contar en el

Coulter Counter de la misma forma que se cuentan los GRs de rutina.

6. Dejar los tubos “control” aproximadamente 15 minutos. Acortar o alargar el tiempo de acuerdo a

cómo aparezcan de limpio de aglutinatos en el sobrenadante.

7. Pipetear el tercio superior (ver Nota 2) de cada tubo “prueba” en frascos de Coulter Counter y

contar en el Coulter Counter de la misma forma que se cuentan los GRs de rutina.

Cálculos

Recuento de la prueba = % de GRs no aglutinados

Recuento del control

Notas

1. Si el antisuero o la lectina no producen una aglutinación completa de todos los GRs antígeno

positivos o no se unen lo suficiente en forma firme como para resistir una agitación enérgica, no se

obtendrán resultados precisos.

2. Puede ser necesario pipetear un volumen ligeramente mayor (posiblemente después de un ligero

aumento en el tiempo de decantación de los aglutinatos) para permitir que la sonda del Coulter

aspire en una muestra adecuada. Alternativamente, la prueba puede prepararse en cuadruplicado y

la capa superior de dos tubos se pueden mezclar para el recuento.

Referencias

1. Ashby W. The determination of the length of life of transfused blood corpuscles in man. J Exp

Med 1919;29:267.

2. Bowdler AJ, Swisher SN. Electronic particle counting applied to the cuantitative study of RBC

agglutination. Transfusion 1964;4:153-68.

Método 7 – Técnica de rosetas para detectar una población menor de GRs utilizando un antisuero

salino

Principio

Es posible detectar poblaciones menores, tales como GRs de grupo A o B, recubriendo GRs con

anticuerpos reactivos salinos, tales como anti-A o anti-B; luego retirando el anticuerpo libre a través de

lavados, y finalmente agregando GRs testigos, los cuales formarán rosetas con la población menor de

GRs recubiertos por anticuerpos.

Aplicación

Esta técnica puede ser utilizada para detectar una población menor de GRs que representen menos del 1%

del total.


1. Antisuero, e.j., anti-A o anti-B

2. Suspensiones al 5% de GRs de grupo A y B

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo

6. Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos

7. Microscopio


9. Suspensión al 2-3% de GRs testigo


1. GRs control positivo: Agregar 1 gota de suspensión en salina al 3% de GRs de grupo A (o de

grupo B si lo requiere el caso) a 8 mL. de una suspensión al 3% de GRs de grupo O.

2. GRs control negativo: Suspensión salina al 3% de GRs de grupo O.

Procedimiento

1. Colocar 1 gota del suero tipificador específico para la población menor sospechada en un tubo de

ensayo y agregar 1 gota de la suspensión al 2-3% de los GRs a estudiar. Mezclar bien.

2. Rotular 2 tubos más y agregar a cada uno 1 gota del suero tipificador específico para la población

menor sospechada. Al tubo rotulado “control positivo”, agregar 1 gota de GRs de control positivo

y mezclar. Al tubo de ensayo rotulado “control negativo”, agregar 1 gota de GRs de control

negativo y mezclar.

3. Incubar los tubos problema y control durante 15 minutos a temperatura ambiente.

4. Lavar los GRs 3 veces con salina.

5. Agregar 1 gota de suspensión al 5% de GRs detectores A o B, específicos para el suero tipificador.

Mezclar bien.

6. Dejar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar frecuentemente.

7. Centrifugar 15 segundos a 1000 g , resuspender suavemente, y repetir la centrifugación y la

resuspensión.

8. Colocar una alícuota de la suspensión en un portaobjetos, cubrir con el cubreobjetos, y examinar

microscópicamente. Las rosetas en medio de GRs no aglutinados indican la presencia de una

población menor de GRs.

Interpretación

En una mezcla de GRs, la aglutinación directa de la población menor con suero tipificador puede no

ocurrir porque las células están tan extensamente distribuidas entre la población mayor de GRs que la

aglutinación puede no llevarse a cabo.

No obstante, estos GRs están cubiertos por el anticuerpo. Cuando se agrega un gran cantidad de células

detectoras, ellas son atraídas por el anticuerpo fijado en la población menor de GRs y se forman las

rosetas.

Si el control positivo no muestra rosetas, los resultados deben ser invalidados porque:

• Hay muy pocos GRs de la población menor en la mezcla o,

• El antisuero no es específico para el antígeno de los GRs de la población menor o,

alternativamente, de los GRs detectores.

Si el control negativo muestra rosetas, esto puede ser:

• Coágulos simulando rosetas, o

• Contaminación de los GRs.

Notas

1. Es importante usar una suspensión al 5% de los GRs detectores porque debe haber bastantes GRs

para buscar y unirse al anticuerpo que está unido a los GRs de la población menor.

Referencias

1. Jones AR, Silver S. The detection of minor erythrocyte population by mixes agglutinates. Blood

1958;13:763-72.

Método 8 – Técnica de roseta para la detección de una población menor de GRs utilizando un

anticuerpo IgG

Principio

Pueden detectarse poblaciones menores de GRs recubriéndolos con un anticuerpo IgG, lavando el

anticuerpo libre, y luego agregando suero antiglobulina y GRs cubiertos con IgG (Control Coombs). Los

GRs del Control Coombs formarán rosetas alrededor de los GRs cubiertos por IgG de la población menor.

Aplicación

Esta técnica puede ser utilizada para detectar una población menor de GRs que representen menos del 1%

del total.


1. Anticuerpo IgG, e.j., anti-D

2. Suero Antiglobulina humana (SAGH)

3. GRs recubiertos por anticuerpo IgG (Control Coombs)

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Tubos de ensayo

7. Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos

8. Microscopio


10. Incubador / Baño

11. GRs control de grupo O Rh positivo y Rh negativo


1. GRs control positivo: Agregar 1 gota de suspensión al 3% de GRs Rh positivo a 8 mL de una

suspensión en salina al 3% de GRs Rh negativo.

2. GRs control negativo: Suspensión salina al 3% de GRs Rh negativo (ver Nota 1).

Procedimiento

1. En un tubo de ensayo, colocar 1 gota del suero tipificador IgG específico para la población menor

sospechada y agregar 1 gota de la suspensión al 2-3% de los GRs a estudiar. Mezclar bien.

2. Rotular 2 tubos más y agregar en cada uno 1 gota del suero tipificador anti-D (ver Nota 1). Al tubo

rotulado “control positivo”, agregar 1 gota de GRs de control positivo y mezclar. Al tubo de

ensayo rotulado “control negativo”, agregar 1 gota de GRs de control negativo y mezclar.

3. Incubar la prueba y los tubos control durante 15 minutos a 37°C.

4. Lavar los GRs 3 veces con salina. Descartar la salina completamente después del último lavado.

5. Agregar 1 gota de SAGH. Mezclar bien y dejar estar 5 minutos. Agitar frecuentemente.

6. Lavar los GRs 3 veces con salina. Descartar la salina completamente después del último lavado.

7. Agregar 1 gota de GRs recubiertos con anticuerpo IgG y mezclar bien.

8. Centrifugar 15 a 1000g , resuspender suavemente, y repetir la centrifugación y la resuspensión.

9. Colocar una alícuota de la suspensión en un portaobjetos, cubrir con el cubreobjetos, y examinar

microscópicamente. Las rosetas en medio de GRs no aglutinados indican la presencia de una

población menor de GRs.

Interpretación

Si se observan rosetas en la prueba y el control positivo pero no se encuentran en el control negativo, está

presente una población menor de GRs antígeno positivos.

Si el control positivo no muestra rosetas, los resultados deben ser invalidados porque:

• Hay demasiado pocos GRs de la población menor en la mezcla o,

• El antisuero no es específico para el antígeno de los GRs de la población menor o,

alternativamente, de los GRs detectores.

Notas

1. Aunque esta guía habla del uso de anti-D y de GRs Rh positivo y Rh negativo, si es necesario se

pueden usar otros antisueros IgG y los GRs de control apropiados.

2. Jones y Silver afirman que puede ser detectada usando esta técnica, una población menor de GRs

que representen tan poco como 1:100.000.

Referencias

1. Jones AR, Silver S. The detection of minor erythrocyte population by mixes agglutinates. Blood

1958;13:763-72.

Método 9 – Investigación semicuantitativa de la inhibición de la hemaglutinación

Principio

En un fluido como saliva y por titulación puede determinarse la cantidad de sustancia de grupo sanguíneo.

Se titulan diluciones dobles del fluido contra una cantidad fija del antisuero que la sustancia es capaz de

inhibir.

Aplicación

La prueba es utilizada para determinar semicuatitativamente la cantidad de antígeno secretado.


1. Saliva.

2. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%.

3. Anti-A o anti-B

4. GRs testigo suspensión al 3% de GRs de grupo A2 o B

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Tubos de ensayo


Procedimiento

1. Recolectar 2-3 mL de saliva (ver Nota 1). Hervir la saliva 10 minutos para destruir la actividad

enzimática. Centrifugar la saliva a 1000g durante 10 minutos. Remover el sobrenadante (ver Nota

2).

2. Preparar diluciones dobles estándar de la saliva en ASB al 6% (0.1 mL de saliva en 0.1 mL de

diluyente, hacer diluciones hasta 1:512 para cada antisuero que va a ser estudiado).

3. Preparar diluciones dobles estándar de anti-A o anti-B (ver Nota 3) hasta 1:512 (ver M123).

Enfrenta cada dilución con los GRs apropiados. Se debe seleccionar el tubo siguiente al último que

muestra una reacción de 2+ para usar en la prueba de inhibición. Agregar 2 gotas (0.1 mL) del

antisuero diluido a cada tubo con saliva. Mezclar y centrifugar durante 1 minuto.

4. Incubar los tubos de ensayo a temperatura ambiente durante 10 minutos.

5. Agregar 1 gota (0.05 mL) de los GRs testigos apropiados en cada tubo.


7. Centrifugar los tubos durante 15 segundos. Leer macroscópicamente.

Controles

1. Preparar un control positivo usando 2 gotas (0.1 mL) de diluyente y 2 gotas (0.1 mL) del antisuero

apropiado.

2. Estudiar la saliva de un secretor y de un no secretor conocidos. Ver en la Tabla 9-1 un ejemplo de

resultados.

Tabla 9-1: Estudio de Secreto y No Secretor

Dilución No Secretor Secretor

1:2 1+ 0

4 2+ 0

8 2+ 0

16 2+ 0

32 2+ 0

64 2+ 0

128 2+ 1+

256 2+ 2+

512 2+ 2+

Interpretación

A mayor cantidad de sustancia de grupo sanguíneo presente en la saliva, se necesitan diluciones más altas

para eliminar su actividad inhibitoria

Notas

1. Si se mastica parafina puede acelerarse la producción de saliva. Advertencia: masticar chicle u

otras sustancias proteicas o azucaradas pueden inhibir el antisuero.

2. La saliva hervida puede conservarse congelada en alícuotas.

3. Es preferible el anti-A o anti-B de donantes no hiperinmunizados al antisuero comercial porque

éste contiene más anticuerpo Ig, lo cual dificulta la inhibición.

Referencias

1. Beattie KM. Discrepancies in ABO blood grouping. In: Walker, RH, ed. A seminar on problems

encoutered in pretransfusion test. Washington, DC:AABB, 1972:159.

Método 10 – Tipificación ABO de GRs tratados con enzimas

Principio

El tratamiento enzimático remueve los residuos de ácido ciálico de los GRs, lo cual potencia la

aglutinabilidad de los GRs con anti-A o anti-B y destruye los receptores para Tn.

Aplicación

Puede evaluarse la causa de campos mixtos y reacciones débiles en la tipificación ABO repitiendo las

pruebas con GRs tratados con enzimas.


1. Ficina o papaína al 1% (ver M42).

2. Anti-A o anti-B

3. GRs a estudiar, en suspensión salina al 5%

4. Controles, suspensión al 5% de GRs reactivos de grupo A, B y O

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina

7. Incubador / baño térmico


Preparación de los reactivos

1. Lavar los GRs a estudiar 2-3 veces con salina, luego preparar una suspensión al 5% en salina.

2. Preparar una batería de GRs no tratados y una de GRs tratados con enzimas (ver M42).

Procedimiento

1. Rotular una cantidad suficiente de tubos de ensayo para los GRs tratados y no tratados.

2. A 1 gota de cada muestra de GRs, agregar 1 gota del antisuero apropiado (anti-A anti-B).

3. Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4. Centrifugar a 1000 durante 15 segundos.

5. Leer, graduar y registrar los resultados.

Interpretación

1. Si la aglutinación de los GRs tratados con enzimas no se potencia o sólo lo hace ligeramente, pero

persiste la aglutinación en campo mixto, pueden estar presentes dos poblaciones eritrocitarias de

diferentes especificidades. Las dobles poblaciones resultan más a menudo por transfusiones no

isogrupo y menos comúnmente por un trasplante de médula ósea reciente. Otras causas raras de

mosaicismo son el resultado de dispermia o el intercambio intraútero de los GRs primigenios en

hermanos gemelos.

2. Si la aglutinación con los GRs tratados con enzimas es potenciada y se elimina la aglutinación en

campo mixto en las pruebas con anti-A, esto es indicativo del grupo A3.

3. Si la aglutinación con los GRs tratados con enzimas desaparece, debe considerarse una activación

Tn. Ver Capítulo VII, Poliaglutinación.

Referencias

1. Beattie KM. Personal communication, 1992.

Método 11 – Determinación de anti-A o anti-B por de inhibición de la hemaglutinación usando

sustancias grupo específicas (SGE)

Principio

Las sustancias solubles grupo específicas A y B (SGEA/SGEB) inhiben fácilmente a las IgM anti-A y

anti-B. La variedad IgG de estos anticuerpos también puede ser inhibida, pero requiere de cantidades

mucho mayores de SGE.

Aplicación

Puede identificarse el anti-A o el anti-B en suero o en eluatos por inhibición de la hemaglutinación

usando SGE.


1. Neutr-AB®, catálogo número B4830, Dade Division, Baxter Diagnostic, Inc. (ver Nota 1)

2. GRs de grupo A2 o B (los que se requieran)

3. Tubos de ensayo

4. Solución salina

5. Pipetas


7. Suero o eluato a estudiar

Procedimiento

1. Agregar 2 gotas del suero o eluato a estudiar en cada uno de 2 tubos de ensayo apropiadamente

rotulados.

2. Agregar 1 gota de Neutr-AB o SGEA/B de la saliva de un secretor a 1 tubo de ensayo y 1 gota de

solución salina al otro tubo como control de la dilución. Mezclar (ver Nota 2).


4. Centrifugar a 1000 g durante 30 segundos.

5. Leer y registrar los resultados.

Interpretación

1. Si se observa aglutinación en el tubo que contiene el suero o eluato y la solución salina pero no en

el tubo que contiene la SGEA/B, la inhibición de esta última reacción indica que en el suero

estudiado estaba presente el anti-A (o anti-B, según sea el caso).

2. Si no se observa aglutinación en ningún tubo, es improbable que el anticuerpo esté presente. Por

otro lado, la dilución puede hacer que al anticuerpo sea demasiado débil para dar una reacción

observable. En este caso, puede resolver el problema se se duplica la cantidad de suero a estudiar

mientras se mantiene la cantidad de SGEA/B en 1 gota, Alternativamente, el suero a estudiar

puede ser concentrado (ver M35).

Notas

1. Alternativamente, la SGEA o SGEB puede ser preparada de saliva humana de un

secretor (ver M3).

2. Si se usa saliva como fuente de SGE, centrifugar el tubo de ensayo antes de agregar la

saliva para permitir que la saliva viscosa se mezcle con el suero o eluato a prueba.

Referencias


Método 12 – Investigación de GRs sospechosos de ser B adquirido con anti-B acidificado

Principio y aplicaciones

Los GRs que tienen los antígenos B adquiridos reaccionarán con el anti-B común o el comercial, pero no

lo harán cuando estos antisueros son acidificados a un pH inferior a 6. Esta prueba es útil para diferenciar

los antígenos B adquirido de los B heredado.


1. Anti-B comercial

2. GRs de grupo B, en suspensión salina al 3%

3. GRs que se sospechan ser B adquirido, en suspensión salina al 3%

4. HCl 0.1 N

5. Solución salina

6. Papel para medir pH

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo


Procedimiento

1. Agregar 1 gota de HCl 0.1 N a 4 gotas de anti-B comercial.

2. Medir el pH. Ajustar el pH a 4.5 agregando HCl 0.1 N o anti-B según se requiera.

3. Control: diluir una segunda alícuota de anti-B con igual cantidad de salina.

4. Agregar 1 gota de GRs sospechados de ser B adquirido a un tubo de ensayo rotulado “ácido” y 1

gota a un tubo rotulado “control”. Agregar 1 gota de células de grupo B a un tubo rotulado “ácido”

y 1 gota a un tubo rotulado “control”.

5. Agregar 1 gota del anti-B acidificado en cada tubo “ácido”. Agregar 1 gota de anti-B control en

cada tubo “control”.

6. Centrifugar durante 15 segundos, resuspender suavemente, leer y registrar la aglutinación.

Interpretación

La Tabla 12-1 muestra los resultados esperados si los GRs de grupo A han adquirido el antígeno B.

Tabla 12-1 GRs Grupo A con antígeno B adquirdo

Glóbulos rojos Anti-B acidificado Control Anti-B

B Adquirido

Grupo B conocido

O

4+

+ (habitualmente +w o 1+

4+

Referencias

1. Gerbal A, Masler C, Salmon CH. Immunologic aspects of the adquired-B antigen. Vox Sang

1975;28:398.

2. Gerbal A, Ropars C. The adquired-B antigen. Rev Fr Transfus and Immunohematol 1976;19:127.

3. Judd WJ. Microbiao-associated forms of polyagglutination (T, Tk and adquired-B). Beck ML,

Judd WJ, eds. In: Polyagglutination. Washington, DC: AABB, 1980.

Método 13 – Reacetilación de GRs B adquirido

Principio

Los GRs de grupo A1 que tienen el antígeno B adquirido in vivo a través de la deacetilación de sus

residuos de N-acetil galactosamina (determinante del grupo A) pueden ser reacetilados in vitro.

Aplicación

Esta prueba se usa para confirmar el estado B adquirido de los GRs.


1. Buffer fosfato (BF) 0.2 M (pH 8.5)

2. Anhídrido acético, (CH3CO)2O, Aldrich Chemical Co.

3. NaOH 1.0 N o Na2HPO4 0.5 M.

4. Agitador magnético y varilla agitadoras

5. Agua destilada


7. Tubos de ensayo

8. Pipetas


10. Campana química

11. GRs B adquirido a estudiar

12. GRs de control de grupo B

Procedimiento

1. Preparar el buffer fosfato 0.2 M disolviendo 2.84 g de Na2HPO2, 0.85 g de NaCl, y 2 mL de

glicerol en aproximadamente 80 mL de agua destilada. Diluir hasta un volumen final de 100 mL

con agua destilada.

2. Preparar NaOH 1.0 N disolviendo 4.0 g de NaOH en 100 mL de agua destilada, o preparar

Na2HPO4 disolviendo 7.1 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

3. Permitir que el buffer fosfato y el Na2HPO4 0.5 M tomen temperatura ambiente antes de usar (ver

Nota 1).

4. A 0.1 mL de paquete globular de los GRs B adquirido (lavados 3 veces con salina), agregar 3.0

mL de buffer fosfato 0.2 M.

5. A 0.1 mL de paquete globular de los GRs B de control (lavados 3 veces con salina), agregar 3.0

mL de buffer fosfato 0.2 M.

6. Mientras se agita constantemente las suspensiones de GRs con un agitador magnético y la pequeña

barra magnética, agregar 20 ul de anhídrido acético (ver Notas 2 y 3).

7. Incubar las mezclas a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8. Neutralizar cada mezcla a pH 7.0 con NaOH, o neutralizar las mezclas agregando 2.0 mL de

Na2HPO2 0.5 M.

9. Lavar los GRs 4 veces con solución salina.

10. Estudiar con reactivos anti-B.

Interpretación

1. Una marcada reducción de la reactividad de los GRs con los reactivos anti-B después del

tratamiento con anhídrido acético es indicativo de un antígeno B adquirido. Los antígenos B

heredados no son afectados por este tratamiento.

2. Si inicialmente no son reactivos o sólo débilmente reactivos con la lectina Dolichos biflorus (anti-

A1), los GRs B adquirido mostrarán una expresión normal del antígeno A1 después del tratamiento

con anhídrido acético.

Notas

1. El Na2HPO4 cristaliza al conservarse a 4°C. Disolver calentando a 37 °C si es necesario.

2. El volumen preciso de anhídrido acético a usarse deberá ser determinado empíricamente, porque la

hidratación varía en grado extremo entre las partidas de anhídrido acético. La hidratación extrema

puede causar la decoloración o lisis de los GRs.

3. Usar una campana química cuando utilice el anhídrido acético.

Referencias

1. Gerbal A, Ropars C, Gerbal R, et al. Adquired-B antigen disappearance by in vitro acetylation

associated with A1 activity restoration. Vox Sang 1976;31:64-6.

2. Lisowska E, Duk M. Effect of modification of amino groups of human erythrocyte M, N, and Nvg

blood group specificities. Vox Sang 1975;28:392-7.

Método 14 – Dispersión de la aglutinación causada por la Gelatina de Wharton

Principio

La hialuronidasa remueve el ácido hialurónico de los GRs.

Aplicación

La sangre de cordón obtenida en forma inapropiada (Ej.: expresión del cordón) puede contener gelatina

de Wharton, la cual puede causar falsas tipificaciones ABO/Rh debido al ácido hialurónico en el cual

están inmersos los GRs.


1. Hialuronidasa (c.s.p. 150 unidades), Signa Chemical Co.

2. Suero de grupo AB inerte (libre de anticuerpos)

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo



8. GRs de cordón a estudiar

Procedimiento

1. Lavar los GRs de cordón 3 veces con solución salina a 37 °C. Resuspender al 3% en salina.

2. Por cada gota de los GRs a ser estudiados, agregar 1 gota de hialuronidasa. Mezclar y dejar estar 2

minutos.

3. Así, los GRs pueden usarse para estudiar si el control no muestra aglutinación.

Controles

A 1 gota de la suspensión de GRs de cordón, agregar 1 gota de hialuronidasa. Dejar en reposo 2 minutos

antes de agregar 1-2 gotas de suero de grupo AB.

Interpretación

Si el tubo control muestra aglutinación, el tiempo de incubación con hialuronidasa debe aumentarse o

debe obtenerse una nueva muestra de sangre periférica del paciente.

Referencias

1. Flanagan CJ, Mitoma TF. Clumping (false agglutination) of blood from the umbilical cord. Am J

Clin Path 1958;29:337.

Método 15 – Investigación de la formación de rouleaux

Principio

Los sueros con propiedades para producir rouleaux llevan a que la mayoría de los GRs parezcan

aglutinados cuando son estudiados. La observación microscópica de la característica formación en “pila

de monedas” o la dispersión por el agregado de salina distinguirá la formación de rouleaux de una

verdadera aglutinación.



2. Microscopio

3. Portaobjetos

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. Solución salina

7. Suero y GRs a estudiar

Procedimiento

Técnica de adición de salina para detectar formación de rouleaux

1. Colocar 1 gota de la mezcla de GRs/suero a estudiar en un portaobjeto. Observar

microscópicamente para los característicos agregados de GRs semejantes a “pilas de monedas”

(ver después de las fases de aglutinación, salina a temperatura ambiente o a 37 °C), en cambio los

agregados de forma irregular resultan de la aglutinación mediada por anticuerpos.

2. Agregar 1 gota de salina a la mezcla. Mezclar y observar microscópicamente en busca de la

dispersión de los agregados semejantes a “pila de monedas”.

Técnica de reemplazo con salina para detectar anticuerpo(s) enmascarados por rouleaux

1. Después que el suero y los GRs han sido incubados a temperatura ambiente o a 37 °C por 10-15

minutos, centrifugar a 1000 g durante 1 minuto y remover el suero con una pipeta.

2. Reemplazar el suero en estudio con igual volumen de salina y mezclar suavemente.

3. Centrifugar durante 15 segundos y resuspender suavemente mientras se examina en busca de

aglutinación.

4. Observar microscópicamente en busca de aglutinación.

Interpretación

El agregado de salina dispersa la formación de rouleaux, pero generalmente no revierte una verdadera

aglutinación. Sin embargo, en algunos casos de mieloma múltiple los GRs pueden estar tan

apretadamente unidos entre sí después de la centrifugación que la salina no los dispersará. En estas

circunstancias, repetir la prueba pero no centrifugar antes de examinar microscópicamente.

Notas

1. El rouleaux es un fenómeno del suero y usualmente no ocurre en la fase antiglobulínica

porque los GRs son lavados, y quedan libres de suero.

2. El rouleaux se ve en enfermedades asociadas con alteración de la relación albúmina:

globulina, tales como mieloma múltiple, macroglobulinemia, crioglobulinemia, Sarcoma de Boekc,

cirrosis, hiperfibrinogenemia y en infecciones.

Referencias

1. Schimdt PJ, Kevy SV. Sources of error in a hospital blood bank. Transfusion 1963;3:198-200.

Método 16 – Detección de anticuerpos irregulares


El suero de un paciente o donante es investigado en busca de anticuerpo(s) irregulares enfrentándolo con

2 o 3 muestras de GRs de grupo O seleccionados para los determinantes antigénicos comunes de los

sistemas de grupo sanguíneo Rh, MNSs, Lewis, P, Kell, Duffy, Kidd y Luteran. Cuando la incubación de

estas pruebas a 37 °C es seguida por la fase antiglobulínica (SAG), serán detectados el 95% o más de los

anticuerpos clínicamente significativos.


1. Tubos de ensayo

2. Pipetas

3. GRs reactivos para detección de anticuerpos, en suspensión al 2-4% en salina

4. Solución salina

5. Suero Antiglobulina humana (SAGH) (poliespecífica o IgG)

6. GRs cubiertos con IgG (Control Coombs)



9. Albúmina sérica bovina (ASB) al 22 o 30% P/V

10. Suero a estudiar y células

Procedimiento

1. Rotular 2 tubos de ensayo con el nombre del paciente (o número de dador) y el número de los GRs

reactivos (I, II). Rotular un tercer tubo “autocontrol”.

2. Pipetear 0.15 mL (3 gotas) del suero del paciente en cada uno de los tubos.

3. Al suero en el tubo 1, agregar 0.05 mL (1 gota) de GRs reactivos I; al tubo 2, agregar 0.05 mL (1

gota) de GRs II; y al tubo 3 (“autocontrol”), agregar 0.05 mL (1 gota) de suspensión al 2-3% de

GRs autólogos.

4. Opcional: Incubar los 3 tubos por 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 37 °C 15-20

segundos a 1000 g , y leer si hay aglutinación (ver Nota 1). Registrar los resultados.

5. Opcional: Agregar 0.10 mL (2 gotas) de ASB y mezclar (ver Nota 2).

6. Incubar la mezcla de suero-GRs durante 30 minutos a 37 °C. Centrifugar por 15-20 segundos y

examinar para hemólisis y aglutinación. Registrar los resultados.

7. Lavar 3 veces con salina, descartar completamente el sobrenadante después del último lavado.

8. Agregar 0.10 mL (2 gotas) de SAGH a cada tubo y mezclar bien.

9. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y examinar para aglutinación.

Registrar los resultados.

10. Agregar 0.05 mL (1 gota) de GRs cubiertos con IgG a cada prueba negativa.

11. Centrifugar durante 15 segundos y leer para aglutinación. Si el contenido de algún tubo falla en

aglutinar, el procedimiento debe repetirse para ese tubo de ensayo.

Interpretación

Ver en la Tabla 16-1 las posibles causas de una prueba de detección de anticuerpos positiva.

Notas

1. Los anticuerpos detectados a temperatura ambiente en la fase salina son usualmente considerados

sin significancia clínica.

2. Con la excepción del anti-K, un método más rápido para detectar anticuerpos es utilizando un

medio salino de baja fuerza iónica (LISS) (ver M21, M23, y M25).

Referencias

1. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:555-557.

Tabla 16-1: Guía para posibles causas de incompatibilidad durante la Prueba Cruzada Mayor

Fase Autocontrol Células del donante Células Pantalla Posibles causas

Pre- 37ºC o + + Alo Ac IgM,

Alo Ac IgG, (raro)

+ + + Rouleaux, crioaglutininas, Auto Ac

Caliente

+/o algunos + + Receptor A1, A1B o B con anti-H o IH

+ algunos + o Receptor Asub. AsubB o B con anti- A1

AloAc IgM contra una Ag de baja

incidencia

o uno + o uno + El donante o una de las cél. Pantalla

es poliaglutinable

Post-37ºC o + + AloAc IgG

Potente AloAc IgM

+ + + Auto Ac caliente

Antiglobulínica + + + Auto Ac caliente (Idiopático o Droga

Dependiente)

Auto Ac frío fijador de complemento

Auto + Alo Ac

+ o o Paciente con PAD positiva

o uno + o Células de donante con PAD +, o es positiva

para un Ag de baja incidencia contra el cual

el paciente tiene un Ac.

o + + Presencia de uno o más Acs

o + + Alo Ac dirigido hacia un Ag de

alta incidencia

Presencia de múltiples Acs

Anti-H o IH fijadores de complemento

Método 17 – Identificación de anticuerpos


El suero que se sospecha contiene anticuerpos dirigidos contra los GRs es enfrentado con un panel

eritrocitario de 8-10 GRs provenientes de donantes con fenotipos seleccionados. Las pruebas son

observadas en busca de hemólisis y aglutinación directa y después en fase de antiglobulina indirecta. La

interpretación de los resultados de la prueba está basada en la temperatura de reacción, medio de reacción,

actividad hemolítica, efecto dosis, habilidad para fijar complemento, y neutralización con sustancias

solubles.


1. Tubos de ensayo

2. Pipetas

3. Panel de GRs reactivos, suspensión al 2-4%



6. Solución salina

7. Suero Antiglobulina humana (SAGH) (poliespecífica o IgG)


9. Suero a estudiar y GRs

Procedimiento

1. Rotular tubos de ensayo según el número viales de GRs del panel y para uno para autocontrol.

2. Colocar 1 gota de la suspensión de GRs apropiados en cada tubo de ensayo. Agregar 1 gota de la

suspensión al 2-4% de los GRs del paciente en el tubo de autocontrol.

3. Agregar 2-3 gotas del suero del paciente a cada tubo y mezclar bien.

4. Opcional: Incubar la mezcla GRs-suero a temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar a

1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el

botón suavemente, y observar para aglutinación. Registrar los resultados en la correspondiente

tabla del panel.

5. Incubar los tubos a 37 °C durante 30 minutos.

6. Centrifugar durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender

el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados en la

correspondiente tabla del panel.

7. Lavar 3 veces con salina, descartar completamente el sobrenadante después del último lavado.

8. Agregar 2 gotas de SAGH a cada tubo y mezclar bien.

9. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y examinar para aglutinación.


10. A todas las pruebas negativas agregar 1 gota de GRs cubiertos con IgG.

11. Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar para aglutinación. Si cualquier tubo careciera de

aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo de ensayo.

Interpretación

1. La aglutinación o hemólisis en cualquier fase de la prueba es considerada como un resultado

positivo e indica la presencia de anticuerpo(s) en el suero dirigidos contra los antígenos

representados en los GRs de prueba.

2. Excluir de una consideración inicial los anticuerpos hacia antígenos presentes en doble dosis en los

GRs reactivos que no reaccionen con el suero del paciente.

3. Cuando el autocontrol es no reactivo y el paciente no ha sido transfundido por lo menos en 90 días,

excluir los anticuerpos hacia antígenos presentes en los GRs del paciente.

4. Para los aloanticuerpos, los GRs del individuo que los produce deben carecer del correspondiente

antígeno. Si el paciente hubiera sido transfundido recientemente, separar y fenotipar los neocitos

del paciente (ver M84, 87).

5. Por lo menos 3 GRs positivos para el antígeno y 3 GRs negativos para el antígeno deben dar las

reacciones esperadas con el suero del paciente para un valor de p de 0.5.

6. Cuando no hay una especificidad aparente, realizar pruebas usando otras técnicas tales como

albúmina-PAG (ver M21), LISS-PAG (ver M23), LIP-PAG (ver M25), PEG (ver M26), o enzimas

(ver M42). Considerar aumentar la relación suero-GRs (ver M119), extender el tiempo de

incubación, modificar la temperatura o el pH de la prueba (ver M18), o usando sustancias solubles

para pruebas de inhibición (ver M31).

7. Cuando el problema no puede resolverse satisfactoriamente y el paciente necesita ser transfundido,

consultar con otro laboratorio de referencia.

Notas

1. La fuerza de las reacciones puede ser un indicio de la especificidad del anticuerpo(s) presente en el

suero. Evaluar las reacciones como se delinea en el procedimiento para lectura e interpretación de

las reacciones (ver M117).

2. La técnica de LISS es frecuentemente usada en los laboratorios de referencia para la detección e

identificación rutinarias de anticuerpos porque es más rápida y eficiente (ver M23).

3. Cuando sea posible la exclusión de anticuerpos, debe realizarse usando GRs reactivos con doble

dosis o expresión fuerte del antígeno.

4. Ciertos antígenos de grupos sanguíneos son desnaturalizados por algunas o todas las enzimas

proteolíticas: M, N, S, Fya, Fyb, Ch, Rg, Yta, Xga, y Pr. El suero que reacciona con los GRs no

tratados, pero no con aquellos mismos GRs después del tratamiento enzimático, puede contener

anticuerpos dirigidos hacia u o más de esos antígenos (ver M42).

Referencias

1. Issitt PD. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publicacions,

1985.

2. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990.

3. Daniels G. Effect of enzymes on and chemical modifications of high-frequency red del antigens.

Immunohematology 1992;8:53-7.

Método 18 – Acidificación del suero


Algunos anticuerpos del sistema MN, anti-Pr, y anti-Sda reaccionan mejor cuando el pH del suero a

estudiar es de alrededor de 6.0. La acidificación del suero potenciará las reacciones de muestras

débilmente reactivas de esos anticuerpos sensibles al pH.


1. HCl 0.1 N

2. Suero a estudiar

3. Agua destilada

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas


7. GRs reactivos


1. Preparar HCl 0.1 N diluyendo 1 parte de HCl 12 N con 119 partes de agua destilada o agregando

0.1 mL de HCl concentrado (12 N) a 11.9 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. A 4 partes del suero a estudiar, agregar 1 parte de HCl 0.1 N. Mezclar bien.

2. Estudiar el suero con papel para pH para asegurarse que su pH es 6.0-6.5.

3. Estudiar el suero acidificado contra un panel de GRs reactivos seleccionados, incluyendo por lo

menos un GR que carezca del antígeno correspondiente a la especificidad sospechada del

anticuerpo.

Interpretación

Las aglutininas que son sensibles al del pH del medio ambiente pueden reaccionar débilmente o sólo con

GRs que tienen un antígeno fuerte o en doble dosis en el pH normal del suero. La acidificación del suero

para reducir el pH entre 6.0 y 6.5 potencia la reactividad de estos anticuerpos.

Si las reacciones débiles no se potencian por la acidificación, las aglutininas no son sensibles al

pH bajo.

Notas

1. El pH debe estar por encima de 6.0 porque pueden ocurrir reacciones no específicas por debajo de

este pH.

2. Los GRs usados en la prueba de suero acidificado deben lavarse para liberarlos de conservantes,

porque algunos diluyentes de los GRs pueden tener un nivel de pH tan alto como 7.5.

Referencias

1. Beattie KM, Zuelzer WW. The frequency and properties of pH-dependent anti-M. Transfusion

1965;5:322-6.

2. Marsh WL, Jenkins WJ. Anti-Sp1: The recognition of a new cold autoantibody. Vox Sang

1968;15:177-86.

3. Marsh WL, Johnson CL, Oyen R, Nichols ME, et al. Anti-Sdx: A new autoagglutinin relared to the

Sda blood group. Transfusion 1980;20:1-8.

Método 19 – Inhibición del anti-M o anti-N con M y N [Aislado de tríptico crudo]


Es posible inhibir el anti-M con sialoglicoproteína M, y el anti-N con sialoglicoproteína N. La

sialoglicoproteína M puede ser separada de GRs M+N- y la sialoglicoproteína N puede separarse de GRs

M-N+. Las sialoglicoproteínas preparadas por extracción [tríptico crudo] de GRs pueden usarse en

estudios de inhibición.


1. Suero a estudiar que contenga anti-M o anti-N

2. Salina tamponada con fosfato (PBS) 0.1 M pH 8.0 (ver M133)

3. Tripsina, tripsina tipo III de páncreas bovino, Sigma Chemical Co., catálogo número T-8253

4. Acido clorhídrico (HCl) 0.1 N

5. Aislado de tríptico crudo

6. Solución salina

7. Tubos de ensayo

8. Pipetas

9. pHmetro o Papel para medir pH

10. Agua desionizada

11. GRs M+N- y M-N+, suspensión al 5%

12. Columna de diálisis

13. Ventilador



1. Preparar PBS 0.1 M pH 8.0 (ver M133).

2. Preparar la tripsina para una concentración final de 1 mg/mL (ver Nota 1).

a.Preparación de tripsina para los GRs: disolver 100 mg de tripsina en 80 mL de PBS pH 8.0.

b.Preparación de tripsina para el blanco: disolver 50 mg de tripsina en 50 mL de PBS pH 8.0.

3. Preparar el HCl 0.1 N: Agregar 0.1 mL de HCl 12 N (37%) a 11.9 mL de agua desionizada.

4. Preparar Aislado de tríptico crudo:

a. Recolectar con cualquier anticoagulante 1 tubo de sangre de un voluntario M+N- y 1 tubo de

sangre de un voluntario M-N+ (ver Nota 2).

b.Lavar por lo menos 2.5 mL de GRs de ambas muestras 3 veces con salina.

c.Lavar 1 vez con PBS pH 8.0.

d.Preparar una suspensión de GRs al 20% en PBS pH 8.0 de ambas muestras.

e. Agregar 10 mL de cada suspensión de GRs al 20% a 2 alícuotas separadas de 40 mL de PBS

pH 8.0 conteniendo 50 mg de tripsina.

f. En un tercer recipiente, colocar los 50 mL de PBS pH 8.0 con 50 mg de tripsina (blanco).

g.Mezclar e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

h.Centrifugar a 2000 rpm (750 x g) durante 5 minutos.

i. Remover el sobrenadante, colocarlo en 3 recipientes limpios y hervir durante 10 minutos.

j. Concentrar los sobrenadantes y el blanco hasta alrededor de 1 mL. Colocar cada sobrenadante

en una columna de diálisis y colgar la columna frente a un ventilador para que tenga lugar la

evaporación.

k. Remover los sobrenadantes concentrados y el blanco de las columnas de diálisis y colocar en 3

tubos de ensayo.

l. Agregar 1 gota de HCl 0.1 N por cada mL de sobrenadante concentrado y blanco. Mezclar.

Procedimiento

La inhibición se puede realizar como una prueba de 1 tubo o como un procedimiento de titulación.

1. Titular (en salina) 0.5 mL de los sueros a estudiar con la técnica de diluciones dobles (ver M123).

2. Rotular 4 hileras de tubos de ensayo para las diluciones de M, N, blanco y salina.

3. Colocar 2 gotas de cada dilución en el correspondiente tubo en las cuatro filas de tubos.

4. a. Agregar 2 gotas de extracto tríptico M a la fila 1.

b. Agregar 2 gotas de extracto tríptico N a la fila 2.

c.Agregar 2 gotas de blanco de control a la fila 3.

d.Agregar 2 gotas de salina a la fila 4.


6. Agregar 1 gota de la suspensión al 5% en salina de los GRs apropiados.

7. Estudiar por técnica de reactividad óptima.

Controles

Estudiar en paralelo un reactivo anti-M y anti-N humanos.

Interpretación

El anti-M debe ser neutralizado por el extracto de M pero no por el extracto de N o los controles de

blanco y salina. El anti-N debe ser neutralizado por el extracto de N pero no por el extracto de M o los

controles de blanco y salina.

Notas

1. La tripsina debe prepararse inmediatamente antes de su uso.

2. Las muestras de GRs para aislado tríptico deben ser tomadas dentro de la hora del comienzo del

procedimiento.

3. Este método de extracción no es todas las veces exitoso. Los resultados son sólo confiables cuando

todos los controles reaccionan como se espera. Si el extracto es inactivo, repetir el procedimiento

usando muestras de GRs frescos.

Referencias

1. Issitt PD, Wilkinson SL. Anti-Tm is anti-N polipeptide. Transfusion 1981;21:493-7.

2. Dean W. Inhibition of anti-M o anti-N with M and N crude tryptic isolates. Red Cell Free Press –

American Red Cross Reference Laboratory Newsletter 1981;6(2):19.

Método 20 – Utilización de Albúmina


La albúmina probablemente incrementa la captación de anticuerpos al disminuir la fuerza iónica del

medio. Es posible potenciar la aglutinación de los GRs por anticuerpos débiles, particularmente aquellos

del sistema Rh, por la acción de la albúmina a los GRs después que han sido incubados con el suero a

estudiar.



2. Suero a estudiar, preferentemente obtenido dentro de las 48 horas

3. GRs a estudiar

4. GRs autólogos

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina

7. Pipetas



Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 3% en salina de los GRs a estudiar y los GRs autólogos.

2. Pipetear 1 gota de los GRs a estudiar en un tubo y la misma cantidad de GRs autólogos en un

segundo tubo. Centrifugar ambos tubos a 1000 g durante 1 minuto y descartar completamente la

salina para producir un botón seco de GRs.

3. A cada tubo de ensayo agregar 2-3 gotas del suero a estudiar.

4. Mezclar e incubar a 37 °C durante 15-30 minutos.

5. Centrifugar durante 10 segundos.

6. Cuidadosamente, dejar correr 2 gotas de ASB al 30% por el interior del tubo para formar una capa

sobre el botón de GRs. No mezclar el contenido del tubo.

7. Incubar los tubos de ensayo a 37 °C durante 15 minutos.

8. Mover los tubos suavemente y observar la aglutinación. Si se duda, pipetear una alícuota en un

portaobjetos y leer microscópicamente, y registrar los resultados (ver Nota 1).

Notas

1. Como la albúmina tiende a producir “adhesividad”, una aglutinación verdadera se determina mejor

con un examen microscópico.

Referencias

1. Case J. The albumin layering for D typing. Vox Sang 1959;4:403.

2. Garratty G. Personal communication, cited in Mollison PL, Blood transfusion in clinical medicine.

7th ed. Oxford: Blackwell, 1983:495.

Método 21 – Prueba de albúmina-antiglobulina

Principio

La albúmina incrementa la captación de anticuerpos por algunos antígenos eritrocitarios, notablemente en

el Sistema Rh. Con los anticuerpos de alto título y baja afinidad (HTLA), la albúmina probablemente

aumenta la captación del anticuerpo al disminuir la fuerza iónica del medio.

Aplicaciones

Este método puede usarse para la detección o identificación de anticuerpos y para las pruebas de

compatibilidad. Esta técnica es particularmente útil en el estudio de anticuerpos HTLA.


1. Albúmina sérica bovina (ASB) al 22% o 30% P/V

2. Suero Antiglobulina Humana (SAGH) (poliespecífica o anti-IgG)

3. Suspensiones al 3-5% en salina de GRs reactivos, autólogos y otros GRs de fenotipos

seleccionados

4. Suero a estudiar

5. GRs recubiertos con IgG (Control Coombs), suspensión al 3-5% en salina

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo



Procedimiento

1. Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a estudiar y para el autocontrol.

2. Agregar a cada tubo, 2-3 gotas (0.1 mL) de suero, 2-3 gotas (0.1 mL) de ASB, y 1 gota (0.05 mL)

de GRs a estudiar. A la misma cantidad de suero y ASB en un tubo rotulado “autocontrol”, agregar

1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos. Mezclar.

3. Incubar a 37 °C durante 30 minutos.

4. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis,

resuspender el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

5. Lavar 3-4 veces con salina, descartar completamente después de cada lavado.

6. Agregar la cantidad de SAGH especificada por el fabricante a cada tubo y mezclar bien.

7. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y observar en busca de

aglutinación. Registrar los resultados.

8. Opcional: Examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

9. Agregar 1 gota de GRs recubiertos con IgG a cada tubo.

10. Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Si cualquier tubo carece

de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Referencias

1. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:556.

Método 22 – Técnica de salina-antiglobulina

Principio

La sensibilización de GRs por anticuerpos es detectada por la adición de suero antiglobulina humana

(SAGH).

Aplicaciones

Este método puede usarse para la detección e identificación de anticuerpos y para las pruebas de

compatibilidad.


1. SAGH (poliespecífica o anti-IgG)

2. Suero a estudiar

3. Suspensiones al 3-5% en salina de GRs reactivos, autólogos y otros GRs con fenotipos

seleccionados

4. GRs recubiertos con IgG (Control Coombs), suspensión al 3-5% en salina

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Tubos de ensayo



Procedimiento

1. Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a estudiar (“prueba”) y para el

autocontrol (“auto”).

2. Agregar a cada tubo, 2-3 gotas (0.1 mL) de suero a estudiar. Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs

reactivos a los tubos rotulados “prueba” y 1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos al tubo rotulado

“auto”. Mezclar.

3. Opcional: incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis,

resuspender el botón suavemente, y observar macroscópicamente en busca de aglutinación.


5. Incubar a 37 °C durante 30-60 minutos.

6. Centrifugar durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender

el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

7. Lavar 3 veces con salina, descartar completamente después de cada lavado.


9. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y observar en busca de


10. Opcional: Examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

11. Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs recubiertos con IgG a cada prueba negativa.

12. Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

Si cualquier tubo carece de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Notas

1. El SAGH anti-IgG puede sustituirse por SAGH poliespecífico para permitir la detección de

anticuerpos irregulares, reactivos en frío que fijan complemento.

Referencias

1. Coombs Rra, Mourant AE, Race RR. A new test for the detection of weak and “incomplete” Rh

agglutinins. Brit J Exp Path 1945;26:255-66.

Método 23 – Prueba de solución salina de baja fuerza iónica-antiglobulina (LISS-PAG)

Principio

Con la disminución de la fuerza iónica, aumenta la unión de los anticuerpos con sus correspondientes

antígenos. Una solución de baja fuerza iónica 0.03 M es efectiva para la detección de anticuerpos de

grupos sanguíneos, manteniendo todavía la sensibilidad de la prueba. Las reacciones positivas debidas al

agregado de inmunoglobulinas y/o a la activación del complemento no se observan cuando se usa LISS.

Aplicación

La mayor ventaja de este procedimiento es acortar el tiempo de incubación para la detección e

identificación de anticuerpos y en las pruebas de compatibilidad.


1. Solución salina

2. LISS 0.03 M

3. Suero Antiglobulina Humana (SAGH) (poliespecífica o anti-IgG)


5. Suero a estudiar

6. Suspensiones al 2-4% en LISS de GRs autólogos y reactivos o GRs de fenotipos seleccionados

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo



Preparar LISS 0.03 M combinando lo siguiente:

• 180 mL de solución salina 0.17 M

• 20 mL de buffer fosfato 0.15 M, pH 6.7

• 800 mL de glicinato de sodio 0.3 M, pH 6.7

Procedimiento

1. Lavar los GRs por lo menos una vez con salina y descartarla completamente después del último

lavado.

2. Resuspender los GRs al 2-4% en LISS.

3. En tubos de ensayo apropiadamente rotulados, agregar igual volumen (2 gotas) de suero y de GRs

suspendidos en LISS.

4. Incubar 10-15 minutos a 37 °C.

5. Centrifugar a 1000 g durante 15 segundos. Leer macroscópicamente en busca de hemólisis y


6. Lavar los tubos 3-4 veces con salina, descartar el sobrenadante completamente después de cada

lavado.


8. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente, y observar en busca de


9. Opcional: examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.




Notas

1. El LISS puede conservarse a 4 °C y, a menos que haya sido esterilizado, debe descartarse a los

pocos días. La conservación puede extenderse con el agregado de 0.5 g de ázida sódica como

conservante. A esta concentración, la fuerza iónica del LISS es elevada de 0.0355 a 0.043 sin que

afecte apreciablemente la reactividad serológica.

2. Hay disponible LISS comercial y debe ser usado y conservado siguiendo estrictamente las

instrucciones del fabricante.

Referencias

1. Low B, Messeter L. Antiglobulin test in low ionic salt solution for rapid antibody screening and

crossmatching. Vox Sang 1974;26:53.

2. Moore HC, Mollison PL. Use of a low ionic-strength medium in manual tests for antibody

detection. Transfusion 1976;16:91.

3. Widmann FK, ed. Technical manual. 8th ed. Arlington, VA: AABB, 1985:205-6.

4. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:557.

5. Fritzsimmons JM, Morel PA. The effects of red blood cell suspending media on hemagglutination

and the antiglobulin test. Transfusion 1979;19:81-5.

Método 24 – Prueba de antiglobulina en medio de baja fuerza iónica (LIM por las siglas en inglés-

PAG)


El suero y los GRs son incubados a 37 °C en un medio de baja fuerza iónica (LIM), luego son lavados

con una solución de baja fuerza iónica y probados usando anti-IgG de baja fuerza iónica (LISS). Las

reacciones antígeno-anticuerpo son resaltadas por el mantenimiento de las condiciones de baja fuerza

iónica a través del procedimiento. Este método es muy útil para investigar sueros que parecen carecer de

anticuerpos con los métodos de rutina. Puede usarse para investigar anemia hemolítica con Coombs

negativa o otros problemas de pacientes que se sospechan tienen anticuerpos de baja afinidad.


1. Suero a estudiar

2. GRs detectores o de panel, suspensión al 3%

3. Medio de baja fuerza iónica

4. Solución de lavado de baja fuerza iónica

5. Anti-IgG de baja fuerza iónica

6. Buffer de Sorenson pH 7.0



9. Tubos de ensayo

10. Pipetas

11. Solución salina

12. Papel para medir pH o pHmetro

13. Columna de diálisis

14. Suero anti-globulina humana anti-IgG


1. a. Preparar el buffer de Sorenson, pH 7.0 combinando 41.3 mL de solución A (9.073 g/L de

KH2PO4) con 58.7 mL de solución B (9.610 g/L de Na2HPO4)

b. Diluir el buffer de Sorenson para hacer buffer de Sorenson 0.004 M, combinando 60 mL de

buffer de Sorenson con 960 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

2. Preparar solución de lavado LISS disolviendo 15.2 g glicina en polvo y 1.62 g de NaCl en 1000

mL de buffer de Sorenson 0.004 M.

3. Preparar LIM disolviendo 19 g de glicina en polvo en 1000 mL de agua destilada, ajustar el pH a

7.0, conservar a 4 °C.

4. Preparar el anti-IgG de baja fuerza iónica por cualquiera de los siguientes métodos.

Método A: Usando anti-IgG natural

Determinar por una titulación (prueba de las diluciones del anti-IgG contra diluciones del

anticuerpo) el título óptimo de trabajo para el anti-IgG sin diluir. Usar para esta determinación el

diluyente de baja fuerza iónica y varios anticuerpos IgG débiles. El pH del diluyente de baja fuerza

iónica debe ser de 7.0. El diluyente de baja fuerza iónica es: 0.18% de NaCl, 0.5% de albúmina

bovina y 1,52% de glicina.

Método B: Usando anti-IgG comercial

Dializar el reactivo anti-IgG comercial en la solución de lavado durante una noche. Colocar la

cantidad de IgG a ser dializada en una columna de diálisis que está anudado en un extremo. Usar

una columna de diálisis que sea lo suficientemente grande como para alojar un volumen a tratar y

un gran volumen de solución de diálisis. Extraer el aire de la columna de diálisis por encima del

anti-IgG y hacer un nudo en la parte superior de la columna. Introducir la columna de diálisis en la

solución de diálisis hasta que la columna esté totalmente sumergida en la solución. La columna

puede rajarse y perder el contenido si se permite que se seque. Después del dializado durante la

noche, sacar la columna de diálisis y secarla, entonces cortar para abrirla y drenar el anti-IgG en un

frasco limpio y estéril. Este se puede conservar a 4 °C. El anti-IgG debe estudiarse con varios

ejemplos de anticuerpos débiles del sistema Kidd para asegurarse que se comporta

satisfactoriamente.

Controles

1. El control positivo es un anticuerpo que reacciona débilmente con GRs antígeno positivos.

2. El control negativo puede ser un autocontrol o el suero anticuerpo positivo con GRs antígeno

negativos.

Procedimiento

1. Mezclar 1 gota de GRs al 3% con 4 gotas del suero a estudiar e incubar a 37 °C durante 2 minutos.

Preparar los controles positivos y negativos de la misma forma.

2. Agregar 8 gotas de glicina al 1.9% precalentada a cada prueba y al control.


4. Centrifugar a 1000 x g. Remover el sobrenadante, y lavar 3 veces con la solución de lavado de

baja fuerza iónica (LISS), decantar completamente después de cada lavado.

5. Agregar 2 gotas de anti-IgG LISS, centrifugar, y resuspender suavemente. Leer y registrar los

resultados.

6. Opcional: examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.




Notas

1. Este método tiene una alta tasa de falsos positivos (hasta el 9% si los resultados son leídos sólo

macroscópicamente) y no puede usarse para la detección rutinaria de anticuerpos.

Referencias

1. Ahn JH, Rosenfield RE, Kochwa S. Low ionic antiglobulin tests. Transfusion 1987;27:125-33.

2. Postoway N, Garratty G. Evaluation of newly described low ionic antiglobulin test (abstract).

Transfusion 1987;27:516.

Método 25 – Prueba de Polybrene® de baja fuerza iónica-antiglobulina (LIP-PAG)

Principio

El Polybrene, un polímero de amonio cuaternario, provoca la agregación de los GRs normales, soluciones

salinas hipertónicas, tal como el citrato sódico, dispersan esta agregación. En la prueba LIP-PAG, si los

GRs son sensibilizados con anticuerpo por la incubación en un medio de baja fuerza iónica y luego

tratados con Polybrene, la aglutinación no será dispersada por la subsiguiente adición de citrato sódico.

Aplicación

Como que el método es rápido y muy sensible, puede usarse para la identificación de anticuerpos y para

la detección de un gran número de unidades antígeno negativo para pacientes cuyos sueros contienen

anticuerpos débiles.


1. Medio de baja fuerza iónica (LIM)

2. Polybrene, solución almacenada al 10% P/V

3. Solución de Polybrene (agregación)

4. Solución de citrato sódico glucosa (resuspensión)

5. Suero antiglobulina humana Anti-IgG (ver Nota 1)

6. Solución de lavado

7. GRs reactivos y autólogos, suspensión al 4-5% en LIM

8. Suero a estudiar (ver Nota 2)



11. Bromidrato de hexadimetrina, Aldrich Chemical Co.

12. Citrato trisódico

13. Dextrosa

14. Pipetas

15. Tubos de ensayo



1. Preparar el LIM: disolver 50 g de dextrosa y 2 g de EDTA en 1000 mL de agua destilada.

Conservar a 4 °C.

3. Preparar la solución de Polybrene: disolver 10 g de bromidrato de hexadimetrina en 100 mL de

salina. Conservar en una botella plástica a 4 °C (ver Nota 3).

4. Preparar la solución de resuspensión: disolver 3.52 g de citrato trisódico (Na3C6H5O7•2H2O) y 2 g

de dextrosa en 100 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

5. Preparar el citrato trisódico: agregar 5.88 g de Na3C6H5O7•2H2O a 100 mL de agua destilada.

Agregar 50 mL de citrato trisódico 0.2 M a 950 mL de salina.

Controles

1. Negativo: Suero de grupo AB libre de anticuerpos irregulares cuando se prueban contra GRs Rh

positivos de grupo O.

2. Positivo: Diluir anti-D comercial modificado para uso en tubo al 1:10.000 agregando 0.1 mL a 100

mL de agua destilada; de esta dilución, dispensar 0.1 mL en 1.0 mL de suero AB libre de

anticuerpos irregulares. Este anti-D al 1:10.000 en suero AB, cuando se prueba con GRs O Rh

positivos, deben dar resultados positivos.

Procedimiento

1. Rotular 4 tubos de ensayo: un para cada autocontrol, prueba, control positivo y control negativo.

2. Agregar 2-3 gotas (0.1 mL) del suero a estudiar y 1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos en el tubo de

autocontrol; colocar la misma cantidad de suero a estudiar en el tubo rotulado “prueba” y agregar 1

gota (0.05 mL) de GRs reactivos.

3. Preparar los tubos de control de igual modo (ver Controles).

4. Agregar 1 mL de LIM a cada tubo, mezclar e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

5. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de Polybrene a cada tubo e invertir para mezclar. Incubar

por 10-15 segundos.

6. Centrifugar a 1000 g durante 10-15 segundos.

7. Decantar el sobrenadante, pero no mezclar.

8. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de resuspensión a cada tubo. Mezclar suavemente durante 10

segundos.

9. Examinar cada tubo macroscópicamente mientras se los mantiene en un ángulo de 45 grados.


10. Agregar otra gota de solución de resuspensión a cada tubo y mezclar bien.

11. Lavar los GRs 3 veces con solución de lavado. Decantar completamente.

12. Al botón de GRs, agregar anti-IgG de acuerdo a las especificaciones del fabricante (ver Nota 5).


14. Leer macroscópicamente y registrar los resultados.

15. Agregar GRs recubiertos con IgG a todos los tubos negativos, mezclar, y centrifugar durante15

segundos. Leer macroscópicamente en busca de aglutinación. Si se obtienen resultados negativos,

la prueba debe ser repetida.

Notas

1. Preferentemente debe usarse suero antiglobulina anti-IgG en lugar del poliespecífico, la fracción

C3 puede fijarse en la fase de sensibilización en el medio de baja fuerza iónica.

2. Para la detección o identificación de anticuerpos y las pruebas de compatibilidad, se usa suero sin

diluir. Pero cuando el método es usado para estudiar unidades antígeno negativo, el suero puede

ser diluido con suero AB libre de aglutininas frías o calientes.

3. Ya que el Polybrene se adsorbe al vidrio y se debilita con la conservación prolongada en vidrio,

debe colocarse en botellas plásticas.

4. El Polybrene varía en fuerza de lote en lote; considerar una fuerza de 0.05% como guía.

Determinar la fuerza correcta por ensayo y error.

5. Cuando se investigan antígenos de los sistemas Ss, Kell y Jka, es necesaria la PAG para evitar las

reacciones negativas falsas. Para otros sistemas, las reacciones pueden ser débiles o negativas si se

pasa a la PAG.

Referencias

1. Lalezari P, Jiang AF. The manual Polybrene test: A simple and rapid procedure for detection of

red cell antibodies. Transfusion 1980;20:206-11.

2. Dembitzer HM, Oberhardt BJ, Duffy JL, Lalezari P. Polybrene-induced red RBC aggregation in

vitro. Morphologic aspects. Transfusion 1972;12:94-7.

Método 26 – Prueba de polietilenglicol-antiglobulina (PEG-PAG)

Principio

El polietilenglicol aumenta la captación de anticuerpos por los antígenos.

Aplicación

Esta técnica es particularmente útil para pruebas de detección e identificación de anticuerpos cuando el

anticuerpo es débil.


1. Polietilenglicol, MW3350, al 20% P/V, Sigma Chemical Co., catálogo número P3640.

2. GRs reactivos y autólogos, suspensión al 4-5% en salina

3. Suero a estudiar

4. Suero antiglobulina humana (SAGH) Anti-IgG (ver Nota 1)


6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Solución salina



11. Salina tamponada con fostato (PBS), pH 7.3 (ver M133)


1. Agregar 20 g de PEG a 100 mL de PBS, pH 7.3.

Procedimiento

1. Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a ser estudiadas. Incluir un

autocontrol.

2. Agregar a cada tubo 2 gotas (0.1 mL) de suero a estudiar, 4 gotas (0.2 mL) de PEG, y 1 gota (0.05

mL) de los GRs reactivos. Agregar el mismo volumen de suero, PEG, y GRs autólogos en el tubo

de autocontrol.

3. Mezclar e incubar a 37 °C durante 15 minutos.

4. No centrifugar (ver Nota 2).

5. Lavar los GRs 3 veces con salina y decantar completamente el sobrenadante final.

6. Agregar SAGH anti-IgG en la cantidad especificada por el fabricante.

7. Centrifugar a 1000 g durante15 segundos.

8. Examinar macroscópicamente los GRs en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

9. Agregar GRs recubiertos con IgG a todos los tubos negativos, mezclar, y centrifugar durante 15

segundos. Leer macroscópicamente en busca de aglutinación. Si se obtienen resultados negativos,

la prueba debe ser repetida.

Notas

1. Debe usarse preferentemente SAGH anti-IgG en lugar del poliespecífico, para evitar las

reacciones positivas debidas a la fijación de C3 por autoanticuerpos fríos.

2. Los GRs no serán fácilmente resuspendidos tras la centrifugación.

Referencias

1. Nance S, Garratty G. Polyethylene glycol: A new potentiator of red blood cell antigen reactions.

Am J Clin Path 1987;87:633-5.

Método 27 – Tratamiento de los GRs con ZZAP

Principio

El ZZAP es un reactivo que combina tiol y proteasa. El tiol remueve las IgG unidas a los GRs y la enzima

desnaturaliza los antígenos sensibles a la proteasa.

Aplicación

El uso primario del ZZAP es la preparación de GRs de pacientes con anemia hemolítica autoinmune

caliente para la autoabsorción autóloga de autoanticuerpos. Un uso secundario es la preparación de GRs

que carezcan de los antígenos del sistema Kell (excepto Kx) y otros antígenos sensibles a la proteasa.


1. Ditiotreitol (DTT) 0.2 M, reactivo Cleland, Calbiochem

2. Tampón fosfato (TF) 15 M, pH 5.4 (ver M132)

3. Papaína al 2 %

4. Papaína activada con cisteína al 1% (ver M42)

5. Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (ver M133)

6. GRs de prueba, autólogos/homólogos

7. Tubos de ensayo

8. Solución salina

9. Pipetas


11. Frasco

12. Papel de filtro Whatman No. 1

13. Papaína (papaína tipo II), Sigma Chemical Co.



1. Preparar el DTT 0.2 M: agregar 1 g de DTT a 32.4 mL de PBS. Dispensar en alícuotas de 2.5 mL

y conservar a –20 °C o menos.

2. Preparar L-cisteína HCl : agregar 0.88 g de L-cisteína HCl a 10 mL de agua destilada.

3. Preparar papaína al 2% : agregar 2 g de papaína en polvo a 100 mL de tampón fostato 15 M en un

frasco. Mezclar el contenido por rotación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Filtar con

un filtro de papel Whatman No. 1.

4. Preparar la papaína activada con cisteína: incubar 10 mL de papaína al 2% en PBS 15 M con 10

mL de L-cisteína HCl 0.5 M por 1 hora. Diluir hasta 200 mL con TF, distribuir en alícuotas de 1

mL, y conservar a –20 °C o menos.

5. Preparar el reactivo ZZAP : mezclar 0.5 mL de papaína activada con cisteína al 1% con 2.5 mL de

DTT y 2 mL de PBS de pH 7.3. Diluir hasta 5 mL con PBS. Para mejores resultados preparar

inmediatamente antes de su uso.

Procedimiento

1. Mezclar 1 volumen de GRs concentrados con 2 volúmenes de reactivo ZZAP.



4. Usar en la detección/identificación de anticuerpos o en pruebas de adsorción.

Referencias

1. Branch DR, Petz LD. A new reagent (ZZAP) having multiple applications in immunohematology.

Am J Clin Pathol 1982;78:161-7.

Método 28 – GRs modificados con ditiotreitol

Principio

Los antígenos de los grupos sanguíneos Cartwright (Yta) y Kell dependen de las uniones disulfuro para

mantener su integridad. El Ditiotreitol (DTT) rompe las uniones disulfuro entre los residuos del

aminoácido cisteína. Estas uniones disulfuro mantienen la estructura del antígeno necesaria para el

reconocimiento por el correspondiente anticuerpo. El antígeno Kx no se es afectado por el tratamiento

con DTT.

Aplicación

Este método es usado para la preparación in vitro de GRs Ko y Yt(a-) a partir de GRs antígeno positivo

para utilizarlos en procedimientos de identificación de anticuerpos (ver Nota 1).


1. Solución salina

2. DTT 0.2 M, Calbiochem Corp.


4. Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3


6. Pipetas

7. Tubos de ensayo

8. GRS a estudiar


1. Preparar el DTT 0.2 M disolviendo 1 g de DTT en 32 mL de PBS. Dispensar en alícuotas de 2.5

mL y conservar a –20 °C o menos.

Procedimiento

1. Lavar los GRs una vez en salina.

2. A 1 volumen de paquete de GRs lavados, agregar 4 volúmenes de DTT 0.2 M.

3. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante30 minutos.

4. Lavar los GRs 3veces con salina y resuspender al 3-5%.

5. Estudiar los GRs tratados con anti-k o anti-Kpb para asegurarse la efectividad del tratamiento con

DTT. Silos GRs modificados no reaccionan con estos antisueros indica que el reactivo está

funcionando.

Notas

1. Los GRs modificados con DTT no son capaces de reaccionar los siguientes anticuerpos anti-Kna,

anti-McCa, anti-Kn/McC, anti-JMH, y anti-McCd (Ella Toy, 1985 ICII Meeting).

2. Algunos ejemplos de anti-Ge, anti-Lwa, y algunos anticuerpos HTLA no reaccionan con GRs

modificados por DTT.

Referencias

1. Branch DR, Muensch HA, Sy Siok Hian AL, et al. Disulfide bonds are a requeirement for Kell and

Cartwright (Yta) blood group integrity. Br J Haematol 1983;54:573-8.

2. Shulman IA, Nelson JM, Lam H, Okamoto M, Meyer E. New approach to antibodies directed at

high-frequency Kell and Cartwright antigens using DTT-modified RBCs. Lab Med 1984;15:607-8.

Método 29 – Tramiento con AET de los GRs

Principio

El bromuro 2-aminoetilisotiourónico (AET) desnaturaliza de tal forma los antígenos del sistema de grupo

sanguíneo Kell de los GRs que éstos no son aglutinados, ni adsorben y eluyen anticuerpos de sistema

Kell. El antígeno Kx no es inactivado.

Aplicación

Este método es usado para la preparación de GRs que parezcan Ko homocigotas, para utilizarlos en la

identificación de anticuerpos hacia los antígenos de alta incidencia del Sistema Kell.


1. AET al 6%, Sigma Chemical Co.

2. Na OH 5 N.

3. Solución salina



6. Tubos de ensayo

7. Pipetas


9. GRS a estudiar


1. Preparar el AET al 6% disolviendo 0.6 g de AET en 10 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8.5

con NaOH 5 N. Preparar inmediatamente antes de usar.

Procedimiento

1. A 1 mL de GRs concentrados y lavados, agregar 4 mL de AET al 6%.

2. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 20 minutos.

3. Lavar los GRs 3 veces con salina y preparar una suspensión al 2-5%. Usar en el día de la

preparación.

Controles

Estudiar los GRs tratados con AET con anticuerpos del Sistema Kell para confirmar la desnaturalización

de los antígenos Kell.

Interpretación

Si la reactividad con los GRs tratados con AET es igual a la de los GRs no tratados, el anticuerpo no está

dirigido hacia un antígeno del Sistema Kell. Si no es reactivo con los GRs tratados con AET, pero si lo

son con GRs no tratados, el anticuerpo puede estar dirigido hacia un antígeno del Sistema Kell.

Notas

1. Los GRs tratados con AET fijan componentes del complemento en forma inespecífica en la misma

forma que lo hacen los GRs en la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Usar reactivos anti-

IgG cuando se realice una prueba antiglobulínica (PAG) con los GRs tratados con AET.

2. El antígeno Kx no es inactivado por el AET; las reacciones con anti-Kx son potenciadas con GRs

tratados con AET.

3. Existen publicaciones que indican que mientras el AET también puede inactivar los antígenos

JMH, Jka, Hy, McCa, Yta, y Hya, éstos mantienen su capacidad de absorber el anticuerpo.

Referencias

1. Advanti H, Zamor J, Judd WJ, Johnson CL, Marsh WL. Inactivation of Kell blood group system

antigens by 2-aminoethylisothiouronium bromide. Br J Haematol 1982;51:107-15.


3. Moulds JJ, Moulds M. Inactivation of Kell blood group antigens by 2-aminoethylisothiouronium

bromide (letter). Transfusion 1983;23:274.

4. Marsh WL, Johnson CL, Mueller KA. AET-treated red cells (letter). Transfusion 1983;23:275.

5. Levene C, Harel N. 2-aminoethylisothiouronium-treated RBCs and the Cartwright (Yta) antigen

(letter). Transfusion 1984;24:541.

Método 30 – Destrucción del antígeno S por el hipoclorito de sodio (Clorox®)

Principio

El hipoclorito de sodio (Clorox) oxida los residuos de metionina en la posición 29 de la

sialoglicoproteína Ss, produciendo la pérdida de la expresión del antígeno S.

Aplicación

Este método permite la preparación de GRs negativos para el antígeno S de los GRs en estudio cuando no

hay disponibles GRs genéticamente antígeno negativo.


1. Hipoclorito de sodio 0.00075%.

2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver M133).

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo


7. GRS en estudio, S+


1. Preparar el hipoclorito de sodio 0.00075% diluyendo

a.1 parte de Clorox + 69 partes de PBS = 0.075%, entonces

b. 1 parte de Clorox diluido + 99 partes de PBS = 0.00075%.

Procedimiento


2. Resuspender al 3% en la PBS con hipoclorito de sodio 0.00075%.



Controles

1. GRs tratados con reactivo anti-S.

2. GRs tratados con el antisuero reactivo correspondiente al antígeno que está siendo probado contra

el suero del paciente.

Notas

1. La expresión de los antígenos Rh también está disminuida por este tratamiento.

2. Enjuagar a fondo todas las superficies que han sido desinfectadas con Clorox y que pueden llegar a

ponerse en contacto con los GRs.

3. El Clorox no diluido contiene 5.25% de hipoclorito.

4. Los autores advierten en la publicación original (ver Referencia 1) que a niveles de Clorox al

0.0005% en una suspensión al 3%, los GRs S+s+ se volvían inmediatamente no reactivos y los

GRs S+s- requerían aproximadamente 1.5 veces esta concentración para destruir el antígeno S.

Referencias

1. Rygiel SA, Issitt CH, Fruitstone MJ. Destruction of the S antigen by Clorox (abstract). Transfusion

1983;23:410.

Método 31 – Inhibición de los anticuerpos de grupos sanguíneos por antígenos solubles

Principio

La actividad de los anticuerpos anti Lea, Leb, P1, ID, i, Chido (Ch), Rodgers (Rg), Sda, y los antígenos

ABH pueden ser neutralizados por sustancias que se encuentran en los fluidos humanos y animales. (ver

Tabla 31-1 más abajo).

Tabla 31-1: Inhibición Específica de algunos Acs por sustancias solubles Ac Inhibible Suero Humano Saliva Leche Orina Quiste

Hidatídico

Albúmina de Huevo de Paloma

Anti-A/B/H

Anti-I

Anti-i

Anti-Lea

Anti-Leb

Anti-P1 /Pk

Anti-Sda

Anti-Ch

Anti-Rg

Anti-HLA2

Anti-

HLAB7,B17,

A28 (Bgb Bgc)

+

O

++

+

+

O

++

++

++

+++

++

+++

+++

O

++

O

O

0

+

+++

+

+

+

+

+++

+

+++

+++

Las sustancias grupo específicas (SGE) de especificidad A, B y/o H se encuentran en varios

fluidos corporales de individuos que son secretores. Existen grandes cantidades en el líquido de quiste

ovárico y pequeñas cantidades en el meconio y la saliva; comercialmente, la SGEA se obtiene de la

mucosa gástrica porcina y la SGEB de la mucosa gástrica equina.

La sustancia Lea se encuentra en grandes cantidades en las secreciones de no secretores con

fenotipo Le(a+b-)] y en cantidades mayores en personas de grupo Le(a-b+) que son secretores. Las

personas de este último grupo también pueden producir mucha sustancia Leb además de Lea. La goma

arábiga (obtenida de la acacia) también neutralizará el anti-Lea y el anti-LebL, pero no el anti-LebH.

La orina –y en pequeña extensión, la saliva- puede inhibir el anti-Sda. El anti-Ch y el anti-Rg son

inhibidos por el suero de individuos antígeno positivos.

El líquido de quiste hidatídico (LQH) y la ovoalbúmina de los huevos de varias especies de

pájaros contienen grandes cantidades de sustancia capaz de inhibir el anti-P1 y el anti-Pk. Algunos

ejemplos de anti-I también pueden ser inhibidos por el LQH.

La leche humana de mujeres lactantes apropiadamente seleccionadas puede contener sustanciales

cantidades de sustancia Lea, ABH e I. Auque la leche humana contiene usualmente sustancia I, no inhibe

la mayoría de los ejemplos de anti-I.

Dependiendo de la especificidad, el suero humano puede inhibir algunos anticuerpos HTLA.

Aplicación

La inhibición de la hemaglutinación es aplicable a:

1. Pruebas para determinar el estado secretor de ABH.

2. Pruebas para determinar el antígeno Sda.

3. La cuantificación de la sustancia soluble en suero o secreciones.

4. Determinación de la clase de inmunoglobulina anti-A y/o anti-B. Los anticuerpos IgM son

fácilmente neutralizados, mientras que los anticuerpos IgG no lo son.

5. Confirmación de la especificidad del anticuerpo o la identificación de mezclas de anticuerpos.


1. Tubos de ensayo

2. Solución salina

3. Saliva [hervida y clarificada (ver M3)]

4. Suero normal libre de anticuerpos

5. Liquido de quiste hidatídico o ovoalbúmina (paloma)

6. Orina (mezcla de 3 individuos, seleccionados aleatoriamente)

7. Leche humana

8. Anti-A, anti-B [suero de donantes no hiperinmunizados (ver M3)]

9. Lectina anti-H de Ulex europaeus [disponible comercialmente o preparada de semillas obtenidas

de semillas (M3, 98, y 99)]

10. Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (M133)


PRUEBAS DE INHIBICION ABH


Esta técnica es utilizada para la inhibición de anticuerpos ABH con saliva de secretor ABH.

Saliva

1. Recolectar 2-3 mL de saliva en un tubo de ensayo.

2. Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos para inactivar las enzimas salivales.

3. Centrifugar la saliva hervida a 1000 g durante 10 minutos.

4. Remover el sobrenadante y conservar a –20 °C si la prueba no va a ser realizada inmediatamente.

Antisuero o lectinas

1. Preparar diluciones dobles de anti-H. Se pueden usar anti-A y anti-B de donantes no

hiperinmunizados si está indicado.

2. Mezclar 0.1 mL de cada dilución y 0.1 mL de suspensión al 2-3% de GRs en tubos adecuadamente

rotulados. Usar GRs A2 para la titulación con anti-A. Los GRs de grupo A2 suministran mayor

sensibilidad como GRs indicadores.

3. Centrifugar durante 15-20 segundos y observar macroscópicamente en busca de aglutinación.

4. Seleccionar para la prueba la mayor dilución de cada anticuerpo que de una aglutinación de 2+.

Procedimiento

Para pruebas de secreción, debe usarse la saliva de un secretor conocido (grupo A, B y O según sea lo

indicado) también la de un no secretor del mismo grupo como controles positivo y negativo. Pueden

congelarse alícuotas de saliva de individuos adecuados para usar posteriormente.

1. Agregar 0.1 mL del antisuero apropiadamente diluido (como se determinó en IA.4, más arriba) a

cada uno de los 4 tubos rotulados “secretor”, “no secretor”, “control” y “prueba”.

2. Agregar 0.1 mL de saliva diluida 1:4 en salina a los tubos apropiados y 0.1 mL de salina en el tubo

“control” (ver Nota 2).

3. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4. Agregar 0.05 mL de suspensión al 2-5% de GRs indicadores a los tubos adecuados.

5. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

6. Centrifugar durante 15-20 segundos y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

Notas

1. El procedimiento puede adaptarse para la semicuantificación de la actividad de grupos sanguíneos

(ABH, Lewis) probando diluciones seriadas de la saliva (ver M9).

2. La saliva puede ser diluida 1:4 para evitar la inhibición inespecífica por glicoproteínas que se

encuentran en pequeñas cantidades en la saliva de secretores y no secretores de sustancias ABH.

La saliva es hipotónica y hemolizaría los GRs si es usada sin diluir.

Referencias

1. Judd WJ, comp. Handbook of serologic techniques for use in investigating immunohematology.

West Chester, PA: Biological Corporation of America, 1981:40.


3. Wallace ME, Green TS, eds. Selection of procedures for problem solving. Arlington, VA: AABB,

1983:113-41.

INHIBICION DE ANTICUERPOS anti- LEWIS CON SALIVA


La saliva de los secretores de grupo O en los cuales el fenotipo de sus GRs es Le(a-b+) puede ser

recolectada y preparada como se describe en el procedimiento I.A Los antígenos Lea y Leb estarán

presentes en suficiente cantidad en la saliva como para inhibir el anti-Lea o el anti-Leb.

Procedimiento

1. A 5 volúmenes de suero, agregar 1 volumen de saliva.

2. Preparar un tubo de control con 5 volúmenes de suero y 1 volumen de PBS.

3. Mezclar bien, centrifugar a 1000 g durante 1 minuto, y dejar a temperatura ambiente durante 10

minutos.

4. Estudiar el suero neutralizado en paralelo con la muestra de control frente a GRs apropiadamente

seleccionados. Se debe usar un mínimo de 1 GR negativo, Le(a-) o Le(b-), y 2 GRs positivos,

Le(a+) o Le(b+), cualquiera que sea el indicado.

Interpretación

La prueba de control negativa (suero no neutralizado) debe mostrar aglutinación mientras que el suero

neutralizado no debe aglutinar los GRs en estudio. Si ambos son no reactivos, se ha producido una

dilución o el anticuerpo se ha tornado inactivo. Cuando tanto la prueba como el control son positivos, el

anticuerpo no es inhibible y debe considerarse una especificidad distinta a la de un anticuerpo del sistema

Lewis.

Notas

1. La sustancia Lea se encuentra en grandes cantidades en las secreciones de personas no secretores

con fenotipo Le (a+b-) y en cantidades mucho menores en personas con fenotipo Le (a-b+) que

son secretoras. Las personas de este último tipo también pueden producir mucha sustancia Leb

junto con Lea.

2. Las sustancias Lewis están disponibles comercialmente.

INHIBICION DE ANTI-I CON LECHE HUMANA


1. Recolectar leche de mujeres lactantes en un envase limpio.

2. Centrifugar la leche durante 10 minutos a 1000 g.

3. Remover y descartar la capa cremosa.

4. Incubar la leche en agua hirviendo durante 10 minutos para inactivar las enzimas presentes.

5. Mezclar 1 volumen de leche con 1 volumen de PBS; conservar pequeñas alícuotas a –20 °C hasta

que se necesiten.

Procedimiento

1. Preparar diluciones dobles del suero a estudiar que contiene el anti-I que se sospecha.

2. Colocar 0.1 mL de cada dilución en 2 tubos de ensayos rotulados “prueba” y “control”.

3. Agregar 0.1 mL de leche al tubo de “prueba”.

4. Agregar 0.1 mL de salina en el tubo “control”.


6. Agregar 0.05 mL de una suspensión al 2-3% de células grupo O, I+ a todos los tubos.

7. Incubar todos los tubos durante 1 hora a temperatura ambiente, centrifugar a 1000 g durante 15-20

segundos, leer, y registrar.

8. Incubar a 16 °C durante 1 hora, centrifugar durante 15-20 segundos, dejar en reposo durante 5

minutos, leer y registrar.

9. Incubar a 1-4 °C en un baño de hielo durante 1 hora, centrifugar durante 15-20 segundos, dejar en

reposo durante 5 minutos, leer y registrar.

Controles

Las titulaciones también pueden estudiarse frente a GRs de adulto i (si hay disponibles) o de cordón.

Interpretación

La aglutinación indica inhibición parcial o no inhibición. La ausencia de aglutinación indica inhibición

sólo si el “control” es reactivo.

Notas

1. No todos los anticuerpos anti-I son igualmente afectados. Por consiguiente, es necesario

seleccionar GRs adultos normales, y una cantidad de leche humana para todas las pruebas, y

también, para graduar los resultados. Estos deben ser por lo menos de 3 tubos menos en el título

para establecer que ha ocurrido la inhibición.

2. El Sistema I posee dos alelos, denominados, IFetal (IF) y IDesarrollado (ID). La sustancia I de la leche

tiene un gran efecto inhibitorio contra el anti-ID, pero solo una ligera inhibición del anti-IF. El anti-

I fuertemente inhibible es habitualmente de la variedad anti-ID, pero no todos los anti-ID son

igualmente inhibibles. Ver Tabla 31-2 más abajo.

Tabla 31-2: Reacciones serológicas para diferenciar Anti-IFetal de un Anti-ID

Anticuerpo

Glóbulos Rojos Inhibición por

Leche Humana I Adulto I Adulto I cordón

IFetal ++++ + ++ No inhibido

ID ++++ o o Inhibido

3. Durante el estudio de antisueros para la inhibición, es de fundamental considerar la compleja

especificidad que involucran a los Sistemas ABH y Lewis.

4. La presencia de sustancias que inhiben el anti-I ha sido confirmada en leche humana, saliva,

líquido amniótico, orina de adulto, y orina de mujeres embarazadas y bebés recién nacidos. La

orina contiene alguna sustancia inhibitoria, pero no es tan potente como la del líquido amniótico y

la leche. La orina de niños de tres semanas no muestra propiedades inhibitorias, aunque la orina

tiene propiedades fuertemente inhibitorias al nacimiento.

5. El anti-I puede también ser inhibido por el líquido de quiste hidatídico (LQH).

Referencias

1. Marsh WL, Feizi T. Inhibition of anti-I sera by human milk. Vox Sang 1970;18:149-54.


1983:113-21.

3. Judd WJ, comp. Handbook of serologic techniques for use in investigative immunohematology.


4. Bell CA, Zwicker H, Sacks HJ. Anti-I: Identification of the “nonespecific” cold agglutinin. Vox

Sang 1967;13:4-6.

5. Tegoli J, Harris J, Issitt PD, Sanders CW. Anti-IB, an expected “new” antibody detecting a joint

product of the I and B genes. Vox Sang 1967;13:144-57.

6. Feizi T, Marsh WL. Demostration of I anti-I interaction in a precipitin system. Vox Sang

1970;18:379-82.

7. Marsh WL, Nichols ME, Reid ME. The definition of two I antigen components. Vox Sang

1971;20:209-17.

8. Cooper A. Soluble blood group I substance in human amniotic fluid. Nature 1970;277:508-9.

9. Jackson V, Issitt PD, Francis BJ, Garis ML, Sanders CW. The simultaneous presence of anti-I and

anti-i in sera. Vox Sang 1968;15:133-41.

10. Wilkinson L, Petz LD, Garratty G. Reappraisal of the role of anti-i in haemolytic anemia in

infectious mononucleosis. Brit J Haem 1973;25:715.

INHIBICION DE ANTI-P1 CON SUSTANCIA P


1. Albúmina de huevo de paloma: separar la clara del huevo de la yema y estudiarla en una dilución

de 1:100 a 1:1000 en PBS contra un anti-P1 potente para establecer la dilución apropiada para usar

en las pruebas de inhibición. Las alícuotas pueden se conservadas a –20 °C o menos.

2. Alternativamente, se puede usar el LQH. Incubar el LQH (que contiene escólices) de fuente

animal o humana a 56 °C durante 1 hora para hacerlo no infeccioso (ver Nota 1). Diluir 1 volumen

de LQH con 9 volúmenes de PBS. Se pueden conservar pequeñas alícuotas a –20 °C o menos

hasta que se necesiten.

Procedimiento

Este es para la inhibición de anti-P1 y/o anti-P1k.

1. Rotular 2 tubos: “prueba” y “control”.

2. Colocar 1 volumen de LQH y 1 volumen del suero a estudiar en el tubo “prueba”.

3. Colocar 1 volumen de PBS y 1 volumen del suero a estudiar en el tubo “control”.

4. Estudiar el suero neutralizado con LQH en paralelo con el control frente a GRs apropiadamente

seleccionados. Se deben usar un mínimo de 1 GR negativo (P1-) y dos positivos (P1+).

Interpretación

1. La no reactividad en ninguno de los tubos de prueba y de suero control indica que se ha producido

una dilución del suero y no puede extraerse ninguna conclusión.

2. La reactividad en ambos tubos, el de prueba y el de suero control indica que el anticuerpo no se ha

inhibido por la sustancia de grupo.

3. La ausencia de reactividad en el tubo de prueba y la reactividad en el tubo de control indica la

inhibición del anticuerpo por la sustancia grupoespecífica.

Notas

1. El LQH natural contiene escólices y es altamente infeccioso. Se deben usar guantes de goma

durante su preparación.

2. Se pueden usar fuentes comerciales de sustancia P siguiendo las instrucciones del fabricante.

3. Algunos anti-I también pueden inhibirse con LQH.

Referencias




1983:113-21.

INHIBICION DE ANTI-Sda CON ORINA


1. Obtener una muestra de orina hervida limpia de una persona Sd(a+) conocida o un pool de orina

de 3 personas seleccionadas aleatoriamente.

2. Centrifugar las muestras para remover partículas.

3. Diluir la orina en volumen igual de agua destilada. Medir el pH de la orina diluida. Si el pH no es

de 6-8.5, dializar (ver M35) la orina con PBS. Las alícuotas de orina diluida pueden congelarse

hasta que se necesite.

Procedimiento

1. Agregar 1 volumen de orina Sd(a+) a 1 volumen del suero a estudiar.

2. Preparar 2 tubos de control, uno con un volumen igual del suero y orina Sd(a-) y el otro con un

volumen igual de suero y PBS.

3. Incubar todos los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4. Estudiar el suero neutralizado en paralelo con las muestras de control con GRs Sd(a+) y Sd(a-)

adecuadamente seleccionados.

Interpretación

1. La no reactividad en ninguno de los tubos de prueba y de suero control indica que ha ocurrido una

dilución del suero y no puede extraerse ninguna conclusión.

2. La reactividad en ambos tubos, el de prueba y el de suero control indica que el anticuerpo no se ha

inhibido por la sustancia grupoespecífica.

3. La ausencia de reactividad en el tubo de prueba y la reactividad en el tubo de control indica la

inhibición del anticuerpo por la sustancia grupoespecífica.

Notas

1. La identificación de la especificidad anti-Sda debe incluir la inhibición del anticuerpo sérico del

paciente con orina Sd(a+) y la confirmación del estado Sd(a-) del paciente porque la orina del

paciente no inhibió el suero conocido con anti-Sda.

Referencias




1983:113-21.

3. Morton JA, Pickles MM, Terry AM. The Sda blood group antigen in tissue and body fluids. Vox

Sang 1970;19:472-82.

Método 32 – Separación de anticuerpos múltiples por adsorción con GRs alogénicos

Principio

Los anticuerpos pueden ser separados por la adsorción de un anticuerpo con GRs positivos para el

antígeno contra el que está dirigido el anticuerpo y antígeno-negativo para el/los otro(s) anticuerpo(s).

Aplicación

La adsorción puede usarse para confirmar la especificidad de un anticuerpo, la preparación de un reactivo

tipificador, o investigar la presencia de un antígeno débil en los GRs.


1. GRs a estudiar positivos para el antígeno contra el cual está dirigido el anticuerpo a ser removido,

y antígeno negativo para el/los otro(s) antígeno(s)

2. Solución salina


4. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. Tapones

7. Parafilm®

8. Suero a estudiar

Procedimiento

1. Lavar los GRs a estudiar 3-4 veces con salina y remover toda la salina sobrenadante.

2. Agregar 1 volumen de suero a 1 volumen de GRs y mezclar bien. Tapar y cubrir con Parafilm.

3. Incubar 30-60 minutos a la temperatura óptima para favorecer la máxima reacción antígeno-

anticuerpo.

4. Centrifugar. Remover el suero y estudiarlo frente a una muestra fresca de los GRs para adsorción.

Si la reacción es positiva indica que la adsorción no es completa, repetir el procedimiento con una

alícuota fresca de GRs de adsorción.

5. Cuando se completa la adsorción, estudiar el suero adsorbido contra un panel de GRs para

determinar la presencia del anticuerpo de otra especificidad.

6. Si se desea, puede realizarse una elución en la primera alícuota de GRs de adsorción para

determinar la especificidad del anticuerpo adsorbido.

Notas

1. Si se sospecha de la presencia de múltiples anticuerpos, pero no hay indicio de la(s)

especificidad(es) del anticuerpo, los GRs elegidos para la adsorción deben ser los más débilmente

reactivos. Esto hace sospechar que los GRs débilmente reactivos contengan solo un antígeno

contra el cual el suero tiene un anticuerpo de esa especificidad.

2. Cuando se adsorbe el suero para preparar un reactivo tipificador, estudiar el anticuerpo removido

por el método de detección más sensible disponible para el anticuerpo en cuestión.

3. El tratamiento enzimático de los GRs de adsorción reducirá el número de adsorciones por la

remoción completa de al menos los antígenos que son desnaturalizados por las enzimas.

Referencias

1. Issitt PD. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publication,

1985:54.

2. Moulds J. Multiple antibodies and antibodies to high incidence blood group factors. In: Trouble-

shooting the crossmatch, a technical workshop. Washington, DC: AABB, 1977:74.

Método 33 – Investigación de anti-Nform


Se ha demostrado que el uso de instrumentos de diálisis renal que son reacondicionados con

formaldehído causan la formación de un anti-N en algunos pacientes N+. Estos anticuerpos, denominados

anti-Nform difieren de otros anti-N en que los GRs tratados con formaldehído reaccionan más fuertemente

con el anti-Nform. Los GRs tratados con formaldehído pueden usarse para diferenciar un anti-N común de

un anti-Nform.


1. Formalina tamponada neutra (PBS) al 10%, Sigma Chemical Co.

2. GRs de prueba: M-N+ (1), M+N+ (1), M+N- (1) tratados con formalina

3. GRs de control: iguales a los anteriores pero sin tratar con formalina

4. Suero a estudiar con el anti-N en cuestión

5. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. Solución salina




1. Preparar el PBS mezclando 1 parte de PBS al 10% con 9 partes de salina.

Procedimiento

1. Lavar los GRs 3-4 veces con salina.

2. Agregar 0.2 mL de PBS a 0.1 mL de cada muestra de GRs y mezclar.

3. Incubar durante 15 minutos a 37 °C.

4. Lavar los GRs 3-4 veces con salina.

5. Resuspender al 5% en salina.

6. Lavar y resuspender al 5% una muestra de GRs como control.

7. Hacer 2 diluciones dobles (ver M123) del suero a estudiar en salina hasta por lo menos 12

diluciones.

8. Rotular 1 tubo para cada uno de los 3 GRs y 1 por cada uno de los 3 GRs de control para cada

dilución.

9. Colocar 3 gotas de cada dilución en cada uno de los 6 tubos.

10. Agregar 1 gota de los GRs en estudio al tubo apropiado.

11. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.


13. Leer, graduar y registrar las reacciones.

Interpretación

1. Una titulación mayor de 4 tubos con los GRs tratados con formalina sobre los GRs no tratados

sugiere un anti-Nform.

Notas

1. Precaución: La formalina es altamente tóxica y sospechado de ser un agente carcinógeno.

Manipularlo con cuidado y evitar su inhalación.

Referencias

1. Judd WJ. On the recognition of N-deficient red blood cells and the selection of blood for

transfusion to patients with anti-N. Immunohematology 1986;2:49-53.

2. Sandler SG, Sharon R, Stessman J, et al. Anti-formaldehyde and anti-N-like antibodies in

hemodialysis patients. Israel J Med Sci 1978;14:1177-80.

Método 34 – Investigación de receptores Nvg resistentes a la tripsina


Los GRs normales S+s+U+ que son tratados con tripsina tienen un determinante N-like denominado N-

quotes (‘N’). Si los GRs S+s+ tratados y no tratados con tripsina se enfrentan con la lectina Vicia

graminea (anti-Nvg), los GRs no tratados son tipificados como N-, mientras que los GRs tratados son

tipificados como N+. Las reacciones de los GRs tratados con tripsina y anti-Nvg se usan para predecir la

normal glicosilación de la glicoproteína Ss (SGP). Los GRs Su y Henshaw positivos tratados con tripsina

serán negativos.


1. GRs a estudiar: tratados y no tratados con tripsina (ver M42)

2. GRs de control: M+N+S-s- (1), y M+N+S+s+ (1), tratados con tripsina y no tratados

3. Lectina Vicia graminea (anti-Nvg) (ver M98)

4. Solución salina

5. Tubos de ensayo


7. Microscopio

8. Pipetas


Procedimiento

1. Rotular un tubo para cada uno de las 6 muestras de GRs a estudiar.

2. Agregar 1 gota de suspensión al 3-4% en salina de GRs tratados con tripsina y no tratados a los

tubos apropiados.

3. Agregar 2 gotas de anti-Nvg a cada tubo y mezclar suavemente.

4. Incubar durante 15 minutos a 37 °C.


6. Leer, graduar y registrar las reacciones.

Interpretación

1. Una prueba negativa con los GRs tratados con tripsina y anti-Nvg indica que la SGP Ss normal

puede estar ausente.

Notas

1. El extracto crudo de tripsina no es adecuado para esta prueba. Debe usarse tripsina cristalina pura.

Referencias

1. Pavone BG, Billman R, Bryant J, et al. An auto-anti-Ena, inhibitable by MN sialoglycoprotein.

Transfusion 1981;21:25-31.

Método 35 – Concentración de anticuerpos

Principio

Los anticuerpos pueden ser concentrados por la extracción del agua a través congelación-descongelación,

diálisis o adsorción.

Aplicación

Los sueros que contienen anticuerpos débiles pueden ser concentrados para establecer sus especificidades

o para convertirlos en reactivos útiles.

METODO DE CONGELACION-DESCONGELACION


1. Tubos de ensayo

2. Pipetas


4. Congelador

5. Suero a estudiar

Procedimiento

1. Llenar parcialmente un tubo de ensayo con el suero a estudiar. Sellar ajustadamente.

2. Colocar a –20 °C hasta congelación.

3. Sacar del freezer. Permitir que se descongele sin agitar. Se harán visibles tres capas de líquido con

líneas no definidas de demarcación. La capa del fondo tendrá la proteína insoluble y la capa

superior, agua.

4. Remover y guardar la capa superior hasta que pueda determinarse si el suero está ahora

concentrado; puede ser necesario ajustar la concentración del anticuerpo sérico por reposición de

la capa superior.

5. Repetir los pasos 1-4 con el suero restante, si se desean posteriores concentraciones.

6. Centrifugar el tubo para clarificar el suero concentrado. Retirar el líquido sobrenadante y usar para

la investigación.

ABSORCION SELECTIVA CON LYPHOGEL®


1. Lyphogel, Gelman Sciences, Inc. (ver Nota 1)

2. Cubeta o tubos de ensayo

3. Parafilm®

4. Pipetas

5. Suero a estudiar

Procedimiento

1. Colocar el suero a ser concentrado en una cubeta o tubo de ensayo; el recipiente debe ser lo

suficientemente grande como para permitir 3 duplicaciones en la expansión del gel.

2. Calcular la cantidad de Lyphogel necesaria para efectuar la concentración deseada. El total de agua

a absorber está exactamente controlada en el proceso de fabricación; 1 g de Lyphogel absorbe 5.4

mL de agua; e.j., para concentrar una muestra de 10 mL a 2 mL, usar 1.48 g de Lyphogel para

remover los 8 mL de agua.

3. Colocar el Lyphogel previamente pesado en el suero a estudiar. Sellar el tubo o cubeta

ajustadamente con Parafilm.

4. El Lyphogel se equilibrará con el suero en 4 horas y entonces puede ser removido, o después en

cualquier momento. No es necesaria una concentración más intensa. El gel puede dejarse toda la

noche en el suero sin que absorba líquido adicional. Los gránulos del gel son removidos fácilmente

del suero con unas pinzas. Cualquier líquido que quede aún adherido a los cilindros hinchados

deben drenados hacia el concentrado tocándolo contra los lados del recipiente (ver Nota 2).

5. El suero concentrado restante está listo para los análisis cuantitativos o cualitativos.

Notas

1. El Lyphogel es un gel de polyacrilamida por concentración macromolecular. Removerá 5 veces su

peso de agua. Las esferas de Lyphogel son agregadas directamente al suero a concentrar. Después

de 5 horas, la captación de líquido estará completa en un 90%.

2. En grandes concentraciones, donde es necesario un gran número de esferas debe usar una cesta

hecha con una película de polipropileno (de aproximadamente 9 hilos por pulgada). El proceso de

escurrido es facilitado levantando la cesta y el gel encima del suero, dejando un borde de la cesta

en contacto con el suero concentrado para permitir que el líquido aún adherido al gel decante en el

concentrado.

Referencias

1. Manufacturer’s directions.

Método 36 – Tratamiento del suero con ditiotreitol (DTT)

Principio

Los reactivos tiol rompen las uniones disulfuro intercatenarias de las moléculas de IgM, perdiendo así su

actividad M mientras que las moléculas IgG no son afectadas. El tratamiento con DTT del suero

distinguirá los anticuerpos IgM de los IgG.

Aplicación

El suero tratado con DTT es usado en pruebas serológicas para detectar anticuerpos IgG enmascarados

por anticuerpos IgM.



2. DTT 0.01 M, Calbiochem Corp.

3. Tubos de ensayo


5. Pipetas

6. Suero a estudiar

7. Anticuerpo IgM de control

8. Anticuerpo IgG de control


1.Preparar el DTT 0.01 M disolviendo 0.154 g de DTT en 100 mL de PBS. Conservar a 4°C o a

–

20 °C.

Procedimiento

1. Dispensar 1 mL del suero a estudiar en un tubo de ensayo rotulado “control de dilución” y 1 mL en

uno rotulado “prueba”.

2. Dispensar 1 mL de anticuerpo IgG de control en el tubo rotulado “control positivo”.

3. Dispensar 1 mL de anticuerpo IgM de control en el tubo rotulado “control negativo”.

4. Al tubo rotulado “control de dilución”, agregar 1 mL de PBS.

5. A los tubos rotulados “control positivo”, “control negativo”, y “prueba”, agregar 1 mL de DTT

0.01 M.

6. Mezclar e incubar todos los tubos a 37 °C durante 2 horas.

7. Estudiar el suero tratado y los controles con las muestras de GRs apropiadas

Controles

1. Un anticuerpo IgM y uno IgG conocidos probados en paralelo con el suero a estudiar darán la

seguridad que el DTT trabaja apropiadamente.

Interpretación

1. La reactividad en ambos tubos, “prueba” y “control de dilución” equivalente al suero limpio,

puede indicar la presencia de un anticuerpo IgG, pero una mezcla de anticuerpos IgM y IgG puede

no ser obvia en una prueba directa y puede requerir una titulación para detectar una reducción en la

actividad del anticuerpo.

2. La pérdida de reactividad del suero en el tubo “prueba” y la reactividad en el “control de dilución”

equivalente al suero limpio indica la presencia de un anticuerpo IgM.

3. La no reactividad en cualquiera de los tubos, “prueba” o “control de dilución” indica que ha

ocurrido una dilución del anticuerpo y se pueden sacar conclusiones.

4. El “control positivo” (anticuerpo IgG) debe demostrar reactividad y el “control negativo”

(anticuerpo IgM) no debe demostrar reactividad.

Notas

1. La capacidad de los anticuerpos IgM para fijar complemento también está disminuida.

2. Muchos profesionales prefieren el DTT al 2-Mercaptoetanol (2-ME) porque este último tiene un

olor muy desagradable.

Referencias

1. Pirofsky B, Rosner ER. DTT test: a new method to differentiate IgM and IgG

erythrocyte antibodies. Vox Sang 1974;27:480.

2. Olson PR, Weiblene BJ, O’Leary JJ, Moscowitz AJ, McCullough J. A simple method

for the inactivation of IgM antibodies using dithiothreitol. Vox Sang 1976;30:149-59.

Método 37 – Tratamiento del suero con 2-Mercaptoetanol (2-ME)

Principio

El 2-ME es un compuesto sulfhidrilo que destruye la actividad aglutinante de los anticuerpos IgM

mediante la rotura por reducción de los puentes disulfuro intercatenarios de las moléculas de IgM,

mientras deja las moléculas IgG sin afectar. El tratamiento del suero a estudiar con 2-ME puede usarse

para distinguir anticuerpos IgM de IgG y para destruir un anticuerpo IgM que enmascara anticuerpos IgG

que lo acompañan.

Aplicación

El suero tratado con 2-ME es usado en pruebas serológicas para detectar anticuerpos IgG enmascarados

por anticuerpos IgM.



2. 2-ME 0.1 M, Sigma Chemical Co.

3. Solución salina


5. Tubos de diálisis (8 mm)

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Suero a estudiar

9. Anticuerpo IgM de control

10. Anticuerpo IgG de control


1. Preparar el 2-ME 0.1 M diluyendo 0.7 mL de 2-ME 14 M en 100 mL de PBS. (Puede ser

conservado a 4 °C por un mes.)

Procedimiento

1. Dispensar 1 mL del suero a estudiar en un tubo de ensayo rotulado “control de dilución” y 1 mL en

uno rotulado “prueba”. Dispensar 1 mL de anticuerpo IgG de control en el tubo rotulado “control

positivo” y 1 mL de anticuerpo IgM de control en el tubo rotulado “control negativo”.

2. Al tubo rotulado “control de dilución”, agregar 1 mL de PBS.

3. A los tubos rotulados “control positivo”, “control negativo”, y “prueba”, agregar 1 mL de 2-ME

0.1 M.

4. Incubar todos los tubos a 37 °C durante 30 minutos.

5. Dializar (ver M35) el suero a estudiar y el de control en agua corriente por una hora.

6. Sacar el suero a estudiar y el de control del agua y dializarlo con salina durante 1 hora (ver Nota

1).

7. Estudiar el suero tratado y los controles con los GRs apropiados

Controles

1. Un anticuerpo IgM y uno IgG conocidos estudiados en paralelo con el suero a estudiar darán la

seguridad que el 2-ME reacciona apropiadamente.

Interpretación

1. La reactividad en ambos tubos, “prueba” y “control de dilución” equivalente al suero limpio,

puede indicar la presencia de un anticuerpo IgG, pero una mezcla de anticuerpos IgM y IgG puede

no ser obvia en una prueba directa y puede requerir una titulación para detectar una reducción en la

actividad del anticuerpo.

2. La no reactividad del suero en el tubo “prueba” y la reactividad en el “control de dilución”

equivalente al suero limpio indica la presencia de un anticuerpo IgM.

3. La no reactividad en cualquiera de los tubos, “prueba” o “control de dilución” indica que ha

ocurrido una dilución del anticuerpo y se pueden sacar conclusiones.

4. El “control positivo” (anticuerpo IgG) debe demostrar reactividad y el “control negativo”

(anticuerpo IgM) no debe demostrar reactividad.

Notas

1. Si es más conveniente, la diálisis puede realizarse durante la noche en salina a 4 °C.

2. La actividad de fijar complemento de los anticuerpos IgM también es abolida con el tratamiento

con 2-ME.

Referencias

1. Friedman J, Masters CA, Newlands M, Mollison P. Optimal conditions for the use of sulfhydryl

compounds in dissociating red cell antibodies. Vox Sang 1976;30:231-9.

2. Issitt PD, Issitt CH. Applied blood group serology. 2nd ed. Oxnard, CA: Spectra Biologicals,

1975:32-3.

Método 38 – Determinación de la validez estadística en la identificación de un anticuerpo por el

Método de Fisher

Principio

La identificación concluyente de la especificidad de los anticuerpos anti-eritrocitarios requiere que el

suero o plasma sea probado contra un número suficiente de muestras de GRs antígeno positivo y antígeno

negativo para dar la seguridad que el patrón de reactividad observado no se debe al azar o a una

coincidencia. La probabilidad (p) que los resultados de un panel identificador sean obtenidos sólo por

azar se calcula usando el Método de Fisher para el análisis de una tabla de casos de 2 x 2. Las normas

actuales para los Laboratorios de Referencia de los Servicios de Sangre de la Cruz Roja Americana

requieren una identificación con un nivel de significancia de 0.01 (1%) o menor.

Procedimiento

Cálculo de probabilidad (p) usando el Método de Fisher:

1. Construir una tabla de casos de 2 x 2 (ver Tabla 38-1).

Tabla 38-1: Tabla de Contingencia 2 x 2

Reacciones Séricas Antígeno presente Antígeno ausente Total

Positivo

Negativo

A

C

B

D

A + B

C + D

Total A + C B + D N

A= Nº de reacciones positivas observadas con GRs antígeno positivo

B= Nº de reacciones positivas observadas con GRs antígeno negativo

C= Nº de reacciones negativas observadas con GRs antígeno positivo

D= Nº de reacciones negativas observadas con GRs antígeno negativo

N= Total de muestras de GRs estudiadas

2. Calcular el valor de p como se sigue en la Tabla 38-2.

Tabla 38-2. Cálculo de probabilidad

P= (A+B)! x (C+D)! x (C+D)! x (A +C) x (B+D)!

N!xA!xB!xC!xD!

Nota: ! es el símbolo por el factorial de un número entero que es el producto de todos los números

enteros desde 1 a todos los números implicados. Ej:

6!= 1 x 2 x 3 x 4 x 5 x 6= 720

3!= 1 x 2 x 3=6

1!= 1

0!= por definición = 1

Notas

1. Los numerosos cálculos individuales requeridos pueden llevar al cálculo de p una situación que

consuma tiempo, aún cuando se use una calculadora electrónica. El cálculo de p puede

completarse más rápidamente usando un programa diseñado por el personal de computación. Fue

desarrollado un programa por el Laboratorio Nacional de Referencia para la Serología de Grupos

Sanguíneos. Este programa calcula la p, analiza los datos ingresados, y suministra al operador

recomendaciones para posteriores investigaciones en instancias donde p excede los niveles

aceptables. Se puede obtener una copia de este programa, en forma escrita o en diskette,

escribiendo al National Reference Laboratory for Blood Group Serology, American Red Cross,

15601 Crabbs Branch Way, Rockville, MD 20855.

Referencias

1. Race RR, Sanger R. Blood groups in man. 6th ed. Oxford: Blackwell, 1975;480-1.

2. Ellisor S, Morel PA, eds. Statistics for blood bankers: The joy of statistics. Arlington,

VA: AABB, 1983;129-31.

3. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990;565-7.

4. Moore BPL. Serological and immunological methods. The technical manual of the Canadian Red

Cross Blood Transfusion Service. 8th ed. Toronto: Canadian Red Cross, 1980;200-2.

5. Blood Services Directive (BSD) 6:38, Reference Laboratories. Washington, DC: American Red

Cross Blood Services, Rev. July, 1987.

6. Eckrich RJ. Use of a personal computer to determine the statistical validity of antibody

identification by Fisher’s Exact Method. Immunohematol 1988;4:34-7.

Método 39 – Identificación de anticuerpos de alto título, baja avidez

Principio

En forma particular, los anticuerpos de alto título-baja avidez (HTLA por sus siglas en inglés) reaccionan

a diluciones altas en fase antiglobulínica, pero las reacciones no son intensas (2+ o menos). En contraste,

otros anticuerpos, tales como el anti-D, anti-Fya, y anti-K que reaccionan con intensidad 2+ o menos en

las medio antiglobulínico, habitualmente tendrán títulos menores a 8.

Los anticuerpos del grupo HTLA incluyen, pero no están limitados a, anti-Ch, anti-Rg, anti-

JMH, anti-Kna, anti-McCa, anti-Csa, anti-McCc, anti-Yka, y anti-Bg. El grupo puede clasificarse

posteriormente como aquellos anticuerpos que son inhibidos por suero humano (anti-Ch, anti-Rg) y

aquellos que no son inhibidos (anti-JMH, anti-Kna, anti-McCa, anti-McCc, anti-Csa, anti-Yka). Los

anticuerpos anti-Bg pueden ser inhibidos por plasma de personas que tienen una expresión fuerte de los

antígenos Bg en sus GRs. El anti-Ch, anti-Rg y anti-JMH muestran reacciones débiles o negativas en las

pruebas que usan GRs tratados con enzimas.


1. Tubos de ensayo

2. Solución salina

3. Pipetas

4. Pool de suero o plasma AB inerte

5. Suero Antiglobulina Humana (SAGH) (poliespecífica o IgG)

6. GRs recubiertos con IgG (Control Coombs)



9. Suero a estudiar

10. GRs a estudiar

Procedimiento

Detección de HTLA

1. Preparar diluciones 1:5 y 1:10 en salina del suero a estudiar.

2. Seleccionar 3 muestras de GRs reactivos con el suero a estudiar. Estos GRs pueden ser reactivos o

de donantes. Si la fuerza de las reacciones es variable, seleccionar una muestra débilmente

reactiva, una moderadamente reactiva, y otra fuertemente reactiva.

3. Rotular 3 tubos para cada GR a ser estudiado: “1:5”, “1:10” y “IgG”.

4. Agregar 1 gota de suspensión globular al 2-5% a cada tubo adecuadamente rotulado. Lavar una

vez con salina y decantar para tener un “botón seco”.

5. Agregar 3 gotas del suero diluido a los tubos adecuadamente rotulados y 3 gotas de suero limpio al

tubo “IgG”.


7. Lavar 3 veces con salina, decantar completamente después de cada lavado.

8. Agregar la cantidad especificada por el fabricante de SAGH poliespecífica a los tubos “1:5” y

“1:10” y la cantidad especificada por el fabricante de anti-IgG al tubo “IgG”.

9. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Resuspender el botón suavemente y observar en

busca de aglutinación. Todas las pruebas negativas deben examinarse microscópicamente.


10. Agregar 1 gota de GRs cubiertos con IgG y centrifugar durante 15-20 segundos. Examinar en

busca de aglutinación; si no se observa ninguna, la prueba debe ser repetida.

Titulación/inhibición de anticuerpos HTLA

1. Preparar diluciones dobles seriadas en salina del suero a estudiar. El rango de la dilución debe ser

desde no diluido hasta 1:512 y el volumen preparado no debe ser inferior a 0.5 mL. (Guardar la

última dilución para el caso que el título exceda 512 y necesiten hacerse posteriores diluciones).

2. Colocar 0.1 mL de cada dilución en cada uno de 2 tubos adecuadamente rotulados.

3. A una fila de tubos que contiene cada dilución del suero, agregar 0.1 mL de salina (“control”).

4. A la otra fila de tubos, agregar 0.1 mL de suero/plasma AB inerte (“prueba”).

5. Mezclar y dejar estar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

6. Agregar 0.05 mL de una suspensión al 2-5% de los GRs reactivos a cada tubo.


8. Lavar los GRs 3 veces con salina, decantar completamente después de cada lavado.

9. Agregar la cantidad especificada por el fabricante de SAGH a cada tubo y centrifugar a 1000 g

durante 15-20 segundos.

10. Resuspender suavemente y observar en busca de aglutinación. Examinar todas las pruebas

negativas microscópicamente. Registrar los resultados.

11. Agregar 1 gota de GRs cubiertos con IgG a todos los tubos negativos y centrifugar durante 15-20

segundos. Examinar en busca de aglutinación; si no se observa ninguna, la prueba debe ser

repetida.

Interpretación

1. El suero que continúa reaccionando 4 diluciones más allá de la que da una reacción de 1+ puede

considerarse que contiene un anticuerpo HTLA.

2. Los anticuerpos HTLA son anticuerpos IgG y las pruebas en las cuales el anti-IgG es sustituido

por SAGH poliespecífica deben ser también reactivas.

3. La inhibición de la actividad del anticuerpo por suero o plasma puede ser parcial o completa. El

título de la prueba debe ser por lo menos 3 diluciones menor que el título del control para

demostrar la inhibición del anticuerpo.

4. La inhibición del anticuerpo con plasma o suero sugieren actividad anti-Ch o anti-Rg, pero puede

deberse a anticuerpos Bg. Para confirmarlo, repetir la titulación usando suero Ch positivo, Rg

negativo y suero Ch negativo, Rg positivo como fuentes de sustancias inhibidoras Ch y Rg.

5. Cuando un anticuerpo no HTLA está también presente en el suero que se sospecha contiene un

anticuerpo HTLA, el GR indicador para el título debe carecer del antígeno correspondiente a la

especificidad del anticuerpo no HTLA.

6. Para confirmar la presencia de anti-Ch o anti-Rg en el suero del paciente, estudiar con GRs

cubiertos con C4d (ver M40). Debe dar una aglutinación directa.

Referencias


Método 40 – GRs recubiertos con C4d: Preparación y uso en la identificación de anticuerpos y

autoadsorción

Principio

Los anticuerpos Chido (Ch) y Rodgers (Rg) están dirigidos hacia el fragmento C4d del Complemento

humano. Cuando existen pequeñas cantidades de C4d sobre los GRs normales, el suero que contiene

estos anticuerpos reacciona solo débilmente en la prueba de antiglobulina indirecta (PAI). Después que

los GRs alogénicos o autólogos son cubiertos con cantidades excesivas del componente C4d in vitro,

pueden dar una aglutinación directa cuando están presentes los anticuerpos anti- Ch y anti-Rg.

Aplicación

Los GRs cubiertos con C4d pueden usarse para demostrar los anticuerpos anti-Chido y anti-Rodgers por

aglutinación directa o para adsorber anti-Ch o anti-Rg del suero. El suero adsorbido puede ser usado para

la detección e identificación de anticuerpos o en pruebas de compatibilidad.


1. Sangre entera anticoagulada con ACD/CPD/CPDA-1, autóloga y homóloga

2. Plasma de donantes Ch positivo, Rg positivo (ACD/CPD/CPDA-1)

3. Sucrosa al 10% en agua destilada

4. Tubo Vacutainer® (16 x 100 mm) con EDTA (K3EDTA), Baxter Diagnostic, Inc., Scientific

Products Division, catálogo número B2991-54.



7. Solución salina

8. Solución Alsever

9. Suero a estudiar


GRs cubiertos con C4d

1. Dispensar 10 mL de sucrosa al 10% en un Vacutainer conteniendo 15 mg de K3EDTA.

2. Agregar 1 mL de sangre fresca anticoagulada con ACD/CPD.


4. Lavar los GRs 3veces con salina. Los GRs están ahora cubiertos por C4b.

5. Tratar con tripsina los GRs cubiertos con C4b (ver M42) para convertir el C4b en C4d. En forma

simultánea, tratar una alícuota de GRs lavados, no recubiertos del mismo donante como control.

Procedimiento

Método rápido para la identificación de anti-Ch y anti-Rg

1. Agregar 3 gotas del suero a estudiar a cada uno de 2 tubos rotulados “prueba” y “control”.

2. Agregar 1 gota de suspensión al 5% de GRs cubiertos con C4d al tubo rotulado “prueba”.

3. Agregar 1 gota de suspensión al 5% de GRs control tratados con tripsina al tubo rotulado

“control”.


5. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos

6. Examinar en busca de aglutinación y registrar los resultados.

7. Las pruebas pueden terminarse en fase antiglobulínica lavando inmediatamente 3 veces con

salina.

8. Agregar 2 gotas de anti-IgG y centrifugar durante 15-20 segundos.

9. Examinar en busca de aglutinación y registrar los resultados.

Interpretación

1. El suero que contiene anti-Ch y anti-Rg aglutinará directamente a los GRs cubiertos in vitro con

cantidades excesivas de C4d. Una prueba positiva y un control negativo indican la presencia de

anti-Ch o anti-Rg. La reacción de los GRs cubiertos con C4d en la fase antiglobulínica debe ser

mucho más fuerte que la reactividad de la misma con GRs no tratados.

2. Una prueba y el control positivos indican una prueba inválida y no pueden hacer interpretaciones.

Los GRs deben ser estudiados con un reactivo que tenga anti-C4d para confirmar el correcto

recubrimiento con C4d.

3. Una prueba y el control negativos indican que el anticuerpo presente en el suero no es un anti-Ch o

anti-Rg.

Autoadsorción de anti-Ch y anti-Rg

Recubrimiento con complemento

1. Dispensar 1mL de paquete globular de GRs autólogos lavados en 2 tubos de 16 x 100 mm que

contengan 15 mg de K3EDTA.

2. A cada alícuota de GRs., agregar 1 mL de pool de plasma fresco alogénico compatible y 10 mL de

sucrosa al 10%

3. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 15 minutos.

4. Lavar 3 veces con salina y remover completamente la salina después de cada lavado.

Adsorción

1. Agregar 2 mL de suero a ser adsorbido a 1 mL de GRs cubiertos con C4.

2. Incubar a 37 °C durante 1 hora.

3. Centrifugar a 1000 g durante 3 minutos y transferir el suero sobrenadante a una segunda alícuota

de GRs cubiertos con C4.


5. Centrifugar durante 3 minutos y transferir el suero a un tubo limpio.

6. Estudiar el suero adsorbido, libre de anti-Ch/anti-Rg, para otros anticuerpos.

Notas

1. Los GRs cubiertos con C4 pueden ser mejores si la sangre extraída en una jeringa de un donante

adecuado es inmediatamente agregada a la solución de EDTA sucrosa.

Referencias


2. Ellisor SS, Shoemaker MM, Reid ME. Adsorption of anti-Chido from serum using autologous red

blood cells coated with homologous C4. Transfusion 1982;22:243-5.

3. Garratty G, Petz LD. Quality control of antiglobulin serum (AGS) (Letter to the editor).


4. Morton JA, Pickles MM. Use of trypsin in the detection of incomplete anti-Rh antibodies. Nature

1947;159:799.

5. Judd WJ, Kraemer K, Moulds JJ. The rapid identification of Chido and Rodgers antibodies using

C4d coated red blood cells. Transfusion 1981;21:189-92.

Método 41 – Preparación y uso de pool de plaquetas para la adsorción de anticuerpos HLA

Principio

La superficie de las plaquetas contiene antígenos HLA-A, HLA-B y HLA-C, sin embargo, no han sido

detectados antígenos para algunos anticuerpos anti-eritrocitarios clínicamente significativos. El pool de

plaquetas puede remover los anticuerpos HLA del suero para permitir la identificación de aloanticuerpos

anti- eritrocitarios que pueden estar presentes.


1. Centrífuga refrigerada o equipamiento automático para el lavado de productos sanguíneos

2. Bolsa de extracción de sangre

3. Extractor de plasma, Baxter Diagnostic, Inc., Fenwal Division, catálogo número 4C2244

4. Centrífuga de alta velocidad Fisher, Fisher Scientific Co., model 59


6. 2-4 mL de suero a estudiar

7. 2 mL de pool de GRs de 12 donantes de grupo O, lavados

8. Tubos de poliestireno cónicos

9. Papel de filtro

10. Pipetas

11. Tubos de ensayo


Técnica para la preparación de las plaquetas

1. En 2 bolsas plásticas de 2000 mL, observando una técnica estéril, realizar un pool de 80

concentrados de plaquetas sin contaminación con sangre que han sido agitados durante 6 horas.

Anexar otra bolsa de 2000 mL a cada uno de los pools, cerrar el tubo de conexión, y colocar las

bolsas con el pool de plaquetas en un extractor de plasma en la heladera a 4 °C durante 3-5 días.

2. Pasar el plasma rico en plaquetas a la segunda bolsa, dejando los GRs sedimentados en las bolsas

originales.

3. Incubar el plasma rico en plaquetas durante 1 hora a 37 °C.

4. Concentrar las plaquetas por centrifugación y remover el plasma.

5. Lavar las plaquetas de acuerdo con las normas de los protocolos manuales y automatizados (ver

Nota 1).

Técnica para la preparación de los GRs

1. Pool de GRs de 12 donantes de grupo O.

2. Lavar los GRs 2-3 veces en salina, remover todo el sobrenadante.

Procedimiento

1. Llenar con 1 mL de pool de plaquetas lavadas los tubos cónicos de poliestireno de 8-12 mL.

Llenar con 1 mL de paquete de GRs lavados los tubos cónicos de poliestireno de 8-12 mL.

2. Centrifugar las plaquetas en una centrífuga de alta velocidad a 7000 g durante 4 minutos. Remover

el sobrenadante de salina y estudiar frente a GRs de grupo A1, B y O para determinar si hay algún

anticuerpo anti-eritrocitario presente.

3. Si hay GRs visibles, transferir la capa superior de plaquetas a otro tubo cónico y descartar la

porción contaminada con GRs. Centrifugar nuevamente las plaquetas concentradas y remover toda

la salina residual con un papel de filtro (ver Nota 2).

4. Centrifugar el pool de GRs de grupo O a 7000 g durante 4 minutos. Descartar el sobrenadante y

remover toda la salina residual con un papel de filtro. Agregar 1 volumen de suero a 1 volumen de

GRs y mezclar.

5. Agregar 1 volumen de suero a 1 volumen de plaquetas concentradas y mezclar.

6. Incubar ambas mezclas a 37 °C durante 30 minutos.

7. Centrifugar a 7000 g durante 4 minutos. Remover el suero y repetir la adsorción con nuevas

alícuotas de plaquetas concentradas y GRs o, alternativamente, estudiar el suero adsorbido como

en el paso 8 abajo.

8. Estudiar el suero adsorbido con las plaquetas y con los GRs en paralelo con los GRs inicialmente

reactivos (ver Notas 2-5).

Interpretación: Ver Tabla 41-1 para un ejemplo de este procedimiento.

Tabla 41-1: Interpretación de la prueba para absorción de Acs. anti-HLA usando pooles de

plaquetas

Reacciones con

Plaquetas – suero

adsorbido

Reacciones con GRs –

suero adsorbido

Interpretación

GRs inicialmente

reactivos

O + Reacción sospechosa de

hemaglutininas anti-

HLA

GRs inicialmente

reactivos

O O Reactividad diluída o

adsorbida. Prueba no

válida

GRs inicialmente

reactivos

+ O La reactividad es GRs

específica, no

aglutinina anti-HLA

GRs inicialmente + + La reactividad no es

reactivos HLA y no es fácilmente

adsorbida por GRs.

Notas

1. Las plaquetas pueden ser conservadas congeladas a menos de –20 °C durante 1 año.

2. Es posible la desaparición de reacciones débiles por la salina residual en las plaquetas y los GRs si

no se tiene el cuidado de realizar una extracción total de la salina residual.

3. Las plaquetas pueden adsorber anticuerpos de las siguientes especificidades: A, B, H, Lea, Leb, I, i,

P1, Bg.

4. Las plaquetas pueden no ser efectivas para adsorber hemaglutininas específicas correspondientes

al HLA B8 y B12.

5. La mayoría de las hemaglutininas con reactividad HLA serán adsorbidas después de 2 adsorciones;

sin embargo, hemaglutininas HLA de alto título pueden requerir 3-4 adsorciones. El suero

adsorbido puede continuar reaccionando con un ocasional GR de prueba debido a una expresión

fuerte de un antígeno HLA.

6. Un concentrado de plaquetas humano desecado (CPH) está disponible comercialmente. Organon

Technika Corp., catálogo número 56167.

Referencias

1. Crawford MN. HLA and the RBC. Malvern, PA: Cooper Biomedical, 1983.

2. Carty L, Wolford F. Personal communication, 1989.

Método 42 – Métodos enzimáticos

Principio

Las enzimas proteolíticas comúnmente usadas en los procedimientos del banco de sangre (ficina, papaína,

bromelina, tripsina) y, en raros casos, neuraminidasa y pronasa remueven ciertas estructuras de la

membrana del GR. En algunos sistemas de grupos sanguíneos, los GRs se vuelven más aglutinables por la

reducción de la carga de sus membranas. En otros sistemas, las estructuras antigénicas son destruidas o

desnaturalizadas.

Aplicación

El incremento o la pérdida de la reactividad serológica pueden ser usadas como un indicio de la identidad

de un anticuerpo. El tratamiento enzimático produce una remoción una más rápida de los autoanticuerpos

presentes en los GRs usados para la autoadsorción en frío o caliente. Las enzimas, cuando se combinan

con DTT (reactivo ZZAP), pueden remover los autoanticuerpos IgG de los GRs para permitir su

fenotipificación. (Nota: las técnicas enzimáticas en dos etapas que incluyen el tratamiento previo de los

GRs a estudiar consumen más tiempo pero son más sensibles que los procedimientos en una etapa.)

Control de calidad de las soluciones enzimáticas

Los extractos en polvo crudo de enzimas se consiguen comercialmente y son usados para preparar las

soluciones de reserva y de trabajo en los siguientes procedimientos. La cantidad de enzimas y la duración

del tratamiento utilizados son aproximados y deben ser estandarizados en cada nueva remesa de enzimas

preparadas. Debe evaluarse que el tiempo de incubación y la fuerza de la enzima seleccionada

desnaturaliza o potencia los antígenos apropiados sin el tratamiento mayor que induce a que los GRs

reaccionen con suero libre de anticuerpos. Para realizar un control de calidad en cada nuevo lote que se

emplea, se deben usar sueros de control con anti-Jka débil, fuerte anti-Fya, y varios sueros libres de

anticuerpos antes de que ésta sea alicuotada y conservada. Recordar que puede ser un problema variar el

tiempo de incubación del tratamiento enzimático y, que si fuera necesario, usar diluciones de trabajo

mayores o menores para el mayor o menor tratamiento.


1. Solución enzimática de reserva (1%) y de trabajo (0.1%) (ver Nota 1)

2. Anticuerpo(s) débiles conocidos para ser potenciados con el procedimiento enzimático (e.j., anti-

Jka)

3. Anticuerpo(s) fuertes conocidos que no son reactivos en medio enzimático (e.j., anti-Fya)

4. Suero libre de anticuerpos (preferiblemente 4-6 muestras diferentes)

5. GRs apropiados, e.j., Jk(a+b+) cuando use el anticuerpo anti- Kidd y Fy(a+b-) con el anticuerpo

anti- Fy-a.

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Solución salina



12. Suero Antiglobulina Humana (SAH) (Poliespecífica o anti-IgG)

Procedimiento

Una etapa

Usando el método de investigación para cada enzima, estudiar los GRs apropiados con el anticuerpo

adecuado contenido en el suero y la mezcla de enzimas, y suero libre de anticuerpos y la mezcla de

enzimas (a) a temperatura ambiente, para diversos tiempos de incubación (15, 20, 25 y 30 minutos) y (b)

a 37 °C, para diversos tiempos de incubación (15, 20, 25 y 30 minutos). Cada fase de la prueba

(temperatura ambiente y 37 °C) y tiempos de incubación deben ser realizadas separadamente.

Dos etapas

Usando el método de investigación para cada enzima, variar el tiempo de pretratamiento enzimático de

los GRs seleccionados a 37 °C (5, 10, 15 y 20 minutos). Estudiar los GRs seleccionados pretratados con

enzima, con el suero que contiene el anticuerpo apropiado y con suero libre de anticuerpo, para diversos

tiempos de incubación (15, 20, 25 y 30 minutos).

Notas

1. Si se observara una aglutinación espontánea de los GRs (actividad enzimática excesiva) usando la

solución de trabajo al 0.1%, preparar y estandarizar una solución enzimática más débil, como

0.05%.

FICINA – DOS ETAPAS


1. Solución tampón de Hendry, pH 7.3-7.5

2. Ficina en polvo (extracto crudo), Sigma Chemical Co., catálogo número F3266

3. Suero de prueba

4. Suspensión de GRs al 3-5%, autólogos y reactivos


6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Solución salina

9. Suero Antiglobulina Humana


11. Matraz, 200 mL

12. Agua destilada


1. Preparar la solución tampón de Hendry agregando 1 parte de solución de KH2PO4 (0.514 g en 100

mL de agua) a 4 partes de solución de Na2HPO4 (0.455 g en 100 mL de agua).

2. Preparar la solución de ficina al 1% agregando 100 mL de la solución tampón de Hendry a 1 g de

ficina en polvo (ver Nota 1). Mezclar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 1000 g

durante 5 minutos. Separar la solución libre de partículas en alícuotas de 1-2 mL y conservar por debajo

de –20 °C. La actividad se mantiene por muchos meses si se conserva congelada.

Tratamiento de los GRs

1. Lavar 3 veces los GRs autólogos y a estudiar con solución salina y resuspender al 3-5%.

2. A 9 partes de suspensión globular agregar 1 parte de la solución tamponada de ficina. Si se van a

tratar únicamente gotas de GRs, diluir la solución al 1% de ficina 1:10 con salina tamponada pH

7.3 y agregar un volumen igual de solución al 0.1 de ficina a los GRs.


4. Lavar los GRs 3 veces con salina y descartar completamente el último lavado.

5. Resuspender los GRs tratados con la concentración original para usar.

Procedimiento

1. Colocar 2 gotas (0.1 mL) de suero y 1 gota (0.05 mL) de GRs al 3-5% tratados con ficina en un

tubo de ensayo.



4. Leer macroscópicamente. Registrar los resultados.

5. Aunque no descripta originalmente, si cree oportuno, puede realizarse una prueba antiglobulínica

indirecta (PAI) a estos GRs.

Notas

1. Tener extremo cuidado cuando se pesa la ficina en polvo. Es muy irritante para las mucosas,

particularmente si es inhalada. Usar guantes y proteger los ojos.

2. Descartar la solución de ficina descongelada después de 24 horas. No volver a congelar.

3. Los GRs tratados con ficina pueden conservarse a 4 °C durante 72 horas.

Referencias

1. Haber G, Rosenfield RE. Ficin-treated RBCs for hemagglutination studies. In: P.H. Andersen-

Papers in dedication of his 60th birthday. Copenhagen: Munksgaard, 1957:45.

2. Giles CM. Survey of uses for ficin in blood group serology. Vox Sang 1960;5:467-71.

PAPAINA – DOS ETAPAS


1. Tampón fosfato M/15, pH 5.4


3. Papaína (papaína tipo II), Sigma Chemical Co.

4. Solución de papaína


6. Suero a estudiar

7. Agitador de microplaca


9. Tubos de ensayo

10. Pipetas





15. Papel de filtro Whatman número 1

16. Matraz, 2000 mL

17. Agua destilada


1. Preparar la solución tampón fosfato M/15: disolver 9.47 g de Na2HPO4 (anhidro) en 1000 mL de

agua destilada. Disolver 9.08 g de KH2PO4 (anhidro) en 1000 mL de agua destilada. Para preparar

la solución tampón de reserva M/15, combinar 36 mL de solución de Na2HPO4 con 964 mL de

solución de KH2PO4.

2. Preparar el PBS: agregar 1 volumen de tampón fosfato M/15 (solución de reserva) a 9 volúmenes

de salina.

3. Preparar la solución de reserva de papaína: agregar 1 g de papaína en polvo a 100 mL de salina;

llevarlo a un agitador durante 15 minutos. Clarificar por filtración con un papel de filtro Whatman

número 1. Separar en alícuotas de 1-2 mL y conservar por debajo de –20 °C.

4. Preparar la solución de trabajo de papaína: Agregar 1 volumen de solución de reserva de papaína a

9 volúmenes de PBS.


1. Lavar los GRs 3 veces con PBS.

2. A 1 volumen de GRs concentrados, agregar 2 volúmenes de solución de trabajo de papaína.

3. Incubar a 37 °C durante 30 minutos. Mezclar frecuentemente.

4. Lavar los GRs 3 veces con PBS.

5. Llevar los GRs a una suspensión al 3-5%.

Procedimiento

1. Colocar 2 gotas (0.1 mL) de suero en un tubo de ensayo y agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs

tratados con papaína.

2. Mezclar e incubar durante 30 minutos a 37 °C.

3. Examinar macroscópicamente en busca de aglutinación.

4. Aunque no está descripta originalmente, puede hacerse una prueba antiglobulínica indirecta a esta

etapa.

Notas

1. Descartar la solución de papaína descongelada después de 24 horas. No volver a congelar la

papaína al 1% después de descongelada.

2. La papaína desecada congelada está disponible comercialmente.

3. Los GRs tratados con papaína pueden conservarse a 4 °C por no más de 3 días.

Referencias

1. Kuhns WJ, Bailey A. Use of RBCs modified by papain for detection of Rh antibodies. Amer J Clin

Path 1950;20:1067-9.

TRIPSINA – DOS ETAPAS


1. Tripsina (1%) (1:250, Difco Laboratories)

2. Solución de tampón fosfato, pH 7.4, solución de reserva M/15.

3. Salina tamponada con fosfato, pH 7.3


5. Suero a estudiar


7. Tubos de ensayo

8. Pipetas

9. Solución salina





14. Matraz, 200 mL, 2000 mL

15. Agua destilada


1. Preparar la solución tampón fosfato como sigue: disolver 9.47 g de Na2HPO4 (anhidro) en 1000

mL de agua destilada. Disolver 9.08 g de KH2PO4 (anhidro) en 1000 mL de agua destilada. Para

preparar la solución de reserva del tampón M/15, combinar 8 mL de solución de Na2HPO4 con 2.0

mL de solución de KH2PO4.

2. Preparar el PBS: agregar 1 volumen de tampón fosfato M/15 (solución de reserva) a 9 volúmenes

de salina.

3. Preparar la tripsina al 1% como sigue: agregar 1 g de tripsina en polvo (cruda) a 100 mL de salina

en un matraz. Mezclar el contenido en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Clarificar por filtración con un papel de filtro Whatman número 1 o centrifugar a 1000 g durante 5

minutos. Dispensar en alícuotas de 1-2 mL y conservar por debajo de –20 °C.


1. Agregar 1 volumen de tripsina al 1% a 9 volúmenes de cada suspensión de GRs.

2. Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Lavar los GRs tratados con tripsina y resuspender al volumen original. Usar solo en el día de la

preparación.

Procedimiento

1. Dispensar 2 gotas (0.1 mL) de suero en cada uno de 2 tubos de ensayo rotulados “prueba” y

“autocontrol”.

2. Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs reactivos tratados con tripsina al tubo “prueba” y 1 gota (0.05

mL) de GRs autólogos tratados con tripsina al tubo “autocontrol”.



5. Examinar macroscópicamente en busca de aglutinación.

6. Aunque no descripta en el procedimiento original, puede ensayarse una PAI a esta etapa si se

desea.

Referencias

1. Wheeler WE, Luby AL, Scholl MLL. The action of enzymes in hemagglutinating systems. II.

Agglutination properties of trypsin-modified RBCs with anti-Rh sera. J Immunol 1950;65:39-46.

2. Morton JA, Pickles MM. Use of trypsin in the detection of incomplete anti-Rh antibodies. Nature

1947;159:779.

PRONASA – DOS ETAPAS


1. GRs a estudiar

2. Pronasa, Calbiochem Corp., catálogo número 53702, grado B

3. Salina tamponada con fosfato, pH 7.3 (ver M133)

4. Solución salina

5. Tubos de ensayo




1. Disolver 100 mg de pronasa en 100 mL de PBS. Dispensar en cuotas de 1 mL y conservar a –20

°C o menos.

Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces con salina, y compactar los GRs.

2. Diluir 1 volumen de solución al 0.1% de pronasa con 9 volúmenes de PBS (ver Nota 1).

3. Mezclar 0.2 mL de la solución de pronasa con 0.1 mL del paquete globular lavado.


5. Lavar los GRs 3 veces.

6. Llevar los GRs a una suspensión al 5% en salina.

7. Estos GRs tratados con pronasa pueden usarse para la detección e identificación de anticuerpos

hasta 3 días si son conservados a 4 °C.

Notas

1. La pronasa diluida debe descartarse después de 1 hora a temperatura ambiente.

2. Una vez descongelada, la solución de pronasa al 1% no debe ser congelada nuevamente.

Referencias

1. Prager MD, Fletcher MA. The effect of enzymatic release of sialic acid from human erythrocytes

on Rh agglutinations. J Immunol 1966;97:165-9.

2. Prager MD, Soules MI, Fletcher MA. Further studies on the mechanism of the effect of enzymes

on erythrocyte serology with special reference to pronase. Transfusion 1968;8:220-5.

PAPAINA – UNA ETAPA


1. Papaína al 1% (papaína tipo II), Sigma Chemical Co.


3. HCl cisteína M/2, Sigma Chemical Co.

4. GRs reactivos y autólogos, suspensión al 3-5%

5. Suero a estudiar



8. Pipetas

9. Tubos de ensayo




13. Portaobjetos

14. Microscopio

15. Matraz, 200 mL, 2000 mL

16. Agua destilada


1. Preparar la solución tampón fosfato M/15: Disolver 9.08 g de KH2PO4 (anhidro) en 1000 mL de

agua destilada. Disolver 9.47 g de Na2HPO4 (anhidro) en 1000 mL de agua destilada. Para

preparar la solución de reserva del tampón M/15, combinando 36 mL de solución de Na2HPO4 con

964 mL de solución de KH2PO4.

2. Preparar la cisteína M/2: Disolver 0.79 g de L-cisteína HCl en 10 mL de agua destilada.

3. Preparar la papaína al 1%: Agregar 2 g de papaína en polvo a 100 mL de tampón fosfato M/15 en

un matraz. Mezclar el contenido en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente. Filtrar

con papel de filtro Whatman número 1. Agregar 10 mL de cisteína M/2. Diluir hasta 200 mL con

tampón fosfato M/15 de reserva. Incubar a 37 °C durante 1 hora. Separar en alícuotas de 1-2 mL y

conservar a menos de –20 °C.

Procedimiento

1. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de papaína al 1% a 2 gotas (0.1 mL) de suero y mezclar.

2. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de la suspensión de GRs. Mezclar.

3. Incubar a 37 °C durante 2 horas (ver Nota 1).

4. Examinar microscópicamente en busca de aglutinación.

Notas

1. Aunque el Método de Low original (ver Referencia 1) requiere un período de incubación de 2

horas, la mayoría de los profesionales actuales realizan una incubación de 30 minutos seguida de

una centrifugación a 1000 g durante 15-20 segundos y la realización de una PAI.

2. No usar la mezcla de suero-enzima después de las 4 horas.

3. El pH óptimo para la enzima tamponada está entre 5 y 7, con reacciones fuertes tanto a pH 5.4

como a 7.3; si el pH es muy alto, pueden obtenerse resultados negativos falsos.

Referencias

1. Low B. A practical method using papain and incomplete Rh-antibodies in routine grouping. Vox

Sang 1995;5:94-8.

2. Stern K, Busch S, Buznitsky A. A crossmatching test using activated papain. Amer J Clin

19957;27:707-13.

BROMELINA – UNA ETAPA


1. Bromelina (cruda en polvo), Calbichem

2. Tampón de Sorenson M/15, pH 5.4, Sigma Chemical Co.

3. GRs reactivos y autólogos, lavados y resuspendidos al 4% en salina

4. Suero a estudiar

5. Tubos de ensayo



8. Solución salina

9. Pipetas

10. Matraz o cubeta


1. En un matraz colocar 0.5 g de bromelina en polvo, 90 mL de salina y 10 mL de tampón de

Sorenson . Mezclar el contenido en un agitador durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos para clarificar. Separar la solución limpia en alicuotas de

1-2 mL y conservar a menos de –20 °C (ver Notas 1 y 2).

Procedimiento

1. Pipetear 2 gotas (0.1 mL) de suero en cada uno de 2 tubos de ensayo.

2. Agregar 1 gota (0.05 mL) de la suspensión de los GRs reactivos al 3% a 1 tubo y GRs autólogos

en el otro tubo.

3. Agregar 1 gota (0.05 mL) de solución de bromelina a cada tubo.

4. Mezclar e incubar 15 minutos a temperatura ambiente (ver Nota 3).


6. Dispersar suavemente el botón de GRs y observar macroscópicamente en busca de aglutinación.

Notas

1. La solución de bromelina congelada puede ser conservada por 4-5 meses. Las alícuotas

descongeladas no deben volver a congelarse.

2. El método original de Pirofsky y Mangum, descripto aquí, usa una solución de bromelina al 0.5%.

Otros investigadores han adoptado una solución de bromelina al 2%.

3. La prueba y el control pueden incubarse a 37 °C por 15 minutos.

Referencias

1. Pirofsky B, Mangum ME. Use of bromelin to demostrate erythrocyte antibodies. Proc Soc Exp

Biol, NY 1959;101:49-52.

TRATAMIENTO CON NEURAMINIDASA

Principio

Los receptores T latentes pueden ser expuestos por el tratamiento con neuraminidasa.

Aplicaciones

Los GRs T activados pueden usarse para investigar la poliaglutinación y para remover el anti-T por

adsorción de reactivos para tipificación (ver Nota 1).


1. Neuraminidasa de Vibrio cholera filtrada, 0.1 UI por vial, Sigma Chemical Co., catálogo número

C8772 (ver Nota 2).

2. Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (ver M133).

3. GRs grupo O.

4. Solución salina

5. Tubos de ensayo

6. Pipetas



Procedimiento


2. Remover todo el sobrenadante y agregar un volumen igual de neuraminidasa diluida. Mezclar.


4. Lavar los GRs 4 veces.

5. Conservar a 4 °C en solución de Alsever a una concentración del 4-5%.

Controles

1. Positivo: GRs de grupo O tratados con la prueba de neuraminidasa con anti-T.

2. Negativo: GRs de grupo O no tratados con anti-T.

Interpretación

Los GRs T activados reaccionan fuertemente con las lectinas Arachis hypogaea (anti-T) y Glycine soja,

pero no son agregados por el Polybrene®.

Notas

1. Puesto que el suero normal de adulto contiene anti-T, los GRs T activados no pueden usarse para

la detección e identificación de anticuerpos sin remover la actividad anti-T. El anti-T puede ser

eliminado por el tratamiento con 2-ME de manera que el anticuerpo desconocido no es

significativamente afectado. El anticuerpo desconocido puede se adsorbido y eluido de los GRs

normales incompatibles. Entonces puede estudiarse la reactividad del anticuerpo eluido contra

GRs tratados con neuraminidasa sin la interferencia del anti-T.

2. La neuraminidasa (sialidasa) es también provista por:

• Calbichem Corp., catálogo número 480717, conteniendo 1.0 UI/mL de neuraminidasa de

Vibrio cholera.

• GIBCO BRL, Life Technologies, Inc., catálogo número 840-7050AA, conteniendo 0.5-1.0

UI/mL de neuraminidasa de Vibrio cholera.

3. Los GRs tratados con neuraminidasa reaccionarán con el anti-T que se encuentra en la mayoría de

los sueros adultos, Arachis hypogaea, y Glycine soja.

4. Los GRs tratados con neuraminidasa no reaccionarán con suero de cordón, suero del cual el anti-T

ha sido adsorbido, o suero de personas con GRs T activados poliaglutinables.

5. Las células T activadas no son agregadas por Polybrene.

Referencias

1. Beck ML. The technical problem of T-activation. Transfusion 1968;8:109-10.

2. Issitt PD. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publications,

1985:461.

3. Moulds JJ. Polyagglutination: overview and resolution. In: Beck ML, ed. Polyagglutination.

Washington, DC: AABB, 1980:15.

Método 43 – Prueba antiglobulínica directa e indirecta para detectar IgG, IgM, IgA y C3


Los anticuerpos de diferentes clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA o complemento pueden recubrir

los GRs tanto in vivo como in vitro. Puede ser útil investigar la proteína que los recubre para el

diagnóstico o determinación de la especificidad del anticuerpo.


1. GRs de prueba (recubiertos in vivo o in vitro)

2. GRs de control (disponibles comercialmente o preparados según necesidad –ver M42, M135,

M138)

3. Reactivos AGH (disponibles comercialmente, ver Nota 1)

a.Suero poliespecífico que contenga anti-IgG y anti-C3 (también puede contener otras

especificidades)

b.Suero anti-IgG humano, específico contra la cadena G

c.Suero anti-IgM humano, específico contra la cadena M

d.Suero anti -IgA humano, específico hacia la cadena A y la porción secretoria

e.Suero Anti-C3

4. Tubos de ensayo


6. Pipetas

7. Solución salina

Procedimiento

1. Preparar los GRs de prueba lavando 4 veces en salina GRs recubiertos in vivo o in vitro y

resuspendiéndolos al 4-5% (o según las instrucciones del fabricante). Lavar y resuspender los GRs

de control en forma similar, si es necesario.

2. Rotular el número apropiado de tubos de ensayo para las pruebas a hacerse (e.j., IgG, IgM).

3. Agregar 1 gota de GRs de prueba a cada tubo.

4. Agregar 1-2 gotas del suero AGH apropiado en los tubos correspondientes (de acuerdo con las

instrucciones del fabricante).

5. Mezclar todos los tubos y centrifugar a 1000 g durante el tiempo apropiado (como se determinó

durante la calibración).

6. Resuspender suavemente el botón celular y examinar en busca de aglutinación.

7. Confirmar todas las pruebas negativas agregando 1 gota de los apropiados GRs de control y

repitiendo los pasos 5 y 6.

Interpretación

1. Si hay aglutinación después del paso 6, la prueba se interpreta como positiva, e.j., los GRs de

prueba están recubiertos con esa inmunoglobulina o con complemento.

2. Si no hay aglutinación después del paso 6, pero sí existe después del paso 7 (adición de los GRs

control), la prueba es interpretada como negativa, e.j., los GRs de prueba no están cubiertos con

esa inmunoglobulina o complemento.

3. Si no hay aglutinación después del paso 6 y 7, entonces la prueba no es válida y deben tomarse las

apropiadas acciones correctivas.

Notas

1. Como mínimo, se deben usar reactivos monoclonales. Siempre que sea posible, los suero AGH

deben estar autorizados para pruebas diagnósticas in vitro.

2. El suero AGH de baja calidad (fracción Ig de suero total) de cualquier especificidad puede

contener anticuerpos no buscados con especificidad anti-especie que deben ser removidos por

adsorción con GRs tratados con enzimas (ver M47).

3. La fuente recomendada de antisuero es Accurate Chemical and Scientific Corp., productos AXL-

215, Anti-IgA humana de conejo, y AXL-549, Anti-IgM humana de conejo. Ambos son sueros de

afinidad y ambos están autorizados para pruebas diagnósticas in vitro.

Método 44 – Autoadsorción en caliente utilizando GRs tratados con enzimas

Principio

La elución parcial de un autoanticuerpo caliente que recubre los GRs en estudio y el subsiguiente

tratamiento con enzimas permite a estos GRs adsorber más autoanticuerpos del suero autólogo.

Aplicación

Remoción del autoanticuerpo del suero (con los GRs autólogos) permitiendo la detección, identificación

de aloanticuerpos y pruebas de compatibilidad.



2. Solución salina

3. Ficina al 1% o papaína al 1% (ver M42)



6. Pipetas

7. GRs y suero a estudiar autólogos

Procedimiento

1. Lavar 2 mL de GRs 1-2 veces con salina, y luego compactar los GRs.

2. Agregar un volumen igual de salina al paquete de GRs lavados.

3. Incubar los GRs a 56 °C durante 4 minutos, mezclando constantemente.

4. Centrifugar a 1000 g durante 3 minutos y remover el sobrenadante.

5. Lavar los GRs 2-3 veces con salina caliente.

6. Agregar 2 volúmenes de ficina al 1% (o papaína al 1%) a 1 volumen de GRs eluidos por calor.

7. Mezclar e incubar a 37 °C durante15 minutos.

8. Lavar 3-4 veces con salina para remover la enzima (habrá alguna hemólisis, pero el último lavado

debe ser claro). Remover la salina completamente en el último lavado para minimizar la dilución

del suero.

9. Dividir los GRs en 2 alícuotas iguales.

10. A 1 volumen de GRs agregar 1 volumen del suero a estudiar.

11. Mezclar. Incubar a 37 °C durante 30-60 minutos, mezclar cada tanto.

12. Centrifugar durante 3 minutos y transferir el suero a la segunda alícuota de GRs tratados con

enzimas.

13. Repetir los pasos 10 y 11.

14. Centrifugar durante 3 minutos y transferir el suero a un tubo limpio. El suero adsorbido puede

usarse para pruebas de detección e identificación de anticuerpos.

Notas

1. Esta técnica puede no estar indicada para pacientes que han sido recientemente transfundidos,

porque los GRs transfundidos pueden adsorber el aloanticuerpo del suero del paciente.

2. Se pueden tratar GRs adicionales por si se necesitan más adsorciones. Si no hay disponibles GRs

adicionales, pueden usarse los GRs hasta que muestren una hemólisis excesiva.

Referencias

1. Morel PA, Bergren MO, Frank BA. A simple method for the detection of alloantibody in the

presence of warm autoantibody (abstract). Transfusion 1978;18:388.

2. Allen NK. Hyland reference manual of immunohematology. Los Angeles, CA: Hyland, 1963, Fig.

18.

Método 45 – Autoadsorción en caliente usando ZZAP


El principal uso de esta técnica es detectar aloanticuerpos clínicamente significativos en el suero de

pacientes con autoanticuerpos calientes. El tratamiento previo de los GRs con ZZAP removerá las IgG

fijadas; y el tratamiento enzimático de los GRs aumentará la adsorción de los autoanticuerpos.



2. L-cisteína HCl 0.5 M (opcional)

3. Papaína al 2% (opcional)

4. Papaína activada con cisteína al 1%

5. Papaína al 1%

6. Salina tamponada con fosfato (STF), pH 7.3 (ver M133)

7. Ditiotreitol 0.2 M (DTT), reactivo de Cleland

8. Reactivo ZZAP

9. Suero a estudiar

10. GRs de prueba (obtenidos con anticoagulante)




14. Pipetas

15. Tubos de ensayo

16. Tapones

17. Suero Anti-IgG


19. Matraz

20. Agua destilada


1. Preparar L-cisteína HCl 0.5 M: disolver 0.88 g de L-cisteína HCl en 10 mL de agua destilada.

2. Preparar tampón fosfato M/15, pH 5.4:

a.Disolver 9.45 g de Na2HPO4 en 1 L de agua destilada.

b. Disolver 9.07 g de KH2PO4 en 1 L de agua destilada.

c.Mezclar 3.5 mL de Na2PO4 y 96.5 mL de KH2PO4.

3. Preparar papaína al 1%:

a. Disolver 2 g de papaína en 100 mL de tampón fosfato M/15, agitar 15 minutos, y filtrar con

papel de filtro Whatman número 1.

b. Agregar tampón fosfato M/15 para un volumen final de 200 mL.

c. Separar en alícuotas y conservar a –70 °C.

4. Preparar DTT 0.2 M: disolver 1 g de DTT en 32.4 mL de PBS. Separar en alícuotas de 2.5 mL y

conservar a –70 °C.

5. Preparar el reactivo ZZAP: mezclar 0.5 mL de papaína al 1% (ver Nota 3) con 2.5 mL de DTT y 2

mL de PBS. Este puede ser conservado durante 24 horas a 4 °C.

6. Si se desea, preparar papaína activada con cisteína:

a. Preparar papaína al 2% disolviendo 4 g de papaína en 100 mL de tampón fosfato, agitar 15

minutos, y filtrar con papel de filtro Whatman número 1. A esta mezcla, agregar tampón

fosfato hasta completar 200 mL.

b. Incubar 100 mL de papaína al 2% con 10 mL de L-cisteína HCl 0.5 M durante 1 hora, diluir

hasta los 200 mL con tampón fosfato, separar en alícuotas de 1 mL, y conservar a –70 °C.

Procedimiento

1. Lavar los GRs a estudiar 6 veces con salina, luego compactar los GRs.

2. Preparar 2 tubos, cada uno con 1 mL de GRs compactados y lavados y 2 mL de reactivo ZZAP.


4. Lavar los GRs 3 veces en salina. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos y remover tanta salina

residual como sea posible.

5. Agregar 2 mL del suero a adsorber a 1 mL de GRs tratados con ZZAP,.


7. Centrifugar durante 2 minutos, recoger el sobrenadante, y repetir el procedimiento de adsorción

con un segundo tubo de GRs tratados con ZZAP.

8. Estudiar el suero adsorbido en paralelo con suero no adsorbido con una prueba antiglobulínica

indirecta.

Notas

1. Preparar el reactivo ZZAP inmediatamente antes de usar.

2. El tratamiento de los GRs con ZZAP destruye los antígenos M, N, S, Fya, Fyb, y los del sistema

Kell excepto el Kx. Si la autoadsorción no parece remover el autoanticuerpo, éste tener una

especificidad hacia el Sistema Kell.

3. La ficina al 1% (ver M42) o la papaína activada por cisteína puede sustituirse por papaína al 1%.

Si se elige ficina al 1%, se requiere un gran volumen de enzima: Prepararla de esta manera el

ZZAP: mezclar 2.5 mL de DTT 0.2 M, 1.0 mL de ficina al 1% y 5 mL de PBS.

Referencias

1. Low B. A practical method using incomplete Rh antibodies in routine Rh blood-grouping. Vox

Sang 1955;5:94-8.

2. Branch DR, Petz LD. A new reagen (ZZAP) having multiple applications in immunohematology.

Am J Clin Pathol 1982;78:161-7.

Método 48 – Remoción parcial de la IgG de los GRs por lavado en caliente

Principio

Los anticuerpos pueden ser removidos parcialmente de los GRs por el aumento de la temperatura durante

cortos períodos de tiempo.

Aplicación

Estos GRs entonces pueden ser tratados con enzimas y usados para una autoadsorción.


1. GRs a estudiar (conservados con anticoagulante)

2. Suero a estudiar

3. Papaína al 1% (ver M42)



6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo

Procedimiento

1. Dividir los GRs en 2 alícuotas de 1 mL cada una. Lavar 6 veces con salina caliente (45 °C), y

luego compactar los GRs.

2. A cada alícuota de GRs agregar un volumen igual de solución salina e incubar a 56 °C durante 3-4

minutos, mezclando constantemente.

3. Centrifugar a 1000 g durante 3 minutos y retirar el sobrenadante. (El sobrenadante eluido puede

guardarse para identificar la especificidad del autoanticuerpo, pero no debe reemplazar en las

pruebas al eluato preparado durante otras técnicas)

4. Lavar los GRs eluidos por calor 3 veces con salina caliente, y luego compactarlos.

5. Usar para la autoadsorción.

6. Agregar 2 volúmenes de papaína a 1 volumen de GRs.

7. Mezclar. Incubar a 37 °C durante 30 minutos, mezclando cada tanto.

8. Lavar 3-4 veces con salina para remover la enzima y retirar completamente la salina tras el último

lavado, para minimizar la dilución del suero.

9. A 1 volumen de GRs tratados con papaína, agregar 1 volumen del suero a estudiar.

10. Mezclar e incubar a 37 °C durante 30-60 minutos, mezclando cada tanto.

11. Centrifugar durante 3 minutos y trasvasar el suero a la siguiente alícuota de GRs tratados con

papaína.


Notas

1. Habitualmente son suficientes dos adsorciones para remover todos los autoanticuerpos del suero,

pero no los más potentes y de alto título. Pueden hacerse hasta más de 6 adsorciones.

2. Puede usarse ficina o papaína.

3. La papaína o la ficina destruirán los antígenos sensibles a las enzimas.

Referencias

1. Morel PA, Begren MO, Frand BA. Irwin Memorial Blood Bank of the San Francisco Medical

Society (personal communication).

Método 49 – Preparación de GRs intactos, libres de anticuerpos con glicina-EDTA

Principio

Los anticuerpos pueden ser removidos de los GRs sin destruir la membrana de los mismos a través de la

acción del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y glicina ácida.

Aplicación

La remoción de las IgG de GRs con PAD positiva permite usarlos para fenotipificación o autoadsorción.


1. Tampón glicina-HCl (tampón G-H)

2. EDTA al 10%

3. Tampón (hidroximetil) aminometano (TRIS) 1 M


5. Suero Antiglobulina Humana (SAGH)

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo



11. GRs a estudiar


1. Preparar el tampón glicina-HCl: agregar 7.5 g de glicina y 5.8 g HCl a 1 L de agua. Ajustar el pH a

1.5 con HCl concentrado (36 N) (ver Nota 1).

2. Agregar 10 g de EDTA a 90 mL de agua desionizada hirviendo. Conservar a temperatura ambiente

o en alícuotas y congelar a –20 °C o menos (ver Nota 2).

3. Preparar el tampón TRIS-NaCl: 12.1 g de TRIS, 5.25 g de NaCl, diluir hasta 100 mL con agua

destilada (ver Nota 1).

Procedimiento

1. Agregar 1 volumen de EDTA a 4 volúmenes de tampón G-H (ver Nota 3).

2. Agregar 1 volumen de paquete globular, de los GRs lavados 3-4, al tampón EDTA/tampón G-H.

Mezclar e incubar durante 1-2 minutos a temperatura ambiente.

3. Ajustar cuidadosamente la mezcla a un pH de 7.4 con tampón TRIS 1 M (ver Nota 4).

4. Centrifugar la mezcla a 1000 g durante 10 minutos para compactar los GRs.

5. Remover el sobrenadante (el cual puede usarse como un eluido), lavar los GRs, y realizar la PAD

en ellos. Si la PAD es positiva, repetir los pasos 2-5.

Notas

1. El tampón G-H y el tampón TRIS 1 M pueden conservarse congelados en alícuotas.

2. El EDTA al 10% puede precipitar si se conserva a 4 °C.

3. Un autor (ver Referencia 2) maximizó la elución de anticuerpos sin perder la integridad de los GRs

alterando los volúmenes de los reactivos como sigue: Mezclar 20 volúmenes de tampón G-H y 5

volúmenes de solución de EDTA al 10%. Agregar 10 volúmenes del paquete de GRs lavados a 20

volúmenes de la mezcla de G-H/EDTA.

4. Los pasos 3-5 deben hacerse rápidamente para prevenir la precipitación del quelante y la lisis de

los GRs.

5. Un artículo (ver Referencia 1) indica que este método permite “la completa conservación de los

antígenos ABH, MNSs, Le, Fy, P y Jk”. El K1, 2, 3, 6, 7, 13 son indetectables durante adsorción-

elución.

Referencias

1. Louie JE, Jiang AF, Zeroulis CG. Preparation of intact antibody-free red blood RBCs in

autoimmune hemolytic anemia (abstract). Transfusion 1986;26:550.

2. Byrne PC. Use of a modified acid/EDTA elution tecnique. Immunohematology 1991;7(2):46-7.

Método 50 – Remoción de IgG de los GRs mediante elución ácida y centrifugación en un gradiente

de densidad (AEDG)

Principio

La elución ácida y el pasaje a través de un gradiente de densidad remueven los anticuerpos IgG de los

GRs.

Aplicación

Usar este método para remover los autoanticuerpos calientes de los GRs y luego utilizar los GRs para la

tipificación antigénica o para la autoadsorción del suero con autoanticuerpos calientes.


1. Muestra de GRs anticoagulados (preferentemente)

2. Solución de tampon fosfato de reserva, pH 7.4

3. Tampón fosfato isotónico, pH 7.4 (A)

4. Salina tamponada con fosfato (STF), pH 7.4 (B)

5. Tampón glicina-HCl, pH 3.0

6. Solución gradiente de tampón Percoll®-fosfato (densidad 1.072 g/mL), Sigma Chemical Co.

7. (hidroximetil) aminometano (TRIS) 0.5

8. pHmetro


10. Baño de hielo derretido

11. Tubos de ensayo para centrífuga, de fondo redondo (capacidad 30 mL)

12. Pipetas


14. HCl 0.1 N

15. Frascos


1. Preparar la solución de reserva del tampón fosfato: Disolver 63.3 g de Na2HPO4• 12H2O y 6.9 g de

NaH2PO4• 2H2O en 1 L de agua destilada.

2. Preparar el tampón fosfato isotónico: Mezclar 1 volumen de solución de reserva de tampón fosfato

con 1 volumen de agua destilada.

3. Preparar el PBS: Mezclar 9 volúmenes de salina con 1 volumen de tampón fosfato isotónico.

4. Preparar el tampón glicina-HCl: Disolver 7.5 g de glicina y 5.8 g de NaCl en 700 mL de agua

destilada. Agregar HCl 0.1 N hasta que el pH sea de 3.0 (Usar un pHmetro; son necesarios

aproximadamente 160-170 mL de HCl 0.1 N) Diluir la solución con agua destilada hasta alcanzar

un volumen final de 1 L.

5. Preparar la solución gradiente de tampón Percoll-fosfato: Mezclar completamente el Percoll de

reserva. Mezclar 1 volumen de Percoll con 1 volumen de tampón fosfato isotónico. Mezclar 9

volúmenes de esta solución con 1 volumen de PBS. Por ejemplo, mezclar 45 mL de Percoll, 45

mL de tampón y 10 mL de PBS.

6. Preparar el TRIS 0.5 M: Disolver 6.1 g de TRIS en 100 mL de agua destilada.

Controles

Cómo estudiar el pH de los reactivos.

Procedimiento

1. Colocar los tubos de ensayo de 30 mL en una gradilla y luego introducirla en un baño de hielo,

inclinar la gradilla en un ángulo de 30-45 grados.

2. Llenar un tubo de ensayo de 30 mL con 15 mL de tampón glicina-HCl 0.1 M, colocar en posición

vertical en el baño de hielo derretido.

3. Llenar otro tubo de ensayo de 30 mL con 5 mL de solución gradiente de tampón Percoll-fosfato,

colocar a 30-45 grados en el baño de hielo.

4. Colocar 1-2 mL de paquete de GRs lavados en un tubo de ensayo de 30 mL; colocar en posición

vertical en el baño de hielo derretido e incubar durante 5 minutos.

5. Verter el tampón glicina-HCl en el tubo con los GRs. Aspirar suavemente con una pipeta y soltar

la mezcla 3 veces; luego cubrir la solución gradiente de tampón Percoll-fosfato con la suspensión

de GRs. Este paso debe completarse rápidamente (en menos de 2-3 minutos).

6. Centrifugar inmediatamente en una centrífuga adaptada con vasos de 50 mL durante 10 minutos a

2500 rpm. Asegurarse que los vasos de la centrífuga tengan un protector de goma en el fondo para

amortiguar los golpes.

7. Descartar el líquido sobrenadante (o conservarlo, ajustar el pH a 7.4 y usar como un eluato).

8. Lavar los GRs una vez con 25 mL de tampón fosfato isotónico, y 3 veces con PBS. Realizar la

PAD.

Notas

1. Si la PAD post elución es negativa, los GRs pueden fenotipificarse o usarse para la autoadsorción.

Si los GRs están aún sensibilizados, repetir el procedimiento o tratarlos con enzimas.

2. El tratamiento AEDG no destruye los antígenos eritrocitarios comunes. El AEDG es una

alternativa útil para el ZZAP cuando hay que buscar antígenos destruidos por el reactivo ZZAP

(Sistema Kell, MNS, Fya, Fyb, algunos s y Yta), o para la autoadsorción de autoanticuerpos

calientes con especificidad Kell.

3. El artículo original estipula el uso de tubos de ensayo y reactivos pre-enfriados.

Referencias

1. Hanfland P. A simple method for the rapid and selective adsorption of warm-reactive erythrocyte

autoantibodies from serum. Vox Sang 1982;43:310-20.

Método 51 – Separación de las IgG de los GRs utilizando Difosfato de Cloroquina (DFC)

Principio

El DFC disocia las IgG de los GRs sin destruir la membrana eritrocitaria.

Aplicación

La remoción de las IgG de GRs con una prueba antiglobulínica directa (PAD) positiva permite que ellos

sean fenotipificados con antisueros que requieren de la prueba de antiglobulina indirecta (PAI).


1. DFC: Sigma Chemical Co. o Sterling Organics, distribuido durante Gamma Biologicals (ver Nota

1).

2. NaOH 0.1 N

3. GRs a estudiar

4. Suero Anti IgG



7. pHmetro o papel para medir pH

8. Solución salina

9. Pipetas

10. Tubos de ensayo

11. Frasco


1. Preparar el DFC como sigue: Agregar 20 g de DFC a 100 mL de salina hasta obtener una solución

al 20 % P/V. Ajustar el pH a 5.1 con NaOH 1 N. Conservar a 4 °C.

Controles

1. Controlar el pH del DFC.

2. Estudiar en paralelo una muestra de GRs con una expresión débil (dosis única) del antígeno(s) a

ser investigado.

3. Estudiar en paralelo una muestra de GRs que carezcan del antígeno(s) a ser investigado.

Procedimiento

1. A 1 volumen de paquete globular de los GRs a estudiar (cubiertos con IgG) y lavados, agregar 4

volúmenes de DFC al 20%. Tratar las células de control de la misma forma.

2. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos (ver Nota 2).

3. Tomar una pequeña alícuota de los GRs tratados con DFC y lavar 4 veces en salina.

4. Realizar una PAD a los GRs lavados usando anti-IgG.

a. Si es negativa: Lavar las muestras a estudiar y de control 4 veces en salina y usar para

fenotipificar con los reactivos que requieren de la PAI. Usar un reactivo anti-IgG cuando se

realice esta prueba (ver Notas 3-5).

b. Si es positiva: Repetir los pasos 3 y 4 con intervalos de 30 minutos hasta que la PAD sea

negativa o hasta que hayan pasado 2 horas. Si ahora la PAD es negativa, proceder con el paso

4a (ver Nota 6).

Notas

1. El DFC de Gamma Biologicals (fabricado durante Sterling Organics) es una solución al 20% lista

para su uso. Este producto es una formulación ligeramente diferente y puede ser más efectiva que

el DFC disponible de Sigma Chemical Co.

2. La incubación de los GRs y DFC a 37 °C puede facilitar la remoción de las IgG. El tiempo total de

incubación no debe exceder los 30 minutos y los GRs deben estudiarse como en los pasos 3 y 4

cada 5 minutos.

3. El DFC no disocia el C3 de los GRs; por lo tanto, los estudios para tipificar los GRs tratados con

DFC que pueden haber sido recubiertos in vivo tanto con IgG como con C3, deben realizarse con

anti-IgG.

4. El DFC disociará completamente las IgG de alrededor del 80% de los GRs recubiertos in vivo por

IgG dentro de las 2 horas.

5. Puede observarse alguna desnaturalización de los antígenos Rh, especialmente cuando los GRs se

hemolizan después de la incubación con DFC. Sin embargo, estos GRs pueden ser tipificados para

el Rh si es realizada la PAI. No deben usarse reactivos anti-Rh químicamente modificados para

tipificar los GRs tratados con DFC.

6. Importante: Tener la precaución durante la interpretación de las pruebas cuando los GRs son

incubados con DFC durante 2 horas y cuando se usan antisueros débiles para la determinación

antigénica.

Referencias

1. Edwards JM, Moulds JJ, Judd WJ. Chloroquine dissociation of antigen-antibody complexes: a new

technique for phenotyping red blood cells with a positive direct antiglobulin test. Transfusion

1982;22:59.

2. Sassetti R, Nichols D. Decresed antigenic reactivity caused by chloroquine (letter). Transfusion

1982;22:537. Moulds JJ, Edwards JM, Judd WJ. (Response). Transfusion 1982;22:538.

3. Prewitt PL, Steane EA, Steane SM. Decreased agglutinability with anti-D of chloroquine-treated

red cells (abstract). Transfusion 1983;23:434.

4. Mallory D, Reid M. Misleading effect of chloroquine (letter). Transfusion 1984;24:412.

5. Shin C, Mallory D, Reid M. False negative red cell antigen typing following chloroquine treatment

(abstract). Transfusion 1984;24:416.

Método 52 – Remoción de anticuerpos ABO de GRs sensibilizados usando sustancias grupo

específicas (SGE)


La transfusión con plasma ABO incompatible, la administración de gammaglobulina intravenosa (IVIG)

o globulina antilinfocítica (GAL), y los anticuerpos ABO maternos que cruzan la placenta pueden causar

una prueba antiglobulínica directa (PAD) positiva, por los anticuerpos ABO que recubren a los GRs de

individuos de grupo A, B o AB. Las SGE, derivadas de la mucosa de porcinos y equinos, formarán

complejos antígeno-anticuerpo que removerán el anti-A, anti-B o anti-A,B de los GRs sensibilizados. La

PAD se vuelve negativa (presumiendo que otros anticuerpos no sensibilizan a los GRs) y puede realizarse

la tipificación de antígenos usando la prueba de antiglobulina indirecta (PAI).


1. GRs a estudiar

2. Neutr-AB®, Baxter Diagnostic, Inc., Dade Division, catálogo número B4830

3. Tubos de ensayo

4. Solución salina

5. Pipetas



8. Suero Antiglobulina Humana, anti-IgG

Procedimiento

1. Lavar los GRs a estudiar 3-4 veces en salina, y luego compactarlos.

2. Colocar 1 gota del paquete de GRs lavados en un tubo de ensayo apropiadamente rotulado.

3. Lavar 3 veces con salina, decantar completamente después del tercer lavado.

4. Agregar 0.5-1.0 mL de Neutr-AB (dependiendo de la fuerza de la PAD) al tubo de ensayo y

mezclar bien.

5. Incubar durante 30-60 minutos (dependiendo de la fuerza de la PAD) a temperatura ambiente.

Mezclar cada tanto.

6. Lavar 4 veces con salina.

7. Hacer una suspensión al 3% de los GRs y realizar una PAD.

8. Si la PAD es negativa, realizar la investigación antigénica deseada ensayando una PAI.

9. Si la PAD es positiva, repetir los pasos 4-7 (ver Nota 1).

Interpretación

Una PAD negativa después de la incubación con Neutr-AB indica que todo el anticuerpo ABO fue

removido de los GRs. Una PAD positiva después de la incubación con Neutr-AB significa que no todo el

anticuerpo ABO ha sido removido de los GRs o que un anticuerpo adicional es el causante de la PAD

positiva.

Notas

1. Los anticuerpos IgG no son tan fácilmente neutralizables como los anticuerpos IgM.

Referencias

1. Beattie K. Identifying the causes of weak or “missing” antigens in ABO grouping tests. In: The

investigation of typing and compatibility problems caused by red blood RBCs. Washington, DC:

AABB, 1975.

2. For in vitro neutralization of human serum isohemagglutinatinins. In: Dade Neutr-AB® reagent

blood group specific substances A and B package insert. Miami, FL: Baxter Healthcare Corp.,

Dade Division, 1989.

3. Judd WJ. Separation of ABO mixtures. In: Summers SH, Rolih SD, Weiland DL, eds. A handbook

of serologic techniques for use in investigative immunohematology. West Chester, PA: Biological

Corduranteation of America, 1982:45.

Método 53 – Determinación antigénica en GRs con una PAD positiva

Principio

Los GRs antígeno positivos adsorben anticuerpos del antisuero específico mientras que los GRs antígeno-

negativos no lo hacen (ver Nota 1).

Aplicación

Esta es una técnica simple usada cuando no hay reactivos disponibles o no son útiles para remover las

IgG de los GRs a ser fenotipificados.


1. Antisueros específicos para los antígenos a ser tipificados (ver Nota 2).


3. GRs a estudiar, con PAD positiva

4. GRs de control, positivos y negativos para el antígeno a tipificar

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina

7. Pipetas



Procedimiento

1. Lavar 3 veces en salina los GRs a estudiar y de control y remover todo el sobrenadante.

2. Rotular tres tubos como “prueba”, “control positivo” y “control negativo”.

3. Agregar 0.2 mL de antisuero a cada tubo.

4. Agregar 0.2 mL de paquete globular de los GRs lavados, de prueba y control en los tubos

correspondientes. Mezclar.

5. Incubar a 37 °C durante 1 hora, mezclando cada tanto.

6. Centrifugar a 1000 g y colocar los GRs libres del suero en tubos adecuadamente rotulados.

7. Rotular 3 juegos de tubos para diluciones dobles (ver M123). Hacer diluciones dobles de 0.1 mL

de cada alícuota del suero adsorbido usando salina como diluyente.

8. A cada dilución del suero agregar 0.1 mL de una suspensión al 3% de GRs antígeno positivos.

9. Incubar los 3 juegos de tubos de la titulación durante 30 minutos a 37 °C.

10. Lavar todos los tubos 3 veces con salina.

11. Agregar la cantidad de SAGH especificada por el fabricante a cada tubo. Mezclar.

12. Centrifugar y leer en busca de aglutinación.

13. Registrar los resultados en un formulario para titulación.

Interpretación

Ver una explicación en la Tabla 53-1.

Notas

1. La capacidad de un GR antígeno positivo para captar anticuerpos generalmente no cambia

substancialmente por tener anticuerpo ya adherido a algunos sitios antigénicos.

2. El suero anti-D comercial para uso en tubo debe ser diluido 1:16 o 1:32 antes de la adsorción.

Otros antisueros de alto título pueden necesitar también ser diluidos hasta un título final de 32 o

menor para hacer más fácilmente aparente la disminución durante la adsorción.

3. Los GRs fuertemente sensibilizados puede aglutinar espontáneamente, aún en salina, y aquellos

menos fuertemente cubiertos pueden aglutinar en medios coloidales con cantidades moderadas de

proteína. De acuerdo con lo establecido por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA por

las siglas en inglés), el suero tipificador para pruebas salinas en tubo puede contener no más de 8%

de albúmina.

4. Algunos antisueros salinos pueden contener anticuerpos Gm. Recordar que los GRs recubiertos

con gammaglobulina de sujetos de tienen una PAD positiva pueden reaccionar con el anticuerpo

anti-Gm contaminante mejor que con el anticuerpo anti-eritrocitario, dando reacciones positivas

falsas en esos pacientes con PAD positiva.

Referencias

1. Beattie KM. Laboratory evaluation and management of antibody specificities in warm

autoimmune hemolytic anemia. In: Bell CA, ed. A seminar on laboratory management of

hemolysis. Arlington, VA: AABB, 1979:126-8.

2. Simmons M, Stapleton RR, Brazier DM, et al. An example of an antibody causing difficulty in

ABO grouping. Vox Sang 1971;21:284.

Tabla 53-1: Tipificación antigénica de eritrocitos con PAD positiva

GRs usados para absorber antisueros Reacciones con Ags + Interpretación del estado

GRs y antisuero absorbido antigénico

1 2 4 8 16 32

Antígeno positivo (conocido) o o o o o o Antígeno positivo

Antígeno negativo (conocido) 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ o Antígeno negativo

Paciente 1 (PAD positiva) 4+ 3+ 2+ 2+ o o Antígeno negativo

Paciente 2 (PAD positiva) o o o o o o Antígeno positivo

Método 54 – Adsorción de aglutininas frías utilizando GRs de conejo

Principio

Los alo y autoanticuerpos fríos pueden interferir con las pruebas del banco de sangre a 37 °C y en la fase

antiglobulínica, incluso si el anticuerpo que interfiere fuera capaz de reaccionar por encima de los 32 °C.

Aplicación

La interferencia de anticuerpos clínicamente no significativos puede evitarse utilizando la adsorción de

los anticuerpos no deseados con GRs o estroma de GRs de conejo.


1. GRs de conejo, National Production Laboratory, American Red Cross; o estroma, REST®,

Organon Technika Corp.

2. Pipetas

3. Tubos de ensayo (10 x 75 mm y 16 x 100 mm)


5. Baño de hielo

6. Suero a estudiar

Procedimiento

Adsorción con GRs de conejo

1. Mezclar 1 mL de suero a estudiar con 2 mL de paquete globular de GRs de conejo fijados con

formalina en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm.

2. Incubar a 1-4 °C en un baño hielo derretido durante 30-60 minutos. Mezclar cada tanto.

3. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos y transferir el suero a un tubo limpio. Repetir los pasos 1

a 3.

4. Ahora el suero está listo para usarse en pruebas para detección o identificación de anticuerpos, o

para compatibilizar unidades para transfundir (ver Notas 1-4).

Adsorción con estroma de GRs de conejo

1. Rotular un frasco para adsorción por cada muestra a ser adsorbida.

2. Centrifugar el frasco para adsorción durante un mínimo de 2 minutos o hasta que el estroma esté

bien concentrado. (El frasco debe ser balanceado durante la centrifugación con el tubo de balance

provisto por el fabricante. No usar el freno de la centrífuga durante la desaceleración).

3. Aspirar completamente el sobrenadante y agregar 1 mL del suero a adsorber.

4. Tapar el frasco y mezclar bien usando un mezclador vórtex o por agitación manual vigorosa.

5. Incubar el frasco a 1-4 °C en un baño de hielo durante 15-60 minutos. Mezclar cada tanto.

6. Centrifugar el frasco de adsorción durante un mínimo de 2 minutos o hasta que el estroma esté

bien empaquetado.

7. Transferir el suero adsorbido a un tubo limpio.

8. Ahora el suero está listo para usarse en pruebas para detección o identificación de anticuerpos, o

para compatibilizar unidades para transfundir (ver Notas 1-4).

Interpretación

1. Si no se detecta aglutinación usando el suero adsorbido, el procedimiento ha removido

efectivamente el autoanticuerpo frío.

2. Si hay aglutinación usando el suero adsorbido, el autoanticuerpo frío no ha sido completamente

removido del suero, o puede estar acompañado de aloanticuerpos.

Notas

1. Los GRs y el estroma de GRs de conejo comparten determinantes antigénicos con el antígeno B,

con antígenos relacionados con el H, y con antígenos del sistema P. Es probable que el anti-B y

ciertos anticuerpos H y del sistema P sean adsorbidos durante este reactivo. El suero adsorbido

con estroma de GRs de conejo no debe usarse para la prueba inversa del ABO.

2. Se ha publicado que algunos aloanticuerpos, tales como el anti-D, anti-E, y anti-Leb, fueron

completamente removidos o reducidos en su título durante la adsorción con estroma de GRs de

conejo.

3. En ocasiones, es posible que un potente autoanticuerpo frío no sea completamente adsorbido.

Pueden ser necesarias posteriores adsorciones o pruebas con precalentamiento (ver M62) o

técnicas de PAI con anti-IgG.

4. La autoadsorción no es la técnica de elección cuando el paciente ha sido recientemente

transfundido (dentro de los 90 días). Es preferible la adsorción con GRs o estroma de conejo.

Referencias

1. Widmann FK, ed. Technical manual. 9th ed. Arlington, VA: AABB, 1985:212,466.

2. Marks MR, Reid M, Ellisor SS. Adsorption of unwanted cold autoagglutinins by formaldehyde-

treated rabbit RBCs (abstract). Transfusion 1980;20:629.

3. Waligora SK, Edwards JM. The use of rabbit red blood cells for the adsorption of cold

autoagglutinins. Transfusion 1983;23:328-30.

Método 55 – Autoadsorción en frío

Principio

Los autoanticuerpos fríos que pueden enmascarar aloanticuerpos pueden ser removidos durante adsorción

con los GRs autólogos a 4 °C (ver Nota 1).

Aplicación

El suero que va a ser usado para la detección o identificación de anticuerpos y para pruebas de

compatibilidad puede ser liberado de los autoanticuerpos que interfieren las reacciones.


1. Solución salina

2. Incubador / Baño térmico



5. Tubos de ensayo

6. Pipetas

7. Papaína o ficina al 1%, Sigma Chemical Co. (ver M42)

8. GRs y suero a estudiar


1. Lavar los GRs del paciente (preferiblemente de una muestra anticoagulada) como mínimo 3 veces

con grandes volúmenes de salina caliente (37 °C) (ver Nota 1). Compactar los GRs durante el

último lavado y remover completamente el sobrenadante.

2. Los GRs del paciente pueden ser usados para autoadsorción o ser tratados con enzimas antes de la

autoadsorción.

3. Para tratar con enzimas los GRs del paciente:

a. A 1 volumen de paquete globular, agregar 1 volumen de solución de enzimas. En general se

usan tanto papaína como ficina al 1%. Si se usan enzimas preparadas comercialmente, seguir

las instrucciones del fabricante (ver Notas 2 y 3).

b. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 15-30 minutos.

c. Lavar los GRs 3 veces con salina a 37 °. Compactar los GRs durante el tercer lavado y remover

completamente el sobrenadante. Centrifugar una vez más y remover la salina residual.

Procedimiento

1. A 1 volumen de paquete globular (lavados o tratados con enzimas), agregar 1 volumen de suero

del paciente y mezclar bien (ver Nota 4).

2. Adsorber a 1-4 °C en un baño de hielo durante 30-60 minutos. Mezclar frecuentemente.

3. Centrifugar la mezcla de suero-GRs y remover el suero inmediatamente. Si es posible, hacer esto a

4 °C.

4. Usar el suero adsorbido para pruebas de compatibilidad, detección e identificación de anticuerpos

(ver Notas 5-8).

Notas

1. En la realización de una autoadsorción con muestras que contienen potentes autoaglutininas frías,

tales como las de pacientes con enfermedad por crioaglutininas, los GRs del paciente deben ser

mantenidos a 37 °C y lavados con salina caliente (37 °C) durante su preparación para la

autoadsorción. El suero para la autoadsorción debe ser tomado de una muestra que sea ha

coagulado a 4 °C.

2. Si la autoaglutinina fría tiene especificidad anti-I y es potente, el aumento de la relación enzima-

GRs durante el tratamiento enzimático expone más sitios antigénicos y da como resultado una

adsorción más eficaz.

3. Recordar, algunos autoanticuerpos fríos están dirigidos contra antígenos que son destruidos

durante las enzimas (los anticuerpos de los sistemas Sp-Pr, durante ejemplo) y los GRs tratados

con enzimas no deben usarse en la autoadsorción de estos anticuerpos.

4. La relación GRs-suero debe ser más alta para la adsorción de autoaglutininas frías más potentes.

5. Tener cuidado durante en la autoadsorción del suero de pacientes que han sido transfundidos

recientemente, porque los GRs circulantes transfundidos pueden poseer un antígeno que puede

adsorber un aloanticuerpo.

6. Si la técnica de adsorción no remueve totalmente el autoanticuerpo, pueden realizarse otras

autoadsorciones usando nuevas alícuotas de GRs del paciente.

7. Es importante compactar muy bien los GRs y remover toda la salina del último lavado antes de

agregar el suero. Esto previene la dilución del suero, el cual puede contener aloanticuerpos de bajo

título.

8. Si se requieren múltiples autoadsorciones, será necesario determinar si se ha perdido la actividad

de algún aloanticuerpo debido a la dilución. Se recomienda el uso de refractómetros para estudiar

el suero autoadsorbido y la dilución del suero durante el procedimiento de autoadsorción. También

puede ser útil realizar una prueba de precalentamiento usando suero no adsorbido para la detección

de aloanticuerpos que pueden ser diluidos hasta llegar a ser negativos durante los procedimientos

de autoadsorción.

Referencias

1. Issitt CH. Cold autoantibodies. In: Walker RH, ed. A seminar on problems encountered in

pretransfusion tests. Washington, DC: AABB, 1972:26.

Método 56 – Uso de reactivos tiol para dispersar la autoaglutinación en frío


Los reactivos tiol desestabilizan los puentes disulfuro entre las subunidades de las moléculas del

anticuerpo. Se pueden usar soluciones débiles de ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (2-ME) para

dispersar la autoaglutinación de autoanticuerpos fríos cuando el lavado con salina caliente no llega a

remover suficientes autoanticuerpos de los GRs. Esto sólo debe ser necesario cuando los autoanticuerpos

fríos con título extremadamente alto interfieren con la tipificación de los GRs porque las muestras han

sido conservadas sin ser separado el suero de los glóbulos de las pruebas.

Se ha demostrado que este método no afecta a los GRs recubiertos con IgG y complemento.


1. DTT 0.01 M, Sigma Chemical Co., o 2-ME 0.1 M, Sigma Chemical Co.

2. Solución salina

3. GRs a estudiar




7. Frascos


9. Tubos de ensayo


1. Preparar el DTT 0.1 M disolviendo 0.154 g de DTT en 100 mL de PBS.

2. Preparar el 2-ME 0.1 M agregando 0.2 mL de 2-ME 0.5 M a 0.8 mL de PBS.

Procedimiento

1. Lavar los GRs a estudiar 3-4 veces con salina caliente (37 °C).

2. Preparar una suspensión al 50% en PBS de los GRs lavados del paciente.

3. Agregar un volumen igual de DTT 0.01 M o 2-ME 0.1 M a los GRs.

4. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 15 minutos (DTT) o 10 minutos (2-ME).

5. Lavar los GRs tratados 3 veces con salina.

6. Diluir una alícuota de los GRs tratados en una suspensión al 3%.

7. Centrifugar 1 gota de los GRs y 2 gotas de ASB al 6%. Leer en busca de aglutinación.

Interpretación

Si el control de aglutinación es negativo, los GRs pueden ser usados para la tipificación antigénica y la

prueba de antiglobulina directa.

Referencias

1. Reid ME. Autoagglutination dispersal utilizing sulfhydryl compounds. Transfusion 1978;18:353-

5.

Método 57 – Método para determinar el título y la especificidad de autoanticuerpos fríos


El título y la amplitud térmica de un autoanticuerpo frío tienen correlato con su significancia clínica. A

menudo es útil preparar diluciones de potentes autoanticuerpos fríos para estudiar contra GRs de

fenotipos raros para determinar la especificidad del autoanticuerpo. Los autoanticuerpos no diluidos a

menudo reaccionan tan fuertemente que no puede verse una distinción de otra forma. Los resultados de la

titulación deben ser correlacionados con la prueba de antiglobulina directa (PAD) del paciente, y si se

trata de anticuerpos clínicamente significativos, deben llevarse a cabo estudios de amplitud térmica. (ver

M58)


1. Suero o plasma a estudiar, obtenido y conservado a 37 °C hasta ser separados de los GRs

2. GRs ABO compatibles de fenotipos comunes y raros (ver Tabla 57-1)

3. Tubos de ensayo

4. Pipetas (preferiblemente automáticas)



Procedimiento

1. Rotular un juego de tubos para cada muestra de GRs a ser probada y un juego para la dilución

madre. Usualmente se prueban primero GRs adultos I positivos, adultos i positivos y de cordón.

Rotular los tubos de acuerdo a la dilución 1:2, 1:4, etc., hasta 1:4096.

2. El volumen calculado para la dilución madre debe ser 0.1 mL x el número de muestras globulares

a estudiar + 0.1 mL. Ejemplo: Si se van a estudiar GRs adultos I positivos, y GRs adultos y de

cordón i positivos, debe prepararse una dilución madre con 0.4 mL.

3. Agregar un volumen igual de ASB al 6% a cada tubo del juego de la dilución madre. En el

ejemplo, esto debe ser 0.4 mL de ASB.

4. Al primer tubo, agregar el volumen calculado del suero y mezclar bien. En el ejemplo, este tubo

deberá contener ahora 0.8 mL de una dilución 1:2 del suero.

5. Usando una pipeta o un tip limpio, remover el volumen calculado de la dilución 1:2 y agregarlo al

tubo rotulado 1:4. Mezclar bien.

6. Continuar las diluciones usando una pipeta o tip limpio por cada dilución hasta que la dilución

1:2048 sea agregada al tubo rotulado 1:4096. Conservar la alícuota no usada de la dilución 1:4096

para el caso de que la titulación necesite continuarse.

7. Empezando con la dilución más alta, agregar un volumen de 0.1 mL del suero diluido al tubo

respectivamente rotulado. Cuando se empieza con la dilución mayor, no es necesario cambiar el

tip con cada dilución porque el efecto de cualquier arrastre será indetectable.

8. Agregar 0.1 mL de los GRs adecuados a todos los tubos de cada juego de diluciones y mezclar

bien.

9. Para los estudios de especificidad, leer y registrar los resultados a lectura inmediata, después de la

incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de 30 minutos a 15 °C, y después

de 1 hora a 4 °C.

10. Para la determinación del título del anticuerpo, puede ensayarse la técnica descrita anteriormente o

las diluciones pueden quedar toda la noche a 4 °C y luego leerlas sin centrifugación.

11. Las titulaciones deben leerse desde la dilución más alta a la más baja de forma que el tecnólogo no

sea prejuiciado durante las anteriores lecturas.

Interpretación

Especificidad

1. Ver los resultados esperados en la Tabla 57-1.

2. En el caso de aglutininas frías de muy alto título, la especificidad sólo puede ser visualizada

cuando se prueban célula raras con el suero durante titulación. Si, por ejemplo, el suero tiene un

título de 64 con células i y de 2048 con células I, la especificidad del anticuerpo es anti-I.

Título

A menudo es obvio que un autoanticuerpo frío es clínicamente significativo. Existe una fuerte correlación

entre la presencia de C3d en los GRs del paciente y la presencia de aglutininas frías de alto título.

Ciertamente la presencia de C3d en los GRs del paciente, junto con signos y síntomas de hemólisis, son

fuertes indicadores de un proceso autoinmune aún con títulos de 64 o menores. Los títulos entre 64 y

1024 han sido asociados con hemólisis pero habitualmente son más altos.

Los resultados de las pruebas que son ambiguos pueden ser causados durante la inapropiada

recolección de la muestra o, raramente, durante formas poco usuales de autoanticuerpos tales como

autoanticuerpos fríos IgG o IgA. Debido a que el autoanticuerpo puede reaccionar mejor con un

determinante antigénico de los GRs del paciente, puede ser necesario investigar esta posibilidad.

Sobre la patogenia de alo y autoanticuerpos anti-eritrocitarios, Garratty informó que

autoanticuerpos fríos de bajo título asociados con hemólisis se correlacionaban mejor con una amplitud

térmica alta que con el título, y que el suero con autoanticuerpos de alto título pero sin autohemólisis

tenían bajos rangos térmicos.

Esta es otra posibilidad a considerar cuando un paciente con autoaglutininas frías de alto título

tienen una PAD negativa y no muestras signos de hemólisis. El paciente puede tener un autoanticuerpo

benigno y un aloanticuerpo frío –seguramente de rara ocurrencia- Tales casos requerirán la investigación

del suero autoadsorbido en frío para buscar la presencia de aloanticuerpos fríos (ver M55). Ver la Tabla

57-1.

Tabla 57-1: Resultados serológicos de las crioaglutininas GR “0”

Anti- Iadulto Cordón iadulto hh GR A1

Iadul.

GR A2

Iadul. iadul.

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iadul. GR/Neur

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Comentarios

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2

3

4

5

6

7

8

S: fuertemente positivo, W débilmente positivo, o: negativo, Aum: aumentado. 1:No reacciona con GRs

de perro. 2. Utilice GRs de animal para diferenciar (Procedimiento I-3). 3: dependiente de glicolípidos. 4:

Dependiente del pH 5: Negativo com GRs tratados com neuraminidasa o proteasa. 6:Hemolítico in vitro,

aumentado por leche. 7: Inhibido por leche. 8: Reacciona com células tratadas y temperatura dependiente

Referencias

1. Petz LD, Garratty G. Acquired immune hemolytic anemias. New York. Churchill Livingstone,

1980.

2. Garratty G. Factors affecting the pathogenicity of RBC auto- and alloantibodies. In: Nance ST, ed.

Immune destruction of red blood cells. Arlington, VA: AABB, 1989.

Método 58 – Prueba para determinar la amplitud térmica (Detección rápida)


En los raros casos en que se encuentran autoanticuerpos fríos de bajo título de aparente significancia

clínica, puede ser útil determinar su amplitud térmica. En tales casos, una amplia amplitud térmica debe

correlacionarse con hemólisis autoinmune. La capacidad del autoanticuerpo de reaccionar a temperaturas

cercanas a 30 °C puede ser una evidencia de su significado clínico. Cuando una persona se expone al frío,

la temperatura de la piel de sus extremidades puede bajar a 27/30°C, lo cual explicaría porqué un

anticuerpo de bajo título reactivo a temperatura más alta que la ambiental puede ser capaz de causar

anemia hemolítica autoinmune. Las pruebas para determinar la amplitud térmica son tediosas y difíciles

de realizar apropiadamente, aunque son rara vez necesarias.

Una detección rápida para ver si serían útiles estudios de amplitud térmica, incluye la incubación

de un viale de GRs antígeno positivos a 37 °C y a 30 °C sin una temperatura controlada durante la

centrifugación. Si estas pruebas son negativas, la amplitud térmica no debería ser muy alta. Si ellas son

positivas, entonces puede hacerse una valoración exacta de la amplitud térmica.


1. Suero o plasma a estudiar, obtenido y separado a 37 °C

2. Un sistema para incubar y centrifugar las pruebas a una temperatura controlada (ver Nota 1)

3. GRs en estudio

4. Reactivos globulares de control, capaces de reaccionar con el anticuerpo

5. Solución salina

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas



Procedimiento

1. Calentar el suero en estudio y los GRs en estudio separadamente a 37 °C como para una prueba de

precalentamiento (ver M62).

2. Agregar el suero caliente a los GRs en estudio e incubar 30-60 minutos a 37 °C. No agregar

albúmina sérica bovina (ASB) u otros potenciadores de la aglutinación.

3. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos y leer.

4. Incubar a 30 °C durante 30-60 minutos.

5. Centrifugar durante 15-20 segundos y leer macroscópicamente mientras se mantiene la prueba a 30

°C.

Interpretación

Si los resultados son positivos a 37 °C o a 30 °C, la amplitud térmica es probablemente más alta que la

temperatura ambiente. Sin embargo, muchos factores, incluyendo la temperatura del laboratorio y el

grado en que las pruebas se enfrían durante la centrifugación, afectan la exacta valoración de la amplitud

térmica del anticuerpo. Si esta información es necesaria, repetir las pruebas usando una centrífuga con

temperatura controlada.

Si los resultados son negativos a 30 °C o a 37 °C, es improbable que el paciente tenga un

autoanticuerpo frío con una amplitud térmica alta.

Notas

1. Una estufa de cultivo para bacteriología puede ser utilizada para colocar la centrífuga y trabajar a

esa temperatura. Las pruebas son incubadas y leídas a 37 °C; luego la temperatura es bajada

entonces a 30 °C.

Referencias

1. Judd WJ. Methods in immunohematology. Miami, FL: Montgomery Scientific Publications,

1988:90.

Método 59 – Prueba de antiglobulina directa (PAD) empleando Polybrene®


En los casos de autoanticuerpos atípicos, puede ser difícil detectar el autoanticuerpo unido a los GRs del

paciente, especialmente si el anticuerpo tiene una baja afinidad hacia los GRs del paciente. Se han

publicado sobre algunos éxitos en la detección de estos anticuerpos usando la PAD con Polybrene. Esta

prueba y la PAD usando salina fría para lavado puede ser útil en la detección de estos inusuales

anticuerpos si ellos son autoanticuerpos reactivos en caliente o frío.


1. Suero o plasma y GRs a estudiar (ver Nota 1)

2. Suero AB de control libre de anticuerpos

3. GRs de grupo O Rh+, suspensiones al 3% en medio de baja fuerza iónica (LIM)

4. Solución de reserva de Polybrene al 10% P/V

5. Bromuro de hexadimetrina, Aldrich Chemical Co.

6. Solución de trabajo de Polybrene (agregación)

7. Solución de citrato sódico de glucosa (resuspensión)

8. Suero Antiglobulina Anti-IgG (ver Nota 2)

9. LIM


11. Tubos de ensayo

12. Pipetas


14. GRs recubiertos con IgG (control de Coombs) (ver M135)

15. Frascos

16. Botellas plásticas

17. Anti-D modificado comercial para técnica en tubo.


1. Preparar una suspensión al 3% en salina con los GRs a estudiar.

2. Preparar el LIM como sigue: Disolver 50 g de dextrosa y 2 g de ácido etilendiaminotetraacético

disódico (EDTA) en 1000 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

3. Conservar Polybrene de reserva: Disolver 10 g de bromuro de hexadimetrina en 100 mL de salina.

Conservar en una botella plástica a 4 °C (ver Nota 3).

4. Preparar solución de trabajo de Polybrene: Agregar 1 mL de solución de reserva de Polybrene a

199 mL de salina (ver Notas 3 y 4).

5. Preparar la solución de resuspensión: Disolver 3.53 g de citrato trisódico (Na3C6H5O7•2H2O) y 2 g

de dextrosa en 100 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

Controles

1. Negativo: Suero de grupo AB y GRs de grupo O Rh+.

2. Positivo: Diluir el anti-D modificado comercial para uso en tubo a 1:10.000 agregando 0.1 mL a

100 mL de agua destilada. De esta dilución, pipetear 0.1 mL en 1.0 mL de suero grupo AB. Usar

este anti-D al 1:10.000 en suero AB y GRs de grupo O Rh+.

Procedimiento

1. Rotular 3 tubos para “prueba” y controles “positivo” y “negativo”.

2. Agregar 2-3 gotas (0.1 mL) del suero a estudiar a 1 gota (0.05 mL) de GRs en estudio en el tubo

rotulado “prueba”.

3. Al tubo rotulado “negativo”, agregar 2-3 gotas del suero AB y 1 gota de GRs de grupo O Rh+.

4. Al tubo rotulado “positivo”, agregar 2 gotas del anti-D al 1:10.000 y 1 gota de GRs grupo O Rh+.

5. Agregar 1 mL de LIM a cada tubo, mezclar, e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

6. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de trabajo de Polybrene a cada tubo y mezclar por inversión.

Incubar 15 segundos.


8. Decantar el sobrenadante, pero no mezclar.

9. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de resuspensión a cada tubo. Mezclar suavemente durante 10

segundos.

10. Examinar cada tubo macroscópicamente en un ángulo de 45° observando si la aglutinación no se

ha dispersado. Registrar los resultados.

11. Agregar otra gota de solución de resuspensión a cada tubo y mezclar bien.

12. Lavar los GRs 3 veces con salina. Descartar completamente.

13. Al botón seco de GRs, agregar anti-IgG de acuerdo a las instrucciones del fabricante.


15. Leer macroscópicamente y registrar los resultados.

16. Agregar GRs recubiertos con IgG a las pruebas negativas, centrifugar y leer en busca de

aglutinación. Repetir todas las pruebas negativas que no aglutinaron con el agregado de GRs

recubiertos con IgG.

Interpretación

Un resultado positivo por este método en un paciente cuyos GRs tienen una PAD negativa por los

métodos de rutina puede indicar la presencia de un autoanticuerpo atípico y debe ser posteriormente

investigado.

Notas

1. Obtener y conservar la muestra a 37 °C hasta que el plasma o el suero y las células sean separados.

2. Es preferible emplear suero antiglobulínico anti-IgG, antes que el suero poliespecífico,

considerando que puede captarse C3 en la fase de sensibilización con LIM.

3. Puesto que el Polybrene es adsorbido por el vidrio y que por esta razón pierde actividad después de

un largo período de almacenamiento, debe ser guardado en botellas plásticas.

4. El Polybrene varía en potencia de lote en lote, por consiguiente, considerar el empleo de una

concentración al 0.05% como guía. Determinar la fuerza correcta por prueba y error.

Referencias

1. Lalezari P, Jiang AF. The manual Polybrene® test: A simple and rapid procedure for detection of


2. Garratty G, Postoway N, Nance S, Brunt D. The detection of IgG on red cells of “Coombs

negative” autoimmune hemolytic anemias. Transfusion 1982;22:430.

Método 60 – Prueba de antiglobulina directa (PAD) con lavados en caliente


En los estudios de pacientes con posible anemia hemolítica con PAD negativa, puede ser útil el uso de

lavados con salina caliente durante la realización de la PAD ya que algunos anticuerpos atípicos pueden

no estar unidos a los GRs del paciente cuando se usan técnicas convencionales.


1. GRs a estudiar obtenidos con anticoagulante

2. Salina enfriada a 4 °C

3. Suero Antiglobulina Humana (SAGH) poliespecífica

4. Tubos de ensayo enfriados a 4 °C

5. Pipetas

6. GRs recubiertos con IgG (control de Coombs) (ver M135)

7. Centrífuga adecuadamente calibrada (preferiblemente refrigerada)

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 3% de los GRs en estudio con salina fría.

2. Agregar 1 gota de la suspensión de GRs a un tubo de ensayo enfriado.

3. Lavar 3 veces con salina a 4 °C.

4. Decantar el último lavado completamente y agregar la cantidad de SAGH según instrucciones del

fabricante.

5. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Leer y registrar los resultados.

6. Agregar GRs recubiertos con IgG a todas las pruebas negativas, centrifugar, y leer en busca de

aglutinación. Repetir todas las pruebas negativas que no aglutinaron con el agregado de los GRs

recubiertos con IgG.

Notas

1. Puede ser útil tratar a la PAD con Polybrene® (ver M59) u obtener y guardar la muestra a 37 °C.

Estos anticuerpos son tan raros y su desarrollo serológico tan atípico que una variedad de métodos

permiten las mejores posibilidades de detección.

Referencias

1. Marsh WL. Personal communication, 1992.

2. Garratty G. The clinical significance (and insignificance) of red-cell-bound IgG and complement.

In: Wallace ME, Levitt JS, eds. Current applications and interpretations of the direct antiglobulin

test. Arlinghton, VA: AABB, 1988.

Método 61 – Remoción de anticuerpos IgM con gel Sephadex®

Principio

El Sephadex es un dextrán de cadenas cruzadas cuya moléculas aumentan de tamaño por el contacto con

agua y soluciones electrolíticas. Está combinado con dietil aminoetil celulosa (DEAE) para producir un

medio de intercambio aniónico débilmente básico (DEAE-Sephadex-A-50). La afinidad de las moléculas

de proteína por el medio de intercambio depende de su tamaño, distribución de su cargas, y la estructura

polimérica. A una determinada fuerza iónica y pH, las moléculas de IgM se fijan bien al DEAE, las IgA

se fijan más débilmente, mientras que la mayoría de las IgG no se fijarán.

Aplicación

El gel Sephadex puede usarse para remover los anticuerpos IgM del suero de un paciente, especialmente

los autoanticuerpos fríos en pacientes que han recibido múltiples transfusiones. Es útil también para

diferenciar el tipo de inmunoglobulina (IgG o IgM) y si el anticuerpo es capaz de causar enfermedad

hemolítica del recién nacido (EHRN).


1. Tampón de Sorenson, pH 6.5

2. Hidróxido de sodio (NaOH), PM = 40

3. DEAE-Sephadex-A-50 (crudo), Sigma Chemical Co.

4. Reactivo de silicona (Prosil®-28), Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division

5. Acida sódica

6. Cuatro vasos de 1 L

7. Un vaso de 4 L

8. Dos matraces de 4 L

9. Una probeta graduada de 500 mL

10. Dos recipientes vacíos de 20 L, lavados y enjuagados para solución salina

11. 12-16 pipetas tratadas con silicona

12. Aproximadamente 120 tubos de ensayo (16 x 100 mm) estériles, sin restos de siliconas

13. Barra de agitación magnética

14. Plato de agitación magnética

15. Agitados de muestras

16. Balanza analítica


18. Pipeta calibrada

19. Suero a estudiar

20. Suero de control, con IgG y IgM (ver 6.a, más abajo)


1. Preparar el tampón de Sorenson, pH 6.5:

a. Fosfato dibásico de sodio anhidro: Colocar en un matraz de 4L 23.785 g de Na2HPO4z y

agregar 2.5 L de H2O destilada usando una probeta de 500 mL. Agregar 0.5 g de ázida sódica y

mezclar bien.

b. Fosfato monobásico de potasio: Colocar 45.56 g de KH2PO4 en un recipiente de salina de 20 L

limpio y agregar 5 L de H2O destilada usando una probeta graduada de 500 mL

c. Tampón fosfato de Sorenson 50.067 M, pH 6.5: Mezclar 4.9 L de solución de KH2PO4 y 2.1 L

de solución de Na2PO4 en un recipiente de salina de 20 L limpio usando una probeta graduada

de 500 mL. Ajustar el pH.

2. Preparar NaOH 0.5 N: Colocar 80 g de NaOH en un matraz de 4 L y disolver en 4 L de agua

destilada midiendo con una probeta graduada. Agregar 0.8 g de ázida sódica y mezclar.

3. Preparar el material de vidrio siliconado: Preparar la solución de silicona de acuerdo a las

instrucciones del fabricante y tratar aproximadamente 120 tubos de vidrio (16 x 100 mm), 12-16

goteros, y cuatro vasos de 1 L. Usando un tubo de vidrio de 16 x 100 mm con 5 mL de agua como

patrón, marcar cada uno de los 120 tubos tratados con silicona a la línea de 5 mL. Rotularlos

“Sephadex-A-50” y la fecha de expiración (1 año).

4. Preparar ázida sódica al 0.02% en agua destilada: Agregar 0.2 g de ázida sódica a 1 L de agua

destilada.

5. Preparar DEAE-Sephadex-A-50:

a. El día 1: Agregar 2 L de agua destilada, 0.4 g de ázida sódica, y una barra de agitación

magnética a un vaso siliconado de 4 L y agitar 7-8 veces. Agregar lentamente 14.4 g de DEAE-

Sephadex-A-50 y agitar bien. Dispensar el Sephadex lechoso en cuatro vasos de 1 L tratados

con silicona y dejar sedimentar toda la noche.

b. A la mañana siguiente: Marcar una línea en la interface gel-lavado y aspirar cuidadosamente el

sobrenadante. Usando una barra y un plato de agitación magnético, agregar 1 L de NaOH 0.5 N

a cada vaso. Dejar el gel durante 45-60 minutos y aspirar cuidadosamente el NaOH. Lavar cada

gel con 750-850 mL de agua destilada, dejando estar cada lavado 45 minutos hasta que el

volumen del gel se expanda hasta la marca de la interface gel-lavado (3-4 lavados).

Lavar cada gel 3 veces con 500 mL de tampón de Sorenson, luego lavar 2 veces con agua

destilada con ázida sódica al 0.02%. Usando los goteros tratados con silicona, dispensar el 70%

de la suspensión de gel en los tubos de ensayo de 16 x 100 mm tratados con silicona hasta la

marca de 5 mL. Dejar sedimentar el gel, aspirar el sobrenadante, tapar y conservar a 4 °C

durante hasta 1 año.

6. Control de calidad para el gel Sephadex:

a. Seleccionar un anticuerpo de cada sistema I, MNSs, Lewis, P, Duffy, Kidd y Rh, incluyendo

ejemplos de anticuerpos IgG e IgM como controles.

b. Las muestras conocidas que contengan un anticuerpo IgM y uno IgG puede mezclarse.

c. Tratar cada muestra con una alícuota del gel Sephadex (ver Procedimiento, más abajo) y

comparar el suero tratado y no tratado preparando diluciones dobles seriadas (ver M123) hasta

1:128. Estudiar en paralelo con GRs positivos y negativos conocidos.

d. Resultados aceptables: completa remoción de todos los anticuerpos excepto las IgG. Una

reducción de no más de 2 tubos (10 de puntaje) en el título del anticuerpo IgG.

Resultados inaceptables: Remoción incompleta del anticuerpo IgM. Repetir el control de

calidad para asegurarse que los resultados inaceptables no sean el resultado de una falla

técnica. Si aún es inaceptable, repetir usando nuevo gel.

e. Comparar el producto final del plasma después del pasaje a través del gel. Un aumento de 0.2

mL puede causar la disminución de la actividad del anticuerpo.

Procedimiento

1. Puede usarse un tubo con gel para tratar 1 mL de suero. Dependiendo de la cantidad de suero a ser

estudiado, sacar un número equivalente de tubos con gel de la heladera y dejar que tome

temperatura ambiente durante 5-10 minutos.

2. Lavar cada tubo con gel llenando el tubo con salina. Tapar e invertir para mezclar. Centrifugar a

1000 g durante 1 minuto. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante.

3. Usando una pipeta calibrada, agregar 1 mL de suero al gel lavado.

4. Tapar y mezclar en un agitador de muestras durante 10 minutos.

5. Centrifugar a 1000 g durante 1 minuto. Comenzar a tomar el tiempo cuando la centrífuga haya

alcanzado las 3400 rpm.

6. Separar cuidadosamente el suero sobrenadante del gel. Si el volumen de suero tratado es mayor de

1 mL, la prueba puede ser inválida por factores de dilución.

7. Estudiar el suero tratado con los GRs apropiados usando suero sin tratar como control.

Interpretación

1. Los anticuerpos IgM reactivos serán removidos por el gel.

2. Cualquier actividad de anticuerpos remanente es anti-IgG.

Referencias

1. Dawson HB, ed. Special serological techniques useful in problem solving: A technical workshop.

Atlanta, GA: AABB, 1977.

2. Webb AJ. A 30-minute preparative method for isolation of IgG from human serum. Vox Sang

1972;23:279-90.

3. Greene M. Personal communication, 1992.

Método 62 – Prueba antiglobulínica indirecta con salina precalentada


La presencia de auto o aloanticuerpos fríos puede dar reacciones positivas no buscadas en la fase

antiglobulínica cuando se ensayan pruebas en suero. El precalentamiento del suero del paciente y las

células reactivas separadamente antes de mezclarlos previene la fijación de anticuerpos a temperatura

ambiente y la activación del complemento. La técnica de precalentamiento no interfiere con los

anticuerpos reactivos a 37 °C que se fijan a los GRs o que activan complemento.





4. Tubos de ensayo

5. Salina

6. Pipetas

7. Reactivos globulares

8. Suero a estudiar

Procedimiento

1. Rotular un tubo de ensayo para cada muestra de reactivo globular a ser estudiado. Rotular un tubo

con la palabra “suero”.

2. Agregar 1 gota de cada muestra de GRs a ser estudiado a los tubos apropiados. Agregar una

alícuota del suero del paciente al tubo “suero”.


4. Agregar 2 gotas del suero del paciente a cada tubo con los GRs usando una pipeta caliente.

Mezclar bien.

5. Incubar 30 minutos a 37 °C.

6. Llenar los tubos con salina a 37 °C y centrifugar a 1000 g durante 60 segundos.

7. Lavar 3 veces con salina a 37 °C.

8. Agregar el suero AGH.

9. Centrifugar, leer en busca de aglutinación, y registrar los resultados.

Interpretación

La aglutinación en fases anteriores a la antiglobulínica indica la presencia de un anticuerpo frío. Una

prueba con pre-incubación previene las reacciones mediadas por anticuerpos fríos no buscados en la fase

AGH. Si la prueba precalentada es aún positiva, es probable que haya un anticuerpo reactivo a 37 °C.

Notas

1. En general no es necesario calentar la salina para la prueba de precalentamiento a menos que haya

un anticuerpo frío potente. Pocos anticuerpos tienen suficiente capacidad de aglutinación o

activación del complemento como para causar problemas cuando están diluidos con 3-4 mL de

salina.

2. No deben usarse medios potenciadores tales como albúmina sérica bovina y salina de baja fuerza

iónica en conjunción con la técnica de precalentamiento porque estos medios potencian la

actividad de las aglutininas frías.

3. La reactividad de las crioaglutininas será eliminada en la mayoría de los casos y los anticuerpos

IgG subyacentes serán detectados.

Referencias

1. Issitt PD. Applied blood group serology. 2nd ed. Miami, FL: Montgomery Scientific Publications,

1985:44.

2. Widmann FK, ed. Technical manual. 8th ed. Arlington, VA: AABB, 1981.

3. Mougey R. Personal communication, 1992.

Método 63 – Prueba de Donath-Landsteiner (D-L) para anticuerpos bifásicos


El anticuerpo D-L no es una aglutinina efectiva, sin embargo, puede activar el complemento, causando

hemólisis. Requiere un período frío primero y luego una incubación en calor para fijar el complemento.

La prueba de D-L detecta aquellos raros casos en los cuales el anticuerpo D-L es la causa de anemia

hemolítica inmune. El anticuerpo D-L es conocido como la causa de la hemoglobinuria paroxística por

frío, pero también está asociada con la anemia secundaria a una infección viral en niños. En tales

instancias, no es asociada necesariamente con hemoglobinuria paroxística por frío.


1. Suero y GRs a estudiar, obtenidas y separadas a 37 °C.

2. GRs reactivo de grupo O (células de panel detector I y II), tratadas y sin tratamiento con enzimas.

3. Suero humano fresco (SHF) como fuente de complemento, libre de anticuerpos anti-eritrocitarios

(ver Nota 1)

4. Tubos de ensayo

5. Suero Antiglobulina Humana poliespecífica (SAGH)

6. Suspensión de GRs pp Tj(a-) al 3%, frescos o conservados congelados.

7. Pipetas



Procedimiento

1. Obtener la muestra y mantenerla a 37 °C hasta que el suero se separe espontáneamente del

coágulo.

2. Rotular los tubos para los GRs I y II no tratados como “prueba” y un grupo igual para el “control”

(ver Nota 2).

3. Rotular tubos para los GRs del panel detector I y II tratados con enzimas como “prueba” y para el

“control”.

4. Agregar 1 gota de los GRs detectores a los tubos apropiados. Lavar una vez con salina y remover

todo el sobrenadante.

5. Agregar 2 gotas del suero a estudiar a todos los tubos.

6. Agregar 2 gotas de SHF a todos los tubos (ver Nota 3).

7. Incubar el grupo de “prueba” de GRs no tratados y el grupo de “prueba” de GRs tratados con

enzimas a 4 °C durante 1 hora.

8. Incubar los grupos “control” de GRs del panel selector tratados y no tratados con enzimas a 37 °C.

9. Después de 1 hora, retirar el grupo “prueba” de los 4 °C, centrifugar a 1000 g durante 30

segundos, y observar en busca de hemólisis. (No debe haber en ninguno). Mezclar.

10. Incubar el grupo “prueba” a 37 °C durante 30 minutos.

11. Al final de la segunda incubación, centrifugar todos los grupos de GRs detectores.

12. Observar en busca de hemólisis. Registrar los resultados.

13. Si no hay hemólisis presente, pasar a la fase antiglobulínica usando suero AGH poliespecífico.

14. Centrifugar y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

15. Si la prueba de D-L es positiva, repetir la prueba usando GRs de fenotipo pp e incubar de la misma

forma como se describió para los GRs detectores de “prueba”.

Interpretación

Ver en las y 63-2 ejemplos de pruebas de D-L y controles.

Tabla 63-1: Prueba de Donath-Landsteiner (D-L)

GRs Suero Temperatura Resultado Positivo Resultado Negativo

Panel I y II Suero Problema +

SHF

4º y luego 37ºC Hemólisis o unión

al Complemento

No Hemólisis o unión

al Complemento

Panel I y II

(Enzimas)

Suero Problema +

SHF

4º y luego 37ºC Hemólisis o unión

al Complemento


al Complemento

Tabla 63-2: Controles de la Prueba de Donath-Landsteiner (D-L)

GRs Suero Temperatura Resultado Positivo Resultado Negativo

Panel I y II Suero Problema +

SHF

Solamente a

37ºC

Hemólisis o unión

al Complemento


al Complemento

Panel I y II

(Enzimas)

Suero Problema +

SHF

Solamente a

37ºC

Hemólisis o unión

al Complemento


al Complemento

1. La prueba de D-L es positiva si se encuentra hemólisis o fijación de complemento en la fase

antiglobulínica en el grupo “prueba” de los GRs selectores incubados en frío y caliente y si no se

encuentra hemólisis o fijación de complemento en el grupo de “control” incubado a 37 °C. Un

anticuerpo D-L débil puede reaccionar sólo con GRs tratados con enzimas y no con GRs sin tratar.

2. Si la prueba de D-L es positiva con los GRs detectores no tratados o tratados, debe ser negativa

con los GRs pp ya que la especificidad del anticuerpo D-L es más frecuentemente anti-P. A pesar

de que se han publicado sobre otras especificidades, son extremadamente raras.

3. La prueba D-L no se usa cuando se conoce la presencia de un anticuerpo hemaglutinante potente

en el suero del paciente. Se usa cuando el paciente está hemolizando y aparentemente no se

detectan anticuerpos por lo métodos de rutina.

Notas

1. La sangre entera a ser usada como fuente de complemento debe dejarse coagular en frío para

remover autoaglutininas. Conservar el suero congelado.

2. Si es poca la cantidad del suero a estudiar (como en las muestras pediátricas), realizar la primera

prueba (1 grupo para cada uno). Los controles sólo serán necesarios si la prueba es positiva.

3. Las pruebas pueden realizarse sin el agregado de suero humano fresco como fuente de

complemento, pero los pacientes que están hemolizando pueden tener bajos niveles de

complemento, un factor que puede ser razón de resultados negativos falsos.

Referencias

1. Dacie JV, Lewis SM. Practical haematology. 6th ed. London: Churchill Livingstone, 1968:403.

Método 64 – Prueba de hemólisis por incubación con glucosa


Cuando los GRs son incubados en su propio suero, la hemólisis ocurre gradualmente. La autohemólisis se

produce por un defecto de membrana y existe la idea que la incubación causa la pérdida de los lípidos de

la misma. Debido a la alteración de la membrana, hay un aumento en la utilización de glucosa y una

eventual depleción del Adenosín Trifosfato (ATP). La hemólisis de la sangre normal generalmente afecta

a menos del 2% de los GRs; mientras que, en la esferocitosis hereditaria hay habitualmente 25-50% o más

de hemólisis después de 48 horas de incubación a 37 °C. El agregado de glucosa a la sangre antes de la

incubación provocará una hemólisis normal en la esferocitosis hereditaria. La hemólisis está aumentada

en la esferocitosis congénita, en todas las anemias hemolíticas no esferocíticas durante deficiencia

enzimática, en la hemoglobinuria paroxística a frigore, y con los GRs Rhnull y Rhmod.


1. Glucosa estéril al 5% en solución de NaCl al 0.85%

2. Solución estéril de NaCl al 0.85%

3. Reactivo de Drabkin, Fisher Scientific Co., catálogo número D-120

4. Tubos de ensayo con tapa a rosca estériles

5. Pipetas estériles

6. Incubador de 37 °C


8. Tubos capilares

9. Centrífuga para microhematocrito

10. Suero y GRs a estudiar (una muestra coagulada y otra anticoagulada con heparina sódica)

11. Suero y GRs de control (una muestra coagulada y otra anticoagulada con heparina sódica)

12. Pipetas y tips de 20 lambdas

13. Espectrofotómetro

14. Agua destilada

15. Matraces

16. Tubos de ensayo


1. Preparar el reactivo de Drabkin mezclando el contenido del envase con 1 L de agua destilada.

Procedimiento

1. Pipetear 0.2 mL de dextrosa al 5% en NaCl al 0.85% en 2 tubos con tapa a rosca rotulados “prueba

de dextrosa” y “control de dextrosa”.

2. Pipetear 0.1 mL de NaCl al 0.85% estéril en 2 tubos con tapa a rosca rotulados “prueba salina” y

“control salino”.

3. Agregar 2 mL de la sangre a estudiar y de control heparinizada a los tubos apropiados e incubar

durante 48 horas a 37 °C.

4. Centrifugar una alícuota de las muestras de sangre y guardar el plasma en la heladera. Usar para la

lectura del blanco en las muestras de plasma.

5. Después de 48 horas de incubación, mezclar por inversión los 4 tubos varias veces.

6. Realizar los hematocritos de cada muestra por duplicado. Este se usará para los cálculos.

7. Rotular 5 tubos para cada muestra como muestra la Tabla 64-1.

Tabla 64-1: Rotulado de muestras

Prueba Control

a. Sangre, glucosa, salina

b. Sangre, salina

c. Plasma, glucosa, salina

d. Plasma, salina

e. Plasma

a. Sangre, glucosa, salina

b. Sangre, salina

c. Plasma, glucosa, salina

d. Plasma, salina

e. Plasma

8. Pipetear 10 mL de reactivo de Drabkin en cada uno de los 10 tubos enumerados en la Tabla 64-1.

9. Agregar 0.02 mL (20 lambdas) de la sangre entera incubada en los tubos que dicen “sangre”.

10. Centrifugar el remanente de las muestras incubadas y agregar 0.2 mL (200 lambdas) de plasma a

los tubos que dicen “plasma”.

11. Llevar a cabo la lectura de las densidades ópticas a 540 nm en los 8 tubos:

a. Lectura del blanco en las muestras de sangre entera contra el reactivo de Drabkin.

b. Lectura del blanco en las muestras de plasma contra 0.2 mL del plasma original en 10 mL de

reactivo de Drabkin.

Tabla 64-2: Cálculo del Porcentaje de hemólisis

% de hemólisis con glucosa + salina= D.O. de c x (100-Hto de a)

D.O. de a x 10

% de hemólisis con salina= D.O. de d x (100 – Hto de b)

D.O. de b x 10

Interpretación

1. Registrar el porcentaje de hemólisis para las muestras con salina y con glucosa más salina. Los

cálculos se muestran en la Tabla 64-2.

2. Los valores normales y los de varios tipos de enfermedad se muestran en la Tabla 64-3.

Tabla 64-3: Hemólisis (% a las 48 hs)

Condición Sin Aditivos Con Glucosa

Normal

Tipo I

Tipo II

Esferocitosis Hereditaria

2.0 (0.2 – 0.4)

3.0 (1-6)

13 (4-44)

16 ( 6-30)

0.3 (0.1 -0.6)

1.3 (0.5 – 4.9)

15 (4 -48)

3 (0.2-14)

Tipo I: La hemólisis leve o moderada es típica de la eliptocitosis hereditaria, enfermedad causada por una

hemoglobina inestable, y deficiencia de glucosa-6-fosfato dehidrogenasa (G6PD). No está afectada por

glucosa o ATP.

Tipo II: La hemólisis es causada por la deficiencia de piruvato quinasa. Es corregida por el ATP pero no

por el agregado de glucosa.

Esferocitosis hereditaria (marcada hemólisis) es corregida durante ATP o glucosa.

Muestra de sangre normal de control debe estar dentro de los límites del rango normal. Si el control no

está en el rango esperado, la prueba debe repetirse:

a. Usando otro control normal.

b. Verificando los instrumentos usados en este método.

c. Preparando un reactivo fresco.

Referencias

1. Dacie J. The haemolytic anaemias. 2nd ed. New York: Grune and Stratton, 1960:37-42.

2. Miale JB. Laboratory medicine hematology. 6th ed. St. Louis: The C.V. Mosby Company,

1982:584-87.

3. Crosby WH, Furth FW. A modification of the benzidine method of measurement of hemoglobin in

plasma and urine. Blood 1956;11:380.

Método 65 – Prueba de hemólisis con sucrosa


Los eritrocitos de los pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) se rompen cuando se

incuban en soluciones isotónicas de baja fuerza iónica. Pueden usarse una cantidad de azúcares simples.

Habitualmente se usan la sucrosa o la glucosa.


1. Solución de azúcar (generalmente sucrosa o glucosa), de buena calidad

2. Agua destilada

3. Fosfato monosódico, NaH2PO4 0.05 M

4. Fosfato disódico, Na2HPO4 0.05 M

5. HCl 1 N

6. NaOH 1 N

7. GRs a estudiar y de control, de sangre citratada y oxalatada

8. Colorímetro con longitud de onda de 550 nm



11. Tubos de ensayo

12. Salina

13. Papel para medir pH o pHmetro

14. Suero normal ABO compatible (fresco o fresco congelado)

15. S/P Lysing y reactivo hemoglobina, Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division, catálogo

número B3157-15; o en forma alternativa, un reactivo cianmetahemoglobina u otro reactivo usado

habitualmente para determinar la hemoglobina.

METODO DE DETECCION


1. Preparar la solución de sucrosa disolviendo 92.4 g de azúcar en 91 mL de NaH2PO4 50 mM y 9

mL de Na2HPO4 50 mM. Ajustar el pH a 6.1 con HCl o NaOH.

Procedimiento

1. Agregar 1 parte de la sangre entera a 9 partes de la solución del azúcar.

2. Mezclar inmediatamente e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

3. Mezclar suavemente a los 10 y 20 minutos durante el período de incubación.

4. Centrifugar la “prueba” a 1000 g durante 5 minutos y observar en busca de hemólisis.

5. Si no hay hemólisis presente, realizar la prueba confirmatoria.

PRUEBA CONFIRMATORIA


1. Preparar la solución de sucrosa como en la Preparación de los reactivos más arriba.

2. Lavar 0.5 mL de los GRs a estudiar tres veces y llevarlos a una concentración del 50% en salina.

3. Lavar 0.5 mL de los GRs de control tres veces y llevarlos a una concentración del 50% en salina.

Procedimiento

1. Rotular tres tubos de 1 hasta 3.

2. Agregar 0.85 mL de solución de sucrosa y 0.05 mL de suero fresco o fresco congelado grupo ABO

compatible a los 3 tubos. Mezclar bien.

3. Agregar 0.1 mL de suspensión al 50% de los GRs a estudiar en el tubo 1. Agregar 0.1 mL de

suspensión de los GRs de control al tubo 2. Agregar 0.1 mL de salina al tubo 3. Mezclar bien.

4. Incubar los 3 tubos a 37 °C durante 30 minutos, mezclando dos veces durante la incubación.

Centrifugar a 1000 g .

5. Preparar un control de 100% de hemólisis: Agregar 0.1 mL de suspensión al 50% de GRs

normales a 0.9 mL de agua. Congelar y descongelar hasta que todos los GRs se hayan hemolizado.

Centrifugar.

6. Determinar el porcentaje de hemólisis:

a. Rotular 5 tubos como tubo A hasta E.

b. Agregar 2.9 mL de reactivo cianmetahemoglobina a cada uno de los 5 tubos.

c. Agregar 0.1 mL del sobrenadante del tubo 1 (preparado en los pasos 1-3) al tubo A. Mezclar.

d. Agregar 0.1 mL del sobrenadante del tubo 2 (preparado en los pasos 1-3) al tubo B. Mezclar.

e. Agregar 0.1 mL de salina del tubo 3 (preparado en los pasos 1-3) al tubo C. Mezclar.

f. Agregar 0.1 mL del sobrenadante del control de 100% de hemólisis (preparado en el paso 4) al

tubo D. Mezclar.

g. Agregar 0.1 mL de agua al tubo E (blanco). Mezclar.

h. Graduar el espectrofotómetro a 540 nm. Leer todos los tubos y registrar la densidad óptica de

cada uno.

Cálculos

A - C

------- x 100 = porcentaje de hemólisis de los GRs del paciente (prueba)

D - E

B - C

------- x 100 = porcentaje de hemólisis de los GRs normales (control)

D - E

Interpretación

1. El 5% o menos de hemólisis no tiene probablemente consecuencias.

2. Entre el 5-10% de hemólisis es cuestionable.

3. Una hemólisis >10% es indicativa de HPN.

Notas

1. La solución de azúcar para la prueba de detección puede prepararse disolviendo 10 g de azúcar

seca (1 cucharita de té al ras) en agua destilada hasta 100 mL.

2. No usar EDTA; sangre heparinizada, desfibrilada o sangre sin anticoagulante.

3. La solución de sucrosa puede usarse durante 2-3 semanas si se conserva a 4 °C.

Referencias

1. Jenkins DE. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria hemolytic systems. In: A seminar on

laboratory management of hemolysis. Bell CA, ed. Washington, DC: AABB, 1979.

Método 66 – Prueba de hemólisis ácida


Los GRs de los pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) hemolizarán por acción del

complemento en suero acidificado mientras que los GRs normales no lo harán. ) También hemolizarán

con suero acidificado los GRs de pacientes con anemia diseritropoyética congénita tipo II llamada

eritroblastosis multinuclear hereditaria con una prueba de suero acidificado positiva (HEMPAS).


1. ClH 12 N

2. Suero fresco (sin anticuerpos irregulares)

3. Suero inactivado (sin anticuerpos irregulares)

4. Suero a estudiar fresco

5. GRs a estudiar y de control de grupo O (desfibrinados o anticoagulados con ACD, CPD, heparina,

citrato sódico, y conservados en solución de Alsever)

6. Tubos de ensayo

7. Salina



10. Solución de Alsever (ver M134)

11. Pipetas

12. Probeta graduada


14. Reactivo de cianmetahemoglobina, S/P Lysing y reactivo hemoglobina, Baxter Diagnostic, Inc.,

Scientific Products Division, catálogo número B3157-15 (alternativamente, usar un reactivo

cianmetahemoglobina u otro reactivo usado habitualmente para la determinación de hemoglobina)


1. Preparar el ClH 0.2 N mezclando 0.1 mL de ClH concentrado (12 N) y 5.9 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. Preparar 0.5-1 mL de suero inactivado incubando el suero fresco a 56 °C durante 30 minutos.

2. Preparar los GRs a estudiar y control lavando 3 veces con salina: Llevarlos a una concentración

del 50%.

3. Rotular 7 tubos de ensayo, 1-7 (ver Tabla 66-1).

4. GRs

a. Colocar 1 gota de la suspensión al 50% de los GRs a estudiar en los tubos 1-5.

b. Colocar 1 gota de la suspensión al 50% de los GRs de control de grupo O en los tubos 6 y 7.

5. Suero

a. Colocar 9 gotas del suero a estudiar en los tubos 1, 2, 6 y 7 (ver Nota 4).

b. Colocar 9 gotas del suero inactivado en el tubo 5.

c. Colocar 9 gotas del suero fresco en los tubos 3 y 4.

6. ClH: Agregar 1 gota de ClH 0.2 N a los tubos 1, 3, 5 y 7.


8. Centrifugar a 1000 g durante 1 minuto.

9. Observar visualmente en busca de hemólisis.

Interpretación

Ver la Tabla 66-1.

1. HPN: hemólisis en los tubos 1 y 3.

2. HEMPAS: hemólisis en el tubo 3.

Tabla 66-1.Diferencia entre HEMPAS y HPN según hemólisis

Tubo GRs GRs control Suero Suero inactivado Suero fresco ClH HPN HEMPAS

1

2

3

4

5

6

7

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

H

O

H

O

O

O

O

O

O

H

O

O

O

O

PARA MEDIR LA HEMOLISIS CUANTITATIVAMENTE

Procedimiento

1. Numerar tubos de A hasta E y agregar 2.9 mL de reactivo cianmetahemoglobina a cada tubo.

2. Agregar 0.1 mL del sobrenadante del tubo 3 al tubo A.

3. Agregar 0.1 mL del sobrenadante del tubo 6 al tubo B.

4. Agregar 0.1 mL de suero al tubo C.

5. Agregar 0.1 mL de suspensión al 50% de GRs normales a 0.9 mL de agua. Congelar y

descongelar hasta que las células se hemolicen. Centrifugar. Agregar 0.1 mL del sobrenadante

al tubo D (control del 100% de hemólisis).

6. Agregar 0.1 mL de agua al tubo E.

7. Mezclar todos los tubos.

8. Graduar el espectrofotómetro a 540 (visible).

9. Leer todos los tubos y registrar las densidades ópticas.

Cálculos

A - C

------- x 100 = % de hemólisis de los GRs del paciente

D - E

B - C

------- x 100 = % de hemólisis de los GRs normales de control

D - E

Interpretación

Habitualmente se observa una hemólisis del 10 al 50% en una prueba positiva. Algunos pacientes con

HPN pueden dar incluso resultados más altos y ocasionalmente, puede observarse hemólisis de menos del

10% en pacientes con HPN.

Notas

1. La hemólisis en otros tubos puede indicar hemolisinas reactivas en caliente o demasiados GRs con

esferocitosis.

2. Los GRs en estudio y de control pueden ser congelados hasta ser probados.

3. El suero normal puede ser un pool de 10 sueros. La hemólisis observada con un pool puede ser

altamente significativa.

4. Si el suero de pacientes con sospecha de HPN está hemolizado, puede usarse suero normal.

5. No se notará hemólisis sólo con una parte del suero normal y con GRs HEMPAS y no se

encontrará con el suero del propio paciente.

Referencias

1. Jenkins DE. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria hemolytic systems. In: A seminar

on laboratory management of hemolysis. Bell CA, ed. Washington, DC: AABB, 1979.

2. Judd WJ. Methods in immunohematology. Miami: Montgomery Scientific

Publications, 1988:208-9.

Método 67 – Elución por calor: una modificación a la técnica de Landsteiner-Miller

Principio

La elución es un método para remover las moléculas de anticuerpo de la membrana de los GRs. Esto

puede llevarse a cabo tanto por la disrupción del antígeno como por el cambio en las condiciones para

favorecer la disociación del anticuerpo del antígeno. Esta técnica usa el cambio en la temperatura para

efectuar la elución.

Aplicación

Un eluato puede usarse para estudiar los anticuerpos que estaban sensibilizando a los GRs tanto in vivo

como in vitro.


1. GRs a estudiar

2. Salina

3. Incubador / Baño térmico de 37 y 56°C



6. Pipetas

7. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6% (opcional)

8. Suero AB (opcional)

Procedimiento

1. Lavar los GRs a ser eluidos 6 veces con solución salina.

2. Después del último lavado, compactar los GRs y guardar una pequeña cantidad del último lavado

para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 1).

3. Agregar un volumen igual de salina (puede usarse suero AB o ASB al 6%) al paquete de GRs

lavados. Mezclar bien.

4. Incubar los tubos a 56°C durante 10 minutos. Agitar los tubos con frecuencia durante ese tiempo.

5. Centrifugar a 1000 g durante 3-5 minutos, preferiblemente en una centrífuga termostatizada.

6. Inmediatamente transferir el sobrenadante teñido con hemoglobina a un tubo limpio y estudiar en

paralelo con el último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas

1. Las pruebas con el último lavado deben ser negativas. Si son positivas, repetir el procedimiento de

elución y aumentar el número de lavados de los GRs.

Referencias

1. Landsteiner K, Miller CP. Serological studies on the blood of primates. II. The blood

groups in anthropoid apes. J Exp Med 1925;42:853-62.

Método 68 – Elución por congelación-descongelación (Lui)

Principio

La elución es un método para remover las moléculas de anticuerpo de la membrana de los GRs. Esto

puede llevarse a cabo tanto por la disrupción del antígeno como por el cambio en las condiciones para

favorecer la disociación del anticuerpo del antígeno. La técnica de Lui utiliza el cambio en la temperatura

para efectuar la elución.

Aplicación

Un eluato puede usarse para investigar los anticuerpos que estaban sensibilizando los GRs tanto in vivo

como in vitro. Este método es particularmente recomendado para recuperar anti-A o anti-B de los GRs de

cordón.


1. GRs a estudiar


3. Salina

4. Congelador (rango de temperatura entre –20 y –70 °C)


6. Pipetas

Procedimiento

1. Lavar los GRs a ser eluidos 5-6 veces con solución salina. Después del último lavado, compactar

bien los GRs y guardar una pequeña cantidad del último lavado para estudiarlo en paralelo con el

eluato (ver Nota 1).

2. Dispensar alícuotas de 0.5 mL del paquete de los GRs lavados en tubos de 13 x 100 mm. Preparar

suficientes tubos como para poder obtener la cantidad de eluato requerido.

3. Agregar 3 gotas de salina a cada tubo con GRs y mezclar bien.

4. Tapar los tubos, entonces girarlos para cubrir la superficie interna de cada tubo con los GRs.

5. Colocar los tubos horizontalmente durante 10 minutos en el congelador.

6. Descongelar rápidamente los GRs calentando los tubos bajo agua corriente caliente.

7. Centrifugar a 1000 g durante 3-5 minutos.

8. Inmediatamente transferir el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta(ver M22).

Notas



Referencias

1. Eicher CA, Wallace ME, Frank S, de Jongh DS. The Lui elution: a simple method for antibody

elution. Transfusion 1978;18:647.

2. Barnes JM. Evaluation of the Lui easy-freeze elution test. Lab Med 1981;12:227-8.

Método 69 – Elución por congelación-descongelación (Weiner)

Principio

El anticuerpos es disociado del antígeno usando la congelación, descongelación y etanol.

Aplicación

Un eluato puede usarse para investigar los anticuerpos que estaban sensibilizando a los GRs tanto in vivo

como in vitro.


1. Albúmina sérica bovina (ASB)

2. Etanol al 50% (ver Nota 1)

3. Solución salina

4. GRs a estudiar (1 mL de paquete globular)




8. Varillas

9. Pipetas

10. Agua destilada

11. Congelador, –20 y –70 °C

12. Freezer


1. Preparar la ASB al 6%: mezclar 2.7 mL de ASB y 7.3 mL de salina o 2 mL de ASB al 30% y 8

mL de salina.

2. Preparar etanol al 50% mezclando 1 parte de etanol (C2H5OH) y 1 parte de agua destilada.

Procedimiento

1. Enfriar el etanol al 50% a –6 °C en un freezer (ver Nota 1).

2. Lavar los GRs 5-6 veces, removiendo toda la salina. Guardar el último lavado para estudiarlo en

paralelo con el eluato (ver Nota 2).

3. Colocar los GRs en un tubo de 16 x 100 mm y colocar en el congelar a –70 °C por 10 minutos.

4. Descongelar rápidamente los GRs calentando los tubos bajo agua corriente caliente.

5. Agregar 10 mL de etanol frío y mezclar por inversión.

6. Colocar los GRs en un congelador a –20 °C durante 60 minutos.

7. Centrifugar a 1000 g durante15 minutos.

8. Descartar el sobrenadante.

9. Desintegrar el estroma con una varilla. Lavar una vez con agua destilada y descartar el

sobrenadante.

10. Agregar 1 mL de ASB al 6% o salina y mezclar bien, disgregando el estroma con una varilla.


12. Centrifugar durante 2 minutos.

13. Inmediatamente transferir el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas

1. Precaución: Manejar con cuidado el etanol. Es explosivo y tóxico. Conservar en un freezer.



Referencias

1. Weiner W. Eluting red-cell antibodies: a method and its applications. Br J Haematol 1957;3:276.

Método 70 – Elución con digitonina ácida

Principio

La digitonina lisa los GRs para obtener el estroma. El ácido disocia los anticuerpos de los antígenos del

estroma de los GRs.

Aplicación

El eluato se utiliza para estudiar los anticuerpos que estaban sensibilizando los GRs tanto in vivo como in

vitro. La digitonina ácida se usa para preparar eluatos potentes de auto y aloanticuerpos.


1. Digitonina al 0.5% P/V, Sigma Chemical Co.

2. Glicina 0.1 M, pH 3.0

3. Tampón fosfaato 0.8 M, pH 8.2

4. GRs a estudiar


6. Pipetas

7. Solución salina



10. Papel de pH

11. HCl 12 N y 1 N

12. NaOH 1 N

13. Albúmina sérica bovina (ASB)

14. Matraces


1. Preparar la digitonina al 0.5% P/V disolviendo 0.5 g de digitonina en 100 mL de agua destilada.

Conservar a 4 °C.

2. Preparar la glicina 0.1 M, pH 3.0, disolviendo 3.754 g de glicina en 500 mL de agua destilada.

Ajustar el pH a 3.0 con HCl 12 N. Conservar a 4 °C.

3. Preparar el tampón fosfato disolviendo 109.6 g de Na2HPO4 y 3.8 g de KH2PO4 en

aproximadamente 600 mL de agua destilada. Ajustar el pH si es necesario con NaOH 1 N o HCl 1

N. Diluir con agua destilada para un volumen final de 1 L. Conservar a 4 °C.

Procedimiento

1. Calentar los reactivos a 37 °C antes de usar y mezclar bien (ver Nota 1).

2. Lavar los GRs 6 veces con grandes volúmenes de solución salina. Concentrar bien los GRs.

Guardar una pequeña cantidad de sobrenadante del último lavado para estudiarlo en paralelo con el

eluato (ver Nota 2).

3. Agregar 9 mL de solución salina a 1 mL de los GRs lavados y mezclar por inversión.

4. Agregar 0.5 mL de digitonina y mezclar por inversión (durante al menos 1 minuto o menos) o

hasta que los GRs estén hemolizados.

5. Centrifugar el tubo a 1000 g durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.

6. Lavar el estroma de los GRs por lo menos 5 veces o hasta que parezcan blancos. Centrifugar por lo

menos 2 minutos en cada lavado.

7. Descartar el sobrenadante del último lavado y agregar 2 mL de glicina al estroma (ver Nota 3).

8. Mezclar por inversión al menos durante1 minuto.

9. Centrifugar durante5 minutos.

10. Transferir el eluato sobrenadante a un tubo limpio y agregar 0.2 mL de tampón fosfato.

11. Mezclar y centrifugar durante2 minutos.

12. Trasvasar inmediatamente el eluato a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el sobrenadante del

último lavado y realizar prueba antiglobulínica indirecta (ver Nota 4).

Notas

1. Los reactivos cristalizarán o precipitarán a 4 °C y, por lo tanto, deben calentarse a 37 °C antes de

usar.

2. Las pruebas con el sobrenadante del último lavado deben ser negativas. Si son positivas, repetir el

procedimiento de elución y aumentar el número de lavados de los GRs.

3. Arazkiewicz y col. obtuvieron una óptima recuperación de anticuerpos durante la incubación de 8

volúmenes de glicina 0.1 M, pH 3.0, con 2 volúmenes de estroma a 45 °C durante 30 minutos.

4. Para reducir la lisis de los GRs, agregar 1 volumen de albúmina bovina al 30% al eluato en el paso

12.

Referencias

1. Jenkins DE, Moore WH. A rapid method for the preparation of high potency auto and alloantibody

eluates. Transfusion 1977;17:110-4.

2. Araskiewicz P, Huff SR, Szymanski IO. Modification of acid stromal elution method for complete

recovery of bound antibodies. Transfusion 1983;23:72-4.

CR7

Método 71 – Elución ácida fría

Principio

Los anticuerpos pueden ser disociados de la membrana de los GRs con ácido, sin hemolizarlos.

Aplicación


vitro. La elución ácida fría permite preparar eluatos potentes de auto y aloanticuerpos evitando la

hemolisis de los GRs.


1. GRs a estudiar

2. Glicina 0.1 M, pH 3.0

3. Tampón fosfato 0.8 M, pH 8.2

4. Solución salina


6. Pipetas

7. Baño de hielo 8. Centrífuga adecuadamente calibrada


10. Papel de pH

11. HCl 12 N y 1 N

12. NaOH 1 N

13. Matraces


1. Preparar la glicina 0.1 M disolviendo 3.754 g de glicina y 2.992 g de cloruro de sodio en 500 mL

de agua destilada. Ajustar el pH a 3.0 con HCl 12 N. Conservar a 4 °C.

2. Preparar el tampón fosfato disolviendo 109.6 g de Na2HPO4 y 3.8 g de KH2PO4 en

aproximadamente 600 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8.2 con NaOH 1 N o HCl 1 N. Diluir

hasta un volumen final de 1 L con agua destilada. Conservar a 4 °C.

Procedimiento

1. Lavar los GRs 5-6 veces con grandes volúmenes de solución salina. Concentrar bien los GRs.

2. Guardar una pequeña cantidad del sobrenadante del último lavado para estudiarlo en paralelo con

el eluato (ver Nota 1).

3. Calentar el tampón fosfato a 37 °C (ver Nota 2).

4. Agregar 1 mL de solución salina fría y 2 mL de glicina fría a 1 mL del paquete de los GRs

lavados.

5. Mezclar e incubar el tubo en un baño de hielo durante 1 minuto.

6. Centrifugar el tubo a 1000 g durante 2 minutos.

7. Transferir el eluato sobrenadante a un tubo limpio y agregar 0.1 mL de tampón fosfato.

8. Mezclar y centrifugar durante 2 minutos.

9. Transferir inmediatamente el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

sobrenadante del último lavado, y realizar la prueba de antiglobulina indirecta (ver M22).

Notas



2. El tampón fosfato debe calentarse antes de usar porque cristaliza durante su almacenamiento a 4

°C.

Referencias

1. Rekvig OP, Hannestad K. Acid elution of blood group antibodies from intact erythrocytes. Vox

Sang 1977;33:280-5.

Método 72 – Elución ácida: Modificación del método de Kochwa-Rosenfield

Principio

Los anticuerpos pueden ser disociados de la membrana de los GRs con ácido.

Aplicación


vitro. Esta modificación de la elución ácida se usa para preparar eluatos potentes de auto y aloanticuerpos.


1. GRs a estudiar

2. Na2HPO4 0.8 M

3. KH2HPO4 0.8 M

4. Tampón fosfato 0.8 M (solución dializada)

5. Glicina 0.1 M




9. Solución salina

10. Pipetas

11. Papel de pH

12. HCl 12 N

13. Matraces


1. Preparar el Na2HPO4 0.8 M: agregar 7.1 g de Na2HPO4 a 63.5 mL de agua destilada.

2. Preparar el KH2PO4 0.8 M : agregar 6.8 g de KH2PO4 a 63.5 mL de agua destilada.

3. Preparar el tampón fosfato como sigue: Agregar 0.225 mL de KH2PO4 0.8 M a 12.1 mL de

Na2HPO4 0.8 M. Conservar a 4 °C.

4. Preparar la glicina 0.1 M: agregar 1 g de glicina a 133 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 3.0

agregando 9-10 gotas de HCl 12 N. Si no se usa inmediatamente, conservar congelado en

pequeñas alícuotas.

Procedimiento

1. Calentar el tampón fosfato a 37 °C. Descongelar una alícuotas de solución de glicina tamponada.

2. Lavar los GRs 5-6 veces con solución salina y guardar una pequeña cantidad de sobrenadante del

último lavado para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 1).

3. Agregar 1.5 mL de la glicina tamponada a los GRs lavados.

4. Invertir durante 1 minuto y entonces centrifugar a 1000 g durante 3 minutos.

5. Transferir el eluato sobrenadante a un tubo limpio.

6. Agregar 3 gotas de tampón fosfato (solución dializada) al eluato.

7. Mezclar y centrifugar durante 3 minutos para remover cualquier precipitado.

8. Transferir inmediatamente el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

último lavado y realizar la prueba de antiglobulina indirecta (ver M22).

Notas



Referencias

1. Jenkins DE Jr., Moore WH. A rapid method for the preparation of high potency auto and

alloantibody eluates. Transfusion 1977;17:110-4.

2. Kochwa S, Rosenfield RE. Immunochemical studies of the Rh system, I. Isolation and

characterization of antibodies. J Immunol 1964;92:682-92.

3. Bush M. A modified one-stage acid elution technique for allo- and autoantibodies (abstract).


Método 73 – Elución con cloruro de cesio

Principio

Las soluciones de sales hipertónicas son eficaces en la disociación de los complejos antígeno-anticuerpo

sin destruir la membrana eritrocitaria.

Aplicación

El cloruro de cesio es utilizado para preparar eluatos de GRs sensibilizados in vivo o in vitro. Este método

puede ser particularmente útil en casos donde el calor o los solventes orgánicos fallan en disociar el

anticuerpo.


1. Solución de cloruro de cesio (CsCl) 1.2 M

2. Solución salina

3. Tubuladura de diálisis de 3/8”

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. GRs a estudiar



1. Preparar la solución de CsCl 1.2 M agregando 202 mg de CsCl a 1 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. Lavar los GRs 5-6 veces con grandes volúmenes de solución salina y guardar una pequeña

cantidad de sobrenadante del último lavado para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 1).

2. Agregar 1 mL de la solución de CsCl 1.2 M a 3 mL de GRs en un tubo de ensayo.


4. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos para empaquetar los GRs. Transferir el elutato

sobrenadante a una tubuladura de diálisis y dializar a 4 °C contra grandes cantidades de solución

salina durante 12-18 horas.

5. Inmediatamente transferir el eluato a un tubo limpio y estudiar el eluato y el último lavado en

busca de anticuerpos, y realizar la prueba de antiglobulina indirecta (ver M22).

Notas



Referencias

1. Anderson RE, Walford RL. Elution of antibodies from sensitized red blood cells by means of

cesium chloride. Am J Clin Path 1963;40:325-8.

2. Edelman IS, Bryan WP. The dissociation of antigen-antibody precipitares in alkali chloride

solutions. Am Chem Soc J 1960;82:1491-4.

Método 74 – Elución con ácido cítrico

Principio

La técnica de elución fría con ácido cítrico permite disociar el anticuerp , dejando los GRs intactos.

Aplicación

Este método es utilizado para estudiar el anticuerpo que se ha asociado con los GRs tanto in vivo como in

vitro, o cuando es necesario obtener GRs intactos para fenotipificación y autoadsorción.


1. Solución de ácido cítrico, pH 2.7

2. Solución de neutralización

3. Papel de pH

4. Tubos de ensayo

5. Solución salina


7. Balanza

8. Pipetas

9. GRs a estudiar

10. Agua destilada


12. Matraces


1. Preparar la solución de ácido cítrico como sigue: Disolver 1.3 g de ácido cítrico (C6H8O7•H2O) y

0.65 g de fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) en 100 mL de solución salina.

2. Preparar la solución de neutralización como sigue: Disolver 13 g de fosfato tribásico de sodio

(Na3PO4) en 100 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. Mantener los reactivos a 4 °C hasta ser usados.

2. Lavar 1 mL de paquete globular 5-6 veces con solución salina, guardando una pequeña cantidad de

sobrenadante del último lavado para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 1).

3. Agregar 2 mL de la solución de ácido cítrico a los GRs. Tapar y mezclar suavemente durante 2

minutos.

4. Centrifugar a 1000 g durante 60 segundos y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.

5. Agregar 0.3-0.5 mL de solución de neutralización.

6. Medir el pH y agregar más solución de neutralización si es necesario para ajustar el pH a 6.8-7.2.

7. Centrifugar para remover los precipitados que se forman cuando el pH se acerca a 7.0, remover el

eluato sobrenadante, y estudiar en paralelo con el sobrenadante del último lavado, y realizar la

prueba de antiglobulina indirecta (ver M22).

8. Los GRs previamente lavados pueden utilizarse para realizar fenotipificación o autoadsorción.

Notas



2. Los antígenos del sistema Kell son debilitados por el tratamiento con ácido cítrico.

Referencias

1. Burich MA, Anderson HJ, AuBuchon JP. Antibody elution using citric acid (letter). Transfusion

1986;26:116-7.

2. Brown LA, Dease M. Acid elution of antibody from intact red cells (abstract). Am J Clin Pathol

1982;78:267.

Método 75 – Elución con cloruro de metileno (Diclorometano)

Principio

El cloruro de metileno es un solvente orgánico capaz de remover las inmunoglobulinas de la membrana

de los GRs.

Aplicación


vitro


1. Cloruro de metileno (diclorometano), Sigma Chemical Co. (ver Nota 1)

2. GRs a estudiar


4. Pipetas

5. Solución salina

6. Tubos de ensayo


8. Tapones

9. Varillas para mezclar

Procedimiento

1. Lavar los GRs 5-6 veces con solución salina, concentrar los GRs. Guardar el sobrenadante del


2. Mezclar un volumen de paquete globular lavado con un volumen igual de solución salina.

Agregara la mezcla 2 volúmenes de cloruro de metileno. El volumen de cloruro de metileno

agregado debe ser igual al volumen sumado de los GRs y la solución salina.

3. Tapar el tubo de ensayo y mezclar el contenido por agitación suave durante 1 minuto. Sacar el

tapón.


5. remover con una pipeta la capa inferior de cloruro de metileno y descartar. Dejar el estroma y el

sobrenadante hemolizado en el tubo.

6. Incubar el tubo a 56 °C durante 10 minutos. Agitar la mezcla estroma-sobrenadante hemolizado

con una varilla con frecuencia.

7. Centrifugar el tubo durante 10 minutos.

8. Trasvasar inmediatamente el eluato sobrenadante a un tubo limpio, y estudiar en paralelo con el

sobrenadante del último lavado, y realizar la prueba de antiglobulina indirecta (ver M22).

Notas

1. Precaución: Los solventes orgánicos pueden ser carcinógenos, narcóticos e inflamables. Tener

cuidado cuando se usen estos compuestos.



Referencias

1. Ellisor SS, Papenfus L, Sugasawa E, Azzi R. Dichloromethane (DCM) elution procedure


Método 76 – Elución con cloroformo

Principio

La elución de las moléculas de anticuerpo de la membrana eritrocitaria puede lograrse mediante la rotura

del complejo antígeno-anticuerpo con un solvente orgánico como el cloroformo.

Aplicación


vitro.


1. Cloroformo, reactivo de calidad (ver Nota 1)

2. Solución salina

3. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6% (ver M69)

4. Varillas para mezclar




8. Tapones

9. GRs a estudiar

Procedimiento

1. Lavar los GRs 5-6 veces con solución salina, Concentrar los GRs y guardar el sobrenadante del


2. Al paquete globular lavado agregar un volumen igual de solución salina y 2 volúmenes de

cloroformo. El volumen de cloruro de cloroformo debe ser igual al volumen sumado de los GRs y

la solución salina (ver Notas 3 y 4).

3. Tapar el tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante 15 segundos. Mezclar por inversión

durante 1 minuto.

4. Sacar con cuidado el tapón e incubar el tubo a 56 °C durante 5 minutos. Agitar el contenido del

tubo con una varilla frecuentemente durante este tiempo.

5. Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos.

6. Inmediatamente trasvasar el eluato sobrenadante (capa superior) a un tubo limpio y estudiar en

paralelo con el sobrenadante del último lavado, y realizar prueba antiglobulínica indirecta (ver

M22).

Notas





3. Puede llevarse a cabo la concentración del anticuerpo de GRs débilmente sensibilizados (prueba

antiglobulínica menor a 2+) omitiendo el agregado de solución salina en el paso 2 del

procedimiento.

4. Si el eluato va a ser conservado, usar albúmina bovina al 6% en lugar de solución salina en el paso

2.

5. El volumen de eluato obtenido por este método es menor al obtenido por otros métodos de elución

con solventes orgánicos.

Referencias

1. Branch DR, Hian ALS, Petz LD. A new elution procedure using nonflammable organic solvent


2. Branch DR, Hian ALS, Petz LD. A new elution procedure using chloroform, a nonflammable

organic solvent. Vox Sang 1982;42:46-53.

Método 77 – Elución con éter y calor-éter

Principio

El éter, al igual que otros solventes orgánicos, es capaz de remover las moléculas de anticuerpo de la

membrana eritrocitaria por la rotura de los complejos antígeno-anticuerpo.

Aplicación


vitro


1. Dietil éter de calidad reactivo o para anestesia (ver Notas 1 y 2)

2. Solución salina

3. Incubador / Baño térmico de 37 y 56 °C

4. Tapones



7. Albúmina sérica bovina al 6% (opcional) (ver M69)

8. Suero grupo AB, libre de anticuerpos (opcional)

9. Pipetas

10. GRs a estudiar

11. Varillas para mezclar (opcional)

Procedimiento

Éter

1. Lavar los GRs a eluir 5-6 veces con solución salina, Concentrar los GRs y guardar el sobrnadante

del último lavado para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 3).

2. Agregar un volumen igual de solución salina al paquete globular lavado (ver Nota 4). Nota: la

albúmina bovina al 6% o el suero de grupo AB puede ser substituido por solución salina.

3. A la mezcla, agregar un volumen igual de éter.

4. Tapar el tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante 1-2 minutos. Precaución: Cuando el tubo

es agitado, sacar periódicamente el tapón para liberar la presión.

5. Sacar con cuidado el tapón e incubar el tubo a 37 °C durante 15 minutos.


7. Remover y descartar la capa superior de éter.

8. Trasvasar el eluato teñido de hemoglobina de la capa inferior de estroma a un tubo limpio.

9. Incubar el tubo a 37 °C durante 15 minutos para evaporar el éter residual.


11. Inmediatamente trasvasar el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar el eluato en paralelo

con el sobrenadante del último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Calor-Éter

Marsh informó de una técnica combinada de calor-éter para producir un eluato más potente que las

eluciones por calor o éter aisladamente.

1. Después del paso 8, más arriba, incubar el tubo a 56 °C y mezclar suavemente con una varilla

durante 5 minutos.

2. Observar con cuidado el tubo y sacar del baño si éste comienza a hervir. Cuando se detiene la

ebullición, volver el tubo al baño.


4. Inmediatamente trasvasar el eluato sobrenadante a un tubo limpio. Todo el éter debe evaporarse.

5. Estudiar el eluato en paralelo con el sobrenadante del último lavado, incluyendo la prueba

antiglobulínica indirecta (ver M22 y Nota 5).

Notas



2. Precaución: El éter se vuelve explosivo cuando forma óxidos. Almacenar el recipiente en un

gabinete a prueba de explosiones y descartar 3 meses después de abierto.



4. Si la PAD es menor a 2+, puede prepararse un eluato concentrado. Omitir el agregado de solución

salina o reducir la cantidad agregada en el paso 2 del procedimiento de la técnica de éter.

5. Este procedimiento de elución puede fallar en eluir anticuerpos anti-S, anti-s y anti-Fya.

Referencias

1. Marsh WL. Personal communication. In: Judd WJ, ed. Methods in immunology. 2nd ed. Miami:

Montgomery Scientific Publications, 1988.

2. Rubin H. Antibody elution from red blood cells. J Clin Pathol 1963;16:70-3.

3. Vos G. The evaluation of specific anti-G (CD) eluate obtained by a double absorption and elution

procedure. Vox Sang 1960;5:472-8.


Método 78 – Elución con xileno o D-limoneno

Principio

El xileno y el D-limoneno son solventes orgánicos capaces de disociar los anticuerpos del estroma

eritrocitario.

Aplicación


vitro


1. Xileno, reactivo de calidad; o [D-limoneno], American Histological Clearing Solution, Baxter

Diagnostic, Inc., Scientific Products Division (ver Notas 1 y 2)


3. GRs a estudiar

4. Tubos de ensayo

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Incubador / Baño térmico de 56 °C

8. Tapones

Procedimiento

1. Lavar los GRs 5-6 veces con solución salina, entonces empaquetar los GRs y guardar el último

lavado para estudiarlo en paralelo con el eluato (ver Nota 3).

2. Mezclar un volumen igual de paquete globular lavado y xileno o [D-limonene] en un tubo de

ensayo.

3. Tapar el tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante 1-2 minutos. Sacar con cuidado el tapón.

4. Incubar el tubo a 56 °C durante 10 minutos, mezclando el contenido del tubo con frecuencia.

5. Centrifugar a 1000 g 1000 g durante 10 minutos.

6. Remover con cuidado y descartar la capa superior de xileno o [D-limonene] y el estroma usando

una pipeta (ver Nota 4).

7. Inmediatamente trasvasar el eluato a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el sobrenadante

del último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas

1. Precaución: El xileno es carcinógeno. Evitar el contacto con la piel. También es muy inflamable.

2. El [D-limoneno] es un sustituto del xileno usado en los laboratorios de histología porque no es

tóxico, ni inflamable y no es sensibilizante. Los estudios muestran que es comparable a otros

solventes orgánicos usados en los métodos de elución.



4. No contaminar el eluato con estroma. Si ocurre la contaminación, centrifugar nuevamente durante

10 minutos.

Referencias

1. Chan-Shu SA, Blair O. A new method of antibody elution from red blood cells. Transfusion

1979;19:182-5.

2. Bueno R, Garratty G, Postoway N. Elution of antibody from red blood cells using xylene – a

superior method. Transfusion 1981;21:157-62.

3. Deisting B, Douglas D, Ellisor S. D-limonene: a xylene substitute for elution procedures


Método 79 – Elución con cloroformo y tricloroetileno

Principio

Los solventes orgánicos como el cloroformo y el tricloroetileno son capaces de disociar los complejos

antígeno-anticuerpo de los GRs.

Aplicación


vitro


1. Cloroformo, reactivo de calidad

2. Tricloroetileno, reactivo de calidad

3. Solución salina



6. GRs a estudiar


1. Preparar la solución de trabajo de cloroformo-tricloroetileno: Agregar 1 volumen de cloroformo a

1 volumen de tricloroetileno (ver Nota 1).

Procedimiento



2. Al paquete globular lavado agregar un volumen igual de solución salina y 2 volúmenes de la

solución de trabajo.

3. Mezclar e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Agitar el contenido del tubo durante al menos 10

segundos a cada minuto.


5. Inmediatamente trasvasar el eluato (capa superior) a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

sobrenadante del último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas





Referencias

1. Massuet L, Martin C, Ribera A, Argelagues F, Duran-Suarez JR, Triginer J. Antibody elution from

red blood cells by chloroform and trichloroethylene. Transfusion 1982;22:359-61.

Método 80 – Elución por microondas

Principio

El calor generado por las microondas disocia el anticuerpo de los GRs.

Aplicación

Métodos A y B: El tratamiento con microondas de los GRs cubiertos con anticuerpos a 55-62 °C produce

eluatos potentes.

Métodos C y D: El tratamiento con microondas de los GRs cubiertos con anticuerpos a 45 °C produce

GRs adecuados para la fenotipificación.

METODO A


1. Horno de microondas convencional

2. GRs a estudiar

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo (12 x 75 mm de polipropileno)

6. Gradilla de tubos plásticos


8. Baño de hielo 9. Termómetro

Preparación del equipamiento

1. Para calibrar el horno de microondas, colocar una gradilla plástica en el centro de la cámara del

microondas y marcar su ubicación en el fondo del horno (ver Nota 1).

2. Preparar varias alícuotas de 2 mL de suspensión al 50% de GRs en tubos de polipropileno. Colocar

en el baño de hielo durante 5 minutos.

3. Colocar un tubo de GRs durantevez en el centro de la gradilla en el horno (ver Nota 2). Usar una

potencia constante del 50% o “descongelar” y un tiempo variable para determinar la temperatura

final deseada. Medir la temperatura de salida final de las muestras con un termómetro (ver Nota 3).

4. Registrar el ajuste de potencia y tiempo que produce una temperatura final de 56-62 °C.

Procedimiento



2. Transferir aproximadamente 1.5 mL de paquete globular lavado a un tubo de ensayo, agregar un

volumen igual de solución salina y centrifugar a 700 g durante 10 minutos.

3. Preparar una suspensión globular al 50% con solución salina. Se requiere una suspensión globular

exacta como control de la temperatura final.

4. Pasar 2.0 mL a un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm y colocar en un baño de hielo durante 5

minutos. Esta estandarización de la temperatura pre-elución también controla la temperatura de

salida final.

5. Colocar el tubo en la posición central de la gradilla de tubos plásticos. Exponer la muestra al

microondas usando el ajuste de tiempo y potencia predeterminados.

6. Centrifugar la muestra a 1000 g durante 5 minutos.

7. Inmediatamente recolectar el eluato sobrenadante teñido de hemoglobina y estudiar en paralelo

con el último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Controles

Estudiar en paralelo una muestra de GRs sensibilizados con un anticuerpo que tenga características de

elución establecidas.

Notas

1. Usar un cronómetro ya que el de los hornos son frecuentemente inexactos.



3. No usar una gradilla metálica en el horno de microondas.

4. Exponer a microondas solo un tubo a la vez.

Referencias

1. Meier TJ, Wilkinson SL, Utz G. Elution of antibody from sensitized red blood cells using a

conventional microwave oven (abstract). Transfusion 1983;23-241.

METODO B

Este método usa una sonda de microondas.


1. Horno de microondas con controles digitales (750 watts)

2. Sonda de temperatura para microondas (opcional)

3. GRs a estudiar

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Tubos de ensayo (12 x 75 mm de polipropileno)

7. Gradilla de tubos plásticos


9. Termómetro (si no está disponible una sonda de temperatura de microondas)

Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces con grandes volúmenes de solución salina. Guardar el sobrenadante del


2. Agregar 1 mL de paquete globular lavado a 2 mL de solución salina fría (1-6 °C) un tubo de

ensayo de polipropileno.

3. Colocar la muestra en la posición central de la gradilla de tubos plásticos en el centro del horno de

microondas (ver Notas 2 y 3).

4. Exponer la muestra durante 8 segundos en el horno en modo “descongelar” (ver Nota 4).

5. Verificar que la temperatura conseguida es de 55-62 °C (ver Nota 2).

6. Centrifugar la muestra a 1000 g durante 1 minuto.

7. Inmediatamente recolectar el eluato sobrenadante teñido de hemoglobina y estudiar en paralelo

con el último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas



2. No usar una gradilla metálica en el horno de microondas.

3. Exponer a microondas solo un tubo a la vez.

4. Usar un cronómetro ya que el de los hornos son frecuentemente inexactos.

Referencias

1. McCullough JS, Torloni AS. Microwave dissociatioon of antigen-antibody complexes from red

cells: a new method for phenotyping RBC’s (abstract). Transfusion 1992;32:14S.

METODO C

Este método usa una sonda de microondas.



2. Sonda de temperatura para microondas

3. GRs a estudiar

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Pipetas plásticas desechables, capacidad 4.9 mL, 15.5 cm de longitud, Gamma Biologicals,

catálogo número 2-854

7. Vasos plásticos de muestras de 5 oz., Sage Productos, Inc., catálogo número 2200

8. Columnas de filtro de suero, 10-20 micrones, Columbia Diagnostic, catálogo número C7425P

Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces en solución salina. Retirar todo el sobrenadante de solución salina del

paquete globular y resuspenderlo en solución salina fría (1-6 °C) hasta un volumen de 3 mL (ver

Nota 1).

2. Aspirar 3 mL de la suspensión globular en una pipeta de plástico descartable (ver Nota 2).

3. Invertir la pipeta y cortar aproximadamente 1 pulgada de su extremo aguzado.

4. Poner 90 mL de agua fría corriente en un vaso plástico de muestras de 5 oz.

5. Colocar la pipeta invertida conteniendo la suspensión globular en el vaso de muestras. Insertar la

sonda de temperatura en los GRs de la pipeta.

6. Colocar la pipeta invertida y la sonda en el centro del horno de microondas.

7. Ajustar la temperatura del horno de microondas a 45 °C.

8. Exponer la muestra al microondas y permitir calentar a la temperatura ajustada.

9. Una vez alcanzada la temperatura deseada, continuar la exposición durante al menos 2 minutos

(ver Nota 3).

10. Realizar una PAD a los GRs. Si la PAD es positiva con anti-IgG, repetir los pasos 5-10.

Notas

1. El porcentaje final de la suspensión celular no es tan importante como que el volumen final sea de

3 mL. Este volumen disminuye también el área de la interface aire/líquido una vez de la sonda es

insertada y evita el calentamiento excesivo y la posible destrucción celular en este punto.

2. Asegurarse de usar solución salina fría (1-6 °C) para hacer la suspensión celular para prevenir un

rápido y excesivo calentamiento.

3. La exposición durante 2-10 minutos es bien tolerada por la mayoría de las muestras con mínimo

artificio de estroma. La mayoría de las muestras deben tratarse con microondas durante 2 minutos

y probadas. Si la reducción de la PAD no es satisfactoria, pueden ensayarse con tiempos más

largos. Algunas muestras parecen “resistentes al calor” y pueden tolerar temperaturas que exceden

los 57 °C. Esto es más probable de encontrarse en muestras con una PAD fuertemente positiva (3+

o mayor). Dependiendo de los resultados iniciales, puede ser deseable experimentar con

exposiciones a temperaturas mayores.

METODO D

Este método puede usarse cuando no hay disponible una sonda de temperatura de microondas.



2. GRs a estudiar

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Columnas de filtro de suero, 10-20 micrones, Columbia Diagnostic, catálogo número C7425P

Procedimiento


2. Resuspender 8 gotas de los GRs lavados y concentrados en 16 gotas de solución salina fría (1-6

°C) en un tubo de ensayo de polipropileno (ver Notas 1-3).

3. Colocar el tubo conteniendo los GRs en el centro de una gradilla de plástico en el centro del horno

de microondas (ver Nota 4).

4. Usar el modo “descongelar” del horno y exponer los GRs a estudiar a las microondas por períodos

de 5 segundos (ver Nota 5). Después de la primera exposición, sacar el tubo y agitar suavemente el

contenido sin introducir burbujas (ver Nota 6).

5. Exponer los GRs a las microondas de 5 segundos y llevar el tubo a un baño de hielo para enfriar a

20 °C.

6. Repetir los pasos 4 y 5 hasta completar un ciclo de tratamiento (ver Nota 7).

7. Realizar una PAD a los GRs.

8. Los tratamientos adicionales comenzarán en el paso 3 después que se haya removido el

sobrenadante y reemplazado con solución salina fría (1-6 °C) (ver Nota 3).

9. Preparar las columnas de filtrado para remover los artificios de estroma sacando el papel de filtro

de 10 columnas de filtrado (Columbia Diagnostics, catálogo número C7625P o similar) y

colocándolos juntos en una sola columna (ver Nota 8).

10. Filtrar la muestra expuesta a microondas a través de la columna de filtrado (ver Nota 8).

11. Realizar una PAD a los GRs filtrados y repetir los pasos 3-11 si la PAD es positiva.

Notas

1. En este método se usó un volumen total de 24 gotas [8 gotas de GRs + 16 gotas de solución salina

fría (1-6 °C)], pero la cantidad de GRs puede aumentarse o disminuirse con tal que el volumen

final sea de 24 gotas. Si se usan otros volúmenes, recordar que en el microondas pequeños

cambios en el volumen cambiarán drásticamente la temperatura (el incremento del volumen

aumenta la temperatura).

2. Deben usarse tubos de ensayo de polipropileno, y no tubos de boro-silicato.

3. Asegurarse que la solución salina usada en el procedimiento esté fría (1-6 °C). Esto ayuda a

prevenir un rápido y excesivo calentamiento y el aumento del tiempo de exposición al microondas.

4. El modelo y la marca del horno de microondas usado no es importante; sin embargo, debe tener

controles digitales para permitir la regulación precisa de la exposición. Para simplificar la técnica

puede utilizarse una sonda de temperatura (ver Método C, más arriba), por lo que sería aconsejable

tener un microondas con esta característica.

5. La temperatura óptima para la elución del anticuerpo y la supervivencia de las células es de 45 °C.

Será necesario realizar algunas pruebas con solución salina y células en un microondas particular

para calibrar el tiempo de exposición que produce esta temperatura. A temperaturas de 50 °C o

más, usualmente ocurre hemólisis excesiva y artificios de estroma; sin embargo, algunas muestras

(generalmente aquellas que tienen una PAD fuertemente positiva) pueden tolerar altas

temperaturas y ser exitosamente eluidas conservando las células para ser fenotipificadas.

6. Durante la exposición al microondas, las temperaturas más altas se dan en la interface aire/líquido.

Si la muestra no es agitada suavemente durante el procedimiento, las células de la superficie serán

destruidas antes que las células del fondo de la muestra hayan sido adecuadamente expuestas. Por

esta misma razón, ensayar para limitar la presencia de burbujas en la superficie.

7. El número de ciclos de exposición necesarios para producir la máxima elución del anticuerpo

variará, dependiendo de la fuerza de la PAD inicial. La exposición puede ajustarse a los resultados

de la PAD. Generalmente, una PAD de 1+ requerirá 1-2 ciclos, una PAD de 2+ requerirá 3-4

ciclos, y una PAD de 3-4+ requerirá 4-5 ciclos.

8. Se utilizaron columnas de filtrado de 4.0 mL, con un tamaño de poro de alrededor de 20-25μl

(Columbia Diagnostics, catálogo número C7425P) como un “filtro modificado de suero”. Ya que

el tamaño ideal de poro es de 10μ, fue retirado el papel de filtro de 10 columnas y colocados en un

sola. Esto remueve exitosamente el estroma alterado que interfiere con la interpretación de la PAD

y la tipificación antigénica en algunos casos. La cantidad de desechos en la muestra aumentará si

se utilizan células muy frágiles o temperaturas mayores a 45 °C .

Referencias

1. McCullough JS, Torloni AS. Microwave dissociatioon of antigen-antibody complexes from red

cells: a new method for phenotyping RBC’s (abstract). Transfusion 1992;32:14S.

2. Tribble L. Personnal communication, 1993.

Método 81 – Elución por ultrasonido

Principio

Las ondas ultrasónicas son capaces de disociar el anticuerpo de la membrana eritrocitaria.

Aplicación

El eluato podrá utilizarse para estudiar los anticuerpos que estaban sensibilizando los GRs tanto in vivo

como in vitro Un eluato puede usarse para estudiar los anticuerpos que estaban sensibilizando los GRs

tanto in vivo como in vitro.


1. Baño de limpieza por ultrasonido


3. GRs a estudiar


5. Solución salina

6. Pipetas


Procedimiento



2. Mezclar 1 volumen de albúmina bovina al 6% y 2 volúmenes de paquete globular lavado en un

tubo de 13 x 100 mm.

3. Llenar el baño de limpieza por ultrasonido con agua destilada hasta (2.5 cm) del borde superior.

Encender el baño.

4. Colocar el tubo en el centro del baño, apoyando el fondo del tubo en el fondo del baño.

5. Mantener el tubo en esta posición durante 1 minuto. Periódicamente, mezclar el contenido del tubo

con una pipeta.


7. Inmediatamente trasvasar el eluato sobrenadante a un tubo limpio y estudiar en paralelo con el

sobrenadante del último lavado, incluyendo la prueba antiglobulínica indirecta (ver M22).

Notas



Referencias

1. Jimerfield CA. A rapid and simple method for preparing red RBC eluates using ultrasound. J Am

Med Technol 1977;39:187-9.

Método 82 – Elución placentaria


El tejido placentario de mujeres inmunizadas puede ser tratado para producir anticuerpo aplicable como

reactivo de tipificación sanguínea.


1. Tejido placentario (sin agregado de fijadores u otras soluciones)

2. Solución de digitonina al 5%

3. Solución salina

4. Tampón de glicina 0.1 M, pH 3.0


6. Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3


8. Tubuladura de diálisis

9. Licuadora


11. Tubos plásticos para centrífuga

12. Pipetas

13. Cubetas

14. Botellas plásticas

15. Papel de pH

16. Filtro de 0.45 μL 17. NaOH 1 N

18. HCl 1 N

19. Azida sódica al 25% en solución salina



1. Preparar la solución de digitonina: disolver 5 g de digitonina en 100 mL de solución salina.

Conservar a 4 °C.

2. Preparar el tampón de glicina 0.1 M: disolver 15 g de glicina en 2 L de agua destilada. Ajustar el

pH a 3.0 con aproximadamente 5 mL de HCl 12 N. Conservar a 4 °C.

3. Preparar el tampón fosfato 0.2 M: mezclar 80.4 mL de Na2HPO4 0.2 M (2.84 g en 100 mL de agua

destilada) y 19.6 mL de KH2PO4 0.2 M (2.72 g en 100 mL de agua destilada).

4. Preparar la PBS : Agregar 1 volumen de solución salina a 1 volumen de tampón fosfato 0.2 M.

5. Preparar el tampón fosfato 0.8 M: Mezclar 35 mL de KH2PO4 0.8 M (4.35 g en 40 mL de agua

destilada) y 965 mL de Na2HPO4 0.8 M (113.6 g en 1 L de agua destilada). Ajustar el pH a 8.2 con

NaOH 1 N o HCl 1 N. Conservar a 4 °C. Calentar a 37 °C antes de usar.

Procedimiento

1. Colocar el tejido en un recipiente lo suficientemente grande como para contener la placenta y

aproximadamente 200 mL de solución salina (el líquido debe cubrir el tejido). Traerla al

laboratorio tan pronto como sea posible. El tejido puede ser conservado a 4 °C durante 1-2 días o

congelado a –20 °C si es necesaria una conservación más larga.

2. Disecar el tejido en cuadrados de aproximadamente 2 x 2 cm (si se usa material congelado,

descongelarlo antes de comenzar el procedimiento).

3. Colocar el tejido en los tubos plásticos y centrifugar a 1000 g durante 15 minutos. Retirar y

conservar el suero para futuras pruebas de anticuerpos.

4. Colocar el material residual en una cubeta. Agregar 100 mL de solución de digitonina.

5. Agregar 200 mL de solución salina y homogeneizar en la cubeta hasta que el material sea una fina

emulsión.

6. Transferir el material a tubos plásticos y centrifugar 10 minutos. Decantar y descartar el

sobrenadante teñido con hemoglobina.

7. Lavar el material residual 4 veces con solución salina o hasta que el último lavado sea claro.

Mezclar el material residual con la solución salina durante cada lavado.

8. Volver la mezcla a la cubeta y agregar 400 mL de tampón de glicina 0.1 M. Mezclar en la cubeta

durante 1 minuto. Dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mezclar

nuevamente.

9. Trasvasar a tubos plásticos y centrifugar durante 15 minutos. Retirar el eluato sobrenadante (ver

Nota 2).

10. Ajustar el pH del eluato sobrenadante a 7.0-7.2 por diálisis contra 250 volúmenes de PBS o

ajustando rápidamente el pH agregando 1 volumen de tampón fosfato 0.8 M a 10 volúmenes del

líquido sobrenadante.

11. Mezclar bien y transferir a tubos plásticos. Centrifugar durante 10 minutos para remover cualquier

precipitado. El sobrenadante resultante es el eluato.

Notas

1. Si el tejido ha sido congelado, el procedimiento dará un eluato fuertemente teñido con

hemoglobina, pero esto no interfiere con la actividad del anticuerpo.

2. El material residual en el paso 8 de Procedimiento puede ser reemulsionado con cantidades

adicionales de 400 mL de tampón de glicina hasta que todo el anticuerpo haya sido eluido.

3. Si el eluato es conservado para futuras pruebas, agregar suficiente PBS como para conseguir una

concentración final de proteínas del 6%.

4. Agregar ázida sódica al 25% (en solución salina) hasta conseguir una concentración final de

aproximadamente 0.1% (e.j.: 0.2 mL/50 mL de eluato).

5. Para clarificar y esterilizar, filtar a través de un filtro de 0.45 L y dispensar en frascos estériles.

Conservar a 4 °C.

Referencias

1. Moulds J, Mallory D, Zodin V. Placental eluates – an economical source of antibodies (abstract).


Método 83 – Separación de mezclas eritrocitarias

Principio

La separación de una población eritrocitaria de otra que es de diferente grupo o tipo sanguíneo se puede

realizar mediante hemólisis, aglutinación, o ambas. La separación por aglutinación puede ser acelerada

mediante gradientes de densidad. Los GRs aglutinados pueden ser disgregados con azúcares específicos,

sustancias solubles grupo-específicas, o reactivos que disocian los anticuerpos IgM o IgG y dejan intactos

los GRs. Los antisueros ricos en complemento que contienen un anticuerpo hemolítico contra una de las

dos poblaciones eritrocitarias pueden causar la hemólisis de una de ellas, dejando la otra intacta. El

método elegido dependerá de la proporción de cada población, de los grupos sanguíneos a ser separados,

y del volumen eritrocitario disponible.

Aplicación

En casos de quimerismo de grupos sanguíneos (surgidos como un fenómeno natural) o después de una

transfusión sanguínea, la separación de las poblaciones eritrocitarias dará lugar a diferencias en varios

marcadores genéticos a ser determinados.

SEPARACION DE MEZCLAS ERITROCITARIAS DE DIFERENTE GRUPO ABO


1. GRs a estudiar

2. Antisueros potentes o lectinas: anti-A, anti-B, anti-A1 (Dolichos biflorus) (ver Nota 1)

3. Neutr-AB®, Baxter Diagnostic, Inc., Dade Division

4. Saliva de secretores de grupo AB, A o B como fuente de sustancias grupo específica (SGE) (ver

Nota 2)

5. Antiglobulina humana (AGH)

6. Gradientes: albúmina sérica bovina (ASB) al 30% o Ficoll-Hypaque®, gravedad específica 1.077,

Pharmacia LBK Biotechnology, Inc.

7. Solución salina

8. Pipetas



11. Incubador

12. Placa de Petri (opcional, ver Nota 3)

14. Parafilm

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 50% de los GRs a estudiar.

2. Para las mezclas de grupos A1-O o A1B-O o A1-B, agregar 2 mL de lectina anti-A1 y 0.5 mL de

la suspensión al 50% de los GRs a estudiar en un tubo de 10 x 75 mm. Tapar con Parafilm y

mezclar bien por inversión lenta del tubo durante 2 minutos. Las mezclas de grupos aparte del A1

requieren otros antisueros (ver Notas 1 y 4).

3. Centrifugar a 1000 g durante 1 minuto e invertir para romper los aglutinatos en pequeños trozos

(Para un método alternativo, ver Nota 3).

4. Pipetear 2 mL de Ficoll-Hypaque o albumina bovina al 30% en un tubo de 13 x 100 mm.

5. Usando una pipeta, aspirar la mezcla de suero-GRs y cuidadosamente transferirlo sobre el

gradiente en un tubo de ensayo.

6. Dependiendo del tamaño de los aglutinatos y la elección del gradiente, los agregados empezarán a

descender a través del gradiente y la mayoría de los GRs aglutinados alcanzarán el fondo del tubo

en 5-15 minutos.

7. Aspirar los dos tercios superiores de los GRs por encima del gradiente en un tubo rotulado “O”; el

otro tercio puede contener GRs de grupo O y algunos de grupo A en pequeños agregados.

8. Aspirar por succión la suspensión restante por encima del gradiente y todo el gradiente debajo de

los GRs aglutinados en el fondo. Rotular este tubo “A” y lavar los GRs aglutinados dos veces con

solución salina.

9. Desagregar los GRs de grupo A agregando SGEA o NeutrAB de acuerdo al porcentaje estimado

de GRs A en la mezcla. Para mezclas que contienen más del 30% de GRs de grupo A, usar 1 mL

de SGEA; 35-60%, usar 2 mL; y sobre el 60%, usar 3 mL.

10. Cuando los GRs han sido dispersados, lavar 3 veces con solución salina y hacer una prueba de

antiglobulina directa (PAD). Si la PAD es positiva, tratar los GRs con glicina-EDTA (ver M49) o

cloroquina (ver M51) y volver a realizar la PAD.

Notas

1. Las mezclas de GRs de grupo A2-O, A2-B, B-O, y A2B-B requerirán antisueros aparte de lectina

anti-A1 para separar las dos poblaciones porque no hay disponibles lectinas específicas para A2 o

una fuente práctica de lectina anti-B. El anti-A y el anti-B deben seleccionarse de un grupo

aleatorio de individuos de grupo B y A2 antes que de origen comercial porque éstos últimos

contienen un anticuerpo IgG apreciable que podría causar que los GRs aglutinados tengan una

PAD positiva y por consiguiente interferir con la tipificación hecha por la prueba antiglobulínica.

El anti-A y el anti-B deben estudiarse sobre muestras de GRs conocidos para su habilidad de

producir una fuerte aglutinación y fácil dispersión sin dejar una PAD positiva. Si se usan el anti-A

o anti-B comercial, disociar los GRs aglutinados como se indica en el paso 10, más arriba.

2. Puede usarse la saliva de individuos secretores de grupo AB, A o B como fuente de SGE. La saliva

debe ser hervida durante10 minutos, centrifugada para remover las partículas materiales, y diluida

con igual cantidad de solución salina para asegurarse su isotonicidad.

3. El método alternativa para los pasos 2 y 3 de este procedimiento puede hacerse en una placa de

Petri. Si una de las poblaciones es mucho menor que la otra será necesario tratar un gran número

de alícuotas

a. Agitar la placa hasta que los aglutinatos no parezcan seguir agrandándose. Si los aglutinatos

son muy pequeños, verter el contenido dentro de un tubo y centrifugar. Volver el contenido a la

placa.

b. Inclinar la placa hasta que todo el contenido se aglomere en un extremo, entonces inclinar

lentamente la placa en la otra dirección. La mayoría de los aglutinatos grandes quedarán detrás

mientras que los GRs libres se moverán hacia el otro extremo.

c. Pipetear los GRs libres en un tubo rotulado “O” y, usando solución salina, enjuagar los GRs

aglutinados dentro de un tubo apropiadamente rotulado.

d. Estudiar en cada una de las separaciones eritrocitarias la contaminación con GRs del otro

grupo. Si la separación no es completa, usar un gradiente como se delineó en Procedimiento,

pasos 4-8, más arriba.

4. Para mezclar A-B, pueden usarse anti-A y anti-B hemolíticos para lisar una población, dejando la

otra intacta. La prueba requiere una substancial relación suero a células y una temperatura óptima

de incubación de 37 °C durante 30 minutos. Puesto que algunos GRs pueden ser resistentes a

cualquier hemolisina, será necesario centrifugar una pequeña alícuota de cada combinación suero-

GRs y observar microscópicamente en busca de aglutinación o realizar una PAD y examinarla

microscópicamente.

Comentarios

Una comparación realizada por Winkler de tres gradientes para facilitar la separación de GRs aglutinados

de los no aglutinados estableció lo siguiente:

1. Debe tenerse cuidado cuando se vuelca la suspensión globular (con aglutinatos) sobre cada uno de

los gradientes y especialmente cuando se usa dextrosa al 20%. Si el volumen o la concentración de

la suspensión globular es muy grande, puede ocurrir un derrame En la placa de Petri gotas enteras

de la suspensión globular caen directamente a través de la capa densa de dextros dejando una

estela detrás que interfiere con una buena separación.

2. El tiempo involucrado en la técnica de separación varía con la densidad del gradiente que fue

usado. El gradiente de dextrosa al 20% permite completar el proceso en 1-2 minutos, el Ficoll en

alrededor de 5 minutos, y la ASB al 30% en aproximadamente 10 minutos.

3. Se observó que los aglutinatos se disgregan más fácilmente cuando fueron usados como gradiente

Ficoll o dextrosa al 20% que cuando se usó ASB al 30%.

4. Ninguno de los tres gradientes causó una PAD positiva en los GRs libres.

Una segunda comparación realizada por Soave de gradientes con 20% de células A y 80% de células O u

80% de células A mezcladas con 20% de células O, confirmó los hallazgos de Winkler y sumó

observaciones adicionales:

1. Los tubos de 13 x 100 mm produjeron una columna más larga y estrecha que los tubos de 16 x 100

mm, permitiendo que fueran recuperados más GRs no aglutinados.

2. No debe usarse ASB al 22% en lugar de ASB al 30% porque permite el deslizamiento de los GRs

a través del gradiente.

3. El Ficoll produjo una separación más rápida y limpia de los GRs aglutinados y no aglutinados.

Referencias

1. Booth PB, Plaut G, James JD, et al. Blood chimerism in a pair of twins. Brit Med J 1957;i:1456-7.

2. Beattie KM, Zuelzer WW, McGuire DA, Cohen F. Blood group chimerism as a clue to generalizes

tissue mosaicism. Transfusion 1964;4:77-86.

3. Beattie KM. Personal observation, 1985.

4. Cohen DW. A simple procedure for separation dual red blood cell populations after differential

agglutination. Red Cell Free Press (American Red Cross Blood Services) 1977;2(2):4.

5. Pierce S. Personal communication, 1985.

6. Winkler M. Personal communication, 1985.

7. Soave J. Personal communication, 1985.

SEPARACION DE MEZCLAS ERITROCITARIAS DE DIFERENTES SISTEMAS DE GRUPO

SANGUINEO APARTE DEL ABO


1. GRs a estudiar

2. Antisuero potente (ver Nota 1)


4. Gradientes: albúmina sérica bovina (ASB) al 30% o Ficoll-Hypaque®, gravedad específica 1.077,

Pharmacia LBK Biotechnology, Inc.

5. Solución salina

6. Pipetas



9. Incubador

10. Parafilm

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 50% de los GRs a estudiar.

2. Agregar 0.5 mL de antisuero y 0.2 mL de la suspensión al 50% de los GRs en tubo de 10 x 75 mm.

Tapar con Parafilm y mezclar bien.

3. Incubar la mezcla a la temperatura y tiempo apropiados para el antisuero que fue usado.

4. Centrifugar a 1000 g durante 1 minuto e invertir para romper los aglutinatos en pequeños trozos.

Repetir la centrifugación e invertir lentamente para disgregar los aglutinatos.

5. Pipetear 2 mL de Ficoll-Hypaque o ASB al 30% en un tubo de 13 x 100 mm.

6. Usando una pipeta, aspirar la mezcla de suero-GRs y cuidadosamente transferirlo sobre el

gradiente en un tubo de ensayo.

7. Dependiendo del tamaño de los aglutinatos, los agregados empezarán a descender a través del

gradiente y la mayoría de los GRs aglutinados alcanzarán el fondo del tubo en 5-10 minutos.

8. Aspirar los dos tercios superiores de los GRs por encima del gradiente en un tubo marcado

“negativo”.

9. Aspirar por succión, la suspensión restante porencima del gradiente dejando los GRs aglutinados

en el fondo. Rotular este tubo “positivo” y lavar los GRs aglutinados dos veces con solución

salina.

10. Desagregar los GRs aglutinados en el tubo rotulado “positivo”. Si ha sido usado un anticuerpo

IgM, el desagregado puede llevarse a cabo con DTT (ver M28). Si fue usado un anticuerpo IgG, se

requerirá glicina-EDTA (ver M49) o cloroquina (ver M51) para disociar la IgG de los GRs

aglutinados.

11. Cuando los GRs han sido dispersados, lavar 3 veces con solución salina y hacer una PAD.

Notas

1. Pueden usarse otros sueros tipificadores para separar las poblaciones de GRs. Cuando sea posible,

debe seleccionarse anticuerpo IgM para la separación, e.j., anti-M o anti-N (el suero de conejo es

adecuado). Si van a ser separados GRs Rh positivos de GRs Rh negativosy los GRs positivo son

tanto C+ o E+, un anti-C o un anti-E pueden ser una mejor elección que un anti-D.

Referencias

1. Booth PB, Plaut G, James JD, et al. Blood chimerism in a pair of twins. Brit Med J 1957;i:1456-7.

2. Beattie KM, Zuelzer WW, McGuire DA, Cohen F. Blood group chimerism as a clue to generalizes

tissue mosaicism. Transfusion 1964;4:77-86.

3. Beattie KM. Personal observation, 1985.

4. Cohen DW. A simple procedure for separation dual red blood cell populations after differential

agglutination. Red Cell Free Press (American Red Cross Blood Services) 1977;2(2):4.

Método 84 – Recuperación de neocitos autólogos dpor centrifugación de microhematocrito

Principio

Los GRs recientemente liberados por la médula ósea (neocitos) son menos densos o más livianos que los

GRs maduros, más viejos. Una centrifugación rápida hace que los GRs más jóvenes se eleven hacia la

parte superior y los GRs más viejos y pesados bajan hacia el fondo.

Aplicación

La separación de los GRs autólogos de los transfundidos se hace necesaria cuando los GRs de pacientes

recientemente transfundidos se precisan en el proceso de identificación de alo o autoanticuerpos

eritrocitarios. Estas células pueden usarse para fenotipificación, prueba de antiglobulina directa y

autoadsorción.


1. GRs a estudiar en EDTA (recogidos recientemente, usados preferiblemente dentro de las 24 horas)

(ver Nota 1)

2. Tubos para centrífuga de microhematocrito (comunes, no heparinizados)

3. Seal-Ease®, masilla plástica, Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division

4. Jeringa plástica de 2 mL con aguja 23 G

5. Lima de ampollas o lima triangular pequeña


7. Solución salina

8. Centrífuga para microhematocrito


Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces con solución salina. Para el último lavado centrifugar a 1000 g durante 15

minutos. Sacar todo el sobrenadante de solución salina que sea posible sin alterar la capa de

leucocitos.

2. Mezclar el paquete globular lavado completa y frecuentemente durante el proceso de llenado.

3. Llenar 10 tubos de microhematocrito hasta la marca de 55 mm con los GRs compactados.

4. Sellar los extremos del tubo de microhematocrito con Seal-Ease.

5. Centrifugar en una centrífuga de microhematocrito (12.000-15.000 rpm) durante 15 minutos.

6. Cortar los tubos con una lima.

7. Recoger 5 mm de la capa de arriba de GRs enjuagando la capa superior de GRs de los tubos

cortados en un tubo de ensayo limpio usando una jeringa llena con solución salina y una aguja de

23 G

8. Lavar los GRs separados y resuspenderlos al 4% en solución salina.

9. Estos GRs separados (neocitos) están listos para su uso.

Interpretación

La tipificación con campo mixto de los GRs separados indica un intento no exitoso de recolectar

reticulocitos. Puede ser necesario usar M85 o M86, o en el caso de pacientes con drepanocitosis . M87.

Notas

1. Se consigue una mejor separación cuando se utiliza una muestra recolectada por lo menos 3 días

después de la transfusión.

Referencias

1. Reid ME, Toy P. Simplified method for recovery of autologous red blood cells from transfused

patients. Am J Clin Pathol 1983;79:364-6.

2. Constandoulakis M, Kay HEM. Observations on the centrifugal segregation of young

erythrocytes: a possible method of genotyping the transfused patient. J Clin Pathol 1959;12:312-

18.

3. Herz S, Kaplan E. A microtechnique for the separation of erythrocytes in accordance with their

density. Am J Clin Pathol 1965;35:181-3.

4. Renton PH, Hancock JA. A simple method of separating erythrocytes on the basis of RBC age.

Vox Sang 1964;9:183-6.

5. Regas DA, Kaler RD. Ultracentrifugal fractionation of human erythrocytes on the basis of RBC

age. Lab Clin Med 1961;58:242-6.

Método 85 – División por densidad de los GRs usando ésteres de ftalatos

Principio

Los GRs recientemente liberados por la médula ósea tienen una gravedad específica de aproximadamente

1.078. A medida que los GRs envejecen, se van haciendo más densos y su gravedad específica alcanza

1.114. Basado en esta diferencia de pesos, los GRs más viejos y pesados del dador pueden ser separados

de los neocitos autólogos más livianos del paciente recientemente transfundido por centrifugación en

ésteres de ftalatos de varias gravedades específicas. Se usan las mezclas de ésteres de ftalatos con

gravedades específicas con un rango desde 1.074 hasta 1.114 para determinar la distribución por densidad

globular midiendo la altura de la columna eritrocitaria debajo de cada éster. Esta medición es graficada

contra la gravedad específica del éster y comparada con una curva de distribución normal.

Aplicación

Este procedimiento permite una rápida evaluación del lapso de vida de GRs con una prueba

antiglobulínica directa (PAD) positiva y una evaluación de la distribución del anticuerpo sobre los GRs

jóvenes y maduros. Cuando se usan conjuntamente, la distribución de anticuerpo y la posición en la curva

brinda una importante información diagnóstica (ver Nota 1). Los neocitos autólogos pueden usarse para

fenotipificación cuando el paciente ha recibido transfusiones recientemente.


1. Tubos capilares/de microhematocrito no heparinizados.

2. Seal-Ease®, masilla plástica, Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division

3. Centrífuga de microhematocrito

4. Jeringa plástica de 2 mL

5. Agujas 23 G

6. Sangre entera recolectada recientemente en EDTA (dentro de las 24 horas)

7. Lima de ampollas o lima triangular pequeña

8. Tubos cónicos de centrífuga, graduados de 12 mL

9. Esteres de dibutil ftalato y dimetil ftalato

10. Balanza


Ver Notas 2 y 3.

1. Por peso: colocar los tubos cónicos en una balanza que mida con exactitud hasta tres decimales

(1,000). Agregar cada éster como se muestra en la Tabla 85-1.

Tabla 85-1: Preparación de la Mezcla de Esteres de Ftalato por peso

Nº de mezcla Gravedad específica Dimetil Ftalato (gs) Dibutyl Ftalato (gs)

1

2

1.114

1.110

5.499

5.792

5.641

5.308

3

4

5

6

7

8

9

10

1.106

1.102

1.098

1.094

1.090

1.086

1.082

1.078

6.086

6.379

6.672

6.966

7.259

7.552

7.845

8.139

4.974

4.641

4.308

3.974

3.641

3.308

2.975

2.641

2. Por volumen: Usar tubos cónicos de centrífuga graduados (ver Tabla 85-2).

Tabla 85-2: Preparación de la Mezcla de Esteres de Ftalato por volumen

Nº de mezcla Gravedad específica Dibutyl Ftalato

(mL)

Dimetil Ftalato

(mL)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1.110

1.106

1.102

1.098

1.094

1.090

1.086

1.082

1.078

1.074

4.8

5.1

5.3

5.6

5.8

6.0

6.3

6.5

6.8

7.0

4.2

3.9

3.7

3.4

3.2

3.0

2.7

2.5

2.2

2.0

3. Agregar primero 1 éster a todos los tubos y permitir que el éster viscoso sedimente. Reajustar el

volumen, si es necesario, antes del agregado del segundo éster.

Procedimiento

1. Lavar los GRs del paciente 4 veces con solución salina. Para el último lavado, centrifugar la

muestra a 1000 g durante 10 minutos. Retirar todo el sobrenadante de solución salina que sea

posible sin aspirar los GRs.

2. Mezclar la muestra globular completamente por inversión. Tanto la muestra globular como los

ésteres deben estar a temperatura ambiente.

3. Para cada densidad del éster de ftalato, llenar un tubo capilar hasta la marca de 5 mm y agregar los

GRs hasta la marca de 60 mm (ver Fig. 85-1).

4.Sellar el extremo seco de cada tubo con Seal-Ease.

5. Centrifugar los 10 tubos en una centrífuga de microhematocrito durante 10 minutos.

6. Para recolectar los neocitos:

a. Examinar todos los tubos y elegir el tubo en el cual 5 mm de GRs estén por encima de la capa

de éster. Preparar más tubos de aquella densidad. Por ejemplo, ver el tubo n° 8 que muestra la

Fig. 85-2, más arriba.

b. Usando una lima, cortar los tubos de microhematocrito a la altura de la interface del ftalato y

debajo de la capa globular.

c. Enjuagar la capa superior de GRs de los tubos cortados usando una jeringa llena con solución

salina y una aguja de 23 G.

d. Lavar bien los GRs separados antes de estudiarlos.

7. Graficar la distribución por densidad de los GRs, graficar el porcentaje de GRs por encima del

éster versus la gravedad específica del éster (ver Nota 6 y Fig. 85-3).

Fig. 85-1

Fig. 85-2

Notas

1. Este método fue usado originalmente para recolectar neocitos autólogos para usarlos para resolver

la tipificación antigénica eritrocitaria en pacientes transfundidos. Desde aquel momento, el método

simplificado de centrifugación de microhematocrito (ver M84) ha probado ser más útil para aquel

propósito.

2. Los autores afirman que la preparación de los ésteres por peso otorga resultados más precisos. Es

esencial el cuidado en la preparación de la mezcla de los ésteres por volumen.

3. Conservar los ésteres preparados en botellas marrones a resguardo de la luz.

4. Se consigue una mejor separación de los neocitos cuando la muestra es recolectada durantelo

menos 3 días después de la transfusión.

5. Un rendimiento pobre de neocitos autólogos puede ser causado por aplasia de la médula ósea o por

muestras de sangre de más de 24 horas de extraídas. Los GRs autólogos de pacientes con anemia

falciforme pueden recuperarse mediante lavado hipotónico (ver M87).

6. Muchos factores afectan la curva de densidad (e.j., presencia de esferocitos y reticulocitos) y hay

muchas razones por las cuales el paciente puede ser portador de una PAD positiva (e.j., drogas y

auto o aloanticuerpos).

Referencias

1. Wallas CH, Tanley PC, Garrell LP. Utilization of a cell separation technique to evaluate patients

with a positive direct antiglobulin test. Transfusion 1982;22:26-30.

2. Wallas CH, Tanley PC, Gorrell EP. Recovery of autologous erythrocytes in transfused patients.


Ejemplo de un capilar para microhematocrito preparado

para separación de GRs por éteres de ftalato

Capa de glóbulos rojos

Capa de éster

Punta sellada

Patrones de densidades luego de la centrifugación en una serie

de tubos capilares convencionales

3. Wallas CH. Personal communication, 1992.

Fig. 85-3: Ejemplos de Curvas de densidad

Método 86 – Separación celular con Percoll® - Renografin®


Los GRs autólogos puede ser separados de los transfundidos usando un gradiente de densidad. Los GRs

autólogos obtenidos pueden utilizarse para fenotipificación, prueba de antiglobulina directa (PAD),

adsorción o elución.


1. Percoll, Sigma Chemical Co.

2. Renografin 60, medio de contraste de rayos X, ER Squibb & Sons

3. Solución de cloruro de sodio 0.15 M

4. 20 mL de sangre entera fresca (24 horas en heparina, EDTA, ACD, CPD, CPDA-1)

5. Jeringa de 20 mL

6. Centrífuga adecuadamente calibrada (de alta velocidad, refrigerada, con un rotor angular)

7. Celulosa microcristalina, Sigma Chemical Co.

8. Alfa celulosa, Sigma Chemical Co.

9. Recipiente de 100 mL

10. Recipiente de 50 mL

11. Tubos de polialomero para ultracentrífuga de 11.5 mL

12. Agua destilada


14. Hidrómetro que pueda medir una gravedad específica de 1.095

15. Osmómetro

Procedimiento

1. Preparar el gradiente de densidad mezclando 35 mL de Percoll, 15 mL de Renografin, 22 mL de

ClNa 0.15 M, y 28 mL de agua destilada en un recipiente de 100 mL (ver Nota 1).

2. Llenar el cuerpo de la jeringa con aproximadamente 2-5 cm de celulosa microcristalina y alfa

celulosa en una relación 1:1 por peso.

3. Llenar la jeringa con sangre entera y, usando el émbolo, expulsar lentamente la sangre de la

jeringa en un recipiente de 50 mL. Esto deplecionará la sangre de glóbulos blancos y plaquetas.

4. Centrifugar la sangre a 1000 g durante 5 minutos. Descartar el plasma.

5. Mezclar 1 mL de paquete globular con 10 mL del medio de gradiente de densidad.

6. Colocar 5 mL de la mezcla en un tubo de polialomero apropiado.

7. Centrifugar a 35.000 x g durante exactamente 5 minutos a 4 °C.

PAD + Células Esferocitosis

Hereditaria

8. Remover las capas superiores (consistentes en los 1.3 cm por encima del menisco) de GRs

(reticulocitos) y colocarlo en un tubo de ensayo.

9. Lavar los reticulocitos 4 veces con solución salina.

10. Conservar a 4 °C en solución de Alsever hasta que se necesiten.

Notas

1. La gravedad específica del gradiente de densidad debe ser de 1.095 y la osmolalidad debe ser de

300± 5 mOsm/kg. Estos parámetros son críticos y necesitan ser verificados por mediciones

apropiadas.

2. Las bandas inferiores contienen GRs autólogos más viejos y GRs transfundidos.

3. Para obtener resultados confiables, los GRs autólogos solo pueden ser fenotipificados usando esta

técnica al menos 48 horas después de la última transfusión.

Referencias

1. Branch DR et al. Erythrocyte age-fractionation using a Percoll-Renografin density gradient:

application to autologous red cell antigen determinations in recently transfused patients. Am J Clin

Pathol 1983;80:453-8.

Método 87 – Recuperación de los GRs falciformes por lavado hipotónico

Principio

Los GRs de pacientes con anemia falciforme (HbSS o HbSC) son más resistentes a la lisis en soluciones

de solución salina hipotónica que los GRs normales.

Aplicación

los GRs de pacientes que contienen HbSS o HbSC pueden aislarse rápidamente de los GRs transfundidos

(HbAA o HbAS) por el lavado con solución solución salina hipotónica (0.3%) gracias a su resistencia a la

tensión osmótica,. Una vez aislados, estos GRs autólogos son útiles en la evaluación de la prueba de

antiglobulina directa (PAD) y cuando está indicada una mayor información del fenotipo o una

autoadsorción.


1. Solución salina 0.3%

2. Solución salina 0.9%

3. GRs anticoagulados de pacientes recientemente transfundidos con anemia falciforme (ver Nota 1)

4. Tubos de ensayo (12 x 75 mm o 16 x 100 mm)

5. Pipetas


7. Probetas graduadas y/o matraces

8. Jeringa de 5 cc (opcional)

9. Lana de nylon (opcional)


1. Preparar el NaCl 0.3% disolviendo 3 g de NaCL, reactivo de calidad, en 1 L de agua destilada o

colocando 30 mL de solución salina al 0.9% en una probeta graduada y diluyendo hasta la marca

de 90 mL con agua destilada.

Procedimiento

1. Colocar 4-5 gotas de paquete globular, lavado en un tubo de 12 x 75 mm (ver Nota 2).

2. Lavar estos GRs 4-6 veces (o hasta que la hemólisis más grosera se aclare) con solución salina

0.3%, mezclando entre cada lavado. Centrifugar cada lavado a 1000 g durante 1 minuto. Descartar

el sobrenadante manualmente con una pipeta (ver Nota 3).

3. Lavar los GRs lavados hipotónicamente (solución salina al 0.3%) dos veces con solución salina al

0.9% para restaurar la tonicidad. Centrifugar este lavado final a 200 g durante 2 minutos. La

centrifugación a baja velocidad facilita la remoción de cualquier estroma residual.

4. Los GRs deben ser llevados a una suspensión en solución salina al 0.9% para usarlos en

fenotipificación o evaluación de la PAD o empaquetados para usarlos en procedimientos de

autoadsorción (ver Nota 4).

Notas

1. Para obtener el máximo rendimiento de GRs autólogos, las muestras deben ser recogidas en EDTA

y probadas dentro de los 4 días de su recolección.

2. Se requerirán grandes volúmenes de GRs si el paciente ha recibido múltiples transfusiones o si los

GRs son usados en procedimientos de autoadsorción. En estas situaciones, se recomienda el lavado

de grandes volúmenes de GRs en tubos de 16 x 100 mm para obtener un volumen suficiente de

GRs.

3. Se notará la hemólisis de los GRs del donante. Una cierta población de GRs autólogos (HbS)

también podrá ser lisada, porque algunos GRs no son tan resistentes a la tensión hipotónica.

4. Los glóbulos blancos no parecen ser lisados en soluciones hipotónicas. Los pacientes con células

falciformes], especialmente aquellos en crisis, con frecuencia tienen un recuento de blancos

elevado. Un exceso de glóbulos blancos puede causar un botón eritrocitario “pegajoso” cuando son

probados los GRs autólogos. Sacar el exceso de glóbulos blancos usando lana de nylon

(preferentemente) o gaza como sigue:

a. Calentar a 37°C la solución salina, una jeringa de 5 cc conteniendo una pequeña cantidad de

lana de nylon en el fondo, y la suspensión de los GRs.

b. Cebar la jeringa caliente con la solución salina caliente, agregando solución salina a la jeringa

y permitiéndole pasar completamente a través del filtro de lana de nylon.

c. Agregar la suspensión eritrocitaria calentada a la jeringa y permitir que pase a través del filtro.

Se obtiene un mejor rendimiento de GRs si la suspensión globular es ligera; por consiguiente,

agregar solución salina caliente a la suspensión globular previo al proceso de filtrado.

Referencias

1. Hare V. Use of the manual Polybrene test and cell separation techniques to aid in antibody

identification. Durham, NC: NCABB, 1987.

2. Brown D. A rapid method for harvesting autologous RBCs from patients with hemoglobin S

disease. Transfusion 1988;28:21-3.

3. Harris JW. Globin biosynthesis and sickle RBC disease. In: The red cell, production, metabolism,

destruction: normal and abnormal. Cambridge, MA: Harvard University Press, 1963:65-105.

Método 88 – Preparación y uso de GRs cubiertos con penicilina

Principio

Los GRs fijan la penicilina firmemente a través del grupo β-lactámico.

Aplicación

Los GRs recubiertos con penicilina se utilizan para demostrar en suero o eluatos la presencia de

anticuerpos hacia la penicilina.


1. Solución salina tamponada con Barbital (STB), pH 9.6

2. 2 mL de GRs de grupo O (ver Nota 1)

3. Penicilina G potásica), 1 x 106 unidades (aproximadamente 600 mg)

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Tubos de ensayo




10. Suero de control positivo y negativo



1. Preparar el STB: Disolver 20.6 g de barbital sódico en 1 L de solución salina. Ajustar el pH a 9.6

con HCl 0.2 N (aproximadamente 15 mL). Conservar a 4 °C. Preparar tampón fresco cada 6

meses. Puede ser substituido por un tampón de ácido bórico, pH 9.6 (ver Nota 2).

2. Lavar los GRs de grupo O 3 veces con solución salina y remover completamente el sobrenadante

después del último lavado.

3. Disolver 1 x 106 unidades (aproximadamente 600 mg) de penicilina G potásica en 15 mL de STB.

4. Agregar la penicilina diluida a 1 mL de paquete globular lavado de grupo O. Agregar 15 mL de

STB a otra alícuota de 1 mL.

5. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Agitar suavemente la mezcla

periódicamente.


7. Resuspender los GRs al 5% en solución salina antes de usar.

Procedimiento

1. Agregar 1 gota de GRs cubiertos con penicilina a 2 gotas del suero o eluato a estudiar.

2. En un segundo tubo, agregar 1 gota de los GRs de grupo O no tratados a 2 gotas del suero o eluato

del paciente (ver Nota 3).

3. Preparar el suero de control positivo y negativo de la misma manera del paso 1, más arriba.

4. Incubar las pruebas y los controles (ver controles más abajo) a 37 °C durante30 minutos.

5. Centrifugar a 1000 g durante 15 segundos. Inspeccionar en busca de hemólisis y aglutinación.

6. Lavar los GRs 4 veces en solución salina y decantar completamente el último lavado.

7. Agregar AGH al botón globular. Mezclar, centrifugar y leer.

8. Agregar GRs cubiertos con IgG a todas las pruebas negativas, centrifugar y leer en busca de

aglutinación. Repetir todas las pruebas negativas que no hayan aglutinado con la adición de los

GRs cubiertos con IgG.

Controles

1. GRs: GRs de grupo O no tratados (ver Nota 3).

2. Suero: Suero de control positivo de un paciente con anticuerpos hacia la penicilina conocido.

3. Suero: Suero de control negativo que carezca de anticuerpos hacia la penicilina.

Interpretación

1. El suero con anticuerpos IgM hacia la penicilina pueden hemolizar los GRs tratados con

penicilina, pero, usualmente, sólo se ve aglutinación. Los anticuerpos IgG reaccionan con la

prueba antiglobulínica.

2. No debe observarse reacción con los GRs no tratados a menos que haya presente aloanticuerpos.

3. La mayoría de los sueros humanos contienen anticuerpos IgM de bajo título hacia la penicilina.

Los pacientes con anemia causada durantela penicilina tendrán IgG anti-penicilina de alto título en

su suero y el anticuerpo podrá ser recuperado en un eluato.

Notas

1. Los GRs tratados con penicilina pueden mantenerse durantevarias semanas si se conservan en

solución de Alsever a 4 °C o pueden ser conservados congelados.

2. Para preparar el tampón de ácido bórico, pH 9.6-10, mezclar 5.16 g de ácido bórico, 2.2 g de KCl,

y 600 mL de agua destilada. Ajustar el pH con NaOH 0.1 N. Diluir hasta 1 L con agua destilada.

Conservar a 4 °C.

3. El propósito de usar los mismos GRs de grupo O no tratados con penicilina es establecer que la

reactividad del suero (o eluato) a estudiar con los GRs sensibilizados con la droga (si se observa)

no se debe a la presencia de anticuerpos no relacionados con la droga (e.j., un aloanticuerpo

específico) que detectan antígenos presentes en los GRs usados para la sensibilización con la

droga.

4. Algunas reacciones con drogas pueden requerir la presencia de sangre entera o plasma para que la

droga se fije a los GRs (e.j., tetraciclina). Otras drogas pueden necesitar ser conjugadas a los GRs

con cloruro de cromo.

Referencias

1. Garratty G. Laboratory investigation of drug-induced immune hemolytic anemia. In: A seminar on

laboratory management of hemolysis (suppl). Washington, DC: 32nd annual AABB meeting.

1979:1-8.

2. Garratty G. Current viewpoints on mechanisms causing drug-induced immune hemolytic anemias

and/or positive direct antiglobulin tests. Immunohematology 1989;5:97-106.

3. Wenz B, Klein RL, Lalezari P. Tetracycline-induced hemolytic anemia. Transfusion 1974;14:265-

9.

4. Orenstein AA, Yakulis V, Eipe J, et al. Immune hemolysis due to hydralazine (letter). Ann Intern

Med 1977;86:40.

Método 89 – Preparación y uso de GRs cubiertos con Keflin®

Principio

Las cefalosporinas se fijan firmemente a la membrana eritrocitaria.

Aplicación

Los GRs cubiertos con Keflin se usan para demostrar anticuerpos hacia el Keflin u otras cefalosporinas en

suero o eluatos.


1. Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (ver M133)

2. 2 mL de GRs de grupo O

3. 400 mg de Keflin cefalotina sódica

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Tubos de ensayo



9. Antiglobulina humana (AGH) (poliespecífica o IgG)





1. Lavar GRs de grupo O 3 veces con solución salina, y concentrarlos.

2. Disolver 400 mg de Keflin en 10 mL de PBS.

3. Agregar 10 mL de solución de Keflin a 1 mL de los GRs de grupo O empaquetados y lavados.

Agregar 10 mL de PBS a otra alicuota globular de 1 mL para el control.

4. Mezclar e incubar a 37 °C durante1 hora. Agitar suavemente la mezcla periódicamente durante

este tiempo.


6. Resuspender los GRs al 5% en solución salina antes de usar (ver Nota 1).

Procedimiento

1. Diluir el suero 1:20 con PBS antes de estudiarlo. Los eluatos no necesitan ser diluidos.

2. Agregar 2 gotas del eluato o el suero diluido del paciente a 1 gota de los GRs cubiertos con Keflin.

3. En un segundo tubo, agregar 2 gotas del eluato o suero diluido del paciente a 1 gota de GRs no

tratados.

4. Preparar el suero de control positivo y negativo de la misma manera del paso 2, más arriba (ver

Controles, más abajo).

5. Incubar las pruebas y los controles a 37 °C durante30 minutos.

6. Centrifugar a 1000 g durante1 minuto. Inspeccionar en busca de hemólisis y aglutinación.

7. Lavar los GRs 4 veces en solución salina y decantar completamente el sobrenadante del último

lavado.

8. Agregar AGH al botón globular. Mezclar, centrifugar y leer.

9. Agregar GRs cubiertos con IgG a todas las pruebas negativas, centrifugar y leer en busca de

aglutinación. Repetir todas las pruebas negativas que no hayan aglutinado con la adición de los

GRs cubiertos con IgG.

Controles

1. GRs: GRs de grupo O no tratados (ver Nota 2).

2. Suero: Suero de control positivo (diluido 1:20 con PBS) de un paciente que sepamos tiene

anticuerpos hacia los GRs tratados con Keflin.

3. Suero: Suero de control negativo (diluido 1:20 con PBS) que carezca de anticuerpos hacia los GRs

tratados con Keflin.

Interpretación

No debe observarse reacción con los GRs no tratados a menos que haya presente aloanticuerpos. Una

reacción positiva con los GRs tratados usualmente indica la presencia de un anticuerpo hacia el Keflin o

una reacción cruzado con un anticuerpo hacia la penicilina.

Notas

1. Los GRs tratados con Keflin pueden mantenerse durantevarias semanas si se conservan en

solución de Alsever a 4 °C o pueden ser conservados congelados.

2. El propósito de usar los mismos GRs de grupo O no tratados con Keflin es establecer que la

reactividad del suero (o eluato) a estudiar con los GRs sensibilizados con la droga (si se observa)

no se debe a la presencia de anticuerpos no relacionados con la droga (e.j., un aloanticuerpo

específico) que detectan antígenos presentes en los GRs usados para la sensibilización con la

droga.

3. El suero a estudiar debe ser diluido antes de estudiarlos con los GRs tratados con Keflin para evitar

reacciones falso positivas. Tal dilución es necesaria porque los GRs tratados con Keflin tienen la

propensión de adsorver todas las inmunoglobulinas no inmunológicamente, incluyendo IgG y C3,

los cuales producirán una prueba antiglobulínica directa positiva.

4. Las cefalosporinas de tercera generación tales como cefotaxima, cefoperazona, ceftazidime,

ceftizoime, ceftriaxona y moxalactam pueden reaccionar duranteel mecanismo de

inmunocomplejos.

5. Algunas drogas pueden requerir la presencia de sangre entera o plasma para fijarse a los GRs (e.j.,

tetraciclina). Otras drogas pueden necesitar ser conjugadas a los GRs con cloruro de cromo.

Referencias


laboratory management of hemolysis (suppl). Washington, DC: 32nd annual AABB meeting.

1979:1-8.

2. Garratty G. Current viewpoints on mechanisms causing drug-induced immune hemolytic anemias

and/or positive direct antiglobulin tests. Immunohematology 1989;5:97-106.

3. Wenz B, Klein RL, Lalezari P. Tetracycline-induced hemolytic anemia. Transfusion 1974;14:265-

9.

4. Orenstein AA, Yakulis V, Eipe J, et al. Immune hemolysis due to hydralazine (letter). Ann Intern

Med 1977;86:40.

Método 90 – Detección de anticuerpos hacia la penicilina y el Keflin® duranteaglutinación directa

Principio

Los GRs tratados con antibióticos pueden ser aglutinados directamente duranteanticuerpos IgM o IgG

dirigidos hacia la penicilina o el Keflin utilizando suero normal de conejo y dextrán en el sistema de

prueba

Aplicación

Este método es recomendado para superar los problemas de resultados no específicos usando la prueba

antiglobulínica (PAG) con GRs tratados con Keflin y para estudios en gran escala durantelo cual la PAG

no es conveniente.


1. Tampón TRIS hidroximetil aminometano, pH 8.2

2. Dextran al 6%

3. Suero normal de conejo obtenible de los fabricantes de reactivos (ver Nota 1), National Production

Laboratory, American Red Cross

4. Diluyente

5. GRs tratados con penicilina o Keflin (ver M88, M89)

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas




1. Preparar el diluyente como sigue: Mezclar 50 mL de tampón TRIS, 25 mL de dextran, y 1 mL de

suero de conejo. El reactivo debe ser preparado recientemente antes de usar.

Procedimiento

1. Agregar 1 gota del suero del paciente y 1 gota de diluyente a 1 gota de los GRs tratados con

antibiótico al 2%.

2. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante1 hora.

3. Centrifugar a 1000 g durante1 minuto. Leer en busca de aglutinación.

Notas

1. El suero de conejo debe ser probado para mostrar que no es reactivo con los GRs tratados con

penicilina o Keflin cuando ha sido diluido 1:75.

Referencias

1. Levine BB, Fellner MJ, Levytska V. Benzylpenicilloyl specific serum antibodies to penicilin in

man. J Immunol 1966;96:707-18.

CR8

Método 91 – Detección de anticuerpos anti-penicilinas semisintéticas


Para la investigación de pruebas antiglobulínicas directas positivas inducidas por droga asociadas con la

terapia con penicilina es necesario utilizar soluciones específicas isoosmolares para preparar GRs

cubiertos con penicilinas semisintéticas. Este método es también útil para detectar anticuerpos hacia las

cefalosporinas


1. Tampón de ácido bórico (TAB), pH 9.6-10.0

2. Hidróxido de sodio 0.1 N (NaOH)

3. Cloruro de potasio (KCl)

4. Soluciones de la droga

5. GRs de grupo O



8. Tubos de ensayo

9. Solución salina

10. Pipetas


12. pHmetro o papel de pH



1. TAB: Disolver 5.16 g de ácido bórico y 2.2 g de KCl en 60 mL de agua destilada. Ajustar el pH

con NaOH 0.1 N y diluir hasta 1 L con agua destilada. Conservar a 4 °C.

2. Preparar las soluciones de droga disolviendo las siguientes cantidades en 15 mL de TAB (ver Nota

1):

a. Carbenicilina disódica 317 mg

b. Penicilina G potásica 280 mg

c. Ampicilina sódica 278 mg

d. Oxaciclina sódica 347 mg

e. Meticiclina sódica 300 mg

f. Nafcilina sódica 340 mg

g. Cefalotina sódica 315 mg

3. Lavar los GRs de grupo O 3 veces con solución salina, concentrar los GRs después del último

lavado y remover tanta solución salina como sea posible.

4. Diluir el suero a estudiar 1:20 con solución salina antes de estudiarlo con los GRs cubiertos con

cefalotina.

Procedimiento

1. A 15 mL de cada solución de droga, agregar 1 mL de GRs. Mezclar bien.

2. Incubar a 37 °C durante 2 horas (1 hora para la cefalotina sódica

3. Lavar 3 veces con solución salina. Resuspender a una concentración del 5% con 20 mL de

solución de Alsever. Pueden conservarse a 4 °C o congelados.

4. Diluir 1 mL de los GRs no recubiertos a una concentración del 5% con 20 mL de solución de

Alsever. Pueden conservarse a 4 °C o congelados.

5. Estudiar el eluato o el suero contra los GRs cubiertos y no cubiertos con droga con una prueba de

aglutinación solución salina a temperatura ambiente y por una prueba antiglobulínica solución

salina (ver M22).

6. Estudiar sueros conocidos con anticuerpos anti-droga para el control positivo y sin anticuerpos

para el control negativo.

Interpretación

1. Los anticuerpos hacia la droga reaccionarán con los GRs cubiertos con la droga, pero no con los

GRs no recubiertos.

2. Ver también M88 y M89.

Notas

1. El TAB tiene una osmolaridad de 0.200 mOsm/kg; la adición de la cantidad determinada de droga

a 15 mL de TAB llevará la osmolaridad hasta 300 mOsm/kg. Para llegar a una osmolaridad final

de 0.300 mOsm/kg, agregar 0.75 mM de cada droga a 15 mL de TAB. La cantidad de mg

requeridos de cada droga se calcula multiplicando el peso molecular de la droga por 0.75.

Referencias

1. Judd WJ. Methods in immunohematology. Miami: Montgomery Scientific Publications, 1989:115-

6.

Método 92 – Detección de anticuerpos que reaccionan por el mecanismo de inmunocomplejos


Para evidenciar anticuerpos dirigidos hacia aquellas drogas que reaccionan mediante el mecanismo de

inmunocomplejos, aglutinarán los GRs no tratados cuando la droga se agrega al sistema de la prueba.


1. Solución tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (ver M133)

2. Solución de la droga a estudiar

3. Suero fresco normal (libre de anticuerpos eritrocitarios y hacia la droga) como una fuente de

complemento

4. GRs de grupo O, suspensión al 5% en solución salina

5. GRs de grupo O tratados con ficina, suspensión al 5% en solución salina (ver M42)

6. Tubos de ensayo



9. Pipetas

10. Antiglobulina humana poliespecífica (AGH)

11. GRs cubiertos con IgG (Control Coombs) (ver M135)



1. Preparar la solución de la droga como sigue: Pulverizar un comprimido de la droga a estudiar en

suficiente PBS para producir una concentración de 1 mg/mL de la droga (ver Nota 1). Incubar a 37

°C durante 30 minutos y agitar vigorosamente para ayudar a disolver la droga. Centrifugar y

separar el sobrenadante claro. Medir el pH de la solución y ajustarlo alrededor de pH 7.

Procedimiento

1. Preparar los seis tubos que se muestran en la Tabla 92-1 por duplicado.

Tabla 92-1: Pruebas para detectar anticuerpos que reaccionan por complejos inmunes

Tubo de prueba Suero del paciente

(mL)

Droga

(mL)

PBS

(mL)

Suero fresco

normal (mL)

GRs grupo 0

(mL)

1

2

3

4

5

6

0.3

0.3

0.3

0.3

--

--

0.1

--

0.1

--

0.1

--

--

0.1

--

0.1

--

0.1

--

--

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

2. A un juego de tubos, agregar GRs tratados con ficina, y agregar GRs no tratados al otro juego.

3. Incubar los tubos a 37 °C durante 1 hora (mezclando suavemente periódicamente).

4. Centrifugar a 1000 g durante 1 minuto.

5. Examinar en busca de hemólisis y aglutinación.

6. Realizar la prueba antiglobulínica y leer en busca de aglutinación.

7. Agregar GRs cubiertos con IgG a todas las pruebas negativas, centrifugar, y leer en busca de

aglutinación. Repetir todas las pruebas negativas que no hayan aglutinados cuando se agregaron

los GRs cubiertos con IgG.

Interpretación

Puede observarse hemólisis, aglutinación o PAIs positivas conjuntamente o por separado. Un resultado

positivo en cualquiera de los tubos en los cuales la droga y el suero del paciente fueron enfrentados (tubos

1 y 3) junto con resultados negativos en los tubos sin suero del paciente o droga (tubos 2, 4-6) sugiere que

la droga está implicada en la reacción.

Notas

1. Los comprimidos contienen excipientes agregados a la droga. Aún después de triturar el

comprimido en un mortero, puede quedar mucho material insoluble cuando se intenta poner la

droga en la solución. Sin embargo, ya que son necesarias cantidades extremadamente pequeñas de

drogas, para detectar el anticuerpo, puede disolverse una cantidad suficiente. Si la droga se provee

en forma de solución intravenosa puede ser utilizada. Puede ser necesario consultar al fabricante

para obtener los métodos para conseguir la droga en una solución.

2. Si se piensa que los componentes de los diluyentes de los GRs reactivos son la causa del problema,

los componentes deben ser preparados en las concentraciones usadas por el fabricante en el

producto. En algunos casos, si un componente individual no produce los resultados esperados en

las pruebas, se deben estudiar varias combinaciones de ellos.

Referencias


laboratory management of hemolysis (suppl). Washington, DC: 32nd annual AABB meeting,

1979:1-19.

Método 93 – Confirmación de anticuerpo contra caprilato de sodio


El caprilato de sodio se usa comúnmente como un estabilizador de la albúmina sérica bovina (ASB) y en

algunos antisueros reactivos. El suero que contiene anticuerpos contra el caprilato de sodio es reconocido

usualmente porque todas las pruebas (incluyendo el control autólogo) son fuertemente positivas cuando se

usa ASB estabilizado con caprilato. Sin embargo, cuando es sustituida por albúmina sin caprilato no se

detecta reactividad. La confirmación de esta especificidad requiere caprilato de sodio (sin ASB) para ser

agregado a las pruebas.


1. Caprilato de sodio 0.04 M, PM 166.21

2. Solución salina




6. Pipetas

7. Tubos de ensayo


9. Suero a estudiar

10. GRs de grupo O, suspensión al 2% en solución salina


1. Preparar el caprilato de sodio 0.4 M disolviendo 1.33 g de caprilato de sodio en 200 mL de

solución salina.

Procedimiento

1. A 3 volumenes del suero a estudiar, agregar 1 volumen de caprilato de sodio 0.04 M.

2. Como un control del diluyente, agregar 1 volumen de solución salina a 3 volumenes del suero.

3. A cada tubo, agregar 1 volumen de suspensión globular al 2%. Mezclar bien.

4. Incubar temperatura ambiente durante 15 minutos.

5. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente los botones globulares y

examinar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

6. Incubar los tubos a 37 °C durante 30 minutos.

7. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente los botones globulares y examinar

en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

8. Lavar los GRs 4 veces con solución salina, descartando completamente después de cada lavado.

9. Agregar 2 gotas de AGH y mezclar bien.

10. Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente los botones globulares y examinar

en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

11. Agregar 1 gota de GRs cubiertos con IgG a cada prueba negativa. Centrifugar durante 15-20

segundos. Examinar en busca de aglutinación. Repetir el procedimiento con todos los tubos que

carecen de aglutinación en esta etapa.

Interpretación

1. La reactividad en el suero que contiene caprilato de sodio y la no reactividad en el suero de control

indica la presencia de un anticuerpo en el suero del paciente dirigido contra el caprilato de sodio.

2. La reactividad en ambos, la prueba y el suero de control, o la no reactividad en ambos, la prueba y

el suero de control, indica la presencia de un anticuerpo dirigido hacia un antígeno distinto del

caprilato de sodio.

Referencias

1. Beck ML, Edwards RL, Pierce SR, Hicklin BL, Bayer WL. Serologic activity of fatty acid

dependent antibodies in albumin-free systems. Transfusion 1976;16:434-6.

Método 94 – Detección de estabilizantes agregados en la albúmina sérica bovina (ASB)

Principio

El caprilato de sodio o el triptofanato son agregados para prevenir la desnaturalización de la ASB cuando

se calienta a 56 °C o más durante la preparación del producto.

Aplicación

Las pruebas pueden dar resultados positivos falsos si fue agregada ASB estabilizada a un antisuero y la

sangre probada contenía un anticuerpo hacia el estabilizador. Puede ser necesario hacer pruebas para

determinar la presencia o ausencia de estabilizadores.


1. Baño de 56 °C

2. ASB, al 22 o 30% P/V

3. Tubos de ensayo

4. Pipetas

5. Reactivo antisuero

6. Tubos capilares (opcional)

Procedimiento

1. Incubar 3 mL de ASB o un pequeño volumen de antisuero reactivo en un baño de 56 °C durante 3

horas (ver Nota 1).

2. Observar visualmente la muestra cada 30 minutos.

Interpretación

1. Si la muestra contiene aditivos estabilizantes, la apariencia de la muestra se mantendrá sin cambios

durante las 3 horas de incubación.

2. Si no hay estabilizantes presentes, la ASB o los reactivos fortificados con ASB se solidificará o se

tornará en una apariencia pastosa.

Notas

1. Alternativamente, si se trata con antisuero raro, llenar un tubo capilar hasta un tercio con el

antisuero, sellar ambos extremos y colocar el capilar en un tubo de 10 x 75 mm lleno con agua a

56 °C. Colocar el tubo de ensayo en un baño a 56 °C.

2. Esta es una prueba general realizada por Hyland Division of Baxter Diagnostic, Inc., para

determinar si fueron agregados estabilizantes con ASB como fuente. (Propuesta por Ray Cady,

Supervisor de la producción de reactivos para bancos de sangre, 21 de agosto, 1978.)

Método 95 – Neutralización de anticuerpos anti-especie en la antiglobulina humana (AGH) con

globulina antilinfocítica (GAL) o globulina antitimocítica (GAT)


La GAL y la GAT son producidas en animales (generalmente caballos). Estas preparaciones contienen

altos títulos de anticuerpos anti-especie que circula en los pacientes a quienes ha sido administrada la

GAL o la GAT y produce pruebas de antiglobulina directa e indirecta positivas. La globulina anti-especie

en la AGH debe ser removida antes de ser utilizado en las pruebas pretransfusionales.


1. Suero de caballo, Pel Freez Biologicals; or GAT, Atgam®, The Upjohn Co., producto número

92601; o GAL, Departamento de Cirugía, Universidad de Minnesota

2. GRs cubiertos con IgG de grupo O (Control Coombs) (ver M135)

3. AGH (poliespecífica o IgG)

4. GRs cubiertos con GAL o GAT (ver M96)


6. Solución salina

7. Pipetas

Procedimiento

1. Mezclar 0.2 mL de suero de caballo o 0.2 mL de una dilución 1:20 de GAL o GAT con 10 mL de

AGH en un tubo de 16 x 100 mm.


3. Estudiar la AGH neutralizada con los siguientes controles con una prueba de antiglobulina directa:

a. Control positivo: GRs cubiertos con IgG

b. Control negativo: GRs cubierto in vitro con GAL (ver M96).

Notas

1. Los problemas asociados con GAL o GAT no se evidencian si se utiliza la técnica de policationes

de baja fuerza iónica (LIP) (ver M25).

2. Los anticuerpos presentes en la GAL y la GAT pueden parecer tener especificidad hacia el sistema

Lutheran.

Referencias

1. Swanson JL, Issitt CH, Mann EW, et al. Resolution of red cell compatibility testing problems in

patients receiving antymphoblast or anti-thymocyte globulin. Transfusion 1984;24:141-3.

2. Ballas SK, Draper EK, Dignam CM. Pretransfusion testing problems caused by anti-lymphocyte

globulin and their solution. Transfusion 1985;25:25.

3. Anderson HJ, AuBuchon JP, Draper EK, et al. Transfusion problems in renal allograft recipient:

anti-lymphocyte globulin showing Lutheran system spercificity. Transfusion 1985;25:47-50.

Método 96 – Adsorción de antiglobulina humana (AGH) con globulina anti-linfocítica (GAL) o

globulina anti-timocítica (GAT)


La GAL y la GAT son usualmente producidas en caballos y utilizadas para el tratamiento de pacientes

con leucemia y en receptores de trasplante de órganos. Estas preparaciones tienen títulos muy altos de

anticuerpos anti-especie que pueden interferir con las pruebas serológicas. Los anticuerpos anti-especie

deben ser removidos de la AGH antes de utilizarla en la investigación serológica de muestras de pacientes

tratados con GAL o GAT. La AGH puede ser adsorbida antes de usarla utilizando GRs recubiertos in

vitro con GAL o GAT.


1. GAT, Atgam®, The Upjohn Co., producto número 92601; o GAL, Departamento de Cirugía,

Universidad de Minnesota

2. Solución salina

3. GRs de grupo O, suspensión 3-5% en solución salina

4. Suero Antiglobulina SAGH (poliespecífica o anti-IgG)





9. Pipetas

Procedimiento

1. Lavar los GRs de grupo O 3 veces con solución salina. Remover completamente el sobrenadante

del último lavado y concentrar los GRs

2. Diluir 1 volumen de GAL o GAT con 9 volúmenes de solución salina.

3. Incubar 1 volumen de paquete globular lavado con 5 volumenes de GAL o GAT diluida durante 1

hora a 37 °C.

4. Centrifugar a 1000 g durante 1-2 minutos y remover el sobrenadante.

5. Lavar los GRs 18-20 veces con solución salina. Pasar los GRs a un nuevo tubo de ensayo después

de 10 lavados.

6. Remover el sobrenadante del último lavado, reservando una alícuota. Concentrarlos GRs

7. Estudiar el sobrenadante del último lavado para la actividad de anticuerpos como sigue:

Colocar 3 gotas del sobrenadante del último lavado en un tubo limpio de 10 x 75 mm y agregar 1

gota de suspensión al 3-5% de GRs frescos de grupo O. Incubar a temperatura ambiente durante 15

minutos. Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Si no se ve

aglutinación, proceder con el paso 8. Si se detecta aglutinación, lavar los GRs adsorbidos 5 veces y

estudiar nuevamente si hay actividad del anticuerpo. Repetir hasta que no se detecte actividad en el

sobrenadante del último lavado.

8. Realizar una prueba de antiglobulina directa (PAD) a los GRs adsorbidos para determinar si están

recubiertos al máximo (los GRs deben reaccionar con 3-4+).

9. Agregar 1 volumen de GRs lavados, cubiertos con GAL o GAT a 5 volúmenes de SAGH y

mezclar bien.


11. Centrifugar durante 1-2 minutos y trasvasar el SAGH adsorbido a un frasco de reactivo, limpio y

rotulado.

Controles

Realizar las PADs con el SAGH adsorbida usando los siguientes controles:

a. Control positivo: GRs cubiertos con IgG.

b. Controles negativos: GRs del paciente, cubiertos con GAL o GAT, que tienen una PAD positiva.

c. GRs cubiertos in vitro con GAL o GAT (preparados como en los pasos 1-3).

Si los controles dan los resultados esperados, el reactivo puede ser usado para PADs, detección

de anticuerpos, y pruebas de compatibilidad. Si los controles no son satisfactorios, repetir los pasos 9-11.

Notas

1. Los problemas asociados con GAL o GAT no se evidencian si se utiliza la técnica de policationes

de baja fuerza iónica (LIP) (ver M25).

2. Los anticuerpos presentes en la GAL y la GAT pueden parecer tener especificidad hacia el sistema

Lutheran.

Referencias

1. Swanson JL, Issitt CH, Mann EW, Condie RM, Simmons RL, McCullough J. Resolution of red

cell compatibility testing problems in patients receiving anti-lymphoblast or anti-thymocyte

globulin. Transfusion 1984;24:141-3.

2. Postoway N, Garratty G. Mechanisms causing positive antiglobulin tests subsequent to

antilymphocyte globulin (ALG) administration (abstract). Transfusion 1984;24:427.

3. Ballas SK, Draper EK, Dignam CM. Pre-transfusion testing problems caused by anti-lymphocyte

globulin and their solution. Transfusion 1985;25:254-6.

4. Anderson HJ, AuBuchon JP, Draper EK, et al. Transfusion problems in renal allograft recipient:

anti-lymphocyte globulin showing Lutheran system spercificity. Transfusion 1985;25:47-50.

Método 97 – Prueba para detectar GRs poliaglutinables usando suero de adulto y de cordón


Las aglutininas hacia los GRs poliaglutinables están presentes en el suero de adultos de todos los grupos

ABO, pero estos anticuerpos IgM no pasan la placenta hacia la circulación fetal. Por lo tanto, los GRs

poliaglutinables son aglutinados por el suero de adulto pero no por el suero de cordón.


1. Suero de sangre de cordón

2. Suero de adulto de grupo AB

3. GRs a estudiar y suero autólogos

4. GRs de grupo A1 y B

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina


8. Pipetas


1. Recolectar suero de 2-3 sangres de cordón. Estos sueros deben ser compatibles con el grupo ABO

de los GRs a estudiar (ver Notas 1 y 2).

2. Recolectar muestras de sangre de 10 individuos de grupo AB. Dejarlas coagular a temperatura

ambiente, y guardarlas durante 4 horas a 4 °C antes de la separación del suero. Estudiar cada

muestra de suero para anticuerpos irregulares. Conservar a –20 °C para su uso futuro.

3. Lavar los GRs 2-3 veces con solución salina y resuspender a una concentración del 3-5%.

4. Lavar los GRs de grupo A1 y B 2-3 veces con solución salina y resuspender a una concentración

del 3-5%.

Procedimiento

1. Rotular 3 juegos de tubos. Cada juego debe consistir de tubos para los 10 sueros de adulto, 2-3

para los sueros de cordón, y 1 para el suero autólogo.

2. Agregar 2 gotas de cada muestra de suero a los tubos apropiados en los 3 juegos.

3. A 1 juego agregar 1 gota de los GRs a estudiar.

4. Agregar 1 gota de GRs de grupo A1 (control) al segundo juego de tubos y 1 gota de GRs de grupo

B (control) al tercer juego.



7. Leer macroscópicamente, evaluar, y registrar los resultados.

Controles

1. Los GRs de grupo A1 y B son controles negativos para el suero adulto de grupo AB y el suero de

cordón.

Interpretación

La aglutinación de los GRs estudiados por el suero adulto, pero no con el suero de cordón, es una

supuesta evidencia de poliaglutinabilidad.

Notas

1. El suero de cordón de algunos bebés puede contener anti-A, anti-B, o ambos.

2. Debe tenerse cuidado en la recolección de la sangre del cordón umbilical para evitar la

contaminación con sangre materna, la cual contiene las aglutininas hacia GRs poliaglutinables.

Referencias



1985:457.

Método 98 – Preparación de lectinas


Varios extractos de semillas contienen proteínas que se unen con azúcares específicos en ciertas

configuraciones. Los GRs que portan el azúcar específico con la configuración apropiada son aglutinados

por los extractos. Puede ser necesaria la dilución de los extractos para detectar la especificidad. Por

ejemplo, Dolichos biflorus contiene una lectina que reacciona con la N-acetil-galactosamina. Sin diluir,

reacciona con los GRs de grupo A1 y A2, pero apropiadamente diluida, detecta confiablemente las

concentraciones más altas de antígeno A que se ven en los GRs A1 y no reacciona con los GRs A2. La

Dolichos biflorus también reacciona con los GRs Tn y Cad positivos. Sin embargo, la estructura de los

azúcares del A1, Cad y Tn deben ser diferentes, porque la Salvia horminum reacciona con los GRs Tn y

Cad pero no con los GRs normales de grupo A. Un panel básico de lectinas para una investigación inicial

deberá incluir Dolichos biflorus, Arachis hypogaea, Glycine max, y Salvia horminum (ver M100).


1. Semillas (se pueden conseguir en compañías de semillas o en tiendas de alimentos saludables


3. Albúmina sérica bovina (ASB), al 30% P/V

4. Mortero o licuadora

5. Tubos de ensayo

6. Pipetas


8. Balanza

Procedimiento

1. Retirar las cáscaras de los maníes y la cubierta de otros tipos de semillas.

2. Pesar 1 g de semillas (ver Nota 1).

3. Las semillas con cáscara dura pueden remojarse durante la noche antes de molerla en igual

volumen de solución salina. Las semillas de Salvia contienen una sustancia parecida al gel y debe

ser molida primero y colocada en un tubo de ensayo antes de agregar la solución salina ya que se

torna dificíl de manejar después de remojarse.

4. Moler las semillas y agregar 5 mL de solución salina.

5. La extracción de algunas lectinas puede mejorarse dejando reposar la pulpa de la semilla toda la

noche en solución salina.

6. Remover el sobrenadante y centrifugar a 1000 g durante 5 minutos.

7. La lectina del maní debe centrifugarse varias veces para remover la capa de grasa que se forma en

la superficie. Refrigerar entre centrifugaciones para endurecer la capa de grasa y facilitar la

remoción.

8. La lectina en bruto está ahora lista para ser estandarizada, seleccionando la mejor dilución para su

uso (ver M99).

9. La lectina concentrada en bruto, puede conservarse congelada hasta ser probada. Para ayudar a

estabilizar la lectina en bruto durante la conservación se podrá agregar un volumen igual de ASB

al 30%

Notas

1. Puede ser necesario enjuagar bien las semillas, ya que algunas compañías las recubren con

fungicidas para ayudar su germinación.

Referencias

1. Judd WJ. The use of purified lectins in immunohematology. Transfusion 1979;19:768-9.

Método 99 – Estandarización de lectinas


Ciertos extractos de semillas contienen proteínas que se comportan como anticuerpos. Las lectinas se

pueden usar para detectar e identificar ciertas formas de poliaglutinabilidad. Los extractos salinos son

estandarizados probando diluciones con GRs poliaglutinables de tipo conocido. Las lectinas purificadas

disponibles comercialmente deben ser diluidas también y probadas contra los GRs poliaglutinables

conocidos como fue descripto por Judd. Un panel básico de lectinas para una investigación inicial deberá

incluir Dolichos biflorus, Arachis hypogaea, Glycine max, y Salvia horminum (ver M100).


1. Extractos salinos en bruto (ver M98) o lectinas de afinidad purificada, E-Y Laboratories

2. Albúmina sérica bovina (ASB), al 6% (ver M69) y solución salina, o ASB al 11% y solución

salina tamponada con fosfato (PBS).

3. GRs a estudiar de tipos conocidos de poliaglutinabilidad

4. Tubos de ensayo

5. Solución salina

6. Pipetas

Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces con solución salina y preparar una suspensión al 3-4% (ver Nota 1).

2. Preparar diluciones dobles (ver M123) de cada lectina en ASB al 6% y solución salina, o ASB al

11% y PBS. La cantidad a preparar es 0.1 mL por el número de muestras globulares a estudiar. De

esta manera, si se prueban 8 muestras globulares, la dilución madre deberá ser de 0.8 mL diluidos

desde 1:2 hasta 1:2048.

3. Usar pipetas o tips limpios para mezclar y transferir cada dilución.

4. Preparar un juego de tubos apropiadamente rotulados para cada lectina que será probada –un tubo

por cada dilución.

5. Agregar 2 gotas (0.1 mL) de cada dilución a los tubos apropiados.

6. Agregar 1 gota de cada GRs poliaglutinable a estudiar al juego de tubos apropiado y mezclar bien.

7. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 1000 g durante 15 segundos, leer, evaluar

las reacciones, y registrar los resultados.

8. Determinar la dilución más alta de la lectina que muestra una reactividad fuerte con los GRs que se

esperan sean positivos. La lectina no debe reaccionar con los otros GRs poliaglutinables.

9. Preparar 5 mL de dilución de trabajo de la dilución seleccionada y confirmar que muestra las

reacciones deseadas.

10. Conservar la dilución de trabajo a 4 °C hasta su uso. Separar en alícuotas la lectina restante sin

diluir y conservarla congelada.

Notas

1. Los GRs poliaglutinables pueden preparase tratando los GRs normales con el sobrenadante del

medio de cultivo de bacterias. Sin embargo, este sobrenadante contiene sustancias enzimáticas, y

es probable que más un receptor poliaglutinable pueda ser expuesto usando este método. Es mejor

usar enzimas purificadas tales como la neuraminidasa para preparar in vitro GRs tratados y usar

GRs de pacientes con formas de poliaglutinabilidad conocidas.

2. Algunos trabajadores han advertido sobre resultados falsos positivos cuando se utilizan GRs

desconocidos con lectinas preparadas con potenciadores de la aglutinación tales como la albúmina.

Es posible que los GRs cubiertos con anticuerpos sean confundidos con GRs poliaglutinables a

causa de la aglutinación espontánea de estos GRs. Por esta razón, se sugiere como diluyente ASB

al 6%. La fuerza de la prueba de antiglobulina directa (PAD) no tiene siempre correlación con las

reacciones falsas positivas con la solución de lectina. Es conveniente usar métodos suaves de

remoción de anticuerpos (ver M51) en los GRs que dan PAD falso positiva, y confirmar entonces

que los GRs son poliaglutinables. Debido a que puede haber poliaglutininas presentes en el suero

antiglobulínico, los GRs poliaglutinables pueden tener una PAD positiva.

Referencias

1.Judd WJ. The use of purified lectins in immunohematology. Transfusion 1979;19:768-9.

Método 100 – Pruebas con lectinas


Varios extractos de semillas, conocidos como lectinas, contienen proteínas que se unen con azúcares

específicos con ciertas configuraciones. Los GRs que tienen estas configuraciones del azúcar específico

son aglutinados por una lectina. Las lectinas son especialmente útiles en la detección de los

criptoantígenos expuestos de los GRs poliaglutinables. Las lectinas usadas para la identificación de los

GRs poliaglutinables están disponibles comercialmente o pueden ser preparadas de acuerdo al M98 y

M99. Un panel básico de lectinas para una investigación inicial deberá incluir Dolichos biflorus, Arachis

hypogaea, Glycine max, y Salvia horminum.


1. Lectinas diluidas y estandarizadas (ver M98, M99)

2. GRs a estudiar

3. GRs de control, positivo y negativo

4. Tubos de ensayo

5. Solución salina

6. Pipetas


Procedimiento

1. Lavar los GRs 3 veces con solución salina y preparar una suspensión al 3-4%.

2. Rotular un juego de 3 tubos, “prueba”, “control positivo” y “control negativo” por cada GR que va

a ser probado con el panel de lectinas (ver Controles más abajo).

3. Agregar 2 gotas de cada lectina a los tubos apropiados.

4. Agregar 1 gota de los GRs a estudiar y de control a los tubos apropiados.


6. Leer, evaluar, y registrar las reacciones.

Controles

1. Los controles positivos deben incluir GRs poliaglutinables conocidos que se esperará reaccionen

con cada lectina. Un control negativo es un GR normal.

2. Puede ser útil incluir un control de la aglutinación para los GRs que se prueban si las lectinas están

diluidas en albúmina u otros potenciadores de la aglutinación.

Interpretación

La Tabla 100-1 enumera las reacciones esperadas de los GRs poliaglutinables con las lectinas, después

del tratamiento con proteasa y sus niveles de ácido siálico esperados. Si se observan reacciones

discrepantes, considerar que los GRs a estudiar pueden tener más de un tipo de criptoantígeno expuesto.

Los polisacáridos bacterianos pueden adsorberse sobre los GRs a estudiar como agregado o a cambio de

una verdadera exposición del criptoantígeno. Es posible remover el antígeno bacteriano absorbido por el

tratamiento suave de los GRs. La adsorción de los antígenos bacterianos sobre los GRs es rara y está

usualmente asociada con la contaminación in vitro de la muestra de sangre o el antisuero.

Los GRs que parecen ser poliaglutinables por otros métodos pero que no reaccionan con el panel

inicial de lectinas pueden exhibir un raro tipo de poliaglutinabilidad (ver Tabla 100-1 y Procedimiento

VII-1 en el Capítulo VII). También es factible que los GRs a estudiar puedan no ser poliaglutinables y

deberán ser consideradas otras posibilidades.

Tabla 100-1: Características y reacciones serológicas de los GRs poliaglutinables

Lectinas Tipo de aglutinaciones

Arachis hypogaea

Glycine max

Salvia sclarea

Salvia horminum

Dolichus biflorus*

Helix pomatia*

Bandeiraea simplicifolia II (

BSH)

Vicia cretica

T

+

+

O

O

O

+

O

+

AcqB

O

O

O

O

O

O

Tk

+

O

O

O

O

O

+

O

Th

+

O

O

O

O

O

+

Tx

+

O

O

O

O

O

O

VA

O

O

O

O

O

CM

O

O

Tn

O

+

+

+

+

+

O

O

HEMPA

S

O

+d

O

O

O

CM

O

O

CAD

O

+

O

+

+

+

O

O

Nor

O

O

O

O

O

O

O

O

Características de poliantígenos

Nivel de ácido siálico

N N N N N

Efecto de las proteasas

* Estudiadas frente a GRs de grupo no A

CM: campo mixto

N: Normal

Disminuido Ligeramente disminuido

Referencias

1.Judd WJ. The use of purified lectins in immunohematology. Transfusion 1979;19:768-9.

Método 101 – Remoción de anti-T de los reactivos de tipificación

Principio

El anti-T puede removerse del suero normal de adultos por adsorción sobre GRs T activados.

Aplicación

El anti-T debe ser inactivado o removido de los reactivos tipificadores ABO y Rh para obtener resultados

de agrupamiento eritrocitario válidos con la sangre de pacientes cuyos GRs son T activados (ver Nota 1).


1. GRs tratados con neuraminidasa, de grupo O, Rh negativo

2. Reactivos de tipificación, anti-A, anti-B y anti-D

3. Solución salina

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas



Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 3-5% de GRs tratados con neuraminidasa (ver M42).

2. Centrifugar 10 gotas de GRs tratados con neuraminidasa por 2 minutos a 1000 g. Descartar el

sobrenadante completamente para producir un botón seco.

3. Al botón seco de GRs tratados con neuranimidasa, agregar 0.2 mL de reactivo tipificador.

4. Incubar a 4 °C durante 30 minutos. Mezclar ocasionalmente.


6. Remover todo el suero y transferirlo a otro botón seco de GRs tratados con neuraminidasa.


8. Remover el suero doblemente adsorbido y estudiar 1 gota con 1 gota de GRs tratados con

neuraminidasa. Si se produce aglutinación, la remoción de anti-T es incompleta y son necesarias

adsorciones adicionales. Si no hay aglutinación, la remoción de anti-T es completa, y el reactivo

puede ser usado para la tipificación de los GRs T activados.

Notas

1. El anti-T puede ser eliminado por el tratamiento con 2-mercaptoetanol (2-ME) del suero con tal

que el anticuerpo del reactivo tipificador no sea significativamente afectado.

Referencias

1. Beck ML. The technical problem of T-activation. Transfusion 1968;8:109-10.

2. Issitt PD. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publications.

1985:460.

Método 102 – Detección de enzimas de activación de T en suero


Es posible detectar la presencia de enzimas de activación de T en el suero de pacientes cuyos GRs,

plaquetas y posiblemente las células del riñon están siendo afectadas por la enzima. El suero es incubado

con GRs normales, exponiendo los antígenos T y causando que las células sean aglutinadas por el anti-T.


1. Suero separado de sangre del paciente extraída recientemente y estudiado dentro de las 24 horas de

su obtención

2. GRs de grupo O

3. GRs de control tratados con neuraminidasa (ver M42)

4. Lectina anti-T de Arachis hypogaea (ver M98)

5. Tubos de ensayo


Procedimiento

1. Lavar los GRs de grupo O 3-4 veces con solución salina y preparar una suspensión al 4% en

solución salina.

2. Agregar 0.4 mL de la suspensión a un tubo de ensayo, centrifugar a 1000 g durante 1 minuto, y

descartar toda la solución salina para producir un botón globular seco.

3. Agregar 0.4 mL del suero fresco del paciente al botón globular, mezclar, e incubar a 37 °C hasta 1

hora (ver Nota 1).

4. A intervalos de 15 minutos, sacar una alícuota de 0.05 mL. Lavar los GRs una vez y agregar 0.05

mL de anti-T al botón seco.

5. Si no se ve aglutinación, continuar probando alícuotas de la mezcla de suero-GRs cada 15 minutos

durante 1 hora.

Controles

1. Control positivo para la lectina anti-T: 1 gota (0.05 mL) de una suspensión al 4% en solución

salina de GRs tratados con neuraminidasa más 1 gota de anti-T.

2. Control negativo para la lectina anti-T: 1 gota de una suspensión al 4% en solución salina de GRs

no tratados con neuraminidasa más 1 gota de anti-T.

Interpretación

Si el suero del paciente permite que los GRs normales puedan ser T activados, la enzima está presente, y

señala la posibilidad de sindrome urémico hemolítico y coagulación intravascular diseminada.

Notas

1. Puede ser necesario incrementar la relación de suero/GRs si la enzima de activación de T en el

suero del paciente es débil.

Referencias

1. Beattie KM, Lewis PE, Briski JE, Strauch BM. Detection of circulating T-activating enzyme in the

serum of a patient having hemolytic-uremic syndrome and disseminated intravascular coagulation.

Am J Clin Path 1985;84:244-8.

Método 103 – Pruebas en microplaca

Principio

Una prueba en microplaca es un método efectivo de estudio, como si fuera un en tubo en miniatura.

Dentro de un espacio de 13 x 8.5 cm, una microplaca suministra 96 pocillos, las pruebas equivalentes a 96

tubos de ensayo normales, en 8 líneas identificadas con letras de 12 pocillos. El rotulado de las líneas

exime del marcado individual de los pocillos. El método en microplaca ahorra tiempo y reactivos.

Aplicación

Este método puede usarse para la fenotipificación eritrocitaria de pacientes y donantes, detección e

identificación de anticuerpos, y titulación.


1. Suero a estudiar

2. GRs a estudiar

3. Panel o selector globular comercial (ver Nota 1)

4. Microplacas de poliestireno rígido transparente o de polivinilo flexible con pocillos con forma de

U (ver Notas 2-4), Dynatech Laboratories, Inc.; CoStar Corp.; W. Sarstedt, Inc.; Rochester

Scientific Co.

5. Tapa de microplacas de plástico transparente (ver Nota 5)

6. Espejo de aumento: cósmetico de 6” o lupa de mano (6x o 7x), Dynatech Laboratories, Inc.

7. Pipetas automáticas y dispositivos para suministrar los reactivos y para el lavado de microplacas

8. Pipetas, calibre pequeño

9. Microdiluidor simple o multi-microdiluidor, Dynatech Laboratories, Inc.

10. Centrífuga de mesada grande, centrífuga Sorvall GLC-2B con rotor de cubetas oscilantes HL-4,

DuPont Co., Biomedicals Division; Beckman Instrument, Inc., Model TJ-6

11. Porta microplaca, Dynatech Laboratories, Inc., Beckman Instruments, Inc.; DuPont Co.,

Biomedicals Division

12. Incubador / baño térmico de aire seco, Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division

13. Soluciones antiestáticas:

a. Immusal, Baxter Diagnostic, Inc., Dada Division

b. Albúmina sérica bovina (ASB) al 0.1% en solución salina (2 mL de ASB al 30% en 498 mL de

solución salina o 1 mL de albúmina al 22% en 219 mL de solución salina)

14. Mezclador vórtex (opcional)

15. GRs tratados con enzimas (ver M42)


17. GRs de control positivo y negativo

18. Microdiluidor (para titulaciones)

19. ASB al 6% (ver M69)

Procedimiento

Fenotipiticación, detección e identificación de anticuerpos

1. Las cargas electrostáticas hacen que los GRs se peguen a una microplaca nueva. Remover estas

cargas antes del primer ensayo de la siguiente manera:

a. Llenar los pocillos con solución antielectrostática.

b. Incubar durante 5-10 minutos.

c. Decantar el contenido en una pileta o recipiente con un rápido golpe de muñeca.

d. Secar una vez con una toalla absorbente.

2. Rotular la placa con marcador, colocar una cinta adhesiva marcada en el costado de la placa, o

frotar el borde con un borrador de tinta y marcar con lápiz.

3. Preparar las suspensiones globulares al 2-3%:

a. Usar una muestra coagulada o anticoagulada. Llenar los pocillos con solución salina o

Immusal. Transferir los GRs de la muestra a los pocillos usando una varilla aplicadora. O

preparar una suspensión al 3% de GRs en tubos de ensayo y agregar 1 gota a los pocillos

apropiados.

b. Cuando se usa selector o panel globular comercial, agregar una pequeña gota del frasco al

pocillo rotulado.

c. Para cualquier célula pretratada con enzimas (ver M42): Agregar 1 gota de una suspensión al

3% a los pocillos apropiados.

4. Lavar los GRs (ver Nota 6) por centrifugación de la placa:

a. Placas flexibles: Centrifugar 10 segundos a 760 x g (2000 rpm in DuPont-Sorvall GLC-2B).

Placas rígidas: Centrifugar 3 minutos a 50-70 x g (500-600 rpm).

b. Decantar como en 1.c y d, más arriba.

c. Resuspender los GRs usando un mezclador vórtex o colocando la placa en una toalla y

moviendo rápidamente en un radio pequeño.

d. Agregar solución salina hasta casi llenar los pocillos, repetir entonces los pasos 4.a-c, más

arriba.

5. Agregar 1 gota del suero a estudiar a los pocillos apropiados y mezclar como en 4.c, más arriba.

6. Cubrir las placas e incubar durante 15-30 minutos a temperatura ambiente o a 37 °C en un

incubador de calor seco (ver Nota 5).

7. Centrifugar la placa adecuadamente balanceada:

a. Placas flexibles: Llevar a la velocidad de 760 x g y apagar inmediatamente.

b. Placas rígidas: Centrifugar a 760 g durante 60-90 segundos.

8. Leer los resultados (ver Notas 6, 7 y 8):

a. Manteniendo la placa casi vertical:

• Prueba positiva: Se mantiene el botón globular.

• Prueba negativa: Los GRs corren por el costado del pocillo. Examinar los pocillos desde el

dorso de la placa con una lupa de 6x o 7x, si es necesario.

• Si las células van a estudiadas en medio de SAGH, omitir el paso 8.b, más abajo, y continuar

con los pasos 9, 10 y 11; centrifugar como en 7.a y b y leer como en 8.a y b.

b. Sedimentación – mezclar suavemente las células, cubrir, colocar sobre un espejo de aumento

por 30 minutos, y leer.

• Positivo: GRs dispersos con un patrón irregular.

• Negativo: GRs sedimentados en un botón redondo liso.

9. Centrifugar con fuerza y decantar el exceso de suero para obtener un botón globular seco (ver Nota

9).

10. Lavar 4 veces como en 4.

11. Agregar 1 gota de SAGH (ver Nota 10). Mezclar suavemente.

12. Leer por inclinación o sedimentación (ver 8, más arriba).

Titulación

1. Agregar 2 gotas pequeñas (50 uL) del suero a estudiar en el pocillo 1 (ver notas 11 y 12).

2. Agregar 1 gota de solución salina o ASB al 6% a los pocillos 2-12. Premojar el microdiluidor, si lo

requiere el fabricante. El microdiluidor debe estar calibrado para dispensar 25 uL.

3. Girar el microdiluidor 4 veces en el pocillo 1 y transferir, sin tocar el borde del pocillo, al pocillo

2.

4. Repetir el paso 3 hasta el final de la fila.

5. Agregar una gota (25 uL) de una suspensión al 3% de los GRs a estudiar y mezclar suavemente.

6. Seguir los pasos 6-12 para fenotipiticación, detección e identificación de anticuerpos.

Notas

1. Los GRs comerciales no deben ser lavados para su uso en microplaca.

2. Hay microplacas disponibles con pocillos en forma de U, en forma de V, o planas. La mayoría de

los laboratorios de los bancos de sangre prefieren las placas con forma de U.

3. Una microplaca pequeña, de aproximadamente 7 x 4.25 cm, es hecha por Gamma Biologicals.

Esta microplaca puede centrifugarse en una centrífuga Clay-Adams.

4. A menos que estén prohibidas por las regulaciones sobre enfermedades infecciosas, las

microplacas pueden conservarse como un equipamiento permanente. Para su reutilización, lavar

para su primer remojo en Clorox® de media fuerza (aproximadamente solución de hipoclorito de

sodio al 2.6%) y entonces en una solución de detergente de vajilla. Enjuagar varias veces con agua

corriente y agua destilada. Secar la placa en una toalla doblada y aire seco boca abajo. Es

conveniente un estante plástico de cocina. Las marcas de lápiz pueden sacarse con una goma; las

marcas de un marcador pueden ser removidas con alcohol.

5. Las tapas para las microplacas son necesarias para el período de incubación. Una microplaca

puede ser tapada con cualquier placa. Las tapas para las microplacas no deben usarse durante la

centrifugación. Las pequeñas placas de Gamma Biologicals pueden cubrirse con Parafilm®, el

cual debe dejarse encima para la centrifugación, para dejar que los reactivos a centrifugar no se

salgan al arrancar la centrífuga.

6. Algunos laboratorios usan ASB al 1% para los lavados durante las pruebas de AGH para ayudar a

prevenir la pérdida de anticuerpos de la superficie eritrocitaria. Agregar 8 mL de ASB al 30% a 2

L de solución salina para hacer una solución de lavado de ASB al 1%.

7. Mantener en mente el retardo producido en durante la observación del fondo de los pocillos; la

observación sobre un espejo de aumento presenta los pocillos en una forma apropiada.

8. Con reacciones muy fuertes, el botón entero de GRs puede deslizarse hacia abajo cuando la placa

es mantenida verticalmente para las reacciones por “inclinación”.

9. Las lecturas por “inclinación” son más sensibles que las lecturas por “sedimentación”, pero la

lectura por sedimentación es más adecuada para evaluar mezclas de anticuerpos y reacciones en

“campo mixto”, tales como se muestran con anti-Sda. Con una mezcla de anticuerpos, la apariencia

variable del botón globular puede ayudar a la identificación. El uso de GRs cubiertos con IgG

(Control Coombs) eliminará la oportunidad de una lectura por sedimentación.

10. Los estabilizantes de los SAGH tienden a hacer que los GRs se peguen al plástico. Casi todos los

SAGH deben ser diluidos 1:2 con solución salina para su uso en microplaca. Habitualmente, 1

gota de SAGH diluida de una pipeta de pequeño calibre es suficiente para cada pocillo.

11. Las microplacas rígidas usadas para titulación no deben ser reusadas; las microplacas flexibles, si.

En las microplacas rígidas, pueden producirse reacciones positivas falsas por los GRs atrapados en

los raspones de los pocillos producidos por los microdiluidores.

12. Se deben usar gotas pequeñas del suero a estudiar como para el microdiluidor no llegue a mojarse

hasta arriba de su cabeza.

Referencias

1. Wegmann T, Smithies O. A simple hemagglutination system requiring small amounts of RBCs

and antibodies. Transfusion 1966;6:67-73.

2. McCloskey RV, Zmijewski CM. A semi-micro-technique for the detection of human blood group

isohemagglutinins. Am J Clin Pathol 1967;48:240-2.

3. Wegmann TG, Smithies O. Improvement of the microtiter hemagglutination method. Transfusion

1968;8:47.

4. American National Red Cross Blood Services Directives: Donor processing using “U” bottomed

microplates, September 1981:1-25.

5. Severns ML, Schoeppner SL, Cozart MJ, Friedman LI, Schanfield MS. Automated determination

of ABO/Rh in microplates. Vox Sang 1984;47:293-303.

6. Dixon MR. Microplate: A flexible system for serologic testing. In: Micromethods in Blood Group

Serology. Arlington, VA: AABB, 1984.

Método 104 – Uso de LISS para la detección de anticuerpos en microplacas

Principio

La solución salina de baja fuerza iónica (LISS) mejora la sensibilidad de las pruebas en microplaca.

Aplicación

Se pueden estudiar múltiples sueros para una conveniente detección de anticuerpos.


1. Suero (ver Nota 1)

2. GRs reactivos

3. Microplacas (ver M103)

4. LISS

5. Albúmina sérica bovina (ASB) – solución lavada entre 20 veces con solución salina

6. Suero Antiglobulina Humana (SAGH), diluida 1:2

7. GRs de control, cubiertos con IgG, suspensión al 0.5% en solución salina

8. Pipetas (preferentemente de pequeño calibre)


1. Preparar la solución de ASB lavada entre 20 veces con solución salina: agregar 0.2 mL de entre 20

a 6 mL de ASB al 30% o 8 mL de ASB al 22 % y diluir hasta 1 L con solución salina.

2. Preparar la SAGH 1:2: mezclar iguales cantidades de SAGH y solución salina (ver Nota 3).

Controles

1. 1 o 2 muestras de suero con anticuerpos.

2. 1 o 2 muestras de suero negativas para anticuerpos irregulares.

Procedimiento

1. Lavar los GRs selectores una vez con LISS y resuspender a una concentración de 0.5% con LISS.

Usar dentro de las 6 horas de la preparación.

2 Con una pipeta de pequeño calibre, agregar 1 gota de suero al pocillo 1 de la microplaca por cada

célula a ser estudiada. Repetir este paso para todos los sueros a ser estudiados, incluyendo el suero

de control.

3. Agregar una gota de igual volumen de los GRs reactivos suspendidos en una concentración de

0.5% en LISS a los pocillos apropiados.

4. Mezclar suavemente e incubar a 37 °C durante 15-20 minutos.

5. Lavar los GRs 4 veces con la solución de lavado de ASB en solución salina.

6. Con una pipeta de pequeño calibre, agregar 1 gota de SGH diluida a cada pocillo.

7. Mezclar cuidadosamente y centrifugar a 50 g durante 1 minuto.

8. Colocar las microplacas en un ángulo de 45-50 grados durante 3-5 minutos.

9. Registrar los resultados:

a. Negativo: manto de GRs en el fondo del pocillo.

b. Positivo: los botones globulares se mantienen en el lugar.

10. Estudiar las reacciones negativas con GRs cubiertos con IgG.

Notas

1. Es preferible el plasma del que se evitó la formación del coágulo.

2. Los GRs comerciales deben ser lavados cuidadosamente y resuspendidos en un medio de preserve

los GRs por un período más largo que los que se logran con solución salina.

3. El SAGH debe ser diluido 1:2 con solución salina porque los estabilizantes del SAGH tienden a

hacer que los GRs se peguen a los pocillos plásticos. La distribución puede también ser un

problema con el SAGH no diluido. Lo mejor es diluir el SAGH inmediatamente antes de usarlo

para evitar la contaminación bacteriana.

4. La presencia de GRs cubiertos con IgG confirma que en los pocillos se dispensó el SAGH.

Referencias

1. Judd WJ. Microplate-antibody detection using LISS. In: Methods in immunohematology. Miami:

Montgomery Scientific Publications, 1988:204-5.

2. Ball M. Methods for blood grouping, antibody screening and rare phenotype screening in

microplates. In: Knight R, Poole G, eds. The use of microplates in blood group serology: A review

of microplate technology in the U.K. Manchester, England: British Society of Blood Transfusion,

1987.

Método 105 – Método de Polybrene® – medio de baja fuerza iónica (LIM) para fenotipificación en

microplaca

Principio

Con el método LIM-Polybrene, el tiempo de incubación de los GRs con el suero se reduce a 2-3 minutos.

Los complejos antígeno-anticuerpo se potencian en presencia del LIM. Se agrega el Polybrene, un

polímero catiónico, para agregar los GRs. Cuando el Polybrene es neutralizado con citrato de sodio, los

GRs, sensibilizados con el anticuerpo, permanecerán aglutinados, pero los GRs que no están cubiertos

con anticuerpos se dispersarán.

Aplicación

Este método se usa para una fenotipificación rápida de los GRs de donantes, particularmente para grupos

raros.


1. GRs de muestras coaguladas o anticoaguladas

2. Antisueros apropiadamente diluidos por una previa titulación

3. Microplacas flexibles con pocillos en forma de U

4. Agitador de microplaca (opcional)

5. Jet-Pipet con divisor de chorro múltiple, Cole-Parmer

6. LIM

7. Dextrosa

8. EDTA disódico

9. Agua destilada o desionizada


11. Solución de Polybrene al 0.05%, Aldrich Chemical Co.

12. Reactivo de neutralización

13. Citrato trisódico 0.2 M

14. Antisuero, libre de partículas materiales (centrifugado o filtrado)

15. Suero Antiglobulina Humana (SAGH), diluida 1:2 (ver M104, Nota 3)

16. Immusal®, Baxter Diagnostic, Inc., Dade Division

17. Varillas aplicadoras de madera

18. Pipetas (preferentemente de pequeño calibre)

19. Espejo con aumento


1. Preparar 1 L de LIM: mezclar 50 g de dextrosa (C6H12O6) y 2 g de EDTA disódico. Agregar agua

destilada o desionizada hasta 1 L. Ajustar el pH a 6.4. Conservar a 4 °C.

2. Preparar la solución de Polybrene al 0.05%: agregar 0.05 g de Polybrene en 100 mL de solución

salina. Conservar a temperatura ambiente en una botella plástica.

3. Preparar 100 mL del reactivo para neutralización: Mezclar 60 mL de citrato trisódico 0.2 M (3.53

g en 60 mL de agua destilada o desionizada) y 40 mL de dextrosa al 5% (2 g en 40 mL de agua

destilada o desionizada). Conservar a 4 °C.

4. Preparar el SAGH como sigue: mezclar iguales cantidades de SAGH y solución salina.

Controles

Si es posible, deben incluirse en cada placa GRs negativos para cada antisuero de alta frecuencia y GRs

positivos para cada antisuero de baja frecuencia.

Procedimiento

1. Rotular la microplaca.

2. Llenar la placa con Immusal y decantar con un golpe rápido de muñeca. Secar la superficie de la

placa.

3. Volver a llenar la placa con Immusal.

4. Usando una varilla aplicadora de madera para cada muestra globular, hacer una suspensión

globular al 2% en los pocillos apropiados. Agregar GRs de control al último pocillo.

5. Centrifugar la placa a 2000 rpm durante 5 segundos.

6. Decantar y secar. Resuspender los botones globulares con el agitador de placas y volver a lavar

(ver Nota 4).

7. Decantar, secar, y resuspender los botones globulares.

8. Con una pipeta de pequeño calibre, agregar 1 gota de antisuero a cada pocillo.

9. Mezclar cuidadosamente, manualmente o en el agitador.

10. Agregar 0.20 mL de LIM a cada pocillo con el Jet-Pipet (calibrado para dispensar la cantidad

apropiada para el conjunto a 2.4 mL por fila).

11. Incubar la placa durante 1 minuto a temperatura ambiente. Algunos antisueros pueden necesitar 2-

3 minutos de incubación.

12. Agregar 0.03 mL de solución de Polybrene al 0.05% a cada pocillo con el Jet-Pipet ajustado a 0.4

mL.

13. Incubar a temperatura ambiente durante 10-15 segundos.

14. Centrifugar la placa a 760 g durante 5 segundos.

15. Decantar y secar.

16. Con una pipeta de pequeño calibre, agregar 1 gota de reactivo para neutralización a cada pocillo.

17. Inclinar la placa en un ángulo de 45 grados y leer desde atrás de la placa, recordando que el pocillo

1 es ahora el de la derecha.

18. Los GRs aglutinados se mantendrán en el lugar y los GRs negativos decantarán hacia el fondo.

Esto toma 1-3 minutos. Las pruebas con Polybrene son inestables, por lo que deben ser leídas

rápidamente.

19. Para convertir las pruebas a la fase de AGH, lavar la placa 3 veces con Immusal.

20. Agregar 1 gota de SAGH diluido con una pipeta de pequeño calibre.

21. Mezclar manualmente o en el agitador.

22. Centrifugar a 170 g (1000 rpm) duranter 5 segundos, entonces mantener la placa en un ángulo de

45 grados.

23. Leer la placa desde atrás y registrar los resultados.

24. Mezclar para dispersar los botones globulares. Cubrir la placa para prevenir que se seque y

mantenerla horizontalmente a temperatura ambiente por 30 minutos.

25. Sacar la tapa. Mantener la placa horizontal y leer sobre un espejo de aumento.

Notas

1. Deben usarse microplacas flexibles para este método para reducir el tiempo de centrifugación. De

otra manera, el tiempo de incubación deberá ser más largo.

2. Conservar el Polybrene en una botella plástica.

3. Puede usarse ASB entre 20 y 1% como una alternativa para el Immusal.

4. Durante la preparación de las suspensiones globulares, remover parte del contenido del pocillo si

el botón globular es muy grande.

5. Los agregados inducidos por el Polybrene se disocian en aproximadamente 5 segundos después de

la adición del reactivo de neutralización.

6. Inmediatamente de centrifugadas las placas con Polybrene deben ser leídas rápidamente (entre 1-3

minutos) o parecerán negativas.

7. Los antisueros específicos para los antígenos de los grupos sanguíneos S, Kell, y Kidd en general

reaccionan mejor con Polybrene-IgG.

8. Los antisueros específicos para los antígenos Duffy, MN, y Lewis habitualmente reaccionan mejor

con Polybrene-centrifugación inmediata.

Referencias

Estos procedimientos son una combinación de los métodos en Referencias 1, 2 y 3.

1. Judd WJ. Methods in immunohematology. Miami: Montgomery Scientific Publications, 1988:204-

5.

2. Storry J. Methods manual. Rockville, MD: American Red Cross Blood Services, National

Reference Laboratory for Blood Group Serology, 1992.

3. Hamilton J. Methods manual. Detroit, MI: American Red Cross Blood Services, Southeastern

Michigan Region, 1992.

4. Malde R, Redmond M. Low-ionic Polybrene technique. In: Knight R, Poole G, eds. The use of

microplates in blood group serology: A review of microplate technology in the U.K. Manchester,

England: British Society of Blood Transfusion, 1987.

5. Etges CC, Callicoat PA, Smith DM. A Polybrene microplate technique for large-scale red cell

typing. Transfusion 1983;23:429.

6. Dembitzer HM, Oberhardt BJ, Duffy JL, Lalezari P. Polybrene-induced red cell aggregation in

vitro. Morphologic aspects. Transfusion 1972;12:94-7.

7. Lazelari P, Jiang AF. The manual Polybrene test: A simple and rapid procedure for detection of


8. Fisher GA. Use of the manual Polybrene test in the routine hospital laboratory. Transfusion

1983;23:152-4.

9. Anderson HJ, Patel S. RBC phenotyping using hexadimethrine bromide (Polybrene®) in a

microplate system. Transfusion 1984;24:353-6.

Método 106 – Pruebas en tubos capilares

Principio

El suero y los GRs, y a menudo un reactivo potenciador, son vertidos en un tubo capilar e incubados a

temperatura ambiente. Invirtiendo los capilares para “un desplazamiento” extra de los GRs a través del

suero se aumentan las reacciones, las cuales se leen entonces con un lente de aumento. Si es necesario,

puede realizarse la prueba de antiglobulina humana (AGH) mediante la centrifugación del contenido del

capilar en un tubo de ensayo para completar la prueba. Este es un método sensible que usa muy pequeñas

cantidades de reactivos y suero.

Aplicación

Este método puede usarse para la tipificación de antígenos eritrocitarios, detección de anticuerpos en el

suero, cálculo de mezclas celulares, y subclasificación de anticuerpos IgG (ver Nota 1).


1. Tubos capilares: 0.4 mm de diámetro interno x 90 mm de largo

2. Pipeta con punta Electro Tips 620/650, Medical Laboratory Automation, Inc.

3. Contenedor de plastilina Seal-Ease®, Becton-Dickinson Vacutainer Systems, catálogo número

1050

4. Lentes de aumento manual, Bausch and Lomb, catálogo número 81-23-63

5. Papel tissue absorbente, fino

6. Guantes de goma

7. Dediles de goma gruesa (ver Nota 2)

8. GRs de prueba y de control

9. Suero a estudiar (ver Nota 3 y 4)

10. Albúmina al 30 y 6%, National Production Laboratory, American Red Cross (ver Nota 5)

11. Ficoll, densidad 1.077 LSM, Organon Technika Corp.

12. Papaína al 1% o ficina al 4%, Sigma Chemical Co.

13. Tampones fosfato, pH 5.4 y 7.3

14. Papel de filtro Whatman N° 42

15. Mortero y mano de mortero

16. Clorhidrato de L-cisteína, Aldrich Chemical Co.

17. Fosfato hidrógeno disódico, anhidro (Na2HPO4)

18. Fosfato di-hidrógeno potásico, anhidro (KH2PO4)

19. Microfiltro (ver Fig. 106-1)

20. Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3

21. Parafilm® o film para embalaje limpio

22. Tubos Fisher, Fisher Scientific Co.


1. Para preparar soluciones de reserva de tampón fosfato:

• Solución A: disolver 14.2 g de Na2HPO4 0.1 M en 1000 mL de agua destilada.

• Solución B: disolver 13.6 g de Na2HPO4 0.1 M en 1000 mL de agua destilada.

• pH 5.4: mezclar 3.5 mL de la solución A con 96.5 mL de solución B.

• pH 7.3: mezclar 78.0 mL de la solución A con 22.0 mL de solución B.

2. Para preparar los GRs, lavar 3 veces. Preparar suspensiones al 40-50% en solución salina o,

preferentemente, en solución de Alsever. Los GRs deben estar libres de coágulos. Los GRs

comerciales no deben ser lavados, pero necesitarán ser concentrados al 50% (ver Nota 6).

3. Para preparar el Ficoll, mezclar 5 partes de albúmina sérica bovina (ASB) al 30% y 1 parte de

Ficoll.

4. Para preparar la solución de ficina al 4% (usando la ficina en polvo menos costosa), diluir 4 g en

100 mL de PBS, y antes de usar, diluir la solución 1:5. Filtrar para eliminar la ficina en polvo no

disuelta. Dispensar la solución en alícuotas de 2 mL y conservar a –20 °C (ver Nota 7).

5. Para preparar la solución de papaína al 1%, disolver 2 g de papaína en polvo en bruto Type II en

tampón fosfato de pH 5.4. Moler en un mortero o agitar por 15-20 minutos. Filtrar a través de

papel de filtro Whatman N° 42 y agregar 10 mL de hidrocloridrato de L-cisteína. Incubar la

mezcla por 1 hora, entonces agregar otros 100 mL de tampón fosfato. La mezcla está lista para su

uso o puede ser separada en alícuotas y conservada a –20 °C.

6. Para armar un microfiltro para la filtración de pocas gotas de suero disponible del equipo del

laboratorio, ver Fig. 106-1. Notar que los tips de la pipeta deben tener salientes en los lados para

impedirles caer dentro de los tubos de microcentrífuga.

Controles

1. Suero reactivo de tipificación globular: Estos sueros pueden necesitar diluirse antes de usar (ver

Nota 8).

2. Se usan sueros conocidos de estar libres de anticuerpos para controlar la posible contaminación de

los GRs reactivos con el anticuerpo que podrían llevar los capilares cuando fueron llenados en

pruebas previas.

3. Deben incluirse GRs de control positivo y/o negativo con cada grupo de pruebas.

Procedimiento

Prueba solución salina

1. Insertar el tubo capilar dentro del suero a estudiar y permitir que corra dentro del capilar hasta 1.5-

2.0 cm (ver Nota 9).

2. Secar el capilar con un paño para prevenir el transporte de suero hacia la suspensión globular.

3. Sellar el capilar con el extremo lleno hacia abajo y el nivel del suero hacia el otro extremo para

permitir tener un espacio o burbuja entre los reactivos. Correr suspensión globular al 50% dentro

del capilar casi hasta el final de la columna de suero. Secar nuevamente. (ver Notas 10 y 11).

4. Con el extremo globular hacia arriba, insertar el capilar cuidadosamente en el contenedor de

plastilina a un ángulo de 40 grados (ver Notas 12 y 13).

5. Cuando los GRs se han asentado en el fondo del tubo capilar, invertir el soporte 1-2 veces para

permitir que los GRs fluyan a través del suero y leer la aglutinación con un lente de aumento (ver

Notas 14-18).

Prueba de dos capas de albúmina

1. Permitir que el suero a estudiar corra dentro del capilar hasta 1.5-2.0 cm (ver Nota 9). Secar el

capilar y agregar una cantidad igual de ASB al 30%.

Punta de pipeta

Corte de ¼”

de la punta

de pipeta

Tubo de

microcentrífuga

6-Inserte la punta de pipeta en

el tubo para microcentrífuga Dispense 2 gotas de

suero o más de en la

punta de pipeta

Instrucciones para el montaje del microfiltro

Tampón vaginal Retire una pieza de fibra del tampón y

colóquela dentro dela punta de pipeta

Fibras

Seitz

4-5-Retire una pieza muy pequeña de

una almohadilla Seitz y colóquela por

encima de la fibra del tampón

Tubo Fisher

Introduzca todo el “ensamblado 7”

dentro del tubo de Fisher y

centrifúguelo durante 5 minutos a 7 rpm

Restos de algodón de la

almohadilla en el fondo del tubo

2. Secar el tubo capilar y dejar correr la suspensión globular al 50% hasta medio camino de la

columna de suero-albúmina. Secar nuevamente. (ver Notas 10 y 11).

3. Insertar el capilar en el contenedor de plastilina en un ángulo de 60 grados (ver Notas 12 y 13).

4. Después que los GRs se han asentado en el fondo del tubo capilar, invertir el soporte 1-2 veces

para permitir que los GRs fluyan a través del suero y leer la aglutinación con un lente de aumento

(ver Notas 14-18).

Prueba de ficina al 4%

1. Agregar una pequeña gota (0.025 mL) de solución de ficina al 4% a cada gota de suspensión al 40-

50% de los GRs de prueba en solución de Alsever y mezclar cuidadosamente.

2. Incubar a temperatura ambiente durante 15-30 minutos y conservar a 4 °C. (No son necesarios

lavados adicionales). Los paneles globulares pueden ser preparados por adelantado. Después

dispensar 4-5 gotas de los GRs tratados con ficina en los pocillos de una microplaca. Cubrir la

microplaca con Parafilm o film para embalaje y guardar. Antes de usar, sacar el exceso del medio

de suspensión para tener suspensiones globulares al 50% (ver Nota 20).

3. Diluir la mayoría de los sueros con igual cantidad de solución salina o ASB al 6% para evitar el

rouleaux. Los sueros comerciales pueden necesitar diluciones mayores (ver Nota 19).

4. Insertar los capilares dentro del suero a estudiar y permitir que el suero corra dentro del capilar

hasta 1.5-2.0 cm (ver Nota 9).

5. Secar los capilares, insertar dentro de los GRs apropiados y dejar que una cantidad igual de GRs

fluyan dentro del capilar. Secar nuevamente. (ver Notas 10 y 11).

6. Insertar el capilar en el contenedor de plastilina en un ángulo de 60 grados (ver Notas 12 y 13).

5. Permitir que los GRs se asienten en el fondo del tubo capilar, entonces invertir el soporte de los

tubos. Invertir 1-2 veces y leer la aglutinación con un lente de aumento (ver Notas 14-18).

Prueba de ficina de dos capas

1. Preparar la ficina al 4% como más arriba.

2. Los sueros comerciales pueden necesitar ser diluidos de 1:2 hasta 1:10.

3. Retirar volúmenes iguales de suero, ficina al 4%, y GRs, en ese orden, en los tubos capilares,

secando el capilar después de cada reactivo. Insertar los capilares en el sostén en un ángulo de 60

grados. El soporte de capilares deberá invertirse 1-2 veces antes de hacerse las lecturas finales con

un lente de aumento (ver Notas 8-20).

Prueba con papaína

1. Esta prueba se lleva a cabo de la misma forma que la prueba de ficina de dos capas.

Cálculo de mezclas globulares

1. Controles: preparar mezclas de GRs aumentando el porcentaje de los antígenos en cuestión (e.j.,

2% de GRs de grupo A en 98% de grupo O, 4% en 96%, 10% en 90%, etc.).

2. Estudiar cada mezcla de control y las células a estudiar con el suero apropiado (e.j., anti-A para el

conjunto de más arriba) usando uno de los métodos para tubos capilares descriptos previamente.

3. Las reacciones en campo mixto en los capilares produce finas estriaciones en una columna de GRs

negativos. Comparar el caso a prueba con los controles y estimar el porcentaje de mezcla en los

GRs a prueba.

Subclasificación de IgG

1. La subclasificación de IgG ha sido llevada a cabo en tubos capilares, pero los reactivos de

subclasificación son de poco suministro, muy costosos, y difíciles de controlar. La investigación

de estos problemas puede, posiblemente, ser pronto aliviada por reactivos monoclonales

confiables.

Prueba antiglobulínica (PAG)

1. El método de Graves (ver Referencias 3) para las pruebas AGH en tubos capilares requiere el

llenado de 2 capilares por cada mezcla de suero-GRs o usando un poco más de cada reactivo por

tubo capilar. Después de haberse llevado a cabo las pruebas de la forma habitual, los capilares se

insertan con su extremo abierto hacia abajo dentro de un tubo de ensayo que conteniendo solución

salina. Los tubos de ensayo entonces son centrifugados para expulsar el contenido de suero-GRs

dentro de los tubos normales. A continuación, realizar la PAG (ver M43).

2. El contenido de los capilares también puede ser expelido dentro de los pocillos de una microplaca,

pero esto requiere el uso de una pequeña perilla de goma para expulsar el contenido después de

romper el extremo tapado del tubo capilar.

3. Los eluatos pueden ser probados convenientemente en tubos capilares abiertos que son puestos

horizontales en surcos estrechos durante la incubación. Se puede hacer un soporte ranurado con

arcilla de modelado o de tres cajas contenedoras de plástico (para diapositivas) unidas con cinta

adhesiva. Luego se hace fluir AGH monoclonal en los capilares abiertos, los cuales son insertados

en los contenedores de Seal-Ease de la manera usual. En las sensibles pruebas en tubos capilares,

es preferible el SAGH monoclonal a los reactivos antiglobulínicos de rutina para evitar la

actividad de los anticuerpos antiespecie.

Interpretación

1. Las reacciones positivas producen una variedad de reacciones:

a. Los GRs pueden verse como cuentas.

b. Pueden verse cordones de GRs con reacciones muy fuertes –particularmente Rh.

c. Estriaciones entrecruzadas muy delgadas son típicas de las reacciones en campo mixto. Estas

tienden a desaparecer si se levanta el soporte, pero las estriaciones regresarán si se deja que las

pruebas decanten sin manipulaciones posteriores del soporte. Otros tipos de reacciones no son

perturbadas por el movimiento del soporte.

2. Las pruebas negativas son columnas globulares lisas y enteras.

Notas

1. Para mantener la habilidad con las pruebas en tubos capilares, deben realizarse a menudo.

2. El dedil de goma se usa para proteger el dedo que se coloca sobre el extremo de los tubos

capilares.

3. 1 mL de suero es suficiente para 300-400 pruebas, o muchas más si es posible diluirlo. Puede

ensayarse un panel celular completo con 1 gota de suero.

4. No puede usarse plasma. Si la muestra no es muy vieja, el plasma puede ser convertido en suero

con clorhidrato de calcio o trombina bovina (ver M126). Liberar el suero de la grasa excesiva y de

partículas materiales por filtración. Puede ser necesario diluir el suero con solución salina o ASB

al 6%.

5. Algunas preparaciones de ASB no son satisfactorias porque el contenido de polímero es muy bajo

o el contenido de ácidos grasos libres es muy alto, o ambas cosas.

6. Los GRs deben ser lavados bien para librarlos del plasma y permitir el tratamiento enzimático. Las

suspensiones globulares deben ser bien mezcladas inmediatamente antes de usar para evitar los

agregados globulares.

7. Ponerse mascarilla y guantes y pesar la ficina en polvo bajo una cubierta.

8. La sensibilidad del método en tubos capilares es tal que a menudo revela anticuerpos séricos no

detectados por otras técnicas.

9. Las dimensiones de los tubos capilares son críticas para una prueba precisa. El pequeño calibre y

la gran área de la superficie hacen que el método en tubo capilar sea muy sensible. Muchos sueros

que requieren de una fase AGH en el método en tubo convencional reaccionarán en los capilares

sin AGH. Algunos sueros son estrictamente dependientes de la AGH.

10. Las burbujas de aire impiden la adecuada mezcla de los reactivos. Para el llenado, del extremo del

capilar debe ser mantenido inclinado apuntando hacia abajo para evitar un espacio de aire que

podría crear una burbuja.

11. Es esencial el cuidado en el llenado de los capilares para disminuir el derroche de los reactivos. El

secado con un paño ayuda a impedir la contaminación con el suero de las suspensiones GRs

restantes.

12. Para un apropiado sellado, el capilar debe ser insertado verticalmente en la plastilina y luego

ajustado suavemente al ángulo apropiado.

13. El ángulo depende de los reactivos de la prueba. Los ángulos bajos aumentan la sensibilidad, pero

son muy lentos para muchos reactivos viscosos tales como la ASB.

14. Los capilares deben ser colocados tan cerca uno de otro como sea posible en el contenedor de

plastilina a fin de que puedan ser estudiadas tantas pruebas como sea posible en un solo campo de

visión.

15. Las lentes de aumento deben tener un campo de visión adecuado y un aumento de 6x a 8x. Para

una observación satisfactoria de muchos capilares simultáneamente, sostener la lente de aumento

contra la ceja y atraer el soporte con los capilares cerca de la lente.

16. El tiempo de incubación varía con los diferentes sueros. Las incubaciones a temperatura ambiente

son satisfactorias para casi todas las pruebas. Las temperaturas más altas son propensas a ablandar

la plastilina, y los capilares pueden caerse.

17. Cuando los GRs se han amontonado en el fondo de los capilares, voltear la parte superior del

soporte hacia abajo y apoyarlo en un estante u otro soporte de manera que los GRs puedan pasar a

través de la columna de suero nuevamente. Varios de tales “pasajes” pueden potenciar

grandemente algunas reacciones. Deben usarse soportes separados para las pruebas que necesitan

diferente número de inversiones.

18. Las mezclas de anticuerpos pueden ser visibles con diferentes porcentajes de reacciones.

19. La prueba requiere ASB para la dilución del suero; es importante seleccionar un suero que se

conozca es negativo por este método. La solución salina o la ASB al 6% pueden usarse como

diluyente para las pruebas enzimáticas.

20. Los GRs están listos para la mayoría de las pruebas después de alrededor de 30 minutos de

tratamiento con ficina al 4%. Estas suspensiones globulares, sin lavados adicionales, dan

reacciones fuertes con anticuerpos Kidd y Dombrock si se usan el día después de su tratamiento

con ficina. Los GRs tratados pueden ser conservados a 4 °C si se suspenden en una solución de

Alsever modificada.

Referencias

1. Hardman J, Pierce SR, Crawford MN, Beck ML. A modified capillary test using 4% ficin.


2. Issitt PD, ed. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publications,

1985.

3. Graves B. Application of the antiglobulin phase to capillary tube testing. Transfusion 1981;21:373.

Para referencias adicionales, ver el Capítulo VIII.

Método 107 – Gel Sephadex® en pruebas inmunohematológicas


La identificación de anticuerpos puede ser realizada por varias formas (ver Nota 1). Esta prueba en gel

usa el principio del fraccionamiento proteico basado en el peso molecular. El tamaño del poro del gel es

seleccionado de manera que los GRs no aglutinados pasen libremente a través de la columna de gel bajo

centrifugación, mientras que las proteínas del suero permanecen atrapadas en las esferas de gel de la

interface del suero y la columna de gel, y los aglutinatos forman un entramado en la interface o cerca de

ella. Las reacciones positivas y negativas pueden ser fácilmente identificadas y pueden leerse muchas

horas después que se ha sido hecha la prueba. Por la incorporación de antiglobulina humana (AGH)

dentro del gel, puede realizarse una prueba antiglobulínica (PAG) de una etapa, que no requiere lavados.

Esta tiene una cantidad de ventajas, incluyendo un manejo mínimo de muestras potencialmente

infecciosas y residuos líquidos contaminados.


1. Sephadex G100 superfino, Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.

2. EDTA / solución salina de baja fuerza iónica (LISS)

3. NaOH

4. K2EDTA

5. AGH (poliespecífica o IgG)


7. Tubos de ensayo de poliestireno (6 x 50 mm), Luckhams Ltd.

8. Reactivos globulares comerciales


10. pHmetro o papel de pH

11. Centrífuga


13. Visualizador de aglutinación


1. Preparar el NaOH 0.125 M: agregar 0.5 g de NaOH a 100 mL de agua destilada.

2. Preparar el EDTA/LISS: disolver 2.7 g de K2EDTA en 50 mL de NaOH 0.125 M. Diluir hasta un

volumen de 500 mL con LISS (ver M23). El pH final debe ser de 7.0-7.2.

3. Hacer una dilución 1:10 de suero AGH comercial en EDTA/LISS. Si no se requiere AGH,

substituir por ASB al 1%. Mezclar 5 g de gel Sephadex seco en 100 mL de diluyente.

4. Dispensar 350 uL de suspensión de gel dentro en los tubos de 6 x 50 mm. Centrifugar a 1000 g

durante 60 segundos para remover las burbujas de aire y compactar el gel.

5. Descartar el sobrenadante. Así, los tubos de gel están listos para su uso o pueden conservarse,

tapados, a 4 °C.

6. Diluir los reactivos globulares comerciales a una suspensión del 1% con solución de Alsever.

Procedimiento

1. Dispensar 1 gota (aproximadamente 35 uL) de GRs al 1% en los tubos con gel.

2. Agregar 1 gota del suero a estudiar.



5. Leer macroscópicamente sobre la luz de un visualizador de aglutinación.

Interpretación

Ver Fig. 107-1 para la interpretación.

Negativo -----------------Positivo----------------------------- Campo Mixto

Fig. 107-1: Interpretación de patrones de aglutinación en las pruebas en gel

Notas

1. El método descripto es sólo un método de investigación y debe ser tratado con cuidado aplicado a

todos los procedimientos en desarrollo.

2. Los tubos de gel deben centrifugarse en gradillas de tubos tan cerca de la línea del eje como sea

posible. Los GRs no aglutinados sedimentarán de una forma más difusa cuanto más lejos estén

puestos los tubos de la línea del eje. A menos que se obtengan gradillas especialmente diseñadas

para los tubos, pueden modificarse para ese propósito microplacas con pocillos en U.

Referencias

1. Moore HC, Mollison PL. Use of a low-ionic-strength medium in manual tests for antibody

detection. Transfusion 1976;16:291-6.

2. Storry JR. The investigation of low affinity RBC antibodies by a modified antiglobulin technique.

Bristol Polytechnic, UK, 1990. Thesis.

Método 108 – Estudios de la sobrevida de GRs marcados con sustancias radioactivas


La sobrevida de GRs marcados in vivo puede ayudar en la evaluación de problemas transfusionales

complejos. Una pequeña alícuota de GRs es marcada con un isótopo radioactivo tal como el cromo 51

(51Cr). Los GRs marcados son infundidos y se hace una medición midiendo la radioactividad en

intervalos específicos tras la infusión. Basado en ese valor, puede calcularse la sobrevida in vivo de los

GRs infundidos. Esta información puede usarse en la planificación de las siguientes transfusiones.


1. Sangre de un donante, de una unidad o de una muestra estéril anticoagulada (ver Notas 1 y 2)

2. Tubos cónicos, 50 mL

3. Radiocromato de sodio (Na2 51Cr O4)

4. Jeringas de tuberculina, 60 mL y 35 mL

5. Agujas 18-G, butterfly 19-G, o para punción lumbar 21-G

6. Pipeta calibrada

7. Heparina, 1000 USP unidades/mL

8. Cloruro de sodio al 0.9%, para inyección


10. Acceso a un calibrador de dosis de radiación

11. Contador gamma y frascos de recuento

12. Balanzas

13. Solución salina inyectable estéril

14. Tubos de ensayo

15. Tubos con EDTA

16. Pipeta de 1.0 mL

17. Centrífuga de microhematocrito

18. Tubos capilares


Marcado de los glóbulos rojos

Usar una técnica estrictamente estéril desde el principio hasta el fin. Todos los reactivos deben estar

aprobados para uso en humanos. Todos los pasos deben ser efectuados a temperatura ambiente (20-24

°C). Descartar el material correspondiente en contenedores para residuos radioactivos.

1. Recoger 3-5 mL de sangre entera bien mezclada o 1.5-3.0 mL de GRs empaquetados y colocar en

un tubo cónico de 50 mL estéril. Si se usa sangre entera, centrifugar a 2000 g durante 10 minutos

para remover el plasma.

2. Agregar suficiente radiocromato de sodio para permitir como mínimo un recuento total de 5000 en

la muestra tomada inmediatamente después de la transfusión (15 a 25 uCi de 51Cr para un adulto

promedio).

3. Agregar el radiocromato de sodio a la suspensión globular de a pocas gotas mezclando cada vez y

continuamente el tubo.

4. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, mezclando cada 10 minutos.

5. Durante la incubación, preparar la solución de heparina de enjuague:

a. A una jeringa de 60 mL con una aguja de 21-G, tirar el émbolo hasta la línea de 1 o 2 mL e

insertar dentro de frasco de heparina, tirar hacia atrás hasta la línea de 5 mL, y soltar. La

jeringa está ahora humedecida con heparina.

b. Conectar la jeringa al dispensador de un envase de solución salina inyectable estéril. Llenar la

jeringa, luego retirar y tapar la jeringa para su uso posterior. Colocar una jeringa de 35 mL

estéril sobre el envase de solución salina.

6. Después de 30 minutos de incubación, lavar los GRs por la suave adición de 20-30 mL de solución

salina estéril de la jeringa de 35 mL. Mezclar bien y centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos.

Retirar y descartar el sobrenadante. Repetir 1 vez.

7. Resuspender las células en 10 mL de solución salina estéril. Mezclar bien.

8. Transferir 0.5 mL de los GRs en un tubo de ensayo plástico.

9. Preparar muestras patrón por duplicado trasladando exactamente 0.2 mL de los GRs marcados del

tubo plástico y exactamente 0.8 mL de solución salina a frascos de recuento gamma.

10. Transferir los restantes GRs radiomarcados hacia una jeringa de 20 mL a través de una aguja para

punción lumbar de 18-G. Sacar la aguja y tapar la jeringa.

11. Pesar la jeringa y registrar.

12. Medir la radioactividad de la jeringa en un calibrador de dosis para asegurarse que los GRs han

sido marcados con una apropiada dosis de 51Cr. Registrar la lectura.

Procedimiento

Infusión de los GRs marcados

1. Punzar una vena periférica con una butterfly de 19-G. Tomar una muestra de 5 mL para medir la

radioactividad de fondo. Enjuagar la vía con la solución salina heparinizada para la toma de

muestras posterior.

2. Infundir los GRs marcados en una vena periférica del brazo opuesto. Completar la infusión dentro

del minuto. Registrar el tiempo cero cuando la muestra ha sido infundida.

3. Enjuagar la jeringa aspirando suavemente y reinfundiendo una pequeña muestra venosa y sacar la

aguja del paciente. Tapar la jeringa. Pesar y registrar.

Colección de la muestra sanguínea

1. Recoger una muestra de 5.0 mL en un tubo con EDTA del brazo opuesto al de la infusión a los 3

minutos, y muestras de 3.0 mL a los 5, 7.5, 10 y 60 minutos siguientes a la infusión.

2. Mantener la vía abierta con solución salina heparinizada entre las muestras. Antes de tomar cada

muestra, enjuagar la solución de heparina de la vía por la extracción de una alícuota de 1-2 mL en

una jeringa separada y descartarla.

3. Extraer una muestra de 3 mL a las 24 horas con una venipuntura distinta. Las muestras pueden

obtenerse a plazos distintos si es necesario para una definición precisa de la curva de sobrevida.

Determinación de los recuentos de 51Cr

1. Transferir exactamente 1.0 mL de la sangre bien mezclada del tubo de cada muestra a estudiar a un

tubo de recuento con una pipeta calibrada. Preparar en duplicado.

2. Determinar el hematocrito de la sangre restante en cada muestra.

3. Centrifugar la sangre restante en la muestra de los 3 minutos a 2000 g durante 15 minutos.

Transferir exactamente 1.0 mL de plasma a un tubo de recuento para la evaluación de la hemólisis

en el sobrenadante.

4. Incubar un tubo de blanco y un duplicado de los tubos (preinfusión) en todos los recuentos.

5. Hacer el recuento de todas las muestras juntas para eliminar el efecto de la descomposición

radiactiva. Contar hasta un recuento total de cómo mínimo 500 cpm (cuentas por minuto).

Interpretación

1. Convertir el cpm total de cada muestra al cpm neto restando el promedio del cpm de fondo.

Corregir el recuento a las 24 horas y cualquier recuento subsiguiente para la elución del 51Cr

(recuento a las 24 horas x 1.03).

2. Convertir el cpm neto al cpm neto por mL de GRs para cada muestra dividiendo por el hematocrito

(x 100).

3. Promediar el cpm neto por mL con los duplicados para cada muestra.

4. Si el cpm neto por mL de GRs es más alto en la muestra de los 3 minutos y el recuento en el

plasma sobrenadante es menor al 5% del recuento total, puede usarse el cpm neto a los 3 minutos

como valor del 100% de sobrevida.

a. Si el recuento del plasma excede el 5% del recuento total a los 3 minutos, sospechar de una

rápida hemólisis o un lavado inadecuado de las células infundidas.

b. Si los recuentos de los 5, 7.5, o 10 minutos excede el de los 3 minutos, sospechar una mezcla

secundaria retrasada por enfermedad cardíaca, esplenomegalia, etc. Promediar los recuentos de

las muestras de los 3 minutos con la de 10 minutos para determinar el recuento del 100% de

sobrevida.

5. Los porcentajes de sobrevida subsiguientes son calculados así:

Sobrevida de los GRs a las 24 hs (%) = media del cpm/mL de GRs x 100 (24 hs)

cpm/mL de GRs (3 min)

6. Construir una curva de sobrevida de los porcentajes de sobrevida globular de cada muestra

recolectada. Una sobrevida eritrocitaria de menos del 70% a los 60 minutos o a las 24 hs sugiere

que no deben ser transfundidas grandes cantidades de sangre similar. Ha sido publicado un

detallado análisis sobre la interpretación de las curvas de sobrevida (ver Nota 3).

Notas

1. La sangre usada debe ser investigada con todas las pruebas para enfermedades infecciosas.

2. La muestra recientemente extraída, estéril y anticoagulada no debe ser con heparina. Es preferible

que la unidad de donante sea de menos de 5 días de extraída.

3. Para asegurarse que no ha habido error en los cálculos del porcentaje del 100% de sobrevida, es

útil comparar el volumen sanguíneo calculado por el cpm a los 3 minutos con el volumen

sanguíneo previsto a partir de la altura y peso del paciente.

a. Volumen sanguíneo previsto del paciente (VSP):

•Hombres: VSP en litros = (altura en metros3 x 0.3669) + (peso en kg x 0.3219) + 0.6041

•Mujeres: VSP en litros = (altura en metros3 x 0.3561) + (peso en kg x 0.03308) + 0.1833

b. Volumen sanguíneo calculado del paciente (VSC):

• Determinar el volumen de los GRs infundidos restando el peso de la jeringa vacía después de

la infusión al peso de la jeringa llena pre infusión.

• Determinar el cpm/mL/GR en la solución normal multiplicando el cpm (normal) x 5.

VSC en litros = volumen infundido x cpm/mL/GR (normal)

cpm/mL/GR (muestra a los 3 minutos)

c. El VSP y el VSC no deben variar por más del 10%. Una variación que exceda el 10% sugiere

una rápida hemólisis, extravasamiento en el lugar de infusión, o daño de la muestra durante su

preparación.

Referencias

1. Davey RJ. Mechanisms of premature der cell destruction. In: Judd WJ, Barnes A. Clinical and

serological aspects of transfusion reactions. Arlington, VA: AABB, 1982:1-35.

2. International Committee for Standardization in Hematology. Recommended method por

radioisotope red cell survival studies. Br J Haematol 1980;45:659-66.

3. Davey RJ. Chromium red cell survival as a measure of tranfusion compatibility. Methods manual.

Bethesda, MD: Transfusion Service, National Institutes of Health, 1993.

Método 109 – Pruebas cruzadas biológicas


Este método puede ser usado para evaluar los riegos de una destrucción inmediata de los GRs

transfundidos.


1. Equipamiento del laboratorio clínico para realizar pruebas inmediatas

2. Materiales para la venipuntura

3. Materiales para la administración de sangre

4. GRs del donante

Procedimiento

1. Realizar una prueba de compatibilidad sérica

2. Seleccionar la unidad apropiada para la transfusión (e.j., la menos incompatible).

3. Administrar lentamente la sangre en presencia del médico clínico o la enfermera, o ambos.

4. Después de 15 minutos (aproximadamente 30 mL), detener la transfusión, extraer un tubo con

EDTA de sangre de otra vena.

5. En el laboratorio del banco de sangre:

a. Observar el plasma en busca de hemólisis.

b. Realizar la prueba antiglobulínica directa (PAD), si la PAD pre-transfusión fue de 1+ o menos.

6. Si la prueba está dentro de los límites normales, recomendar que la transfusión continúe.

Notas

1. Si se necesita una mayor seguridad en la valoración de la hemoglobina en el plasma, analizar una

muestra pretransfusional y una muestra a los 15 minutos después de la transfusión.

Referencias

1. Kruskall MS. Clinical management of transfusion to patients with red cell antibodies. In: Nance

SJ, ed. Immune destruction of red blood cells. Arlington, VA: AABB, 1989:273-4.

Método 110 – Medición de la sobrevida eritrocitaria por citometría de flujo


Este método puede ser usado para medir la sobrevidade los GRs después de una transfusión.


1. Unidad de donante fenotípicamente distinguible de los GRs del receptor

2. Materiales para la administración de sangre

3. Materiales para la venipuntura

4. Muestras del paciente (e.j., un tubo con EDTA) como muestras espaciadas post transfusión

5. Citómetro de flujo

6. Anticuerpo de grupo sanguíneo elegido por los resultados de la fenotipificación de los GRs del

donante y el paciente –preferiblemente un anticuerpo IgG.

7. Anticuerpos marcados con fluorocromo (e.j., anti-IgG o anticuerpo de grupo sanguíneo)

8. Solución salina


10. Tubos de ensayo

11. Valor de hematocrito del paciente en el momento de la transfusión y de los días siguientes si se

desea una sobrevida extendida de los GRs

12. Altura y peso del paciente

Procedimiento

1. Obtener el peso en gramos de la unidad de sangre.

2. Fenotipificar los GRs del paciente y de la unidad de sangre.

3. Identificar las diferencias fenotípicas (e.j., paciente negativo, dador positivo).

4. Después de la infusión de la unidad, obtener muestras a intervalos espaciados. Los tiempos

sugeridos son a los 3 minutos, 60 minutos, y 24 horas.

5. Control: Preparar una suspensión al 4% en salina de GRs positivos y negativos para el antígeno

seleccionado para el estudio. Mezclar estas 2 suspensiones globulares como la población

aproximada de GRs transfundidos en la circulación del paciente. Por ejemplo, si el 20% de los

GRs del paciente son GRs transfundidos, mezclar 1 mL de la suspensión al 4% de los GRs

positivos para el antígeno con 4 mL de la suspensión de GRs negativos para el antígeno.

6. Lavar los GRs de los controles y del paciente, y resuspender al 2-4% en salina.

7. Agregar el anticuerpo de grupo sanguíneo que fue determinado para ser aplicable a los GRs del

paciente y del donante, e incubar de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Alternativamente,

pueden usarse anticuerpos marcados directamente con fluorocromo (omitir el paso 8).

8. Lavar los GRs y agregar la cantidad adecuada de anti-IgG marcada con fluorocromo,

habitualmente fluoresceína, pero puede ser ficoeritrina.

9. Después de la incubación, lavar los GRs y resuspender al 0.2% o a una suspensión apropiada para

el citómetro de flujo.

10. Mezclar en un agitador y aspirar en el citómetro de flujo inmediatamente después de la agitación.

11. Analizar comparativamente los resultados de la curva normal de los controles con los resultados de

las muestras del paciente.

Notas

1. La resuspensión del botón globular con una pipeta MLA de 200 uL puede beneficiar la disolución

de los agregados.

2. Es importante la preparación exacta de las mezclas globulares y la adecuada mezcla de las

suspensiones globulares en todas las fases.

3. El procedimiento para el análisis eritrocitario con el citómetro de flujo debe ser planeada con

anterioridad a estudiar la sobrevida globular.

Referencias

1. Nance SJ, Garratty G. Application of flow cytometry to immunohematology. J Immunol Meth

1987;101:127-31.

2. Nance SJ, Nelson JM, Arndt PA, Lam HT, Garratty G. Quantitation of fetal-maternal hemorrhage

by flow cytometry: Simple and accurate method. Am J Clin Pathol 1989;91:288-92.

3. Arndt P. Personal communication, 1990.

Método 111 – Ensayo de monocapa de monocitos (MMA) para predecir la significancia clínica de

un anticuerpo eritrocitario

Principio

Se recubre con el anticuerpo que nos interesa, GRs antígeno positivo. Los GRs sensibilizados son

incubados con monocitos de sangre periférica en un tejido de cultivo delgado sobre portaobjetos. Después

de ser fijados y teñidos, los portaobjetos son examinados bajo el microscopio, y se determina el

porcentaje de monocitos reactivos. Menos del 3% de monocitos reactivos indica que el anticuerpo

probablemente no es de significancia clínica.

Aplicación

Este es un método in vitro para predecir la sobrevida de los GRs transfundidos en casos de aloanticuerpos

hacia antígenos de alta incidencia con un historial de significancia clínica variable.


1. Sangre fresca normal de donante (anticoagulada)


3. Gradiente de densidad, e.j., Ficoll-Hypaque®, Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.

4. Medio RPMI 1640, pH 7.2, Sigma Chemical Co.; GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.

5. Suero fetal de ternero, inactivado por calor, GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.

6. Salina tamponada con fosfato (PBS) estéril, GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.

7. Pipetas estériles

8. Pipetas MLA y tips

9. Cámara y portaobjetos con tejido de cultivo Lab-Tek®, Nunc, Inc.

10. Incubador seco (37 °C)

11. Control positivo, anticuerpo MMA positivo conocido, (e.j., anti-D)


13. GRs antígeno positivo


15. Suero Antiglobulina Humana (SAGH)/ anti-IgG

16. Tintura Wright/Giemsa

17. Microscopio con objetivo de inmersión

18. Aceite de inmersión

19. Caja de portaobjetos

20. Tubos de centrífuga de 50 mL con tapa


Todos los pasos deben realizarse usando una técnica estéril, y no debe haber retrasos entre los pasos.

Preparación globular

1. Comenzar la sensibilización de los GRs alrededor del paso 12 de la preparación de la monocapa de

monocitos.

2. GRs para la prueba: seleccionar 1 o 2 ejemplos de GRs positivo para el antígeno apropiado; usar

GRs con una expresión fuerte del antígeno si se investigan las potenciales reacciones

transfusionales; usar GRs con una expresión débil del antígeno si se realizan evaluaciones de

potencial enfermedad hemolítica del recién nacido.

3. GRs para control del suero: un ejemplo de GRs negativo para el antígeno debe ser “sensibilizado”

con el suero en paralelo con los GRs positivos para el antígeno.

4. Control globular: deben incluirse GRs no sensibilizados (esto es, todos los GRs usados en el

ensayo) incubados con PBS en paralelo con el suero a estudiar.

Sensibilización globular

1. Agregar 0.6 mL de suero a 0.3 mL de los GRs a estudiar y 0.6 mL de PBS a 0.3 mL de los GRs de

control en un tubo de ensayo. Agregar 0.6 mL de una fuente inerte de complemento fresco si el

anticuerpo evaluado se conoce o se sospecha de ser capaz de activar el complemento.

2. Incubar 1 hora a 37 °C.

3. Lavar 4 veces con PBS.

4. Resuspender al volumen original en RPMI con 10% de suero fetal de ternero.

5. Estudiar 1 gota de los GRs sensibilizados con SAGH anti-IgG y 1 gota con SAGHanti-C3. Leer y

registrar los resultados.

6. Estos GRs suspendidos en RPMI son usados en el paso 4 del ensayo de monocapa de monocitos.

Preparación de la monocapa de monocitos

1. Sacar todos los reactivos de la heladera y colocar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

2. Obtener 21 mL de sangre fresca anticoagulada (e.j., EDTA) de dos individuos normales.

3. Si los monocitos del pacientes también van a ser probados, incluir 21 mL de sangre fresca

anticoagulada de un individuo normal. (La muestra normal servirá como un estudio control, e.j.,

sangre extraída al mismo tiempo y manejada de la misma forma que la muestra del paciente).

4. Verter la sangre para la separación de las células mononucleares en tubos de centrífuga estériles de

50 mL.

5. Centrifugar para preparar plasma rico en plaquetas (PRP) (e.j., 150 x g por 10 minutos).

6. Retirar el PRP.

7. Agregar PBS estéril para obtener una dilución 1:4 de las células mononucleares concentradas.

Mezclar suavemente por inversión.

8. Separar en alícuotas el gradiente de densidad adecuado en un tubo de centrífuga estéril distinto

(siguiendo las instrucciones del fabricante para la cantidad de gradiente y el volumen de sangre

diluida).

9. Hacer cuidadosamente una capa con la dilución 1:4 de las células mononucleares sobre el

gradiente de densidad, teniendo cuidado de no mezclar con la capa interior del gradiente de

densidad.

10. Centrifugar para separar las células blancas mononucleares (e.j., 800 x g durante 15 minutos).

11. Retirar la capa mononuclear y colocar en un tubo estéril distinto.

12. Lavar 3 veces con PBS estéril.

13. Después de la centrifugación final, remover la PBS, dejando aproximadamente 1 mL sobre el

botón de células mononucleares.

14. Resuspender en RPMI con 10% de suero fetal de ternero en un volumen adecuado para obtener un

recuento de células mononucleares de aproximadamente 3 a 6 x 106/mL.

15. Resuspender suavemente y mezclar con una pipeta (se sugieren pipetas MLA de 200 uL).

Procedimiento

1. Separar en alícuotas 0.2 mL de la preparación de monocitos en cada cámara de cultivo o

portaobjeto Lab-Tek necesarios para el ensayo. Un pocillo debe contener solamente monocitos

(como un control).

2. Incubar a 37 °C en un incubador seco durante 1 hora para permitir que los monocitos se adhieran

al vidrio.

3. Retirar el RPMI sobrenadante con una pipeta y descartar.

4. Agregar 0.2 mL de los GRs sensibilizados y de control resuspendidos en RPMI con 10% de suero

fetal de ternero a cada cámara.

5. Llevar al incubador seco a 37ºC durante 1 hora.

6. Aspirar el RPMI sobrenadante con una pipeta.

7. Sacar la cámara y el empaque

8. Enjuagar los portaobjetos suavemente en un volumen de 250 mL de PBS.

9. Secar los portaobjetos y teñir con Wright/Giemsa.

10. Cuando estén secos, cubrir con cubreobjetos. Examinar 200-600 monocitos en busca de adherencia

y fagocitosis (ver Nota 2). Leer con alto aumento, 1000x, bajo aceite de inmersión. Un monocito

reactivo tiene como mínimo un GR adherido a él o fagocitado.

Notas

1. Los rangos normales para la significancia o insignificancia debe establecerse mediante pruebas de

laboratorio.

2. Deben evaluarse tantos monocitos como sea posible. Si la reactividad es menor del 20%, deben

evaluarse 600 monocitos; si la reactividad es mayor del 20%, deben evaluarse como mínimo 200

monocitos.

3. Es aconsejable consultar con el Laboratorio de Investigaciones de los Servicios de Sangre de la

Cruz Roja Americana, Región Sur de California, o los Laboratorios de Referencia Nacionales de la

Cruz Roja Americana para la Serología de Grupos Sanguíneos antes de intentar el ensayo.

4. Si van a ser evaluados anticuerpos que sabemos que son capaces de fijar complemento, debe

realizarse una prueba aparte usando complemento fresco en la fase de sensibilización.

Referencias

1. Garratty G. Predicting the clinical significance of alloantibodies and determining the in vivo

survival of transfused RBCs. In: Judd WJ, Barnes A, eds. Clinical and serological aspects of

transfusion reactions. Arlington, VA: AABB, 1982:91-119.

2. Nance SJ, Arndt PA, Garratty G. Predicting the clinical significance of RBC alloantibodies using a

monocyte monolayer assay. Transfusion 1987;27:449-52.

3. Garratty G. Predicting the clinical significance of red cell antibodies with in vitro cellular assays.

Trans Med Rev 1990;IV(4):297-312.

4. Schoeppner-Esty S, Chin J, Mallory D, Davey R. A comparison of the monocyte monolayer assay

(MMA) to the 51chromium (51Cr) red cell survival for determining the clinical significance of red

cell alloantibodies (abstract). Blood 1986;68:302a.

Método 112 – Técnica de microfluorescencia para tipificar GRs obtenidos de una muestra de

vellocidades coriónicas (MVC)


Las biopsias de vellocidades coriónicas contienen tanto GRs fetales como maternos. Para realizar una

tipificación de los antígenos fetales, debe diferenciarse esta población celular. Las pruebas

convencionales no son adecuadas debido al pequeño número de GRs presente. Este método puede usarse

para la tipificación ABO y Rh del tejido trofoblástico del primer trimestre.


1. 20 mg de tejido trofoblástico

2. Placas de microtitulación de 10 uL, Microtest®, Falcon Division, Becton-Dickinson Co.


4. Microscopio fluorescente con objetivo de inmersión Leitz con HBO 50 lamps

5. Poly-l-lysina 0.1 mg/mL en salina tamponada con fosfato (PBS), Sigma Chemical Co.

6. Suero fetal de ternero, al 20% en PBS, ICN Biomedicals, Inc.

7. Tampón fosfato hipotónico (TFH), pH 7.43, 30 mosmol/L sin NaCl

8. Suero IgM anti-humano de conejo conjugado con fluoresceína

9. Suero IgG anti-humano de conejo conjugado con fluoresceína

10. Suero Ig anti-conejo de caballo conjugado con fluoresceína

11. GRs de la MVC a estudiar

12. PBS (ver M133)

Procedimiento

1. Llenar tantos pocillos de la placa de microtitulación como sean necesarios para la prueba con poly-

l-lysina 0.1 mg/mL en PBS.

2. Incubar durante 1 hora.

3. Lavar los GRs 10 veces con PBS. Hacer una suspensión globular que tenga 8 a 12 x 106 GR/mL.

4. Agregar 10 uL de la suspensión globular a cada pocillo.

5. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

6. Centrifugar la microplaca durante 5 minutos a 120 g. Los GRs deben verse como una monocapa en

el fondo de la placa adosados por sus cargas negativas al poly-l-lysina.

7. Neutralizar las cargas de los sitios no ocupados llenando los pocillos con suero fetal de ternero,

entonces incubar a temperatura ambiente durante45 minutos.


9. Agregar anti-D, anti-A y anti-B a los pocillos adecuados.

10. Para anticuerpos IgG, incubar durante45 minutos a 37°C. Para anticuerpos IgM, incubar durante

30 minutos a temperatura ambiente.


12. Llenar los pocillos con TFH e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para convertir

los GRs en células fantasmas

13. Lavar 5 veces con TFH.

14. Incubar con SAGH IgG anti-humana de conejo conjugada con fluoresceína (1:20 en PBS) o

SAGH IgM anti-humana de conejo conjugada con fluoresceína (1:20 en PBS) durante 45 minutos

a temperatura ambiente.


16. Incubar con suero Ig anti-conejo de caballo (1:20 en PBS).


18. Agregar 10 uL de TFH a cada pocillo.

19. Leer los resultados usando un microscopio con objetivo de inmersión.

Interpretación

La observación de fluorescencia significa que los GRs fetales son positivos para el antígeno y han sido

sensibilizados por el antisuero agregado durante el procedimiento.

Referencias

1. Gemke RJBJ, Kanhai HHH, Overbeeke MAM, et al. ABO and Rhesus phenotyping of fetal

erythtocytes in the first trimester of pregnancy. Brit J Haemol 1986:64;689-97.

2. Tillman W, Cordua A. Organization of enzymes of glycolyses and glutations metabolism in

human red cell membranes. Biochimica et Biophysica Acta 1975;382:157-71.

3. Bowman TM. The prevention of Rh immunization. Transfusion Med Rev 1988;2:129-50.

METODO MODIFICADO


1.Fluoresceinisotiocianato, Behringwerke AG

2. Microscopio fluorescente con objetivo de inmersión Leitz

3. Portaobjetos

4. Anti-D

5. Papaína (ver M42)

6. Luz azul

7. GRs de la MVC

Procedimiento

1. Lavar los GRs de la MVC 4 veces con salina.

2. Tratar con papaína (ver M42).

3. Hacer extendidos.

4. Incubar los extendidos no fijados con anti-D.

5. Lavar con PBS.

6. Incubar con Suero IgG anti-humana de conejo conjugada con fluoresceinisotiocianato.

7. Examinar con luz azul bajo el microscopio.

Interpretación

La observación de fluorescencia significa que los GRs fetales son Rh positivos y han sido sensibilizados

por el anti-D agregado durante el procedimiento.

Referencias

1. Fuhrman HC, Klink F, Grzejszczyk G, et al. First trimester diagnosis of Rh0(D) con an

immunofluorescence technique after chorionic villus sampling. Prenatal Diagnosis 1987;7:17-21.

2. Bowman TM. The prevention of Rh immunization. Transfusion Med Rev 1988;2:129-

50.

Método 113 – Espectrofotometría del líquido amniótico


La bilirrubina muestra un pico de absorbancia a 450-455 nm. Un barrido de la absorbancia desde 350

hasta 700 nm muestra un trazado lineal. Si hay presente bilirrubina debida a la hemólisis de los GRs del

feto, el líquido amniótico mostrará un pico a 450 nm. La severidad de la enfermedad hemolítica del recién

nacido (EHRN) se puede juzgar durante el tercer trimestre comparando el período gestacional con la

cantidad de bilirrubina usando la gráfica de Liley. Se puede obtener información adicional usando la

clasificación de Freda.


1. Líquido amniótico (ver Nota 1)



4. Cubeta

5. Papel de filtro Whatman N° 4

6. Agua destilada

7. Papel semilogarítmico

8. Agua destilada

Procedimiento

1. Encender el espectrofotómetro.

2. Centrifugar el líquido amniótico, en la oscuridad, durante 10 minutos a 2000 g (4000 rpm).

3. Filtrar el sobrenadante a través de papel de filtro Whatman N° 4, en la oscuridad.

4. Si la muestra está turbia, diluir con agua destilada hasta que se puedan obtener lecturas de la

densidad óptica (DO).

5. Poner a cero el espectrofotómetro con agua destilada.

6. Llenar con el líquido sobrenadante una cubeta cuadrada dejando 1 cm de luz

7. Explorar entre 350 y 700 nm. Si se realizan lecturas manuales, balancear cada DO con agua y leer

el líquido amniótico a 350, 365, 380, 390, 400, 410, 415, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 500,

530, 550, 600, 630, 650 y 700 nm.

8. Graficar las lecturas de la absorbancia contra la longitud de onda en un papel semilogarítmico.

9. Trazar una línea recta desde la porción lineal del rango de 300-350 nm hasta la porción lineal del

rango de 550-600 nm.

10. Construir una línea recta desde el DO a 450 nm hasta la línea que muestra el DO esperado a esa

longitud de onda.

DO450 verdadera – DO450 esperada = ∆D450

11. Realizar los mismos pasos a 410 nm. Esta es la absorbancia para la oxihemoglobina (ver Nota 2).

12. Corregir para la oxihemoglobina:

corregida = ∆D450 – (0.05 x ∆D410)

Interpretación

Clasificación de Liley

Liley observó el pico de absorbancia a 450 nm y lo relacionó con la severidad de la EHRN. La diferencia

entre el declive de la curva esperado y el declive obtenido muestra cuanta bilirrubina hay en el líquido

amniótico y por consiguiente es una medida de la severidad. Esto no funciona bien en el segundo

trimestre pero es una predicción bastante buena en el tercer trimestre. Graficando en una retícula la DO a

450 nm contra la edad gestacional, se puede usar una gráfica lineal para evaluar el estado normal, suave,

moderado o severamente afectado del bebé (ver Fig. 113-1).

.

Fig. 113-1.Grafico de Liley

Clasificación de Freda

Las diferencias en la DO pueden clasificarse básicamente de 1+ a 4+. Esto puede servir como otra forma

de calcular la severidad de la EHRN y si es necesaria una intervención clínica (ver Tabla 113-1).

Tabla 113-1. Clasificación de Freda

Clasificación Absorbancia neta a

450nm

Bi Total

(mg/100mL)

Interpretación clínica

1+ 0.0 – 0.20 > 0.28 Feto normal o medianamente afectado

Sin riesgo de muerte intraútero x 2

semanas

2+ 0.21 – 0.34 0.28 – 0.46 El feto es Ag positivo

Feto probablemente afectado si el

anterior fue un feto muerto.

Transfusión intrauterina (TIU) si < 30

semanas.

Inducir el parto si > 30 semanas

3+ 0.35 – 0.70 0.47 – 0.95 El feto es Ag positivo.

Severamente afectado, puede haber

falla cardíaca.

TIU si < 30 semanas

Parto si > 30 semanas

4+ > 0.70 > 0.95 Feto hidrópico y pre-mortem

Parto inmediato

Mal pronóstico

Notas

1. Inmediatamente después de obtener la muestra, transferir el líquido amniótico a una botella oscura

o envolver con una lámina de aluminio el tubo con la muestra, porque la exposición a la luz

provoca una disminución en la amplitud de la curva de bilirrubina. Conservarla por más de 3 días a

temperatura ambiente, aún en la oscuridad, puede resultar en una pérdida de al menos el 20% del

pigmento. Las muestras que son congeladas no muestran cambios.

2. No deben usarse los resultados del análisis si la DO a 410 nm excede 1.0 unidad de absorbancia o

si hay significativa metahemoglobina que se ve como una absorbancia > .050 por encima de la

línea de base de 630 nm.

Referencias

1. Todd-Sanford. Clinical diagnosis by laboratory methods. 14th ed. Davidsohn I, Henry JB, eds.

Philadelphia: WB Saunders Co., 1969:1189-200.

2. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990;597-9.

3. Freda VJ. The antepartum management of Rh disease. In: Garratty G, ed. Hemolytic disease of the

newborn. Arlington, VA: AABB, 1984;33-51.

4. Gambino SR, Freda VJ. The measurement of amniotic fluid bilirubin by the method of Jendrasik

and Grof. Am J Clin Pathol 1966;46:198-203.

5. Liley AW. Liquor amnit analysis in the management of the pregnancy complicated by rhesus

sensitization. Am J Obstet Gynecol 1961;82:1359-71.

Método 114 – Prueba de roseta para detectar GRs Rh positivo en la circulación de mujeres Rh

negativo


Los GRs de una mujer Rh negativoson incubados con anti-D, el que sensibilizará los GRs fetales Rh

positivo si están presentes en la suspensión a estudiar. Se remueve el exceso de anticuerpos por lavados.

Se agregan GRs cDE tratados con enzimas que se fijarán a cualquier GR Rh positivo sensibilizado con

anti-D presente en la muestra original. Este método se usa como prueba para determinarla magnitud de la

hemorragia feto-materna (HFM) o para la tipificación antigénica de los GRs fetales en una muestra de

vellocidades coriónicas (MVC).


1. GRs a estudiar

2. GRs de control de grupo O, Rh positivo y negativo

3. GRs testigo, cDE, tratados con papaína o ficina (ver M42) o GRs cDE tratados con ficina de un

panel comercial, Gamma Biologicals (ver Nota 1)

4. Tubos de ensayo

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Portaobjetos de vidrio

8. Microscopio


10. Papaína al 0.1% (ver M42) o GRs tratados con ficina disponibles comercialmente (ver Nota 2)


1. Lavar los GRs a estudiar, los de control Rh negativos y Rh positivos 1-2 veces en salina y llevarlos

a una suspensión al 3%.

2. Preparar el control positivo:

a. Mezclar 1 gota de suspensión globular de grupo O Rh positivo y 16 gotas de suspensión

globular de grupo O Rh negativo.

b. Mezclar 1 gota de la mezcla antes preparada con 9 gotas de suspensión globular de grupo O Rh

negativo. (La mezcla es aproximadamente de 0.6% de GRs Rh positivo y 99.4% de Rh

negativo).

3. El control negativo son GRs Rh negativo.

4. Preparar los GRs tratados con papaína:

a. Lavar los GRs de grupo O 1-2 veces en salina y hacer una suspensión al 5%.

b. Agregar 10 gotas de la suspensión al 5% a 1 gota de papaína. Mezclar e incubar a 37°C

durante30 minutos.

c. Lavar 3 veces con salina y hacer a una suspensión al 2% en salina (ver Nota 3).

Procedimiento

1. Rotular 3 tubos de ensayo: “prueba”, “control negativo”, y “control positivo”.

2. Colocar 2 gotas de los GRs a estudiar, de control negativo y positivo en los tubos apropiados.

3. Agregar 2 gotas del reactivo anti-D químicamente modificado a cada tubo. No todos los antisueros

químicamente modificados darán resultados satisfactorios.

4. Mezclar bien e incubar a 37°C durante 30 minutos.


6. Agregar 3 gotas de los GRs detectores a cada tubo y mezclar suavemente pero bien.

7. Centrifugar a 1000 g (3400 rpm) durante 15 segundos y resuspender suavemente.

8. Verter los GRs sobre portaobjetos rotulados y dejar reposar durante 15 segundos.

9. Mirar al microscopio (100x) 10 campos por lo menos.

Interpretación

Control positivo: Se ven rosetas.

Control negativo: No se ven aglutinatos.

Si se ven aglutinatos en la muestra de un paciente que va a recibir IG Rh, debe hacerse una

prueba cuantitativa para determinar la cantidad de IG Rh que deberá recibir.

Si la prueba fue hecha para determinar el tipo Rh de un feto usando una MVC, el feto es Rh

positivo si se ven aglutinatos y negativo si no se ven aglutinatos.

Notas

1. Los GRs detectores tratados con enzimas deben conservarse a 4 °C en una solución conservante

como la de Alsever. En la prueba original, los GRs tratados con papaína fueron utilizables por 1

semana.

2. El uso de papaína al 1% es arbitrario. La selección del porcentaje apropiado de enzima depende

del control de calidad realizado en el momento de la prueba.

3. El tratamiento enzimático y el lavado puede ser hecho simultáneamente con los pasos 3 y 4 del

procedimiento de investigación del paciente. En forma alternativa, los GRs detectores tratados con

enzima pueden sacarse de la heladera y diluidos en una suspensión al 0.2% en salina justo antes de

usarlos en el paso 5.

Referencias

1. Sebring ES, Polesky HF. Detection of fetal maternal hemorrhage in Rh immune globulin

candidates. Transfusion 1982;22:468-71.

2. Polesky HF, Sebring ES. Evaluation of methods for detection and quantitation of fetal cells and

their effect on RhIgG usage. Am J Clin Pathol 1981;76:525-9.

3. Sebring ES. Fetomaternal hemorrhage-incidence and methods of detection and quantitation.

Garratty G, ed. Hemolytic disease of the newborn. Arlington, VA: AABB, 1984:87-117.

4. Sebring ES. Current trends in prevention and treatment of Rh immunization (handouts). Fall

Education Seminar. Oshkosh, WI: Wisconsin Association of Blood Banks, 1982:1-6.

5. Jones AR, Silver S. The detection of minor erythrocyte populations by mixed agglutinates. Blood

1958;13:763-72.

6. Balk TM. Personal communication, 1992.

CR9

Método 115 – Técnica de elución ácida para demostrar GRs que contienen hemoglobina F


Esta técnica está basa en la modificación de Shepard del procedimiento de Kleihauer. A un pH bajo la

hemoglobina A se eluye de los GRs de adulto fijados en un extendido sanguíneo. La hemoglobina F, que

se encuentra en los GRs del recién nacido, resiste esta elución. Puede calcularse el porcentaje de GRs

fetales que se encuentran en la circulación materna.


1. GRs a estudiar

2. GRs de control

3. Etanol al 80%

4. Soluciones tampón de reserva: ácido cítrico 0.1 M, Na2HPO4 0.2 M (ver Nota 1)

5. Soluciones tampón de trabajo

6. Coloración para hemoglobina: eosina al 1% o eritrocina B al 0.5% (ver Nota 2)

7. Hematoxilina de Mayer, coloración para glóbulos blancos (opcional)


9. Portaobjetos de vidrio

10. Microscopio

11. Tubos de ensayo


13. Placa para coloración, Curtin Matheson Scientific, Inc., catálogo número 271-510

14. Soporte para portaobjetos

15. Termómetro


17. Lente de aumento


19. Agua destilada


1. Preparar una suspensión al 20% de los GRs a estudiar en suero autólogo, plasma o salina. (La

salina puede provocar alguna distorsión en la morfología globular).

2. Preparar los GRs de control:

a. Mezclar 1 parte de GRs de cordón y 10 partes de GRs adultos y hacer una suspensión al 20%

en suero autólogo, plasma o salina.

b. Preparar un segundo control con 100% de GRs de adulto (opcional).

3. Preparar ácido cítrico 0.1 M de reserva: diluir 21.0 g de ácido cítrico monohidrato hasta 1 L en

agua destilada.

4. Preparar el Na2HPO4 0.2 M de reserva: diluir 28.4 g de Na2HPO4 anhidro hasta 1 L en agua

destilada.

5. Preparar las soluciones tampón de trabajo:

a. Mezclar 147 mL de ácido cítrico 0.1 M de reserva con 53 mL de Na2HPO4 0.2 M de reserva.

b. Colocar la placa para coloración en un baño térmico a 56 °C hasta que el tampón alcance los

37 °C.

c. Sacar el tampón del baño térmico a 37°C y proceder inmediatamente con el paso 3 de

Procedimiento.

Procedimiento

1. Hacer los extendidos de los GRs a estudiar y de control y rotular.

2. Mientras los extendidos se secan, preparar el tampón de trabajo.

3. Colocar los extendidos secos en un soporte para portaobjetos y sumergirlos en etanol al 80% en

una placa de coloración durante 5 minutos.

4. Sacar los portaobjetos de la placa de coloración que contienen agua corriente caliente y lavar bien

bajo agua corriente caliente.

5. Sumergir los portaobjetos en el tampón de trabajo en una placa de coloración en un baño térmico a

37 °C por el tiempo exacto de elución. Ver el paso 8 (más abajo) para determinar el tiempo de

elución para la cantidad de reactivos que van a ser usados.

6. Repetir el paso 4, entonces sumergir el portaobjeto en el colorante para hemoglobina durante 5

minutos.

7. Repetir el paso 4, entonces sumergir el portaojetos en el colorante de Mayer durante 2 minutos

(opcional).

8. Repetir el paso 4, entonces secar al aire el portaobjeto y examinar bajo microscopio (20x). Los

GRs fetales en el portaobjeto de control debe ser rojo brillante, suave, refractante y oscuramente

delineado; los GRs de adulto deben ser células fantasmas descoloridas. Si la diferenciación de los

GRs fetales y adultos en el portaobjeto de control no es buena, hacer un segundo juego de

portaobjetos con el mismo tampón ajustando el tiempo de elución. Con un tiempo de elución

corto, los GRs fetales se vuelven más rojos. Con un tiempo de elución más largo, los GRs de

adulto se vuelven más descoloridos. El tiempo de elución está usualmente en 2 y 6 minutos.

Interpretación

Cualitativa

Una rápida visualización de los portaobjetos puede ser todo lo que se necesita para determinar si ha

ocurrido una hemorragia feto-materna (HFM) importante.

Cuantitativa

Determinar la relación de GRs maternos/GRs fetales contando el número de GRs fetales que se ven en un

número específico de GRs maternos.

1. La forma más fácil de hacer esto es usar un disco ocular para contar un quinto, un octavo, o un

décimo de los GRs maternos en una cantidad de campos del microscopio y contar el número de

GRs fetales presentes en el área total del mismo número de campos. Se puede aplicar un factor de

conversión. Para convertir el número de GRs fetales vistos al volumen de HFM como fue sugerido

por Kleihauer:

GRs fetales/GRs totales x 5000 = mL de sangre entera fetal

Este número, dividido por 15, corresponde al número de viales de Ig Rh a administrar. Duplicando

el número de frascos se obtiene un factor de seguridad.

2. Usando un aumento de 40x, deben contarse 2000 GRs maternos y debe contarse y registrarse el

número de GRs fetales. Entonces se calcula el porcentaje de GRs fetales:

Vol HFM = % de GRs fetales x 50

Notas

1. Las soluciones tampón de reserva, pH 3.5, son estables a 20°C durante 4 meses. Cuando se prepara

soluciones de reserva frescas, debe hacerse una solución de trabajo y el pH medido.

2. Los colorantes para hemoglobina pueden reusarse por 4 meses.

3. Todos los reactivos, excepto el tampón se usan a temperatura ambiente.

Referencias

1. Kleihauer E, Braun H, Betke K. Demonstration von fetalem häemoglobin in den erythrozyten

eines blutauastrich. Klin Wochenschr 1957;35:637-8.

2. Shepard MK, Weatherall DJ, Conley CL. Semi-quantitative estimation of the distribution of fetal

hemoglobin in red cell populations. Bull Johns Hopkins Hosp 1962;110:293-310.

3. Walker RH, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:596-7.

4. Sebring ES. Fetomaternal hemorrhage incidence and methods of detection and quantitation. In:

Garratty G, ed. Hemolytic disease of the newborn. Arlington, VA: AABB, 1984:87-117.

5. Martin J. Personal communication, 1992.

Método 116 – PAG asociada con enzimas (ELAT) para cuantificar GRs fetales Rh positivo en

circulación materna


Se agrega anti-D a una muestra de GRs maternos Rh negativo. Este se fija a los sitios antigénicos D en los

GRs fetales presentes en la circulación materna. Se saca el exceso de anticuerpo y se agrega suero

antiglobulina humana IgG conjugada con fosfatasa alcalina. Se remueve el exceso de anticuerpo, y se

agrega un sustrato enzimático. Este sustrato reacciona con la IgG fijada, conjugada. La cantidad de color

producido se mide con un espectofotómetro y es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente

primariamente. El método se usa para cuantificar la hemorragia feto-materna (HFM).


1. Espectrofotómetro y cubetas

2. Tubos de ensayo de plástico (16 x 100 mm)

3. Tubos de ensayo de vidrio (12 x 75 mm, 16 x 100 mm)

4. Pipetas de 5 mL

5. Pipetas y tips de 25, 100 y 200 uL

6. Suero IgG anti-humano conjugado (cabra), Sigma Chemical Co., catálogo númeto A-3150

7. Anti-D

8. P-nitrofenil fosfatasa disódica (PNP) comprimidos de 5 mg, Sigma Chemical Co., catálogo

número 104-105

9. Albúmina sérica bovina (ASB) al 0.2% en salina

10. NaOH 1 N


12. Tampón carbonato (NaHCO3)

13. Glutaraldehido, Eastman-Kodak Co., catálogo número P8648 (opcional, para usar en lugar de PBS

al 0.1%)

14. GRs frescos, con EDTA, Rh positivo y negativo (de no más de 48 horas)



17. GRs maternos a estudiar


1. Preparar ASB al 0.2% en salina fresca antes de cada prueba.

2. Preparar el tampón carbonato: diluir 5.04 g de NaHCO3 hasta 1 L con agua destilada. Ajustar el

pH a 9.6.

3. Preparar el glutaraldehido en PBS: diluir 0.1 mL de glutaraldehido en 99.9 mL de PBS.

4. Diluir el sueroa nti-IgG conjugado hasta la dilución de trabajo recomendada en el inserto. Diluir en

PBS (e.j., 1:1000 = usar pipeta de 25 uL – 5uL en 5 mL).

Procedimiento

1. Colocar 1 gota de los GRs Rh positivo, Rh negativo y a estudiar en tubos de 16 x 100 mm

adecuadamente rotulados.

2. Lavar 3 veces con ASB al 0.2% a 1000 g (3400 rpm) durante 2-3 minutos, luego compactar los

GRs.

3. Preparar una suspensión globular al 4% en ASB al 0.2% en tubos de 16 x 100 mm de cada uno de

los GR citados más arriba como sigue: 4.5 mL de ASB al 0.2% + 0.5 mL (200 L) de paquete

globular lavado.

4. Preparar la curva normal en tubos de vidrio de 16 x 100 mm usando pipetas de microlambdas y las

siguientes proporciones:

5 mL de suspensión al 4% de GRs Rh negativo, más –

• <25 uL de suspensión de Rh positivo = <0.5% (sangrado <25 mL)

• 25 uL de suspensión de Rh positivo = 0.5% (sangrado 25 mL)




5. Rotular dos tubos de 12 x 75 mm para cada muestra del paciente: muestras de “control negativo”

(GRs Rh negativo solamente) y de “curva normal”.

6. Agregar 400 uL de GRs a los tubos apropiadamente rotulados.

7. Agregar 100 uL de anti-D diluido con ASB al 0.2% a cada tubo. La dilución usada debe dar

valores de DO (DO) altos con las mezclas que contienen GRs Rh positivo y valores de DO bajos

con los GRs Rh negativo.

8. Incubar a 37°C durante 30 minutos.

9. Lavar 3 veces con ASB al 0.2% . Centrifugar por lo menos durante 2 minutos para impedir que se

pierda cualquier GR.

10. Agregar 200 uL de suero anti-IgG conjugado, el cual fue diluido hasta la dilución de trabajo

recomendada en las especificaciones del inserto.


12. Encender el espectrofotómetro y colocarlo a 405 nm.

13. Disolver 1 comprimido de PNP en 5 mL de tampón carbonato (dejar en la oscuridad).

14. Lavar todos los tubos 3 veces como se describió en el paso 9. Transferir los GRs a un tubo limpio

y lavar una cuarta vez.

15. Suspender los GRs en la salina residual después de descartar el último lavado.

16. Agregar 200 uL de PNP.

17. Incubar durante 1 hora a 37°C. El desarrollo del color varía con los diferentes lotes de PNP y

puede ser necesario cambiar el tiempo de incubación.

18. Centrifugar los tubos durante 3-5 minutos.

19. Transferir 200 uL del sobrenadante a un tubo limpio de 12 x 75 mm.

20. Detener la reacción de coloración con 0.2 mL de NaOH 1 N.

21. Transferir a una cubeta de vidrio. Leer la DO en el espectrofotómetro a 405 nm. Calibrar a cero

con un blanco hecho con 200 uL de PNP + 200 uL de NaOH 1 N.

22. Marcar los resultados en un papel de gráficos y determinar el porcentaje del sangrado feto-materno

en los GRs probados.

Tratamiento de los GRs con glutaraldehido al 0.1%

La adición de glutaraldehido al 0.1% puede ayudar a minimizar la hemólisis globular en muestras viejas.

1. Después del paso 8, agregar 400 uL de glutaraldehido al 0.1% en PBS a cada tubo.

2. Tapar e incubar a temperatura ambiente durante1 hora.

3. Lavar 1 vez con PBS utilizando 2 minutos de centrifugación.

4. Lavar 2 veces más con ASB al 0.2%.

5. Continuar con el paso 10 del Procedimiento.

Referencias

1. Greenwalt TJ, Siongco A, Dunaswala UJ, Domino MM. A modified enzyme-linked antiglobulin

test. Transfusion 1989;29:215.

2. Kuczmarski CA, Sosler SD. The enzyme-linked antiglobulin test. Laboratory Medicine

1985;16:791-5.

3. Riley JZ, Ness PM, Taddie SJ, et al. Detection and quantitation of F-M hemorrhage utilizing an

enzyme-linked antiglobulin test. Transfusion 1982;22:472-4.

4. Leikola J, Perkins HA. Enzyme-linked antiglobulin test: An accurate and simple method to

quantify RBC antibodies. Transfusion 1980;20:138-44.

5. Nicolaides KH, Rodeck CH, Mibashan RS, Kemp JR. Have Liley charts outlived their usefulness?

Am J Obstet Gynecol 1986;155:90-4.

Método 117 – Graduación y puntaje de las pruebas de aglutinación

Principio

Se asigna un valor numérico a cada reacción positiva basado en la fuerza de la aglutinación en cada tubo.

Aplicación

La graduación y el puntaje de las reacciones es útil para comparar la fuerza y la avidez de los anticuerpos

y la fuerza relativa de los antígenos.

Procedimiento

La Tabla 117-1 indica la graduación y el puntaje para la lectura macroscópica de la aglutinación en tubo.

Tabla 117-1. Graduación de la aglutinación para pruebas en tubo

Hallazgos observados macroscópicamente Graduación Valor (Score)

Un aglutinato sólido

Varios aglutinatos grandes

Aglutinatos de tamaño mediano, fondo claro

Pequeños aglutinatos, fondo turbio

Aglutinatos muy pequeños, fondo turbio

Aglutinatos apenas visibles, fondo tubio

Sin aglutinación

Mezcla de GRs agltinados y no aglutinados (campo mixto)

Hemólisis total

Hemólisis parcial, algunos GRs remanentes

4+

3+

2+

1+

1d

½ o trazas

0

Cm

HT

HP

12

10

8

5

3

2

0

Notas

1. Pueden asignarse puntajes para las reacciones de aglutinación leídas como 3½, 2½ y 1½+

2. Algunos profesionalesque leen las reacciones microscópicamente adoptan un sistema usando

signos más (+), rodeándolos con un círculo cuando registran estos resultados.

Referencias

1. Race RR, Sanger R. Blood group in man. 1st ed. Oxford: Blackwell, 1950.

Método 118 – Obtención de GRs de muestras coaguladas


Algunas veces se reciben sólo muestras coaguladas para la identificación de anticuerpos. Se pueden

obtener GRs libres por el macerado del coágulo por uno de los siguientes métodos. Todos los métodos

producen hemólisis, pero suministrarán un volumen sorprendente de GRs libres, intactos.

Inevitablemente, habrá unos pocos coágulos pequeños presentes.


1. GRs a estudiar en un coágulo

2. Palillo aplicador

3. Tubos de ensayo

4. Solución salina

5. Pipetas


7. Colador y mano de mortero, Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division, catálogo

números S1228-40, M9022

8. Placas de Petri (100 mm) o cazoleta de 3 5/8” de una balanza Ohaus con un borde para vertir,

Baxter Diagnostic, Inc., Scientific Products Division, catálogo número B2035-2, Dial-O-Gram

9. Tijeras

Procedimiento

Tubo y palillos aplicadores

1. Macerar el coágulo con 3 o 4 palillos aplicadores contra las paredes del tubo.

2. Llenar el tubo con salina y tranferir la suspensión globular en un tubo limpio.

3. Lavar los GRs hasta que el sobrenadante esté libre de hemólisis.

Colador y mano de mortero

1. Colocar un colador en una placa de Petri de 100 mm o más convenientemente en un cazoleta con

un borde para verter de una balanza Ohaus.

2. Colocar el coágulo en el colador y forzarlo a través de la malla con una mano de mortero o con el

fondo de un tubo de 7 mL. Enjuagar el colador con salina para maximizar la recolección de GRs.

3. Verter los GRs de la placa de Petri o de la cazoleta en un tubo y lavar los GRs hasta que el

sobrenadante esté libre de hemólisis.

Filtro de un equipo de transfusión

1. Cortar la parte de arriba del filtro de un equipo de transfusión (Fenwall HB-98D) (ver Fig. 118-1).

Descartar la cámara de goteo y la tubuladura adosada.

Fig. 118-1: Esquema del recipiente para el equipo de filtro usado en la prparación de GRs libres de una

muestra de sangre coagulada

2. Insertar la punta del filtro dentro de un tubo de 15 mL. Verter el coágulo dentro de la cámara del

filtro.

Cámara de goteo

Cortar aquí

Filtro

3. Machacar el coágulo con 3 o 4 palillos aplicadores y exprimir la masa a través del filtro. Enjuagar

el filtro para obtener más GRs.

4. Lavar los GRs hasta que el sobrenadante esté libre de hemólisis.

Referencias

1. Obtaining red cell suspensions from clotted specimens. Ellisor S, Reid M, Glidden H, eds.

American Red Cross Reference Laboratory Newsletter 1976;1(2):9-10.

Método 120 – Cálculo de la fuerza centrífuga relativa (FCR)


Cuando se aplica una fuerza centrífuga a partículas o GRs en una suspensión acuosa, por la rotación de la

misma en una centrífuga, la taza de velocidad a la cual las partículas o los GRs se moverán está basada en

el volumen de su masa por unidad, también conocida por densidad. La selección del valorde fuerza

centrífuga apropiada a aplicar a los GRs en suspensión es de importancia crítica para muchas técnicas en

el banco de sangre, e.j., lavado globular, separación globular y preparación de componentes.

La FCR está definida como el peso de un objeto en una centrífuga relacionada con su peso

normal. La fuerza centrífuga por unidad de masa está expresada en gravedades y es conocida como fuerza

g.

Procedimiento

Calcular la FCR usando la siguiente fórmula:

FCR = 11.18 x 10-6 x r x N2

donde r = es el radio de la centrífuga, medido en centímetros, desde el centro del eje hasta el fondo del

tubo o de la interface entre las capas de líquidos inmiscibles.

y

N = la velocidad angular, en rpm, de los tubos.

Por ejemplo, la centrífuga DuPont Sorvall GLC-2B equipada con un rotor HL-4 y un Omni-Carrier tiene

un radio máximo de 16.41 cm. A una velocidad de 1500 rpm, la FCR, expresada como una fuerza g, es

11.18 x 10-6 x 16.41 x (1500) 2, o 413 x g.

Notas

1. En la mayoría de las centrífugas, el manual de instrucciones del fabricante incluye tablas de FCRs

para varias velocidades para la combinación de rotores y soportes comúnmente usados. Es mejor

referirse a estas tablas para aplicaciones específicas. Para aplicaciones en las cuales la FCR es

crítica, debe usarse un tacómetro para verificar la velocidad del rotor.

Referencias

1. Bennington JL, ed. Dictionary and encyclopedia of laboratory medicine and technology.

Philadelphia, PA: WB Saunders Co., 1984;1313.

2. Instruction manual, Sorvall GLC-2B General Laboratory Centrifuge. Newton, CT: DuPont Co.,

Instrumen Products, Biomedicals Division, July 1977.

Método 121 – Método parapara la detección de GRs Jk(a-b-) empleando urea


Los GRs de personas Jk heterocigotas y Jk(a-b-) son resistentes a la lisis en urea 2 M o metilurea. Se

pueden usar pruebas basadas en este hecho para determinar unidades de donantes Jk(a-b-) o para

identificar Jknull o Jk heterocigotas en estudios familiares.


1. GRs a estudiar

2. GRs de control: Jk(a-b-), fenotipo Jk normal


4. Reactivos de prueba: Urea 2 M o metilurea, Sigma Chemical Co., en NaCl al 0.4%

5. Tubos de ensayo


Procedimiento

1. Lavar con PBS los GRs a estudiar y los de control una vez y resuspenderlos a una concentración al

2% en PBS.

2. Colocar alícuotas de 0.25 mL de los GRs a estudiar y de control en tubos de 10 x 75 mm y

centrifugarlos durante2 minutos a 1000 g (3400 rpm).

3. Remover completamente el sobrenadante y agregar 1 mL de reactivo de urea a cada botón

globular. Mezclar y dejar estar a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Centrifugar los tubos e inspeccionar visualmente en busca de hemólisis.

5. Para cuantificar el porcentaje de hemólisis, leer los tubos en un espectrofotómetro a 540 nm.

6. Calcular el porcentaje de hemólisis usando la cantidad de hemólisis producida por el agua

destilada como un 100 por ciento normal.

Interpretación

Los GRs Jk(a-b-) permanecen intactos al menos durante 15 minutos en urea 2M o metilurea en NaCl al

0.4%, mientras que los GRs normales se hemolizan completamente en 2 minutos. Los GRs de Jk

heterocigotas demuestran un nivel intermedio de hemólisis cuando se comparan con los GRs normales

Jk(a-b-). Los GRs que contienen HbS son también un tanto resistentes a la hemólisis en soluciones

hipotónicas; por consiguiente, deben realizarse otras pruebas para detectar HbS.

Referencias

1. Edwards-Moulds J, Kasschau MR. The effect of 2 molar urea on Jk(a-b-) red cells. Vox Sang

1988;55:181-5.

2. Eswards-Moulds J, Kasschau MR. Methods for the detection of Jk heterozygotes: Interpretations

and applications. Transfusion 1988;28:545-8.

Método 122 – Adición de complemento al suero estacionado (viejo)


Algunos sueros reaccionan mejor cuando está presente en complemento en el sistema en estudio,

habitualmente el anti-Vel y los anticuerpos anti-Kidd. Para demostrar la dependencia del complemento de

los anticuerpos de algunos sueros conservados o de suero viejo, puede agregarse complemento fresco.

Algunos sueros conservados pueden desarrollar también una actividad anti-complemento, y para estos

sueros, es necesario el agregado de EDTA al sistema antes de la adición de complemento (Método B).

Hay dos métodos disponibles: un paso (Método A) y dos pasos con EDTA (Método B).


1. Suero fresco, libre de anticuerpos

2. Solución de EDTA

3. GRs a estudiar, suspensión al 3-4%

4. Suero a estudiar

5. Tubos de ensayo


7. Salina

8. Suero Anti-globulina humana (SAGH), poliespecífica

9. GRs recubiertos con IgG (Control Coombs) (ver M135)

10. Pipetas



Procedimiento

Método A: un paso

1. Agregar 1 volumen de suero fresco a 3 volúmenes del suero a estudiar (ver Nota 1). Mezclar.

2. Ensayar un procedimiento de una prueba de rutina, e.j., panel celular, detección de anticuerpos,

etc.

Método B: dos pasos con EDTA

1. Preparar una solución de EDTA: Mezclar 4.0 g de K2EDTA y 0.3 g NaOH. Diluir hasta 100 mL

con agua destilada. Ajustar el pH a 7.0-7.4.

2. A 1 mL de suero que contiene al anticuerpo, agregar 0.1 mL de solución de EDTA.


4. Al botón de GRs seco, agregar 4 gotas del suero tratado con EDTA para cada célula que va a ser

probada y mezclar.

5. Incubar a 37 °C durante 15-60 minutos

6. Lavar 3 veces en salina.

7. A cada botón seco de estos GRs lavados, agregar 2 gotas de suero fresco ABO compatible como

una fuente de complemento y mezclar.


9. Lavar 3 veces en salina.

10. Al botón seco de estos GRs lavados, agregar SAGH (de acuerdo a las instrucciones del fabricante).

Centrifugar, leer y registrar los resultados.

11. Finalizar todas las reacciones negativas con GRs recubiertos con IgG.

Notas

1. Si se sospecha de anticuerpos anti-Lewis, usar suero fresco de un individuo Le(a-b-). La relación

consuero fresco se debe ajustar experimentalmente. El uso de plasma Le(a+) o Le(b+) como fuente

de complemento inhibirá los anti-Lewis.

Referencias

1. Polly MJ, Mollison PL. The role of complement in the selection of blood group antibodies: Special

reference to the antiglobulin test. Transfusion 1961;1:9-22.

Método 123 – Dilución madre para la titulación de anticuerpos

Principio

El título de un anticuerpo se puede obtener por la prueba de diluciones dobles del suero contra una

muestra globular seleccionada. Los resultados se expresan como la recíproca de la dilución más alta del

suero en la cual es detectada aparentemente aglutinación. Cuando se informan los resultados, sólo se

considera la reactividad macroscópica para la mayoría de los anticuerpos; sin embargo, a menudo se

hacen lecturas microscópicas en la titulación de anticuerpos de alto título, baja avidez (HTLA).

Aplicación

El puntaje de la titulación puede suministrar información acerca de la cantidad de anticuerpo en el suero o

la cantidad de antígeno presente en los GRs. La información es especialmente útil en la detección de

anticuerpos HTLA.


1. Pipetas automáticas y tips

2. Diluyente (salina, albúmina sérica bovina (ASB) al 6%)

3. Suspensión al 3-4% de GRs detectores

4. Suero a estudiar

5. Tubos de ensayo



1. Preparar la ASB al 6% agregando 3 volúmenes de ASB al 22% y 8 volúmenes de salina o

agregando 1 volumen de ASB al 30% y 4 volúmenes de salina.

Procedimiento

1. Rotular 10 tubos de ensayo de acuerdo a la dilución del suero (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, etc.)

2. En cada tubo, excepto el primero, dispensar 1 volumen de diluyente (ver Nota 1).

3. Agregar 1 volumen de suero al primer tubo (dilución 1:1) y 1 volumen al segundo tubo (dilución

1:2).

4. Usando un tip de pipeta limpio, mezclar el contenido 5 veces y transferir 1 volumen del segundo

tubo al tercero (dilución 1:4).

5. Continuar el procedimiento para todas las diluciones, usando una pipeta limpia para cada

trasvasamiento. Guardar 1 volumen del último tubo para usar en posteriores diluciones, si son

necesarias.

6. Usando pipetas distintas, transferir 2 gotas (0.1 mL) de cada dilución a los tubos apropiadamente

rotulados 1:2, 1:4, etc.

7. Agregar 1 gota (0.05 mL) de la suspensión cuidadosamente medida de GRs en cada uno de los 10

tubos. La suspensión globular debe ser preparada usando el diluyente seleccionado.

8. Mezclar bien y estudiar con la técnica apropiada.

9. Examinar las reacciones de las pruebas macroscópicamente, graduar las reactividades (score) y

registrar los resultados. Se pueden asignar valores de puntaje (ver M117).

Interpretación

1. Los resultados se informan como la recíproca de la dilución más alta que produce aglutinación

(1+). Un título será informado como 32, no como 1:32.

2. En estudios comparativos, la diferencia del título en al menos 3 tubos, o una diferencia del puntaje

(score) de al menos 10 puntos, es considerada una diferencia significativa.

Notas

1. Determinar el volumen de la dilución madre tomando 0.1 mL para cada fenotipo globular a ser

probado. Por ejemplo, si el suero va a ser titulado contra GRs R1R1, R2R2, y rr, pipetear 0.3 mL de

suero en los 2 primeros tubos y agregar 0.3 mL de diluyente en todos los tubos excepto el primero.

Debido a que es dificultoso sacar la alícuota final de cada dilución madre, es ventajoso usar más

suero y diluyente que el necesario. Ya que las mediciones con grandes volúmenes son más

precisas que con pequeños volúmenes, se recomienda un volumen de 0.5 mL o más.

2. Es esencial una técnica meticulosa de pipeteo. Se recomienda las pipetas automáticas con tips

descartables que son cambiados después de cada dilución.

3. El fenómeno de prozona puede causar reacciones más débiles en el primer tubo que en diluciones

más altas.

4. Para asegurar el objetivo, comenzar la lectura con el tubo que contiene la mayor dilución del suero

y proseguir hasta la muestra más concentrada, leyendo un tubo a la vez.

Referencias

1. Widmann FK, ed. Technical manual. 10th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:568.

Método 124 – Métodos para congelar y descongelar GRs con fenotipos raros usando nitrógeno

líquido (N2L)


Este método puede usarse para conservar y recuperar pequeños volúmenes de GRs y luego usarlos para la

identificación de anticuerpos o pruebas de compatibilidad.

METODO A: congelamiento por goteo y descongelmiento de GRs


1. Soluciones de congelamiento: sucrosa, dextrosa, cloruro de sodio

2. N2L (ver nota 1)

3. GRs con fenotipos raros

4. Agitador magnético con barras de 2 x 3/8”

5. Embudo

6. Colador de té

7. 3 o más matraces DewarTM o frascos de acero inoxidable que han sido adecuadamenteaislados

recubriéndolos con goma-espuma y cinta engomada.

8. Frascos plásticos con tapa, Nunc, Inc., Vanguard International, Inc.

9. Jeringas plásticas de 10 cc

10. Agujas de 23 Gs (ver Nota 1)

11. Tubos de ensayo

12. Marcador indeleble

13. Hemostato

14. Gasa (4” x 8”)

15. Guantes de seguridad


17. Pipetas


19. Congelador de N2L


1. Preparar 100 mL de solución de congelamiento: disolver 15.4 g de sucrosa (alrededor de 3½

paquetes o terrones de azúcar), 5.4 g de dextrosa (D-glucosa), y 0.29 g de cloruro de sodio en 100

mL de agua destilada. Mezclar la solución y dispensar en alícuotas de 10 o 15 mL. La solución

puede ser congelada.

Procedimiento

Congelado por goteo

1. Lavar los GRs con fenotipos rarosa congelarse 2-3 veces en salina; retirar el sobrenadante.

2. Colocar una barra de agitación dentro del matraz 1 y llenarlo ¾ partes con N2L.

3. Llenar el frasco 3 ¼ parte con N2L.

4. Agregar un volumen igual al de los GRs de solución de congelamiento. Mezclar e incubar a

temperatura ambiente durante 10-60 minutos.

5. Rotular una jeringa de 10 cc para cada muestra globular. Poner una aguja 23 G a cada jeringa.

Mezclar los GRs y la solución de congelamiento y extraer dentro de la jeringa adecuadamente

rotulada.

6. Colocar el matraz 1 sobre un agitador y ponerlo al máximo. Para mejores resultados tratar de crear

un vórtice profundo.

7. Sostener la jeringa sobre el N2L y dispensar los GRs en un chorro lento y continuo entre el centro

y el borde del N2L (ver Nota 2).

8. Cuando todos los GRs han sido dispensados, apagar el agitador.

9. Poner un colador sobre el matraz 2 y volcar el N2L del matraz 1, que contiene los GRs congelados,

a través del colador.

10. Volcar rápidamente los GRs desde el colador a un frasco ya rotulado usando el embudo. La tapa

de los frascos debe tener un orificio.

11. Tapar los frascos y ponerlos en el matraz 3, el cual fue previamente llenado hasta ¼ con N2L. No

dejar que los GRs se descongelen.

12. Limpiar el matraz 1 para asegurarse que no haya GRs libres. Volcar el N2L del matraz 2 a través

del colador forrado con gasa en el matraz 1. Limpiar el matraz 2.

13. Repetir el procedimiento completo para cada muestra globular a congelar.

Descongelamiento de las gotas globulares

1. Llenar un tubo rotulado con salina y calentarlo a 37-40 °C.

2. Sacar el frasco del congelador de N2L. Volcar el N2L a través del orifio de la tapa.

3. Sacar la tapa y sacudir el frasco para desprender algunas bolitas de GRs.

4. Agregar 2-6 (dependiendo del tamaño) bolitas globulares congeladas a la salina caliente. Si se

agregan demasiados GRs, la salina se enfriará y los GRs no se descongelarán rápidamente,

causando una hemólisis excesiva. Volver a colocar el frasco rápidamente en el congelador de N2L

con los GRs restantes.

5. Mezclar los GRs y la salina y mantenerlo a temperatura ambiente durante 60 segundos.

6. Centrifugar y lavar los GRs dos veces con salina (o hasta que el sobrenadante esté límpido).

Notas

1. El N2L es un líquido incoloro e inodoro con un punto de ebullición de –197 °C (-320 °F). Por lo

tanto es extremadamente frío y como una pequeña cantidad de N2L se convierte en grandes

cantidades de gas, por lo tanto deben observarse las siguientes precauciones:

a. Impedir el contacto con el N2L usando ropa de protección, guantes y anteojos de seguridad o

escafandra.

b. Tener una apropiada ventilación de forma que la concentración de oxígeno en el aire no

descienda a niveles inapropiados.

c. Nunca colocar el N2L en un recipiente cerrado ajustadamente, porque la formación de gas

puede iniciar una explosión.

d. Los objetos mantenidos a temperatura ambiente deben ser introducidos en el N2L con cuidado

para evitar la excesiva ebullición.

2. Cuanto más pequeña es la gota, mejor es la recuperación de los GRs.

Referencias

1. Reid MD, Ellisor SJ. A simple method for the preservation of RBCs in liquid nitrogen.


2. Direction circular: Some aspects of the cryogenic preservation of blood. Form 2-0453.

Indianapolis, IN: Union Carbide, November 1972.

3. Huestis DW, Bove JR, Busch S. Practical blood transfusion. 2nd ed. Boston: Little, Brown and Co.,

1976:71-6.

4. Myhre BA. Quality control in blood banking. New York: John Wiley & Sons, 1974:78-80.

METODO B: congelamiento y descongelamiento de GRs usando una mallade alambre


1. GRs con fenotipos raros

2. Plasma de grupo AB

3. Soluciones de congelamiento: ázida sódica al 1%, sucrosa, dextrosa, cloruro de sodio


5. Hemostato

6. Malla de alambre de acero inoxidable de 16” x 16”, malla de 0.018, cortada a 2½” x 3/8”

7. Parafilm®

8. Vasos StyrofoamTM o canisters de acero inoxidable

9. N2L (ver nota 1)

10. Congelador de N2L con canisters



13. Marcador indeleble

14. Guantes de seguridad


16. Lámina de goma

17. Cinta engomada


1. Preparar la ázida sódica al 0.1%: disolver 1 g de ázida sódica en agua destilada y diluir hasta 100

mL con agua destilada.

2. Preparar la solución de congelamiento: combinar 154.03 g de sucrosa y 59.04 g de dextrosa, llevar

hasta 1 L con agua destilada, entonces agregar 8.77 g de cloruro de sodio y 10 mL de ázida sódica

al 0.1%.

Procedimiento

GRs congelados usando una malla de alambre

1. Centrifugar los GRs con fenotipos raros a ser congelados y observar el sobrenadante en busca de

hemólisis. Si la hay, lavar los GRs con salina hasta que no se note hemólisis, luego concentrar los

GRs.

2. Remover todo el sobrenadante (si no fuera plasma) y agregar plasma de grupo AB hasta obtener

un hematocrito de 75-80%.

3. A esta solución de plasma-GRs, agregar un volumen igual de solución de congelamiento. Mezclar

bien e incubar a temperatura ambiente durante15-60 minutos.

4. Preparar un frasco para congelamiento cortando un orificio de 1 cm2 en la tapa del frasco. Debe

registrarse el ABO y Rh, el factor significativo, y nombre del donante o la identificación en la tapa

y los lados del frasco.

5. Llenar 2 vasos Styrofoam con N2L. Colocar el frasco rotulado en 1 vaso.

6. Verter la suspensión globular sobre un trozo de Parafilm. Usando un hemostato, sumergir la malla

en la suspensión globular hasta cubrirla e inmediatamente sumergirla en N2L en el primer vaso.

Repetir usando otras mallas, hasta que toda la suspensión globular hubiera sido puesta en las

mallas y congelada.

7. Trasferir las mallas congeladas al frasco del congelador en el segundo vaso (aproximadamente 25-

30 mallas por frasco). Tapar el frasco con la tapa rotulada.

8. Colocar el/los frasco/s en el canister del congelador y registrar la ubicación del frasco, la fecha y

el número de mallas congeladas.

Descongelamiento de los GRs congelados en mallas de alambre

1. Rotular un tubo de ensayo.

2. Agregar aproximadamente 3 mL de solución de congelamiento incubar a 37 °C hasta que la

solución alcance los 37 °C.

3. Retirar 1 malla del frasco del congelador de N2L.

4. Rápidamente sumergir la malla en la solución de congelamiento calentada en el tubo rotulado y

mezclar.

5. Sacar la malla (ver Nota 1).

6. Centrifugar la suspensión globular y descartar el sobrenadante.

7. Lavar los GRs con salina hasta que se resuspendan fácilmente (aproximadamente 3 veces).

8. Agregar solución de Alsever al botón globular y ajustar a una concentración de 3-4%.

Notas

1. El N2L es un líquido incoloro e inodoro con un punto de ebullición de –197 °C (-320 °F). Por lo

tanto es extremadamente frío y como una pequeña cantidad de N2L se convierte en grandes

cantidades de gas, deben observarse las siguientes precauciones:

a. Impedir el contacto con el N2Lutilizando ropa de protección, guantes y antiparras o escafandra.

b. Tener una apropiada ventilación de forma que la concentración de oxígeno en el aire no

descienda a niveles inapropiados.

c. Nunca colocar el N2L en un recipiente cerrado ajustadamente, porque la formación de gas

puede iniciar una explosión.

d. Los objetos a temperatura ambiente deben ser introducidos en el N2L con cuidado para evitar la

excesiva ebullición.

2. Si se derrama N2L sobre la piel o en los ojos, empapar el área con agua, aplicar una compresa fría,

y consultara un médico.

3. Para reciclar la malla de acero inoxidable, lavar y autoclavar.

4. La recuperación globular depende de las condiciones de los GRs en el momento del

congelamiento.

Referencias

1. Gibbs MB, McCord EB, Collins WS, Schrider CT Jr., Akeroyd JH. Simple method of storage of

human erythrocytes in liquid nitrogen: Comparative study of the agglutinability of erythrocytes of

the ABO blood groups preserved by various methods. Transfusion 1962;2:100-5.

2. Bronson WR, McGinniss MH. The preservation of human red blood RBC agglutinogens in liquid

nitrogen: Study of a technique suitable for routine blood banking. Blood 1962;20:478-84.

3. Direction circular: Precautions and safe practices. Liquefied atmospheric gases. Form 9888-N.

Indianapolis, IN: Linde Division, Union Carbide, June 1973.

Método 125 – Congelamiento y recuperación de GRs con fenotipos raros usando glicerol

Principio

El glicerol penetra en los GRs y previene los severos daños porcongelamiento como el cambio de

tonicidad de las células. La remoción del glicerol después del descongelamiento se lleva a cabo por el

descenso gradual del medio hipertónico intracelular con soluciones salinas.

Aplicaciones

Estos métodos se usan para conservar y recuperar pequeños volúmenes globulares para luego usarlos en

identificación de anticuerpos o pruebas de compatibilidad.


1. Solución de glicerol 6.2 M, o Glycerolyte 57, Baxter Diagnostic, Inc., Fenwall Division

2. Cloruro de potasio (KCl)

3. Cloruro de magnesio (MgCl2)

4. Fosfato disódico (Na2HPO4)

5. Solución de cloruro de sodio al 9.0% (Método I), al 2.5% (Método I), al 12% (Método II), al 1.6%

(Método II), al 0.9% (Métodos I y II) (ver Nota 1)

6. GRs con fenotipo raro

7. Congelador de –80 °C

8. Frasco de plástico, 12 x 75 mm, Falcon Division, Becton-Dickinson & Co., catálogo número 2054

9. Tubos de ensayo


1. Preparar la solución de glicerol 6.2 M: Mezclar 57.1 g de glicerol, 0.03 g de KCl, 0.04 g de MgCl2

y 0.08 g de Na2HPO4.

Procedimiento para congelar

1. Lavar los GRs hasta que la salina sobrenadante esté libre de hemólisis. Concentrar los GRs hasta

obtener un hematocrito aproximado de 90% (ver Nota 2).

2. Resuspender completamente los GRs y verterlos en una pequeña cubeta o frasco (puede usarse un

tubo de ensayo si va a congelarse un pequeño volumen). No debe haber botones globulares

presentes durante la glicerolización.

3. A 1 volumen de GRs, agregar 2 volúmenes de glicerol muy lentamente mezclando constantemente

como sigue:

a. Primero agregar 20% del total de glicerol a los GRs.

b. Incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante10 minutos.

c. Agregar lentamente el glicerol restante a los GRs.

d. Incubar esta mezcla final a temperatura ambiente por al menos 10 minutos antes de congelar.

4. Verter los GRs glicerolados dentro de los frascos plásticos rotulados y colocar en un congelador de

–80 °C (ver Nota 3). Conservar a –80 °C hasta que fuera necesario descongelar y desglicerolar

(ver Nota 4).

Procedimientos para descongelar y desglicerolar

Método I

1. Descongelar los frascos de GRs a 37 °C.

2. Mientras se agita continuamente los GRs glicerolados, agregar lentamente (de a gotas) un volumen

igual a la mezcla globular de solución de NaCl al 9.0%.

3. Mezclar el contenido por inversión e incubar la muestra a temperatura ambiente por al menos 1

minuto.

4. Llenar el frasco con solución de NaCl al 2.5% y mezclar por inversión. Transferir a un tubo

apropiadamente rotulado.

5. Centrifugar a 1000 g durante 30 segundos y descartar el sobrenadante.

6. Llenar el tubo con solución de NaCl al 2.5%, mezclar y centrifugar durante 30 segundos.

7. Descartar el sobrenadante y lavar los GRs con salina al 0.9% hasta que el sobrenadante quede

descolorido.

Método II

1. Descongelar los frascos de GRs a temperatura ambiente.

2. Transferir las células a un tubo limpio, adecuadamente rotulado.

3. Mientras se agita continuamente, agregar lentamente de a gotas un volumen igual a la mitad de los

GRs descongelados de solución de NaCl al 12%.

4. Mezclar suavemente y dejar a temperatura ambiente durante 3 minutos.

5. Agregar lentamente NaCl al 1.6% hasta llenar la mitad del tubo. Terminar el llenado del tubo con

salina al 0.9%.

6. Centrifugar durante1 minuto a 1000 g . Retirar el sobrenadante.

7. Lavar las células una vez más con salina normal al 0.9%. Centrifugar y aspirar como en el paso 5

8. Resuspender los GRs a la concentración deseada con salina normal al 0.9% y usar dentro de las 48

horas.

Notas

1. El NaCl al 12% y 1.6% usado para la desglicerolización de unidades de GRs puede usarse para el

Método II.

2. No es necesario un hematocrito de 90%, pero este da mayor recolección de GRs por muestra y

ahorra espacio en el congelador. La sangre entera también puede ser adecuadamente protegida por

este método hasta un hematocrito de 10-15%.

3. Los GRs desglicerolizados pueden conservarse a 4 °C por varios días si se conservaen solución de

Alsever (ver M134) inmediatamente después de su recuperación.

4. Congelar los GRs en volúmenes necesarios como para realizar 2-4 pruebas.

Referencias

1. Smith AU. Prevention of haemolysis during freezing and thawing of red blood cells. Lancet

1950;ii:910-11.

2. Yagnow R, Shannon S, Weiland D. Procedure for freezing and thawing of small aliquots and

segments. Red Cell Free Press, American Red Cross Reference Laboratory Newsletter

1978;3(1):8.

Método 126 – Coagulación de sangre entera y plasma


Aunque el plasma es aceptable para la detección e identificación de anticuerpos, y pruebas cruzadas, hay

situaciones en las cuales puede ser necesaria la conversión de plasma en suero. Se usan trombina, cloruro

de calcio, sulfato de protamina, o ácido epsilon-amino caproico (AEAC)para promover o acelerar la

coagulación de sangre entera o plasma.


1. Sulfato de protamina, The Upjohn Co.

2. Acido epsilon-amino caproico (AEAC), Amicar®, Lederle Laboratories

3. Trombina, Parke-Davis & Co.

4. Cloruro de calcio (Cl2Ca)

5. Sangre entera o plasma a estudiar

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Salina



1. Preparar la solución de sulfato de protamina al 1%: agregar 50 mg de sulfato de protamina a 5 mL

de salina.

2. Preparar una solución salina de sulfato de protamina 1:10: agregar 1 volumen solución de sulfato

de protamina al 1% a 9 volúmenes de salina.

3. Preparar AEAC como sigue: Disolver 5 g de AEAC en 120 mL de salina.

4. Preparar la trombina:

a. Agregar 5 mL de salina a un frasco de 5000 unidades de trombina.

b. Agregar 1 mL de la trombina reconstituida a 9 mL de salina (dilución 1:10) para producir una

concentración de 100 unidades/mL.

5. Preparar el Cl2Ca 1 M : Agregar 11.1 g a 100 mL de salina

Procedimiento

Sulfato de protamina

1. Agregar 0.1 mL de la solución salina de sulfato de protamina 1:10 a 4 mL de sangre entera o 1

gota de solución salina de sulfato de protamina 1:10 a 1 mL de plasma, mezclar.

2. Incubar la mezcla durante 10 minutos a 37 °C o hasta que se produzca la coagulación.

AEAC

1. Agregar 0.1 mL de AEAC a 4 mL de sangre entera y mezclar.


Trombina

1. Agregar 0.1 mL de la dilución de trombina 1:10 a 4 mL de sangre entera y mezclar.


Cl2Ca

1. Agregar 0.1 mL de CaCl 1 M a 10 mL de sangre con EDTA, citratada o oxalatada y mezclar.

2. Incubar la mezcla durante10 minutos a 37 °C o hasta que se produzca la coagulación.

Notas

1. Aunque la coagulación debe ocurrir dentro de los 30 minutos, el coágulo no se retraerá por 4 horas

o más.

2. Todos los reactivos pueden ser separados alícuotas y conservados congelados hasta su uso.

Referencias

1. Simmons A. Coagulation and protein abnormalities. In: Walker RH, ed. A seminar on problems

encountered in pretransfusion tests. Washington, DC: AABB, 1972:125-6.

Método 127 – Desfibrinación de grandes cantidades de plasma


El plasma debe ser desfibrinado o convertido en suero antes de ser usado en la producción dereactivos

paraagrupamiento sanguíneo. La coagulación se consigue por el agregado de cloruro de calcio (Cl2Ca) al

plasma en exceso en relación con el anticoagulante disponible. Este método puede usarse para grandes

volúmenes de plasma que contiene anticuerpos.


1. Cl2Ca 1.5 M

2. Trombina, Parke-Davis & Co.

3. Azida sódica (NaN3) al 10%

4. Plasma a desfibrinar

5. Matraces

6. Embudo

7. Tres trozos de estopa de 12” x 12”

8. Guantes


10. Salina

11. Agua destilada


1. Preparar el Cl2Ca 1.5 M: agregar 166.4 g de CaCl2 a 1000 mL de salina.

2. Preparar la NaN3 al 10%: agregar 10 g de NaN3 a 1000 mL de agua destilada.

3. Preparar trombina por dilución con agua destilada hasta obtener 10.000 unidades en 5 mL.

Procedimiento

1. Medir el volumen de plasma con una diferencia de 10 mL.

2. Verter el plasma en una botella de vidrio o en un matraz que tenga 2 veces el volumen de plasma.

3. Agregar 1 mL de Cl2Ca 1.5 M por cada 100 mL de plasma.

4. Incubar en un baño térmico a 37 °C.

5. Cuandocomienza a coagular (habitualmente a los 15-30 minutos), tapar el matraz y agitar

vigorosamente para romper el coágulo.

a. Si no se forma el coágulo, agregar la mitad del volumen original de Cl2Ca y repetir los pasos 4

y 5.

b. Incubar a 2-8 °C durante la noche.

c. Si no se ha producido la coagulación, congelar a –20 °C durante una noche.

d. Descongelar a temperatura ambiente.

e. Si no se ha producido la coagulación, tratar el plasma como suero.

6. Colocar 3 capas de estopa en un embudo grande para formar una bolsa que retendrá los coágulos.

Colocar el embudo en un matraz grande y limpio.

7. Verter el suero dentro del embudo. Confirmar que los coágulos sean retenidos y el suero pase a

través adentro del matraz. Puede ser necesario levantar las esquinas de la estopa para permitir que

el suero drene.

8. Después que el suero haya drenado, tomar las 4 esquinas de la estopa y unirlas para formar una

bolsita.

9. Alzar la estopa y retorcer para cerrar la bolsita abierta. Esto previene el escape de los coágulos.

10. Manteniendo la bolsita cerrada con una mano, exprimir el coágulo con la otra para expulsar todo el

suero atrapado.

11. Agregar 1 mL de NaN3 a 100 mL de suero y mezclar. Esto previene el desarrollo microbiano.

Referencias

1. Collins R. Methods manual. Rockville, MD: National Production Laboratory, American Red

Cross, 1993.

Método 128 – Remoción del cloruro de calcio del suero desfibrinado

Principio

El oxalato de sodio se une con el calcio en el suero desfibrinado y precipita como sales de calcio

insolubles.

Aplicación

La remoción del calcio del suero desfibrinado con cloruro de calcio previene su precipitación durante la

conservación. Este método puede usarse para grandes volumen es de plasma que contienen anticuerpos

(ver M127).


1. Tubos de ensayo

2. Heladera


4. Pipetas

5. Oxalato de sodio

6. Agitador magnético

7. Suero desfribinado (ver M127)

Procedimiento

1. Para cada 100 mL de suero, agregar 0.2 g de oxalato de sodio.

2. Incubar a temperatura ambiente durante2-4 horas mezclando constantemente.

3. Incubar a 4 °C durante la noche para asegurarse la completa formación de complejos y su

precipitación.

4. Centrifugar a 4000 rpm durante15 minutos y separar el suero.

Notas

1. Si fue necesaria solución de cloruro de calcio adicional durante el procedimiento de desfibrinación

(ver M127), será necesario usar 0.3 g de oxalato de sodio por cada 100 mL de suero.

Referencias


Cross, 1993.

Método 129 – Fraccionamiento del suero con sulfato de amonio

Principio

Las inmunoglobulinas son precipitadas por el sulfato de amonio.

Aplicación

Los anticuerpos anti-eritrocitarios pueden ser concentrados por precipitación de las inmunoglobulinas en

el suero. Una segunda aplicación es la remoción de la hemoglobina del suero para permitir una lectura

fácil en las pruebas de hemaglutinación.


1. Agua destilada y desionizada

2. Solución de sulfato de amonio 3.6 M [(NH4) 2 SO4]

3. Suero a estudiar conteniendo anticuerpos

4. Solución salina

5. GRs de grupo O, antígeno positivos

6. Solución de cloruro de bario al 10% (Cl2Ba)


8. Tubuladura de diálisis, el tamaño dependerá del volumen de inmunoglobulinas disueltas

9. HCl 1 N

10. NaOH 1N

11. Embudo separador


13. Tubos de ensayo

14. Matraces


1. Preparar la solución de sulfato de amonio 3.6 M: disolver 475 g de sulfato de amonio en agua

desionizada y diluir hasta 1 L. Esta solución puede conservarse a temperatura ambiente

indefinidamente.

2. Preparar la solución de cloruro de bario al 10%: disolver 10 g de cloruro de bario en agua destilada

y diluir hasta 100 mL. Esta solución puede conservarse a temperatura ambiente indefinidamente.

3. Preparar los GRs de grupo O lavando 2-3 veces en salina, luegopreparar una suspensión al 2-4%.

4. Preparar el suero ajustando el pH a 6.8 ± 0.2 usando HCl 1.0 N o NaOH 1.0 N según sea

necesario.

Procedimiento

1. Mezclar el suero lentamente en un matraz sobre un agitador magnético y agregar un volumen igual

de sulfato de amonio 3.6 M. Es aconsejable el agregado de a gotas y puede conseguirse usando un

embudo separador.

2. Continuar mezclando a temperatura ambiente durante60 minutos más para asegurar la completa

precipitación de las inmunoglobulinas.

3. Centrifugar la mezcla a 4000 gdurante 20 minutos. Descartar el sobrenadante y retener las

inmunoglobulinas precipitadas.

4. Disolver el precipitado en agua desionizada. La relación habituales partes iguales de precipitado y

agua.

5. Colocar la fracción de inmunoglobulinas en una tubuladura de diálisis y dializar en agua

disionizada por 4 horas. Usar 10-20 volúmenes de agua por 1 volumen de la fracción.

6. Transferir la tubuladura de diálisis a un recipiente con 20 volúmenes de salina y dializar durante

una noche.

7. Estudiar la presencia residual de sulfato de amonio. Puede usarse una de las siguientes pruebas:

a. Agregar 2 gotas de la fracción dializada a 1 gota de suspensión globular de grupo O al 2-4%.

Incubar a 37 °C durante 1 hora y observar en busca de hemólisis. Si se evidencia hemólisis,

repetir el paso 7.

b. Colocar 0.5 mL de la fracción dializada en un tubo de ensayo. Agregar lentamente un volumen

igual de cloruro de bario al 10% y observar en busca de un precipitado blanco. Si el precipitado

es evidente, repetir el paso 7.

8. La fracción ahora puede estudiarse y ajustada a su reactividad óptima (ver Nota 3).

Notas

1. Puede agregarse ázida sódica (NaN3) como un conservantepara tener una concentración final de

0.1%.

2. El pH debe ajustarse a 7.0 ± 0.2.

3. Debe usarse ASB al 6% o suero normal AB libre de anticuerpos.

4. Deben hacerse pruebas para determinar si algún anticuerpo previamente no detectado es ahora

demostrable.

5. La mayoría de la hemoglobina se decanta en el sobrenadante en el paso 5. Sin embargo, cuando se

desea una solución limpia, el precipitado puede ser lavado una o dos veces con solución de sulfato

de amonio 1.8 M (preparado diluyendo 1 parte de solución de reserva 3.6 M con 1 parte de agua

destilada). El precipitado entonces puede ser disuelto y diluido hasta el 90% del volumen original

en el paso 6.

Referencias

1. Pennell RB. Fractionation and isolation of purified components by precipitation methods. The

Plasma Proteins 1960;1:9-50.


Cross, 1993.

Método 130 – Remoción de lípidos de un suero lipémico con FreónTM

Principio

El freón forma un gel con los lípidos.

Aplicación

Este método se usa para remover los lípidos y los residuos grasos de un suero lipémico para prevenir

interferencias durantela realización de las pruebas de hemaglutinación.


1. Freón (Tricloromonofluorometano [CCl3F]), Ucon, Union Carbide, Inc., Linde Division

2. GRs de grupo O, suspensión al 2-4%

3. Licuadora de alta velocidad o mezclador vórtex

4. Suero lipémico

5. Centrífuga adecuadamente calibrada y refrigerada

6. Salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo


Procedimiento

1. Por cada 5 volúmenes de suero, agregar 1 volumen de Freón.

2. Mezclar con una licuadora de alta velocidad hasta que la solución sea homogénea y tenga la

apariencia de leche espesa (ver Notas 1-3). Pueden procesarse muestra pequeñas usando un

mezclador vortex.

3. Centrifugar a 4000 rpm durante 20 minutos. El gel de Freón/lípidos deberá acumularse en el

fondo. Si la capa de gel no es aparente, repetir los pasos 2 y 3.

4. Separar el suero tratado y sacar cualquier residuo de Freón calentando a 56 °C durante30 minutos

o a 37°C o 45°C durante 2 horas. Las muestras de menor volumen requieren menos tiempo.

5. Estudiar la presencia de Freón residual agregando 2 gotas del suero tratado a 1 gota de GRs e

incubando a 37 °C durante 1 hora. Inspeccionar en busca de hemólisis. Si es evidente la hemólisis,

repetir el paso 4.

Notas

1. El Freón no es inflamable, pero es muy volátil; tiene su punto de ebullición a los 24 °C. Debe

conservarse a 4°C. Todos los procedimientos de mediciones, mezclas y centrifugaciones deben

realizarse a 4°C. El suero a ser tratado debe estar a 4°C.

2. Las bajas concentraciones de Freón no son generalmente peligrosas, pero altas pueden tener un

efecto narcótico y causar mareos o alucinaciones y mareos.

3. Impedir el contacto del Freón con las membranas mucosas y los ojos. Si ocurre el contacto

enjuagar con agua corriente.

Referencias


Cross, 1993.

Método 131 – Conversión de anticuerpos incompletos en aglutininas directas


Los anticuerpos que no aglutinan directamente a los GRs en salina u en otro medio de baja concentración

proteica lo harán después de la reducción suave de las cadenas disulfuro intercatenarias. La reducción

realza la flexibilidad de la región de bisagra, lo cual aumenta la distancia entre los sitios fijadores de

antígeno en la porción Fab de la molécula de IgG mejorando la interacción antígeno-anticuerpo.


1. Ditiotreitol (DDT) 0.01 M, Cleland’s reagent, Calbiochem Corp.


3. Suero a estudiar conanticuerpos incompletos de alto título

4. Salina

5. Tubos de ensayo


7. GRs de grupo O antígeno positivos, en suspensión al 3%


1. Preparar del DTT 0.01 M: disolver 0.154 g de reactivo de Cleland (C4H10O2S2) en 100 mL de PBS.

Procedimiento

1. Rotular 2 tubos “DTT” y “PBS”.

2. Dispensar 1 mL de suero en cada tubo.

3. Agregar 1 mL de DTT 0.01 M al tubo “DTT”.

4. Agregar 1 mL de PBS al tubo “PBS”.


6. Rotular 2 tubos “DTT” y “PBS”.

7. Agregar 2 gotas de la mezcla de DTT y suero al tubo “DTT”.

8. Agregar 2 gotas de la mezcla de PBS y suero al tubo “PBS”.

9. Agregar 1 gota de GRs a cada tubo “DTT” y “PBS” y mezclar.

10. Leer en busca de aglutinación después de 15 minutos y después de 2 horas de incubación a

temperatura ambiente.

Interpretación

Si las cadenas disulfuro han sido rotas, el suero tratado con DTT aglutinará a los GRs y a la mezcla de

suero y PBS no.

Referencias

1. Romans DG, Tilley CA, Crookston MC, et al. Conversion of incomplete antibodies to direct

agglutinins by mild reduction: Evidence for segmental flexibility within the Fc fragment of

immunoglobulin G. Proc Natl Acad Sci 1977;74:2531-5.

Método 132 – Preparación del tampón fosfato


Este método es usado para preparar un reactivo de uso en las pruebas inmunohematológicas.


1. Fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) anhidro

2. Fosfato dihidrógeno potásico (KH2HPO4) anhidro

3. Matraces de 2 L

4. Probetas graduadas de 100 mL (opcional)

5. Balanza


7. Pipetas (opcional)


Procedimiento

1. Para preparar soluciones de reserva 0.1 M:

a. Para el Na2HPO4 0.1 M, disolver 14.21 g de Na2HPO4 (anhidro) en 1 L de agua destilada o

desionizada en un matraz.

b. Para el KH2HPO4 0.1 M, disolver 13.6 g de KH2HPO4 (anhidro) en 1 L de agua destilada o


2. Usando una probeta graduada, mezclar los volúmenes mostrados en la Tabla 132-1 para obtener

100 mL de tampón fosfato al pH deseado.

Tabla 132-1 Volúmenes para obtener 100 mL de buffer fosfato a un pH correcto

pH 0.1 M HPO4Na2 (mL) 0,1 M PO4KH2 (mL)

5.29

5.40

5.59

5.91

6.24

6.47

6.64

6.81

6.98

7.17

7.30

7.38

7.73

8.04

2.5

3.5

5.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

78.0

80.0

90.0

95.0

97.5

96.5

95.0

90.0

80.0

70.0

60.0

50.0

40.0

30.0

22.0

20.0

10.0

5.0

Notas

1. Ajustar el pH si es necesario con la solución de reserva apropiada. El agregado de Na2HPO4

aumentará el pH y hará la solución más básica; el agregado de KH2HPO4 bajará el pH y hará la

solución más ácida.

Referencias


Método 133 – Preparación de salina tamponada con fosfato (PBS)


Este método es usado para preparar un reactivo de uso en las pruebas inmunohematológicas.


1. Fosfato hidrógeno disódico (Na2HPO4) anhidro

2. Fosfato dihidrógeno potásico (KH2PO4) anhidro

3. 2 Matraces de 2 L

4. Probetas graduadas de 100 mL (opcional)

5. Balanza


7. Pipetas (opcional)


9. Cloruro de sodio (NaCl)

Procedimiento

1. Para preparar soluciones de reserva 0.1 M:

a. Para el Na2HPO4 0.1 M, disolver 14.21 g de Na2HPO4 (anhidro) en 1 L de agua destilada o


b. Para el KH2HPO4 0.1 M, disolver 13.6 g de KH2HPO4 (anhidro) en 1 L de agua destilada o


2. Preparar salina al 0.85% : diluir 8.5 g de NaCl en 1 L en agua destilada.

3. Usando una probeta graduada, mezclar los volúmenes mostrados en la Tabla 133-1 para obtener

100 mL de PBS al pH deseado.

Tabla 133-1 Volúmenes para obtener 100 mL de PBS a un pH correcto

pH 0.1 M HPO4Na2 (mL) 0,1 M PO4KH2

(mL)

0,85% salina

(mL)

5.29

5.40

5.59

5.91

6.24

6.47

6.64

6.81

6.98

7.17

7.30

7.38

7.73

8.04

0.25

0.35

0.5

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

7.8

8.0

9.0

9.5

9.75

9.65

9.5

9.0

8.0

7.0

6.0

5.0

4.0

3.0

2.2

2.0

1.0

0.5

90

90

90

90

90

90

90

90

90

90

90

90

90

90

Notas

1. Ajustar el pH si es necesario con la solución de reserva apropiada. El agregado de Na2HPO4

aumentará el pH y hará la solución más básica; el agregado de KH2HPO4 bajará el pH y hará la

solución más ácida.

Referencias



1985:51.

Método 134 – Preparación de solución de Alsever


La solución de Alsever es una solución conservantepara glóbulos rojos usada para extender la

conservación de los eritrocitos a 4 °C.


1. Citrato trisódico (dihidrato)

2. Dextrosa

3. Cloruro de sodio (NaCl)

4. Acido cítrico (monohidrato)


6. Matraz o botella plástica de 1 L

7. GRs a ser conservados


1. Preparar la solución se Alsever combinando 8.0 g de citrato trisódico (dihidrato), 19.0 g de

dextrosa, 4.2 g de NaCl, y 0.5 g de ácido cítrico (monohidrato). Diluir hasta 1 L con agua destilada

o desionizada.

Procedimiento

1. Mezclar 1 volumen de solución de Alsever con 1 volumen de GRs o preparar una suspensión

globular al 3-4% en solución de Alsever. Conservar a 4 °C.

Notas

1. A los reactivos globulares comerciales usualmente se les agrega cloranfenicol (0.33-0.55 g/L) y

sulfato de neomicina (0.5 g/L) para prevenir el desarrollo bacteriano.

Referencias

1. DeGowin EL, Hardin RC, Alsever JB. Blood transfusion. London: WB Saunders, 1949:330. Cited

by Mollison PL. Blood transfusion in clinical medicine. 7th ed. Oxford: Blackwell, 1986:789.

Método 135 – GRs cubiertos con IgG (Control Coombs)


Los GRs cubiertos con IgG reaccionarán con los reactivos antiglobulínicos. Pueden ser usados para

evaluar el reactivo antiglobulínico y como un control positivo para la prueba.


1. Anticuerpo IgA, no aglutinante (ver Nota 1)

2. GRs a estudiar: grupo O, antígeno positivos

3. EDTA dipotásico (K2EDTA)


5. Tubos de ensayo



8. Salina

9. NaOH 1 N

10. Agua destilada


12. Matraz

Procedimiento

1. Preparar los GRs lavando 3 veces con salina y hacer una suspensión globular al 25%.

2. Preparar el EDTA dipotásico agregando 4.45 g de K2EDTA a 80 mL de agua destilada. Ajustar el

pH a 7.0 con NaOH 1 N y diluir hasta 100 mL con agua destilada.

3. Preparar el suero agregando 0.25 mL de K2EDTA al 4.45% a 2 mL de suero con anticuerpo e

incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos (ver Nota 2).

4. Usando 2 mL de la mezcla de suero, preparar diluciones dobles desde 1:1 hasta 1:2048 (ver

M123).

5. Agregar 0.1 mL de la suspensión al 25% de los GRs a estudiar a cada 2 mL de dilución.

6. Mezclar e incubar a 37 °C durante 15-60 minutos.


8. Llevar a una concentración globular de 4-5% en solución de Alsever. Conservar a 4 °C hasta su

uso (ver Notas 3 y 4).

Notas

1. Se recomienda un pool de anticuerpos.

2. El K2EDTA se usa para prevenir la fijación de complemento a los GRs de prueba.

3. Los GRs cubiertos con cantidades decrecientes de IgG pueden usarse para evaluar los reactivos

antiglobulínicos.

4. Cuando los GRs cubiertos con IgG van a ser usados como control de la prueba antiglobulínica,

seleccionar sólo la dilución que da una reacción de 2+.

Referencias

1. Issitt PD, Smith TR. Evaluation of antiglobulin reagents. In: Myhre BA, ed. A seminar on

perfomance evaluation. Washington, DC: AABB, 1976:25-73.

Método 136 – Preparación de GRs cubiertos con IgA o IgM obtenidos de unmieloma


Las IgA y los anticuerpos no aglutinantes dirigidos contraantígenos eritrocitarios son raros. Por

añadidura, los anticuerpos IgM con especificidad hacia antígenos eritrocitarios reaccionan

preferentemente en el frío y se eluirán de la superficie globular a temperaturas elevadas. Como resultado,

el uso de tales anticuerpos es de poco valor en la preparación de GRs cubiertos con IgA o IgM para su uso

en la prueba antiglobulínica usando reactivos anti-IgA o anti-IgM humana.

El cloruro de cromo (CrCl3) tiene la capacidad de fijar las proteínas a la membrana eritrocitaria.

Las proteínas aisladas y purificadas de cualquier origen pueden fijarse sobre los GRs usando cloruro de

cromo. A pesar de que tiene lugar una pequeña cantidad de elución después del recubrimiento, la

cobertura es esencialmente permanente. Los GRs recubiertos de esta manera con proteínas IgA o IgM de

mieloma son estables por varias semanas cuando se conservan en solución de Alsever.


1. CrCl3

2. CrCl3 al 10%, solución de reserva

3. CrCl3 al 1%, solución de trabajo

4. Proteínas IgA o IgM de mieloma purificadas

5. GRs de grupo O

6. Tubos de ensayo de plástico o vidrio, limpios y sin usar

7. Solución salina

8. Pipetas

9. Mezclador vortex



1. Preparar la solución de reserva de CrCl3 al 10%: disolver 10 g de CrCl3 en 100 mL de salina.

Conservar, protegido de la luz, en la heladera.

2. Preparar la solución de trabajo de CrCl3 al 1%: agregar 1 volumen de solución de reserva de CrCl3

a 9 volúmenes de salina. Preparar inmediatamente antes de usar y descartar después de su uso.

3. Preparar las proteínas de mieloma IgA o IgM purificadas, 0.5-1.0 mg/mL: agregar salina al 0.5-1.0

mg/mL para producir la cantidad necesaria para el procedimiento.

4. Lavar los GRs de grupo O 3 veces en salina y remover todo el sobrenadante. Los GRs que tienen

7-10 días de extraídos parecen mejores para trabajar.

Procedimiento

1. Agregar 0.1 mL de la proteína de mieloma purificada y diluida a un tubo limpio.

2. Agregar al tubo 50 uL de GRs de grupo O a ser recubiertos.

3. Agregar 25 uL de solución de trabajo de CrCl3 a la mezcla de mieloma-GRs y agitar el tubo en el

vortex inmediatamente.

4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 4-5 minutos.

5. Lavar los GRs recubiertos 3 veces con salina.

6. Conservar los GRs recubiertos en solución de Alsever o en una solución conservadora similar.

Referencias

1. Jandl JH, Simmons RL. The agglutination and sensitization of red cells by metallic cations:

Interactions between multivalent metals and the red cell membrane. Br J Haemotol 1957;3:19-38.

2. Gold ER, Fudenberg HH. Chromic chloride: A coupling reagent for passive hemagglutination

reactions. J Immunol 1967;99:859-66.

3. Fudenberg HH, Koistinen J. Human allotype detection by passive hemagglutination with special

reference to immunoglobulin A allotypes. In: Rose RR, Friedman H, eds. Manual of clinical

immunology. 2nd ed. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1980:767-74.

Método 137 – Preparación de GRs cubiertos con C3b y C4b


Los GRs cubiertos con complemento se usan para control de calidad y evaluación de los reactivos

antiglobulínicos.



2. Sucrosa al 10%

3. Sangre entera de grupo O (de menos de 3 semanas de extraída, conservada a 4 °C en ACD, CPD o

CPDA-1)



6. Tubos de ensayo

7. Salina

8. Probeta graduada

9. Agua destilada

10. Tubo de centrífuga graduado de 10 mL


1. Preparar la sucrosa al 10% agregando sucrosa hasta el nivel de 1 mL de un tubo de centrífuga

graduado y llenando hasta el nivel de 10 mL con agua destilada. Mezclar hasta disolver.

Procedimiento

1. Mezclar 1 mL de sangre entera con 10 mL de la solución de sucrosa al 10%.



4. Hacer una suspensión globular al 2-5% con solución de Alsever y conservar a 4 °C.

Referencias

1. Petz LD, Garratty G. Acquired immune hemolytic anemia. 1st ed. Edinburg: Churchill Livingstone,

1980.

Método 138 – Preparación de GRs cubiertos con C3b y transformación a GRs cubiertos con C3d


Los GRs recubiertos con complemento se usan para control de calidad y evaluación de los reactivos

antiglobulínicos.



2. EDTA neutro

3. Suero humano (recientemente extraído y sin anticuerpos)

4. Suero anti-Lea o anti-Lea + Leb

6. Tubos de ensayo

7. Solución salina


8. NaOH 1 N

9. Agua destilada

8. Probeta graduada

11. Matraces

12. Papel para control de pH

13. GRs a estudiar Le(a+)


15. Tripsina al 0.1 % (ver M42)

Procedimiento

Preparación de los GRs cubiertos con C3b

1. Preparar EDTA neutro mezclando 4.45 g de K2EDTA y 80 mL de agua destilada. Ajustar el pH a

7.0 con NaOH 1 N. Agregar agua destilada hasta el nivel de 100 mL.

2. Preparar los GRs Le(a+) suspendidos al 50% en salina.

3. Mezclar 9 volúmenes de la suspensión de GRs Le(a+) al 50% en salina a 1 volumen de EDTA

neutro.

4. Agregar 1 volumen de la suspensión de GRs Le(a+) al 50% en salina a la mezcla anti-Lea – EDTA

neutro.

5. Incubar a 37 °C durante30 minutos.

6. Lavar 4 veces con solución salina.

7. Resuspender al 2-5% en solución de Alsever y conservar a 4 °C.

Transformaciónde los GRs cubiertos con C3b a cubiertos con C3d

1. Mezclar 1 gota de los GRs concentrados cubiertos con C3b con 1 gota de tripsina al 0.1% en PBS.

2. Incubar a 37 °C durante30 minutos.

3. Lavar 4 veces con solución salina.


Método de transformaciónalternativo

1. Incubar durante2 horas, 1 volumen de los GRs concentrados cubiertos con C3b y 20 volúmenes de

suero fresco humano carente de anticuerpos.



Notas

1. Los reactivos anti-Lewis de cabra no son satisfactorios.

Referencias


1980.

2. Issitt PD. Applied blood group serology. 3rd ed. Miami, FL: Montgomery Scientific Publications,

1985.

Método 139 – Alternativa para la preparación de GRs cubiertos con C3b


Los GRs cubiertos con complemento se usan para control de calidad y evaluación de los reactivos

antiglobulínicos.


1. Diluyente

2. Solución de Alsever enfriada (ver M134)

3. Cloruro de magnesio, 0.4 M (MgCl2)


5. Baño con hielo derretido

6. Sangre entera (anticoagulada en CPD, CPDA-1 o ACD)

7. Papel para control de pH o pHmetro

8. Matraces

9. Agua destilada

10. Sucrosa

11. NaH2PO4 • H2O

12. Na2EDTA • 2H2O


1. Preparar el diluyente:

a. Solución A: en un matraz de 250 mL con 125 mL de agua destilada, disolver 23.1 g de sucrosa,

173 mg de NaH2PO4 • H2O y 395 mg de Na2EDTA • 2H2O y llenar hasta 250 mL con agua

destilada.

b. Solución B: en un matraz de 250 mL con 125 mL de agua destilada, disolver 23.1 g de sucrosa,

178 mg de NaH2PO4 • H2O y 395 mg de Na2EDTA • 2H2O y llenar hasta 250 mL con agua

destilada.

c. Ajustar el pH de la solución A a pH 5.1 con solución B (aproximadamente 6.5 mL).

2. Preparar el MgCl2 0.4 M agregando 810 mg de MgCl2 • 6H2O a 10 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. Enfriar todos los reactivos en un baño con hielo derretido.

2. Colocar 19 mL de diluyente en un matraz pequeño en un baño de hielo derretido sobre un agitador

magnético (preferentemente en un habitación fría).

3. Agregar rápidamente 1.0 mL de sangre entera de a gotas.

4. Inmediatamente agregar 0.1 mL de MgCl2 0.4 M.

5. Agitar en el baño de hielo derretido durante60 minutos.

6. Lavar las células 3 veces con solución salina fría.

7. Conservar en solución de Alsever a 4 °C.

Notas

1. Los GRs cubiertos con C3b pueden ser transformados en GRs cubiertos con C3d como se indica

en M138.

Referencias

1. Fruitstone MJ. C3b-sensitized erythrocytes (letter). Transfusion 1978;18:125.


1980.

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