UNIVERSIDAD CENTROAMERICANA FACULTAD DE CIENCIA, TECNOLOGÍA Y AMBIENTE DEPARTAMENTO DE DESARROLLO TECNOLÓGICO

INGENIERÍA EN CALIDAD AMBIENTAL

Potencial de biodegradación de DDT y sus metabolitos en suelos agrícolas de fincas pertenecientes al Ingenio Monte Rosa, “Zona

Sur Los Millonarios”, Chinandega, 2007.

Tesis para optar al Título de Ingeniería en Calidad Ambiental

Autor: Carlos Ernesto Noguera Solís

Tutor: Jorge Alberto Huete Pérez, Dr.

Managua, Nicaragua Febrero 2008

Dedicatoria

A mi Madre, por enseñarme a soñar A mi Tiíta, por ser mi segunda madre A mi Padre, por hacernos libres

A Opo y la Mami, por darme su mano

Carlos Ernesto Noguera Solís

Agradecimientos Es más que una obligación agradecer a cada una de las personas que hicieron posible esta tesis. Gracias Dios por darme la bendición de ser libres y por darme una familia maravillosa, Mamá y Papá por darme la vida, por educarme hacia los demás y por darme el orgullo de ser su hijo, Familia Caldera Solís, por ser parte de mi vida; Humberto Martín, por su impulso; y Opita y Mami, por sus dos inmensos corazones. Esa tercera integrante de esta tesis, Adriana Guzmán, que sin duda marcó un antes y después en mi vida. A la Universidad Centroamericana por creer que la iglesia esta en el hacer. Gracias a mi tutor, Dr. Jorge Huete, por guiarme y ver en mi, a más que un pasante. Al Centro de Biología Molecular por el apoyo brindado todos estos años y no dudar en este proyecto. A mis compañeros, fue un lujo de compartir las mismas aulas. A los que les robe más de un día, sin tener la obligación de hacerlo, Ing. Indiana García e Ing. Enrique Campbell.

Gracias al Ingenio Monte Rosa, especialmente los Ing. Carlos García, Gustavo Ralda, Dalia Jiménez, y por supuestos a los muchachos que hicieron posible un muestreo de dos semanas en tres días, Elvin Arroliga, Miguel Oviedo, Marlon Guzman y Winston Palma.

Al MINSA, MAGFOR y UNA, por la colaboración con esa tesis, sobresaltando el gran aporte de la MSc. Verónica Guevara.

Por último, pero no menos importante, a los responsables de financiar esta tesis, FIUCA (Fondos para la Investigación de la UCA) y New England Biolabs.

Carlos Ernesto Noguera Solís

ÍNDICE

Resumen Abstract CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

1.1 Introducción 1.2 Objetivos CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades de contaminación mundial debida a plaguicidas 2.2 Contaminación de DDT a nivel naciona l 2.3 Dinámica de los plaguicidas en el suelo 2.3.1 Adsorción 2.3.1.1 Características fisicoquímicas de los plaguicidas 2.3.1.2 Composición coloidal del suelo 2.3.1.3 Características de la solución del suelo 2.3.2 Volatilidad 2.3.3 Procesos de lixiviación 2.3.4 Procesos de escorrentías 2.3.5 Procesos de degradación 2.3.5.1 Degradación química 2.3.5.2 Biodegradación 2.3.5.3 Fotodegradación 2.3.5.4 Metabolismos e isomería 2.4 Caracterización de compuestos organoclorados 2.4.1 Clasificación de organoclorados 2.5 Propiedades fisicoquímicas del DDT 2.6 Principios de biodegradación 2.6.1 Ley del mínimo de Liebig 2.6.2 Ley de tolerancia de Shelford 2.6.3 Principio de infabilidad microbiana 2.6.4 Biodegradación 2.6.4.1 Comprobación del potencial de biorremediación 2.6.4.2 Modelo cinético de primer orden 2.6.5 Mineralización 2.6.6 Cometabolismo 2.6.7 Detoxificación

2.7 Factores determinantes de biodegradación 2.7.1 Presencia de organismos con potencial de degradación 2.7.2 Presencia de cepas degradadoras específicas de la zona 2.7.3 Inducción de enzimas degradadoras apropiadas 2.7.4 Disponibilidad apropiada de donantes y aceptores de electrones 2.7.5 Disponibilidad de nutrientes 2.7.6 Compuestos inorgánicos 2.7.7 pH adecuado y capacidad buffer 2.7.8 Temperatura adecuada 2.7.9 Sustancias tóxicas o inhi bidoras 2.7.10 Clima 2.7.11 Materia orgánica 2.8 Aplicaciones microbiológicas en la biodegradación de DDT 2.8.1 Biodegradación de xenobióticos 2.8.2 Degradación de plaguicidas 2.8.2.1 Procesos anaeróbicos 2.8.2.2 Procesos aeróbicos 2.8.3 Biodegradación de DDT 2.8.3.1 Biodegradación anaeróbica de DDT 2.8.3.2 Biodegradación aeróbica de DDT 2.8.3.3 Mineralización de DDT 2.8.4 Biodegradación mejorada 2.8.4.1 Comensalismo 2.8.4 .2 Sintrofismo 2.8.4.3 Transferencia interespecífica de hidrógeno 2.8.5 Biorremediación de DDT in situ . CAPÍTULO III

DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO

3.1 Ubicación 3.2 Aplicaciones históricas de plaguicidas 3.3 Uso actual de plaguicidas 3.4 Descripción de las fincas 3.4.1 Finca la Haya 3.4.2 Finca Dos Reyna 3.4.3 Finca El Hular 3.4.4 Finca El Bosque 3.4.5 Finca Diano Marino 3.4.6 Finca Enma 3.4.7 Finca La Pita 2

3 .4.8 Finca El Trapiche 3.4.9 Finca Santa Lucía CAPÍTULO IV

DISEÑO METODOLÓGICO

4.1 Tipo de estudio 4.2 Universo 4.3 Población 4.4 Estrategia 4.5 Tipo de muestreo 4.5.1 Criterio de selección de puntos de muestreo 4.5.2 Criterio de frecuencia de muestreo 4.5.3 Sitios de muestreo 4.5.4 Recolección, prevención e identificación de muestras 4.5.4.1 Ensayo de biodegradación 4.5.4.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos 4.6 Variables 4.6.1 Ensayo de biodegradación 4.6.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos 4.7 Métodos y técnicas de análisis 4.7.1 Ensayo de biodegradación 4.7.1.1 Reactivos 4.7.1.2 Análisis 4.7.1.2.1 Degradación de DDT 4.7.1.3 Composición de cada uno de los lotes 4.7.1.4 Indicadores 4.7.1.5 Requerimientos mínimos 4.7.1.6 Identificación de microorganismos 4.7.1.7 Resumen de la metodología 4.7.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos 4.7.2.1 Reactivos 4.7.2.2 Aislamiento 4.7.2.3 Unidades formadoras de colonias (UFC) 4.7.2.4 Estudio de tolerancia o unidades degradadoras de colonias (UCD) 4.7.2.5 Identificación de microorganismos 4.7.2.6 Resumen de la metodologia 4.8 Instrumentos de recolección de datos 4.9 Procedimientos para el procesamiento y análisis de información 4.9.1 Ensayo de biodegradación 4.9.2 Ensayo de búsqueda e identi ficación de microorganismos

CAPÍTULO V: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Ensayo de biodegradación 5.1.1 Macronutrientes 5.1.2 Aplicaciones microbianas: Environoc 201 ® 5.1.3 Temperatura de trabajo (Tw

) 5.1.4 pH 5.1.5 Humedad (%) 5.1.6 Unidades formadoras de colonias (UFC) 5.1.7 Degradación de DDT 5.1.8 Degradación de DDT (valores corregidos) 5.1.9 Tiempo de vida media (t1/2) 5.1.10 Tiempo de vida 5.1.11 Correlación entre degradación (%) d e DDT y Tw 5.1.12 Correlación entre UFC y Tw 5.1.13 Factores de Correlación 5.1.14 Inversión 5.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos 5.2.1 Unidades de colonias degradadoras (UCD) 5.2.2 Relación entre Unidades de colonias degradadoras (UCD) y

Concentración inicial de DDT en las fincas 5.2.3 Relación de Unidades de colonias degradadoras (UCD) y

Concentración de DDT aplicadas 5.2.4 Especies aisladas e identificadas 5.2.5 Relación entre colonias aisladas y concentración de DDT CAPÍTULO VI

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

6.1 Conclusiones 6.2 Recomendaciones Abreviaturas Referencias ANEXO A: Estructura del DDT y sus metabolitos ANEXO B: Hojas de trabajo ANEXO C: Coordenadas fincas ANEXO D: Tw, Humedad (%) y pH ANEXO E: Envinonoc 201 ® y Environbrew ® ANEXO E: Hojas de seguridad y Certificados

LISTA DE TABLAS

Tabla 2.1. Procesos en suelos relacionados con plaguicidas Tabla 2.2. Tabla resumen: Plaguicidas organoclorados representativos Tabla 2.3. Propiedades del DDT y sus metabolitos Tabla. 2.4. Algunos géneros microbianos y enzimas que co-oxidan contaminantes orgánicos Tabla. 2.5. Valores mínimo, óptimo y máximo de pH en la multiplicación de diversas bacterias Tabla 2.6. Características de los principales géneros de bacterias que realizan decloración reductora Tabla. 2.7. Reacciones de dehalogeneración reductiva catalizada por cultivos puros de bacterias en un proceso metabólico o cometabolico Tabla 2.8. Resultados del estudio in situ de los microcosmos durante 6 semanas Tabla 4.1. Fincas muestreadas perteneciente a la Zona Sur “Los Millonarios” Tabla 4.2. Análisis de DDT y UFC por día, para el Ensayo de biodegradación Tabla 5.1. Análisis físicos-químicos* de la Finca El Bosque Tabla 5.2. Detalle de aplicaciones de E201® y agua Tabla 5.3. Efecto de dilución (m/m) en los Controles 1 (estiércol) y 2 (cachaza) Tabla 5.4. Temperatura de Trabajo (Tw ) durante de los 100 días de seguimiento Tabla 5.5. pH promedio resultante los 100 días de seguimiento Tabla 5.6. Humedad % promedio resultante los 100 días de seguimiento Tabla 5.7. Crecimiento microbiano (UFC), Crecimiento microbiano como UFC para los lotes y controles durante los 100 días de seguimiento. Tabla 5.8. Promedio de Unidades Formadoras de Colonias para los Lotes 2, 3 y 4 Tabla 5.9. UFC Total Promedio Tabla 5.10. Análisis por día de DDT y metabolitos Tabla 5.11. Degradación estadística de DDT y sus metabolitos por regresión lineal Tabla 5.12. Tiempos de vida media (días y años) calculados Tabla. 5.13. Tiempo de vida calculado Tabla 5.14. Correlación entre Tw y degradación (%) de DDT Tabla 5.15. Temperatura de Trabajo (Tw) contra Unidades Formadoras de Colonias Tabla. 5.16. Factores de correlación (r) entre degradación (%) de DDT, Tw y UFC Tabla 5.17. Costos anuales de biorremediación del Ensayo de biodegradación de la finca El Bosque Tabla 5.18. Costos de alternativas para tratar suelos contaminados por desechos peligrosos Tabla 5.19 Condiciones iniciales de las fincas muestreadas Tabla 5.20. Unidades Degradadoras de Colonias por Finca y concentración Tabla 5.21. Unidades de colonias degradadoras contra Concentración Inicial de DDT Tabla 5.22. Unidades de colonias degradadoras contra Concentración de DDT aplicadas Tabla 5.23. Especies y/o géneros de los microorganismos aislados Tabla 5.24. Colonias aisladas contra Concentración de DDT

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1. Dinámica de los plaguicidas en el suelo Figura 2.2. Algunos compuestos xenobióticos que pueden ser degradados por microorganismos Figura 2.3. Degradación microbiana de compuestos aromáticos por vías orto y meta, ilustrada mediante el benceno Figura 2.4. Diversas vías de degradación aerobia del tolueno Figura 2.5. Vía metabólica microbiana por declorinación reductiva del DDT. Figura 2.6. Vía de degradación propuesta para la degradación de DDT por Pseudomonas sp Figura 2.7. Vía metabólica propuesta para la mineralización de DDT por P. chrysosporium. Figura 2.8. Degradación secuencial anaerobia/aerobia de PCBs altamente clorados Figura 2.9. Consorcio de microorganismos: una red microbiana para la degradación de compuestos aromáticos clorados Figura 3.1. Puntos muestreados en la Finca La Haya Figura 3.2. Puntos muestreados en la Finca Dos Reyna Figura 3.3. Puntos muestreados en la Finca El Hular Figura 3.4. Puntos muestreados en la Finca El Bosque Figura 3.5. Puntos muestreados en la Finca Diano Marino Figura 3.6. Puntos muestreados en la Finca Enma Figura 3.7. Puntos muestreados en la Finca La Pita 2 Figura 3.8. Puntos muestreados en la Finca El Trapiche Figura 3.9. Puntos muestreados en la Finca Santa Lucía Figura 4.1. Resumen de la metodología utilizada para el Ensayo de biodegradación Figura 4.2. Resumen de la metodología utilizada para el Ensayo de búsqueda y asilamiento de microorganismos Figura 5.1. Unidades Formadoras de Colonias contra Tiempos Figura 5.2. Correlación de Pearson entre degradación (%) de DDT y Tw de todos los lotes Figura 5.3. Temperatura de Trabajo contra Unidades Formadoras de Colonias Figura 5.4. Unidades degradadoras de colonias contra concentración de DDT Figura 5.5. Correlación entre UCD y concentración (%) de DDT Figura 5.6. Microorganismo identificado: Pseudomonas sp Figura 5.7. Microorganismo identificado: Phanerochaete chrysosporium.

RESUMEN

El presente trabajo de tesis evaluó el potencial de biodegradación del 1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (DDT) y sus metabolitos en suelos agrícolas de Zona Sur, Los Millonarios, pertenecientes a Fincas del Ingenio Monte Rosa, a través de dos ensayos: Ensayo de biodegradación ex situ y ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos capaces de biodegradar DDT. En el primer ensayo, se determinó el porcentaje de biodegradación, bajo condiciones idóneas durante un período de 100 días, en diferentes lotes de suelo con diferentes aditivos (cachaza y estiércol), a través de la aplicación de cepas microbianas comerciales Environoc 201®. De ello se obtuvo como resultado un porcentaje de biodegradación mayor para el lote que no presentaba aditivos orgánicos, siendo éste de 23,92%. En el ensayo de búsqueda e identificación de bacterias, se lograron aislar e identificar cepas microbianas nativas de los suelos agrícolas objeto de estudio, utilizando medios de cultivo con DDT como única fuente de carbono y energía. Como resultado, se lograron identificar los siguientes microorganismos: Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Phanerochaete chrysosporium y levaduras.

ABSTRACT The biodegradation potential of 1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) and its metabolites in agricultural soils were evaluated in the southern zone of Los Millonarios, of the Ingenio Monte Rosa farms. Two analyses were performed: ex situ biodegradation analysis, and search and identification analysis of microorganisms capable of biodegrading DDT. In the first analysis, the percentage of biodegradation was determined under ideal conditions after a period of 100 days, in various soil strata containing certain additives (sugar cane residue, cow dung), through the application of commercial microbic stumps of Environoc 201®. The highest percentage of biodegradation (23,92%) was obtained in the stratum that did not present organic additives. In the second analysis, native microbial stumps were isolated and identified using a culture media with DDT as the only carbon and energy source. The following microorganisms were found: Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Phanerochaete chrysosporium and yeasts.

CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN

1.1 Introducción El 1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (DDT) (Kamanavalli y Ninnekar, 2004) es un insecticida perteneciente a la familia de los organoclorados, con alta toxicidad, persistencia y capacidad bioacumulativa, que tiene implicaciones desfavorables para el ambiente, la sociedad y la economía. En Nicaragua, fue utilizado a gran escala a partir de la explosión del cultivo del algodón entre los años 70 y 80 (EMBUSA, 1999). A pesar de que su utilización ha disminuido en gran medida en los últimos 20 años, aún se encuentran concentraciones significativas de DDT y sus metabolitos en los suelos agrícolas y el agua. Tal es el caso de zonas aledañas al Ingenio Monte Rosa, donde se han encontrado concentraciones en el suelo de hasta 900 ppb (partes por billón) (Pantaleón, 2007). Existen sub-registros de intoxicaciones agudas y crónicas en ocho departamentos, incluyendo la región de León-Chinandega, reportándose intoxicaciones incluso en 1994, un año después de haber incluido el DDT dentro de la docena sucia (MINSA, 1995; PAN, 1993). Cerca de los aeródromos agrícolas de esta región, se han encontrado niveles de colinesterasa (enzima-control de afectaciones por pesticidas organoclorados) del 35,30% en los niños expuestos a los desechos de la pista (Appel, 1990). Sus efectos sobre la biota acuática, suelos, agua y cadena alimenticia, así como sus efectos bioacumulativos que provocan afectaciones al sistema nervioso (niveles altos de la enzima colinesterasa) y que pueden provocar incluso la muerte, (ATSDR, 2002a) han motivado a realizar investigaciones con el fin de reducir su impacto. La presente investigación pretende evaluar el potencial de biodegradación de DDT en suelos agrícolas pertenecientes a 9 Fincas (El Bosque, El Trapiche, Santa Lucía, La Haya, El Hular, ENMA, Diano Marino, Dos Reyna y La Pita 2) del Ingenio Monte Rosa, ubicadas en “Zona Sur Los Millonarios”, en el Municipio El Viejo, Departamento de Chinandega.

Estas Fincas fueron seleccionadas atendiendo a los resultados de análisis realizados en el Laboratorio Nacional de Residuos Biológicos del MAG-FOR (Pantaleón, 2007), a partir de las cuales se eligieron sitios con rangos variables de concentraciones de DDT en el suelo. Cada una de dichas concentraciones, sobrepasaba el límite máximo permisible de DDT en agua potable (no existe límite máximo permisible de DDT en suelos). De ahí que surgiera la necesidad de evaluar el potencial de biodegradación de DDT asociado a dichos suelos. Para llevar a cabo dicha evaluación, la investigación se orientó a: efectuar un Ensayo de biodegradación en suelos pertenecientes a la finca “El Bosque”, utilizando cepas microbianas comerciales del tipo Environoc 201® (E201®), durante un período de 100 días, a lo largo de los cuales se monitorearon variables ambientales (ph, Humedad y Tw ) que sirvieron para controlar el crecimiento microbiano asociado con la actividad biodegradadora sobre el DDT. La segunda parte de la investigación (segundo ensayo) buscó cultivar, aislar e identificar bacterias nativas de los suelos del resto de las fincas, capaces de tolerar y biodegradar DDT. En Nicaragua, se han llevado a cabo proyectos pilotos de biorremediación en agua y suelos, enfocados en el estudio de biodegradación de otros plaguicidas, tales como toxafeno y DDT (únicamente a nivel de laboratorio o en cuerpos de agua) (Carvalho et al, 1999). La importancia de la presente investigación radica en que constituye el primer estudio realizado en Nicaragua de biodegradación ex situ de DDT, valorando variables ambientales que inciden directamente en el crecimiento de microorganismos que conllevan a la biodegradación. Por su parte, la búsqueda de microorganismos nativos en suelos agrícolas de Nicaragua, capaces de biodegradar DDT, ofrece un marco de referencia en el establecimiento de criterios de selección, métodos y análisis para facilitar su aislamiento e identificación. En su sentido más amplio, la metodología empleada también sirve como marco de referencia para el desarrollo de futuros estudios en la identificación de microorganismos capaces de biodegradar el DDT u otro tipo de plaguicidas, a través del uso concomitante de una variedad de medios selectivos de cultivo. Por su parte, un ensayo ex situ constituye un buen punto de partida para la proposición de futuros proyectos de biorremediación in situ a gran escala que disminuiría n el grado de contaminación por DDT y las correspondientes afectaciones a la salud de la población. Este aporte podría verse desarrollado a posteriori a través de un proyecto in situ cuyo objetivo principal versara sobre la biorremediación de suelos agrícolas pertenecientes a fincas del Ingenio Monte Rosa.

1.2 Objetivos Objetivo general

- Evaluar el potencial de biodegradación de DDT en suelos agrícolas pertenecientes a la Zona Sur “Los Millonarios” del Ingenio Monte Rosa.

Objetivos específicos

- Establecer las condiciones idóneas para remediar los suelos de la Zona Sur “Los Millonarios” del Ingenio Monte Rosa por bioaumentación ex-situ.

- Determinar el porcentaje de biodegradación de DDT en un intervalo de

tiempo definido, mediante la aplicación de cepas microbianas y residuos orgánicos.

- Aislar e identificar microorganismos capaces de tolerar y biodegradar DDT

bajo determinadas condiciones.

- Determinar las concentraciones en la que se de mayor crecimiento de microorganismos capaces de tolerar y/o biodegradar DDT.

CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO

En este capítulo se describe el panorama general sobre la contaminación mundial y nacional por DDT. Con el fin de profundizar en el análisis, se estudia la dinámica de los plaguicidas en el suelo, en especial, los organoclorados. Debido a que el DDT es uno de los máximos exponentes de la familia de los organoclorados, así como el plaguicida objetivo de la investigación, se describen sus propiedades fisicoquímicas. Dado que la microbiología ambiental es una rama extensa y nueva en ciencia de la vida, se hace una revisión general a los principios y fundamentos de la interrelación de los microorganismos con el medio ambiente. Por último, se plantea los principios de la biodegradación, describiendo las últimas técnicas utilizadas, los microorganismos más representativos, así como los factores ambientales que afectan en la eficiencia de la degradación microbiana.

2.1 Generalidades de contaminación mundial debida a plaguicidas

El empleo de productos químicos inorgánicos para destruir plagas, principalmente insectos, se remonta posiblemente a los tiempos de Grecia y Roma clásicas. Homero menciona la utilidad del azufre quemado como fumigante, mientras que Plinio El Viejo recomienda el arsénico como insecticida y alude al empleo de sosa y aceite de oliva para tratar las semillas de leguminosas. En el Siglo XVI, los chinos empleaban arsenicales como insecticidas y poco después, empezó a usarse la nicotina extraída del tabaco (OMS, 1992). En el siglo XIX, se utilizaron el pelitre (planta de sabor salino muy fuerte a la que se le añade keroseno) y el jabón par combatir los insectos, así como los lavatorios elaborados a partir de una mezcla de tabaco, azufre y cal para eliminar tanto insectos como hongos (OMS, 1992). Tiempo después se utilizaron los compuestos orgánicos, entre ellos los organoclorados (OC).

Una de las definiciones más completas es la propuesta por la FAO en 1986 (OMS, 1992), la cual establece que un plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de organismos causantes de enfermedades humanas o de los animales, las especies no deseadas de plantas o animales que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera, productos de ésta o alimentos para animales. Asimismo la definición abarca las sustancias reguladoras del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de las frutas o agentes para evitar la caída prematura de la misma y sustancias utilizadas antes o después de la cosecha, con el propósito de proteger el producto. El primer plaguicida OC y el más conocido, fue el DDT. Se sintetizó por primera vez en 1874, pero sus propiedades insecticidas se descubrieron sólo hasta 1939, cuando se le utilizó para proteger la lana contra la polilla. Durante la Segunda Guerra Mundial resultó ser muy efectivo para combatir el piojo del tifus y evitar la proliferación de epidemias, como paludismo. Posteriormente fue empleado para enfrentar todo tipo de plaga artrópoda (Restrepo, 1988). Poco después, su aplicación se amplió al campo agrícola y ya para la década de los sesenta, el 80% de la producción de DDT era empleada en el cultivo del algodón (Restrepo, 1988). Murty (1986) menciona que en las dos décadas posteriores a la Segunda Guerra Mundial hubo un uso indiscrimado de compuestos OC, especialmente en Norte América con el DDT, mientras que en Gran Bretaña y Japón fueron los ciclodiénicos (aldrín y dieldrín en particular) y el hexaclorociclohexano (HCH). Aunque en los últimos 15 años el DDT ha sido incluido dentro de la llamada docena sucia (PAN, 1993), restringiéndose su uso, la Organización Mundial de Salud (OMS, 1992) ha estimado que hasta 1971, más del billón de personas han sido salvadas del riesgo de contraer malaria por el uso de éste. El DDT fue prohibido en Suecia durante 1970 y en los Estados Unidos durante 1972. Debido a sus características físico-químicas, el DDT puede transportarse por grandes distancias y ello ha originado su distribución global. Se ha encontrado DDT y sus metabolitos DDD (1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofenil)-2,2-dicloroetano) y DDE (1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofeni)etileno) aún en lugares donde el insecticida no ha sido aplicado, tal y como ocurre en el Ártico. Suecia es uno de los países en los que se ha determinado que los niveles de OC empezaron a disminuir considerablemente desde la década de los años 70 a pesar de que en los años 60 estaba muy contaminado por DDT y HCH (Hexaclorociclohexano), lo que demuestra que las medidas de protección ambiental implementadas tuvieron un efecto positivo (Bignert et al., 1998).

El DDT se ha utilizado extensamente en todo el mundo. La OMS (1992) calcula que su eficacia en el control del mosquito Anopheles sp. liberó a 1000 millones de personas del riesgo de contraer paludismo en las décadas de 1950 y 1960, con lo cual se impidieron millones de muertes. A pesar de estar prohibido en la mayoría de países desde hace más de tres décadas, es un contaminante comúnmente detectado en los diferentes compartimentos ambientales.

Actualmente la UNECE (Comisión Europea de Economía para la Organización de las Naciones Unidas, 1999) permite el uso de DDT en dos casos: protección de la salud pública en enfermedades como la malaria y como producto intermedio en la síntesis del Dicofol, siempre que el contenido total de DDT sea inferior a 0,1 %.

2.2 Contaminación por DDT a nivel nacional Durante los años sesenta, Nicaragua presentaba un panorama creciente en producción de nuevos cultivos como bananos, caña de azúcar y algodón, que a su vez provocó un crecimiento proporcional al uso de plaguicidas como control de plagas, entre ellos el DDT (EMBUSA, 1999). Debido a su fertilidad y clima favorable, la región occidenta l León-Chinandega fue seleccionada como la región cultivable para estos cultivos, concentrándose gran parte de los plaguicidas como el DDT, metil-paratión y toxafeno, con el fin de exterminar la plaga del algodón, Anthonomus grandis (Carvalho et al., 1999). La repercusión de la aplicación excesiva del DDT y otros pesticidas, después de 40 años, aún son representativas. En 1996 el Centro para la Investigación en Recursos Acuáticos (CIRA), de la Universidad Nacional de Nicaragua (UNAN), determinó la existencia de residuos de plaguicidas de organoclorados en leche materna y grasa corporal de mujeres naturales de la cuenca del Río Atoya, Chinandega. En este estudio se encontró pp-DDT en el 74,00% de las muestras, además de detectarse otros plaguicidas como el dieldrín, endrin y heptacloro epóxido en el 20,00%, 9,40% y 8,90% respectivamente del total de muestras. En 1997, el Programa de Manejo de Plaguicidas (PROMAP-MARENA) determinó el nivel de residuos de plaguicidas en alimentos frescos en varias regiones del país, encontrándose que el 45,00% de 218 muestras de tomate, sandía, repollo, chiltoma y lechuga tenían niveles por encima de los límites máximos de residuos donde los productos con mayores niveles fueron la lechuga (100,00%), el repollo (79,60%) y la chiltoma (41,40%) (Salgado, 1997). Un estudio de Álvarez (1997), con 132 muestras de agua y sedimentos recolectadas en 32 puntos de ríos y pozos, evaluó 32 plaguicidas

organofosforados y organoclorados, encontrando DDD, DDE y toxafeno, entre los plaguicidas organoclorados y etion, metil paration y etil paration entre los organofosforados. Además, se encontraron muestras de ríos con concentraciones encima de los niveles permitidos, pozos rurales contaminados con endrin y toxafeno y un pozo urbano contaminado a 500 metros del antiguo aeródromo. La gran reserva de DDT y toxafeno acumulada en los suelos seguirá actuando como la principal fuente de contaminación en los sistemas lagunares, observándose en los resultados de un estudio realizado por Carvalho y Cols (1997), elevadas concentraciones de toxafeno y DDT en almejas del Estero Naranjo. Actualmente, el cultivo de caña de azúcar figura entre las actividades más importantes dentro del sector agropecuario. La industria azucarera, Ingenio Monte Rosa S.A. ubicada en el Km. 148,50 carretera El Viejo-Potosí, representa la segunda industria azucarera más importante a nivel nacional, aportando en el año 2000 cerca del 31,00% de la producción de azúcar (UNI, 2007). A su vez, Monte Rosa ha tomado iniciativas con el fin de mitigar el impacto ambiental de sus actividades, que como toda industria utiliza insumos que pueden alterar las condiciones naturales de los diferentes sustratos como agua y suelo. A pesar que dentro de los agroquímicos utilizados en esta industria, no figura el DDT, análisis realizados en el Laboratorio Nacional de Residuos Orgánicos, del Ministerio Agropecuario y Forestal (MAGFOR), demuestran la persistencia de pesticidas organoclorados, incluyendo el DDT y sus metabolitos, en suelo, no así en los tejidos de caña de azúcar y sus subproductos (Pantaleón, 2007). La zona más afectada es la Zona Sur, Los Millonarios, donde se observan concentraciones de hasta 900 ppb (Pantaleón, 2007), en el peor de los casos, y fincas con concentraciones de entre 400 y 100 ppb. Si bien, esta contaminación fue “heredada” por los cultivos bananeros y algodoneros, el ingenio ha mostrado un interés por reducir estas concentraciones, aportando a la investigación del país al permitir el ingreso de los diversos centros de investigación del país (Centro de Biología Molecular – UCA, UNI, etc.), realizar ensayos y propuestas de tratamiento de aguas residuales y suelos.

2.3 Dinámica de los plaguicidas en el suelo La dinámica de plaguicidas en los suelos hace referencia a su comportamiento en el mismo, dependiente de numerosos procesos que se llevan a cabo en la matriz edáfica. A su vez, está relacionada con el tiempo de permanencia del plaguicida en los suelos. La presencia de los plaguicidas en los suelos se produce por diferentes causas. Independientemente del uso específico que se haga del mismo, el suelo es el que recibe la mayoría de los plaguicidas usados para la protección de los cultivos (Arnold y Briggs, 1990) y, dependiendo del método de aplicación, entre un 30,00% y un 100,00% del plaguicida llega directamente hasta él (Fernandes, 2004). Las tres principales vías de llegada de los plaguicidas al suelo son las siguientes: - Tratamientos que se realizan directamente en las partes aéreas de las plantas, en las que parte del producto aplicado cae directamente en el suelo o bien, es arrastrado desde la planta hasta el suelo por medio de la lluvia, el viento, el riego, etc.

- Tratamientos que se realizan directamente sobre el suelo, por ejemplo: herbicidas, nemáticidas, fungicidas.

- Restos vegetales que quedan en el suelo una vez recogida la cosecha o que se desprenden durante el tratamiento. Según el tiempo en que tarden en degradarse, los plaguicidas pueden ser clasificados en dos grupos: persistentes o recalcitrantes, y no persistentes. El DDT es un plaguicida de alta persistencia que presenta una vida media de más de 100

Figura 2.1. Dinámica de los plaguicidas en el suelo. Fuente: Arnold y Briggs, 1990.

días. En algunos casos, la vida media puede llegar a ser de más de 30 años, dependiendo de las condiciones climáticas y edáficas de la zona contaminada. Una vez en el suelo, los plaguicidas sufren una serie de procesos físicos, químicos y biológicos, todos ellos relacionados entre sí, y que se representan de forma global en la Figura 2.1 (página anterior). Estos procesos pueden agruparse en dos grandes grupos: fenómenos de transporte y fenómenos de transformación o degradación. En la Tabla 2.1 podemos observar los procesos de transferencia y transformación que ocurren en el suelo en relación con los plaguicidas. Los procesos de transferencia implican un movimiento del plaguicida de una fase a otra del suelo o dentro de una misma fase, mientras que en los procesos de transformación hay un cambio en la estructura del plaguicida (Cornejo y Moreno, 1998).

Tabla 2.1. Procesos en suelos relacionados con plaguicidas

Adsorción-desorción Volatilización Difusión y Arrastre Escorrentía Absorción por las plantas

Transferencia

Lixiviación Química Fotoquímica Transformación Biológica

Fuente: Fernandes, 2004.

Las características físicas y químicas de la disolución del suelo son las que regulan en gran parte la actividad biocida del plaguicida y su comportamiento como agente de polución. Entre ellas, la cantidad del producto en disolución es particularmente determinante y, por ello, todos los factores susceptibles de hacerla variar tienen una gran influencia en la dinámica del plaguicida. Desde este punto de vista, los procesos de adsorción y desorción son, entre los distintos factores a considerar, los más importantes (Navarro,1986).

2.3.1 Adsorción Se entiende por adsorción el proceso a través del cual átomos, iones o moléculas se adhieren, física o químicamente, a la superficie de un material. El proceso contrario recibe el nombre de desorción. El nombre que recibe la sustancia que se adsorbe es adsorbato, mientras que el material donde se adsorbe recibe el nombre de adsorbente.

La adsorción, conocida también como fisiosorción, se lleva a cabo a través de fuerzas atractivas débiles, mientras que la quimiosorción se lleva a cabo a través del establecimiento de enlaces químicos entre adsorbato y adsorbente. En síntesis, el proceso de adsorción se debe a la atracción o repulsión entre la superficie del adsorbente (macroporos y microporos del suelo) y las moléculas o iones del adsorbato (plaguicida) (Calvet, 1989). Entre los mecanismos de adsorción se tiene: enlace iónico, enlace covalente, puente de hidrógeno, transferencia de cargas, cambios de ligandos, fuerzas de van der Waals e interacciones hidrofóbicas. Los procesos de adsorción-desorción vienen determinados en gran parte por la cantidad de superficie de contacto del sólido que, como es inversamente proporcional al tamaño, resulta evidente que los principales componentes del suelo implicados en la adsorción sean los constituyentes de las fracciones más finas o fracción coloidal, tanto orgánica como inorgánica (Bailey y White, 1970). Los procesos de adsorción ocurren más frecuentemente entre la fase sólida del suelo y la solución del suelo, ya que la fase sólida siempre está rodeada de una fina capa de agua, por lo que sólo en casos de extrema aridez se produciría la adsorción sólido-gas (Pignatello, 1989). Los procesos de adsorción-desorción tienen gran importancia, puesto que al determinar la cantidad de plaguicida presente en la solución del suelo, controlará otros procesos que afectan a la dinámica de plaguicidas en el suelo. Por ejemplo, la adsorción del plaguicida puede producir ua disminución de: la fotodegradación (Sukul y Spiteller, 2001), la volatilización (Chester et al., 1989), la biodisponibilidad (Walker et al., 1989), el transporte por escorrentía (Jamet, 1993), y el movimiento vertical de los plaguicidas a lo largo del perfil del suelo. Por otro lado, los procesos de adsorción pueden catalizar procesos de degradación química (Cox et al., 1994) y fotólisis (Senesi, 1993), pero también pueden proteger los plaguicidas adsorbidos de la degradación biótica y fotoquímica (Hermosín et al., 1993; Walter et al., 1999; Romero et al., 1998, Aguer et al., 2000) Por el contrario, los procesos de desorción incrementan la volatilización, la biodisponibilidad y el transporte de plaguicidas. Según la Agencia para las Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades (ATSDR, 1989), la afinidad que tiene cualquier plaguicida con el suelo está determinada por un coeficiente de adsorción, denominado Koc. Las sustancias que presentan un coeficiente de adsorción mayor de 100 000 son las que se adsorben con mayor fuerza al suelo. El DDT tiene un coeficiente de adsorción de 140 000; el DDD de 780 000, mientras que el DDE supera a los dos anteriores con un coeficiente que es tres veces mayor al del DDD. Debido a la alta persistencia, es normal que en suelos tratados con DDT, la concentración de éste vaya disminuyendo al tiempo de que la concentración de los metabolitos va incrementándose, sobre todo, la del DDE. Se han descrito algunos

suelos que son particularmente resistentes a la degradación del DDT y, en ellos, el cociente de los coeficientes respectivos de DDE/DDT es menor de lo normal. Entre los factores que influyen en los procesos de adsorción de plaguicidas a los suelos se pueden citar las características físico-químicas del plaguicida, composición coloidal y solución del suelo. 2.3.1.1 Características físico-químicas de los plaguicidas Comprende factores determinantes como la estructura molecular, la carga y la polaridad, la solubilidad en el agua y tamaño molecular. Estructura molecular: Determina el proceso de adsorción al condicionar los mecanismos de interacción que pueden tener lugar entre el plaguicida y el suelo. Factores que determinan el carácter químico, son: la naturaleza de los grupos sustituyentes, su posición, y la presencia y magnitud de las instauraciones (Bailey y White, 1970). Carga y polaridad: La naturaleza catiónica o aniónica del adsorbato y el adsorbente determinará la fuerza del fenómeno de adsorción. La polaridad del plaguicida es importante en interacciones entre los dipolos (permanentes o inducidos) y las superficies polares de los coloides del suelo, y contribuye en muchos casos al proceso de retención, designadamente para los compuestos altamente polares. Solubilidad en agua: Existe una correlación negativa entre la solubilidad de los plaguicidas en agua y la adsorción a suelos, especialmente para moléculas apolares o de escasa polaridad. Tamaño molecular: El tamaño de la molécula del plaguicida influye en la adsorción porque guarda relación directa con las fuerzas Van der Waals, por lo que en moléculas voluminosas este tipo de interacción puede ser importante en la adsorción. 2.3.1.2 Composición coloidal del suelo

Coloides inorgánicos: Las partículas más finas del suelo constituyen la fase denominada arcillosa. Está integrada en su mayor parte por silicatos alumínicos hidratados y, en menor proporción, por óxidos de hierro y aluminio, residuos muy finos de cuarzo y caliza, generalmente precipitada (Navarro,1986).

Coloides orgánicos: En general los compuestos orgánicos de baja polaridad no son capaces de competir con las moléculas de agua que solvatan las superficies hidrofóbicas de los coloides minerales por posibles sitios de adsorción. Además, la concentración del compuesto orgánico en la solución del suelo suele ser muy pequeña para competir eficazmente con las moléculas de agua por los sitios de adsorción (Calvet, 1989). Muchos autores (Hermosín et al, 1993; 1994; Aguer et al., 2000) han puesto de manifiesto las limitaciones de considerar a la materia orgánica como la única responsable de la adsorción en el caso de compuestos polares. En muchos casos se ha encontrado una mayor correlación entre la adsorción y el contenido de arcilla de los suelos que con el de materia orgánica. Excepto para los plaguicidas muy polares o suelos con muy bajo contenido de materia orgánica se considera que los coloides orgánicos juegan un papel prioritario en los procesos de adsorción. La correlación entre la adsorción y el contenido orgánico suele ser bastante alta (Wolfe et al., 1990). Esto es una consecuencia de la alta afinidad de las moléculas de agua por las superficies minerales, que quedan por lo tanto excluidas para la adsorción de compuestos orgánicos. En suelos con un alto contenido de materia orgánica (> 5%), la movilidad de los plaguicidas está relacionada con el contenido de materia orgánica, teniendo la naturaleza de la materia orgánica aparentemente poco efecto en los procesos de adsorción (Bailey y White, 1970; Hayes, 1970). Esto no ocurre en suelos de contenido de materia orgánica inferior a 5%. 2.3.1.3 Características de la solución del suelo Efectos del pH: Numerosos trabajos han puesto de manifiesto la importancia del pH en los procesos de adsorción (Fernandes, 2004). El pH de la solución del suelo determina la carga superficial de los componentes con carga variable del suelo y la ionización de los plaguicidas con propiedades ácidas o básicas. Efecto de la fuerza Iónica: El aumento de este parámetro disminuye la adsorción debido a la competencia por los sitios de adsorción entre el soluto y los iones en solución (Watson et al., 1973). Humedad: La humedad se relaciona estrechamente con la adsorción. Cuando el contenido de agua es bajo, debido a la baja solubilidad que generalmente presentan la mayor parte de los plaguicidas, tienden a quedar en estado sólido y, por tanto, difícil de disolverse. Por otra parte, los contenidos bajos de humedad provocan una fuerte retención de agua, que deja pocos sitios activos libres para que el plaguicida pueda adsorberse (Navarro,1986).

Temperatura: Los procesos de adsorción son exotérmicos, mientras que los de desorción son endotérmicos (Clark, 1974), por lo que un incremento de temperatura dará lugar a una disminución de la adsorción y a un aumento de desorción. Por otra parte, la temperatura afecta a la solubilidad de los plaguicidas, afectando también indirectamente a la adsorción. Según Hamaker y Thompson (1972), el efecto de la temperatura en la adsorción depende de la fuerza de la interacción entre el soluto y la superficie; a mayor fuerza de interacción mayor es la influencia de la temperatura.

2.3.2 Volatilidad

La volatilidad de un compuesto se define como todo proceso físico-químico por el cual un compuesto es transferido a la fase gaseosa. Puede resultar de la evaporación de la fase líquida, sublimación de la fase sólida, evaporación de una solución acuosa o desorción de la matriz del suelo (Bedos et al., 2002) Los factores que influyen en la volatilización son: las propiedades físico-químicas del plaguicida, las características del suelo, las condiciones climáticas y las prácticas de cultivo. Las altas temperaturas favorecen la volatilización, porque la presión de vapor de un compuesto en una solución acuosa depende exponencialmente de la temperatura. Sin embargo, la combinación de la temperatura del suelo con la humedad puede limitar este efecto. La velocidad del viento y la humedad también afectan a la velocidad de volatilización. A un incremento en la temperatura del suelo, se espera un aumento de la volatilización. El DDT y sus metabolitos se consideran compuestos semivolátiles o de volatilidad moderada. A causa del fenómeno de la volatilidad, el DDT puede bajar sus concentraciones en el suelo. El DDT volatiliza de los suelos con una vida media de 100 días. Sin embargo, para el caso particular del DDT, hay que considerar que el DDD es cinco veces menos volátil que el DDT, mientras que el DDE es hasta 8 veces más volátil que el DDT. La volatilidad se incrementa con el aumento de temperatura.

2.3.3 Procesos de lixiviación La lixiviación es el proceso por el cual el agua, procedente de lluvia o de riego, arrastra o disuelve moléculas de plaguicidas dando lugar a un movimiento vertical a lo largo del perfil del suelo. Sin embargo, esto reviste importancia

particularmente para determinar el riesgo de contaminación de aguas subterráneas. (Fernandes, 2004) Los principales factores que afectan la movilidad de plaguicidas en el suelo son las propiedades físico-químicas del plaguicida, la adsorción por los coloides del suelo, las propiedades físicas, químicas y microbiológicas del suelo, la estructura del suelo, el clima, la forma y época de aplicación y prácticas culturales (riego, laboreo, etc.). Entre los más importantes, destacan la adsorción por los coloides del suelo, características físico-químicas del plaguicida, estructura del suelo, intensidad de lluvia y/o riego y prácticas culturales.

Adsorción por los coloides del suelo: La movilidad de los plaguicidas a lo largo del perfil del suelo es directamente proporcional a la solubilidad e inversamente proporcional a la adsorción (Beck et al., 1993). En los horizontes más superficiales, la materia orgánica es, en general, el factor determinante de la adsorción, impidiendo o reduciendo los procesos de lixiviación (Bouchard y Lavi, 1985), mientras que al aumentar la profundidad, es la fracción mineral, arcillas y óxidos metálicos lo que controla los procesos de adsorción-desorción. Cuando se produce el fenómeno de desorción, el plaguicida puede movilizarse a lo largo de perfil por los procesos de percolación (Worral et al., 1999) Características físico-químicas de los plaguicidas: Entre éstas se encuentran su ionizabilidad, solubilidad en agua, presión de vapor y la naturaleza lipofílica (Weber et al., 1980). Mientras mayor sea la adsorción, menor será el riesgo de lavado, aunque si el lavado es continuo, el plaguicida puede desorberse y así aumentar la concentración de plaguicida en el lixiviado.

Estructura del suelo: El suelo posee un conjunto de características estructurales denominadas macroporos, cuya presencia influencia el movimiento de plaguicidas, originando flujos preferenciales sin pasar por la masa del suelo (Beven y Germann, 1981; Larsson et al., 1999). En este caso se habla de transporte hidrodinámico, mientras que el movimiento del plaguicida a través de la masa del suelo se da por difusión. En sistemas con macroporos de gran diámetro y longitud, una gran parte del soluto puede ser transportado a lo largo del perfil del suelo sin entrar en contacto con la masa del suelo. De este modo, plaguicidas de muy baja solubilidad en agua que se adsorben fuertemente y en grandes cantidades en el suelo, pueden llegar a contaminar aguas subterráneas (White et al., 1986).

Intensidad y frecuencia de lluvia y/o riego: El aporte de agua al suelo, ya sea procedente de lluvia o de agua de riego, es un factor de gran importancia en lo que se refiere a persistencia y lixiviación de plaguicidas en los suelos. La intensidad, frecuencia, distribución y estacionalidad del agua aplicada afectan

enormemente al movimiento y distribución de los plaguicidas en el suelo (Fernandes, 2004). Prácticas culturales: Tienen un efecto directo en la lixiviación de plaguicidas. La utilización de un mínimo de laboreo aumenta la microfauna y microflora del suelo , con lo que puede favorecer la biodegradación y, consecuentemente, una disminución del riesgo de contaminación al reducirse la cantidad de plaguicida en la solución del suelo (Cox et al., 1994). Se ha encontrado que en el laboreo de conservación, la materia orgánica en los primeros milímetros del suelo es mayor que en suelos con laboreo convencional (Calderón et al., 1999), por lo que la adsorción se puede ver favorecida y reducida la lixiviación. Hay que considerar también que el aumento en materia orgánica del suelo tras la enmienda podría llevar a un aumento de adsorción de plaguicidas y/o a una mayor degradación, dando lugar a una menor lixiviación. El cambio en la estructura del suelo puede dificultar o favorecer el desplazamiento del plaguicida.

2.3.4 Procesos de escorrentía La escorrentía tiene lugar cuando la precipitación o el riego supera la tasa de infiltración de agua. Según Wauchope (1978), las pérdidas por escorrentía tienen lugar en disolución para plaguicidas con solubilidades mayores a 2 mg/L. Los factores más importantes que determinan la pérdida de escorrentía son: las condiciones climáticas, las características del suelo, las características del plaguicida y las prácticas culturales. La dificultad para predecir el proceso de escorrentía conlleva a que los modelos en uso establezcan las condiciones que disminuyen las pérdidas y sugieren medidas más apropiadas para minimizar el proceso, en lugar de indicar de alguna forma las concentraciones posibles en las aguas de escorrentía (Fernandes, 2004).

2.3.5 Procesos de degradación Los insecticidas se ven afectados en el suelo por diferentes transformaciones que son las responsables de su desaparición (Cheng y Lehman, 1985) y que, por tanto, reducen la contaminación de plantas y aguas superficiales y subterráneas. Los procesos de degradación o transformación más importantes suelen ser, la degradación química, biodegradación, fotodegradación, y la transformación del compuesto y sus metabolitos o isómeros, los cuales se detallan a continuación.

2.3.5.1 Degradación química Los procesos de hidrólisis y oxidación son los más frecuentes y los que presentan mayor variedad de transformaciones (Armstrong y Honrad, 1974). Todas estas reacciones suelen ser catalizadas en mayor o menor grado por la superficie de las arcillas, óxidos metálicos, iones metálicos, superficies de sustancias húmicas y materiales orgánicos diversos (Hermosín et al., 1983) Las reacciones hidrolíticas son catalizadas por ácidos, bases y/o metales de transición, por lo que afectan en gran medida las tasas de hidrólisis. Factores determinantes de las tasas de degradación química son: el mecanismo de reacción y la estructura química del plaguicida. 2.3.5.2 Biodegradación Los procesos de biodegradación se deben fundamentalmente a la microflora del suelo (bacterias y hongos) y dan lugar a metabolitos más o menos tóxicos y a compuestos minerales como NH3, CO2, y H2O. En general, la tasa de biodegradación aumenta con la temperatura y con el aumento de la humedad del suelo hasta capacidad de campo (Parker y Doxtader, 1983), debido a un aumento de la población microbiana. La materia orgánica puede ser un substrato nutritivo para la microflora, dando lugar a un aumento de ésta y, por tanto, a una mayor tasa de degradación de plaguicidas biodegradables (Hole et al., 2001). La modificación del comportamiento de plaguicidas varía con la naturaleza y reactividad de la enmienda orgánica utilizada y sus efectos en la actividad microbiana del suelo (Alvey y Crowley, 1995). Otro fenómeno de gran interés en lo que respecta a la biodegradación de plaguicidas es el fenómeno de degradación acelerada de plaguicidas en suelos que se puede definir como una adaptación de los microorganismos del suelo dando lugar a una metabolización rápida, tras tratamientos repetitivos (Felsot y Shelton, 1993). A la fecha, la mayoría de las investigaciones con DDT han examinado la contaminación de aplicación relativamente recientes, sin embargo con el tiempo, los residuos de DDT se pueden unir a materia orgánica o superficies arcillosas (Boul, 1995). En suelos, el DDT ha demostrado tener una gran afinidad por la materia orgánica, y muy poco se sabe sobre su interacción con la arcilla.

El más importante mecanismo de unión entre el DDT y los suelos es considerado como una interacción hidrofóbica en varios sitios activos de la materia húmica. (Boul, 1995) 2.3.5.3 Fotodegradación Consiste en la degradación del plaguicida como consecuencia de la energía de la luz solar. Esta reacción es importante en los primeros centímetros del suelo, en la superficie de las plantas y en ecosistemas acuáticos, donde los plaguicidas pueden ser transportados en disolución o bien, adsorbidos a la materia particulada. Según Burrows et al. (2003), la fotodegradación se puede dar por cuatro procesos: fotodegradación directa, degradación por fotosensitización, degradación fotolocatalizada y degradación por reacción con radicales hidroxilos. El proceso de fotodegradación depende de factores como la intensidad y tiempo de exposición del plaguicida a la radiación solar, la presencia de catalizadores fotoquímicos que pueden favorecer la descomposición; el pH del suelo, el grado de aireación del suelo, el estado en que se encuentra el plaguicida (sólido, en disolución, vapor, etc.), el grado de adsorción y la estructura química del plaguicida. 2.3.5.4 Metabolitos e isomería El DDT puede metabolizarse a varios metabolitos, entre los cuales destacan: DDD y DDE. Los tres compuestos pueden presentarse, además, en los isómeros p,p´- y o,p´. El isómero o,p´-DDT es un compuesto quiral que puede presentarse en los enantiómeros (+) y (-). Los enantiómeros tienen las mismas propiedades físico-químicas, pero son biodegradados de manera diferente, por lo cual se convierten en excelentes monitores de este fenómeno. (Ortiz et al., s.n.f.)

2.4 Caracterización de compuestos organoclorados Los plaguicidas comunes se pueden categorizar químicamente en tres grupos generales: inorgánicos, orgánicos naturales y orgánicos sintéticos. Los organoclorados son moléculas orgánicas con sustituyentes cloro en varios lugares de su estructura, el número y localización de estos sustituyentes determinan la

facilidad de degradación del compuesto. Como regla general, cuanto más sustituido, menor facilidad de degradación. Los microorganismos lo transforman en DDD, mientras que mamíferos e insectos lo convierten principalmente en DDE, en virtud de sus diferentes sistemas enzimáticos. Tanto DDD como DDE son compuestos bastantes estables y de larga vida en el medio, y además son bastantes tóxicos. Se han descrito muchos caminos de degradación de los hidrocarburos clorados. Se conocen tantos los mecanismos como los productos de degradación de la mayoría de los plaguicidas hoy en su uso. Sin embargo, desde la perspectiva de la calidad de las aguas, la aparición de metabolitos no es tan importante como la velocidad a la que son producidos. En general, los hidrocarburos clorados causan severos problemas de calidad en las aguas, debido a su lenta velocidad de degradación. Algunas autores (Kuhr et al., 1972) han estudiado la degradación del DDT en suelos de viñedos a los que se estuvo aplicando DDT constantemente durante 24 años. Se observó que el DDT permanecía entre la superficie y una profundidad máxima de unos 7 cm y no se movía hacia las aguas subterráneas; esto último debido al tipo de suelo significativamente arcilloso. También se mostró que aproximadamente el 50% del DDT se degradaba en 6 años, el 67% en 12 años y el único producto de degradación que se encontró en el suelo fue el DDE. Los plaguicidas se pueden clasificar de diversas maneras (CPEHS, 1986): Por su naturaleza química: inorgánicos, orgánicos, naturales (botánicos y microbianos), sintéticos. Por su mecanismo de acción: contacto, ingestión, fumigante, sistémicos. Por el tipo de organismos que afectan: insecticidas, acaricidas, fungicidas, herbicidas. En la categoría de plaguicidas orgánicos sintéticos están incluidos los OC, los cuales se clasifican por su estructura química en: - Derivados halogenados de hidrocarburos alicíclicos (HCH, lindano) - Derivados halogenados de hidrocarburos aromáticos (DDT; p,p'DDT; p,p'DDE) - Derivados halogenados de hidrocarburos ciclodiénicos (aldrín, dieldrín)

2.4.1 Clasificación de organoclorados Se pueden dividir en varios grupos según su estructura molecular: grupo del DDT y análogos como metoxicloro, pertano; Hexaclorociclohexano, con los isómeros alfa, beta y gamma o lindano; ciclodienos, aldrín, endrín, dieldrín, clordano, endosulfán y heptaclor; y canfenos clorados, toxafén y clordecona (Ferrer y Martínez, 1993). En la Tabla 2.2 se puede observar un resumen de los plaguicidas organoclorados más representativos.

Tabla 2.2. Tabla resumen: Plaguicidas organoclorados representativos. Contaminante

Orgánico Fuente Principal Esfera más

afectada Efectos primarios en la

salud

DDT

Aplicación como plaguicida en todo el mundo

Agua, cadena alimenticia

Se bioacumula en tejidos grasos; produce trastornos nerviosos; reducción en la cuenta de glóbulos blancos, persiste en el ambiente

Dioxina (específicamente

TCDD)

Impureza de manufactura de triclorofenoles que se utilizan en diversos biocidas. Emitida por aplicación o accidente.

Agua, Cadena alimenticia

Extremadamente tóxica en forma concentrada, daños a riñones, hígado y sistema nervioso; potente teratógeno, posible carcinógeno

Fenitrotión

Rocío insecticida en cultivos, terrenos forestales

Agua, aire Sólo es tóxico para mamíferos en dosis grandes; puede ser en parte causa de la iniciación del síndrome de Reye en niños

Mírex Insecticidas, retardante de flama en plásticos

Agua, cadena alimenticia

Biológicamente activo, persistente; su toxicidad varía con la especie; bioacumulable.

PCB

Dieléctrico, transferencia de calor y fluido hidráulico

Cadena alimenticia

Persistente en el ambiente, probable carcinógeno, la exposición produce cloroacné , dolores de cabeza, trastornos visuales

Cloroformo

Anestésico, bienes de consumo, productos farmacéuticos, plaguicidas. Cloración de abastecimientos de agua

Alimentos, agua Toxicidad aguda en concentraciones altas, daños al hígado y al corazón, carcinógeno para los roedores

Trihalometanos (incluye el

cloroformo)

Accidentalmente en agua como consecuencia de la cloración de materia orgánica

Agua Posibles carcinógenos

Fuente: Fernandes, 2004. Según la OPS (2005) es posible clasificarlos como: Derivados de hidrocarburos aromáticos: DDT y compuestos análogos, tales como DDE, DDD, dicofol, metoxicloro y clorobencilato. La estructura molecular del DDT y sus metabolitos se muestran en el Anexo A. Derivados de hidrocarburos alicíclicos: Cicloalcanos clorados, como los isómeros del hexaclorociclohexano, dentro de los cuales el más conocido es el lindano (isómero gamma).

Derivados de hidrocarburos ciclodiénicos: Ciclodienos clorados como aldrín, dieldrín, endrín, endosulfán, mirex, clordano, heptacloro. Derivados de hidrocarburos terpénicos (terpenos clorados): Todos los OC son considerados sustancias persistentes, ya que su tiempo promedio de degradación es de 5 años. Lo anterior obedece a que sus estructuras químicas son muy estables y se degradan lentamente bajo condiciones ambientales extremas. Entre los compuestos más persistentes destacan el toxafeno (11 años), el DDT y endrín (10 años), clordano (8 años), dieldrín (7 años), aldrín (5 años), heptacloro (4 años) y lindano (2 años).

2.5 Propiedades fisicoquímicas del DDT

El DDT es un compuesto muy persistente en el medio ambiente. Su degradación tiene lugar muy lentamente. Las fuentes primarias de DDT y sus metabolitos en el medio ambiente en la actualidad serían: la volatilización a la atmósfera en zonas de aplicación o síntesis, transporte atmosférico y deposición desde zonas de aplicación actual y el uso continuado de Dicofol, aunque los datos de usos de este plaguicida, al menos a nivel de USA y Canadá, indican que las emisiones de DDT al medio ambiente por esta causa son probablemente bajas. (Henry y Heinke, 1999) Cuando se refiere al DDT, se trata generalmente del p,p´-DDT, el cual fue producido y usado debido a sus propiedades insecticidas. Sin embargo, el DDT de uso comercial, a una composición que por lo general era la usada para fabricar el plaguicida, estaba compuesto por más de 14 sustancias químicas, de las cuales solamente del 65 al 87% representaba el ingrediente activo, p,p´-DDT. Los otros componentes incluían de 15 a 21% del casi inactivo o,p-DDT, más de 4% de p,p´-DDD y más de 1,5% de 1-(p-clorofenil)-2,2,2-tricloroetanol (Metcalf, 1995). Las fórmulas, estructuras y nombres de identificación para p,p -́DDT, p,p´-DDE, p,p´-DDD, o,p´-DDT, o,p´-DDE y o,p´-DDD se muestran en Anexo A (ATSDRb, 2002). Los últimos 5 compuestos corresponden a una fracción de impurezas o bien, a metabolitos: El DDT es un polvo blanco, amorfo, que se derrite en un rango de temperatura entre 80 y 94 ºC (Metcalf, 1995). Las propiedades del p,p´-DDT, p,p´-DDE, o,p´-DDT, o,p´-DDE y o,p´-DDD se pueden apreciar en las siguiente Tabla 2.3 (página siguiente).

Tabla 2.3. Propiedades del DDT y sus metabolitos

Propiedades p,p´-DDT p,p´-DDE p,p´-DDD

o,p´-DDT

o,p´-DDE o,p´-DDD

P.M. 354,49 318,03 320,05 354,49 318,03 320,05

Color Blanco o sin color Blanco Blanco o

sin color Blanco

cristalino Sin dato Sin dato

Estado físico Sólido Sólido cristalino

Sólido Sólido Sólido Sólido

Punto fusión 109 89 109-110 74,02 Sin dato 76-78

Punto ebullición

Descomposición 336 350 Sin dato Sin dato Sin dato

Densidad 0,98-0,99 Sin Dato 1,385 0,98-0,99 Sin dato Sin dato

Olor Inodoro a Ligero Sin Dato Inodoro Inodoro a Ligero Sin dato Sin Dato

Solubilidad agua

0,025 0,012 0,090 0,085 0,14 0,1

Solubilidad en otros

solventes

Etiléter y acetona

Lípidos, solventes orgánicos

Sin datos Sin datos Sin

datos

Etanol, isoctano,

tetracloruro de carbono

Presión de vapor

1,60x10-7 6,0x10-6 1,35x10-6 1,1x10-7 6,2x10-6 1,94x10-6

Fuente: Metcalf, 1995.

Todos los metabolitos poseen una elevada tendencia a bioacumularse en los seres vivos y la exposición a estos compuestos se ha asociado a efectos teratogénicos, disrupción del sistema endocrino, efectos a largo plazo relacionados con el sistema nervioso y disfunciones hepáticas (Metcalf, 1995; Henry y Heinke, 1999) Debido a que la mayoría de las reacciones químicas ocurren en la fase líquida o de vapor, la persistencia del DDT, no sólo atribuida a su composición química inherente, se debe también a su baja solubilidad en agua y presión de vapor (Jury et al., 1984). El DDT también es resistente a la degradación microbiana; esto debido a dos razones: Los niveles en la solución acuosa son tan bajos que, a menos que haya toxicidad para el microbio, no habrá una presión de selección para degradar el DDT; el DDT no imita compuestos de ocurrencia natural, por lo que los sistemas enzimáticos no pueden utilizarlo fácilmente como sustrato, exceptuando ciertas enzimas específicas para especies microbianas, micóticas y mamíferas. La resistencia del DDT ante el ataque microbiano puede ser atribuida a los sustituyentes de cloro de la molécula, la cual es recalcitrante al presentar un cloro más que su análogo, DDD, el cual se sabe es más fácilmente biodegradable (Wedemeyer, 1967).

2.6 Principios de Biodegradación

En cuanto a la remediación microbiana, existen muchos términos que tienden a relacionarse, o bien, a crear confusión. Con el fin de evitar confusiones, a continuación se definirán los principios de biodegradación.

2.6.1 Ley del mínimo de Liebig Esta ley revela que la producción total de biomasa de cualquier organismo está determinada por el nutriente cuya concentración sea la mínima, en relación con lo que requiere el organismo (Atlas y Bartha, 2002). Por ende, para crecer, un microorganismo necesita obtener de su ambiente, diversos nutrientes con el fin de producir energía y su biosíntesis. Además, la ley expresa que al igual que sucede con los átomos de una molécula, los elementos de un organismo vivo se encuentran en distintas proporciones. Así, el agua constituye entre el 70 y el 90% del peso celular, considerándose el nutriente principal. Los componentes sólidos y los cationes metálicos desarrollan funciones fundamentales para la célula. (Atlas y Bartha, 2002) Un aumento en la concentración de un determinado nutriente limitante permite el crecimiento o reproducción de la población afectada, hasta que queda limitada por la escasez de otro factor (Atlas y Bartha, 2002). Por ejemplo, un ecosistema que está limitado por la concentración de fósforo disponible, la adición de nitrógeno no aumentará el crecimiento; sin embargo, dentro del mismo ecosistema, puede existir otra población cuyo crecimiento esté limitado por la concentración de nitrógeno. En el último caso, será ésta la población que se desarrollará.

2.6.2 Ley de tolerancia de Shelford La ley de tolerancia de Shelford describe la forma en que las variables abióticas (temperatura, potencial Redox, pH, etc.) controlan la abundancia de organismos en un ecosistema, y no solo los nutrientes (Atlas y Bartha, 2002). Por ende, cada organismo necesita de una serie de condiciones para sobrevivir y desarrollarse, donde los factores ambientales establecen límites, por encima y por debajo de los cuales no es posible que los microorganismos sobrevivan (Shelford, 1913). El éxito de un organismo en el ambiente recae en las condiciones que se hallen dentro de su margen de tolerancia. Autoecología: en ecología microbiana, la autoecología estudia las interacciones entre poblaciones microbianas aisladas y sus determinantes ambientales. Estudia,

a su vez, las adaptaciones ambientales extremas, y el por qué se desarrollan dichas condiciones (Atlas y Bartha, 2002). Sinecología: la sinecología estudia las interacciones entre las poblaciones (Atlas y Bartha, 2002). Dentro de las interacciones sinecológicas, existen interacciones positivas (comensalismo, sintrofismo y transferencia interespecífica de hidrógeno), así como negativas (competitividad, parasitismo o depredación) (Álvarez y Guevara, 2003). De esta forma, las interacciones entre las poblaciones microbianas alteran el crecimiento de otros microorganismos.

2.6.3 Principio de infalibilidad microbiana La hipótesis de la Infalibilidad microbiana expresa que cualquier compuesto orgánico virtualmente disponible habría de tener un organismo heterotrófico (Varnam y Evans, 2000) que lo degrade bajo condiciones adecuadas; en caso contrario, la evolución y adaptación produciría una cepa competente en un período relativamente corto (Gale, 1952). Según Álvarez y Guevara (2003), esta hipótesis esta sustentada mediante numerosas observaciones sobre capacidades de biodegradación nuevas, basándose principalmente en compuestos considerados anteriormente recalcitrantes o reacios (ejemplo, MTBE, 1,4-diozano y atrazina). Aún no se conoce con claridad si estas observaciones se deben a nuevas enzimas producidas por mutaciones o recombinaciones de genes catabólicos, o bien si enzimas preexistentes se han proliferado debido a la presión selectiva por el contaminante y que sale a relucir en el ambiente con la mejora de los procesos de investigación y los métodos para detectarlas.

2.6.4 Biodegradación Biodegradación se puede definir como la biotransformación de la estructura de compuestos orgánicos mediante la ruptura de los enlaces moleculares (Álvarez y Guevara, 2003). Esta implicación puede ser sutil (grupos funcionales sustituidos) o bien, severa (rompimiento completo de las estructuras moleculares). 2.6.4.1 Comprobación del potencial de la biorremediación Con el fin de demostrar la eficiencia de degradación microbiana mediante biorremediación, se requieren ensayos de laboratorio. Los ensayos de laboratorio demuestran el potencial de un tratamiento particular para estimular la eliminación

de un compuesto xenobiótico presente en un enclave contaminado (Bailey et al., 1973), siempre y cuando se reproduzcan en lo posible las condiciones ambientales del sitio, es muy probable que se produzcan los mejores resultados (Bertrand et al. 1983). Según Atlas y Bartha (2002) se recomienda incluir en los estudios de biorremedición: Muestras autóctonas del sitio: se deben realizar muestreos recogiendo sobre el terreno con poblaciones microbianas autóctonas. Controles abióticos: con el fin de separar la biodegradación real de los efectos de la evaporación o la meteorización del contaminante. Recuento de poblaciones microbianas: medir en lo posible la biodiversidad microbiana. Esta técnica nunca medirá recuento totales de microorganismos o Unidades Formadoras de Colonias (Atlas y Bartha, 2002). Determinación de la velocidad de biodegradación: comparar la velocidad de degradación de las muestras tratadas con los controles no tratados. Esta es la medida más directa de la biodegradación del contaminante. 2.6.4.2 Modelo cinético de primer orden Una medida de la longevidad es el intervalo del tiempo al cual la concentración disminuye en un 50%, lo cual se llama: tiempo de vida media. Aunque la degradación de DDT fuera una reacción de primer orden, la pérdida de residuos totales sería complicada por diferentes niveles de degradación, pérdida y enlace. En suelos templados, la vida media es de 2 a 10 años (Cramer, 1973). En suelos tropicales, los estimados son de 1 año (FAO/IAEA, 1994). Se han utilizado un gran número de modelos más o menos complejos para cuantificar la degradación de los plaguicidas en suelos y aguas. El más común es el denominado modelo cinético de primer orden que describe la degradación del plaguicida en función del tiempo: r= dC/dt= -kt C, siendo r= degradación (mg/g/día), C concentración de plaguicida (mg/g), t (días) y Kt coeficiente de degradación (1/día ). El coeficiente de biodegradación describe la tasa a la cual se degrada el contaminante. La degradación usualmente sigue un patrón de decaimiento de primer orden con respecto a la concentración del contaminante (C):

dC = -?C Dt

(2.1)

Cuando idealizamos un sistema completamente mezclado (sin flujos de entradas ni salidas de masas), podemos integrar la Ecuación 2.1, obteniendo:

C = e-?t Co

(2.2)

Donde, Co: concentración inicial C: concentración en el tiempo t Por ende, si el sistema es de batch (cerrado) y completamente mezclado, la gráfica de Ln (C) contra tiempo debería arrojar una línea recta, cuya pendiente es el valor de ? . Reordenando la Ecuación 2.2, se obtiene la siguiente expresión:

t= Ln[Co/C] ?

(2.3)

El tiempo de vida media (t½) del contaminante, definido como el período requerido para reducir la concentración del contaminante a la mitad, se puede calcular con la siguiente ecuación (página siguiente):

t½ = Ln[2] ?

(2.4)

Estas ecuaciones sólo son aplicables para el tipo batch, completamente mezclados, en los cuales la dilución y advección no son factores que influyen sobre la concentración de los contaminantes. Otra forma más conveniente de cuantificar dicho efecto es mediante la vida-media t1/2 (días), donde t1/2= 0.693/kt. Los valores de t1/2 calculados para un determinado plaguicida pueden obtenerse a partir de las numerosas tablas publicadas. Es de destacar que estos valores corresponden a medidas realizadas a una temperatura y contenido de humedad específico y normalmente a una actividad microbiana óptima. Sin embargo la biodegradación tiende a disminuir en suelos secos y cuando la temperatura disminuye (debido al descenso de la actividad microbiana). Por esta razón, para un determinado compuesto cabe la posibilidad de poder encontrar un rango de variabilidad de t1/2 importante, que en algunos casos puede llegar a alcanzar varios órdenes de magnitud. El valor del período de vida mitad o período de semidegradación da una idea acerca de la persistencia del plaguicida. Cuando un plaguicida resiste los procesos

de transformación y además no se evapora será muy persistente, tendrá un período de semidegradación muy largo y un alto potencial para contaminar las aguas subterráneas. Esto es particularmente cierto si el mismo plaguicida es altamente soluble en agua y no permanece adsorbido en el suelo. En general, los plaguicidas con vidas medias superiores a 2-3 semanas deben ser cuidadosamente evaluados de cara a la posibilidad de que puedan contaminar los acuíferos.

2.6.5 Mineralización Resulta en la conversión de una molécula orgánica, por medio de vías de catabolismo, en su constituyente inorgánico (por ejemplo CO2, CH4, H2O, SO4

2- y PO4

3-; o en sales minerales). El organismo responsable generalmente se beneficia de la reacción; en dicho caso se espera que una porción original de la molécula objetivo (ejemplo DDT) sea usualmente incorporado en caso de crecimiento microbiano (Álvarez y Guevara, 2003).

2.6.6 Cometabolismo El término cometabolismo es un fenómeno mediante el cual un microorganismo transforma un compuesto, pero no obtiene energía, carbono, o ningún otro nutriente a partir de él. Debido a esto, los microorganismos no pueden crecer empleando este compuesto como único sustrato. Estas ocurren cuando una enzima de un microorganismo que crece a partir de un sustrato A reconoce otro compuesto B como sustrato y lo transforma en un producto (Ecuación 2.6). Esta transformación es generalmente limitada ya que el siguiente sustrato no puede ser reconocido por la enzima, al tener ésta una mayor especificidad (Atlas y Bartha, 2002).

Tabla. 2.4. Algunos géneros microbianos y enzimas que co-oxidan contaminantes orgánicos.

Género Enzima Sustrato primario

Algunos compuesto cometabolizados

Psedomonas Rhodococcus Dioxigenasa de

Tolueno Tolueno,

fenol, otros

TCE, muchas otras oleofinas alifáticas, clorobenceno, nitrobenceno, nitrotolueno Isómeros, alquilsulfidos

Burhkolderia, Pseudomonas sp., Acinetobacter

Monooxigenasa de Tolueno

Tolueno, fenol, otros

TCE, clorobenceno, nitrobencno, nitrotolueno, isómeros, alquenos

Methylosynus, Methylococcus, Methylomicrobium

Monooxigenasa de Metano

Metano, formato, metanol

TCE, todos los isómeros DCE, cloroformo, diclorometano, ciclohexano, n-alcanos

Nitrosomonas Monooxigenasa de amoníaco

Amoníaco TCE, 1-1-DCE, dimetiléter, thioéteres, metil flioruro

Tabla. 2.4. (cont.) Algunos géneros microbianos y enzimas que co-

oxidan contaminantes orgánicos.

Género Enzima Sustrato primario

Algunos compuesto cometabolizados

Pseudomonas Dioxigenasa de Naftaleno Naftaleno

Tolueno, etilbenceno, sulfuros aril álcali, indan, fenantreno

Burhkolderia, Pseudomonas sp., Sphingomonas, Comamonas

Dioxigenasa de Bifenil Bigenil

Congéneres de PCB ligeramente clorados, dibenzofuranos y dioxinas carbazoles

Mycobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Rhodococcus

Monooxigenasa de Propano Propano

Isómeros TCE, DCE, cloruro de vinil, cloroalcanos, benceno, MTBE.

Fuente: Álvarez y Guevara, 2003.

Al prevalecer en el ambiente cultivos mixtos, los productos de las transformaciones metabólicas pueden ser frecuentemente metabolizadas por otras especies de la comunidad microbiana, resultando en algunos casos en una completa mineralización (Álvarez y Guevara, 2003). En la Tabla 2.4 se muestran ejemplos de microorganismos y enzimas que exhiben cometabolismo (lista no exhaustiva), conjuntamente con los compuestos objetivos a ser degradados. En las ecuaciones 2.5 y 2.6 (Álvarez y Guevara, 2003) podemos observar el clásico comportamiento del metabolismo y cometabolismo microbiano.

2.6.7 Detoxificación Según Álvarez y Guevara (2003), la transformación de un contaminante prioritario resulta en un compuesto menos tóxico. Existen algunas excepciones válidas de hacer notar, donde el compuesto transformado se transforma en uno más tóxico (TCE a cloruro de vinilo, y aldrín a eldrín). Con la biorremediación se quiere transformar los compuestos en unos menos tóxicos; si éste no fuera el caso; no es viable la biorremediación.

a b Metabolismo: A ? B ? ? ? CO2 + energía + célula –C a Cometabolismo: A´ ? B´ ? //

(2.5)

(2.6)

2.7 Factores determinantes de biodegradación De acuerdo a sus propiedades y las características químicas del plaguicida como del entorno en el que se encuentra depositado, la vida media de ellos puede variar de días a meses. Muchos plaguicidas se degradan rápidamente en el suelo, proceso denominado: mineralización, en el cual el plaguicida es transformado en compuestos más simples, como dióxido de carbono, amoníaco y agua. El resultado de este proceso es causado por reacciones de hidrólisis, fotólisis y también por procesos de degradación metabólica mediada por microorganismos, los cuales utilizan los plaguicidas como fuente de carbono. Según el tipo de plaguicida del que se trate, su presencia en el suelo puede generar una selección o inducción de microorganismos que pueden descomponer más rápidamente el producto. Los diversos factores ambientales como temperatura, pH, aireación y contenido de materia orgánica del suelo influyen en la descomposición (Madigan et al., 2004). La desaparición de un plaguicida de un ecosistema no significa necesariamente que haya sido degradado por microorganismos, ya que su pérdida puede deberse también a volatilización, lixiviación o rotura química espontánea.

2.7.1 Presencia de organismos con potencial de degradación El contaminante orgánico se degradará apreciablemente siempre y cuando posea enzimas que catalicen las conversiones a un producto que pueda ser canalizado hacia una vía metabólicamente existente (Álvarez y Guevara, 2003). Esto quiere decir que mientras más se asemejen la estructura del contaminante a degradar y los constituyentes de los organismos vivos, habrá más probabilidades de que el contaminante sea reconocido como sustrato.

2.7.2 Presencia de cepas degradadoras específicas en la zona contaminada

Durante largos períodos geológicos, muchos organismos han estado en contacto con los hidrocarburos, por ende no es sorprendente que muchas bacterias tengan la habilidad de utilizar los hidrocarburos como fuente de alimentación. Por otro lado, xenobióticos contaminantes relativamente nuevos tienden a ser persistentes en el ambiente, ya que los microorganismos capaces de reconocerlos como sustratos escasean en la naturaleza. Debido a este inconveniente, la bioaumentación se ha introducido dentro de los procesos de biorremediación, al introducir una cepa especializada, pura o mixta, para degradar contaminantes recalcitrantes, al aumentar la capacidad de degradación de la población autóctona (Álvarez y Guevara, 2003). Cabe destacar

que el principal factor limitante es la supervivencia de las bacterias adicionadas y la adecuada distribución sobre la zona contaminada (Walter, 1999).

2.7.3 Inducción de enzimas degradadoras apropiadas Además de incluir enzimas que participan en las vías de metabolismo central (enzimas constitutivas) que se encuentran siempre presentes a algún nivel; se deberán incluir enzimas inducibles mediante la alteración de las condiciones ambientales existentes (Álvarez y Guevara), dando inicio al efecto dominó de reacciones bioquímicas, resultando en la trascripción de genes que codifican la síntesis de las enzimas degradadoras necesarias. Por lo general, las enzimas catabólicas requieren que el sustrato que las induce esté en concentraciones más altas que el nivel específico para cada cepa (Linkfield et al., 1989)

2.7.4 Disponibilidad apropiada de donantes y aceptores de electrones

La respiración microbiana no es más que la energía que requieren para desarrollar sus funciones vitales, mediante una secuencia compleja de reacciones oxidación y reducción. Mediante la respiración, los electrones son transferidos desde un donante a un aceptor a través de un transportador biológico de electrones, produciendo energía química, la cual es almacenada en moléculas de trifosfato de adenosina (ATP). Por ende la oxidación se refiere a la remoción de electrones de un átomo o una molécula y la reducción es el proceso inverso (adición de electrones). El tipo de aceptor de electrones utilizado establece el tipo del metabolismo, determinando las reacciones específicas que pueden o no ocurrir. El metabolismo aeróbico es el régimen aceptor de electrones más favorecido energéticamente (potencial Reducción-Oxidación, Redox) que usan los microorganismos para oxidar los compuestos orgánicos. Debido a este factor, se prefiere utilizar oxígeno en lugar de aceptores anaeróbicos El inconveniente de utilizar reacciones aerobias es la tendencia a agotar el oxígeno disuelto disponible, creando condiciones anaerobias (Álvarez y Guevara, 2003). En la Ecuación 2.7 (Álvarez y Guevara, 2003), se observa cómo la degradación microbiana agotaría en secuencia el oxígeno, luego el nitrato, manganeso, hierro férrico y sulfato, para después dar inicio a la metanogénesis.

O2 > NO3

- > Mn4+ > Fe3+ > SO42- > HCO3

-

(2.7)

La transformación de DDT a DDE puede ser mediada por las arcillas, con reducciones de hasta 10% en 10 días. Estudios a nivel de laboratorio utilizando

columnas de bentonita ácida, vermiculita sódica, bentonita sódica, entre otras, han mostrado esta tendencia. Sin embargo, aún no se han valorado estos efectos in situ.

2.7.5 Disponibilidad de nutrientes Con el fin de obtener una degradación óptima, es necesario asegurarse que los microorganismos posean los macronutrientes necesarios, por ejemplo: nitrógeno para la síntesis de aminoácidos y enzimas; fósforo para ATP; azufre para algunas coenzimas; calcio para estabilizar las paredes celulares; y magnesio para estabilizar ribosomas (Álvarez y Guevara, 2003). La presencia de agua, en una proporción de al menos el 7% (sobre la base del peso), es requerida para la biodegradación, obteniendo resultados óptimos si la relación de agua/tierra alcanza el 14% (English y Loehr, 1991).

2.7.6 Compuestos inorgánicos

Es necesario considerar la forma química de un compuesto inorgánico para catalogarlo como un nutriente o inhibidor químico (Atlas y Bartha, 2002). Entre los principales compuestos inorgánicos se encuentran gases como el oxígeno, dióxido y monóxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno, óxido nitroso y sulfuro de hidrógeno. Según Atlas y Bartha (2002), también es necesario incluir en un estudio de biodegradación el azufre elemental, los cationes de amonio, hierro ferroso, hierro férrico, magnesio, calcio, sodio, potasio, cobalto, cobre, manganeso, vanadio, níquel, zinc, mercurio, cadmio y plomo; y los aniones fosfato, carbono, bicarbonato, borato, sulfuro, sulfato, nitrito, cloruro, clorato, bromuro, fluoruro, silicato, selenito, molibdato y arseniato. Seubert (1960) desarrolló un medio basado en sales minerales, con el cual se han desarrollado experimentos de biorremediación y de aislamiento de microorganismos que ha demostrado, en estudios recientes (Carrillo et al., 2004; Kamanavalli y Ninnekar, 2004), ser un medio capaz de tolerar compuestos tóxicos como plaguicidas organoclorados. El cloruro de aluminio (AlCl3), óxido de titanio (III) (TiO2), óxido de zinc (ZnO), sulfuro de cadmio (CdS), óxido de wolframio (WO3) y óxido de titanio (III) (TiO3) platinizado han reportado la mineralización de DDT en lodos aireados sujetos a luz solar artificial (Atlas y Bartha, 2002). No se han hecho estudios de esta disminución en aplicaciones in situ. Metales con bajos contenidos de Al, Ba, Cd, Co, Cr, Fe y K presentarán un mayor ratio de transformación de DDT a DDE. La transformación del DDT a DDE se ha reportado por efectos de catálisis proferidos por el Fe (III), pero bajo condiciones de aireación y humedad elevadas. La reducción de DDT a DDD tiene correlación con el potencial Redox del suelo, con un creciente potencial reductor afectando esta reducción. La formación del Fe+3 muestra correlación con la transformación, conllevando a que el DDT sufra

una reacción Redox irreversible bajo condiciones anaeróbicas, a través de un mecanismo de radicales libres con Fe+2 como donante de electrones. En la presencia de sustratos oxidables, el Fe+3 es de nuevo reducido a Fe+2. Las hierro porfirinas reducen también efectivamente el DDT a DDD, mas no afectan la transformación del DDE, que persiste. Dióxido y monóxido de carbono: Éste puede encontrarse en disolución como dióxido de carbono, carbonato o bicarbonato, siendo necesario tanto para el metabolismo autotrófico como el heterotrófico. A pH 7, el 20% del total de CO2 se halla en forma disuelta, mientras que el resto se encuentra principalmente en forma de bicarbonato. El consumo de CO2 suele servir como un medidor de la productividad primaria, mientras que su generación representa la mineralización de la materia orgánica. El CO es un potente inhibidor de las vías de respiración microbiana, al unirse con proteínas que contienen hierro y a moléculas como los citocromos (Atlas y Bartha, 2002). Nitrógeno: La generación de proteínas es la principal importancia, a nivel microbiológico, del nitrógeno. Los principales nutrientes inorgánicos que contiene el nitrógeno son amonio, nitrato y nitrito (Atlas y Bartha, 2002). Las bacterias nitrificantes permiten la entrada de los electrones de los compuestos nitrogenados a una cadena de transporte de electrones, donde el flujo de electrones establece un potencial de membrana y una fuerza protón motriz produciendo ATP (Madigan et al., 2004). Fósforo: El fósforo es necesario para la formación de ATP, síntesis de fosfolípidos de la membrana y de ácidos nucleicos, sin embargo, las concentraciones elevadas de fosfato pueden ser tóxicas (Atlas y Bartha, 2002). Se ha observado (Biodyne, s.n.f.a; Atlas, 1977; Atlas y Bartha 1972) que al agregar nitrógeno y fósforo de manera controlada, se intensifica la descomposición de compuestos orgánicos contaminantes. Azufre: El azufre es utilizado por los microorganismos para la formación de proteínas y de otros componentes moleculares. También existen formas tóxicas para muchos microorganismos como son el sulfuro de hidrógeno y dióxido de azufre. Sin embargo, algunas bacterias fotoautótrofas utilizan el sulfuro de hidrógeno como donador de electrones, además de ser producido como producto del metabolismo de las proteínas (Atlas y Bartha, 2002). Biodisponibilidad: Es un factor que controla el ataque microbiano de los compuestos xenobióticos. Muchos de ellos son bastante hidrofóbicos y, por tanto, no muy solubles en agua. La adsorción de esos compuestos xenobióticos a la materia orgánica y a la arcilla de suelos y sedimentos impide que los microorganismos accedan a ellos. La adición de tensoactivos o emulsionantes suele aumentar la biodisponibilidad, y por ende la biodegradación de compuestos xenobióticos (Madigan et al., 2004)

2.7.7 pH adecuado y capacidad buffer Los microorganismos se desarrollan adecuadamente entre un pH alrededor del neutro (6-8) (Tabla 2.5), debido al hecho que las enzimas (al ser aminoácidos) requieren un grado de protonación para controlar su actividad, donde está a su vez es controlada por el pH (Álvarez y Guevara, 2003). Es por esta razón que muchos microorganismos no son capaces de tolerar valores extremos de pH, debido a que algunos compuestos naturales tienden a hidrolizarse o se desnaturalizan algunas enzimas (Atlas y Bartha, 2002).

Tabla 2.5. Valores mínimo, óptimo y máximo de pH en la multiplicación de diversas bacterias.

pH Organismo Mínimo Óptimo Máximo

Escherichia coli 4,40 6,00-7,00 9,00 Proteus vulgaris 4,40 6,00-7,00 8,40 Enterobacter aerogenes 4,40 6,00-7,00 9,00 Pseudomonas sp. aeruginosa 5,60 6,60-7,00 8,00 Erwinia carotovora 5,60 7,10 9,30 Chlostridiun sporogenes 5,50-5,80 6,00-7,60 8,50-9,00 Nitrosomonas sp. 7,00-7,60 8,00-8,80 9,40 Nitrobacter sp. 6,60 7,60-8,60 10,00 Thiobacillus thiooxidans 1,00 2,00-2,80 6,00 Lactobacillus acidophilus 4,00 4,60-5,80 6,80 Bacillus acidocaldarius 2,00 3,50 6,00 Thermoplasma acidophilus 1,00 1,50 4,00 Sulfolobus acidocaldarius 1,00 2,50 4,00 Bacillus alcalophilus 8,50 9,50 11,50

Fuente: Atlas y Bartha, 2002.

Hay pocos reportes del papel del pH en la degradación del DDT en los suelos. Condiciones altamente básicas favorecen la transformación de DDT a DDE. Si bien ha sido reportado ampliamente que los suelos ácidos favorecen la degradación de DDT no hay evidencias que permitan sostener estas aseveraciones. Por ejemplo, Atlas y Bartha (2002) afirman que el pH determina en parte la solubilidad del CO2, afectando la velocidad de fotosíntesis, la disponibilidad de nutrientes (amonio y fósforo), limitando el crecimiento microbiano; así como la movilidad de metales pesados (cobre), que pueden ser tóxicos para los microorganismos.

2.7.8 Temperatura adecuada La temperatura es uno de los factores más importantes en la actividad microbiana o su metabolismo. El metabolismo suele acelerarse con el aumento de temperatura hasta alcanzar un valor óptimo, donde el crecimiento es óptimo (Álvarez y Guevara, 2003). Según Chapelle (2001), la mayoría de las bacterias

presentes en ambientes subsuperficiales se desarrollan óptimamente entre 20,00 y 40,00 oC, mientras que a temperaturas muy bajas, Richmond (2001) agrega que la biodegradación no es representativa en climas subárticos. A temperaturas mayores a 108,50 ºC el DDT es descompuesto a DDE; temperaturas mayores implicarán niveles de reacción cada vez mayores. Por esta razón, los niveles de DDT son menores en suelos tropicales que en suelos fríos, aún para aplicaciones antiguas.

2.7.9 Sustancias tóxicas o inhibidoras La actividad microbiana puede ser inhibida por algunos contaminantes que se encuentren en concentraciones demasiado altas. Dentro de los principales inhibidores se encuentran los metales pesados como Pb, Hg, Cd y Cr, donde algunos son requeridos a nivel de trazas por los microorganismos. Estos llegan a ser tóxicos a niveles mucho mayores a 1,00 mg/L (Álvarez y Guevara, 2003). A estas concentraciones, es posible que se active el mecanismo general de toxicidad de los metales pesados, al unirse con los grupos sulfihidrilo (-SH) de proteínas o con las enzimas microbianas esenciales (Atlas y Bartha, 2002). 2.7.10 Clima El clima es un factor importante en incidir en la persistencia del DDT. Las vidas medias son generalmente más cortas en zonas cálidas que en zonas templadas, presumiblemente debido a la dependencia a la temperatura de muchos procesos químicos, físicos y bióticos. Estos procesos también se ven influidos por los niveles de humedad, y los suelos inundados han mostrado una disminución en la persistencia del DDT (Farmer et al., 1974). 2.7.11 Materia orgánica El contenido de materia orgánica ha probado afectar la toxicidad del plaguicida, enlaces y persistencia desde hace décadas (Lichtenstein et al., 1971). La fracción húmica del suelo proviene del metabolismo de la materia orgánica en el suelo. Se divide en: ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y la fracción insoluble de humus. La importancia de la presencia de estos ácidos radica en el hecho de que el DDT puede unirse químicamente a estos sin modificar considerablemente su estructura y a través de las variaciones de pH que favorezcan la solubilización de estos ácidos el DDT puede verse conjuntamente solubilizado con ellos. Entre

ambos, el DDT presenta mayor afinidad por los ácidos húmicos. No se ha reportado interacción química con la fracción insoluble del humus. (Lichtenstein et al., 1971). Las interacciones del DDT con arcillas dependen de las uniones de este contaminante con las superficies internas de los minerales. Si bien es cierto que estas interacciones son reversibles por corresponder con fenómenos de adsorción, es más fácil remover DDT de suelos con aplicaciones más antiguas que de aplicaciones más frescas. (Lichtenstein et al., 1971). Durante las formaciones y transformaciones del material húmico, el DDT puede ser incorporado en estructuras poliméricas haciéndolo menos biodisponible. Estas uniones se dan mayoritariamente por medio de enlaces covalentes. La unión del DDT a materia orgánica también se puede ver complicada por la incidencia de la luz. La biodisponibilidad se verá incrementada en suelos inundados como resultado del arrastre del DDT unido a la fracción orgánica transformada. Esto se ve sostenido por resultados que han arrojado numerosos bioensayos, en los cuales el incremento en la LD50 demuestra una mayor biodisponibilidad de DDT para ser incorporado en organismos para casos de suelos inundados. La unión del DDT en suelos secos es debida principalmente a las arcillas y, por tanto, su biodisponibilidad será menor, impidiendo que éste penetre en los organismos con efectividad. Bajo condiciones de inundación de suelos, la materia orgánica acelera el consumo de oxígeno por la flora del suelo y provee un potencial reductor para la conversión de DDT a DDD. El papel de la materia orgánica es el de enlazarse al DDT y solubilizarlo.

2.8 Aplicaciones microbiológicas en la biodegradación de DDT

2.8.1 Biodegradación de xenobióticos

Los compuestos químicos que no existen de manera natural son llamados compuestos xenobióticos (Madigan et al., 2004). Dentro de los diferentes tipos de xenobióticos podemos encontrar los bifenilos policlorados (PCBs), municiones, tintes, disolventes clorados y plaguicidas. Debido a que muchos xenobióticos están ligados estructuralmente a compuestos naturales, existen enzimas en la naturaleza que pueden degradar los compuestos lentamente. Aún así, existen casos extremos en que la estructura difiere tanto a cualquier compuesto natural que la velocidad de degradación es extremadamente baja. Actualmente, se han encontrado microorganismos capaces de degradar compuestos xenobióticos como los plaguicidas, que según varios autores (Suresh et al., 2005; Kamanavalli y

Ninnekar, 2004; Hay y Focht, 1998; Francis, 1998; Nadeau et al., 1994; Higgblom, 1992; Patil et al., 1970.) poseen un potencial de degradación microbiana. El DDT es un plaguicida con menor número de átomos de cloro en su molécula que puede sufrir ciertas transformaciones bioquímicas, pero su esqueleto carbonado básico permanece en la naturaleza durante un tiempo excesivamente largo. Algunos microorganismos pueden atacar el DDT, como el hongo de la podredumbre blanca Phanerochaete chrysosporium (Aislabie, 1997; Bumpus y Aust, 1987).

2.8.2 Degradación de plaguicidas La estructura de los plaguicidas es muy diversa, encontrándose compuestos clorados, anillos aromáticos, moléculas con fósforo y nitrógeno, etc. (Figura 2.2); donde algunas de estas sustancias sirven como fuente de carbono y donadores de electrones para algunos microorganismos del suelo, mientras que otras no (Madigan et al., 2004).

Figura 2.2. Algunos compuestos xenobióticos que eeeeeeeeeeepueden ser degradados por eeeeeeeeeeemicroorganismos.

Fuente: Madigan et al, 2004.

Si el plaguicida puede ser atacado por los microorganismos, este tenderá a desaparecer del suelo, sin embargo, la degradabilidad puede variar entre compuestos estrechamente relacionados debido a su persistencia de diversos herbicidas e insecticidas (Madigan et al., 2004). La capacidad para metabolizar plaguicidas incluye diversos géneros, tanto de bacterias como hongos, donde los plaguicidas pueden ser su fuente de carbono y energía, siendo oxidados a CO2, o bien el plaguicida puede ser muy recalcitrante y

necesitará otro tipo de materia orgánica que puede servirle como fuente de materia orgánica primaria. A este último fenómeno se le conoce como cometabolismo o cooxidación (Madigan et al., 2004), no obstante, si la degradación es parcial el producto microbiano resultante puede ser en algunos casos más tóxico que el compuesto original. 2.8.2.1 Procesos anaeróbicos La respiración anaerobia también puede ser llamada decloración reductora, donde los compuestos organoclorados son utilizados como aceptores terminales de electrones, manteniendo las condiciones anóxicas. En la Ecuación 2.8 (Madigan et al., 2004) se observa un ejemplo de reducción anóxica de 3-Clorobenzoato por la bacteria Desulfomonile.

C7H4O2Cl- + 2 H

C7H5O2- + HCl

3-Clorobenzoato Benzoato (2.8)

Dentro de los géneros de bacterias reductoras encontramos a la Desulfomonile, que reduce el 3-Clorobenzoato a Benzoato y ácido clorhídrico; Dehalococcoides, reduce tri- y tetracloroetileno al gas etano (inocuo); Dehalobacterium convierte el compuesto tóxico diclorometano (CH2Cl2) en acetato más formiato (Tabla. 2.6). Tabla 2.6. Características de los principales géneros de bacterias que realizan decloración reductora

Género Propiedad Dehalobacter Desulfomonile Desulfitobacterium Dehalococcoides

Donadores de electrones

H2 H2 formiato, piruvato lactato y benzoato

H2, Formiato y piruvato lactato H2 y lactato

Aceptores de electrones

Tricloroetileno y tetracloroetileno

Metaclorobenzoatos, tetracloroetileno y SO3

2-, S2O3

2- y S0

Orto-, meta- o paraclorofenoles, NO3

-, fumarato, SO3

2-, S2O32-

y S0

Tricloroetileno y tetracloroetileno

Producto de la reducción de

tetracloroetileno Dicloroetileno Dicloroetileno Tricloroetileno Eteno

Otras propiedades*

Contiene citocromo b

Contiene citocromo c3; requiere fuente de carbono orgánico; puede crecer por fermentación de piruvato

Puede crecer también por fermentación

Carece de peptidoglicano

Filogenia

Relacionado con miembros Gram + de bajo GC del dominio Bacteria

Relacionado con el grupo delta de la proteobacterias

Relacionado con miembros Gram+ de bajo GC de dominio Bacteria

Linaje especial del dominio Bacteria

*Todos los organismos son anaerobios estrictos . Fuente: Madigan et al., 2004

Si bien es cierto que hay compuestos más importantes que el 3-Clorobenzoato, hay pruebas de decloración reductora de los compuestos dicloro-, tricloro- y tetracloro (percloro-) etileno, cloroformo, diclorometano, algunos bifenilos policlorados.

Debido a la importancia de las bacterias al convertir compuestos tóxicos hasta algunos que pueden carecer de toxicidad, la decloración reductora no es sólo una forma de metabolismo energético, sino un proceso de biorremediación ecológicamente significativa (Madigan et al., 2004), reduciendo algunos plaguicidas como el lindano (Holliger y Schraa, 2004), que bien puede desarrollarse vía un proceso simple o como cometabolismo donde los mircroorganismos no se benefician de las transformaciones metabólicas. Según Holliger y Schraa (2004), las fracciones de la membrana de las células de E. coil se reducen por declorinación el 1,1,l-tricloro-2,2-bis(p-clorofenil)etano (DDT) a 1,1-dichloro-2,2-bis(p-clorofenil) etanC (DDD) bajo condiciones anaerobias. Además, agregan que Psedumona putida también tiene la capacidad de declorinar la molécula de DDT. En la Tabla 2.7 (siguiente página) podemos observar otros compuestos halogenados que pueden ser degradados por bacterias (Desulfomonile tiedjeri y Stephylococcus epidermidis), tanto por metabolismos como por cometabolismos.

Tabla 2.7. Reacciones de dehalogeneración reductiva catalizada por cultivos puros de bacterias en un proceso metabólico o cometabolico.

Compuesto halogenado

Bacteria Producto Metabolismo (me)/ Cometabolismo (co)

2-CB Desulfomonile tiedjeri Benzoale me PCP Desulfomonile tiedjeri 2,4,6-TCPA co 1,2,4-TCB Stephylococcus epidermidis DCBs, MCB co

Fuente: Holliger y Schraa, 2004 2.8.2.2 Procesos aeróbicos

Los procesos aeróbicos, además de incluir O2 en su proceso, implican reacciones bioquímicas que incluyen las enzimas monoxigenasas y dioxigenasas. Las Pseudomonas sp. degradan aeróbicamente el plaguicida 2,4,5-T (Madigan et al., 2004) que después de la decloración de una enzima dioxigenasa rompe el anillo aromático generando compuestos que son metabolizadas por la vías metabólicas centrales. La degradación de anillos aromáticos (componentes comunes de algunos plaguicidas) siguen dos pasos críticos (Álvarez y Guevara, 2003): Primero, el anillo es dihidroxilado ya sea por las enzimas monoxigenasas o dioxigenasas, agregando un átomo de oxígeno o dos átomos de oxígeno según la enzima. El segundo paso, es la ruptura oxidativa del catecol resultante, el cual es catalizado por enzimas di-oxigenasas.

El anillo puede romperse en la posición orto (entre los dos grupos –OH) o más comúnmente en una posición meta (adyacente a uno de los grupos –OH), según es mostrado en la Figura 2.3.

Figura 2.3. Degradación microbiana de compuestos eeeeeeeeeearomáticos (Benceno) por vías orto y meta.

Fuente: Álvarez y Guevara, 2003.

En la vía de ruptura meta, actúan generalmente enzimas con una especificidad relativamente amplia y pueden cometabolizar otros compuestos. Mediante la vía orto, el resultado es un crecimiento mucho más rápido, ya que esos productos de anillos abiertos pueden ser alimentados con mayor facilidad mediante el Ciclo de Krebs (Figura 2.4, página siguiente).

Figura 2.4. Diversas vías de degradación aerobia del tolueno.

Fuente: Álvarez y Guevara, 2003.

2.8.3 Biodegradación de DDT En uno de los primeros estudios de biodegradación (Patil et al., 1970), se lograron identificar veinte cultivos microbianos que degradaron organoclorados (endrin, aldrín, DDT y una gama de isómeros de benzenohexaclorinado). En la actualidad se conocen algunas especies de Pseudomonas sp., bacilos, Enterobacter, y hongos que pueden ser utilizadas para estudios de biorremediación (Kamanavalli y Ninnekar, 2004; Aislabie, 1997; Bumpus y Aust, 1987). A continuación se describen las vías anaeróbicas y aeróbicas de degradación de DDT, así como la posible mineralización del mismo.

2.8.3.1 Biodegradación anaeróbica de DDT El DDT se transforma en DDD por medio de una declorinación reductiva en condiciones reductoras (Johnsen, 1976), siendo éste el mecanismo más usado por las bacterias y hongos para convertir los isómeros p´-DDT y el p,p´-DDT del DDT a DDD (Fries et al. 1969), reacción que se puede observar en la Figura 2.5 de la siguiente página.

Figura 2.5. Vía metabólica mircobiana por declorinación reductiva del DDT: DDT = 1,1,1-tricloro-eeeeeeeee2,2-bis(p-clorofenil)etano; DDD = l,l-dicloro-2,2-bis(p-clorofenil)etano; DDMU = l-cloro-eeeeeeeee2,2-bis(p-clorofenil)etileno; DDMS = 1 -cloro-2,2-bis(p-clorofenil)etano; DDNU = 2,2-eeeeeeeeebis(p-clorofenil)etileno; DDOH = 2,2-bis(p-clorofenil)etanol; DDA = ácido acético-bis(p-eeeeeeeeechlorofenil); DDM = bis(pclorofenil) metano; DBH=4,4'-diclorobezidrol; DBP = 4,4' eeeeeeeeediclorobenzofenol; and PCPA = ácido acético-p-clorofenil.

Fuente: Wedemeyer, 1967; Langlois et al., 1970; y Pfaender y Alexander, 1972. Esta vía anaeróbica, es efectuada por cultivos mixtos, al declorar el grupo etano a DDD, o bien por dehalogenación de DDE. El inconveniente con el DDE es que se transforma en el intermediario final (no se registró posterior degradación), el cual es un potente receptor de andrógenos (Kelce et al., 1995); por otro lado, el DDD es secuencialmente degradado por declorinación reductiva y la hidroxilación del grupo etano, formando diclobenzofenol. El proceso requiere de la presencia de una fuente de carbón alternativa, donde el proceso se vuelve cometabolico. Dentro de las especies de bacterias capaces de convertir DDT a DDD podemos mencionar Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas sp. aeruginosa, Pseudomonas sp. putida, Bacillus sp., “Hydrogenomonas“; y por los hongos Saccharomyces cerevisiae, Phanerochaete chrysosporium, y Trichoderma viridae (Lai y Saxena, 1982; Johnsen, 1976) El DDD puede seguir metabolizándose bajo condiciones anaeróbias por cultivos puros de E. Coli y E. Aerogenes hasta DBP (Figura 2.5.), donde hasta la fecha no se ha encontrado un microorganismo que sea capaz de metabolizarlo por esta vía (Aislabie et al., 1997).

2.8.3.2 Biodegradación aeróbica de DDT En 1981, Golovleva y Skryabin, observaron que la cepa bacteriana aislada de suelos contaminados con DDT, Pseudomona aeruginosa 640x, degradaba el DDT a compuestos fenilacéticos, fenílpropionicos y ácido salicílico. Recientemente se ha demostrado la degradación de DDT mediante cepas de Pseudomonas sp. (Kamanavalli y Ninnekar, 2004). La vía metabólica se efectúa a través de la posición meta (2,3-dihidroxi-DDT), donde la enzima bifenil-2-3-dioxigenasa degrada el DDT (por doble hidroxilación) hasta el metabolito estable, ácido 4-clorobenzoico.

Figura 2.6. Vía de degradación propuesta para la degradación de DDT por Pseudomonas sp

Fuente: Kamanavalli y Ninnekar, 2004. La aparición de un producto amarillo en el supernadante del cultivo de Pseudomona sp. sugiere el rompimiento del anillo en meta. Según Nadeau et al. (1994) el producto amarillo (hoy conocido como catecol) surgía por las siguientes vías. En la vía aeróbica, posteriormente descrita con más exactitud por Kamanavalli y Ninnekar (2004), el DDT es inicialmente oxidado en la posición orto y meta por las dioxigenasas (Fulthorpe et al., 1996), formando el intermediario 2,3-dihidroxiol-DDT (dos grupos hydroxil) al romperse el anillo aromático. Al ser este intermediario inestable, es fácilmente dehidratado a dos compuestos hidroxilados. Siguiendo el mismo patrón que los hidrocarburos aromáticos y los PCBs, el dihidriol-DDT será degradado a 2,3-dihidroxi-DDT por una dihidrogenasa (Nadeau et al., 1994). Como se observa en la Figura 2.6. propuesto por Kamanavalli y Ninnekar (2004), el 2,3-dihidroxi-DDT será metabolizado por el rompimiento del anillo en meta (Fulthorpe et al., 1996), formando catecol (producto amarillo), degradándose hasta el intermediario más estable, ácido 4-clorobenzoico (4-CB). Sólo se ha detectado que el plásmido pSS50 posee un único fragmento (10kb) que tiene la habilidad de declorar el 4-CB a 4-hidroxibenzoato (Layton et al., 1992), pero aún no se ha demostrado la total mineralización de DDT en condiciones aeróbicas.

2.8.3.3 Mineralización de DDT Los hongos ligninolíticos han demostrado tener la capacidad de biodegradar varios compuestos ambientales persistentes, incluyendo DDT. Esta capacidad de degradar DDT es atribuida a su capacidad de degradar lignina (Barr y Aust, 1994), ya que al agregar el DDT en un medio con lignina, la mineralización inició inmediatamente. Se han estudiado las especies Phanerochaete chrysosporium , Gleophyllum trabeum (Bumpus y Aust, 1987) y Phanerochaete cordylines (Walter, 1992). En la siguiente figura se puede observar la vía metabólica propuesta por Bumpus y Aust (1987) para la mineralización de DDT por P. chrysosporium , donde podemos observar que se forma dicofol o DDD, para luego transformarse a DBP (o DDE a DBP). Antes de la mineralización es necesario que se rompan los anillos, donde una fracción se transformará en CO2.

Figura 2.7. Vía metabólica propuesta para la mineralización de DDT por P. chrysosporium.

Fuente: Bumpus y Aust, 1987

Como se observa en la Figura 2.7, P. chrysosporium logró mineralizar un 10% del DDT en un período de 30 días, mientras que G. trabeum, no mineralizó DDT en cantidades apreciables (Bumpus y Aust, 1987). P. cordylines transformó entre un 80 – 90% de DDT (Walter, 1992).

2.8.4 Biodegradación Mejorada

Es muy raro que en el ambiente, una sola cepa singular degrade completamente un contaminante, siendo más común y exitosa una degradación que implique una red de consorcios y actividades microbianas en presencia de una gran variedad microbiana (Álvarez y Guevara, 2003). Por ejemplo, al utilizar tanto bacterias como hongos, se puede iniciar y continuar la degradación, ya que unos microorganismos se encargarán de iniciar la degradación, o bien tener un rango más amplio, ya sea desde concentraciones muy bajas (desde 10,00 pg/mL), donde algunos bacilos pueden degradar DDT (Katayama et al., 1993), o bien con rangos de pH variables (hongos). Otras especies de Rhizobium (fijadoras de Nitrógeno (N2) atmosférico) han sido usadas para la degradación de DDT (Jackson et al., 1992) siempre y cuando encuentren N disponible (Fertilizantes). Existen otros factores que pueden ayudar a la población microbiana como la adición de una fuente de carbono, la inundación de los suelos y la utilización de un surfactante (Aislabie et al., 1997) La primera consiste en adicionar una fuente de energía al agregar compuestos orgánicos, reduciendo la persistencia de DDT. Al inundar los suelos, se incrementan el enlace entre el suelo y el DDT, reduciendo su actividad y aumentando el porcentaje de detoxificación. Si los suelos contaminados con DDT son periódicamente regados, también se puede observar una reducción en su concentración (Boul et al., 1994). Al usar surfactantes, se incrementa la solubilidad del DDT en agua, además de desorber el DDT de la materia orgánica y de partículas arcillosas (Parfitt et al., 1995). A continuación se presentan las interacciones microbianas descritas por Álvarez y Guevara (2003):

2.8.4.1 Comensalismo Es una interacción unidireccional en la cual una población microbiana se beneficia de los desechos de otra población. Como ejemplo se puede mencionar la degradación del ciclohexano por Mycobacterium vaccae, la cual al degradar el ciclohexano a ciclohexanol (por medio de la enzima propano mono-oxigenasa), la Pseudomonas sp. es capaz de mineralizar el ciclohexanol (Beam y Perry, 1974). Otro ejemplo es la biodegradación secuencial anaerobia/aerobia de compuestos policlorados y en la cual es factible, bajo condiciones anaerobias, degradar vía decloración reductiva siempre y cuando se encuentren presentes donantes de electrones. Esta degradación produce sub-productos mono- y declorados que no son factibles energéticamente bajo condiciones anaerobias; pero que, bajo condiciones aerobias, son fácilmente oxidados.

Tomando en cuenta que los PCBs son altamente clorados, por ende recalcitrantes, la biorremediación por comensalismos anaerobios/aerobios es factible (Figura 2.8). Bajo condiciones anaerobia es posible reducir los PCBs a mono- a tetra-clorados, que luego serán cometabolizados por enzimas aerobias (oxigenasas), siguiendo por una ruptura de los anillos por intermediarios mono-aromáticos, para luego ser mineralizados por otros organismos aerobios.

Figura 2.8. Degradación secuencial anaerobia/aerobia de PCBs altamente clorados.

Fuente: Álvarez y Guevara, 2003.

Al ser los PCBs (bifenilos policlorados) y el DDT (1,1,1-tricloro.2,2-bis-4-clorofenil-etano) estructuras químicas y propiedades físicas muy similares (baja solubilidad y un alto coeficiente de partición en lípidos), las vías metabólicas y consorcios de microorganismos para su degradación pueden ser muy similares (Nadeau et al., 1994).

2.8.4.2 Sintrofismo A diferencia del comensalismo, el sintrofismo es una interacción benéfica mutua, que suministran entre si requerimientos nutricionales y factores de crecimiento, pero no es obligatoria para la otra población. En la Figura 2.9. (página siguiente) se observa un ejemplo de sintrofismo para degradar clorobenzoato; entre tres microorganismos (Desulfomonile tiedjei, BZ-2 y Methanospirillum ), donde un microorganismo dehalorrespirador (capta la energía liberada de la reacción de decloración) Desulfomonile tiedjei declora a benzoato, usando CO2 como fuente de carbono, H2 como donante de electrones y clorobenzoato como aceptor de electrones. Luego BZ-2 fermenta benzoato produciendo Acetato, CO2 y H2. De esta forma, Desulfomonile tiedjej se beneficia de la producción de H2 y CO2 de BZ-2. El problema surge al acumularse H2 (ya que su producción es superior a su consumo) que inhibe la fermentación de benzoato, problema que es eliminado por Methanospirillium, al alimentarse de H2 y evitar su posible acumulación.

Figura 2.9. Consorcio de microorganismos: una red microbiana para la

degradación de compuestos aromáticos clorados. Fuente: Tiedje y Stevens, 1988.

2.8.4.3 Transferencia interespecífica de hidrógeno

Se observa principalmente bajo condiciones anaerobias, donde las poblaciones microbianas se ven en la obligación de colaborar entre sí, donde los compuestos orgánicos son degradados a productos no tóxicos como acetato, CO2, CH4 y H2

(White, 1995). Si bien la degradación aeróbica de xenobióticos orgánicos clorados tiene una gran importancia, la decloración reductora presenta un interés ambiental especial a causa de la rapidez con que en la naturaleza los hábitat microbianos contaminados se hacen anóxicos (Madigan et al., 2004).

2.8.5 Biorremediación de DDT in situ

La completa biodegradación o mineralización de una molécula orgánica en aguas subterráneas o suelos, es normalmente realizada por la actividad microbiana. Muy pocas veces los mecanismos abióticos logran degradar completamente un producto orgánico a compuestos inorgánicos más sencillos. Sin importar que el plaguicida sufra absorción, adsorción, se encuentre activado o inactivado, estacionario o movible, los residuos que son productos de estas transformaciones abióticas serán finalmente degradados por microorganismos autóctonos. Se ha observado que bajo condiciones aerobias, el DDT se transforma a DDE por dehidroclorinación, mientras que en condiciones anóxicas, el DDT se transforma a DDD por declorinación reductiva. La tasa de mineralización de DDT en suelo es muy baja (3.1% en 42%), las cuales ocurren tanto en condiciones anaerobias y aerobias, reflejando la complejidad de la degradación de DDT in situ (Aislabie et al., 1997).

A pesar de tener una base científica de la biodegradación de DDT, esta solo ha sido enfocada en resultados de laboratorio, los cuales en campo pueden variar. Según Gray et al. (1999), la compañía Stauffer Management Company (SMC) logró remediar suelos contaminados por DDT al utilizar microflora autóctona que había sido asociada con suelos contaminados por DDT y sus metabolitos DDD y DDE (o familia DDX), así como otros contaminantes como toxafeno y clordano. Ensayos en laboratorio (Gray et al., 1999) demostraron que la degradación de DDT es factible cuando se mantienen ciertos parámetros ambientales, entre ellos: micro y macronutrientes, potencial Redox, aireación, ciclos anaerobios/aerobios, temperatura, humedad, pH y la adición de surfactantes. Lograron identificar tres diferentes tipos de tecnologías con diferentes modos de aplicación: tratamiento de suelos aerobio/anaeribio, biopilas y compostaje aerobio/anaerobio mejorado. Las tres tecnologías lograron degradar DDT, aún a altas concentraciones (700 ppm), utilizando compostaje mejorado. El procedimiento utilizado incluía la excavación y mezcla de la tierra contaminada, para luego trasladar a celdas de compostaje dentro de un depósito para el mismo fin. Se dividió el tratamiento en intervalos aerobio y anaerobios, controlados por medio de mezcla mecánica y complementos orgánicos. Cada ciclo o intervalo comprendía unas 6 semanas, donde 4 semanas se establecía bajo condiciones anaerobias y 2 semanas bajo condiciones aerobias. Se observaron degradaciones con un porcentaje de alrededor de 70% tanto para DDT como para sus metabolitos, donde el microcosmos 7312 degradó el 72.67% de DDT, y el microcosmos 7140 logró degradar un 68.94%.

Tabla 2.8. Resultados del estudio in situ de los microcosmos durante 6 semanas Microcosmo 7312 Microcosmos 7140 Plaguicida

Semana 0 (ppm) Semana 6 (ppm) Semana 0 (ppm) Semana 6 (ppm) DDD 125,5 34,3 126,2 39,2 DDE 0,8 0,5 8,5 2,7 DDT 134,5 - 128,5 45,1

Fuente: Gray et al., 1999.

Debido al auge que han adquirido los microorganismos en la remediación de suelos contaminados, empresas han comercializado cepas microbianas especializadas en la degradación de xenobióticos, como es el caso de Biodyne®, empresa que ha aislado cepas de bacterias y hongos con el fin de degradar hidrocarburos (Environoc 101®), pesticidas (Environoc 201®), aguas negras (Environoc 301®), así como la producción de compost (Environoc 501®) (Biodyne, 2008a). Según Biodyne (2008b) Environoc 201® son capaces de degradar isoprenoides, terpenos lineales y cíclicos, hidrocarburos clorinados, fenoles y compuestos similares, así como una variedad de pesticidas y herbicidas. Estas cepas pueden ser aplicadas in situ en suelos agrícolas que se pretenda reducir el exceso de residuos de pesticidas.

CAPÍTULO III DESCRIPCION DEL AREA DE ESTUDIO

El capítulo presenta el área de estudio, así como las fincas muestreadas, pertenecientes a la Zona Sur “Los Millonarios”, Municipio de El Viejo, Departamento de Chinandega. Se describe la textura, uso actual, uso histórico y agroquímicos utilizados en el pasado, de las siguientes fincas: El Bosque, El Trapiche, Santa Lucía, La Haya, El Hular, ENMA, Diano Marino, Dos Reyna y La Pita 2. 3.1 Ubicación Las Fincas objeto de estudio se ubican en un área de 7 175,26 ha., conocida como la Zona Sur Los Millonarios, pertenecientes al Ingenio Monte Rosa, en el Departamento de Chinandega, Municipio de El Viejo. 3.2 Aplicaciones históricas de plaguicidas El hecho que el DDT no salga reflejado en las fincas que históricamente se les ha aplicado DDT (algodoneras), se debe a que su aplicación fue prohibida en los años ochenta en Nicaragua, y para cuando se realizaron los análisis y se dedicaba su uso a otro tipo de cultivo, ya estaban aprobados diferentes plaguicidas que no presentaban persistencia, a diferencia del DDT. 3.3 Uso actual de plaguicidas En la actualidad los plaguicidas que se usan son: ametrina, terbutrina , diuron, glifosato, cletodim, 2,4-D, haloxifop-metil, fluazifop-butil, hexazinona metsulfuronmetil. A manera de insecticidas, se aplican en la actualidad: cipermetrina e imidacloprid, entre otros aditivos, como lo representan los adherentes, reguladores de pH, inhibidores y fertilizantes foliares.

A continuación se presentan las nueve fincas de estudio, así como una foto satelital de los límites y puntos de muestreo de las mismas (Figuras 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 y 3.9). Las coordenadas se adjuntan en el Anexo C. 3.4 Descripción de las fincas 3.4.1 Finca La Haya Presenta una extensión de 79,68 ha, que comprenden un suelo arcilloso y franco arcilloso. En ella se ha cultivado azúcar durante 20 años, aunque anteriormente también fueron utilizados para la producción pecuaria. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo:

Figura 3.1. Puntos muestreados en la Finca La Haya

Fuente: Digital Globe, 2008; Europa Technologies, 2007. 3.4.2 Finca Dos Reyna Comprende un área de 178,21 ha. Presenta un suelo de tipo franco arcilloso y su uso se ha dedicado al cultivo de caña de azúcar durante 15 años. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.2. Puntos muestreados en la Finca Dos Reyna

Fuente: Digital Globe, 2008; Europa Technologies, 2007.

3.4.3 Finca El Hular Presenta un área de 141,41 ha, cuyos suelos son de tipo franco arenoso. En ella se han cultivado caña en los últimos 3 años, siendo antes de ese tiempo utilizado para el cultivo de bananos. Durante esa época se utilizaron plaguicidas counter y diazinón. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.3. Puntos muestreados en la Finca El Hular

Fuente: Terra Metrics,, 2007 3.4.4 Finca El Bosque Presenta un área de 131,29 ha. El suelo es de tipo franco y durante 20 años se ha dedicado al cultivo de caña de azúcar. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.4. Puntos muestreados en la Finca El Bosque

Fuente: Digital Globe, 2008

3.4.5 Finca Diano Marino Tiene un área de 128,58 ha. El suelo es de tipo franco y su uso ha sido para el cultivo de caña durante los 7 últimos años. Antes de ello la tierra se dedicaba al cultivo de maní, para lo cual se utilizaban los plaguicidas carbendazim, braco 700 y daconil. Cuando se cultivó algodón se empleó cotován, prowl, vitavax y lopsban. Cuando se cultivó soya, se utilizaban bacterias como agente inoculante. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.5. Puntos muestreados en la Finca Diano Marino

Fuente: Digital Globe, 2008; Terra Metrics, 2007. 3.4.6 Finca Enma Comprende un área de 90,84 ha y el suelo es de tipo franco. El uso para cultivo de caña de azúcar se remonta hasta 4 años atrás. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.6. Puntos muestreados en la Finca Enma

Fuente: Digital Globe, 2008.

3.4.7 Finca La Pita 2 Presenta un área de 129,28 ha y comprende suelos tanto de tipo arcilloso como franco arcilloso. Se dedicó en el pasado a la producción pecuaria. El uso para el cultivo de caña de azúcar se remonta hasta hace 9 años, y anteriormente se había dedicado para sorgo y algodón. Para el primero se usaron plaguicidas como MTD y cipermetrina. Para el algodón se utilizó cotován, prowl, vitavax y lopsban. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.7. Puntos muestreados en la Finca La Pita 2

Fuente: Digital Globe, 2008; Europa Technologies, 2007. 3.4.8 Finca El Trapiche La finca más pequeña de todas es El Trapiche, la cual solamente comprende 6,98 hectáreas. Su suelo es del tipo franco y anteriormente se utilizó para el cultivo de arroz, por lo cual se utilizó prowl y cipermetrina en el pasado. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.8. Puntos muestreados en la Finca El Trapiche.

Fuente: Terra Metrics, 2007.

3.4.9 Finca Santa Lucía Presenta un área de 115,31 ha. El tipo de suelo es franco. El uso para caña de azúcar se ha remitido a 6 años, y anteriormente se utilizaba para la actividad pecuaria y el cultivo de algodón, para el cual se empleaban plaguicidas como cotován, prowl, vitavax y lopsban. En la siguiente figura se observan los puntos de muestreo.

Figura 3.9. Puntos muestreados en la Finca eeeeeeeeeSanta Lucía

Fuente: Europa Technologies, 2007.

CAPÍTULO IV DISEÑO METODOLÒGICO

En este capítulo se describe la metodología utilizada, haciendo hincapié en cada uno de los ensayos realizados, con el fin de determinar el potencial de biodegradación en la zona sur del Ingenio Monte Rosa. Se describe el muestreo, reactivos, variables, métodos y técnicas, instrumentos de recolección de datos y el procedimientos para el procesamiento y el análisis de información. 4.1 Tipo de Estudio Los estudios (Ensayo de biodegradación y Ensayo de búsqueda y aislamiento de microorganismos se enmarcan dentro de un tipo de investigación descriptiva (Piura, 1995). De esta forma, se evaluará el potencial de biodegradación de la Zona Sur del Ingenio Monte Rosa en el año 2007, a través de la descripción de las variables que condicionan la biodegradación de DDT en suelos, así como la microfauna existente e inducida que posee características degradadoras de DDT explotables. 4.2 Universo El universo de muestreo corresponderá a los suelos de las fincas de la Zona Sur Los Millonarios pertenecientes al Ingenio Monte Rosa, Chinandega. La Zona Sur cuenta con un área de 7,175.26 ha (Pantaleón, 2007). 4.3 Población La población corresponderá a los suelos de los estratos dentro de las fincas seleccionadas, los cuales están definidos por los transectos de la ruta de recorrido de muestreo (Mejías y Jerez, 2006).

4.4 Estrategia Con el fin de evaluar el potencial de biodegradación de la zona sur los millonarios, se dividió el estudio en dos ensayos: Ensayo de biodegradación y Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos. En el primer Ensayo de biodegradación se establecieron las condiciones idóneas para remediar los suelos del Ingenio Monte Rosa, al utilizar microorganismos comerciales, Environoc 201 (E201®), por un período de 100 días. Con esto se evaluó la posibilidad de implementar un proyecto de biorremediación dentro del Ingenio Monte Rosa. Por otra parte, se aislaron e identificaron microorganismos capaces de tolerar y biodegradar DDT, en medios con DDT como fuente de carbono. El DDT se aplicó con diversas concentraciones, con el fin de determinar a que concentraciones se observó mayor crecimiento de colonias. 4.5 Tipo de muestreo La población corresponde a los suelos de los estratos dentro de las fincas seleccionadas, los cuales están definidos por los transectos de la ruta de recorrido de muestreo (Mejías y Jerez, 2006). 4.5.1 Criterio de selección de puntos de muestreo Se seleccionaron los puntos de muestreo por finca, es decir, cada finca representa una muestra. Se seleccionaron las fincas que en algún momento fueron rociadas por DDT. Para ello se recurrió a la base de datos del Ingenio Monte Rosa, seleccionando fincas donde previamente se hayan realizado análisis de presencia y concentración de DDT, por cromatografía de gases por detección de captura de electrones (GC-ECD). Así mismo, se seleccionaron fincas con diversas concentraciones de DDT. 4.5.2 Criterio de frecuencia de muestreo Se utilizó la misma frecuencia de muestreo que utilizó el Ingenio Monte Rosa para el muestreo de análisis de organoclorados. Cada muestra en la finca contiene una serie de submuestras, tomadas cada 20 ha.

4.5.3 Sitios de Muestreo

Se seleccionaron las fincas: El Bosque, El Trapiche, Santa Lucía, La Haya, El Hular, ENMA, Diano Marino, Dos Reyna y La Pita 2 (Tabla 4.1). En el Capítulo III y en Anexos C, se muestra la localización de los sitios de muestreo, así como los puntos de muestreo debidamente georeferenciados.

Se realizó un segundo muestreo de la finca El Bosque, utilizando los mismos puntos georeferenciados, con la diferencia de que las muestras aumentaron en volumen, para un total de 3,00 m3 ó 0.43 m3 por submuestra. Esta muestra se utilizó en el Ensayo de biodegradación. En la siguientes tabla se presentan el área (ha), número de submuestras y la concentración de DDT (ppb) de las fincas muestreadas.

Tabla 4.1. Fincas muestreadas perteneciente a la Zona Sur “Los Millonarios”

Finca *DDT y

Metabolitos (ppb)

*Área (ha)

*Área Total Sur Los

Millonarios (ha) Á

rea

(%)

# Sub-Muestras

Cantidad (g)

Cantidad Total

(g)

El Bosque 906,90 131,39 1,83 7 100,00 700,00 El Trapiche 487,20 6,98 0,10 1 100,00 100,00

Santa Lucía Y La Haya 410,40 194,99 2,72 10 100,00 1000,00

El Hular 143,50 161,51 2,25 8 100,00 800,00 ENMA 116,00 55,90 0,78 3 100,00 300,00

Diano Marino 98,30 125,22 1,75 6 100,00 600,00

Dos Reyna 90,50 174,93 2,44 9 100,00 900,00

La Pita 2 60,00 122,82 1,71 6 100,00 600,00 Total 973,74

7175,26

13,57 50 *Fuente: Pantaleón, 2007.

4.5.4 Recolección, preservación e identificación de muestras A continuación se describe la metodología seguida para la recolección, preservación e identificación de muestras para el ensayo de biodegradación y el ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos. 4.5.4.1 Ensayo de biodegradación El muestreo de suelos realizado en la finca El Bosque, corresponde al Ensayo de biodegradación, en el cual se trazaron transectos a lo interno de cada finca (Mejías y Jerez, 2006), a lo largo de los cuales se fijaron puntos de muestreo donde se cavaron calicatas de 1m x 1,00 m x 0,30 m, a partir de las cuales se llenaron 8 sacos de suelo por cada una de ellas, siendo abiertas a 1 calicata por cada 20,00 ha. En total se muestrearon 7 puntos, obteniéndose 3,00 m3 de suelo como una muestra compuesta. Cada de los 7 puntos fue georeferenciado (ver Anexos C).

4.5.4.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos Las submuestras se recolectaron, según el procedimiento rutinario del Ingenio Monte Rosa, por medio de calicatas con dimensiones de 0,10 m x 0,10 m x 0,30 m. Cada muestra fue recolectada en bolsas plásticas (zip-lock) libres de contaminantes o sustancias que pudieran alterar el pH de la muestra; esto favoreció la preservación de la humedad de la muestra. Las bolsas se rotularon por muestra y submuestra, se anotó el pH y temperatura de la muestra in situ. Se anotaron las coordenadas, en el punto que se recolectaron, cada submuestra en una hoja de campo. No fue necesario ajustar el pH de las muestras, ya que se encontraron entre un pH de 5.0 – 9.0 (EPA, 1984). 4.6 Variables 4.6.1 Ensayo de biodegradación Temperatura de trabajo, Tw (ºC): La temperatura es un indicador de la actividad metabólica de los microorganismos. Por lo general, las temperaturas elevadas que no son letales para los microorganismos determinan mayores actividades metabólicas (Atlas y Bartha 2002). Para determinar la Tw , se midió la diferencia entre la temperatura del suelo (Ts) y la temperatura ambiente (Tamb). Porcentaje de humedad (%): El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para los microorganismos, el factor crítico es la disponibilidad de agua líquida (Atlas y Bartha 2002). Se entiende como porcentaje de humedad el cociente entre la masa de agua perdida por desecación y la masa total de la muestra, multiplicado por cien. pH: El pH de un medio afecta directamente a microorganismos y enzimas, influyendo también en la disociación y la solubilidad de muchas moléculas que, de manera indirecta, ejercen alguna influencia sobre los microorganismos (Atlas y Bartha 2002). Con el fin de mantener un pH estable, en el cual se pudieran desarrollar tantos las cepas comerciales, como las nativas del suelo, se midió el pH con el fin de mantenerlo entre 6 y 9 (Biodyne, s.n.f.a). Concentración de DDT (ppb): Es una medida de la cantidad de DDT en una muestra, calculada como la cantidad de ug de DDT por Kg de suelo (ug/Kg = ppb). Porcentaje de biodegradación de DDT (%): Es una medida de la biodegradación del DDT a lo largo de cierto intervalo de tiempo, determinado según convenga (100 días, en el presente caso), obtenida a partir del cociente del valor de disminución de concentración del DDT y la concentración inicial de DDT, multiplicado por 100 unidades.

Tiempo de vida media (t1/2): Es el lapso de tiempo en el cual el contaminante (DDT) se degrada a la mitad de su concentración. Tiempo de vida: Es el lapso de tiempo en el cual el contaminante se degrada completamente. En el presente estudio se entiende que el contaminante se degrada hasta una concentración igual o menor a 1 ppb. Disponibilidad de oxígeno (volteos por homogenización): Para asegurar una disponibilidad de oxígeno adecuada, se homogenizó semanalmente cada Lote de una a dos veces, según el clima, correspondiendo a dos para casos en los cuales el suelo se encontrara muy húmedo (saturado). Dosis microbiana (mL): Representa la aplicación de las cepas microbianas Environoc 201®, previamente cultivadas durante 24 horas en Environbrew, y que asegura una concentración microbiana consistente con la cantidad de tierra a ser tratada. Los protocolos de elaboración, conservación y seguridad de estos productos se encuentran en Anexos E y F. Unidades formadoras de colonias (UFC): Se midió con el fin de observar el crecimiento microbiano a través del tiempo. 4.6.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos pH: Se midió el pH con el fin de establecer las condiciones iniciales del crecimiento microbiano. Porcentaje de humedad (%): Se midió el % de humedad con el fin de establecer las condiciones iniciales del crecimiento microbiano. Concentración de DDT (ppb): Es una medida de la cantidad de DDT en una solución de fenol. Esta concentración se conocía de antemano, siendo esta de 100, 300, 600 y 1000 ppb. Unidades formadoras de colonias (UFC): Se midió con el fin de determinar la población microbiana inicial Unidades de colonias degradadoras (UCD): Es la cantidad de colonias que son tolerantes a cierta concentración de DDT.

4.7 Métodos y Técnicas de Análisis La investigación está dividida en dos grandes ensayos: Ensayo de biodegradación y ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos. A continuación se describe cada uno de ellos. 4.7.1 Ensayo de biodegradación Con el fin de determinar que aditivos (microorganismos, abonos, estiércol, bagazo, etc.) podrían aumentar la velocidad de degradación del DDT, y por ende el porcentaje de degradación, se dividió una muestra compuesta de 3 m3 suelo en 6 partes, cada una con un volumen de 0.5 m3.

4.7.1.1 Reactivos Se utilizaron los siguientes reactivos: Environoc 201®, Enrinonbrew®, materia orgánica (cachaza, estiércol bovino), aguas residuales, agua deionizada y destilada. 4.7.1.2 Análisis

A cada uno de los Lotes se les dio seguimiento por 100 días (del día 0 al 99), con el fin de determinar los factores que influyeron en la degradación de DDT. Para ello se determinó la concentración inicial de DDT, recuento de poblaciones microbianas, textura del suelo, humedad (%), temperatura, pH y concentración de micro y macroelementos. En la Tabla 5.2 (página siguiente) se adjuntan los días de muestreo para la concentración de DDT (GC-ECD) y UFC.

Tabla 4.2. Análisis de DDT y UFC por día, para el Ensayo de biodegradación

Análisis DDT UFC Día

Lote 0 45 70 99 0 10 50 99

Lote 1 (Testigo) 1 1 1 1 1 - 1 1 Lote 2 (Environoc 201®) - 1 1 1 - 1 1 1 Lote 3 (Environoc 201® + estiércol) - 1 1 1 - 1 1 1 Lote 4 (Environoc 201® + cachaza) - 1 1 1 - 1 1 1 Control 1 (Estiércol) - - - 1 - 1 1 1

Control 2 (Cachaza) - - - 1 - 1 1 1

4.7.1.2.1 Degradación de DDT Se determinó la concentración de DDT en el tiempo por medio de GC-ECD. Se utilizó un cromatógrafo Varian, modelo 3400, con el detector a una temperatura de 350 oC y el inyector a 220 oC. Este análisis se realizó en el Laboratorio Nacional de Residuos Orgánicos, del Ministerio Agropecuario y Forestal (MAGFOR). Los días de análisis se realizaron los días 45, 70 y 99, únicamente para los Lotes 2, 3 y 4. Se realizó una muestra inicial (día 0), y un análisis el día 99 para los controles 1 y 2, con el fin de determinar el posible efecto de dilución que pudo haber ocurrido. Debido al alto costo de cada análisis, se realizó una muestra compuesta. 4.7.1.3 Composición de cada uno de los lotes Lote 1 (Testigo): Se tomaron 0,50 m3 de suelo contaminado con DDT. No se adicionó ningún aditivo. Lote 2 (Environoc 201®): Se tomaron 0,50 m3 de suelo contaminado con DDT. Se aplicaron los cultivos microbianos comerciales Environoc 201®. Lote 3 (Estiércol + Environoc 201®): Se tomaron 0.5 m3 de suelo contaminado con DDT. Se aplicaron los cultivos microbianos comerciales Environoc 201®, además de 0.20 m3 de estiércol bovino. Lote 4 (Estiércol): Se tomaron 0.5 m3 de suelo contaminado con DDT más de 0.20 m3 de estiércol bovino. Control 1 (Cachaza + Agua Residual): se tomaron 0.5 m3 de suelo contaminado de con DDT, 0.10m3 de cachaza y 5 galones de agua residual. Control 2 (Cachaza + Agua Residual + Environoc 201®): se tomaron 0.5 m3 de suelo contaminado con DDT, 0.10m3 de cachaza y 5 galones de agua residual. Se aplicaron los cultivos microbianos comerciales Environoc 201®.

Con el fin de proteger los lotes y controles, estos se cubrieron individualmente con plástico negro, tanto debajo de la muestra como en su superficie. La cubierta individual de cada lote, favoreció a evitar una posible contaminación cruzada en caso de lixiviación. Los lotes y controles se cubrían con plástico después de las 5:00pm, en caso de lluvia o de fuertes vientos. Bajo condiciones normales, los lotes y controles permanecían destapados de 8:30am a 5:00pm.

4.7.1.4 Indicadores Los controles son indicadores que fueron útiles para determinar el posible estado de degradación de DDT sin necesidad de realizar los análisis de GC-ECD para organoclorados. Los indicadores utilizados en este ensayo fueron: Unidades formadoras de colonias (UFC): se midió el día 0, 10, 50 y 99. Temperatura ambiente (Tamb): se medió al menos 2 veces por semana. Temperatura del suelo (Tsuelo): se medió al menos 2 veces por semana. Corresponde a la temperatura interna del suelo. Temperatura de trabajo (Tw): Se midió al menos 2 veces por semana. Humedad (%): Se midió cada vez que se aplicó el inóculo microbiano. pH: Se midió cada vez que se aplicó el inóculo microbiano. 4.7.1.5 Requerimientos Mínimos Para que los microorganismos (Environoc 201®) contaran con un medio benéfico, necesitaron de los siguientes requerimientos mínimos. Oxígeno: Se mezcló el suelo al menos una vez por semana, con el fin de asegurar la oxigenación mínima del suelo (Biodyne, s.n.f.a). Humedad: La humedad del suelo se tuvo que mantenerse alrededor de un 22% y menor a un 40%. El suelo no estuvo que estar seco (polvo) ni tan húmedo que conllevara lixiviados (Biodyne, s.n.f.a). Macroelementos (Nutrientes): Se proporcionó al suelo una dosis mínima de nutrientes (Relación carbono, C y nitrógeno, N) con el fin de facilitar el crecimiento microbiano. En caso de que la relación C:N fuera mayor a 100:2 ó 50:1, no sería necesario aplicar fertilizante. (Biodyne, s.n.f.a). 4.7.1.6 Identificación de microorganismos Se identificaron microorganismos con el fin de observar la incidencia de los mismos en la degradación de DDT, de tal forma que se facilitara la identificación de las especies que aumentaron o disminuyeron a lo largo del tratamiento.

Se tomaron 10 g de la muestra (suelo), se mezclaron en un Erlenmeyer con 99 mL de solución salina (NaCl), agitándose por varios minutos. Se preparó una serie de diluciones a partir de la primera dilución 10-2 hasta obtener la dilución 10-6. Luego se sembró por triplicado en placas de Petri con medio nutritivo a partir de la dilución 10-5. Las placas fueron incubadas de forma invertida a 30oC, a partir de 24 horas se procedió al recuento de colonias, reportándose como Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/por gramo de suelo. En la presente investigación se entiende UFC como UFC/g. Este procedimiento fue realizado por el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA), utilizando protocolos propios de la UNA. 4.7.1.7 Resumen de la metodología En la Figura 4.1 se puede observar un resumen de la metodología utilizada en el Ensayo de biodegradación. Se observan los indicadores utilizados, el seguimiento y la composición de los lotes.

Figura 4.1. Resumen de la metodología utilizada para el Ensayo de biodegradación

Muestreo

Condiciones Iniciales

El Bosque Concentración Inicial de DDT

Tw Macronutreintes

UFC Humedad (%)

pH

Seguimiento Lote 1 (Testigo) Lote 2 (E201®) Lote 3 (E201® + Estiércol) Lote 4 (E201® + Cachaza) Control 1 (Estiércol) Control 2 (Cachaza)

Concentración (%) de DDT Tw pH

Humedad (%) UFC

Degradación Final

100 días

Concentración (%) de DDT Tiempo de vida media (t1/2)

Tiempo de vida (1 ppb)

4.7.2 Ensayo de búsqueda y aislamiento de microorganismos Con el fin de determinar a que concentración de DDT existe mayor crecimiento microbiano, y al mismo tiempo asilar microorganismos capaces de tolerar y/o degradar DDT, se muestrearon 9 fincas, formando una muestra compuesta por cada finca.

4.7.2.1 Reactivos Se utilizaron los siguientes reactivos: DDT puro (Supelco) facilitado por el Ministerio de Salud (MINSA), K2HPO4, KH2PO4, NH4SO4, MgSO4·7H20, CaCl2·2H2O, MnSO4·H2O, FeSO4, NaMoO4·2H2O, NaCl y Agar Base. 4.7.2.2 Aislamiento Se colocaron 5,00 g de tierra de cada muestra en un tubo de ensayo para luego agregar 50,00 mL de solución NaCl al 1%. Se homogenizó la muestra y se midió pH (Carrillo et al., 2004). Se utilizaron medios no nutritivos para el crecimiento de microorganismos, teniendo como única fuente de carbono el DDT puro (Carrillo et al., 2004) y sales minerales con la siguiente composición en g/L: K2HPO4, 1.73; KH2PO4, 0.68; NH4SO4, 1.0; MgSO4

.7H20, 0.1; CaCl . 2 H2O, 0.02; MnSO4.H2O, 0.03; FeSO4, 0,03

y NaMoO4·2H2O, 0,06. Estos se esterilizaron a 121 ºC por 15 minutos (Stanlake y Finn, 1982). Se planteó la posibilidad que, en caso de que el compuesto xenobiótico no sustentara el crecimiento de microorganismos, se utilizarían medios enriquecidos con un análogo biodegradable, como fenol o bifenilo (You y Bartha, 1982; Focht y Brunner, 1985) con el fin de facilitar su crecimiento (Atlas y Bartha, 2002). 4.7.2.3 Unidades formadoras de colonias (UFC) Se tomó una alícuota de 1/10 de cada una de las muestras de suelo, en una solución de NaCl al 1,00%, siguiendo una serie de diluciones entre 10-5 hasta 10-8, que luego fueron plateadas en platos con agar nutritivo Luria Agar Base (LB) sólido. Todos los platos fueron inoculados a una temperatura de 37,00°C, por 48-96 horas. Las colonias fueron leídas como unidades formadoras de colonias (UFC), entendiéndose UFC como UFC/g. Como referencia, se analizaron las UFC en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA).

4.7.2.4 Estudio de tolerancia o unidades de colonias degradadoras (UCD) Con el fin de evaluar la tolerancia de DDT para las diferentes poblaciones de microorganismos, se realizó un conteo de número de colonias degradadoras. Se tomó una alícuota en 1/10 mL de NaCl al 1,00%, siguiendo una serie de diluciones entre 10-3 hasta 10-5, que luego fueron plateadas en platos con agar no nutritivo (NNA) sólido (Biodyne, s.n.f.b). Los platos fueron rociados por 4 concentraciones diferentes, 100, 300, 600 y 1 000 ppb. Se incubaron a una temperatura de 37°C por 48 horas. Como resultado se obtuvieron cultivos mixtos, a los cuales se les realizó una media aritmética entre las tres réplicas, midiéndose como UCD, entendiéndose UCD como UCD/g de suelo (Biodyne, s.n.f.b). Se utilizó un blanco por cada serie de diluciones. Los microorganismos de interés se aislaron posteriormente en la identificación. 4.7.2.5 Identificación de microorganismos A partir de los diferentes cultivos mixtos, se aislaron cepas puras. Estas se platearon en placas con agar enriquecido, siguiendo el mismo proceso que el planteado en el inciso 4.7.2.4. Se realizaron 5 análisis por cada concentración de DDT (100, 300, 600 y 1000 ppb), para un total de 20 análisis por finca. Las cepas que lograron desarrollarse adecuadamente pasaron al proceso de identificación. Para la identificación, se utilizaron los siguientes criterios (Madigan et al., 2004): Morfológicos: Forma, Tinción de Gram, movilidad, pigmentación. Bioquímicas: Prueba de oxidación-fermentación, medio O/F glucosa, presencia de enzimas (catalasa, oxidasa). El proceso de identificación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA), siguiendo protocolos propios de la UNA. 4.7.2.6 Resumen de la metodología En la Figura 4.2 (siguiente página) se observa un resumen de la metodología utilizada en el Ensayo de búsqueda y aislamiento de microorganismos. Se observan los indicadores utilizados, métodos y análisis utilizados.

Figura 4.2. Resumen de la metodología utilizada para el Ensayo de búsqueda y asilamiento

de microorganismos. 4.8 Instrumentos de recolección de datos Para facilitar el análisis de los resultados, se utilizaron fichas a lo largo del muestreo y recolección de datos. Además se utilizó la bibliografía existente para comparar la veracidad de nuestros resultados. Ficha de campo in situ: Se utilizaron fichas para recolectar datos durante el muestreo, como: pH, temperatura ambiente, temperatura del suelo, coordenadas y observaciones generales de cada ficha (ANEXO B). Fichas de campo ex situ: Se utilizaron estas fichas para llevar un control sobre las variables tomadas del Ensayo de biodegradación. En esta ficha se anotaron datos como el pH, humedad %, Temperatura de Trabajo, temperatura ambiente, temperatura del suelo, concentración de DDT y sus metabolitos, dosis microbiana, volumen de agua agregado, condiciones climáticas y observaciones generales (ANEXO B).

Muestreo

Condiciones Iniciales

El Bosque El Trapiche Santa Lucía La Haya El Hular

Humedad (%) pH

Aislamiento de colonias

ENMA Diano Marino Dos Reyna La Pita 2

Medios con DDT como fuente única Carbono

UFC UDC

Aislamiento de colonias puras

DDT: 100 ppb 600 ppb 300 ppb 1000 ppb

Intolerante al DDT

Identificación

Tolerante al DDT

Descartó

Género y/o especies

Fichas de laboratorio: Se utilizaron estas fichas para llevar un control de las UFC y UCD durante el ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos. Además, se anotaron datos como pH y humedad inicial, y observaciones generales (ANEXO B). Revisión bibliográfica: Se utilizó para comparar los microorganismos cuya capacidad de tolerar o degradar DDT contra los microorganismos encontrados durante la investigación ya ha sido demostrada (ANEXO B). 4.9 Procedimientos para el procesamiento y el análisis de

información Los resultados fueron analizados estadísticamente por medio del programa Excel versión 2003. Los cálculos estadísticos variaron desde regresión lineal, factor de correlación de Pearson (r) , promedio o media aritmética, desviación estándar, error estadístico, pendiente (m), intersección (x) y sumatoria. Con fines aclaratorios, se utilizó regresión lineal en dependencia de una variable Y en dependencia de una variable independiente x. Esta se utilizó en las proyecciones de degradación (%) de DDT en el tiempo (x). Por otro lado, se utilizó el cálculo de correlación de Pearson o coeficiente producto momento de Pearson cuando el fin era encontrar si dos variables son independiente o covarían entre si (No se expresaron como variables independiente o dependientes) (Pérez, 2004). El coeficiente de Pearson (r) se dividió en muy bajo (0.00 – 0.20), bajo (0.21 – 0.40), moderado (0.41 – 0.60), alto (0.61 – 0.80) y muy alto (0.81 – 1.00) (Gagel et al., 2007; Hill et al., 1995). Para los cálculos de error, se utilizaron dos términos, desviación estándar y error estadístico. El error estadístico se utilizó en el cálculo de medias de muestras del mismo tamaño de una población, tomando en cuenta los valores originales (Tw, pH y humedad (%)), mientras que el error estándar se utilizó en cálculos que implicaban el error a valores calculados (valores corregidos de la degradación (%) de DDT y cálculos de correlación) (Skoog et al., 2001).

4.9.1 Ensayo de biodegradación Con el fin de determinar si existe una relación directa entre el porcentaje de biodegradación con respecto a la Temperatura de trabajo (Tw ), se realizó un análisis de correlación de Pearson en los Lotes a los que se aplicó E201®. El Lote 1 (Testigo) se utilizó como referencia para contrastar las circunstancias en las que no se aplicaron aditivos ni se controlaron las variables ambientales. Los Lotes 5 y 6, sirvieron como control para describir la incidencia que el estiércol y la cachaza representaban en la posible dilución del DDT. Se tomó el porcentaje de biodegradación de DDT como variable dependiente de las variaciones en el tiempo, t (día). Se obtuvo una recta cuyo valor de pendiente (m) fue un indicador de biodegradación a lo largo del tiempo. A mayor inclinación de la recta, mayor es la biodegradación en el tiempo. Se realizó una comparación entre lotes para determinar cuál de éstos presentó la mayor tendencia a biodegradar el DDT a lo largo del tiempo y según la Tw . El coeficiente de correlación de Pearson (r) indicó el tipo de relación (directa o inversamente proporcional) existió entre la degradación (%) de DDT, Tw y UFC. A su vez, se calculó la degradación (%) en largo períodos de tiempo (años) por medio del tiempo de vida media (t½) y tiempo de vida. 4.9.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos Se realizaron dos análisis de correlación. El primero, de carácter preliminar, estuvo orientado a analizar la correlación entre los valores de concentración de DDT en cada finca con respecto a las UCD de las mismas. En el segundo análisis, se evaluó la correlación entre la concentración de DDT en cada finca con respecto a las UDC de las mismas, pero habiéndose obtenido éstas últimas a partir de la técnica de enriquecimiento de cultivo. Cada análisis de correlación por cada finca fue considerado como un caso aislado. El punto de interés de la pendiente (m) radicó en su signo, para poder determinar si la correlación era directa o inversamente proporcional entre las variables estudiadas.

CAPÍTULO V

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este capítulo se presentan los resultados de los dos ensayos contenidos en el estudio: Ensayo de biodegradación y Ensayo de búsqueda y aislamiento de microorganismos. En el Ensayo de biodegradación se discutieron los factores que influyeron en la degradación de DDT y sus metabolitos durante los 100 días de seguimiento, por ende se incluyó el comportamiento del contaminante durante este curso. Se discutió la relación entre la concentración de contaminante y las unidades formadoras de colonias (UFC), unidades de colonias degradadoras (UCD), temperatura de trabajo (Tw ), así como las especies microbiológicas encontradas en el ensayo. En el Ensayo de búsqueda y asilamiento de microorganismos se discutió la relación entre las UCD y la concentración de DDT aplicada, así como las especies microbianas encontradas. 5.1 Ensayo de biodegradación A continuación se discuten los resultados obtenidos en el Ensayo de biodegradación en la Finca El Bosque. 5.1.1 Macronutrientes Según los resultados obtenidos, descritos en Tabla 5.1, la finca “El Bosque” presenta una relación de 20:1 ó 100:5 de C:N, superior a 100:2, por lo cual no fue necesario aplicar nitrógeno. La textura del suelo es franco, predominado partículas de arena (44,80%), seguido de limo (30,00%) y por último arcilla (25,20%). Dado que el porcentaje de materia orgánica resultó ser inferior al 5,00%, se puede afirmar que el potencial de los suelos para favorecer las uniones covalentes entre

el DDT con la fracción húmica del suelo no es tan alto (Lichtenstein et al., 1971), sin embargo, su influencia no puede descartarse. Como se sabe, la materia orgánica interactúa hidrofóbicamente con el DDT, generando enlaces relativamente fuertes que no inquieren en una modificación de la estructura del DDT. Así, al modificarse el pH, la solubilización de DDT, conjuntamente con la materia orgánica, puede verse favorecida. Dado que los valores de pH oscilaron entre 6 y 7, se estima que la alta presencia de iones hidrógeno no representa factor determinante en la solubilización del DDT unido al material húmico. Por otra parte, la presencia de materia orgánica favorece la disponibilidad de macronutrientes para fines de nutrición de los microorganismos biodegradadotes de DDT en el suelo, no obstante, la concentración no sobrepasó el 5,00%, el cual era considerado como un valor óptimo. Si bien la presencia de aditivos orgánicos resulta en un aumento de materia orgánica, ésta contenía microorganismos que probablemente inhibieron la actividad microbiana de algunas cepas E201®, por lo cual no se apreció una disminución en la concentración de DDT en el que se agregaron los aditivos (estiércol y cachaza).

Tabla 5.1. Análisis físicos-químicos* de la Finca El Bosque. Partículas (%) MO

(C%) N (%) C:N P-disp

(ppm) Arcilla Limo Arena Textura

2,40 0,12 20 8,64 25,20 30,00 44,80 Franco *Realizados en el Laboratorio de suelo y agua de la UNA.

5.1.2 Aplicaciones microbianas: Environoc 201® Los cuatro lotes objeto de estudio y los dos controles, fueron sometidos a las mismas condiciones para asegurar igualdad de variables ambientales. En la Tabla 5.2 podemos observar un resumen de las aplicaciones de E201® y agua a lo largo de la investigación.

Tabla 5.2. Detalle de aplicaciones de E201® y agua. E201® (mL) Agua (L) Lote s

N0 Volteos Total Promedio* Total Promedio

Lote 1 (Testigo) 13 0,00 0,00 52,40 4,00 Lote 2 (E201®) 13 2661,00 204,69 76,40 5,88

Lote 3 (E201®+Estiércol) 13 2661,00 204,69 82,40 6,34 Lote 4 (E201®+Cachaza) 13 2661,00 204,69 74,40 5,72

Controles Control 1 (Estiércol) 13 0,00 0.00 52,40 0,00 Control 2 (Cachaza) 13 0,00 0.00 52,40 0,00

*Al Lote 1, y los Controles 1 y 2, no se les aplicó E201®. *Se aplicaron 194 mL de E201®, a excepción del día 42, aplicándose 333,00 mL. A partir del día 42 se inocularon (por 24 horas) los 194,00 mL de dosis microbiana en agua destilada, más la proporción de Environbrew (por cada 1,00 L de E201® se aplicaron 25,00 mL de Environbrew), antes de ser aplicada a los Lotes.

Si bien al Testigo (Lote 1) no se le aplicaron microorganismos, se homogenizó y aplicó agua en un volumen que igualara al de la dosis microbiana aplicada en el resto de los Lotes. De igual forma, en los Controles 1 y 2 se aplicó agua en una cantidad equivalente a la del Testigo y en todos los Lotes se homogenizó el suelo para un total de 13 veces que asegurara una oxigenación adecuada del suelo. Las dosis de E201® se aplicó equitativamente en los Lotes que comprendían desde el 2 hasta el 4. La aplicación del estiércol, como se verá más adelante, no afecta en las tasas de humedad y no determina la dosis microbiana; esto es, pues, debido a que el estiércol representa la matriz nutritiva que está a disposición los microorganismos para su alimentación, lo cual conlleva a una rápida disminución del volumen atribuido al proceso de mineralización. A su vez, los cálculos de aplicación de E201® se basan en los volúmenes de suelo contaminado por plaguicidas (DDT). De conformidad con los protocolos de aplicación de dosis microbiana de Biodyne®, los aditivos no se toman en consideración para la preparación de la dosis. Se maneja una dosis constante según el volumen de suelo contaminado con que se cuente, a excepción del día 44 en el cual se aplicaron 33,00 mL, los cuales se inocularon por 24 horas con el fin de obtener mayor concentración de microorganismos. La composición de los Lotes se determinó con base en el alcance de la investigación. La determinación del porcentaje de biodegradación en un período de tiempo definido vendrá dada por el comportamiento del suelo de los Lotes 2, 3 y 4, en concordancia con los aditivos agregados. El Lote 1 funge como Testigo al presentar las mismas condiciones ambientales, mas sin la presencia de microorganismos, para determinar el porcentaje de biodegradación atribuido a factores varios de naturaleza no biótica. Los Controles 1 y 2 se adjuntaron a la investigación con el fin de determinar la influencia que tenían los aditivos de cachaza y estiércol en el comportamiento biodegradador de los microorganismos y determinar hasta qué medida estos afectaban positiva o negativamente el resultado final en la concentración de DDT. Se observó que la adición de estiércol y cachaza produjo un efecto de dilución masa/masa (m/m), por lo cual, para la toma de muestra de los análisis de los Lotes 3 y 4, se tomó únicamente suelo. Con el fin de determinar el posible efecto de dilución de la concentración de DDT que se puede producir al aumentar el volumen con masa no contaminada con cachaza y estiércol, se realizó un análisis de GC-ECD el día 99 para los controles 1 y 2, determinándose que la dilución fue de 25,45%, para el Control 1 y para el Control 2. Para evitar que en los análisis de degradación de DDT fueran influidos por este efecto, se tomó únicamente suelo en todos los muestreos. En la Tabla 5.3 (siguiente página) se puede observar el efecto de dilución atribuido a la adición de los agregados orgánicos.

Tabla 5.3. Efecto de dilución (m/m) en los Controles 1 (estiércol) y 2 (cachaza).

Control Concentración

Inicial (ppb) Concentración

Final* (ppb) Dilución (%) Concentración

Final Teórica sin Diluir (ppb)

1 196,82 25,45 246,91 2

264,00 196,82 25,45 246,91

*En el momento del muestreo se tomó una proporción igual de suelo-agregado orgánicos (cachaza o estiércol) a sus respectivos lotes (Lotes 3 y 4)

5.1.3 Temperatura de trabajo (Tw) A continuación se presentan los promedios de la Tw en el tiempo (Tabla 5.4). Es necesario señalar que los promedios se realizaron tomando en cuenta la sumatoria desde el día cero hasta el día objeto (99). De esta forma, el promedio del día 10 es la sumatoria del día 0 al 10 entre los días de toma de datos de variables ambientales; el promedio del día 45, la sumatoria del día 0 al 45, entre los días de toma de datos, y así sucesivamente. Así se facilitó observar la disminución o aumento en promedio de la Tw .

Tabla 5.4. Temperatura de Trabajo (Tw) durante los 100 días de seguimiento. Día Lote s

0 10 45 70 99 Promedio

Global Desviación Estándar*

Lote 1 (Testigo) 4,00 2,80 1,00 0,90 0,90 0,90 2,01 Lote 2 (E201®) 3,00 3,00 1,30 0,90 1,10 1,10 2,30

Lote 3 (E201®+Estiércol) 6,00 4,70 2,30 2,30 2,40 2,40 2,30 Lote 4 (E201®+Cachaza) 2,00 2,20 0,50 0,50 0,70 0,70 2,14

Controles Control 1 Estiércol) 6,00 4,70 1,30 1,00 1,00 1,00 2,31 Control 2 (Cachaza) -1,00 0,20 -0,90 -1,00 -1,00 -1,00 2,21

*Con respecto al promedio global.

La diferencia de temperatura de suelo (Ts) con respecto a la temperatura ambiente (Tamb) brinda una referencia sobre la actividad microbiana presente en el suelo . Así, a mayor Tw , se sospecha que la tendencia de biodegradación será más alta . Este fenómeno puede verse reflejado el caso del Lote 3, el cual no presentó el mayor porcentaje de biodegradación, a lo largo del período de estudio, pero si las Tw más altas. Esto se debió a que la población microbiana del suelo aumentó como resultado de la presencia de estiércol, cuya mineralización conllevó a una liberación elevada de calor. Aunque la Tw es elevada, ello no implica que se deba por efectos de biodegradación de DDT, sino que realmente se debe por efectos de mineralización del estiércol. La Tw para los lotes con cachaza no fue alta porque el aditivo en sí mismo representa una matriz menos nutritiva para los microorganismos, por estar compuesta principalmente de celulosa y lignina, que no son tan rápidamente biodegradables como el estiércol.

Si se compara el Lote 1 con el Lote 2 se podrá ver que, a falta de aditivo, el Lote 2 presentó una mayor tendencia a tener una mayor Tw , como resultado de la adición de dosis microbiana. Este incremento se debió únicamente a la actividad microbiana biodegradadora del DDT y a la microfauna nativa del suelo (Pseudomonas sp., Bacillus sp. y Sarcina sp.). Cabe mencionar que la cachaza y el estiércol influyen en el comportamiento de Tw . Para el Lote 3 (E201® + estiércol) puede que los microorganismos E201® entren en procesos de cometabolismo e incrementen la Tw al mineralizarse el estiércol y biodegradarse el DDT. La razón por la cual disminuye la Tw radica en el hecho de que entre el día 11 y 45 las reservas de aditivos (agregados) orgánicos (estiércol y cachaza) se habían agotado como resultado de la mineralización, reduciéndose así el calor generado por el metabolismo microbiano. Como se comentó anteriormente (inciso 5.1.2), fue necesario aplicar concentraciones más altas de E201® (reinoculación por 24 horas), con el fin de aumentar la Tw , la cual aumentó considerablemente en los siguientes días. Esto evidencia una vez más el papel fundamental que juegan los microorganismos aplicados en el aumento de Tw no atribuida a fenómenos bióticos. A pesar que la desviación estándar de Tw (Tabla 5.4) en los cuatro lotes fue alta, esto no es un factor que reduzca la capacidad degradadora de los microorganismos, siempre y cuando se mantengan las condiciones de humedad y pH constantes. Este fenómeno ha sido comprobado por Aden (2003) y Kubiak (1986), los cuales en sus respectivas investigaciones obtuvieron una mayor degradación de pesticidas bajo temperaturas variables y humedad constante (Beulke et al., 2005) 5.1.4 pH Los valores de pH de los lotes que se presentan en la Tabla 5.5 se encuentran dentro del rango óptimo de desarrollo de microorganismos.

Tabla 5.5. pH promedio resultante de los 100 días de seguimiento.

Lote Promedio Global

Desviación Estándar

Lote 1 (Testigo) 6,15 0,13 Lote 2 (E201®) 6,33 0,28

Lote 3 (E201®+Estiércol)

6,41 0,32

Lote 4 (E201®+Cachaza)

6,38 0,32

Controles Control 1 (Estiércol) 6,38 0,33 Control 2 (Cachaza) 6,32 0,31

A este pH (6 - 7) hay un grado de protonación adecuado para el funcionamiento de las enzimas de los microorganismos biodegradadores. A pH ligeramente por debajo de 7, se favorece que el DDT se libere de la matriz orgánica por afinidad de sus átomos de cloro a la carga positiva de las especies hidrogeniónicas en la solución de suelo. Valores bajos de desviación estándar de los promedios globales indican que el pH del suelo permanece relativamente constante. Las ligeras variaciones se deben, naturalmente, a la heterogeneidad del suelo y al variante comportamiento del suelo en cuanto a la dinámica de sus especies iónicas en la solución. 5.1.5 Humedad (%) En la Tabla 5.6 se observan los valores de humedad (%) promedios. Los valores de humedad son relativamente constantes, con una desviación estándar baja con relación al promedio. La humedad (%) nunca estuvo por debajo del 22% ni por encima de su nivel de saturación (40%), ya que no se observó lixiviado. Los Lotes con E201® mantuvieron un porcentaje de Humedad muy similar. Dentro de este intervalo, se mantuvo una adecuada hidratación de los microorganismos, favoreciendo a su vez el mantenimiento de una temperatura óptima del suelo. 5.1.6 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) Se observó el crecimiento de Pseudomonas sp, (Kamanavalli y Ninnekar, 2004; Hay y Focht, 1998; Francis et al., 1978; Seubert, 1960), Bacillus sp. (Aislabie et al., 1997; Patil et al., 1970) y Sarcina sp., donde las primeras dos especies presentan antecedentes comprobados de biodegradación de DDT. En la muestra inicial (Tabla 5.7, siguiente página), se observaron solamente Bacillus sp. A medida que se fueron aplicando las dosis microbianas, hubo un aumento de Pseudomonas sp. y Bacillus sp. y en la tabla de la siguiente páginas, se observa el crecimiento individual por cada Lote, donde los Lotes 2 y 3 presentaron una mayor actividad microbiana, principalmente de Bacillus sp.

Tabla 5.6. Humedad (%) promedio resultante de los 100 días de seguimiento.

Lote Promedio Global

Desviación estándar

Lote 1 (Testigo) 26,50 3,83 Lote 2 (E201®) 30,31 4,30

Lote 3 (E201®+Estiércol) 29,36 5,77 Lote 4 (E201®+Cachaza) 31,10 3,49

Controles Control 1 (Estiércol) 31,70 2,87 Control 2 (Cachaza) 32,05 2,96

Tabla 5.7. Crecimiento microbiano como UFC para los lotes y controles durante los 100 días de

seguimiento.

Día Lote s Pseudomona sp. UCF (x106)

Bacillus sp. UCF (x106)

Sarcina sp. UCF (x106)

Total UCF (x106)

0 Inicial - 9,00 - 9,00

Lote 1 (Testigo) - - - - Lote 2 (E201®) 20,00 4,00 - 24,00

Lote 3 (E201®+Estiércol) 10,00 1,00 1,00 12,00

Lote 4 (E201®+Cachaza) 11,00 1,00 - 12,00 Controles

Control 1 (Estiércol) 18,00 7,00 4,00 29,00

10

Control 2 (Cachaza) 30,00 - - 30,00 Lote 1 (Testigo) 20,00 8,00 - 28,00 Lote 2 (E201®) - 30,00 21,00 51,00

Lote 3 (E201®+Estiércol) - 100,00 - 100,00

Lote 4 (E201®+Cachaza) 9,00 3,00 1,00 13,00

Controles Control 1 (Estiércol) 5,00 1,00 2,00 8,00

50

Control 2 (Cachaza) 20,00 5,00 4,00 29,00 Lote 1 (Testigo) 5,00 1,00 - 6,00 Lote 2 (E201®) 8,00 - - 8,00

Lote 3 (E201®+Estiércol) 4,00 2,00 - 6,00 Lote 4 (E201®+Cachaza) 6,00 5,00 - 11,00

Controles Control 1 (Estiércol) 1,00 - - 1,00

99

Cont rol 2 (Cachaza) 2,00 - - 2,00

La Tabla 5.8 muestra el promedio de especies microbiana, sin tomar en cuenta el testigo, de los tres Lotes a los cuales se les aplicó E201®. Se observa que a medida que aumentan las aplicaciones de E201®, las especies de Bacillus sp. aumentan, mientras que las especies de Pseudomonas sp., que si bien aumentan para el día 10, tienden a disminuir en adelante. Se observaron también especies de Sarcina sp. que aumentaron según las aplicaciones, sin embargo, éstas lo hacen en una menor proporción.

Tabla 5.8. Promedio de Unidades Formadoras de Colonias para los Lotes 2, 3 y 4.

Día Pseudomonas sp. UCF (x106)

Bacillus sp. UCF (x106)

Sarcina sp. UCF (x106)

Total UCF (x106)

0 0,00 9,00 0,00 9,00 10 14,00 2,00 0,30 16,00 50 3,00 44,00 7,00 55,00 99 6,00 2,00 0,00 8,00

Tomando en cuenta todas las especies microbianas, UFC Total, se observa (Tabla 5.9) que en el Lote 3 existe una actividad microbiana aproximadamente dos veces mayor que la del Lote 1, lo cual se debe particularmente a la influencia del estiércol. En el Lote 2, por su parte, se observó que hay una mayor actividad microbiana atribuida a la adición de E201®. Así, se puede ver que en el Lote 3 parte de la actividad microbiana se debe a la microfauna nativa del estiércol (obsérvese que el Control 1 en el día 10 tiene una actividad de 29 x 106), y no necesariamente a la adición de E201®. Por ende, la totalidad de estas colonias no logran tolerar ni biodegradar DDT, solo una parte de ella.

Tabla 5.9. UFC Total Promedio t (días)

Lotes 0 10 50 99

Promedio (x106)

Lote 1 (Testigo) 9,00 - 28,00 5,00 14,00 Lote 2 (E201®) 9,00 24,00 51,00 8,00 23,00

Lote 3 (E201®+Estiércol) 9,00 13,00 100,00 6,00 32,00 Lote 4 (E201®+Cachaza) 9,00 12,00 13,00 6,00 11,00

Controles Control 1 (Estiércol) 9,00 29,00 7,00 1,00 12,00

UF

C (

x106 )

Control 2 (Cachaza) 9,00 30,00 29,00 2,00 18,00

En la Figura 5.1 se muestra la tendencia en la curva de UFC contra t (días). Esta figura muestra que a medida de que se aplican las dosis microbianas, UFC aumenta, disminuyendo al dejar de aplicar las dosis y al mineralizarse los aditivos.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

t (días)

UFC

(x10

6 )

Testigo E201 E201 + Estiercol E201 + Cachaza

Figura 5.1. Unidades Formadoras de Colonias contra Tiempo.

5.1.7 Degradación de DDT Los porcentajes de biodegradación que se muestran en la Tabla 5.10, representan el comportamiento de porcentaje de biodegradación a lo largo del período investigativo. Las mediciones se realizaron en 4 puntos en el tiempo. Como punto de partida, se tiene que el Testigo (Lote 1) presenta una concentración inicial de 264,00 ppb de DDT.

Tabla 5.10. Análisis por día de DDT y metabolitos Día Lote

0 45 70 99 Degradación Final (día 99)

Lote 1 (Testigo) 264,00 158,40 258,13 258,33 2,15 Lote 2 (E201®) 264,00 150,86 187,73 196,80 25,45

Lote 3 (E201®+Estiércol)

264,00 145,80 195,00 222,55 15,70

Lote 4 (E201®+Cachaza)

264,00 129,06 207,30 242,24 8,24

Si se toma en cuenta el valor de la concentración inicial con respecto al valor en el día 99, se podrá apreciar que el valor del Testigo parece casi inalterable, con un porcentaje de degradación de 2,15%. Esta pequeña degradación pudo haberse debido a degradación abiótica o bien, a degradación autóctona del suelo inducida por las condiciones de calor a que se vio sometido cada Lote al ser tapado con plástico negro, acompañado de la homogenización. El Lote que presentó el segundo porcentaje de biodegradación más bajo fue el 4 (E201® + cachaza). La razón por la cual se estima que este porcentaje no fue tan alto, radica en el hecho de que la cachaza no es un material orgánico con alta presencia de microorganismos capaces de mineralizarla en estas condiciones. A su vez, está compuesta principalmente por celulosa y lignina, cuya degradación, si bien se trata de sustancias biodegradables (Barr y Aust, 1994), es relativamente lenta. Sin embargo, éste resultó ser más alto que el Testigo. La cachaza se encontraba ligeramente fermentada, lo cual favoreció al crecimiento de microorganismos nativos del suelo. El Lote 3 (E201® + estiércol), fue el segundo en presentar mayor porcentaje de biodegradación. Esto como resultado de la alta presencia de microorganismos que se encuentran en el estiércol. Durante el proceso de mineralización del mismo, el aumento de la temperatura fue mayor, no obstante, lo que determina en verdad el porcentaje de biodegradación es el papel que juegan los microorganismos capacitados para biodegradar DDT.

La razón por la cual el Lote 2, que no contenía aditivos, presentaba el mayor porcentaje de biodegradación con respecto al Lote 3, puede deberse al hecho de que en este último, haya acontecido un crecimiento competitivo entre los microorganismos del estiércol y las cepas E201® (Madigan et al., 2004; Atlas y Bartha, 2002), de forma tal que estas pudieron desarrollarse a su máxima capacidad, biodegradando el DDT a una tasa balanceada. Sin embargo, cabe mencionar el hecho de que durante el día 45, la concentración disminuyó en gran medida con respecto a la de los días 70 y 99, donde en realidad se observa una ligera tendencia de aumento en la concentración de DDT. Esto se debe al hecho de que la muestra tomada durante el día 45 fue analizada 2 meses después de recolectada. La muestra ya tenía microorganismos en su matriz y al estar tanto tiempo almacenada en una bolsa de polietileno (zip-lock), bajo condiciones anaeróbicas y con nutrientes suficientes para su desarrollo, microorganismos no aeróbicas pudieron haberse desarrollado y biodegradado el DDT con mayor intensidad. Se sabe que un medio anaeróbico (Aislabie et al., 1997) es el más común para sostener esta biodegradación. Lo mismo sucedió con las muestras del día 70, que fueron analizadas 1 mes después, sin embargo, no se dejó pasar el tiempo suficiente para descartar el análisis. Para fines de considerar la degradación (%) de DDT se tomaron en cuenta únicamente el d ía 0, 70 y 99. Otra razón que sustenta el hecho de que la anaerobiosis incidió en una remarcada tasa de biodegradación del DDT radica en que el Testigo no varió de concentración. Apenas varió en un 2,33% entre las muestras del día 0, 70 y 99. Esto sugiere que la cepa E201® presentaba en su matriz microbiana anaeróbicas o, posiblemente, aeróbicas y anaeróbicas facultativas, las cuales, al encontrarse condiciones anaeróbicas, hayan favorecido la biodegradación del DDT. Se puede advertir que un porcentaje de biodegradación de 25,00% en 100 días es bastante alto (comparado con el t1/2 calculado en el inciso 5.1.9), lo cual sugiere que la degradación no solamente fue aeróbica, sino anaeróbica facultativa , puesto que los lotes estaban apilados y en el fondo de ellos, si bien se homogenizaba regularmente, el acceso a oxígeno era dificultoso. Se estima que a estas condiciones experimentales ex situ, la biodegradación sufre un comportamiento relativamente lineal, lo cual se debe a que el período de tiempo de análisis es corto y las condiciones ambientales permanecen constantes. A medida que el tiempo va aumentando, el comportamiento se vuelve logarítmico.

5.1.8 Degradación de DDT (valores corregidos) A la tabla anterior (Tabla 5.10) se le aplicó el análisis de regresión lineal debido a que se trataba de un período corto de análisis, haciéndolo susceptible de utilizarlo. Como se observa en la Tabla 5.11, se descartó el día 45, debido a las condiciones inusuales de almacenamiento en el Laboratorio de Residuos del MAGFOR, con las cuales la muestra pasó en un ambiente anaeróbico por dos meses. Para los Lotes 1 y 2, el coeficiente de correlación lineal (r = 0,90 y 0,85) (Tabla 5.11) resultó ser muy alto, mientras que los Lotes 3 y 4, presentaron coeficientes moderados y bajos. Esto puede deberse a que la cachaza y el estiércol probablemente ejerzan una influencia desestabilizadora en el análisis de DDT por GC-ECD, causando que el ajuste no fuera tan confiable como los del Lote 1 y 2. Al sustituir las variables independientes (días) se obtienen los estimados de concentración de DDT en cada punto en x. Así, la biodegradación estará directamente correlacionada con el tiempo en que se extiendan las aplicaciones.

Tabla 5.11. Degradación estadística de DDT y sus metabolitos por regresión lineal. t (Día) Lote

0* 70 99 Degradación

(%) Error

Estadístico Pendiente

(m) r

Lote 1 (Testigo) 263,66 259,30 257,50 2,33 1,44 -0,06 ± 0,02 0,90 Lote 2 (E201®) 258,69 205,86 183,98 23,92 22,83 -0,75 ± 0,32 0,85

Lote 3 (E201®+Estiércol)

256,68 220,03 204,85 20,19 31,52 -0,52 ± 0,44 0,59

Lote 4 (E201®+Cachaza)

256,37 233,35 223,82 12,70 32,81 -0,33 ± 0,46 0,34

*Varía debido a la corrección de la regresión lineal, suponiendo que en cortos períodos de tiempo, la relación degradación contra tiempo es lineal (Yánez y Granada, 2006; Carrillo et al., 2004).

5.1.9 Tiempo de Vida media (t1/2) El tiempo de vida media estimado para el Testigo es de casi 8 años o 2910,84 días. Por otro lado se puede observar que los Lotes a los cuales se les aplicó microorganismos, tienen un tiempo de vida media mucho menor, donde el Lote 2 (E201®) alcanzó un tiempo de vida media de 0,57 años o 208,86 días, seguido del Lote 3 (E201® + Estiércol) con un tiempo de vida media de 0,84 años o 314,23 días, y el Lote 4 (E201® + Cachaza) con un tiempo de vida media de 1,41 años o 514,87 días. La siguiente tabla (página siguiente) nos muestra un resumen del cálculo realizado para determinar el t1/2 para todos los lotes, incluyendo la relación de t1/2 entre el Lote 1 y los demás lotes.

Tabla 5.12. t1/2 (días y años) calculados

Lote Kt Ln (2) t (días)

t (años)

X

Lote 1 (Testigo) 2,38x10-4 0,69 2910,84 7,97 1,00 Lote 2 (E201®) 3,32x10-3 0,69 208,86 0,57 13,98

Lote 3 (E201®+Estiércol)

2,21x10-3 0,69 314,23 0,86 9,31

Lote 4 (E201®+Cachaza)

1,35x10-3 0,69 514,87 1,41 5,68

Según estos datos, se puede predecir el tiempo en el cual se degradará el DDT. Al calcular el t1/2 se puede determinar realmente cómo influye la aplicación de cepas a lo largo del tiempo, permitiendo decidir si la biodegradación será factible. Así, el Lote 2 se degradaría casi 14 veces más rápido que el testigo. 5.1.10 Tiempo de vida* El tiempo que necesita el DDT y sus metabolitos para biodegradarse hasta 1 ppb en el Lote 1 (Testigo) es de 64,14 años o 2911 días. Los Lotes que fueron rociados por microorganismos tienen un tiempo de vida menor, donde el Lote 2 (E201®) alcanzó un tiempo de vida de 4,59 años o 1674 días, seguido del Lote 3 (E201® + Estiércol) con un tiempo de vida de 6,89 años o 2415,06 días, y el Lote 4 (E201® + Cachaza) con un tiempo de vida de 11,29 años ó 4120 días. La Tabla 5.13 muestra un resumen del cálculo realizado para determinar el tiempo de vida para todos los lotes, incluyendo la relación de t1/2 entre el Lote 1 y los demás lotes.

Tabla 5.13. Tiempo de vida calculado

Lote Kt Co (ppb)

C (ppb)

Ln (Co/C) t (días) t (años)

X

Lote 1 (Testigo) 2.38x10-4 263,66 1,00 557,46x10-2 23410,46 64,4 1,00 Lote 2 (E201®) 3.32x10-3 258,69 1,00 555,56x10-2 1674,01 4,59 13,94

Lote 3 (E201®+Estiércol)

2.21x10-3 256,67 1,00 554,78x10-2 2515,06 6,89 9,26

Lote 4 (E201®+Cachaza)

1.35x10-3 256,37 1,00 554,66x10-2 4120,00 11,29 5,65

*DDT y metabolitos no es mayor a 1ppb.

5.1.11 Correlación entre degradación (%) de DDT y Tw En la Tabla 5.14 (página siguiente), podemos observar una tendencia para los Lotes 2 y 3, que a mayor Tw existe una mayor degradación (%), pero el factor de correlación (r) es muy bajo para los 4 lotes. Aunque la pendiente (m) es positiva, esto no permite afirmar con convicción que la Tw es el principal factor en la degradación, pero si es un indicador útil de ésta (Boul, 1995; Guenzi, 1976)

Tabla 5.14. Correlación entre Tw y degradación (%) de DDT

Lote s %

Degradación Tw

Tw (corregidos)

r Error

Estadístico Pendiente

(m) Intersección

(x) Lote 1 (Testigo) 2,33 0,94 0,82 Lote 2 (E201®) 23,92 1,08 1,60

Lote 3 (E201®+Estiércol)

20,19 2,40 1,47

Lote 4 (E201®+Cachaza)

12,70 0,66 1,20

0,20 0,85 5,48 ± 0,87 0,74 ± 0,05

La Figura 5.2 muestra la relación directa entre Tw y la degradación (%) de DDT, donde al aumentar la temperatura, aumenta el porcentaje de degradación. Esta relación concuerda con lo descrito por Boul (1995) y Wedemeyer, (1967), encontrando el segundo una relación directa entre la temperatura y la producción de DDD (degradación de DDT a DDD).

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

0 5 10 15 20 25

Degradación de DDT (%)

Tw (

oC)

Figura 5.2. Correlación de Pearson entre degradación (%) de DDT y Tw de todos los lotes.

5.1.12 Correlación entre UFC y Tw Si bien la relación entre Tw y la degradación (%) es muy baja (Tabla 5.14), Tw y la actividad microbiana expresada como UFC sí presenta una correlación muy alta (r= 0,86), lo cual indica una sólida tendencia positiva (m= 0,07), donde a mayor Tw habrá una mayor actividad microbiana (UFC).

Tabla 5.15. Temperatura de Trabajo (Tw) contra Unidades Formadoras de Colonias

Lote s UFC (x106)

Tw r Error Estadístico

Pendiente (m)

Intersección (x)

Lote 1 (Testigo) 14,00 0,94 Lote 2 (E201® ) 23,00 1,08

Lote 3 (E201®+Estiércol) 32,00 2,40

Lote 4 (E201®+Cachaza) 10,00 0,66

0,86 0,36 0,07 ± 0,02 -0,17 ± 0,45

La Figura 5.3. muestra la tendencia de la correlación entre Tw y UFC, donde al aumentar la temperatura, UFC. Esta se debe a la estrecha relación que existe entre la actividad (degradadora) microbiana con los cambios de temperatura (Beulke et al., 2005), pudiendo aseverar que a medida que se eleva la Tw las reacciones químicas y enzimáticas de la célula son más rápidas, acelerándose el crecimiento o la actividad microbiana (UFC) (Madigan et al., 2004).

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 5 10 15 20 25 30 35

UFC (x106)

Tw (

oC)

Figura 5.3. Temperatura de Trabajo contra Unidades Formadoras de Colonias

5.1.13 Factores de Correlación La Tabla 5.16 muestra un resumen de los factores de correlación (r) entre degradación (%) de DDT, Tw y UFC. Se puede observar que la degradación está más sensiblemente relacionada con la actividad microbiana (UFC) (r = 0,45), que con la Tw (0,20) y que, por su parte, Tw está fuertemente relacionada con UFC. Estos resultados muestran una tendencia que actividad microbiana (UFC) es un indicador más fiable en la degradación de DDT en suelos.

Tabla 5.16. Factores de Correlación (r) entre degradación (%) de DDT, Tw y UFC.

Degradación Tw UFC Degradación 1,00 0,20 0,45

Tw 0,20 1,00 0,86 UFC 0,45 0,86 1,00

5.1.14 Inversión El costo de la inversión se determinó en base a los costos de remediación de 0.5m3 del Lote 2 (E201). Estos costos no incluyen transporte, maquinaria, impuestos, ni costo por importación del producto (Tabla 5.17.). Debido a que el tiempo de vida del DDT puede variar, el costo se calculó con base en el tiempo de aplicación del producto (años).

Tabla 5.17. Costos anuales de biorremediación del Ensayo de biodegradación de la finca El Bosque.

Insumo Costo ($)

Tiempo (meses)

Cantidad (Unidades)

Total ($)

Environoc 201® 100,00 3 * 3 300,00

Envirobrew 30® 20,00 1 1 20,00 1,00 320,00

Volumen (m3) 0,50 160,00

*La viabilidad de E201® es de 3 meses después de inoculado.

Los costos para remediar 1,00 m3 de suelo contaminado por DDT son de $320,00 anuales y $26,67 mensuales. Si bien el costo de biorremediar un suelo es más bajo que otras técnicas (Tabla 5.18), remediar áreas muy extensas eleva el costo de remediación, especialmente en residuos peligrosos como los pesticidas. Lo más recomendable es utilizar E201® solo para puntos focales o derrames de plaguicidas en campo, y adicionar nutrientes al suelo en el sistema de riego que ayuden a la microfauna existente a cometabolizar el DDT. Como medida de ahorro en su aplicación, se recomienda aplicar el producto por medio del sistema de riego del Ingenio Monte Rosa.

Tabla 5.18. Costos de alternativas para tratar suelos contaminados por desechos peligrosos

Tipo de Tratamiento Costo medio ($/m3)

Rango típico del costo ( $/m3)

Incineración 975 350 – 1 600 Relleno Sanitario 350 100 – 600 Desorción Térmica 125 50 – 200 Lavado de suelo 237 125 – 350 Biorremediación sobre superficie 95 40 – 150

Fuente: Álvarez y Guevara, 2002.

5.2 Ensayo de búsqueda e identificación de microorganismos A continuación se discuten los resultados obtenidos en el Ensayo de aislamiento e identificación de microorganismos capaces de biodegradar DDT. En la Tabla 5.19, se observa que las fincas tenían en promedio un pH de 6,64, siendo la menor El Bosque (6,30) y la mayor La Haya (6,90). Los rangos de pH son aceptables, y no hubo necesidad de ajustarlo. La humedad en promedio fue de 3,08%, valores aceptables para el crecimiento microbiano por el método de placas.

Tabla 5.19. Condiciones inicial de las fincas muestreadas

Finca pH Humedad (%)

El Bosque 6,30 2,91 El Hular 6,45 3,56

El Trapiche 6,70 3,71 ENMA 6,67 2,78

La Pita 2 6,34 1,90 Dos Reyna 6,89 3,12 Santa Lucía 6,61 3,00

La Haya 6,90 2,95 Diano Marino 6,86 3,81

Promedio 6,64 3,08

5.2.1 Unidades de colonias degradadoras (UCD) Las Fincas en las que se observó una mayor formación de UCD (Tabla 5.20 en negrita) fueron El Bosque, 2,71 x 105; Dos Reyna, 1,93 x 105; Santa Lucía, 1,79 x 105; y la Pita 2, 1,75 x 105

. También se observó que a mayor concentración de DDT aplicado hubo una menor formación de colonias (Tabla 5.20, siguiente página).

Tabla 5.20. Unidades Degradadoras de Colonias por Finca y concentración

UCD (x105)

Fincas El Bosque

El Trapiche

Santa Lucía

La Haya

El Hular ENMA Diano

Marino Dos

Reyna La Pita

2 Promedio

Blanco 1,60 0,36 3,83 1,92 0,88 0,45 1,10 1,72 7,20 2,12

100 2,05 0,99 3,10 0,92 0,68 0,92 1,30 1,93 4,10 1,77

300 3,30 0,64 2,13 2,30 0,77 0,53 1,10 2,16 0,90 1,54

600 2,72 0,68 0,84 2,00 0,49 0,98 0,92 2,06 0,80 1,28

Co

nce

ntr

ació

n

(ppb

)

1000 2,75 0,26 1,08 0,19 0,81 1,37 0,81 1,58 1,20 1,12

Promedio UCD

2,71 0,64 1,79 1,35 0,68 0,95 1,03 1,93 1,75 1,43

UFC 28,00 15,00 72,00 8,00 1,00 26,00 1,00 7,00 19,00 19,67

A su vez, la proporción de UCD es menor que la de unidades formadoras de colonias (UFC). Esto es lógico, ya que UFC expresa la población total de microorganismos, mientras que UCD sólo expresa la población capaz de tolerar o biodegradar DDT. Sin embargo, esto no es aplicable para la finca Diano Marino, posiblemente porque la población microbiana de esta finca en su mayoría es capaz de tolerar DDT. Con el fin de confirmar la existencia de una población degradadora representativa en la finca Diano Marino, se deberán realizar análisis más profundos tanto de UCD como de UFC. 5.2.2 Relación entre Unidades de colonias degradadoras (UCD) y

Concentración inicial de DDT en las fincas La concentración inicial de DDT en las Fincas que se muestran en la Tabla 5.21 corresponden con un análisis realizado por el Ingenio Monte Rosa, extraído de la base de datos de mismo (Pantaleón, 2007), mientras que los análisis de UCD y UFC realizados en esta investigación, corresponden al año 2007.

Tabla 5.21. Unidades de colonias degradadoras contra concentración Inicial de DDT Concentración Fincas (ppb)

UCD (x105)

UCD (corregidos) r

Error Estadístico

Pendiente (m)

Intersección (x)

906,90 2,71 2,16 487,20 0,64 1,65 410,40 1,79 1,56 410,40 1,35 1,56 143,50 0,68 1,23 116,00 0,95 1,20 98,30 1,03 1,18 90,50 1,93 1,17 60,00 1,75 1,13

0,25 0,63 1,22 x10-3 ± 0,79 x10-3 1,06 ± 0,32

Esto no da un margen de comparación significativo, pero si es posible observar en la Figura 5.4, una tendencia, que a mayor concentración, mayor UCD. Para poder afirmar esto tácitamente se deberán realizar análisis de la concentración real de DDT en las fincas, ya que los datos pueden estar obsoletos después de un año de haberse analizados.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

50 150 250 350 450 550 650 750 850 950

DDT (ppb)

UD

C (

x105

)

Figura 5.4. Unidades degradadoras de colonias contra concentración de DDT

5.2.3 Relación de Unidades de colonias degradadoras (UCD) y

Concentración de DDT aplicadas En la Tabla 5.22 se observó una fuerte correlación (r = 0,95) entre la concentración de DDT (%) aplicada y las unidades de colonias degradadoras (UCD). Esto permite afirmar que a menor concentración de DDT es más fácil para los microorganismos adaptarse a este medio en un corto lapso de tiempo. Esto no quiere decir que no exista la adaptación o bien, que la adaptación sea menor a concentraciones más altas, ya que se ha demostrado que en prolongados períodos de tiempo, las colonias logran adaptarse (Álvarez y Guevara, 2003; Gale, 1952).

Tabla 5.22. Unidades de colonias degradadoras contra concentración de DDT aplicadas

Concentración UCD UCD (corregidos)

r Error Estadístico

Pendiente (m)

Intersección (x)

100 1,77x105 1,71x105 300 1,54x105 1,57x105 600 1,28x105 1,35x105

1 000 1,12x105 1,06x105

0,95 0,08x105 -72,16 ±

12,11 1,79x105 ± 0,07x105

La Figura 5.5. (siguiente página) muestra la correlación (muy alta) entre UCD y la concentración (%) de DDT, siendo esta negativa (m = -72,16) o inversamente proporcional.

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

1.80

2.00

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

DDT (ppb)

UD

C (

x105 )

Figura 5.5. Correlación entre UCD y concentración (%) de DDT.

5.2.4 Especies aisladas e identificadas En la Tabla 5.23 (siguiente página), se indican las especies de microorganismos identificados por fincas. Se lograron identificar una variedad de microorganismos, entre los que se encuentran bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos. Tanto las bacterias (Pseudomonas sp.) (Kamanavalli y Ninnekar, 2004; Hay y Focht, 1998; Francis et al., 1978; Seubert, 1960), como los Actinomicetos (Streptomyces sp.) (Chacke et al., 1966), los hongos (Aislabie et al., 1997; Bumpus y Aust, 1987) y las levaduras (Kallman y Andrews, 1963) han presentado afinidad por tolerar o degradar plaguicidas, incluyendo el DDT. Por otro lado, el único microorganismo que presenta afinidad por mineralizar DDT son los hongos, resaltando la especie Phanerochaete chrysosporium (Bumpus y Aust, 1987).

Tabla 5.23. Especies y/o géneros de los microorganismos aislados

Finca Nombre Concentración

DDT (ppb)

Crecimiento Microorganismos Género ó Especie

EB 2102 1000 Poco Bacteria Pseudomonas sp.

EB 2103 1000 - - - Actinomicetos Streptomyces sp. EB 3101 1000 Poco

Levaduras - El Bosque

EB 3102 1000 Hongos Phanerochaete chrysosporium

El Trapiche*

- - - - -

Santa Lucía

SL 131 300 Poco Actinomicetos Streptomyces sp.

La Haya LH 3101 1000 - - -

El Hular* - - - - -

EM 161 600 - - -

EM 162 600 Poco Levaduras -

EM 163 600 Poco Levaduras -

EM 164 600 - - - ENMA

EM 331 300 - - -

DM 312 100 Actinomicetos Streptomyces sp.

DM 313 100 - - -

DM 3101 1000 Normal Bacteria Pseudomonas sp. Diano Marino

DM 3102 1000 Normal Actinomicetos Streptomyces sp.

DR 2101 1000 Normal Bacteria Pseudomonas sp.

DR 2103 1000 - - -

DR 2104 1000 Poco Bacteria Pseudomonas sp. Dos Reyna

DR 311 100 - - -

LP 261 600 - - -

LP 262 600 Poco Hongo Phanerochaete chrysosporium

LP 331 300 - - -

LP 332 300 Normal Hongo Phanerochaete chrysosporium

LP 361 600 - - -

LP 362 600 Poco Hongos Phanerochaete chrysosporium

LP 3101 1000 Poco Hongos Phanerochaete chrysosporium

LP 3102 1000 Poco Levaduras -

La Pita 2

LP 3103 1000 Poco Bacterias Pseudomonas sp. *No se lograron aislar colonias puras de las Finca El Trapiche y El Hular

En las Figuras 5.6 y 5.7 se pueden observar una especie aisladas de bacteria (Pseudomonas sp.) y una de hongo (Phanerochaete chrysosporium).

Figura 5.6. Microorganismo identificado: Pseudomonas sp.

Figura 5.7. Microorganismo identificado: Phanerochaete chrysosporium.

5.2.5 Relación entre colonias aisladas y concentración de DDT En la Tabla 5.24 se puede observar que 13 de las 45 colonias que se intentaron aislar a una concentración de 1000 ppb, lograron desarrollarse, tendencia que disminuyó en las concentraciones menores, tanto así que sólo 3 de 45 colonias lograron desarrollarse a una concentración de 100 ppb. Si bien la relación entre las colonias aisladas y concentración de DDT no formó parte de nuestro estudio, es interesante ver la relación de que a mayor concentración de DDT, hay mayor probabilidad de aislar las colonias (r = 0,98).

Tabla 5.24. Colonias aisladas contra Concentración de DDT

Concentración No de

colonias aisladas

No de colonias aisladas

(corregidas)

r Error

Estadístico Pendiente

(m) Intersección

(x)

100 3 2 300 4 5 600 8 8

1000 13 13 Total 45 45

0,98 0,68 0,01 ±

0,10x10-1 1,24 ± 0,61

La facilidad que tienen los microorganismos para aislarse como cultivos puros en un medio con concentraciones altas de DDT se explica al haber una mayor disponibilidad de éste como fuente de carbono, mientras que a concentraciones menores, existe una menor disponibilidad.

CAPÍTULO VI CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

6.1 Conclusiones El potencial de biodegradación de DDT y sus metabolitos en los suelos objeto es significativo, ya que se logró biodegradar el DDT en un 24,00% y se lograron aislar microorganismos capaces de tolerarlo y biodegradarlo. Las condiciones idóneas para biodegradar los suelos de la Finca El Bosque se dan con la aplicación de dosis de Environoc 201®, inoculadas por 24 horas, con una humedad (22 – 40%) y pH (~7) óptimos. El mayor porcentaje de biodegradación de DDT en 100 días correspondió al Lote 2 (Environoc 201®) con 24,00%, seguido del Lote 3 con 20,00% (Environoc 201® y Estiércol) y del Lote 4 con 13,00% (Environoc 201® y Cachaza). La Temperatura de trabajo (Tw ) no se relaciona fuertemente con el porcentaje de biodegradación de DDT (r = 0,20), pero sí se relaciona sólidamente con la actividad microbiana en el suelo (UFC) (r = 0,86). Se aislaron 18 colonias puras de microorganismos capaces de tolerar o biodegradar DDT, identificándose bacterias (Pseudomonas sp.), actinomicetos (Streptomyces sp.), hongos (Phanerochaete chrysosporium) y levaduras. El mayor crecimiento de colonias tolerantes o degradadoras de DDT (UCD), se produjo a una concentración 100 ppb de DDT. Por su parte, se observó una mayor facilidad de aislamiento de colonias puras, capaces de tolerar o degradar DDT, a una concentración de 1000 ppb de DDT. El costo de bioremediar suelos de uso agrícola contaminados por plaguicidas, en la Zona Sur los Millonarios, se estima de $360m3/año y $26,66m3/mes, lo cual se encuentra relativamente más económico que otras técnicas.

6.2 Recomendaciones Acordar con el Ministerio del Ambiente y de los Recursos Naturales (MARENA) los límites máximos permisibles (lmp) para suelos con fines agrícolas con presencia de plaguicidas. Esto facilitará plasmar las metas ambientales, dentro del Sistema de Gestión Ambiental (SGA) y evaluarlas anualmente. Se propone utilizar E201® en los meses que sea más factible regar los suelos, es decir, en tiempo fuera de zafra. Así se puede dar tratamiento a los suelos 3 meses al año, evaluando anualmente la degradación hasta llegar a una concentración lo suficientemente baja. Utilizar cepas comerciales (E201®) en puntos focales de contaminación, es decir, en derrames accidentales de pesticidas que se den en los almacenes, aeródromo agrícolas o cerca de alguna población y cuerpos de agua. Para posibles estudios de biodegradación de DDT ex situ, se recomienda realizar un ensayo conjunto bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas intercaladas, o bien, que consideren un ambiente aeróbico o anaeróbico facultativo, para analizar el potencial de E201® (o de cualquier otra cepa microbiana comercial) en otro tipo de medio. Para evitar la disminución de la actividad biodegradadora de E201®, se recomienda utilizar aditivos que no presenten en su matriz microorganismos asociados a actividades de descomposición de materia orgánica que pueden entrar en competencia con microorganismos biodegradadores. Para profundizar en el estudio de biodegradación, se recomienda realizar análisis individuales en los que se someta a cada cepa identificada a una concentración inicial de DDT y se evalúe, consecuentemente, durante un período de tiempo establecido y bajo condiciones ambientales controladas, el porcentaje de DDT biodegradado asociado a la actividad biodegradadora del microorganismo objeto de estudio.

ABREVIATURAS

ATSDR: Agency for toxic substances and disease registry DDT: 1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano DDD: 1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofenil)-2,2-dicloroetano DDE: 1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofeni) etileno CIRA: Centro para la Investigación en Recursos Acuáticos CPEHS: Centro Panamericano de Ecología Humana y Salud E201®: Environoc 201® EMBUSA: Embajada de los Estados Unidos en Nicaragua FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nation GC-ECD: Cromatografía de gases por detección de captura de electrones HCH: Hexaclorociclohexano LD50: Dosis letal 50 Lmp: Límite máximo permisible MAGFOR: Ministerio Agropecuario y Forestal MARENA: Ministerio del Ambiente y de los Recursos Naturales MINSA: Ministerio de Salud OC: Organoclorados OMS: Organización Mundial de Salud PAN: Pesticides Action Network PCBs: Bifenilos policlorados SMC: Stauffer Management Company t1/2: Tiempo de vida media

Ts: Temperatura interna del suelo Tw: Temperatura de Trabajo UCD: Unidades de Colonias Degradadoras UFC: Unidades Formadoras de Colonias UNA: Universidad Nacional Agraria UNECE: Comisión Económica Europea de la Organización de las Naciones Unidas UNI: Universidad Nacional de Ingenierías

REFERENCIAS

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ANEXO A

Estructura del DDT y sus metabolitos (ATSDR, 2002b)

Compuesto p,p´-DDT Sinónimos

4,4´-DDT; 1,1,1-tricloro-2,2-bis (p-clorofenil)etano; diclorodifenil tricloroetano; DDT; 1,1´-(2,2,2-tricloroetilideno)bis(4-cloro-benceno); a-a-bis(p-clorofenil)-ß-ß-ß-tricloroetano

Nombres de Marcas Registradas Genitox, Anofex, Detoxan, Neocid, Gesarol, Pentaclorin, Dicofan, Clorofenotan

Fórmula Química C14H9Cl5

Estructura Química

Compuesto p,p´-DDE Sinónimos

4,4´-DDE: diclorodifenil-dicloroetano; 1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofeni) etileno; 1,1´-(2,2-dicloroetilideno)nis(4-clorobenceno); DDE

Nombres de Marcas Registradas Ninguno

Fórmula Química C14H8Cl4

Estructura Química

Compuesto p,p´-DDD Sinónimos

4,4´-DDD; DDD; 1,1-dicloro-2,2-bis(p-clorofenil)-2,2-dicloroetano; TDE; tetraclorodifeniletano Nombres de Marcas Registradas

DDD, Rotano, Dileno, TDE Fórmula Química

C14H10Cl4 Estructura Química

Compuesto o,p´-DDT Sinónimos

4,4´-DDT;1,1,1-tricloro-2-(o-clorofenil)-2-(p-clorofenil)-etano; o,p -́diclorodifeniltricloroetano Nombres de Marcas Registradas

Ninguno Fórmula Química

C14H9Cl5

Estructura Química

Compuesto o,p´-DDE Sinónimos

2,4´-DDE; 1,1-dicloro-2-(o-clorofenil)-2-(p-clorofenil) etileno; 1-cloro-2-(2,2-dicloro-1-(4-clorofenil)etenilbenceno

Nombres de Marcas Registradas Ninguno

Fórmula Química C14H8Cl4

Estructura Química

Compuesto o,p´-DDD Sinónimos

2,4´-DDD; mitotano; o,p´-DDD; 1,1-dicloro-2-(o-clorofenil)-2-(p-clorofenil)etano; o,p´-TDE; Choditano; 2-(o-clorofenil)-2-(p-clorofenil)-1,1-dicloroetano

Nombres de Marcas Registradas Lysodren

Fórmula Química C14H10Cl4

Estructura Química

Anexos B

Hojas de trabajo

Fichas de trabajo (in situ) para el muestreo del Ensayo de biodegradación

Finca: El Bosque Fecha: Hora

Calicatas UTM Lat./ Long.

Altitud (m)

Tamb (ºC)

Ts (°C)

pH Humedad (%)

1

2

3

4

5

6

7

Promedio

Fichas de trabajo (ex situ) para el Muestreo del Ensayo de Búsqueda e

Identificación de microorganismos Finca: Fecha: Hora

Puntos UTM Lat./ Long.

Altitud (m)

Tamb (ºC)

Ts (°C)

pH Humedad (%)

1 2 3 4 5 6

…

Promedio

Fichas de trabajo ex situ para el Ensayo de biodegradación

Fecha XX-XX-07

Hora XX:XX

Día X Tam

b (°C)

Tsuel

o (°C)

Tw (°C

)

UFC

ph

Humedad (%)

Agua (L)

Inoculo (ml)

DDT (ppb

)

Volteo

Lote 1 Blanco Lote 2 201

Lote 3 201+Estiérc

ol

Lote 4 201+Cachaz

a Control

1 Estiércol Control

2 Cachaza Clima

Observaciones

Anexos C

Coordenadas Fincas

Ubicación de la las fincas en la zona de estudio (El Viejo, Chinandega)

Fuente: Terra Metrics, 2008; Europa Technologies, 2008; Digital Globe, 2008.

Finca: El Bosque Fecha: 24/04/2007

Calicatas UTM Lat./Long. Altitud (m)

1395393N 12º 37' 21N 1

16 471181W 087º 15' 55W 17

1395335N 12º 37' 19N 2

16 471718W 087º 15' 38W 21

1394442N 12º 36' 50N 3

16 471677W 087º 15' 39W 14

1394943N 12º 37' 06N 4

16 472101W 087º 15' 25W 23

1395013N 12º 37' 08N 5

16 472142W 087º 15' 23W 18

1394781N 12º 37' 01N 6

16 471401W 087º 15' 48W 18

1394985N 12º 37' 07N 7

16 47184W 087º 15' 52W 22

Finca: El Trapiche Fecha: 26/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1390059N 12º 34' 27N 1

16 483783W 087º 08' 57W 11

Finca: ENMA Fecha: 25/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1397603N 12º 38' 33N 1

16 475234W 087º 13' 41W 36

1397686N 12º 38' 35N 2

16 475604W 087º 13' 29W 25

1397512N 12º 38' 30N 3

16 475905W 087º 13' 39W 26

Finca: La Haya Fecha: 26/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1396477N 12º 37' 56N 1

16 470861W 087º 16' 06W 35

1402479N 12º 37' 37N 2

16 474297W 087º 16' 15W 32

1396168N 12º 37' 46N 3

16 470725W 087º 16' 10W 37

1396071N 12º 37' 43N 4

16 470976W 087º 16' 02W 32

1395918N 12º 37' 35N 5

16 470371W 087º 15' 57W 35

Finca: El Hular Fecha: 25/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1395315N 12º 37' 18N 1

16 479607W 087º 11' 16W 34

1395135N 12º 37' 12N 2

16 479584W 087º 11' 17W 31

1394856N 12º 37' 03N 3

16 479534W 087º 11' 18W 27

1394705N 12º 36' 58N 4

16 479503W 087º 11' 19W 32

1395464N 12º 36' 51N 5

16 479509W 087º 11' 19W 30

1394739N 12º 37' 00N 6

16 480262W 087º 10' 54W 31

1395018N 12º 37' 09N 7

16 480334W 087º 10' 52W 34

1395259N 12º 37' 17N 8

16 480343W 087º 10' 52W 37

Finca: La Pita 2 Fecha: 25/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1393808N 12º 36' 29N 1

16 469540W 087º 16' 50W 13

1393401N 12º 36' 16N 2

16 469346W 087º 16' 56W 7

1392913N 12º 36' 00N 3

16 468840W 087º 17' 13W 11

1392984N 12º 36' 02N 4

16 468684W 087º 17' 18W 20

1388748N 12º 36' 18N 5

16 469951W 087º 17' 13W 0

1393838N 12º 36' 30N 6

16 468701W 087º 17' 17W 23

Finca: Diano Marino Fecha: 25/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1399727N 12º 39' 42N 1

16 423630W 087º 14' 34W 19

1400241N 12º 39' 59N 2

16 473760W 087º 14' 30W 23

1400538N 12º 40' 08N 3

16 473471W 087º 14' 40W 26

1400662N 12º 40' 12N 4

16 474011W 087º 14' 22W 20

1401225N 12º 40' 31N 5

16 473756W 087º 14' 30W 22

1401311N 12º 40' 33N 6

16 473547W 087º 14' 37W 18

Finca: Dos Reyna Fecha: 25/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1393592N 12º 36' 22N 1

16 469669W 087º 16' 45W 28

1393754N 12º 36' 27N 2

16 469752W 087º 16' 43W 28

1393510N 12º 36' 19 N 3

16 470180W 087º 16' 14W 16

1393340N 12º 36' 14N 4

16 470083W 087º 16' 32W 26

1393208N 12º 36' 12N 5

16 470526W 087º 16' 17W 22

1393108N 12º 36' 06N 6

16 470406W 087º 16' 21W 18

1392768N 12º 35' 55N 7

16 471026W 087º 16' 00W 20

1392891N 12º 35' 59 N 8

16 471095W 087º 15' 58W 30

1392534N 12º 35' 48N 9

16 471496W 087º 15' 45W 20

Finca: Santa Lucía Fecha: 26/04/2007

Puntos UTM Lat./Long. Altitud (m)

1395874N 12º 37' 36N 1

16 472589W 087º 15' 09W

18

1395989N 12º 37' 40N 2

16 472638W 087º 15' 07W

16

1395784N 12º 37' 33N 3

16 473132W 087º 14' 51W

21

1395534N 12º 37' 25N 4

16 473449W 087º 14' 40W

22

1396191N 12º 37' 47N 5

16 473637W 087º 14' 34W

17

Anexo D

Resultados Tw, Humedad (%) y pH

Temperatura de trabajo (Tw)

Días

0 1 4 7 9 10 11 14 16 21

Lote 1 (Testigo) 4,00 5,00 0,00 1,00 3,00 4,00 0,00 0.00 3,00 0,00

Lote 2 (Environoc 201 ®) 3,00 4,00 0,00 1,00 5,00 5,00 1,00 1,00 2,00 2,00

Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol) 6,00 7,00 3,00 2,00 4,00 6,00 3,00 4,00 4,00 2,00

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) 2,00 3,00 1,00 0,00 2,00 5,00 0,00 -2,00 2,00 0,00

Control 1 (Estiércol) 6,00 7,00 3,00 2,00 4,00 6,00 0,00 2,00 2,00 -1,00

Control 2 (Cachaza) -1,00 0,00 -1,00 -1,00 1,00 3,00 -2,00 -1,00 1,00 -2,00

Días

23 24 28 30 31 34 35 37 38 41

Lote 1 (Testigo) 0,50 -0,60 0,00 0,00 -0,80 -1,30 -0,60 0,00 -0,30 0,90

Lote 2 (Environoc 201 ®) -0,60 -1,00 2,00 1,00 -1,30 -1,00 0,90 -0,60 -0,20 0,30

Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol) 1,70 -0,30 3,00 1,00 -1,20 -0,30 1,40 -0,50 -1,80 1,10

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) -0,80 -1,20 2,00 2,00 -1,90 -0,30 -0,10 -1,80 -2,30 -0,40

Control 1 (Estiércol) 2,00 -1,40 2,00 1,00 -1,50 -3,00 -0,30 -2,00 -1,80 0,60

Control 2 (Cachaza) 0,00 -2,20 -0,20 1,00 -1,40 -4,40 -1,40 -2,94 -2,10 -2,80

Días

42 45 48 49 50 52 56 57 58 59

Lote 1 (Testigo) -1,50 5,10 -0,80 8,20 0,40 0,70 1,00 1,30 1,00 0,20

Lote 2 (Environoc 201 ®) -2,40 6,90 -2,70 8,30 0,00 0,10 0,20 0,50 0,20 -0,50

Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol) -1,30 7,30 -1,00 9,20 2,00 1,60 1,20 1,50 1,20 2,50

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) -2,00 5,40 -1,00 7,10 0,20 0,00 -0,20 0,10 -0,20 -0,20

Control 1 (Estiércol) -2,90 4,30 -1,20 7,10 0,10 0,10 0,00 0,30 0,00 -0,10

Control 2 (Cachaza) -5,40 4,20 -4,60 4,60 -2,60 -1,90 -1,20 -0,90 -1,20 -0,30

Días

65 66 69 70 71 73 76 78 80 65

Lote 1 (Testigo) -0,40 -2,00 -0,50 -0,10 1,60 -0,20 -0,50 2,90 2,60 -0,40

Lote 2 (Environoc 201 ®) -1,10 -1,90 0,40 0,50 2,20 0,40 0,10 4,10 3,50 -1,10

Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol) 1,90 1,10 1,90 3,40 3,20 2,30 2,50 4,80 4,00 1,90

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) -0,80 -1,50 1,20 1,40 1,80 0,60 0,70 3,90 3,10 -0,80

Control 1 (Estiércol) -0,70 -1,50 0,80 0,80 1,40 0,10 0,10 3,50 2,20 -0,70

Control 2 (Cachaza) -0,90 -2,00 0,40 -2,30 -1,30 -2,70 -2,80 3,70 2,10 -0,90

Días

83 85 87 90 93 97 99

Lote 1 (Testigo) 3,60 1,60 -0,40 1,00 -1,00 0,20 1,40

Lote 2 (Environoc 201 ®) 4,20 2,00 -0,10 1,30 -0,90 0,30 0,80 Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol)

4,60 2,90 1,20 2,20 2,30 1,70 1,10

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) 3,70 1,50 -0,70 1,30 -3,30 0,10 0,10

Control 1 (Estiércol) 2,20 0,80 -0,70 1,10 1,90 -0,90 0,10

Control 2 (Cachaza) 1,90 -1,00 -4,00 -0,40 -2,99 -2,70 -0,50

Humedad (%)

Días

0 4 7 14 23 35 38 42 50 65 73 83 93 99

Lote 1 (Testigo) 18.80 32.20 30.30 28.00 30.00 24.00 22.50 28.50 27.20 23.10 27.13 29.86 23.81 25.64

Lote 2 (Environoc 201 ®) 43.40 31.40 31.30 30.80 28.60 27.20 25.70 29.10 29.50 25.60 30.85 34.04 27.23 29.57

Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol)

13.40 35.00 35.37 35.33 30.20 28.20 27.50 30.20 31.30 26.60 29.92 32.99 26.38 28.59

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza)

29.80 36.60 35.10 33.20 34.80 26.80 25.20 32.10 29.80 27.10 31.63 34.91 27.95 30.39

Control 1 (Estiércol) 29.00 34.00 34.40 34.40 33.80 28.60 27.20 33.50 33.10 28.50 32.22 35.57 28.49 31.01

Control 2 (Cachaza) 34.20 33.60 32.70 31.40 31.60 28.00 26.90 36.20 35.00 30.40 32.56 35.95 28.80 31.37

pH

Días

0 4 7 14 23 30 38 42 50 65 73 83 93 99

Lote 1 (Testigo) 6.30 6.37 6.42 5.99 6.09 6.10 5.97 6.24 6.12 5.99 6.18 6.13 5.98 6.15

Lote 2 (Environoc 201 ®) 6.30 7.09 6.53 6.08 6.71 6.23 6.09 6.28 6.09 6.08 6.36 6.34 6.03 6.34 Lote 3 (Environoc 201 ® +Estiércol) 6.30 6.89 6.47 6.87 6.85 5.99 5.94 6.70 6.35 5.99 6.45 6.43 6.01 6.43

Lote 4 (Environoc 201 ® + Cachaza) 6.30 6.92 6.48 6.79 6.79 5.92 5.90 6.65 6.24 5.93 6.41 6.39 6.27 6.39

Control 1 (Estiércol) 6.30 6.52 6.36 7.03 6.66 5.97 5.89 6.82 6.25 5.92 6.38 6.36 6.45 6.36

Control 2 (Cachaza) 6.30 6.90 6.48 6.68 6.69 5.86 5.87 6.57 6.25 5.91 6.36 6.34 5.98 6.35

Anexo E

Enrinonoc 201 ® y Environbrew ®

Anexo F

Hojas de Seguridad y Certificados