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Moléculas de guía axonal en la retina de teleósteos

-Trabajo de Fin de Grado-

Marcos Sande Melón

Salamanca, 2013

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

Índice

Agradecimientos

Abreviaturas

Introducción

1. Antecedentes

1.1 Migración de las células ganglionares Pág. 1

1.2 Cono de crecimiento Pág. 1

1.3 Estructura del nervio óptico Pág. 2

1.4 Componentes del nervio óptico Pág. 2

1.5 Moléculas de guía axonal Pág. 4

1.6 Netrinas Pág. 4

1.7 Efrinas Pág. 5

1.8 Slit Pág. 7

1.9 Semaforinas Pág. 8

1.10 Pax2 Pág. 9

2. Hipótesis Pág. 10

3. Justificación Pág. 10

4. Objetivos Pág. 10

Materiales y métodos

5.1 Animales de experimentación Pág. 11

5.2 Grupos experimentales Pág. 11

5.3 Axotomización del nervio óptico Pág. 11

5.4 Extracción de los ojos del pez cebra Pág. 12

5.5 Procesamiento histológico Pág. 12

5.6 Inmunohistoquímica Pág. 13

5.7 Marcadores utilizados Pág. 14

5.8 Procesamiento de imágenes Pág. 15

Resultados y discusión

6.1 Resultados Pax2 Pág. 16

6.2 Resultados Sox10 Pág. 21

Conclusiones Pág. 25

Bibliografía Pág. 26

Esos besos citoplasmáticos que parecen constituir el éxtasis final de una épica historia de amor

de Santiago Ramón y Cajal.

Agradecer toda la ayuda y paciencia que he recibido durante este trabajo y durante mi formación en

el laboratorio a Héctor, Fernando, y Adrián, que sin ellos no sabría todo lo que sé hoy en día.

A todos los profesores que nos enseñan con placer y que siguen manteniendo interés una vez

finaliza la clase.

A todos mis amigos biólogos, Noelia, Becky, Mario, Víctor, Diego, Usa y Patri, porque llegamos al

final de la carrera y cada uno se va para un lugar diferente, pero hemos pasado cuatro años

maravillosos. No me despido porque seguimos el mismo camino.

A mis padres y mi hermana por subvencionarme la carrera y calmarme antes de los exámenes de

botánica.

A la primera persona que apostó por mí y me dio la oportunidad de aprender a ser científico.

Muchas gracias por estos cuatro años, esperemos que sean muchos más juntos.

Abreviaturas

CNO: Cabeza del nervio óptico

CFNO: Capa de fibras del nervio óptico

DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol

DO: Disco óptico

DCC: Receptor ausente en el cáncer colorrectal

MS-222: Metanosulfato de tricaína

PBS: Tampón fosfato salino

QO: Quiasma óptico

RGCs: Células ganglionares de la retina

RTK: Receptor de la tirosina kinasa

Sema5A: Semaforina 5A

Shh: Sonic Hedgehog

SIO: Segmento intraorbital

TP: Tampón fosfato

TR: Tracto óptico

TSP: Trombospondina

Introducción

1

Antecedentes

1.1 Migración de las células ganglionares

La retina es una estructura sensible a la luz, con fotorreceptores, que presenta una estructura

histológica laminar en la que se distinguen diferentes capas, formadas por diferentes tipos celulares.

En la capa de las células ganglionares, encontramos las células ganglionares de la retina (RGCs),

cuyos axones forman el nervio óptico (NO). El desarrollo del nervio óptico ha sido muy estudiado y

es fácilmente manipulable experimentalmente (Inatani, 2005). Los axones de las células

ganglionares navegan desde la retina hasta centros diana del diencéfalo, mesencéfalo y telencéfalo,

contactando con numerosas moléculas de guía axonal que intervienen en pasos críticos permitiendo

guiar a los axones. Las bases moleculares de esta migración comienzan a descubrirse. Así,

diferentes moléculas están implicadas en la correcta migración de los axones hacia sus objetivos,

entre ellas tenemos las Netrinas, Robo y Slit, Efrinas que juegan un papel fundamental (Erskine y

Herrera, 2007). También existen otros factores, como morfógenos, que actúan directamente en la

guía de los axones de las células ganglionares, como Sonic hedgehog (Shh).

1.2 Cono de crecimiento

Los axones que están creciendo finalizan en una estructura conocida como el cono de

crecimiento. El cono de crecimiento es una estructura sensitivo motora que reconoce señales

atrayentes y repelentes, regulando el citoesqueleto y determinando el crecimiento del axón en una

dirección. El cono de crecimiento está formado por diferentes estructuras: la región central, los

filopodios y los lamelopodios. La región central posee microtúbulos y mitocondrias. Los filopodios

son unas estructuras muy móviles, ricas en actina, y responsables de la integración de la

información exterior. Dicha información actúa sobre segundos mensajeros que provocan la

reorganización del citoesqueleto regulando la dirección y velocidad del crecimiento del axón. El

calcio es un segundo mensajero muy importante, la movilidad del cono de crecimiento es óptima en

una concentración adecuada de calcio, el llamado punto de posición. El calcio, junto con los

nucleótidos cíclicos, intervienen en la regulación de las proteín kinasas, proteín fosfatasas, y Rho

GTPasas permitiendo que el cono de crecimiento crezca, se retraiga o gire (Round y Stein, 2006).

Los microtúbulos migran desde la región central hacia una protuberancia recién creada permitiendo

que el cono de crecimiento se desplace hacia adelante. En la nueva porción del cono de crecimiento

se formarán de nuevo los lamelopodios y los filopodios (Kandel, 2004).

2

1.3 Estructura del nervio óptico

El nervio óptico está formado por axones de las células ganglionares y células gliales, todo ello

rodeado por las meninges. En el nervio óptico de teleósteos se distinguen tres regiones diferentes.

La primera, el segmento prequiasmático, que a su vez se divide en dos porciones: el segmento

intraocular (CNO) y el segmento extraocular o intraorbital (SIO). La segunda, el quiasma óptico

(QO). La tercera, el segmento postquiasmático o tracto óptico (TR; Parrilla-Monge, 2010).

1.3.1 Cabeza del nervio óptico

La cabeza del nervio óptico es la zona de transición que se encuentra entre la retina y el

segmento intraorbital. En esta región solo están presentes los axones de las células ganglionares y

células gliales. Las moléculas de guía axonal se expresan de manera diferencial en esta zona,

jugando un papel esencial durante el desarrollo del sistema visual, regeneración y crecimiento

continuado, como es el caso de los teleósteos y anfibios.

1.4 Componentes del nervio óptico

Astrocitos: Son células gliales presentes en el nervio óptico, así como, en la retina. En la retina

madura de los vertebrados se encuentran en la capa de fibras del nervio óptico (CFNO). Sus somas

se disponen entre los axones de las células ganglionares y sus prolongaciones se extienden sobre

varios fascículos nerviosos. En teleósteos se denominan astrocitos reticulares (Maggs y Scholes,

1990). Los astrocitos sirven de sostén, y permiten la nutrición de los axones de las células

ganglionares. Además, juegan un papel fundamental en la guía axonal y en el empaquetamiento de

los axones. Ultraestructuralmente presentan un núcleo eucromático, redondeado y con identaciones.

Figura 1. Esquema del cerebro de un teleósteo.

BO: bulbo olfatorio; CB: cerebelo; CNO: cabeza

de nervio óptico; OD: ojo derecho; OI: ojo

izquierdo; QO: quiasma óptico; SIO: segmento

intraorbital; TEL: telencéfalo; TO: techo óptico;

TR: tracto óptico. Extraído de Parrilla-Monge,

2010.

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Figura 2. Micrografía de microscopia electrónica

de transmisión de dos astrocitos fibrosos. AsP:

Proceso astrocitario, ER: Retículo endoplasmático, f:

filamentos intermedios, G: gránulo de glucógeno; mit:

mitocondria, Nuc: Núcleo. Extraído de Peter et al.,

1991.

Oligodendrocitos: Son células gliales que se encuentran en el nervio óptico (NO) y en la CFNO

en teleósteos (Lillo et al., 1998). Los oligodendrocitos presentan una gran variedad morfológica y

ramificación en sus procesos. Su soma es pequeño y redondeado. Micrografías de microscopia

electrónica muestran que los oligodendrocitos son más electrodensos que los astrocitos, con el

núcleo en posición lateral e irregular.

Su función es formar la vaina de mielina de los axones de las células ganglionares.

Microglía: Está presente en la retina y en el nervio óptico. Existen dos tipos de microglía, la

microglía residente o ramificada en estado latente, que en situaciones patológicas se transforma en

microglía ameboide o reactiva. Ésta última tiene una gran capacidad de migración y fagocita

desechos celulares (Parrilla-Monge, 2010).

Figura 3. Micrografía de microscopia

electrónica de transmisión de un

oligodendrocito. ER: Retículo

endoplasmático, mit: mitocondria, N:

Núcleo, OL: Oligodendrocito. Extraído de

Peters et al., 1991.

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1.5 Moléculas de guía axonal

Las moléculas de guía axonal son señales moleculares que permiten a los axones llegar a su

destino tras una serie de pasos individuales, permitiendo que el cono de crecimiento viaje a través

de la retina hacia el disco óptico y posteriormente a la cabeza del nervio óptico para abandonar la

retina.

1.6 Netrina

Las netrinas son una familia de proteínas extracelulares secretadas que

regulan la migración de neuronas y de los conos de crecimiento (Barallobre

et al., 2005). Estas proteínas bifuncionales pueden actuar como

quimioatrayentes y quimiorepulsoras, interaccionando con receptores

específicos DCC y UNC-5 (Rajasekharan y Kennedy, 2009). La Netrina-1

está conservada en diversas especies animales (Ko et al., 2012), incluyendo

el pez cebra, donde se ha observado la relación entre la expresión de Netrina-

1 y el crecimiento axonal (Lauderdale et al., 1997). La netrina 1a del pez

cebra comparte un alto grado de similitud de aminoácidos con la netrina-1

del pollo y del ratón (Lauderdale et al., 1997). Este alto grado de similitud se encuentra en el

dominio V, homólogo de la laminina (Lauderdale et al., 1997).

La unión de la netrina-1 a sus receptores, provoca una cascada de activación en el citoplasma y

cambios en el citoesqueleto, permitiendo el desarrollo del cono de crecimiento para llegar a su

destino (Moore et al., 2007). Varias señales de transducción y moléculas efectoras se han visto

implicadas en la respuesta a netrina-1, tales como RhoGTPasas, MAP-kinasas, segundos

mensajeros y proteína 1B asociada a microtúbulos (Barallobre et al., 2005).

Figura 5. Comparación del

grado de similitud entre

netrinas. La netrina-1 está muy

conservada evolutivamente entre

diferentes especies. Siendo la

netrina-1a del pez cebra muy

similar a la netrina-1 de ratón y

pollo. Extraído de Lauderdale et

al., 1997.

Figura 4. Estructura

Netrina-1. Extraído de

Rajasekharan y

Kennedy, 2009

5

Los axones han de abandonar la retina a través del disco

óptico. En esta región, el neuroepitelio expresa netrina-1, que

interacciona con el receptor DCC de los axones (Deiner et al.,

1997) y permite que el cono de crecimiento abandone la retina

(De la Torre et al., 1997). Experimentos in vivo e in vitro han

mostrado una relación espacio-temporal entre la expresión de

la Netrina-1 y el desarrollo del cono de crecimiento axonal de

las RGCs en embriones de pez cebra (Lauderdale et al., 1997).

Así, experimentos in vitro han demostrado que la netrina-1

promueve el crecimiento del axón dependiendo de la dosis,

teniendo un máximo desarrollo con una dosis de 100 ng/ml de

netrina-1, observándose que a mayores dosis los axones

crecen menos en ratón (Deiner et al., 1997) y tienen un

máximo desarrollo con 300ng/ml en Xenopus (De la Torre et

al., 1997). La comparación de ojos de embriones mutantes para netrina-1 y ojos de embriones

control demuestran que la netrina-1 es esencial para la guía axonal, pero no para el proceso de

morfogénesis de los axones de las RGCs. En los ojos de embriones mutantes se observa que los

axones de las RGCs se extienden correctamente por la capa de las fibras del nervio óptico (CFNO),

sugiriendo que aquí no interviene la señalización por netrina-1, pero al llegar al disco óptico

muchos axones se extienden hacia otras regiones, sin salir hacia el nervio óptico. Otros estudios

han descrito que la expresión de la netrina-1 en la proximidad de la cabeza del nervio óptico

incrementa la complejidad del cono de crecimiento in vitro (De la Torre et al., 1997). Todo esto

indica que la netrina-1 es esencial en la guía axonal en el disco óptico y de la retina.

1.7 Efrinas

Las efrinas y sus receptores Eph intervienen en la comunicación célula a célula, siendo muy

importantes en la migración celular y en la guía axonal. La familia de las efrinas está formada por

nueve efrinas diferentes, que se clasifican según la afinidad que posean en su unión, como efrina A

o efrina B, según se una al receptor EphA o EphB respectivamente (Goldhsmith et al., 2006). Los

receptores Eph son una gran familia de receptores tirosina kinasa (RTK; Nikolov et al., 2013). En

vertebrados se han descrito dieciséis tipos diferentes de receptores Eph, diez EphA y seis EphB.

Los receptores Eph de los axones de las células ganglionares de la retina interaccionan con

efrinas, permitiendo su desarrollo normal. Intervienen en el establecimiento de mapas topográficos

y guía axonal hacia el disco óptico en la retina. EphB guía directamente a los axones hacia el disco

Figura 6. Sección sagital de la

cabeza del embrión de ratón E14

mostrándose la inmunorreactividad

en color rojo de la netrina-1.

Diamino Fenilindol de color azul

oscuro muestra el neuroepitelio y

núcleos de las células vasculares.

Extraído de Deiner et al., 1997.

6

óptico, para que salgan de la retina (Cordeiro et al., 2007). La ausencia de EphB2 y EphB3

incrementa la frecuencia de errores en la guía de los axones de las RGCs hacia el disco óptico. Los

errores originados dentro de la retina no están directamente relacionados con la actividad tirosina

kinasa de EphB. Los receptores EphB actúan de manera independiente a kinasa para mediar la guía

axonal dentro de la retina, ya que es el dominio extracelular de EphB el que guía potencialmente a

los axones.

Los errores que se producen en la guía axonal cerca del disco óptico de los dobles mutantes Eph2

EphB3 (Birgbauer et al., 2000) son similares a los defectos en la guía axonal vistos en netrina-1 y

embriones deficientes en DCC (Deiner et al., 1997). Sin embargo, los defectos en netrina-1 y DCC

son mucho más severos, provocando que la mayoría de los axones estén afectados y resulta en la

hipoplasia del disco óptico (Deiner et al., 1997).

El receptor EphB se expresa en la parte ventral de la retina. Se ha descrito que su dominio

extracelular puede actuar como una señal inhibidora en la guía de los axones de la retina, actuando

como un mecanismo de corrección para que los axones de la retina dorsal, que se expanden en

dirección ventral, no crezcan erróneamente en la parte ventral de la retina sino hacia el disco óptico

(Birgbauer et al., 2001).

Figura 7. Modelo de proteína Eph

actuando como señal de guía axonal

inhibidora. En la retina normal hay un

gradiente ventral-alto a dorsal-bajo. Los

axones dorsales crecen hacia la zona

ventral, la inhibición resultante genera

una gran fasciculación y la guía directa

hacia el disco óptico. Los dobles mutantes

EphB2 y EphB3 presentan crecimiento

hacia la parte ventral y defectos de

desfasciculación alrededor del disco

óptico. Extraído de Birgbauer et al., 2001.

7

Figura 8. A-B) Animales control, presentan un crecimiento

correcto hacia el disco óptico de los axones de las RGCs. Con la

tinción mediante DiI, se observan los axones en rojo. El disco

óptico está representando mediante un círculo discontinuo. E-F) son

dobles mutantes EphB2-EphB3 en los que se observa errores en la

migración y axones que no se desplazan dentro del disco óptico.

Modificado de Birgbauer et al., 2000.

1.8 Slit

Slit contiene 4 dominios repetidos ricos en leucina en el extremo N-terminal, seguido de siete a

nueve dominios EGF, un dominio laminina G (Morlot et al., 2007) y un módulo rico en cisteína en

el extremo C-terminal. El receptor de Slit es robo, el cual contiene 5 dominios similares a

inmunoglobulina y tres dominios de fibronectina tipo III (Morlot et al., 2007).

Slit y su receptor Robo son esenciales para que los axones de las RGCs migren correctamente en

el sistema visual de vertebrados (Thompson et al., 2009). Slit1 y Slit2 son moléculas

quimiorrepelentes que se encuentran en el tracto óptico (Thompson et al., 2006), y solo Robo1 y

Robo2 se expresan en las RGCs (Erskine et al., 2000). En la retina dorsal, Slit controla la polaridad

inicial del crecimiento de los axones de las RGCs y evita que los axones de las RGCs se localicen

en la retina ventral (Thompson et al., 2006). Las proteínas Robo1 y Robo2 están presentes en la

capa de las RGCs y en los axones, en la cabeza del nervio óptico, así como en otras regiones del

desarrollo de la vía óptica (Thompson et al., 2009).

Figura 9. Sección coronal de la retina

teñida mediante hibridación in situ.

Se observa la expresión del mRNA de

robo1 y robo2 en las células

ganglionares de la retina. Extraído de

Thompson et al., 2007.

8

Slit y Robo no son necesarios para la entrada de los axones de las células ganglionares en el

nervio óptico, ya que se ha descrito que en las retinas deficientes en Slit1/2 y deficientes en robo2,

el número de errores en la guía axonal hacia el disco óptico no aumenta. La mayoría de los axones

originados desde la retina dorsal y ventral se extienden normalmente hacia afuera del ojo. En un

pequeño número de casos se han encontrado axones que no salen por el disco óptico (Fig.10). Sin

embargo, tanto la incidencia como la severidad de estos errores son indistinguibles de los

observados en las retinas control (Thompson et al., 2009).

1.9 Semaforinas

Las Semaforinas son una gran familia de proteínas que participan en la guía axonal, en la

migración celular y en la morfogénesis (Zheng et al., 2008). La semaforina 5A (Sema5A), es una

proteína transmembrana que se expresa en las células neuroepiteliales del disco óptico y a lo largo

del nervio óptico (Oster et al., 2003).

La semaforina 5A inhibe el crecimiento de los axones de las células ganglionares por sí misma y

en combinación con la netrina-1, laminina o L1 (Oster et al., 2003). La alteración de la función de

Sema5A con anticuerpos bloqueantes, da lugar a que algunos axones se desvíen de la ruta principal

(Zheng et al., 2008). Algunos axones no abandonan la retina por el disco óptico y se proyectan

erróneamente dentro de la retina (Zheng et al., 2008), indicando la importancia de la semaforina 5A

en la guía axonal hacia el nervio óptico.

Las Semaforinas clase V son únicas ya que contienen un dominio sema y 7 repetidos de

trombospondina tipo1 en sus dominios extracelulares. La actividad inhibidora de la Sema5A está

dentro de su dominio sema, como ha sido descrito en la Sema3A (Koppel et al., 1997).

Adicionalmente, la actividad inhibidora total requiere de otras regiones en el dominio extracelular.

Figura 10. Cuantificación de

errores en la guía axonal

hacia el disco óptico. Slit y

Robo no intervienen en la guía

de axones en la retina, ya que

no hay diferencias

significativas entre el fenotipo

salvaje y los fenotipos

deficientes en Slit y Robo.

Thompson et al., 2009

9

Otro aspecto único de la semaforina clase V son los siete repetidos tipo 1 de trombospondina

(TSP) en el dominio extracelular. Los repetidos de trombospondina combinados con el dominio

semaforina claramente resultan en una molécula con actividad inhibidora para el crecimiento de los

axones. Gracias a los repetidos de TSP la sema5A se puede asociar con otras proteínas (Oster et

al., 2003).

1.10 Pax2

Las proteínas Pax son una familia de factores de transcripción conservados durante la evolución.

Esta familia de genes pax se caracterizan por la presencia de un dominio paired- domain de unión

al ADN de 128 aminoácidos altamente conservado (Czerny et al., 1993). Este dominio se encuentra

en el extremo N-terminal y es el responsable de reconocer los genes diana.

Se ha comprobado que Pax2 es un factor de transcripción esencial para la formación del ojo y

que la expresión se mantiene en estado adulto (Macdonald et al., 1997). En teleósteos adultos, Pax2

se conserva en una población de astroglía perteneciente a astrocitos reticulares y a la glía limitante

en el NO y la CNO. En otros modelos animales, tales como el ratón, los astrocitos de la CNO, así

como, los astrocitos de la CFNO son positivos para Pax2, pero en rata la expresión disminuye en el

estado adulto. Además, en humanos la síntesis de Pax2 está presente en astrocitos de una región que

rodea la CNO. Se piensa que Pax2 interviene en la guía axonal de los axones de las RGCs.

Figura 11. Tinción mediante hibridación in situ

de la semaforina 5A.

A. Hibridación in situ de Sema5A en el disco

óptico y a lo largo del tracto óptico.

B. Hibridación in situ de Sema5A en el disco

óptico

E. Hibridación in situ de Sema5A en el tracto

óptico.

Extraído de Oster et al., 2003.

Hipótesis, justificación y

objetivos

10

Hipótesis de trabajo La expresión y la función del factor de transcripción pax2 se conserva en el pez cebra adulto

(Danio rerio), permitiendo la guía de los axones hacía el disco óptico para abandonar la retina.

Justificación

En los teleósteos, el desarrollo ocular no cesa y se mantiene durante el estado adulto. Por ello en

este trabajo, pretendemos estudiar la guía de los axones en la retina del pez cebra adulto, analizando

la distribución del factor de transcripción Pax2, el cual interacciona con otras moléculas de guía

axonal como la netrinas y efrinas.

Se han realizado pocos estudios de guía axonal durante el estado adulto de los teleósteos, y no

existen estudios que muestren si la función de Pax2 se mantiene en el pez cebra adulto. Otra

cuestión a resolver es si este factor se modifica tras lesiones en el nervio óptico en el estado adulto,

lo cual tampoco ha sido estudiado en el pez cebra adulto.

Debido a que estas proteínas están ampliamente conservadas evolutivamente en diferentes

grupos animales, los resultados y conclusiones aquí descritas pueden ser extrapolados a otros

modelos animales, y tener repercusión en los estudios sobre regeneración de axones en la edad

adulta en otros modelos animales.

Objetivos

1. Analizar la distribución de Pax2 en el pez cebra adulto (Danio rerio).

2. Determinar las posibles modificaciones de la distribución de Pax2 tras la lesión del nervio

óptico en el pez cebra adulto (Danio rerio).

3. Comprobar si hay alguna asociación entre Pax2 y los axones de las células ganglionares.

4. Analizar la expresión de Sox10, marcador de oligodendrocitos, en el pez cebra adulto

(Danio rerio).

5. Determinar las posibles modificaciones de la distribución de Sox10 tras la lesión del nervio

óptico en el pez cebra adulto (Danio rerio).

Materiales y métodos

11

Materiales y me todos

5.1 Animales de experimentación

En el presente trabajo de Fin de Grado en Biología se emplearon 8 ejemplares de pez cebra

adulto (Danio rerio; Hamilton-Buchanan, 1822), disponibles en el Instituto de Neurociencias de

Castilla y León (INCyL). Los animales en el laboratorio fueron mantenidos en acuarios a 28ºC, con

agua desionizada suplementada con sales Instant Ocean® (Aquarium Systems, Mentor, Ohio;

EE.UU) a una concentración de 0,3 g/l, con un fotoperiodo de

catorce horas de luz y diez horas de oscuridad, y alimentados

entre 5 y 7 veces al día. Los animales fueron manipulados

siguiendo las directrices de la Comunidad Europea

(86/609/EEC y 2003/65/EC) y la legislación española (RD

1201/2005, BOE 252/34367-91, 2005) vigentes para el uso y

cuidado de animales de experimentación. Además, los animales

fueron anestesiados con metanosulfonato de tricaína (MS-222)

antes de cualquier tipo de operación.

5.2 Grupos experimentales

Se usaron dos grupos experimentales. El grupo uno, un grupo control al que no se realizó ningún

tipo de cirugía previa al sacrificio. El grupo dos al que se le realizó la axotomización del nervio

óptico a un ojo, y tras tres días fue sacrificado.

5.3 Axotomización del nervio óptico

El procedimiento comenzó con la anestesia de los animales sumergiéndolos en una solución de

metanosulfonato de tricaína (MS-222, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, EE.UU.) a una

concentración de 0,3 g/l. A continuación realizamos el corte del nervio óptico provocando una

GRUPO 1 GRUPO 2

Ojo izquierdo Ojo derecho Ojo izquierdo Ojo derecho

No manipulado,

Control

No manipulado,

Control

No manipulado,

Contralateral

Manipulado

Lesionado

Figura 12. Pez cebra adulto

(Danio rerio)

Tabla 1. Grupos experimentales

12

destrucción temporal de los axones de las células ganglionares. Esta técnica permite estudiar la

regeneración de los axones de las células ganglionares de la retina y su interacción con las células

de la glía, ya que los teleósteos tienen la capacidad de regenerar los axones de las células

ganglionares.

Para realizar correctamente la lesión del nervio óptico usamos unas pinzas con las que retiramos

el tejido conjuntivo que rodea al ojo, y conseguimos tener acceso al nervio óptico. Posteriormente

con la ayuda de unas tijeras de precisión realizamos un corte transversal del mismo. Durante el

proceso, hay que tener cuidado de no dañar la arteria oftálmica, ya que produciría sangrado y

destrucción del ojo por falta de riego sanguíneo.

La lesión se realizó en el ojo derecho del pez cebra, mientras que el ojo izquierdo quedó intacto

para provocar el menor estrés posible al animal, y medir posteriormente si se produce algún cambio.

Los peces cebras se mantuvieron vivos durante tres días. Tras este periodo fueron sacrificados

para medir los posibles cambios producidos en la retina.

5.4 Extracción de los ojos del pez cebra

Tras sacrificar al animal se procedió a la extracción bajo lupa de los ojos, cortando la

musculatura extraocular y el tejido conjuntivo que rodea al ojo. Finalmente se extrajo el ojo

cortando el nervio óptico. Una vez extraído, se realiza una pequeña incisión en la córnea y se

presiona mediante dos pinzas para sacar el cristalino, esto es necesario para evitar problemas en la

obtención posterior de las secciones histológicas.

5.5 Procesamiento histológico

Los ojos extraídos se fijaron en una mezcla de paraformaldehido al 4% en tampón fosfato (TP)

0,1M y pH 7,4, durante cuatro horas a temperatura ambiente. Posteriormente se crioprotegieron

mediante inmersión en sacarosa al 30% en TP 0,1 M, manteniéndose durante dos días a 4ºC en

agitación hasta que los ojos se hundieron en el líquido de crioprotección.

Una vez crioprotegidos se encastraron en moldes rellenos de OCT®

en los que se orientaron los

ojos para su corte. Posteriormente se congelaron con nitrógeno líquido y se cortaron en un criostato

(Thermus Scientific Microm HM 560) a una temperatura de -29ºC. Se realizaron secciones

coronales de 12 µm de espesor que se recogieron en portaobjetos superfrost (Thermo Scientific,

Braunschweig, Alemania). Las secciones se almacenaron a -30ºC hasta su posterior uso.

13

5.6 Inmunohistoquímica

La Inmunohistoquímica es una técnica muy útil que permite el marcaje de proteínas basándose

en el principio de unión antígeno-anticuerpo. Mediante esta técnica podemos detectar la

localización de las distintas proteínas y ver qué tipos celulares las expresan.

Para realizar esta técnica, las secciones se descongelaron a temperatura ambiente durante una

hora y se lavaron 3 veces cada 10 minutos con tampón fosfato salino 0,1M pH 7,4 (PBS) en

agitación para rehidratar el tejido.

Tras los lavados iniciamos la preincubación utilizando suero no inmune procedente de la misma

especie que el anticuerpo secundario que se va a utilizar posteriormente. La preincubación se

realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1% y Triton X-100 0,2% en TP (Probus S.A.) en el tejido.

Con este paso ayudamos a que los anticuerpos penetren mejor y reducimos el número de uniones

inespecíficas.

Tras una hora de preincubación en una cámara de humedad, se procedió a realizar la incubación,

la cual se realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1%, Triton X-100 0,2% en TP (Probus S.A.) y el

anticuerpo primario correspondiente en TP. Los anticuerpos primarios utilizados se recogen en la

tabla 2.

Después de un día de incubación, las secciones se lavan en PBS, y posteriormente se incuban en

el anticuerpo secundario fluorescente. Las secciones se mantienen en una cámara de humedad

durante una hora. La incubación se realizó con suero de cabra 5%, DMSO 1%, Triton X-100 0,2%

(Probus S.A.) y el anticuerpo secundario correspondiente en TP obtenido de cabra. Los anticuerpos

secundarios se recogen en la tabla 3.

Para terminar, lavamos con PBS más gelatina de pez que ayuda a eliminar la fluorescencia de

fondo. Los portaobjetos se montaron con un medio comercial Prolong®

Gold Antifade Reagent

(Invitrogen) y cubreobjetos para su posterior análisis en el microscopio.

Figura 13. Representación gráfica de la obtención de una sección en el criostato.

Modificado de Parrilla-Monge, 2010

Bloque de OCT

14

5.7 Marcadores utilizados

Pax2: El anticuerpo policlonal anti-Pax2 detecta una proteína de 22kDa. La proteína Pax2 en

teleósteos se ha descrito que está presente en astrocitos del nervio óptico, pudiendo tener un papel

en la regeneración y en el crecimiento continuado en la retina (Parrilla-Monge, 2010).

Zn8: El anticuerpo policlonal reconoce a una molécula de superficie llamada neurolina, que

pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Permite detectar los axones en crecimiento de

las células ganglionares de la retina. En procesos de regeneración la neurolina permite la guía de los

axones. Sin embargo, en neuronas maduras solo está presente en los lugares de contacto y sinapsis,

pudiendo estar implicada en la comunicación célula a célula y transducción de señales (Parrilla-

Monge, 2010).

Sox10: El anticuerpo policlonal reconoce a Sox10, un factor de transcripción que posee un

dominio HMG (grupo de alta movilidad) de unión al ADN. Estudios en mutantes de pez cebra

demuestran que es necesario para la diferenciación de los oligodendrocitos. También parece que

interviene en la expresión de genes que codifican factores que median entre axones y

oligodendrocitos, necesarios para la supervivencia de los axones. En el sistema nervioso adulto, la

proteína sox10 está presente en oligodendrocitos diferenciados (Parrilla-Monge, 2010).

ANTICUERPOS PRIMARIOS

Antígeno Anticuerpo Dilución de uso Casa comercial

Zn8 IgG monoclonal ratón 1:400 Hybridoma Bank

Pax2 IgG policlonal conejo 1:500 Covance

Sox10 IgG policlonal conejo 1:500 Cedida por Prof. Appel

ANTICUERPOS SECUNDARIOS

Método Antígeno Anticuerpo Conjugado Casa comercial

Fluorescencia IgG ratón IgG de cabra Cy2 Jackson

Fluorescencia IgG conejo IgG de cabra Cy3 Jackson

Fluorescencia IgG conejo IgG de cabra Cy3 Jackson

Tabla 3. Relación de anticuerpos secundarios

Tabla 2. Relación de anticuerpos primarios

15

5.8 Procesamiento de imágenes

Las imágenes fueron tomadas con el microscopio de campo claro y epifluorescencia Olympus

Provis AX70 y con una cámara digital Olympus DP70. El programa usado para la captación de

imágenes fue DP controller y DP manager (Olympus Optical CO., LTD. 2002). Las imágenes

fueron posteriormente procesadas con Adobe Photoshop® CS6.

Resultados y discusión

16

Resultados y discusio n

Para comprobar la distribución del factor de transcripción Pax2 y de Sox10 en la retina del

pez cebra adulto, concretamente en la cabeza del nervio óptico de la retina, utilizamos técnicas de

inmunohistoquímica descritas en el apartado de Material y Métodos. Además, analizamos dos

grupos de experimentación, el grupo uno que sirve de control, y el grupo dos con un ojo lesionado y

el otro al que no se le realizó ninguna operación.

6.1 Grupo 1. Nervio óptico control. Pax2

La distribución de las células Pax2 positivas no es regular a lo largo de la cabeza del nervio

óptico. La mayoría de células marcadas se encuentran concentradas en la parte más vitreal de la

cabeza del nervio óptico (Fig.14.1A; flechas), el disco óptico, por donde los axones de las células

ganglionares abandonan la retina. En el disco óptico, hay células marcadas intensamente y que

muestran una forma oval característica de astrocitos.

En la región donde limitan CNO, retina, coroides y esclera, observamos células positivas para

Pax2 (Fig.14.1B; cabezas de flechas). Estos astrocitos tienen forma alargada, son de menor tamaño

y están dispuestos en hileras.

Cuando nos desplazamos hacia la parte más escleral de la cabeza del nervio óptico, podemos

observar como los astrocitos adquieren una morfología fusiforme, siendo posible diferenciarlos de

los astrocitos del disco óptico (Fig.14.1C; cabezas de flechas huecas).

Por otra parte, el marcaje con Zn8 nos permite observar axones jóvenes provenientes de

células ganglionares de la retina. Muchos de los axones marcados mediante Zn8 se encuentran

asociados longitudinalmente con células Pax2 positivas (Fig.14.2; flechas). Ello sugiere que los

astrocitos Pax2 positivos intervienen en la guía de los axones jóvenes en la cabeza del nervio

óptico, permitiendo la conducción de los mismos hacia el disco óptico, para salir de la retina

posteriormente.

17

Grupo 2. Nervio óptico contralateral al lesionado. Pax2

A los tres días postlesión no se observaron cambios en la forma ni en la disposición de las

células positivas para Pax2 en la cabeza del nervio óptico (Fig.15.1 y 15.2; cabezas de flechas). Sin

embargo, aunque no se ha cuantificado, si se observa una menor proporción de células Pax2

positivas en comparación con los nervios ópticos control (Fig.14).

Se observan células Pax2 positivas en el DO y en la parte más escleral de la CNO (Fig.15.1 y

15.2; cabezas de flechas). En algunos casos también es posible ver como algunos astrocitos se

encuentran asociados a axones jóvenes Zn8 positivos (Fig.15.1; flechas).

Figura 14. Sección de la CNO en un animal control con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8

(verde)-DAPI (azul). 1) A. Células positivas para Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO)

marcadas intensamente y con morfología oval. B. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas)

dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con morfología

fusiforme. 2) Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas), células Pax2 positivas (cabeza de flecha)

en la CNO. Escala 200 µm.

Figura 15. Sección de la CNO del ojo contralateral al lesionado con triple marcaje Pax2

(rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul). 1) Células positivas para Pax2 (cabezas de flechas) en el

disco óptico (DO) y en la parte más escleral marcadas intensamente, y axones jóvenes Zn8

positivos (flechas). 2) Células Pax2 positivas en el DO con forma oval (cabeza de flechas).

Escala 200 µm.

1 2

1 2

1 2

18

Grupo 2. Nervio óptico lesionado. Pax2

A los tres días postlesión no se observaron cambios morfológicos, ni modificaciones en la

localización de las células positivas para Pax2 en la cabeza del nervio óptico (Fig.16.1 y 16.2). Sin

embargo, aunque es difícil de cuantificar, si se observa una menor proporción de células Pax2

positivas en comparación con los nervios ópticos control (Fig. 14.1 y 14.2).

El número de células marcadas en el disco óptico parece menor en todas las secciones de

nervios ópticos lesionados comparado con el nervio óptico control. Los astrocitos Pax2 positivos

siguen manteniendo la forma oval (Fig.16.1A).

En la región donde limitan CNO, retina, coroides y esclera, también se observan células

positivas para Pax2 (Fig.16.1B). Estos astrocitos presentan forma alargada, son de menor tamaño en

comparación con los astrocitos del disco óptico y están dispuestos en hileras.

En la parte más escleral se observan células Pax2 positivas con morfología fusiforme

(Fig.16.1C). El número de astrocitos en esta región es menor al observado en los nervios ópticos

control (Fig. 14).

En los nervios ópticos lesionados no encontramos axones jóvenes positivos para Zn8 en la

cabeza del nervio óptico. Este hecho puede deberse a que las células ganglionares no hayan podido

regenerar axones jóvenes en este periodo de tiempo.

Figura 16. Sección de la CNO en un animal lesionado con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8

(verde)-DAPI (azul). 1) A. Células positivas para Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO)

marcadas intensamente y con forma oval. B. Células Pax2 positivas (cabezas de flechas) dispuestas

en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con morfología fusiforme. 2) A.

Células positivas para Pax2 (rojo; cabezas de flechas huecas) en el disco óptico (DO) marcadas

intensamente y con morfología oval. Escala 200 µm.

1 2

19

Durante los últimos años se está intentando elucidar el papel de numerosas proteínas implicadas

en la guía axonal de los axones de las células ganglionares de la retina (ver Introducción). Algunos

autores han propuesto que factores de transcripción, como Pax6 y Pax2 que se expresan en la retina,

pueden tener un papel fundamental en la guía axonal en el pez cebra durante la regeneración

(Rodger et al., 2006). Se han realizado diversas investigaciones sobre la expresión de Pax6 en la

retina, pero pocos son los autores que han realizado estudios sobre Pax2. En la bibliografía

científica no hemos encontrado estudios que analicen las posibles variaciones en la expresión de

Pax2 en el nervio óptico control respecto a la axotomización del mismo en pez cebra. Sin embargo,

si se han realizado estudios sobre Pax2 en la retina del carpín (Parrilla et al., 2012; Parrilla et al.,

2013), su localización y su expresión en el nervio óptico control respecto al nervio óptico pinzado

y criolesionado (Parrilla et al., 2012).

Figura 17. Comparación entre controles y lesionados, tanto del ojo lesionado como del contralateral a

la lesión, con triple marcaje Pax2 (rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul). 1) Control. A. Células positivas para

Pax2 (rojo; flechas) en el disco óptico (DO) marcadas intensamente y con morfología oval. B. Células Pax2

positivas (cabeza de flechas) dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de flechas huecas) con

morfología fusiforme. 2) Contralateral al lesionado. A. Células positivas para Pax2 (cabezas de flechas) en

el disco óptico (DO) marcadas intensamente. B. Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas). 3) Lesionado. A.

Células positivas para Pax2 (flechas) en el disco óptico (DO) marcadas intensamente y con morfología oval.

B. Células Pax2 positivas (cabezas de flechas) dispuestas en hileras. C. Células Pax2 positivas (cabeza de

flechas huecas) con morfología fusiforme. 4) Control. Axones jóvenes Zn8 positivos (flechas) y células

Pax2 positivas (cabeza de flecha) en la CNO. Escala 200 µm.

1 2

3 4

B

A

20

En el presente trabajo no hemos realizado estudios que permitan medir la expresión del ARNm

de Pax2, ni hemos cuantificado el número de células Pax2 positivas. Aun así, nuestros resultados

son coherentes con los datos mostrados por Parrilla et al., 2012, en los que se describe como el

número de células positivas para Pax2 desciende tras dos días postpinzamiento en la retina del

carpín. La lesión que provocamos en el pez cebra puede ser la responsable en gran medida de la

disminución de astrocitos Pax2 positivos. Además, es posible que la degeneración de los axones de

las células ganglionares libere numerosas moléculas de señalización de muerte celular, como la

caspasa-3 y produzca la muerte de los astrocitos, los cuales se encuentran interaccionando con los

axones de las células ganglionares (García y Koke, 2009).

Por otra parte, se ha observado que en mayores espacios de tiempo, el número de células Pax2

positivas aumenta significativamente, coincidiendo con la llegada de axones jóvenes Zn8 positivos

a la cabeza del nervio óptico (Parrilla et al., 2012). Por ello, muchos autores sostienen que Pax2

puede jugar un papel esencial en la guía de estos axones jóvenes Zn8 positivos en la cabeza del

nervio óptico. Nuestro periodo de exposición no permite una regeneración de tal calibre, por lo que

no podemos comprobar dicha llegada de axones y su interacción con astrocitos tras una lesión. Sin

embargo, en los nervios ópticos control, sí observamos una clara interacción entre astrocitos Pax2

positivos con axones jóvenes Zn8 positivos (Fig.14.2).

Nuestros resultados muestran que la expresión de Pax2 se mantiene en el pez cebra adulto y que

los astrocitos Pax2 positivos interaccionan con los axones, guiándolos a través de la cabeza del

nervio óptico para que lleguen correctamente a sus destinos, como la hipótesis planteaba.

En futuras investigaciones sería interesante estudiar a diferentes periodos de tiempo tras la lesión

cómo varía la expresión del mRNA para Pax2 mediante hibridación in situ y PCR, cuantificar el

número de células Pax2 positivas mediante técnicas de inmunofluorescencia y realizar un conteo

celular. Además, sería muy interesante comparar el número de células positivas para Netrina-1 y la

Tabla 4. Expresión del ARNm de Pax2 y número

de células pax2 positivas tras pinzamiento en la

retina del carpín. Extraído de Parrilla et al., 2013.

21

expresión de la misma en nervios ópticos control y nervios ópticos lesionados, ya que uno de los

genes diana de Pax2 es la netrina.-1. Se han realizado estudios similares sobre la expresión de

netrina-1 en teleósteos como en carpín (Petrausch et al., 2000), pero no en pez cebra.

6.2 Grupo 1. Nervio óptico control. Sox10

Los oligodendrocitos se caracterizan por ser MBP+/Sox10+, como se ha descrito previamente en

la literatura tanto en ratón como en carpín (Parrilla Monge, 2010).

Hemos visto que las células positivas para Sox10 se encuentran formando hileras tanto en el disco

óptico como en parte más escleral de la cabeza del nervio óptico (Fig.18; flechas). En el disco

óptico los oligodendrocitos forman grupos característicos (Fig.18; cabezas de flechas). Las células

Sox10 positivas se encuentran entre los axones marcados mediante Zn8 (Fig.18; cabezas de flechas

huecas).

Grupo 2. Nervio óptico contralateral al lesionado. Sox10

Hemos observado que las células positivas para Sox10 mantienen una localización y morfología

similar a la observada en el nervio óptico control (Fig.18). Los oligodendrocitos se encuentran

formando grupos en el disco óptico (Fig.19.1 y 19.2; flechas). En la parte más escleral los

oligodendrocitos forman hileras características de esta zona (Fig.19.1 y 19.2; cabezas de flechas).

En la mayoría de las secciones analizadas se observa una mayor densidad de células positivas a

Sox10 respecto al control.

Figura 18. Sección de la CNO en un animal control con

triple marcaje Sox10 (rojo)-Zn8 (verde)-DAPI (azul).

Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;

cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en

hileras (flechas) rodeando un axón Zn8 positivo (cabeza

de flechas huecas) Escala 200 µm.

22

Grupo 2. Nervio óptico lesionado. Sox10

En el nervio óptico lesionado (Fig.20), los oligodendrocitos Sox10 positivos mantienen una

localización y morfología similar a la observada en el nervio óptico control (Fig.18). Sin embargo,

el número de oligodendrocitos positivos para Sox10 es muy escaso (Fig.20). Se observan pequeños

grupos aislados en el disco óptico y unas pocas células en hileras dispuestas en la región más

escleral de la cabeza del nervio óptico (Fig.20). Como en el caso de Pax2, no encontramos axones

positivos para Zn8 en secciones de nervios ópticos lesionados de grupo 2.

Figura 19. Sección de la CNO de la retina contralateral a la lesión de un animal, con

doble marcaje Sox10 (rojo)-DAPI (azul). 1) Células positivas para Sox10 en el DO en

grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). 2) Células

positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en

hileras (cabezas de flechas). Escala 200 µm.

Figura 20. Sección de la CNO de la retina de un animal

lesionado con doble marcaje Sox10 (rojo)-DAPI (azul).

Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;

cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras

(flechas). Escala 200 µm.

1 2

23

Los datos obtenidos en el presente trabajo concuerdan con los datos mostrados en estudios previos

realizados en otros teleósteos como el carpín (Parrilla-Monge, 2010), en los que se muestra que tras

el pinzamiento del nervio óptico, durante los primeros siete días tras la lesión, el número de

oligodendrocitos Sox10 positivos disminuye en la cabeza del nervio óptico. Ello puede ser debido a

factores apoptóticos que se liberan desde los axones destruidos durante la axotomización del nervio

óptico (García y Koke, 2009).

No hemos encontrado en la bibliografía científica datos que muestren los cambios producidos en

el ojo no lesionado de los peces correspondientes al grupo dos (Ver apartado Materiales y

Métodos), en los que hemos visto que también se producen cambios aunque no se haya lesionado

(Panagis et al., 2005). En estudios futuros, sería interesante comparar la expresión del ARNm de

Figura 21. Retinas de animales control, contralaterales y lesionados con doble y triple marcaje Sox10

(rojo)-DAPI (azul)-Zn8 (verde). 1) Control. Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;

cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (flechas) rodeando un axón Zn8 positivo (cabeza

de flechas huecas) 2) Contralateral al lesionado. Células positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo;

flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en grupos

(cabezas de flechas huecas). 3) Contralateral al lesionado. Células positivas para Sox10 en el DO en

grupos (rojo; flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras (cabezas de flechas). 4) Lesionado. Células

positivas para Sox10 en el DO en grupos (rojo; cabezas de flechas). Oligodendrocitos dispuestos en hileras

(flechas). Escala 200 µm.

1

2

3 4

24

Sox10 entre los dos grupos experimentales, para cuantificar los cambios observados en este trabajo

y cuantificar el número de células Sox10 positivas entre los mismos.

Conclusiones

25

De acuerdo con los objetivos planteados en este Trabajo de Fin de Grado, y como consecuencia de

los resultados obtenidos y de la discusión llevada a cabo, hemos llegado a las siguientes

conclusiones:

I. Las células positivas a Pax2 pueden participar en la guía de los axones de las células

ganglionares de la retina en procesos de regeneración del nervio óptico del pez cebra adulto

(Danio rerio).

II. Sox10 está presente en oligodendrocitos de la cabeza del nervio óptico que se encuentran

asociados a los axones en crecimiento, modificándose su número tras una lesión en el pez

cebra adulto (Danio rerio).

26

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26

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El presente trabajo de Fin de Grado en Biología, bibliográfico y

experimental, se realiza un resumen de las principales moléculas de

guía axonal presentes en la retina del pez cebra. Además, analizamos

la distribución de Pax2 en la cabeza del nervio óptico, sugiriendo que

tiene un papel en la guía de los axones de las células ganglionares.

También analizamos la distribución del marcador de oligodendrocitos

Sox10, observando como varían las células de la glía tras una lesión.