Modelos Cineticos de Crecimiento Bacteriano

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Emiro Valbuena, Jos Barreiro, Egar Snchez, Gustavo Castro, Wilfido Briez, Armando TovarModelos cinticos aplicados al crecimiento de lactococcus lactis subsp. lactis en leche

Revista Cientfica, vol. XV, nm. 5, diciembre, 2005, pp. 464-475,Universidad del Zulia

Venezuela

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_________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XV, N 5, 464 - 475, 2005

MODELOS CINTICOS APLICADOS AL CRECIMIENTODE Lactococcus lactis subsp. lactis EN LECHE

Growth Kinetics Models Applied to Lactococcus lactis subsp. lactis in Milk

Emiro Valbuena1, Jos Barreiro3, Egar Snchez 2, Gustavo Castro1, Wilfido Brez1 y Armando Tovar 1

1Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de la Leche. 2Unidad de Bioestadstica.

Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia, Apartado 15252. Maracaibo 4005-A, Venezuela.3Departamento de Tecnologa de Procesos Biolgicos y Bioqumicos, Universidad Simn Bolvar.

Sartenejas, Venezuela. E-mail: [email protected]

RESUMEN

El Lactococcus lactis subsp. lactis es una bacteria ci-do-lctica muy utilizada como cultivo iniciador principalmenteen quesos madurados, capaz de producir algunas bacterioci-nas, entre estas la nisina, por lo cual su uso como preservadores importante. En el presente trabajo se utilizaron modelos ci-nticos con el objeto de describir el crecimiento de este micro-organismo en leche en polvo reconstituida, con los cuales esposible predecir su dinmica dentro del rango de temperaturaestudiado, entre 9 y 39C. Se utiliz la ecuacin de Gompertzcon cuatro parmetros de regresin para modelar cada una delas curvas de crecimiento obtenidas experimentalmente. Comoresultado de este proceso, se obtuvieron los parmetros nece-sarios para calcular la fase de adaptacin (), tasa de creci-miento exponencial (m) y el tiempo de generacin (Tg). Estosparmetros microbiolgicos fueron relacionados con la tempe-ratura en un modelo secundario, en el cual, la fase de adapta-cin y el tiempo de generacin fueron bien ajustados utilizandouna ecuacin hiperblica, obteniendo un R2 = 0,922 y 0,991respectivamente, mientras que la tasa de crecimiento se mo-del utilizando la ecuacin de la raz cuadrada de Ratkowsky(R2 = 0,991). Se recomienda utilizar la metodologa descritapara estudiar el crecimiento de este microorganismo en que-sos frescos, incluyendo en el modelo la cintica de produccinde nisina.

Palabras clave: Lactococcus lactis, microbiologa predictiva,modelo de Gompertz, cintica de crecimiento.

ABSTRACT

Lactococcus lactis subsp. lactis is a lactic acid bacteriafrecuently employed as a starter culture for ripened cheese.This microorganism is capable of producing several bacte-riocins such as nisin, that is precisely why its use as a pre-servative is important. In the present work, growth kineticsmodels were used to describe the growth of this microorgan-ism in reconstituted powder milk, to predict its growth dynamicwithin the temperature range studied (9-39C). Gompertz equa-tion with four regression parameters was used to model for eachone of the growth curves experimentally obtained. As a result,the necessary parameters to calculate the adaptation phase,maximum rate of exponential growth and generation time wereobtained. Microbiological parameters were compared with tem-perature in a secondary model. In this model the lag time (),and generation time (Tg) were well adjusted using an hyperbolicequation, obtaining a R2 = 0.922 and 0.991, respectively. TheRatkowsky square root equation (R2 = 0.991) was used tomodel the growth rate (m). It is recommended to use previ-ously described methodology to study the growth of this micro-organism in fresh chesses, including in the model the kineticsof nisin production.

Key words: Lactococcus lactis, predictive microbiology, Gom-pertz model, growth kinetics.

INTRODUCCIN

La leche y sus derivados representan un grupo de ali-mentos caracterizados por su gran valor nutricional; sin embar-go, la mayor parte de ellos son altamente perecederos, situa-cin que no puede controlarse mediante el uso de sustanciaspreservativas, debido a que las normativas vigentes tanto en

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Recibido: 03 / 12 / 2004. Aceptado: 09 / 06 / 2005.

Venezuela como en otros pases, son estrictas en cuanto a laausencia de preservativos qumicos en la leche y en sus pro-ductos derivados, salvo algunas excepciones. Por otra parte,es evidente la exigencia de un consumidor mejor formado, ha-cia el consumo de alimentos sin la adicin de elementos extra-os al mismo, por lo cual se hace cada vez ms importantedesarrollar formas de conservacin basadas en la biopreserva-cin [8, 11].

Las bacterias cido-lcticas han sido utilizadas comobiopreservadores en productos alimenticios de diversa ndole,incluyendo productos lcteos como quesos frescos y madura-dos, con el objeto de evitar la proliferacin de patgenos comoListeria monocytogenes, diversas especies de Clostridium yStaphylococcus aureus, siendo este ltimo reconocido comoresponsable de frecuentes brotes de intoxicaciones alimenta-rias en Venezuela [3, 14].

El Lactococcus lactis subsp. lactis es un microorganismomesfilo, capaz de fermentar la lactosa produciendo cido lc-tico en gran cantidad, de la misma forma es capaz de produciralgunas substancias antibacterianas conocidas en forma gen-rica como bacteriocinas, entre las cuales destacan la nisina yla diplococcina. Ambos factores, acidez y bacteriocinas, soncapaces de inhibir el crecimiento de un amplio rango de micro-organismos [4, 6, 8].

Diversos modelos matemticos han sido desarrolladoscon el objeto de predecir el comportamiento de las poblacio-nes bacterianas cuando crecen en condiciones controladas delaboratorio y muchos de ellos han logrado ser validados encondiciones de produccin, transporte y almacenamiento dealimentos, esto es posible incluso tomando en cuenta variacio-nes en factores de crecimiento extrnsecos como la temperatu-ra y en otros intrnsecos como la concentracin de sal, activi-dad de agua, entre otros [5, 18, 19].

La microbiologa predictiva utiliza los modelos matemti-cos para describir el comportamiento microbiano, incluyendolas expresiones que describen cmo las poblaciones bacteria-nas cambian con respecto al tiempo dentro de determinadascondiciones. Las respuestas obtenidas como la tasa de cre-cimiento (m), fase de adaptacin (), densidad poblacionalmxima, tiempo para la formacin de algn metabolto espec-fico, por ejemplo, pueden luego ser modelados con respecto ala influencia que sobre los mismos ejercen otras variables in-trnsecas o extrnsecas presentes [15, 17, 21].

Esta rama de la microbiologa de alimentos permite es-timar el crecimiento, la supervivencia y/o la muerte de los mi-croorganismos en relacin a los factores crticos que los afec-tan, como lo son la temperatura, pH, actividad de agua yotros [9, 15].

El presente trabajo tuvo como objetivo aplicar los mode-los matemticos que mejor se ajusten a los valores poblacio-nales obtenidos experimentalmente para describir las curvasde crecimiento del microorganismo Lactococcus lactis subsp.

lactis, a once temperaturas en estudio, dentro del rango de 9 a39C y a partir de las ecuaciones desarrolladas calcular losprincipales parmetros que describen el crecimiento microbia-no (tiempo de adaptacin, tasa mxima de crecimiento expo-nencial y tiempo de generacin) a nivel del modelo primario ylograr finalmente, describir el comportamiento de estos par-metros, en funcin a la temperatura dentro del rango estudiadomediante el empleo de modelos secundarios [5, 20].

MATERIALES Y MTODOS

Medio y condiciones de crecimiento

Se utiliz como medio para el crecimiento leche en polvodescremada, libre de inhibidores, reconstituida al 10% y luegoesterilizada en autoclave a 110C/10 min.

Se colocaron 25 mL de leche en tubos de ensayo previa-mente esterilizados, los mismos fueron inoculados con el mi-croorganismo hasta alcanzar un nivel inicial cercano a 1,0 103 UFC/mL. El cultivo de Lactococcus lactis subsp. lactis(ATCC 29146) fue utilizado en fase logartmica de crecimiento,la cual se alcanz por incubacin previa en leche a 30C du-rante 12 horas y luego diluyendo en forma seriada en lecheestril hasta alcanzar el ttulo requerido.

Las temperaturas en las cuales se estudi el crecimientofueron; 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 y 39C con una va-riacin de 0,1C, lo cual se consigui utilizando un bao decirculacin termoregulado con refrigeracin, marca FormaScientific, modelo 2161.

Para cada temperatura se incubaron 15 tubos en lascondiciones descritas y dependiendo de la relacin tiempo-temperatura en estudio, fueron retirados del bao y se toma-ron alcuotas de cada uno de ellos para medir por duplicado lapoblacin del L. lactis, en forma tal de obtener una representa-cin de toda la curva de crecimiento, fase de adaptacin, decrecimiento exponencial y comienzo de la fase estacionaria.

Anlisis microbiolgico

Con el fin de garantizar la ausencia de inhibidores queafecten el crecimiento microbiano, la leche en polvo utilizadaen los experimentos fue sometida previamente a un anlisispara detectar posibles substancias inhibidoras del crecimientobacteriano, para ello se utiliz la prueba del Delvotest SP(Gist-brocades).

Con la muestra de cada tubo incubado, se procedi enprimera instancia a la extraccin asptica de una alcuota de1,0 mL, con la cual se efectu la siembra en profundidad y loscontajes segn la metodologa APHA [1]. Los resultados se re-portaron como Log (UFC/mL) para su inclusin en los modelosmatemticos a utilizar.

El medio utilizado para el cultivo fue el M-17 (Difco), conglicerofosfato como controlador de pH, el azcar incorporado

465

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fue lactosa al 10%, la cual se aadi en forma estril al mediopreviamente tratado a 121C/15 min. Esta tcnica ha sido am-pliamente utilizada para el microorganismo en cuestin y fueoriginalmente descrita por Terzaghi y Sandine [16 ].

Anlisis del modelo primario

Los datos del crecimiento para cada temperatura fueronincorporados como variable dependiente en el modelo de cre-cimiento de Gompertz de cuatro parmetros (Ec. 1) [10], mien-tras que el tiempo de incubacin (t) se incorpor como variableindependiente.

Luego se introdujo la ecuacin correspondiente al mode-lo descrito y sus variables al computador utilizando el mduloNONLIN del paquete estadstico Systat [2] y se efectu el pro-ceso analtico hasta encontrar el punto de convergencia, en elcual los parmetros de regresin (A, D, B y M) consiguen unamagnitud apropiada, ajustando de la mejor forma posible la re-lacin entre las variables.

El proceso de ajuste utiliza una modificacin del procesomatemtico de Gauss-Newton para la disminucin del error enla suma de cuadrados en cada proceso iterativo al aplicar laecuacin de regresin no lineal.

log exp exp ( )N A D B Tiempo M (1)

donde;

logN: es el logaritmo comn de poblaciones bacterianas(UFC/mL).

Tiempo: de incubacin, es la variable independiente (horas).A, D, B

y M:son los parmetros de ajuste del modelo y repre-sentan a efecto del inicio del ciclo computacional ite-rativo: A es el logaritmo comn de la poblacin ini-cial en UFC/mL (inculo); D es el logaritmo comnde la diferencia entre la poblacin inicial y final en lafase estacionaria; B representa la pendiente de lacurva y describe la tasa de crecimiento; y M es eltiempo en el cual la tasa de crecimiento es de ma-yor magnitud.

Este proceso permiti disminuir a un mnimo la dife-rencia entre los datos experimentales y los valores ajusta-dos por el modelo los cuales se describen como residuales.La verificacin de la bondad de los modelos empleados encada caso, se llev a cabo mediante la construccin de gr-ficos, en los cuales se contrastaron las curvas ajustadas conlos valores de las poblaciones observadas para cada tempe-ratura.

Utilizando los parmetros de ajuste del modelo de Gom-pertz, se calcularon la fase de adaptacin (), la tasa mximade crecimiento exponencial (m) y el tiempo de generacin(Tg), como descriptores microbiolgicos a ser utilizados para

efectos de prediccin de la poblacin en un tiempo dado y encada temperatura incluida en el rango de estudio (9-39C), atal efecto, se utilizaron las siguientes expresiones matemticas[10]:

Fase de adaptacin ():[h] = M 1/ B + ((log N A)/((B D)/exp(1))) (2)

Tasa especfica de crecimiento (m):[log (UFC/mL)/h] = B D/exp (1) (3)

Tiempo de generacin (Tg):[h] = exp(1) log (2)/B D (4)

Anlisis del modelo secundario

La fase de adaptacin (), tasa mxima de crecimientoexponencial (m) y tiempo de generacin (Tg) fueron incorpo-rados a los modelos secundarios que mejor ajustaron sus va-lores en todo el rango trmico estudiado y en los cuales se in-tegraron los datos provenientes de todas las temperaturas enestudio. As, el modelo hiperblico utilizado para modelar lafase de adaptacin fue bastante sencillo y de fcil ajuste, elmismo es presentado en la literatura para modelar el logaritmoneperiano de la fase de adaptacin [10, 20]:

= p / (Temperatura q) (5)

donde p y q representan los parmetros de ajuste de la ecua-cin.

Para modelar el efecto de la temperatura sobre la tasaespecfica de crecimiento (m) se utiliz el modelo de la razcuadrada [13], modificada por Ratkowsky para su uso inclusomas all de la temperatura ptima de crecimiento. La ecuacinde regresin no lineal utilizada en el proceso iterativo hasta lo-grar la menor suma de residuales, fue la siguiente:

m = (b (Temp. Tmin)) (1 exp (c * Temp. Tmax)) (6)

donde b y c son los parmetros de regresin del modelo; y Tminy Tmax corresponden a las temperaturas mnima y mximas alas cuales puede crecer la cepa de L. lactis estudiada, siendoajustados tambin por el modelo.

El tiempo de generacin o tiempo de doblaje, fue muybien descrito por un modelo hiperblico, el mismo fue utilizadoen virtud de la forma de la curva representativa del tiempo degeneracin contra la temperatura de incubacin, la ecuacinutilizada para describir tal interaccin fue similar a la utilizadapara la fase de adaptacin;

Tg = p / (Temperatura q) (7)

466

Modelos cinticos aplicados al crecimiento de L. lactis subsp. lactis en leche / Valbuena, E. y col.__________________________________

donde p representa la disminucin del tiempo de generacinen la medida en que se aumenta la temperatura y q representala temperatura a la cual el tiempo de generacin es infinito.

Una vez obtenidos todos los puntos experimentales, seefectu el anlisis de regresin no lineal correspondiente a to-dos los modelos secundarios descritos hasta obtener el mejorajuste, obtenindose as los descriptores de crecimiento defini-tivos que resultan vlidos a cualquier temperatura dentro delrango entre los 9 y 39C.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Modelo primario

En la TABLA I, se resumen los parmetros de ajuste, A,D, B y M, obtenidos como salida del proceso iterativo paracada conjunto de datos, agrupados por temperatura.

Puede apreciarse como los valores del R2 corregido sonbastante elevados, lo cual deja claro la bondad del modelopara el ajuste de los datos analizados, sin embargo, es buenoaclarar que en este caso el coeficiente de determinacin por ssolo, no es concluyente para el anlisis de este tipo de mode-lo, lo cual representa una importante diferencia con el anlisisde modelos de regresin lineal, razn por la cual se incluyetambin el anlisis de residuales [12].

En la TABLA I, se presenta como residual para cadaconjunto de datos, la sumatoria de los residuales para cadapunto de observacin, de esta forma se detect que, porejemplo, entre las poblaciones observadas y ajustadas a33C, se presenta una sumatoria de residuales de 0,041 con9 observaciones, con un promedio de 0,0046 (0,041/9) para

cada observacin, luego, si se toma en cuenta que para cadaobservacin (Log UFC/mL) hay valores entre 3,0 y 9,0, sepuede concluir que al menos para este caso, el error es bas-tante aceptable. Para el resto de las temperaturas se puedeapreciar que la magnitud de los residuales en relacin al n-mero de observaciones (n), presentan una situacin similar ala descrita.

En la TABLA II, se encuentran los parmetros microbio-lgicos ms importantes que pueden derivarse de la aplicacindel modelo de regresin utilizado, cuyas ecuaciones fueronpreviamente descritas y representan la culminacin del modeloprimario de prediccin. A partir de estos parmetros fue posi-ble abordar los modelos secundarios, con los cuales se lograpreciar cmo los parmetros derivados del modelo primariovaran con respecto a las variables que afectan el crecimiento,en este caso, la temperatura.

Como era de esperarse, la fase de retardo () y el tiem-po de generacin (Tg) se hacen mnimos cuando la temperatu-ra se acerca al ptimo, aumentando gradualmente conforme latemperatura se aleja de este punto, mientras que la tasa mxi-ma de crecimiento exponencial (m) muestra un comporta-miento inverso, dada su naturaleza. Los valores resaltados enla columna de la fase de retardo, son producto de la falla enlos conjuntos de datos correspondientes (15 y 21C), paraadaptarse a la forma sigmoidal tpica que se presentan nor-malmente en los grficos de crecimiento bacteriano, esto pue-de apreciarse ms claramente en las curvas de crecimientoque se presentan ms adelante.

Al utilizar los grficos para establecer la fase de adapta-cin, se puede apreciar que en esos dos casos citados ante-riormente, la proyeccin de una lnea recta tangencial a la l-

467


TABLA I

PARMETROS DE AJUSTE DEL MODELO PRIMARIO

Temp.(C)

A D B M R2 Corregido Resid. n Res/n

9 2,172 7,826 0,010 84,933 0,976 1,612 15 0,107

12 2,324 7,140 0,030 25,553 0,992 0,408 14 0,029

15 2,570 6,382 0,080 9,896 0,986 0,537 10 0,053

18 2,646 7,298 0,083 14,642 0,997 0,245 14 0,017

21 2,505 7,026 0,126 5,790 0,993 0,292 11 0,027

24 3,604 6,063 0,197 7,299 0,998 0,100 12 0,008

27 3,045 6,486 0,234 4,003 0,995 0,196 9 0,022

30 3,664 5,746 0,312 4,217 0,997 0,122 10 0,012

33 3,261 6,624 0,262 3,863 0,999 0,041 9 0,005

36 4,038 5,237 0,409 3,712 0,999 0,023 9 0,003

39 3,123 5,783 0,335 4,355 0,993 0,272 9 0,030A, D, B y M: representan los parmetros de ajuste. R2 Corregido: representa el coeficiente de determinacin. Resid: es la sumatoria de losresiduales. n: es el nmero de muestras de cada curva.

nea de crecimiento exponencial, hasta el eje de las ordenadas(tiempo), reflejara una fase de adaptacin con magnitud nega-tiva, lo cual es posible desde el punto de vista matemtico, sinembargo, desde el punto de vista microbiolgico, significaraque no se present siquiera un retardo inicial en las curvas decrecimiento en cuestin. Este defecto slo se observa en es-tos dos casos y por lo tanto no representa un problema intrn-seco del modelo y justifica la no incorporacin de los datos re-feridos para el desarrollo del modelo secundario referido a lafase de adaptacin.

Para hacer una mejor evaluacin del ajuste del modeloutilizado y lograr al mismo tiempo apreciar el problema plan-teado en el prrafo anterior, se presentan las FIGS. 1-11, co-rrespondientes a las curvas de crecimiento obtenidas a cadatemperatura y los valores estimados obtenidos como resultadoal utilizar el modelo, en ellos se puede corroborar grficamentecomo los tiempos calculados para la fase de adaptacin se co-rresponden con la realidad, resultando la nica excepcin losdos casos discutidos en el prrafo anterior.

Modelo secundario

Los modelos secundarios aplicados para cada uno delos parmetros de inters microbiolgico se utilizaron segnmejor se adaptaban a cada caso, as, se encontr que lostiempos de la fase de adaptacin eran bien ajustados por elmodelo hiperblico, tal como haba sido presentado en traba-jos previos con modelos cinticos [20], por su parte la tasa decrecimiento fue muy bien ajustada por el modelo modificadode la raz cuadrada [13]. En el caso del tiempo de generacin,se observ que al graficar el mismo contra la temperatura,describa una hiprbole casi perfecta, por lo cual se aplic elmismo modelo hiperblico empleado para la fase de adapta-

cin, lo cual no haba sido descrito en ninguna de las referen-cias analizadas.

Modelo hiperblico para la fase de adaptacin ()

Luego de efectuar los ajustes a travs del paquete esta-dstico utilizado en este trabajo, se consigui que el modeloajustaba mejor al utilizar los tiempos de adaptacin sin trans-formacin logartmica, lo cual no se encontr en ninguno delos trabajos revisados. El modelo matemtico utilizado en defi-nitiva puede resumirse en el desarrollo de la Ec. 5 de la si-guiente forma:

= 34,324 / (Temperatura 4,416) (8)

En la TABLA III, se presentan el resultado de los par-metros p y q obtenidos de la aplicacin del modelo, con su res-pectivo intervalo de confianza, en el cual puede apreciarse,que en ninguno de los casos, dicho intervalo incluye el valorcero, lo cual, segn explican Ato y Lopez [2], valida la pendien-te e intercepcin del modelo aplicado. Sin embargo, puede ob-servarse que los intervalos incluyen valores bastante distantesdel estimado para lograr la confianza del 95%, lo cual puedeexplicarse, al menos parcialmente, por la poca cantidad de ob-servaciones realizadas.

En la TABLA IV, se presentan los tiempos obtenidoscomo fase de adaptacin o retardo para cada una de las tem-peraturas, los tiempos estimados por el modelo hiperblicoaplicado y los residuales encontrados para cada caso, mien-tras que en la FIG. 12, se representan los valores estimados yde origen para este modelo, el cual arroj un R2 de 0,922 quesi bien es inferior al de los otros modelos utilizados en este tra-bajo, tiene un excelente ajuste.

468


TABLA II

FASE DE ADAPTACIN, TASA DE CRECIMIENTO MXIMA Y TIEMPO DE GENERACIN PARA CADA TEMPERATURA

Temperatura(C)

(h)m

log [UFC/mL) / h]Tg(h)

9 7,441 0,029 11,94212 4,618 0,079 3,82015 1,140 0,188 1,51918 2,832 0,223 1,35021 0,277 0,326 0,85624 2,419 0,439 0,68627 0,149 0,558 0,50530 1,238 0,660 0,45733 0,613 0,638 0,47036 1,363 0,788 0,38239 1,620 0,713 0,421

Los valores resaltados no se tomaron en cuenta por ser negativos, para modelar la fase de adaptacin.

469


1. ( 9C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 50 100 150 200 250

2. (12C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 20 40 60 80 100 120 140

4. (18C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 10 20 30 40 50 60

5. (21C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30

3. (15C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 10 20 30 40 50

N FIGURA. (Temp. ensayo C)

Valor ExperimentalValor Ajustado ____

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 50 100 150 200 250Tiempo (h)

Po

bla

ci

n[L

og

(UF

C/m

L]

FIGURAS 1-5. VALORES EXPERIMENTALES Y MODELOS DE CRECIMIENTO DE Lactococcus lactis subsp. lactisA DIFERENTES TEMPERATURAS.

470


6. (24C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20 25 30 35

7. (27C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

8. (30C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 5 10 15 20

9. (33C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

10. (36C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12 14

11. (39C)

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16

FIGURAS 6-11.VALORES EXPERIMENTALES Y MODELOS DE CRECIMIENTO DE Lactococcus lactis subsp. lactisA DIFERENTES TEMPERATURAS.

En la FIG. 12, correspondiente al modelo secundariopara la fase de adaptacin, se aprecia como la lnea de ajuste,s representa un buen estimado de los puntos de origen, loscuales describen una hiprbole.

Modelo para la tasa mxima de crecimientoexponencial (m)

En la TABLA V, se presentan los parmetros estimadospor el modelo de la raz cuadrada con sus respectivos interva-los de confianza, en los que puede apreciarse que los valoresestimados para los cuatro parmetros (b, c, Tmin y Tmax) se en-cuentran en un rango estimado para el intervalo de confianzabastante estrecho, lo cual infiere precisin al modelo.

Como producto del desarrollo experimental de la ecua-cin 6, integrando los estimadores presentados en la TA-BLA V, se obtuvo la siguiente ecuacin de prediccin:

m = (0,042 * (T 4,39)) * (1 exp (0,05 * (T 56,5))) (9)

Por otra parte, en la TABLA VI se presentan los resulta-dos estimados para la tasa especfica de crecimiento segn elmodelo primario, los estimados al aplicar el modelo secunda-rio, as como las diferencias entre ambos para cada tempera-tura (residuales). Los mismos valores del modelo estimado ylos obtenidos del modelo de Gompertz se encuentran repre-sentados en la FIG. 13.

471


TABLA III

ESTIMADORES DEL MODELO HIPERBLICO PARA LA FASE DE ADAPTACIN

Parmetro Estimado Intervalo de Confianza (95%)Inferior Superior

p 34,324 11,659 49,990q 4,416 1,903 6,929

TABLA IV

FASE DE ADAPTACIN ESTIMADA POR EL MODELO HIPERBLICO, VALORES DE ORIGEN Y RESIDUALES

Temperatura (C) Estimado () Residual9 7,441 7,448 0,047

12 4,618 4,526 0,09215 3,24318 2,832 2,527 0,30521 2,07024 2,419 1,753 0,66627 0,149 1,520 1,37130 1,238 1,342 0,10433 0,613 1,201 0,58836 1,363 1,087 0,27639 1,620 0,992 0,628

Los valores resaltados son estimados obtenidos para las temperaturas cuyos valores de origen fueron excluidos. R2 (corregido) = 0,922.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temperatura (C )

Tie

mp

o(h

)

Fase Adaptacin

Estimado

FIGURA 12. MODELO HIPERBLICO PARA LA FASE DEADAPTACIN DE L. lactis subsp. lactis.

Al analizar los residuales es posible establecer que lasmagnitudes de los mismos son pequeos y los mismos noexhiben un patrn determinado, ya que se ubican en algunoscasos por arriba, mientras que en otros casos lo hacen por de-bajo del estimado, por lo cual se concluye que el modelo apli-cado funcion bastante bien, lo cual una vez ms es corrobo-rado con un slido R2 = 0,991.

En la FIG. 13 se logra apreciar lo sealado en el prrafoanterior, la lnea slida correspondiente al modelo ajustadopresenta una relacin muy cercana a los puntos correspon-dientes a las tasas mximas de crecimiento exponencial obte-nidas del modelo primario, slo puede objetarse a este respec-to, el punto correspondiente a la temperatura de los 33C, elcual queda un poco por debajo del la lnea de ajuste, pero sepuede inferir que este valor es aparentemente atpico al com-pararlo con los puntos superior e inferior.

Modelo hiperblico para el tiempo de generacin (Tg)

En la TABLA VII, se presentan los parmetros estimado-res del modelo, tomados de la Ec. 7, donde se aprecian lasmagnitudes de p y q, con sus respectivos intervalos de con-fianza. Al incluir los estimadores obtenidos de esta TABLA en

472


TABLA V

ESTIMADORES DEL MODELO DE LA RAZ CUADRADA PARA LA TASA MXIMA DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL


b 0,042 0,022 0,062c 4,390 2,233 6,547Tmin 0,050 0,014 0,113Tmax 56,500 44,034 68,966

b, c, Tmin y Tmax son parmetros de regresin de la ecuacin.

TABLA VI

RAZ CUADRADA DE LA TASA MXIMA DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL, VALORES DE ORIGEN Y RESIDUALES

Temperatura (C) m (Origen) Estimado Residual9 0,170 0,177 0,007

12 0,281 0,288 0,00715 0,434 0,393 0,04118 0,472 0,492 0,02021 0,571 0,584 0,01324 0,663 0,667 0,00427 0,747 0,738 0,00930 0,812 0,796 0,01633 0,799 0,836 0,03736 0,888 0,857 0,03139 0,844 0,853 0,009

R2 (corregido) = 0,991.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 10 20 30 40 50

Temperatura (C)

Ra

z2

[Lo

g(U

FC

/m

L)]

Raz 2

Estimado

FIGURA 13. MODELO DE RATKOWSKY PARA TASA MXI-MA DE CRECIMIENTO DE L. lactis subsp. lactis.

la Ec. 7, se obtiene la ecuacin de prediccin para el tiempode generacin;

Tg = 14,288 / (Temperatura 7,638) (10)

En la TABLA VIII, se presentan los tiempos de genera-cin obtenidos del modelo primario, los estimados por el mo-delo y los residuales correspondientes, en la misma se puedeapreciar, que existe un ajuste muy bueno entre los estimadospor el modelo y los datos de origen, es decir, los obtenidos delmodelo primario. Sin embargo, se aprecia cierta tendencia delmodelo ajustado a sobreestimar el parmetro en estudio encasi todas las temperaturas, esto puede evidenciarse por ladispersin de los residuales por debajo del estimado, por locual los residuales son casi siempre negativos.

Este hallazgo no pudo ser comparado con otros trabajospuesto que no se encontr en la bibliografa la aplicacin deecuaciones hiperblicas para modelar el tiempo de genera-cin.

En cuanto a los valores obtenidos para el tiempo de ge-neracin para el L. lactis, se puede decir que los mismos sonbastante similares a los reportados por Langeveld y Cuperus[7]. Estos autores calcularon un tiempo de generacin especfi-co de 0,67 horas a 27C y en condiciones similares a las em-pleadas en este trabajo, con la salvedad de que los autores ci-

tados no calcularon el tiempo mnimo de generacin, sino eltiempo de generacin en la fase exponencial de crecimiento;vale decir, no utilizaron el modelo de Gompertz para el ajustede las curvas de crecimiento.

El coeficiente de determinacin R2 corregido obtenidopara este modelo fue de 0,991, similar al obtenido en el mo-delo de la raz cuadrada, lo cual deja bastante claro que exis-ti un buen ajuste. Por otra parte, es importante destacarque, tanto el tiempo mnimo de generacin, como la tasa m-xima de crecimiento exponencial, representan parmetros mi-crobiolgicos descriptivos de la velocidad de crecimiento delmicroorganismo en el medio o alimento, en este caso leche,estando ambos relacionados matemticamente, por lo cual,basta con modelar uno de ellos para lograr una funcin pre-dictiva. En el presente trabajo el modelo de la raz cuadradade la tasa de crecimiento parece ms apropiado para descri-bir la relacin entre la velocidad de crecimiento y la tempera-tura dentro del rango estudiado, por presentar menor magni-tud total de residuales y con una mejor distribucin de losmismos.

En la FIG. 14, se puede observar el ajuste del modelocon los tiempos de generacin obtenidos del modelo primariopara cada temperatura. En esta, se evidencia la capacidad delmodelo utilizado y de los estimadores empleados para calcularla relacin entre ese parmetro y la temperatura.

473


TABLA VII

ESTIMADORES DEL MODELO HIPERBLICO PARA EL TIEMPO DE GENERACIN


p 14,288 11,997 16,580q 7,638 7,403 7,874

TABLA VIII

TIEMPO DE GENERACIN, VALORES DE ORIGEN Y RESIDUALES

Temperatura(C)

Tg (Origen)(h)

Estimado(h)

Residual

9 10,456 10,492 0,03612 3,820 3,276 0,54415 1,603 1,941 0,33818 1,351 1,379 0,02821 0,924 1,069 0,14524 0,685 0,873 0,18827 0,539 0,738 0,19930 0,456 0,639 0,18333 0,472 0,563 0,09136 0,422 0,504 0,12239 0,421 0,456 0,034

R2 (corregido) = 0,991.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Los modelos aplicados para describir las curvas de cre-cimiento del Lactococcus lactis subsp. lactis, fueron muy pre-cisos para describir las etapas del crecimiento bacteriano estu-diadas, es decir, el modelo primario utilizando la ecuacin deGompertz permite la prediccin del crecimiento en cada unade las temperaturas ensayadas.

Los modelos secundarios utilizados en este trabajo re-sultaron apropiados para describir los parmetros microbiolgi-cos que permiten predecir la cintica de crecimiento del micro-organismo en estudio.

Se recomienda verificar las ecuaciones propuestas conalguna de las cepas del Lactococcus lactis subsp. lactis pro-ductoras de nisina, ya que esta bacteriocina ha resultado su-mamente til en la preservacin de los productos lcteos, in-cluso, resultara ms importante relacionar la produccin deeste metabolito con la cintica de crecimiento de la bacteriaestudiada controlando otras variables de crecimiento (pH, con-centracin de sal, actividad de agua y otras).

Finalmente, resultara importante utilizar los modelospropuestos en este trabajo para tratar de describir el creci-miento del Lactococcus lactis subsp. lactis en otros productos

lcteos, debido a que su utilidad como biopreservador seraimportante en productos como quesos frescos o leche pasteu-rizada.

AGRADECIMIENTO

Los autores desean expresar el ms profundo agradeci-miento al Decanato de Postgrado de la Universidad Simn Bo-lvar (USB) y a la Divisin de Investigacin de la Facultad deCiencias Veterinarias de la Universidad del Zulia por el finan-ciamiento otorgado para la realizacin de este estudio.

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0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temperatura (C)

Tie

mp

od

eG

ener

aci

n(h

ora

s)

Tiempo generacinEstimado

FIGURA 14. MODELO HIPERBLICO PARA EL TIEMPO DEGENERACIN DE L. lactis subsp. lactis.

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