MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN

TRANSLACIONAL

Virginia Hernández Gea

Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica

BCLC group. IDIBAPS. Hospital Clínic

MODELOS ANIMALES

Desarrollo de tratamiento de muchas enfermedades humanas

• Desarrollo tratamientos (tratamiento de DM con insulina en perros)• Validación mecanismos de acción (tratamiento de asma con anti-

IL5 en roedores y primates )• Estudios de seguridad /Eficacia (toxicidad de penicilina Ginea pigs)

Avances en investigación del genoma y biología molecular

ELEGIR EL MODELO ADECUADO

No hay modelos disponibles para todas las enfermedades

Determinadas condiciones etiología-especifica no son patogénicas en animales

• Virus de la Hepatits C virus no afecta roedores

La respuesta a un determinado agente inductor puede cambiar entre animales y humanos

CARACTERÍSTICAS DEL MODELO ANIMAL IDEAL

•Reproducibilidad % animales que alcanzan el estadio de interés

•Especificidad alteración deseada sin otras complicaciones

•Coste directo e indirecto mantenimiento colonia

•Seguridad riesgo para el personal

•Tamaño volumen de sangre requerido, accesos vasculares, cantidad fármaco

•Ética aceptabilidad del modelo

•Viabilidad del modeloexperiencia en el laboratorio, mano de obra

SIMILITUD CON LA ENFERMEDAD HUMANA OTRAS CONSIDERACIONES

• Patogénesis y fenotipo similar a la enfermedad en humanos

• Reflejo de interacciones celulares y moleculares (microambiente)

• Similares biomarcadores de enfermedad

• Predicción fiable de toxicidad y respuesta a terapias aprobadas en humanos

DESARROLLO HEPÁTICO

Chu & Sadler. Hepatology 2009

La formación del hígado empieza 60-72 horas post-fertilizaciónEl hígado esta completamente desarrollado a los 5 díasEl desarrollo hepático es independiente de la vasculogenesis

VentajasCamadas de gran númeroCreación de transgénicos es fácil, rápida y barataManipulación genética unida a fluorescencia permite visualización en tiempo real de todo el proceso de desarrollo

HEPATITIS AGUDA POR VHC

No modelos en animales pequeños que reproduzca todo el ciclo infección

La inoculación virus en roedores (incluso inmunodeprimidos) no produce infección detectable

Chimpancé• Permite el estudio de todos los pasos del ciclo vital de la infección

Replicación/Infección/Producción virus• Modelo immunocompetente

Estudio de la respuesta inmune huésped (innata & adaptativa)• Permite analizar cambios precoces en la expresión génica

Obtención muestras tras infección aguda• Probar de forma directa agentes antivirales• Único modelo para el estudio y desarrollo de vacunas• Limitaciones

• Éticas• Escasa disponibilidad• Coste prohibitivo

Bukh J. Gastroenteroogy 2012

USO DE RATONES

• Genética/bioquímica y fisiológicamente similares

• Habilidad para manipular su genoma

• Rápida reproducción • Mínima variabilidad biológica

• Disponibilidad de histología postmortem

VENTAJAS

USO DE RATONES

• Genética/bioquímica y fisiológicamente similares

• Habilidad para manipular su genoma

• Rápida reproducción • Mínima variabilidad biológica

• Disponibilidad de histología postmortem

• Diferencias propias de la especie

• Diferente talla/ ciclo vital/morfología de los órganos

• Actividad de la telomerasa

• Escaso desarrollo de metástasis o en localizaciones distintas

• Diferencias en vías de señalización y metabolismo

• Distinto microambiente y sistema inmune

VENTAJAS LIMITACIONES

Ligadura parcial de la Vena Porta • Fácil, reproducible y de bajo coste• Desarrollo de HTP muy rápido (máx 24h) • Una semana tras la LPVP , desarrollo

completo del sme HTP (circulación híperdinámica, shunts porto-sistémicos)

Sección rama de la Vena Ileocólica• Caracterizado en LPVP y BDL • La severidad de la hemorragia depende del

grado de hipertensión portal y del tamaño de la rama seccionada

• Buen modelo para testar drogas vasoactivas en condiciones hipovolémicas

Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006

HIPERTENSIÓN PORTAL HEMORRAGIA POR HIPERTENSIÓN PORTAL

COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS

COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS / FIBROSIS

Shunt Portocava en ratas

• Bypass portosistémico sin fallo hepático• Cambios comportamiento • Reversible con tratamiento anti-EH• Buen modelo para estudio EH y

desarrollo de nuevos fármacos

Díaz-Gómez et al. Rev Esp Enferm Dig. 2011

ENCEFALOPATIA HEPÁTICA FIBROSIS POR ALCOHOL

Modelo Lieber–DeCarli • Reproduce la mayoría de los rasgos

patológicos de la enfermedad

hepática por alcohol

• Dieta semilíquida que aporta etanol

como el 36% de las calorías totales

• Ad libitum como única fuete de

alimento y líquido

• Fibrosis pericelular y perivenular

progresiva

• Aparición de cirrosis en 1/3 de los

animales después de una exposición

tras 1-3 años.

FIBROSIS

• Necrosis centro-lobulillar aguda• Respuesta reparadora inmediata

• Reclutamiento de células inflamatorias• Incremento de matriz extracelular

• Fibrosis significativa tras 2-4 semanas• Cirrosis micronodular en 12 semanas• Administración ip / inhalación • DEN (Diethylnitrosamine) + CCl4 reproduce la

secuencia daño hepático / fibrosis / transformación maligna

• Fibrosis periportal • Cirrosis macronodular en 12

semanas• Administration: i.p. / agua

TETRACLORURO DE CARBONO TIOACETAMIDA (TAA)

Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006

FIBROSIS

• Cirrosis biliar primaria.• Especialmente apropiado en ratas

(no tienen vesícula biliar)• Desarrollo de fibrosis-cirrosis biliar

en 4-6 s • Proliferación colangiocitos y fibrosis

portal• Demuestra la importancia a de los

miofibroblastos periportales

Concanavalin A

• Injección iv durante 20 semanas

• Fibrosis centrilobular y perisinusoidal

Schistosoma mansoni

• Exposición percutanea produce granulomas y fibrosis periportal

Arias M et al. BMC Gastroenterology 2003

LIGADURA COLÉDOCO INMUNOLOGICAMENTE MEDIADA

MANIPULACIÓN GENÉTICA

Gen de interés

Pérdida de función Ganancia de función

Knock-down Knock-out Transgénico Knock-in

RNAi

Control Espacial & Temporal?

No Sí

Conventional knockout

Reversible?

Cambio esporádico?

Inducible system

Knock-out condicional

Virus-mediated delivery

No

No

No Sí NoSí

No Sí

Control Espacial & Temporal?

Control Espacial & Temporal?

Expresión Tejido específica?

• Condicional(Cre-Lox)

• Inducible(Tet)

Transgénico con

promotor ubicuo

Transgenico con

promotor Tejido-

específico

Knockin Convencional

Sí

Sí

FIBROSIS

RATONES KNOCK OUT ATP-binding cassette (ABC) B4 (ABCB4-/-)

Defecto en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos al luz canalicular

Desarrollo espontáneo de fibrosis

LIM homeobox gene (Lhx) 2 (LHX2-/-)

Ratones deficientes en LHX2 desarrollan fibrosis hepática espontánea y progresiva durante el desarrollo embrionario (día 14) semanas del nacimiento

El gen de interés se reemplaza (knock out) mediante selección antibiótica (Neomicina)

Inyección embrión y Reproducción

COMBINACIONES

Hepatotoxinas: CCl4/TAA con Modificación genética tejido específica (sistema Cre LoxP)

La deleción del gen Atg7 específicamente en HSC aminora el desarrollo de fibrosis tras provocación daño hepático con hepatotoxinas.

PROMOTOR LOX

GFAP

Atg7

CRE

Deleción gen interés en celulas estrelladas

GFAP-cre Atg7F/F

Homocigotos Atg7flox/flox GFAP-Cre(Knockout Atg7 específicamente en

células estrelladas)

FIBROSIS

Hernandez-Gea et al. Gastroenterology 2012

LOX

PROMOTOR

FIBROSISRATONES TRANSGÉNICOSSobreexpresión de Tgf-β1 en hepatocitos (ALBUMIN-Promoter)

Sobreexpresión de PDGF-C en hepatocitos

Cambios morfológicos a las 2 semanas de edad con fibrosis prominente a las 6 semanas

HCC entre 6 meses-1 año. Reproduce los pasos de desarrollo de HCC que ocurren en humanos (esteatosis, fibrosis, displasia, neoangiogenesis y malignización)

Doyle A et al.Transgenic Res (2012)

HEPATOCARCINOMA

DOBLE TRANSGÉNICOMyc/TGFα

TGFa bajo el promotor metalotionina. Myc bajo el promotor albúmina

20% de los ratones transgénicos para ambos genes desarrollan HCC a los 4 meses y el 100% a los 8-10 meses.

Co-expresión de Myc y TGFa induce tumores con alto grado de inestabilidad genética, aneuplodia y alta proliferación similar a los HCC de mal pronóstico

Sobreexpressión hepática de linfotoxinas α y β

Selectivamente en hepatocitos Hepatitis crónica a los 9 mesesHCC a los 12 meses

Johannes Haybaeck et al. Cell 2009

Control LTαβ LTαβ

Factor VM et al. J Biol Chem 1998

TRANSGÉNICOS CONSTITUTIONALES LIMITACIONES

Letalidad embrionaria / infertilidad

El gen alterado puede ser vital para el desarrollo normal

Variabilidad en el patrón de expresión

Poco control sobre el sitio de integración y el nº copias del DNA insertado

Puede que la proteína truncada todavía retenga actividad biológica

No mimetiza la secuencia de eventos presentes en la tumorogenesis espontánea

Mutación esta presente en todas las células alteradas y desde el principio

El transgen se integra en los dos alelos del genoma del animal

Tanto las células tumorales como estromales expresan el transgen

Disponibilidad limitada de promotores tejido-específico

HEPATOCARCINOMATRANSGÉNICOS INDUCIBLESRaton transgénico con delección del oncogen Myc específica en hígado e inducible

Proteína tTA bajo el control del promotor LAP (Liver activator promotor) capaz de unirse en hígado a celulas que expresan secuencia específica TetO

Myc bajo el control de protor TetO-CMV

El tratamiento con Doxicilina en estos animales previene la expressión de Myc.

Discontinuación de doxiclinia a las 3 semanas de edad activa la expressión de Myc (Tet-Off) y los ratones que expresan Myc desarrollan HCC a las 12 semanas

TetR VP16

TetO CMV Myc Expresión gen interés

TetR VP16No expresiónLAP

Doxi

LAP

Shachaf CM et al. Nature 2004

Firma genética generada en hepatocitos primarios de ratón basada en la expresión temporal del gen TGFβ es capaz de identificar distintos subgrupos de HCC en humanos

INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN)

Coulouarn C et al. Hepatology 2008

INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) En humanos los dos subgrupos generados presentan diferencias en supervivencia, origen de células tumorales (hepatoblastos vs hepatocitos), expresión c-Met/HGF, HBV status.

Coulouarn C et al. Hepatology 2008

IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ONCOGENES

Análisis de expresión para comparar anomalías genómicas (amplicones) entre ratón y humano. Los eventos recurrentes sirven como filtro para identificar los genes candidatos. Una vez identificados se evalúa su funcionalidad en cuanto actividad tumoral o metastásica

p53−/− con sobreexpresión de Myc (marcage GPP)Identificación de oncogenes cIAP1 y Yap Zender L et al. Cell. 2006

XENOGRAFTS

Inyección de células tumorales humanas o fragmentos de tumor de forma subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes

Crecimiento tumoral con el soporte del estroma y vasculatura murina

Formación de nódulo tumoral en 2–6 semanas tras implantación

Pilar principal de los estudios preclínicos para el desarrollo in vivo de nuevos medicamentos

Células tumorales en cultivo

Inyección subcutánea de células

DESARROLLO NUEVOS TRATAMIENTOS

Sharpless & DePinho. Nature Reviews Drug Discovery 2006

Tras inyectar células tumorales, los ratones se tratan con el compuesto de interés durante 2-6 semanas tiempo durante el cual se desarrolla el tumor. Es estudio es positivo si el compuesto de interés reduce le crecimiento tumoral

Cultivo de células tumorales

Inyección ≈ 106 células en ratón inmunodeprimido

Tratamiento durante 2-6 semanas

XENOGRAFTS

• Fácil uso y bajo coste• Células tumorales

representativas de tumores reales (complejidad genética)

• Evaluación del volumen tumoral y crecimiento tras tratamiento

• Nuevas terapias: • diferentes dosis • esquemas de tratamiento en

el mismo set de células• Gran ayuda para priorizar los

compuestos que pasaran a Fase I

• Inmunosupresión huésped • SCID mice (severe combined

Immunodeficience) tienen defectos en los mecanismos de reparación del DNA

• Nude mice ( alteración timica ): fragilidad general que limita su tolerancia y resistencia a fármacos

• No sirve para evaluar tratamientos inmunomoduladores

• No recapitulan completamente la heterogeneidad intratumoral ni el microambiente

• Eficacia quimioterapéutica es sensible pero poco específica

• Hasta 89% de fármacos que superan los estudios preclínicos nunca llegan a ser aprobados

VENTAJAS DESVENTAJAS

QUIMERAS / TRASPLANTE HUMAN-IN-MOUSE

Células cancerígenas humanas se implantan en un tejido adyacente normalFácil/ Rápido/ Coste efectivoValoración interacciones tumor-estroma (quimeras)Desarrollo y validación de nuevos fármacos Heyer J et al. Nature Reviews Cancer. 2010

MODELO ANIMAL IDEAL

GEMM

Biología MolecularFisiopatología

Desarrollo FármacosQuimioresistencia

Análisis genomaPerfil molecular

Histopatología

Estudios Imagen in vivo

Carcinogénesis

Screening Identificación Biomarcadores

Determinantes de progresión metastásica

Influencia factores

ambientales

CONCLUSIONES

• El perfecto modelo animal todavía esta por generar

• En cáncer, no existe el modelo que recapitule todos los estadios del desarrollo del tumor

• Diferencias interespecies obligan a seguir utilizando material humano

• Entender las ventajas y limitaciones de cada modelo es necesario para maximizar la rentabilidad de los modelos disponibles