Revista Tendencias en Docencia e

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Año 5

Número 5

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Modelado de la interacción de albúmina de suero de bovino (BSA) con diferentes combinatorias en la estructura de

pirrol sintetizado por plasma (PPPy) García Martínez Alberto Abraham1, Olayo González Roberto2*, Morales Corona Juan,

Guzmán Benavides Laura Noemí1, Vicente Escobar Jonathan Osiris1, Serratos Álvarez Iris Natzielly1*

1Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, Departamento de Química. Avenida San Rafael Atlixco No. 186. Colonia Vicentina, Ciudad de México. CP 09340.

2Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa, Departamento de Física. Avenida San Rafael Atlixco No. 186. Colonia Vicentina, Ciudad de México. CP 09340.

*Autóres de córrespóndencia: óagr@xanum.uam.mx

Recibido 22/agosto/2019

Aceptado 04/noviembre/2019

Palabras clave: Albu mina de sueró bóvinó (BSA), pólipirról sintetizadó pór plasma (PPPy), cóntribució n electrósta tica.

Keywords: Bóvineserumalbumin (BSA), plasma synthesizedpólypyrról (PPPy), electróstatic cóntributión.

RESUMEN

Se ha estudiado la interacción entre el polipirrol sintetizado por plasma (PPPy) con

la proteína albúmina de suero bovino (BSA). Esta interacción es importante debido a

que el PPPy presenta neuroprotección y mejora la actividad motora en lesiones

traumáticas de médula espinal en roedores. Se realizaron estudios de acoplamiento

molecular (docking) alrededor de la superficie de BSA con diferentes combinaciones

de PPPy generados a partir de la estructura reportada por Kumar et al., (2003) y se

evaluó la energía de unión de estos complejos. Los resultados obtenidos indicaron

una clara contribución electrostática en los sitios de reconocimiento sobre la

superficie de BSA debido a la combinación de tres grupos funcionales (CH3, OH y

NH2) presentes en los confórmeros de PPPy. Es importante mencionar que estos

resultados complementan evidencias experimentales y computacionales de nuestro

grupo de investigación.

ABSTRACT

The interaction between plasma synthesized polypyrrol (PPPy) with bovine serum albumin protein (BSA) has been studied. This interaction is important because PPPy exhibits neuroprotection and improves motor activity in traumatic spinal cord lesions in rodents. Docking studies were made around of surface of BSA with different combinations of PPPy generated from the structure reported by Kumar et al., (2003) and the binding energy of these complexes was evaluated. The results indicated a clear electrostatic contribution at the recognition sites on the surface of BSA due to the combination of three functional groups (CH3, OH and NH2) present in the PPPy conformers. It is important to mention that these results complement the experimental and computational evidence obtained in our research group.

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Introducción

La albúmina de suero de bovino (BSA por sus siglas en inglés) es una proteína de transporte compuesta por 583 aminoácidos, posee estructura de α-hélice y tiene un peso aproximado de 66 kDa. La BSA está compuesta de tres dominios donde se encuentran tres cavidades de carácter hidrofóbico. Se ha reportado que en estas cavidades se unen una variedad de ligandos (Wu et al., 2017), (ver figura 1).

Figura 1. Estructura y cavidades de la albúmina de suero de bovino (BSA), reportada por Kumar et al., (2003).

Además de que ciertos ligandos se unen a BSA, esta proteína puede anclarse a materiales como el pirrol polimerizado por plasma (PPPy) (ver figura 2) el cual, es un biomaterial que tiene la capacidad de mejorar las funciones motoras y sensoriales en lesiones traumáticas de medula espinal (Zhang et al., 1998, Álvarez et al, 2015).

Figura 2. Estructura química del pirrol polimerizado por plasma (PPPy).

Experimentalmente se ha estudiado el sistema BSA-PPPy, en donde se demostró que el efecto de la proteína y el polímero promueve el tratamiento de las lesiones en médula espinal en roedores. Dichos estudios se realizaron a través de análisis superficiales y reológicos. Los estudios de superficie estuvieron basados en técnicas fisicoquímicas como Espectroscopia Infrarroja, Espectroscopia de fotoelectrones emitidos por Rayos X y ángulo de contacto. Los estudios de reología se realizaron entre el PPPy en combinación con la BSA de rata (Fabela et al., 2017).

Por otro lado, en nuestro grupo se publicó previamente un estudio computacional sobre la interacción molecular en las cavidades hidrofóbicas de BSA con dos modelos combinatorios de PPPy. El primer modelo en la estructura de PPPy consistió en sustituir (CH3), hidroxilo (OH) y amino (NH2) aleatoriamente en R1, R2 y R3 como se muestra en la figura 2. En el segundo modelo combinatorio, se sustituyeron los grupos nitrilo (C≡N), hidroxilo (OH) y amino (NH2). Se observó que los grupos funcionales que favorecieron la unión BSA-PPPy fue el modelo combinatorio uno con la siguiente posición de los grupos funcionales R1=OH, R2=CH3, R3=NH2 en la estructura de PPPy. También es importante mencionar que en la cavidad uno de la BSA la unión fue muy favorable con la estrcutura de PPPy y donde predominaron las interacciones de tipo hidrofóbico. (Serratos et al., 2018). Cabe mencionar que fue importante probar la estructura determinada por Kumar et al., 2003 en las cavidades de la BSA como control. El estudio de Serratos et al. 2018 permitió establecer dos criterios fundamentales para la continuación del estudio computacional en la interacción de BSA-PPPy: 1) Estudiar la interacción ahora alrededor de la superficie de BSA con la estructura de PPPy y 2) Utilizando el modelo combinatorio uno, el cual ha sido el más favorable como ya se mencionó en el sistema BSA-PPPy. En el presente trabajo, también se varió la posición de CH3, OH y NH2 en los sitios de R1, R2 y R3 en la estructura de PPPy, ya que la afinidad se modifica con la posición de los grupos funcionales. Estos estudios de interacción se realizaron a través de estudios de reconocimiento molecular (docking) y con cálculos de energía libre de unión (∆𝐺𝑢) de estos complejos. Los resultados indicaron que en la mayoría de los complejos fueron favorecidos con la posición de R1=OH, R2=CH3 yR3=NH2; y las interacciones que se establecieron fueron de tipo electrostático alrededor de la superficie de la BSA. Sin embargo, cuando el sitio encontrado estaba cerca de una de las cavidades de BSA, las interacciones fueron de tipo hidrofóbico. Estos estudios han permitido proporcionar una mejor interpretación molecular a los resultados

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computacionales obtenidos recientemente sobre la unión de PPPy en las tres cavidades de BSA. Estos estudios exhaustivos permitirán que se construya una red compleja de PPPy utilizando la posición más favorable de los grupos funcionales NH2, OH y CH3 e interactúe sobre la superficie de BSA. También, estos resultados complementan experimentos in vivo realizados en roedores donde se ha estudiado la interacción BSA con micropartículas de PPPy en el grupo de investigación del Dr. Roberto Olayo en la UAM-I (Fabela et al., 2019).

Metodología

Estudio computacional de la interacción BSA-PPPy

a) Preparación de las estructuras de la BSA y PPPy

Se realizó el análisis computacional utilizando el programa GROMACS (Groningen Machines for Chemical Simulations) mediante una Dinámica Molecular (MD) con el fin de relajar la proteína BSA y la molécula PPPy (obtener energías de minimización), lo anterior se logró a partir del empleo de campos de fuerza de OPLS/aa (The all-atom Optimized Potentials for Liquid Simulations), por ello, se realizaron los siguientes pasos:

1) Con la utilería de GROMACS pdb2gmx se eliminaron las moléculas de agua cristalina del archivo PDB de la BSA. Se empleó al sistema OPLS-AA/L all-atom force field (2001 aminoacid dihedrals), esto con el fin de asignar la topología con los parámetros que este campo de fuerzas incluye.

2) Para solvatar al sistema se empleó la utilería de GROMACS empleando el campo de fuerzas spc216.gro que es un modelo equilibrado de 3 puntos.

3) Los iones agregados para neutralizar al sistema se incluyeron mediante las utilerías de GROMACS en donde se agregaron iones Cl-.

4) El proceso para minimizar la energía (relajar al sistema) se llevó a cabo mediante una dinámica molecular en la cual las condiciones se muestran a continuación:

La simulación se realizó en el conjunto canónico NVT (número de moléculas, volumen y temperatura constantes). La temperatura del sistema se adaptó al termostato V-rescale (termostato de Berensen modificado) con un tiempo de integración de 0.002 ps. Se manejaron los grupos electrostáticos con PME (Particle Mesh Ewald for long-range electrostatics), se utilizó

“lincs” cómó algóritmó de restricción de enlace, además de un esquema de corte de tipo Verlet con una distancia de primeros vecinos de 1 nm. Esta simulación se llevó a cabo durante 2000 ps cón un integradór del tipó “md”. Las condiciones para relajar la mol´cula de PPPy mediante dinámica molecular fueron las siguientes:

1) El desarrollo de la simulación se realizó con el programa GROMACS y el campo de fuerza OPLS/aa.

2) En un ensamble del conjunto canónico NVT con el número de moléculas constante, se empleó un volumen de 3.57 nm y el termostato de Berensen con un tiempo de integración de 0.002 ps. Además, los grupos electrostáticos fueron manejados con PME, con un esquema de corte de tipo Verlet con una distancia de 1.2 nm para primeros vecinos. La dinámica molecular se llevó a cabo durante 4000 ps.

De acuerdo con la figura 2, se generaron tres modelos combinatorios en los sitios R1, R2 y R3 en la estructura de PPPy:

Modelado 1, equivale a R1= OH, R2=NH2, R3=CH3

Modelado 2, equivale a R1=CH3, R2=OH, R3=NH2

Modelado 3, equivale a R1=NH2, R2=CH3, R3=OH

Estos modelos se pueden apreciar en la siguiente figura.

Figura 3. Estructura química y modificada de PPPy (Kumar et al., 2003), incluyendo las diferentes combinaciones: A. R1=OH, R2=NH2, R3=CH3, B. R1=CH3, R2=OH, R3=NH2, C. R1=NH2, R2=CH3, R3=OH.

b) Estudios de acoplamiento (docking) de los complejos BSA-PPPy

Los estudios de acoplamiento molecular se realizaron con el programa Autodock Vina (Trott y Olson, 2010), los mejores modelos se seleccionaron bajo criterios energeticos y geometricos para cada combinación.

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c) Cálculos de energía libre de unión BSA-PPPy: contribución electrostática y no electrostática

c.1) Cálculos electrostáticos.

De acuerdo a Baker et al., 2001, la energía libre de unión (∆𝐺𝑢) se puede determinar a partir de las contribuciones del tipo electrostático ( ∆𝐺𝑢,𝑒𝑙𝑒𝑐 ) y no electrostático

(∆𝐺𝑢,𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐) empleando la siguiente expresión:

∆𝐺𝑢 = ∆𝐺𝑢,𝑒𝑙𝑒𝑐 + ∆𝐺𝑢,𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐 (1)

donde ∆𝐺𝑢,𝑒𝑙𝑒𝑐 es función de la energía de solvatación

(∆𝐺𝑠𝑜𝑙) y la energía coulómbica (∆𝐺𝑐𝑜𝑢𝑙). Dicha relación está dada por la siguiente expresión:

∆𝐺𝑢,𝑒𝑙𝑒𝑐 = ∆𝐺𝑠𝑜𝑙 + ∆𝐺𝑐𝑜𝑢𝑙 (2)

Para determinar las energías electrostáticas se determinaron con el programa Adaptive Poisson-Boltzmann. Los calculos se resolvieron en un medio continuo y a traves de un ciclo termodinamico.

c.2) Cálculos no electrostáticos

La evaluación de las interacciones no electrostáticas ( ∆𝐺𝑢,𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐 ) en el ∆𝐺𝑢 se obtuvo mediante la energía

liberada al ocultar el área de la interfase al solvente cuando se forma el complejo. Esta energía es proporcional al cambio en el área accesible al solvente y un parámetro perteneciente a la tensión superficial (γ) ) cuyo valor es de 0.021 kJ/mol-1Å-2, por lo que se obtiene ∆𝐺𝑢,𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐 = (γ) 𝐴𝑆𝐴𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑓𝑎𝑠𝑒 (Friedman y Honig, 1995).

Se empleó el programa Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey et al., 1996) para calcular el área de la interfase que queda oculta del solvente en el complejo, a partir de los archivos PDB del complejo y de las moléculas aisladas:

∆𝐺𝑢,𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐 = γ( 𝐴𝑆𝐴𝐵𝑆𝐴−𝑃𝑃𝑃𝑦 − 𝐴𝑆𝐴𝐵𝑆𝐴 − 𝐴𝑆𝐴𝑃𝑃𝑃𝑦) (3)

Una vez obtenidas las contribuciones electrostáticas y no electrostáticas del complejo, se calculó el ∆𝐺𝑢 con base en la ecuación 1.

Resultados y discusión

Tomando como referencia la metodología descrita en el apartado anterior, en la tabla 1 se muestran los valores de las energías de unión de los complejos más favorables de cada sistema combinatorio de PPPy alrededor de la superficie de BSA.

Tabla 1. Análisis energético para los modelos combinatorios más favorables en la interacción BSA-PPPy.

∆𝑮𝒔𝒐𝒍 (𝐤𝐉/𝐦𝐨𝐥)

∆𝑮𝒄𝒐𝒖𝒍 (𝐤𝐉/𝐦𝐨𝐥)

∆𝑮𝒏𝒐𝒆𝒍𝒆𝒄 (𝐤𝐉/𝐦𝐨𝐥)

∆𝑮𝒖∗

(𝐤𝐉/𝐦𝐨𝐥)

Modelo 1 (R1=OH, R2=NH2, R3= CH3)

71 -2 -21 48

Modelo 2 (R1=CH3, R2=OH, R3= NH2)

38 -204 -14 -180

Modelo 3 (R1= NH2, R2=CH3, R3=OH) 73 -102 -22 -51

∆𝑮𝒖∗ = ∆𝑮𝒔𝒐𝒍 + ∆𝑮𝒄𝒐𝒖𝒍 + ∆𝑮𝒏𝒐𝒆𝒍𝒆𝒄

En la tabla 1 se observó que los modelos combinatorios 2 y 3 fueron más favorables energéticamente ( ∆𝐺𝑢 =−180 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 y ∆𝐺𝑢 = −51 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 respectivamente). Es claro que la mayor contribución energética en las zonas encontradas en la superficie de BSA está dada por el componente cuolómbico, si bien, las interacciones no electrostáticas contribuyen energéticamente, pero en menor proporción en la unión. Sin embargo, en el modelo combinatorio 1 la región encontrada predominó las interacciones no electrostáticas que se ve reflejado en el ∆𝐺𝑛𝑜𝑒𝑙𝑒𝑐 ( −21 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 ) y por lo tanto ∆𝐺𝑢 fue menos favorable, además este sitio encontrado se localizó cerca de una de las cavidades hidrofóbicas. La mayoría de los complejos obtenidos por el estudio de acoplamiento molecular entre BSA y los modelos combinatorios 2 y 3 de PPPy indicaron que el ∆𝐺𝑢 fue favorable y predominaron las interacciones electrostáticas (datos no mostrados). Es importante mencionar que en un reciente trabajo por nuestro grupo Serratos et al., (2018), se realizaron estudios de acoplamiento en las cavidades de BSA con la estructura de PPPy utilizando los mismos grupos funcionales y se determinó que la energía de unión fue gobernada por interacciones no electrostáticas. En este trabajo el reconocimiento molecular de PPPy por BSA (alrededor de la superficie) se establece principalmente por contactos electrostáticos, ya que en las cavidades y sitios cercanos a éstas los contactos de interacción son de tipo hidrofóbico.

En la figura 4A se muestra la interacción de los tres modelos combinatorios alrededor de la superficie de BSA aleatoriamente. En la figura 4B se muestra la mejor combinación que corresponde al modelo 2 alrededor de toda la superficie de BSA. Finalmente, en la figura 4C se muestran los aminoácidos de la BSA que interactúan con la estructura de PPPy para el modelo menos favorable (lado izquierdo) y en la figura 4D el mejor modelo (lado derecho).

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Figura 4. Interacción en la superficie de BSA con PPPy: A. Proteína BSA rodeada superficialmente por cada uno de los modelos combinatorios de PPPy propuestos. B. Complejo BSA-PPPy del modelo combinatorio más favorable (Modelado 2) sobre toda la superficie de la proteína. C. Complejo menos favorable: Modelo combinatorio 1 (R1=OH, R2=NH2, R3=CH3); D. Complejo más favorable: Modelo combinatorio 2 (R1=CH3, R2=OH, R3=NH2).

En la figura 4A se observa el complejo de la BSA rodeada con cada uno de los modelos combinatorios propuestos, los sitios de interacción se hicieron de manera aleatoria con el fin de abarcar la mayor área superficial sobre la proteína. En la figura 4B se muestra la selección al complejo más favorable (Modelado 2), en donde se realizó el mismo procedimiento rodeando toda la superficie de la proteína seleccionando sitios de interacción aleatorios. En la figura 4C se pueden observar los grupos de interacción que contribuyeron al modelo menos favorable (R1=OH, R2=NH2, R3=CH3) en donde participan grupos cargados tales como Lys502 que interactúa con el Oxígeno del PPPy, Glu 501 cuya interacción se establece con el N de uno de los anillos del PPPy, Asp 500 y Phe 499 entre otros. La posición R2=NH2 de este modelo desfavoreció la formación de posibles puentes de hidrógeno debido a la poca movilidad que esta cadena presenta. Por otro lado, las interacciones más favorables pertenecientes al modelado 2 (R1=NH2,

R2=CH3, R3=OH) se establecieron principalmente por puentes de hidrógeno entre N de Lys469 y O de PPPy, además de O de Asp491 y O de PPPy.

A continuación, se comparan los potenciales electrostáticos del modelo combinatorio 2 como el complejo más favorable respecto al modelo combinatorio 1 (complejo menos favorable). Con el objetivo de analizar las cargas de la proteína cuando se forma el complejo.

Figura 5. Potenciales electrostáticos. Modelo combinatorio 2: R1=CH3, R2=OH, R3=NH2: A. Proteína (BSA). B. Complejo BSA-PPPy obtenido por estudios de acoplamiento molecular. Modelo combinatorio 1: R1=OH, R2=NH2, R3=CH3. C. Proteína (BSA). D. Complejo BSA-PPPy obtenido por estudios de acoplamiento molecular. (Color azul indica cargas positivas, el color rojo las cargas negativas y el color blanco contribuciones no electrostáticas).

En la figura 5 se mostraron los potenciales electrostáticos para el complejo más favorable y el menos favorable. Para el modelo 2, se observó que en la proteína (figura 5A) predominaron las cargas negativas (color rojo), principalmente por la presencia de los residuos lisinas y glutámicos en ese sitio. Al formarse el complejo BSA-PPPy (figura 5B), se crea un ambiente electrostático fuerte (color rojo y azul) debido a que en la molécula de PPPy predominan las cargas positivas de los grupos aminos. Además, cuando interactúa el modelo combinatorio 2 de PPPy, la carga positiva generada en el sitio R3=NH2 se atraen electrostáticamente con las cargas negativas de los oxígenos del grupo carbonilo de las lisinas y treoninas. También un grupo amino que forman parte del anillo de PPPy interactúo electrostáticamente con los oxígenos del Glu 501 (figura 4A). Otra interacción electrostática importante en el modelo combinatorio 2 de PPPy es la que se estableció en

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R2=OH con lisinas. Finalmente, para R1=CH3tiene menos movilidad e interactúa con contactos hidrofóbicos. Estas contribuciones se reflejaron en el valor del ∆𝐺𝑢 (-180

kJ/mol). Cabe mencionar que en la mayoría de los complejos obtenidos en la superficie de BSA presentaron interacciones electrostáticas similares excepto en sitios cercanos a las cavidades hidrofóbicas de BSA. Como es el caso del modelo combinatorio 1 se observó que el sitio encontrado por el estudio de acoplamiento molecular en la superficie de BSA (figura 5C) predominaron contactos hidrofóbicos treoninas, prolinas y valinas (color blanco) y en menor proporción interacciones electrostáticas al formarse el complejo (figura 5D) ya que el CH3se encontró en el sitio R3.

En este estudio fue importante determinar cómo influye la posición del NH2, OH y CH3 en R1, R2 y R3 en la interacción con la superficie de BSA. Se demostró que el grupo NH2 y el OH deben estar en R1 y R3 para favorecer las interacciones de tipo electrostático. Con base en estos resultados se está realizando la construcción de una red molecular de PPPy utilizando el modelo combinatorio 2 porque fue el más favorable sobre BSA para explicar con más detalle esta interacción. Además, se realizarán estudios de titulación por fluorescencia para determinar una constante de unión sobre este sistema. Es importante complementar los estudios in vivo que se realizaron en roedores a través de una microinyección con partículas de PPPy en suspensión en una solución de BSA para el tratamiento de lesiones de médula espinal ya que hasta ahora no hay modelos moleculares que expliquen dicha interacción.

Conclusiones

El reconocimiento molecular entre la superficie de BSA y los modelos combinatorios 2 y 3 se estableció principalmente por los grupos funcionales NH2 y el OH generando un ambiente electrostático si se encuentran en las posiciones R1 y R3. Sin embargo, para que la unión sea muy favorable la posición del NH2 debe ser en R3 en la estructura de PPPy. En la posición R2 se tiene menos movilidad y menos contactos en la interacción BSA-PPPy. También se observó que los valores de ∆𝐺𝑢 de la mayoría de los complejos obtenidos fueron conducidos por contribuciones electrostáticas respecto a contribuciones no electrostáticas. Estos resultados complementan el trabajo de Fabela et al., (2017) donde se realizaron estudios superficiales y reológicos entre la BSA y micropartículas de PPPy para explicar el papel que desempeña el grupo NH2 en la superficie de estos biomateriales y su interacción con ésta y otras proteínas.

Esta interacción es importante para el tratamiento de las lesiones de médula espinal en roedores.

Agradecimientos

A la M. en C. Brenda Anahí Segura Bailón por su apoyo en la discusión de resultados y apoyo técnico.

Alberto Abraham García Martínez agradece al Dr. Edgar Rojas Núñez por la beca de Proyecto CONACyT No. 287101 otorgada para estudios en la Lic. En Química de la UAM-I.

Jonathan Osiris Vicente Escobar agradece a CONACyT por la beca de posgrado No. 375880 otorgada para los estudios del Doctorado en Ciencias (Química).

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