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Identificación de la Inmunoglobulina G en suero bovino y humano purificado mediante Cromatografía de Afinidad, ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para su cuantificación y electroforesis SDS-PAGE para su caracterización final.
Ketsia Y. González Vázquez
Resumen:
Las inmunoglobulinas o anticuerpos se encargan de reconocer un antígeno y de
enviar señales al interior de la célula B para inducir una respuesta inmunológica efectiva
contra el mismo. Se utilizaron diferentes técnicas para lograr la identificación de nuestra
proteína de interés, inmunoglobulina G en suero humano. La primera técnica utilizada fue
cromatografía de afinidad, su propósito, obtener la IgG purificada; para lograr esto se
hicieron tres lavados con amortiguador de unión en los que se indujo la unión de la
proteína A y la IgG. Posteriormente estas uniones fueron rotas utilizando un amortiguador
de elución en tres eluciones diferentes para así obtener la IgG purificada. Se utilizó un
ensayo de BCA para cuantificar la IgG y mediante la realización de una curva estándar de
concentración conocida de una proteína estándar, en este caso albúmina de suero bovino
(BSA), se corrigieron los valores obtenidos de las absorbancias de las muestras de IgG
con concentración desconocida. Por último, mediante la electroforesis de poliacrilamida se
determinó la presencia de la proteína de interés en las muestras y de esta forma también
se comprueba la eficacia de las técnicas utilizadas anteriormente. Durante la identificación
de la proteína de interés se logró purificar la misma, así como conocer la concentración de
esta en la muestra y comprobar su pureza mediante la electroforesis de poliacrilamida
donde se presentaron bandas de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina G.
Este tipo de pruebas son de mucha ayuda en el campo clínico, ya que ayudan a identificar
algunas enfermedades como el virus de inmunodeficiencia humana.
Introducción:
La respuesta inmunológica humoral es la encargada de proteger al organismo de
numerosos patógenos. Los linfocitos B son las células que poseen un rol indispensable en
esta rama de la respuesta inmunológica adaptativa, ya que pueden reconocer una gran
cantidad de antígenos, incluyendo aquellos que son solubles, por medio de moléculas
especializadas llamadas anticuerpos o inmunoglobulinas presentes en su superficie. La
inmunoglobulina inicialmente se encuentra anclada en la membrana celular donde forma
parte del receptor para antígeno de los linfocitos B, el cual se encarga de reconocer el
antígeno y de enviar las señales al interior de la célula B para inducir una respuesta
inmunológica efectiva8.
Biológicamente, las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que son producidas
por los linfocitos B o sus células derivadas, las células plasmáticas, y que poseen la
capacidad de reconocer y unirse específicamente al antígeno que indujo su formación. Su
función es inactivar o destruir antígenos en el organismo9. Existen cinco tipos de
inmunoglobulina, en las que se encuentran la IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Para nuestro
propósito nos estaremos concentrando exclusivamente en la Inmunoglobulina G, esta es
la más pequeña y la que más abunda en el fluido corporal, además es la única capaz de
atravesar la placenta y brindarle inmunidad al bebé. La purificación, cuantificación y
electroforesis son procesos esenciales para el estudio de una proteína, por lo tanto fueron
empleados para lograr la identificación de la IgG.
Debido a su estructura, las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas y purificadas
por diferentes métodos, entre los que se encuentra la cromatografía de afinidad. Este
proceso consta de una fase móvil y la fase estacionaria. La sustancia de interés quedará
enlazada a la fase estacionaria y es mediante este enlace que ocurre la separación y los
demás componentes de la muestra migrarán con la fase móvil. La fase estacionaria
utilizada fue un gel de agarosa con la Proteína A y la fase móvil el suero humano que
contenía la IgG.
Existen varias proteínas bacterianas (proteína A, proteína G, proteína L) que tienen
la capacidad de enlazar anticuerpos con mucha eficiencia. Para el estudio que se llevó a
cabo en el laboratorio, se utilizó proteína A que se encuentra en la pared celular de
algunas cepas de la bacteria Staphylococcus aureus10, con el fin de separar de
inmunoglobulina G de una muestra de suero bovino.
En cuanto a la cuantificación de una proteína se refiere a la cantidad y/o
concentración de proteína presente en una muestra, existen diferentes técnicas para
llevar a cabo este proceso1. En este caso se utilizó el ensayo de ácido bincinconínico
(BCA), el reactivo presente en este ensayo forma un complejo ternario en medio alcalino
al unirse al cobre reducido Cu+1, además, posee una elevada sensibilidad y selectividad
en la detección colorimétrica, es así la quelación de un ion cobre por dos moléculas de
BCA3. Al ocurrir esta reacción obtenemos un producto de color violeta con absorbancia a
562nm. La intensidad de este color es esencial para nuestro propósito ya que la
concentración de proteína y la absorbancia que presente la muestra tienen una relación
lineal, por lo tanto, mientras más intenso sea el color, mayor concentración de proteína en
la muestra y viceversa. El BCA tiene como ventaja que puede detectar pocas
concentraciones de la muestra y, además, presenta alteraciones en los resultados debido
a sustancias encontradas usualmente en la preparación de proteínas1. Se preparó una
curva estándar de una proteína conocida, en este caso albúmina de suero bovino (BSA),
con concentración conocida para así poder comparar los resultados obtenidos en el BCA
y determinar la concentración de IgG.
La electroforesis es una técnica que permite la separación de moléculas según la
movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, que finalmente
las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se
utilize7. En este caso, se utilizó la técnica de SDS-PAGE en la cual se mezclan las
proteínas con el detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS) en un gel de
poliacrilamida, para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La
electroforesis es utilizada para determinar el peso molecular de una proteína. La
determinación del peso molecular de las proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando
se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido
todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su
interacción con el SDS6.
Para reducir la proteína se utilizó β-mercaptoetanol como agente reductor. Este
causa que los enlaces disulfuro intra- e inter-catenarios son disociados, la estructura
cuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas peptídicas
individuales6. Por lo tanto, vamos a tener la cadena pesada y la cadena liviana de la
inmunoglobulina separadas. La cadena pesada tiene un peso molecular de 50KDa,
mientras la cadena liviana tiene un peso de 25KDa, esto resulta en un peso total de
150KDa para la inmunoglobulina sin reducir. En este laboratorio, se analizaron las
muestras de las dos maneras: reducidas y sin reducir.
La integración de las tres técnicas utilizadas tenía como fin varios objetivos. En
purificación por cromatografía de columna se pretendía describir las características
estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, así como técnicas de cromatografía y
aislar IgG de una muestra de suero por cromatografía de afinidad. En cuantificación, se
buscó describir diversos ensayos de cuantificación de proteínas, comparar y contrastar
ventajas y desventajas de éstos y se determinó la concentración de inmunoglobulina G
purificada de una muestra de suero humano utilizando un ensayo colorimétrico. Mientras
que en el laboratorio de electroforesis se pretendió describir los fundamentos de la técnica
de electroforesis de proteínas, algunos usos de la electroforesis de proteínas y finalmente
se utilizó la electroforesis de proteínas en poliacrilamida para separar algunos
componentes de las fracciones obtenidas por cromatografía de afinidad.
Materiales y Métodos:
I. Purificación de inmunoglobulina G de suero por cromatografía de afinidad.
A.Preparación de la proteína A en agarosa
Se nos entregó 200 µL de agarosa la cual contenía proteína A contenidos en un
microtubo de 1.5 mL. La misma estaba equilibrada en amortiguador de unión: 10 mM Tris,
pH 7.5. Se centrifugó a 3000 RPM por un minuto y luego se descartó el sobrenadante.
B.Preparación de la muestra
Se desinfectó la yema del dedo con alcohol. Luego, se pinchó el dedo en el área
desinfectada con una lanceta estéril. Se colocó varias gotas de sangre (aprox. 600µL) en
un microtubo. Después, se centrifugó por 5 min a 10000 RPM. Se removió
cuidadosamente el sobrenadante y se mezcló con un volumen igual de amortiguador de
unión, 10 mM Tris, pH 7.5, para ajustar la concentración iónica y el pH, para facilitar el
enlace entre IgG y la proteína A.
C.Unión de la IgG a la proteína A
La muestra diluida de suero fue añadida a la agarosa equilibrada en amortiguador
de unión. Se agitó la muestra para mezclar bien. Luego, se incubó esta mezcla por 15 min
a temperatura ambiente agitandose regularmente para evitar el asentamiento de la
agarosa. Posterior a la incubación, se centrifugó la muestra durante 5 min a 3000 RPM. El
sobrenadante fue removido y guardado en un microtubo previamente rotulando como FT
o “flow through”, este corresponde a lo que no se enlazó a la proteína A.
D.Lavado
Se añadió 1.5 mL de amortiguador de unión a la agarosa y se agitó el microtubo
para remover el material retenido de forma no específica en la gel. Luego, se centrifugó la
muestra durante 5 min a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido cuidadosamente y
almacenado en un microtubo rotulado como L1, que corresponde al primer lavado. Se
repitieron 3 veces estos pasos del lavado teniendo un total de cuatro lavados, rotulados
L1, L2, L3 y L4, respectivamente.
E.Elución de la IgG de la proteína A
Para desprender la IgG de la proteína A se añadió a la agarosa 350µL de
amortiguador de elución y 100 mM glicina pH 3.0. Luego, se incubó la muestra agitándola
por 2 min. y se centrifugó otros 2 min. a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido y
almacenado en un microtubo rotulado E1 el cual contenía 30µL de 1.0 mM Tris, pH 8.8,
esto corresponde a la elución. Este paso fue repetido 2 veces más obteniendo un total de
tres eluciones, rotulados E1, E2 y E3, respectivamente. La muestra de Ig fue recogida en
presencia del amortiguador de Tris para subir el pH de la muestra a nivel fisiológico ya
que el pH ácido de la elución pudo haber desnaturalizado el anticuerpo.
F.Regeneración de la proteína A en agarosa
Para preservar la proteína A después de la elución a pH ácido, se lavó la agarosa
con solución salina amortiguada con fosfato (PBS: Phosphate-Buffered Saline). Se
añadió 1 ml de 1X PBS a la agarosa y se mezcló bien agitando el microtubo. Luego, fue
centrifugado por 2 minutos a 3000 RPM y el sobrenadante fue descartado. Estos pasos
fueron repetidos tres veces para obtener tres lavados de regeneración. Luego de haber
regenerado la proteína A en 1 X PBS, la misma fue entregada a la instructora del
laboratorio.
II. Cuantificación de Inmunoglobulina G de suero
En primer lugar, se tomó una placa de micro ensayo. Luego, se le echó a las fosas
A, B y C desde la columna 1 a la 8, 10μL de la curva estándar más 200μL de reactivo de
trabajo. Con esto se calculó la curva estándar lo que nos ayudó a calcular luego la
concentración del desconocido.
Posteriormente, se añadió 210μl de amortiguador de unión a las fosas designadas
como blanco. A las elegidas para control se le echó 10μL de amortiguador de unión (10
mM Tris, pH 7.5) más 200μL de reactivo de trabajo. Después, se le adicionó 10μL de
cada una de las muestras de las fracciones de la cromatografía más 200μL de reactivo de
trabajo a las fosas designadas para los desconocidos. Cada una de las muestras se
preparó en triplicado.
Luego que se le añadió cada muestra a cada una de las fosas se cubrió la placa
con parafina y se dejó incubar por 30 minutos a 37°C. Una vez pasado este tiempo se le
quitó la parafina y se leyó la absorbancia a 560nm en un “microplate reader”.
III. Electroforesis
El gel de poliacrilamida que se utilizó fue preparado entre dos placas de vidrio. La
electroforesis se corrió verticalmente en presencia de 0.1% SDS, en un sistema de gel
discontinuo, donde el gel de corrida está entre una cámara superior y otra inferior, sin
contacto directo entre sí (Método de Laemmli). El gel de poliacrilamida fue preparado
anteriormente por la técnica de laboratorio y el aparato de electroforesis tenía el
ensamblaje pertinente.
Preparación de las muestras
Para esta parte fueron preparadas las fracciones de la cromatografía de afinidad, la
muestra del lavado de L1 y las tres muestras de lavado E1, E2 y E3, además un control
(FT). El marcador fue provisto por la instructora. El volumen total de cada muestra,
excepto para FT, fue de 30µL, en los cuales se añadió 5µl de amortiguador de muestra y
el volumen del inoculo el cual fue de 25 µL. Para FT se utilizó el volumen calculado de
3µL, se le añadió 5µL de amortiguador de muestra y se completó los 30µl con
amortiguador de corrida.
Para desnaturalizar las proteínas se hirvieron las muestras a 97°C durante 5
minutos, excepto el control. Las muestras de elución fueron preparadas tanto en
condiciones reductoras como en condiciones no reductoras. Con una pipeta se colocaron
las muestras en las fosas del gel. En el primer carril del gel se echaron 7µL del marcador
de peso molecular. En la fosa número cuatro que corresponde al vacío se coloco 30µL de
amortiguador de corrida. Las muestras y marcador fueron colocadas en las fosas como
ilustra la Figura 1.
Figura 1: Orden de las muestras para la corrida de electroforesis
1.Marcador, 2. Control (FT), 3. L1, 4. Vacío, 5. E1 reducido, 6. E1 sin reducir, 7. E2 reducido, 8. E2 sin reducir, 9. E3 reducido, 10. E3 sin reducir
Corrida de electroforesis y tinción del gel
Cuando todas las muestras estuvieron colocadas en las fosas, se prosiguió a
ensamblar el equipo. Se selló la cámara de electroforesis y se colocó los cables en los
electrodos correspondientes. Luego, se conectó la cámara sellada a la fuente de poder y
se le aplicó un pequeño voltaje a la caja de electroforesis. Posteriormente, se aplicó un
voltaje de 120-150V a la cámara de electroforesis hasta que el tinte en el amortiguador de
muestra llegó a la parte inferior del gel.
Subsiguientemente, una vez terminada la corrida, el voltaje fue reducido a cero y
se apagó la fuente de voltaje. Luego, se procedió a desconectar la cámara de
electroforesis. Después, se removieron las placas de vidrio y se removió el gel de estas.
Finalmente, se tiñó con solución teñidora (10% ácido acético, 50% etanol, 40% agua y
0.05% tinte Coomassie blue) por una hora, luego fue desteñido hasta que fueron vistas
las bandas de proteínas.
Resultados:
I. Purificación de inmunoglobulina
En esta parte se obtuvo la proteína purificada por medio de la cromatografía de
afinidad. En los sobrenadantes de los lavados se removió todo lo que no se quedo
enlazado a la proteína. En las eluciones se consiguió la inmunoglobulina purificada.
II. Cuantificación de IgG de suero utilizando ensayo de BCA
Con las absorbancias obtenidas se calculó la absorbancia promedio de las réplicas
de cada muestra y la absorbancia corregida (Tabla 1). Esta última se determinó
restándole la absorbancia promedio del control a la absorbancia promedio de cada una de
las muestras. Por ejemplo, para la absorbancia promedio: Abs562 promedio = (abs #1 +
abs #2 + abs #3)/3 = Abs562 promedio control = (0.097 + 0.096 + 0.097)/3= 0.097nm; para
absorbancia corregida: A562 corregida = A562 promedio - A562 promedio del control = A562
corregida L1= 3.975 – 0.097 = 3.879nm. Los cálculos realizados para obtener los datos
mostrados en la Tabla 1 se encuentran adjuntos en el Apéndice.
Tabla 1: Promedio de absorbancia (Abs) y absorbancia corregida a 562 nm por ensayo de
BCA.
Muestra A 562 #1 A 562 #2 A 562 #3 A 562 promedio A 562 corregidacontrol 0.097 0.096 0.097 0.097 N/A
200 0.161 0.211 0.172 0.181 0.085400 0.163 0.158 0.138 0.153 0.056600 0.231 0.174 0.160 0.188 0.092800 0.204 0.203 0.181 0.196 0.099
1000 0.286 0.304 0.309 0.300 0.2031200 0.388 0.277 0.245 0.303 0.2071400 0.327 0.473 0.419 0.406 0.3101600 0.719 0.645 0.733 0.699 0.6021800 0.809 0.848 0.760 0.806 0.709FT 2.540 2.169 2.786 2.498 2.402L1 3.930 3.962 4.034 3.975 3.879L2 0.472 0.489 0.520 0.494 0.397L3 0.248 0.230 0.255 0.244 0.148L4 0.141 0.152 0.197 0.163 0.067E1 0.541 0.518 0.313 0.457 0.361E2 0.915 0.312 0.913 0.713 0.617E3 0.178 0.240 0.227 0.215 0.118
FT: “Flow Through”, L: Lavado, E: Elución
Se procedió a construir una gráfica titulada Curva Estándar de BSA que comprende
de la absorbancia corregida versus la concentración del estándar (Figura 1). La ecuación
generada por la curva de la Figura 1, y = 0.0004x - 0.1274, se utilizó para determinar las
concentraciones de las muestras desconocidas. La ecuación en la forma y = mx + b, es la
ecuación de una línea recta; donde ‘y’ es la absorbancia de la muestra desconocida, m =
0.0004 la pendiente de la línea recta, ‘x’ es la concentración (μg/μL) de la proteína
desconocida y b= -0.1274 el intercepto en y.
Figura 1. Curva Estándar de BSA (albúmina de suero bovino). Se preparó la gráfica para
determinar las concentraciones desconocidas de la inmunoglobulina G. La ecuación generada es
y = 0.0004x - 0.1274, donde y es la absorbancia corregida y x la concentración de proteína en la
muestra.
Si despejamos para x la ecuación generada por la curva, tenemos: x = (y – b) / m.
Utilizando la ecuación despejada y sustituyendo los valores de y, b y m correspondientes
para cada muestra (b y m son contantes dadas por la ecuación generada por la gráfica)
se determina la concentración de inmunoglobulina G (IgG) en cada muestra. Al obtener la
concentración se puede buscar el volumen inicial (V1) requerido para electroforesis en gel
de poliacrilamida (SDS-PAGE). Este volumen se determina usando la formula de dilución
C1V1= C2V2, donde C1 es la concentración de la proteína que se obtuvo al despejar la
fórmula de la recta, C2 es 0.5 μg/μl y el volumen final (V2) es 30 μl el cual es
aproximadamente el volumen máximo de muestra que se puede añadir a una fosa del gel
de poliacrilamida. Los resultados para cada muestra se muestran en la Tabla 2. Los
cálculos realizados para obtener la concentración de proteína en cada una de las
muestras y el volumen inicial se encuentran adjuntos en el Apéndice.
Tabla 2: Absorbancia corregida, concentración de proteína en la muestra y volumen inicial
requerido para cada muestra en SDS- PAGE.
Muestra A562 corregida [Proteina] μg/μL Volumen inicial (μL)
FT 2.402 6.323 2.37
L1 3.879 10.015 1.50
L2 0.397 1.311 11.44
L3 0.148 0.688 21.81
L4 0.067 0.485 30.92
E1 0.361 1.220 12.29
E2 0.617 1.860 8.06
E3 0.118 0.614 24.42
III.Electroforesis SDS-PAGE
En los resultados obtenidos de la electroforesis SDS-PAGE (Figura 2) se puede
observar la presencia del marcador de peso molecular utilizado.
· Se observó una banda en las fosas 5,7 y 9 las cuales corresponden al peso
del anticuerpo completo (cadena pesada más cadena liviana)
· En el carril 4 estaba vacío.
· En el carril 3 se observaron 4 bandas.
· Se observó dos bandas en el 6,8 y 10. Estas corresponden a la cadena
pesada, la cual pesa 50KDa, y la cadena liviana que pesa 25KDa.
Figura 2: Electroforesis SDS- PAGE. Para separar la IgG se utilizó β-mercaptoetanol que el cual
rompe los puentes de azufre presentes en la IgG, generando dos bandas una de 50KDa y una de
25 KDa. En la fosa 6,8 y 10 se observa una sola banda, mientras que las fosas 5, 7 y 9 presentan
dos bandas. E1r significa la elución 1 reducida, igual para E2r y E3r. E1sr significa elución 1 sin
reducir, lo mismo para E2sr y E3sr.
Carriles: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Discusión y Conclusión:
Los resultados obtenidos en este trabajo nos indican que la purificación de la IgG
fue exitosa porque se logró cuantificar la misma. Esto nos indica que la técnica de
cromatografía de afinidad demostró ser un método efectivo para la purificación de una
proteína, en este caso IgG, en suero humano.
En la parte de Cuantificación de Proteína nuestros resultados indican la
concentración de inmunoglobulina G purificada de una muestra de suero utilizando un
ensayo colorimétrico. La relación entre absorbancia y concentración de proteína es una
lineal. Para nuestros resultados, la curva estándar de BSA fue bien precisa, ya que
obtuvimos una regresión lineal (R2) cercana a 1. Aunque la curva estándar es precisa, no
se obtuvieron los resultados esperados, ya que las concentraciones y
volúmenes .................................................................. Esto pudo deberse a que la proteína
no había sido regenerada la última vez que se utilizó. Sin embargo tampoco que se puede
descartar posibles errores experimentales, ya sean errores en algunos pasos o que el
“microplate reader” no estuviera bien calibrado, entre otros.
A pesar de los errores el ensayo BCA demostró ser un método de cuantificación de
proteínas esencialmente sencillo y rápido, pero es su sensibilidad y tolerancia a muchas
sustancias encontradas comúnmente en las preparaciones de proteínas lo que lo hace
único, ya que en otros tipos de pruebas de cuantificación están presentes grandes
interferencias las cuales hacen menos precisos los resultados.
Este ensayo, además de lograr sus objetivos, comprobó su gran importancia tanto
para futuras investigaciones como también para el área clínica, ya que existen un
sinnúmero de condiciones relacionadas a desniveles de inmunoglobulinas en la sangre
que requieren del conocimiento temprano de concentraciones de inmunoglobulinas en la
sangre12. Un gran ejemplo es la leucemia, en la cual los niveles de IgG sobrepasan el
rango normal de 560 a 1800 mg/dl de IgG en la sangre y este ensayo les provee una
valiosa herramienta para su detección y control11.
Finalmente, para la electroforesis de poliacrilamida con SDS, según las bandas
observadas y el peso relativo de las mismas en los carriles 6, 8 y 10 se obtuvo la proteína
pura bajo condiciones no reductoras ya que se encontró una sola banda de
aproximadamente 150KDa. Esto es así debido a que las proteínas no se dividen porque
no fueron reducidas, sino que mantienen las cadenas pesadas y las cadenas livianas
unidas. El peso aproximado de la cadena pesada es de aproximadamente 50KDa cada
una mientras que la cadena liviana es de 25KDa aproximadamente1. Por lo tanto, la suma
de las dos cadenas pesadas y las dos cadenas livianas que componen la inmunoglobulina
tendrán un total de 150KDa aproximadamente.
Por otro lado, las proteínas en condiciones reductoras, reducen los puentes de
disulfuro que tengan las proteínas de la muestra entre cada una de las cadenas11 y se
reflejan en la electroforesis como dos bandas, una de las cadenas pesadas y otra de las
cadenas livianas. Por esta razón los carriles 5, 7 y 9 presentaron dos bandas. La banda
en el carril 5 correspondiente a la cadena liviana, no se presentó claramente en ninguno
de los resultados, eso pudo haber sido debido a la cantidad o a alguna sustancia que
interfiriera en la reacción.
Sin embargo, se puede concluir que los lavados (rotulados como L) no mostraron
unión de la proteína ya que la concentración era menos en cada lavado, mientras que las
eluciones sí. Esto sustenta los objetivos ya que en los lavados se incluye todo el material
que no se adhirió a la gel excepto la proteína, mientras que las eluciones son el lavado
luego de que la IgG queda separada de la proteína A.
En este laboratorio se logró aislar IgG de una muestra de suero humano utilizando
cromatografía de afinidad. Además se determinó la concentración de inmunoglobulina
utilizando un ensayo colorimétrico, BCA. Por último, se utilizó la electroforesis de
proteínas en poliacrilamida separar componentes de las fracciones obtenidas por
cromatografía de afinidad. Estas técnicas se utilizan a menudo para identificar
enfermedades, como por ejemplo electroforesis la cual se utiliza a menudo en el ámbito
clínico y se considera la prueba definitiva para determinar si un paciente ha sido infectado
por el virus de inmunodeficiencia humana1.
Referencias
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afinidad de el Laboratorio de Inmunología, Universidad de Puerto Rico RUM.
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4Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC.1985. Measurement of protein using bicinchoninic
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12Tscheliessnig A., A. Jungbauer. 2008. High-performance monolith affinity chromatography for
fast quantitation of immunoglobulin G. J Chromatogr A.
Apéndice:
Cálculos realizados para obtener los datos en la Tabla 1 y Tabla 2.
Muestra Absorbancia Cor-regida
Conversión de μg/ml a μg/μl
Volumen inicial Volumen final = 30 μl
FT 2.498-0.097 =2.402 6322.6÷1000=6.323 2.37μl 15μl + 15μl = 30 μl
L1 3.975-0.097=3.879 10015.1 ÷1000=10.016 1.50 μl 15μl + 15μl = 30 μl
L2 0.494-0.097 =0.397 1311.0÷1000=1.311 11.44 μl 15μl + 15μl = 30 μl
L3 0.244-0.097 =0.148 687.667 ÷1000=0.688 21.81 μl 15μl + 15μl = 30 μl
L4 0.163-0.097 =0.067 485.167 ÷1000=0.485 30.92 μl 5μl + 25μl = 30 μl
E1 0.457-0.097 = 0.361 1220.167 ÷1000=1.220 12.29 μl 15μl + 15μl = 30 μl
E2 0.713-0.097 = 0.617 1860.167 ÷1000=1.860 8.06 μl 15μl + 15μl = 30 μl
E3 0.215-0.097 = 0.118 614.333 ÷1000=0.614 24.42 μl 15μl + 15μl = 30 μl
Fórmulas utilizadas:
1. Absorbancia Corregida = Abs promedio de muestra – Abs promedio de control
2. Conversión de μg/ml a μg/μl = Concentración de proteína en μg/ml ÷ 1000μl
3. Volumen inicial (Vi) = CfVf /Ci ; donde Vf = 30 μl Cf = 0.5 μg/μl
4. Volumen final (Vf ) = ___μl de amortiguador de muestra + __μl de muestra = 30 μl