UNIVERSIDAD POLITCNICA

DE VALENCIA

Departamento de Tecnologa de Al iment osINSTITUTO DE

AGROQUMICA Y

TECNOLOGA DE

ALIMENTOS

INTERACCIN DE LOS COMPUESTOS AROMTICOS DEL J AMN CURADO CON LA MATRIZ PROTEICA Tesis Doctoral Mara Prez Juan Valencia, 2006

UNIVERSIDAD POLITCNICA DE VALENCIA Departamento de Tecnologa de Alimentos INSTITUTO DE AGROQUMICA YTECNOLOGA DEALIMENTOS

D. Fidel Toldr Vilardell, Profesor de Investigacin y Da. Mnica Flores Llovera, Cientfico Titular, ambos del Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, HACENCONSTAR:queeltrabajodeinvestigacintitulado INTERACCINDELOSCOMPUESTOS AROMTICOSDELJAMNCURADOCON LA MATRIZ PROTEICA que presenta Da. Mara PrezJ uanporlaUniversidadPolitcnicade Valencia,hasidorealizadaenelInstitutode Agoqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA-CSIC) bajonuestradireccinyquerenelascondiciones para optar al grado de Doctor. Valencia, Mayo de 2006 Fdo: Prof. Dr. Fidel Toldr VilardellFdo: Dra. Mnica Flores LLovera RESUMEN En este trabajo de tesis se estudi el efecto de la matriz en la generacin y percepcin de la principal caracterstica que define la calidad del jamn curado, su aroma. Para ello, se analiz en las diferentes secciones de jamn curado de 7 y 12 meses la composicin en protenas, aminocidos, cidos grasos libres y compuestos voltiles. La principales diferencias entre las secciones del jamn se encontraron en la composicin de aminocidos y compuestos voltiles, siendo esta ms elevada en el centro que en las otras secciones estudiadas, aunque la proporcin de compuestos voltiles se vi modificada con el tiempo de curado. Asimismo, se analiz la interaccin existente entre las protenas de la matriz y determinados compuestos voltiles utilizando la tcnica de microextraccin en fase slida(SPME)ylacromatografadegases.Enestesentido,lacapacidadde interaccin de las protenas sarcoplsmicas de msculo porcino fue mayor que la capacidad que mostraron las protenas de jamn de 7 y 12 meses. Adems, se puso de manifiesto una menor capacidad de interaccin de las protenas miofibrilares. Por otra parte, se purificaron la actomiosina y actina de msculo porcino en estado post-rigor mediante un proceso simultneo el cual, permiti conservar sus propiedades y obtener cantidad suficiente de protena para estudiar su capacidad de interaccin con los compuestos voltiles. En este sentido, se demostr que el efecto delaconcentracinyconformacindeactomiosinayactinapurasafectala capacidad de interaccin con los compuestos voltiles aunque dicho efecto dependa del compuesto voltil estudiado. Estosresultadosdemuestranlaexistenciadeinteraccionesentrelamatriz proteica y los compuestos voltiles responsables del aroma adems de demostrar el efecto que la concentracin y conformacin proteca ejercen en dicha interaccin. Todoello,suponeunaumentodelconocimientodelprocesodeinteraccinysu posible repercusin en la percepcin del aroma del jamn curado. ABSTRACT Inthisthesiswork,themainqualitycharacteristicofdry-curedham,its flavour, was analyzed through the study of the matrix effect on flavour generation and perception. The composition in proteins, free amino acids, free fatty acids and volatile compounds were analysed in different sections of dry-cured ham of 7 and 12 months of processing. The main differences among sections were detected in free amino acids and volatile compounds being higher in the centre section than in the othersectionsalthoughthecuringtimechangedtheproportionofvolatile compounds among sections.Furthermore,thebindingabilityofproteinmatrixwasstudiedusingsolid phasemicroextraction(SPME)andgaschromatographyanalysis.Thebinding abilityofsarcoplasmicproteinsfromporkmusclewashigherthantheability showedby7and12monthsdry-curedhamsarcoplasmichomogenatesandalso higher than the binding ability of myofibrillar homogenates.Ontheotherhand,actomyosinandactinwereisolatedfrompost-rigor porcinemusclebyasimultaneousprocessthatmaintainedtheirpropertiesand produced enough quantity for its use in binging ability studies. In this sense, the concentration and conformation affected the binding ability of isolated actomyosin and actin although, this effect was different depending on the volatile compound studied. These results showed the existence of interactions between the protein matrix andthevolatilecompoundsresponsibleforaroma.Theeffectofprotein concentration and conformation on the binding was also demonstrated. All of these increase the knowledge about the binding process and its possible role on dry-cured ham aroma perception. RESUM En aquest treball de tesis, sestudi lefecte de la matriu en la generaci de laroma,principalcaractersticaquedefineixenlaqualitatdelpernil.Peraix, sanalitz la composici en protenes, aminocids, cids grassos lliures i compostos voltilsenlesdiferentsseccionsdelpernilde7i12mesos.Lesprincipals diferncies entre les seccions estudiades es trobaren en la composici daminocids i compostosvoltilssentmselevadaenelcentrequeenlesaltresseccions estudiades,encaraquelaproporcidelscompostosvoltilsesmodificambel temps de processament. Al mateix temps, linteracci existent entre les protenes de la matriu amb determinants compostos voltils sestudi utilitzant la microextracci en fase slida (SPME) i la cromatografia de gasos. En aquest sentit, la capacitat dinteracci de les protenessarcoplsmiquesdemsculdeporcfoumselevadaqueladeles protenesdepernilde7i12mesos.Msaviat,esposdemanifestunamenor capacitat dinteracci de les protenes miofibrilars. Daltra banda, lactomiosina i lactina de mscul de porc en estat de post-rigor es purificaren seguint un procs simultani que va permetre mantenir les seues propietatsiobtindrequantitatsuficientperestudiarlaseuacapacitatdinteracci ambelcompostosvoltils.Enaquestsentit,esdemostrquelefectedela concentraciilaconformacidelactomiosinailactinapuresafectlaseua capacitat dinteracci amb el compostos voltils encara que aquest efecte depn del compost voltil estudiat. Aquestsresultatsdemostrenlexistnciadinteraccionsentrelamatriu proteica i els compostos voltils responsables de laroma a ms de demostrar lefecte de la concentraci i la conformaci proteica en aquesta interacci. Tot a suposa un aument del coneixement dels processos dinteracci i de la seua possible repercusi en laroma del pernil. AGRADECIMIENTOS DeseoagradecerenprimerlugaralDr.FidelToldrVilardellyala Dra. Mnica Flores Lovera, directores de esta tesis, su orientacin y apoyo eneldesarrollodelamisma,yaquesinsudedicacin,consejos,ayuday trabajonohubierasidoposiblesurealizacin.Asimismo,megustara agradecerlessusvaliososconsejosparaeldesarrollodemicarrera investigadora. AgradezcoalMinisteriodeEducacinyCiencialabecaFPIqueha hechoposiblemiformacinpredoctoralascomolosproyectosAGL-2001-1141yAGL-2004-05064-CO2-01enloscualessehadesarrolladoesta tesis. AlDr.JosFloressusconstantesnimosyaqueesunejemploa seguir para aquellos que quieren dedicarse al mundo de la investigacin. QuisieraagradeceraMargasusvaliososconsejosyayudaenel campo de la cromatografa lquida. AMPilar,MaribelyPabloporsuvaliosaayudayconsejosenlas prcticas de laboratorio. Y a M Angeles por su saber hacer. A Natalia y Mara, por el tiempo y esfuerzo que han dedicado conmigo a la realizacin de este trabajo. A todos mis compaeros de laboratorio que durante estos cuatro aos hancompartidoconmigosuamistadymehanbrindadosuapoyo.Gracias Leticia,Laura,Lorena,MCarmen,Manolo,Mnica,Maijo,Liliana,Mara, Aurora,Miguelngel,Natalia,Milagro,JoseMa,Sergio,Merche,Asuny Pa. AAlicia,Laura,Araceli,SusanayFabiolaporseguirahapesarde que nuestros caminos han tomado distintas direcciones. Gracias por vuestra amistad. Alicia, gracias por estar ah. AArturo,pormirarmecontanbuenosojosyhacermesentiralguien muyespecial.Graciasportupaciencia,tuapoyoyporcompartirconmigo este viaje. Amifamilia,graciasporvuestroapoyoycarioentodomomento. Papa y mama, gracias por darme la oportunidad de conseguir todo aquello conloquehesoadoyporvuestroincondicionalapoyo.Quiqueyngela, miscompisdepiso,graciasporvuestrocarioyporaguantarlosmalos momentos. Finalmente, a mis abuelos gracias por creer siempre en mi. NDICES Y ABREVIATURAS ____________________________________________________NDICES NDICE GENERAL NDICE DE FIGURAS................................................................... XVIII NDICE DE TABLAS...................................................................... XXII ABREVIATURAS.......................................................................... XXIII 1INTRODUCCIN .............................................................................27 1.1 MATRIZ PROTEICA DE LA CARNE ............................................27 1.1.1COMPOSICINYESTRUCTURADELMSCULO ESQUELTICO ......................................................................27 1.1.2CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS MUSCULARES.......29 1.1.2.1Protenas sarcoplsmicas ....................................................29 1.1.2.2Protenas miofibrilares .........................................................30 1.1.2.2.1Miosina..............................................................................34 1.1.2.2.2Actina................................................................................35 1.1.2.2.3Actomiosina ......................................................................35 1.1.2.3Protenas del estroma...........................................................36 1.1.3PURIFICACINDELASPROTENASMIOFIBRILARES MAYORITARIAS.....................................................................36 1.1.3.1Purificacin de la miosina....................................................36 1.1.3.2Purificacin de la actina .......................................................37 1.2 GENERACINDELAROMAYSABORDELJAMN CURADO............................................................................................41 1.2.1DEGRADACIN PROTEICA EN EL CURADO......................41 1.2.2DEGRADACIN LIPDICA EN EL CURADO.........................43 1.2.3COMPUESTOSRESPONSABLESDELAROMADEL JAMN CURADO...................................................................44 1.3 INTERACCIONDELASPROTENASCONLOS COMPUESTOS VOLATILES.............................................................48 1.3.1INTERACCIN........................................................................48 1.3.2ESTUDIO DE LA INTERACCIN PROTENA-VOLTIL .......48 1.3.3FACTORESQUEAFECTANALAINTERACCIN PROTEINA-VOLTIL..............................................................52 1.3.4EFECTODELAINTERACCINENLAPERCEPCIN DEL AROMA Y SABOR..........................................................53 2OBJETIVOS.....................................................................................59 3CAPTULO I: EFECTO DE LAS DISTINTAS SECCIONES DEL JAMNCURADOENLAGENERACINDECOMPUESTOS VOLTILES AROMTICOS. ..........................................................63 3.1 INTRODUCCIN ...........................................................................63 XVNDICES____________________________________________________3.2 MATERIAL Y MTODOS..............................................................64 3.2.1MATERIAL...............................................................................64 3.2.2ANLISIS QUMICOS.............................................................65 3.2.3ANLISIS DE PROTENAS ....................................................66 3.2.4ANLISIS DE AMINOCIDOS LIBRES..................................67 3.2.5ANLISIS DE CIDOS GRASOS LIBRES.............................67 3.2.6ANLISIS DE LOS COMPUESTOS VOLTILES ..................68 3.2.7ANLISIS ESTADSTICO.......................................................68 3.3 RESULTADOS Y DISCUSIN.....................................................69 4CAPTULOII:EFECTODELASPROTENAS SARCOPLSMICASYMIOFIBRILARESDELMSCULO PORCINOYDELJAMNCURADOENLAINTERACCIN CON COMPUESTOS VOLTILES .................................................89 4.1 INTRODUCCIN ...........................................................................89 4.2 MATERIAL Y MTODOS..............................................................91 4.2.1MATERIALES..........................................................................91 4.2.2PREPARACINDELOSEXTRACTOSDEPROTENAS SARCOPLMICAS Y MIOFIBRILARES.................................92 4.2.3DILISIS DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS......................92 4.2.4PREPARACIN DE LA DISOLUCIN DE COMPUESTOS VOLATILES.............................................................................93 4.2.5INTERACCIN PROTENA-VOLTIL....................................93 4.2.5.1Anlisis por cromatografa de gases ..................................94 4.2.5.2Clculo de la cantidad de compuesto voltil unido por g de extracto proteico ..........................................................95 4.2.6ANLISIS ESTADSTICO.......................................................96 4.3 RESULTADOS Y DISCUSIN.....................................................96 4.3.1INTERACCINDECOMPUESTOSVOLTILESCONEXTRACTOS DE PROTENAS SARCOPLSMICAS ...........96 4.3.2INTERACCINDECOMPUESTOSVOLTILESCON EXTRACTOS DE PROTENAS MIOFIBRILARES...............100 4.3.3EFECTODELAFUERZAINICAENLACAPACIDAD DEINTERACCINDEEXTRACTOSDEPROTENAS SARCOPLSMICAS Y MIOFIBRILARES............................103 5CAPTULOIII:PROCESODEPURIFICACINSIMULTNEO DE ACTOMIOSINA Y ACTINA DE MSCULO ESQUELTICO POST-RIGOR DE PORCINO.........................................................111 5.1 INTRODUCCIN .........................................................................111 5.2 MATERIAL Y MTODOS............................................................113 XVI____________________________________________________NDICES 5.2.1MATERIALES........................................................................113 5.2.2MUESTRA.............................................................................114 5.2.3PROCESOS DE PURIFICACIN DE PROTEINAS.............114 5.2.3.1Proceso simultneo de purificacin .................................114 5.2.3.2Proceso de purificacin de Dudziak .................................116 5.2.3.3Proceso de purificacin de Pardee and Spudich ............117 5.2.4MEDIDA DE LA CONCENTRACIN DE PROTENA ..........119 5.2.5ANLISIS ELECTROFORTICO .........................................119 5.2.6POLIMERIZACIN DE LA ACTINA......................................119 5.3 RESULTADOS Y DISCUSIN...................................................120 5.3.1EXTRACCIN DE ACTOMIOSINA ......................................120 5.3.2EXTRACCIN DE ACTINA...................................................124 6CAPTULOIV:EFECTODELACONCENTRACINY CONFORMACINDELASPROTENASMIOFIBRILARES PURIFICADASDEMSCULOPORCINOENLA INTERACCIN CON COMPUESTOS VOLTILES....................129 6.1 INTRODUCCIN .........................................................................129 6.2 MATERIAL Y MTODOS............................................................132 6.2.1MATERIALES........................................................................132 6.2.2PURIFICACIN DE PROTENAS.........................................132 6.2.3PREPARACIN DE LA DISOLUCIN DE COMPUESTOS VOLTILES...........................................................................133 6.2.4INTERACCIN PROTENA-VOLTIL..................................133 6.2.4.1Anlisis por cromatografa de gases ................................134 6.2.4.2Clculo de la cantidad de compuesto voltil unido por g de extracto proteico ........................................................134 6.2.5EFECTO DE LA CONCENTRACIN PROTEICA................135 6.2.6EFECTO DE LA CONFORMACIN PROTEICA..................135 6.2.7ANLISIS ESTADSTICO.....................................................136 6.3 RESULTADOS Y DISCUSIN...................................................136 6.3.1EFECTO DE LA CONCENTRACIN PROTEICA................136 6.3.2EFECTO DE LA CONFORMACIN PROTEICA..................139 7DISCUSIN GENERAL.................................................................147 8CONCLUSIONES ..........................................................................155 9BIBLIOGRAFA .............................................................................159 10APNDICE.....................................................................................175 XVIINDICES____________________________________________________NDICE DE FIGURAS Figura 1.1. Estructura muscular:a) Msculo b) detalle de 3 miofibrillas; c) una fibrilla; d) detalle de unamiofibrilla e) sarcmero f) vistaalmicroscopioyesquemadeladistribucindeun sarcmero. Fuente (Whitaker, 1977). .....................................28 Figura 1.2. Clasificacin de los mtodos de equilibrio para el estudio de la interaccin. .....................................................................49 Figura1.3.Efectodelainteraccindeloscomponentesdelamatriz de los alimentos en la percepcin del aroma y sabor. ...........55 Figura 3.1. Localizacin de las muestras en las diferentes secciones del jamn curado. ...................................................................65 Figura 3.2. Geles SDS-PAGE (10 %) de las protenas miofibrilares en las diferentes secciones del jamn curado despus de 7 y 12mdecurado.(Std)Patrones(B)Punta,(C)Centroy (S) Codillo. ..............................................................................71 Figura3.3.Principalesgruposqumicosdeloscompuestosvoltiles extraidos de las diferentes secciones de jamn curado de 7m(a)y12m(b).Lasbarrascondiferentesletras muestrandiferenciassignificativas(p