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MICROSTICK‐SALMONELLATest rápido de Immunocromatografía para la detección
Uso exclusivo en laboratorio cualitativa de Salmonella spp. en muestras de alimentos. Ref. KMTC85
LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE:
1‐Rapidez de resultados: ¡5‐10 minutos tras elenriquecimiento ISO 6578! (no horas como loskits ELISA, ni 4‐6 días como en el métodotradicional de cultivo en placa). Ahorro en laobtención de resultados, conseguidos en sólo36 horas (incluidos los enriquecimientos).Ahorro mínimo de 2 días de trabajo. No hacefalta ir a leer resultados en días festivos.
2‐Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos como los látex o los ELISAs; elinmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede inclusoalmacenarse fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado.
3‐Sensibilidad extraordinaria: 99,9%, lo que limita la proporción de resultados falsamente negativos aalgo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido de muestras negativas
4‐Especificidad excelente: >90%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamentepositivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 10%de casos en los que no había Salmonella y el test dió presunto positivo
5‐Seguridad para el operario: las muestras pueden hervirse una vez concentradas y justo antes derealizar el test, ya que éste detecta los antígenos de Salmonella, no las células, por lo que no esnecesario que éstas sigan vivas tras el enriquecimiento selectivo
6‐Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación,que es simplemente visual. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos. El kit es compacto, alincluir los dos caldos de enriquecimiento ISO 6579 optimizados y los Sticks confirmativos.
7‐Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más
8‐Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4‐30ºC), durante muchos meses
9‐Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado variosdías antes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para laempresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de estaheroicidad. Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, NO LO ES en absoluto.
10‐Validado: estudio realizado en todo tipo de muestras alimentarias por los mayores especialistas enEspaña en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado,vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentosdietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comidaanimal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde 10‐16 ufc Salmonella /25 g de alimento conun nivel de acompañantes e interferentes muy diversos 102‐103 veces superior que las dianas!
ISO 9001ER‐0632/1999
Apartado de Correos / P.O. Box 4428210‐Valdemorillo (Madrid, Spain) (34) 91 897 46 16 Fax: (34) 91 897 46 41
E‐mail: [email protected] Web: www.microkit.es
http://www.laboratoriosmicrokit.blogspot.com
COSMETIKIT® CHROMOSALM
SEILAGUA® KITPRO-5S
COMPACT-DRY-PLATES®
DESINFECTEST®
MUGPLUS
NUTRILINIA
CROMOKIT®
COLICULT-MCC CRIOTECA®
PLAQUIS® M-IDENT®
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I. INTRODUCION Y USO
Los síntomas clínicos causados por infección de Salmonella typhimurium, en seres humanos, se dividen en lafiebre tifoidea, causada por S. typhimurium serotipos typhi y paratyphi y una variedad de síntomas clínicos,incluyendo las enfermedades diarreicas, causadas por las Salmonellas no tifoideas (NTS), de las cuales hay unos2.500 serotipos, como la S. enteritidis. La fiebre tifoidea es restringida a humanos y está altamente adaptadacomo enfermedad invasiva sistémica de adultos y niños, mostrando una leve asociación con la inmunosupresión.En contraste, las cepas NTS tienen una amplia gama de huéspedes vertebrados y una epidemiología que amenudo incluye alimentos animales, al menos en los países industrializados donde normalmente se manifiesta enforma de gastroenteritis. Las cepas NTS pueden producir una grave enfermedad invasiva si va asociada a estadosinmunodeprimidos. También es común en niños africanos que presentan afecciones, desnutrición y anemia.
MICROSTICK‐SALMONELLA es un kit de tres componentes diseñado para proporcionar una rápida detección deSalmonella spp. en muestras de alimentos. MICROSTICK‐SALMONELLA combina un doble enriquecimientooptimizado de la muestra, con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Salmonella spp.en muestras de alimentos contaminados, para así evitar el consumo y por tanto, la salmonelosis.
II. FUNDAMENTO DEL TEST
Los caldos de pre‐enriquecimiento revitalizador y post‐enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO6579 pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de dicha norma. ElMICROSTICK‐Salmonella es un inmunoensayo cualitativo para la detección de Salmonella en muestras dealimentos. La membrana está pre‐revestida con anticuerpos, en la región de banda del test, para reconocer elantígeno de Salmonella spp. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex queestán recubiertas con anticuerpos anti‐salmonella pre‐desecados. La mezcla resultante, empuja hacia arriba lamembrana por acción capilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojasmigra. En el caso de un resultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán elaglutinado de partículas rojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana conel anticuerpo inmovilizado que está en la región de banda decontrol. En la línea de control siempre aparece una banda de colorverde, lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente yque se obtuvo un flujo adecuado del caldo de post‐enriquecimiento inoculado, además de servir como control internode los reactivos.
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Cada kit contiene:
1. 20 tubotes (ref: DPA001) con polvo estéril del caldo de revitalización APT‐MICROKIT para 25 g de alimento(pre‐enriquecimiento)
2. 20 tubos (ref: TPL401) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo SS‐MICROKIT, de color rojo(post‐enriquecimiento)
3. 20 tarjetas inmunocromatográficas para Salmonella Ag (Sticks)4. Instrucciones de uso
Materiales necesarios (no suministrados):
Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico,temporizador, Stomacher y bolsas Stomacher, incubadoras + 37 º y + 41.5ºC (se puede mantener con sólo laestufa de 35‐37° C y agua purificada estéril.
IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25ºC, y emplear antes de lafecha de caducidad impresa en sus etiquetas.Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25° C al abrigo de la luz y se deben usar antes de la fecha decaducidad impresa en sus etiquetas.Las tarjetas inmunocromatográficas se deben almacenar tal y como están empaquetados en sus bolsas selladas, auna temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36‐86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Lastarjetas inmunocromatográficas son estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y debenpermanecer en ésta hasta su uso.
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V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS
Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debe realizarseinmediatamente después de la recogida, aunque las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2‐4 º C)durante 1‐2 días previos a la prueba. Para un almacenamiento mas prolongado, la muestra debe mantenerse enel congelador a ‐20ºC. En ese caso, la muestra será totalmente descongelada y puesta a temperatura ambienteantes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos de congelación‐descongelación no sonrecomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación.
Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Salmonella en 25g de alimento, es fundamental realizar unenriquecimiento adecuado en dos fases:
a) Pre‐enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Salmonelladañadas sub‐letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes delalimento, sean naturales, sean añadidos
b) Post‐enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo quemultiplicará más que las acompañantes, las células de Salmonella hasta 106‐109 , un nivel más queadecuado para ser detectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK‐SALMONELLA, que detectan desde 104 uf/ml
Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post‐enriquecimiento no es necesaria, sobre todo siel nivel de flora interferente (aerobios totales) es baja, menor a 104 ufc/ml final; esa es una afirmación muyaventurada, ya que si se comete el frecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada 103‐104 células viables de Salmonella/25 g y escasa flora interferente, lógicamente la fase de enriquecimientomultiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección de Salmonella por debajo del límite dedetección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 106 células de Salmonella por test (y las 104
células de Salmonella por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK‐Salmonella para S.enteritidis yS.typhimurium). Por ello el laboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades quemuestren claramente todos los datos de la validación y no un simple certificado por mucho renombreinternacional que tenga la entidad certificadora.
VI. ENRIQUECIMIENTO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE SALMONELLA
1‐Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos elpolvo contenido en un tubote de caldo de revitalización APT‐MICROKIT (una mejora del agua de peptonatamponada BPW, especialmente obligada para este kit). Si es preciso, golpear el tubote con polvo de pre‐enriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo del fondo; despuéscerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar duranteaproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante 18‐24 h a 35‐37 ° C.
2‐ Añadir 1 ml de cultivo de pre‐enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo SS‐MICROKIT, e incubar este tubo durante otras 18‐24 h a 35‐37 ° C (no resulta necesario hacerlo a 41,5 ° C). Si eltubo ha virado a negro es altamente presuntivo de presencia de Salmonella, pero no hay que descartar los tubosque hayan quedado rosas‐rojos y a ellos también hay que hacerles el Stick.
Ya en el segundo día se obtendrán los resultados de Salmonella, ya que de aquí el paso siguiente y definitivo setardan escasamente 5‐15 minutos.
VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15‐30ºC/59‐86ºF ).No abrir las bolsas hasta el momento de realizar el ensayo. 0. Si se desea por cuestiones de seguridad para el analista, colocar el tubo en un baño de agua hirviendodurante 15 minutos. Retirar y dejar atemperar. 1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antesposible. 2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3‐5 gotas ó 100 µL de la muestra de post‐enriquecimiento en el pocillo (S), hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de lamuestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar el pocillo generosamente de caldo de post‐enriquecimiento,con un volumen suficiente como para crear un menisco que casi desborde el pocillo. Iniciar el temporizador. 3. Leer el resultado en 5‐15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antesque la del test). Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2‐5minutos ya se ven los positivos, pero en caso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de unpositivo lento.
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VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS
NEGATIVO: Sólo aparece una banda verde en la ventana central del punto
marcado con la letra C (línea de control).
POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventanacentral del sitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una bandaroja (línea de test) en el sitio marcado con la letra T (zona de resultados).Toda banda roja, por tenue que sea o truncada que esté, debe considerarsemuestra positiva.
NO VALIDO: Una ausencia total de bandas coloreadas. Insuficiente volumen
de muestras, procedimientos incorrectos de utilización o reactivos
deteriorados son probablemente las razones del fracaso del test. Revisar el
procedimiento y repetir el test usando un nuevo Stick con otra muestra
similar del caldo SS, sin partículas de alimento.
IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es uncontrol interno. Confirma suficiente volumen de muestra y correcta técnica de uso del test. Si desea un controlpositivo de Salmonella emplee preferentemente cepas de referencia como S. enteritidis (por ejemplo NCTC 6676) oS. typhimurium (por ejemplo NCTC 74).
X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT
‐Solo para profesionales de laboratorio. ‐No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad. ‐Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar enla zona... ‐Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agenteinfeccioso. ‐Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugarfresco, seco y oscuro. ‐Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios handemostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit. Por ejemplo el caldo Rappaport no esbien absorbido por la membrana del kit, mientras el SS sí lo es y a pesar de estar algunos de sus tubos negros, nosuelen dejar residuo suficiente como para ocultar el resultado. De modo que el SS detecta un 80% más que elRappaport con este kit. ‐La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Salmonella y deberealizarse el Stick. ‐El medio de post‐enriquecimiento contiene Sales biliares, por lo que debe trabajarse con precaución (guantes,máscaras) y evitar tocar el líquido. ‐No se puede prescindir del post‐enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del pre‐enriquecimiento prolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestrastomadas directamente de la solución madre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en lamembrana del inmunocromatograma. ‐La adición de 0,1 ml de pre‐enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post‐enriquecimiento quedefienden algunos autores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Salmonella y muchasufc de interferentes y acompañantes, por lo que resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml sila muestra enriquecida es demasiado espesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que ellímite de detección sigue siendo el adecuado. ‐No es necesario hervir la muestra enriquecida inmediatamente antes de realizar el test, sólo si los protocolosinternos de seguridad del laboratorio así se lo exigen; ya que la banda test se ve mejor sin hervir. ‐El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjetainmunocromatográfica. ‐Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso. ‐No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas estén dañadas. ‐Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunqueincluyamos altas concentraciones de Salmonella: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso.
POSITIVO:BANDAROJA DELTEST YVERDEDEL
CONTROL
NEGATIVO:SÓLOBANDA
VERDE DELCONTROL
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‐Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandasmarrones). Las bandas negras que se dan circunstancialmente (menos del 2% de tubos SS negros) en el test no seconsideran positivas, pero tampoco negativas, ya que son acúmulo del precipitado negro del medio SS que no dejaver si hay o no banda roja. En tal caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y mediadel tubo, para repetir el test en otro Stick. ‐Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otrasmuestras (alimentos muy grasos…) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formarla línea verde (test invalidado).‐Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC85‐TT
‐Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultadoserróneos. ‐Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuadobiohazard después de los ensayos. ‐Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de ausencia/presencia de Salmonella spp. en muestras dealimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Salmonella spp. en lamuestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub‐letales y no han conseguido replicarse losuficiente como para ser detectadas. La determinación de Salmonella spp. debe llevarse a cabo sobre la muestraadecuadamente enriquecida con el protocolo que se explica en este folleto. ‐Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromosalm (Ref: DMT500) y si en él crecen colonias verdes,identificarlas bioquímica (ref: KBH260), inmunológica (refs: AC01, ZC02, PL6100) y/o molecularmente (ref: SFI004+),a fin de evitar reportar falsos positivos.
XI. RENDIMIENTO
A. Límite de detecciónEl límite de detección del Stick inmunocromatograma para los diferentes serotipos es:S. enteritidis 1x104bacteria/mL,S. typhimurium 1x104bacteria/mL yS. typhi: 1x107bacteria/ml.de caldo post‐enriquecido, que equivale, según la validación con el protocolo aquí explicado, a menos de 10 ufc deSalmonella/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbre microbiológica, nadie puede apostar en un métodoque el límite de detección sea 1 ufc).
B. Sensibilidad y EspecificidadSe realizó una evaluación con diversas cepas mediante MICROSTICK‐SALMONELLA aplicando el método dereferencia ISO 6578:2002 de Salmonella. MICROSTICK‐SALMONELLA mostró > 99% de sensibilidad y > 97% deespecificidad. Los anticuerpos utilizados para elaborar este test reconocen epitopos de Salmonella encontrados encultivos de bacterias in vitro. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que más datos deevaluación estén disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes.
C. Reactividad cruzada e InterferenciasSe realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de MICROSTICK‐SALMONELLA. No hay reactividadcruzada con patógenos intestinales comunes, otros organismos ni otras sustancias presentes ocasionalmente en losalimentos como Listeria monocytogenes, Campylobacter, H. pylori, Escherichia coli O157: H7.
D.Validación con muestras naturales de alimentosSe analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas para Salmonella spp. de diferentes alimentos, contoda clase de microorganismos acompañantesGram + (Enterococcus faecalis, Micrococcusluteus, Staphylococcus epidermidis, Listeriamonocytogenes, Listeria grayii, Listeria ivanovii,Listeria welshimeri, Listeria inocua) einterferentes Gram ‐ (Proteus mirabilis,Citrobacter freundii, E.coli) en mezclas muydiversas y a muy superior concentración (>102‐103
ufc/25 g) que los microorganismos diana(Salmonella nottingham), que estaban a un nivelínfimo de presencia (10‐16 ufc/25 g). Losalimentos implicados en la validación fueronhamburguesa cruda de ternera, lechepasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales,huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta,harina de trigo, pollo crudo, papilla infantil defrutas, barritas dietéticas con chocolate, salsa rosa, paella‐arroz a banda, pasteles variados, crema catalana, heladode vainilla, chorizo loncheado, queso curado, mariscos, galletas de perro, espaguettis. Los resultados fueron, para
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tan ajustado inóculo de Salmonella y tan elevada carga interferente, de una sensibilidad del 100% (ningún falsonegativo) y de una especificidad del 90% (los únicos falsos positivos detectados fueron en pollo crudo y en pescadocrudo).
De este modo queda validado MICROSTICK‐SALMONELLA en alimentos por su inmejorable sensibilidad (100%,no hay falsos negativos para Salmonella), por su correcta especificidad (90%, solo un 10% de falsos positivos) ypor su inmejorable límite de detección (demostrado para 10 ufc/25 g, lo cual no significa que no pueda llegar a1 ufc/25g, el problema es que es estadísticamente imposible de evaluar a causa de la incertidumbremicrobiológica).
XIII. REFERENCIAS‐
‐GORDON, M, et al, “Invasive salmonellosis in Malawi”. J Infect Developing Countries2008; 2(6):438‐442.‐ SANCHEZ‐JIMENEZ, M. et al. “Validation of a PCR for diagnosis of typhoid fever and salmonellosis byamplification of the hilA gene in clinical simples from Colombian patients”, Journal of Medical Microbiology(2004), 53, 875–878.
‐ ISO 6579:2003 ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Salmonella.
El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislaciónmedioambiental vigente. Autoclavar antes de desechar en la basura.
Protocolo y componentes del kit MICROSTICK‐Salmonella diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 22 de Diciembre de 2011.
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MICROSTICK-LISTERIA Test rápido de Immunocromatografía para la detección
Ref.KMTC86 cualitativa de Listeria spp. en muestras de alimentos.Uso exclusivo en laboratorio
LAS 10 VENTAJAS DE UN KIT SOBRESALIENTE:
1‐Rapidez de resultados: ¡5‐10 minutostras el enriquecimiento! (no horas comolos kits ELISA, ni 3‐4 días como en elmétodo tradicional de cultivo en placa).Ahorro en la obtención de resultados,conseguidos en sólo 36 horas (incluidoslos enriquecimientos). Ahorro mínimo de2 días de trabajo. Elimina la necesidad deir a leer resultados en días festivos.
2‐Robustez: se ahorran los puntos críticos de otros métodos, como los látex o ELISAs; elinmunocromatograma es el método inmunológico más duro en toda circunstancia, que puede almacenarsedurante meses fuera del refrigerador y transportarse a temperatura ambiente sin verse alterado.
3‐Sensibilidad extraordinaria: 99,9% para L.monocytogenes, lo que limita la proporción de resultadosfalsamente negativos a algo testimonial, convirtiendo el método en un correcto screening de barrido demuestras negativas de Listeria monocytogenes, ya que si no hay Listeria, no hay Listeria monocytogenes.
4‐Especificidad excelente: 95%, lo que limita adecuadamente la proporción de resultados falsamentepositivos y permite ahorrar las posteriores confirmaciones de los presuntos positivos a menos del 5% decasos en los que no había Listeria monocytogenes y el test dió presunto positivo
5‐ Kit compacto: incluye los dos caldos de enriquecimiento ISO 11290 optimizados y los Sticks confirmativos
6‐Comodidad de uso: es como un test de embarazo, no necesita aparato alguno para su interpretación,simple y visual por aparición de dos bandas de colores. Reducir manipulaciones es reducir puntos críticos.
7‐Flexibilidad: test unitarios, no hay necesidad de agrupar muestras, se pueden analizar de 1 a 20 ó más
8‐Estabilidad: se mantiene, incluso sin necesidad de refrigeración (4‐30ºC), durante muchos meses
9‐Ahorro económico: Dada la rapidez de resultados, el alimento puede ser liberado al mercado varios díasantes que como lo haría con el método clásico, lo que supone inmensos ahorros económicos para laempresa, que deben redundar en un aumento del presupuesto para el laboratorio artífice de esta heroicidad.Por ello, aunque el kit parece más costoso que el método clásico, en realidad NO LO ES en absoluto.
10‐Validado: Eficiencia del 95‐97,5% en todo tipo de muestras alimentarias según los mayores especialistasen España en validación de métodos microbiológicos: carne de ternera, leche pasteurizada, pescado,vegetales, ovoproductos, especias y aperitivos, harina de cereales, pollo, alimentos infantiles, alimentosdietéticos, salsas, paella, postres, pastelería, helados, embutidos loncheados, queso, mariscos, comidaanimal, espaguettis. Límite de detección demostrado desde 6‐10 ufc Listeria /25 g de alimento con un nivelde acompañantes e interferentes muy diversos 102‐103 veces superior que las dianas!
ISO 9001ER‐0632/1999
Apartado de Correos / P.O. Box 4428210‐Valdemorillo (Madrid, Spain) (34) 91 897 46 16 Fax: (34) 91 897 46 41
E‐mail: [email protected] Web: www.microkit.es
http://www.laboratoriosmicrokit.blogspot.com
COSMETIKIT® CHROMOSALM
SEILAGUA® KITPRO-5S
COMPACT-DRY-PLATES®
DESINFECTEST®
MUGPLUS
NUTRILINIA
CROMOKIT®
COLICULT-MCC CRIOTECA®
PLAQUIS® M-IDENT®
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I. INTRODUCION Y USO
Listeria monocytogenes es un pequeño bacilo, Gram positivo que puede crecer en condiciones anaerobias o aeróbicas. Se encuentraampliamente en el medio ambiente, en el suelo, agua y vegetación en descomposición y pueden formar parte de la flora fecal demuchos mamíferos, incluyendo adultos humanos sanos. Los síntomas iniciales de infección incluyen síntomas inespecíficos de gripe,náuseas, vómitos, fiebre, diarrea, calambres, septicemia, meningitis.... Hay muy pocas características clínicas que son exclusivas de lalisteriosis. Los síntomas se pueden desarrollar en cualquier momento desde 2 a 70 días después de comer alimentos contaminados. Aexcepción de la transmisión vertical madre–feto, la mayoría de los casos de listeriosis comienza con la ingestión de una fuente dealimentación contaminada. La mayoría de los adultos y los niños que consumen alimentos contaminados, experimentan sólo síntomasleves o moderados. Las personas inmunocomprometidas (bebés, ancianos, embarazadas, convalecientes…) corren un riesgo muchomayor de sufrir manifestaciones graves e incluso mortales de listeriosis.
El MICROSTICK‐LISTERIA es un kit de 3 componentes diseñado para proporcionar una rápida detección de Listeria spp. (incluidaL.monocytogenes) en muestras de alimentos. El MICROSTICK‐LISTERIA combina un doble enriquecimiento optimizado de la muestra,con un inmunoensayo cromatográfico para la detección cualitativa de Listeria spp. (incluida L.monocytogenes) en muestras dealimentos contaminados.
II. FUNDAMENTO DEL TEST
Los caldos de pre‐enriquecimiento revitalizador y post‐enriquecimiento selectivo, basados en los de la Norma ISO11290 pero optimizados para el Stick, mejoran extraordinariamente el rendimiento de ésta. La membrana del Stickestá revestida con anticuerpos monoclonales de ratón, en la región de banda del test, para reconocer esteantígeno. Durante la prueba, la muestra puede reaccionar con las partículas rojas de látex que están recubiertascon anticuerpos anti‐Listeria pre‐desecados. La mezcla resultante, migra hacia arriba en la membrana por accióncapilar. Como la muestra fluye a través de la membrana, el aglutinado de partículas rojas migra. En el caso de unresultado positivo, los anticuerpos específicos presentes en la membrana capturarán el aglutinado de partículasrojas, formando una banda roja. La mezcla sigue avanzando a través de la membrana con el anticuerpoinmovilizado que está en la región de la banda de control. En la línea de control aparece una banda de color verde,lo cual verifica que se ha añadido el volumen suficiente y que se obtuvo un flujo adecuado del caldo de post‐enriquecimiento inoculado, además de servir como control interno de los reactivos.
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Cada Kit contiene:
1. 20 tubotes (ref: DPA015) con polvo estéril del caldo de revitalización MICROKIT‐Listeria para 25 g de alimento(pre‐enriquecimiento)2. 20 tubos (ref: TPL033) con 10 ml del caldo de enriquecimiento selectivo MICROKIT‐Listeria, de color amarillo(post‐enriquecimiento)3. 20 tarjetas inmunocromatográficas para Listeria Ag (Sticks)4. Instruciones de uso
Materiales necesarios (no suministrados):
Contenedor de recogida de muestras, guantes desechables, contenedor de desechos, pipetas de plástico, temporizador, Stomacher ybolsas Stomacher, incubadoras + 30 ºC y + 37 ºC (se puede mantener con sólo la estufa de 35‐37ºC), y agua purificada estéril.
IV. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Los tubotes de polvo deben mantenerse lejos de la humedad atmosférica, entre 15 y 25° C, y emplear antes de la fecha de caducidadimpresa en sus etiquetas.Los tubos de líquido deben mantenerse entre 8 y 25° C al abrigo de la luz y usar antes de la fecha de caducidad impresa en susetiquetas.Las tarjetas inmunocromatográficas deben almacenarse tal como están empaquetadas en sus bolsas selladas, así como los tubosherméticos, a una temperatura comprendida entre 4 y 30 ºC (36‐86ºF), al abrigo de la luz y de la humedad. No congelar! Las tarjetasson estables hasta la fecha de caducidad impresa en su bolsa sellada y deben permanecer en éstas hasta su uso.
V. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS
Las muestras de alimentos deben ser recogidas en recipientes limpios y el ensayo debería realizarse inmediatamente después de larecogida. Aún así, las muestras pueden almacenarse en el frigorífico (2‐4 º C) durante 1‐2 días previos a la prueba. Para unalmacenamiento más prolongado, la muestra debe mantenerse en el congelador a ‐20ºC. En ese caso, la muestra será totalmentedescongelada y puesta a temperatura ambiente antes del ensayo. Descongelar sólo la cantidad necesaria ya que los ciclos decongelación‐descongelación no son recomendables. Homogeneizar la muestra lo mejor posible antes de la preparación.
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Para conseguir el nivel necesario de 1 célula de Listeria monocytogenes en 25g de alimento, es fundamental realizar unenriquecimiento adecuado en dos fases:
a) Pre‐enriquecimiento, enriquecimiento primario o fase revitalizante de las células de Listeria monocytogenes dañadassub‐letalmente durante la fabricación el alimento y neutralización de los conservantes del alimento, sean naturales,sean añadidos
b) Post‐enriquecimiento, enriquecimiento secundario o fase de enriquecimiento selectivo que multiplicará más que lasacompañantes, las células de Listeria monocytogenes hasta 105‐108 ufc/ml, un nivel más que adecuado para serdetectadas por las tarjetas inmunocromatográficas del MICROSTICK‐LISTERIA, que detectan desde 104 ufc/ml
Aún así, diversos kits en el mercado aseguran que la fase de post‐enriquecimiento no es necesaria, sobre todo si el nivel de florainterferente (aerobios totales) es baja, menor a 104 ufc/ml final; esa es una afirmación muy aventurada, ya que si se comete elfrecuente error de validar el kit con una muestra que tenga ya de entrada 103‐104 células viables de Listeria/25 g y escasa florainterferente, lógicamente la fase de enriquecimiento multiplicador es redundante; pero nadie puede asegurar la detección deListeria por debajo del límite de detección de la técnica, que en inmunocromatografía ronda las 106 células de Listeria por test (y las104 células de Listeria por test en el mejor de los casos, como es el MICROSTICK‐LISTERIA para L.monocytogenes). Por ello ellaboratorio debe elegir un kit de su total confianza, validado por entidades que muestren claramente todos los datos de la validacióny no un simple certificado, por mucho renombre internacional que tenga la entidad certificadora.
VI. ENRIQUECIMIENTO NECESARIO DEL ALIMENTO ANTE LA POSIBLE PRESENCIA DE Listeria monocytogenes
1‐Mezclar 25 g de muestra sólida o 25 ml de muestra líquida con 225 ml de agua estéril a la que añadiremos el polvo contenido enun tubote de caldo revitalizador Listeria‐MICROKIT (una mejora del caldo semiFraser, especialmente obligada para este kit). Si espreciso, golpear el tubote con polvo de pre‐enriquecimiento, en posición horizontal, antes de abrirlo, para descompactar el polvo delfondo; después cerciórese de que se ha vaciado completamente sobre el agua y la muestra. Homogeneizar duranteaproximadamente 2 minutos, a ser posible en el Stomacher. Incubar durante 18‐24 h a 28‐30ºC, o bien a 35‐37ºC.
2‐Añadir 1 ml de caldo de enriquecimiento a un tubo de 10 ml de caldo de enriquecimiento selectivo Listeria‐MICROKIT. Incubardurante otras 18‐24 h a 35‐37°C. Si no hay turbidez en el tubo después de 24 horas de incubación, reincubar otras 24 ± 2 h.
Ya en el segundo día se obtendrán los resultados para Listeria monocytogenes, ya que de aquí al paso siguiente se tardanescasamente 5‐15 minutos.
VII. PROCEDIMIENTO PARA EL TEST INMUNOCROMATOGRÁFICO EN MUESTRAS DE ALIMENTOS
Mantener previo al ensayo, todo el material: test, muestras y envases, a temperatura ambiente (15‐30ºC/59‐86ºF ). No abrir las bolsashasta el momento de realizar el ensayo.
1. Abra la bolsa del Stick por la muesca, retire la tarjeta, descarte la bolsita desecante y use la tarjeta lo antes posible.
2. Con una pipeta diferente para cada muestra, dispensar 3‐5 gotas ó 100 µL de la muestra de post‐enriquecimiento en el pocillo (S),hasta que éste se llene completamente, evitando añadir partículas sólidas de la muestra (no pipetear del fondo del tubo). Llenar elpocillo generosamente de caldo de post‐enriquecimiento, con un volumen suficiente como para crear un menisco que casidesborde el pocillo. Iniciar el temporizador.
3. Leer el resultado en 5‐15 minutos (aparecen las bandas de colores, normalmente la de control mucho antes que la del test).Generalmente no hace falta esperar 15 minutos a la lectura del Stick y en los primeros 2‐5 minutos ya se ven los positivos, pero encaso negativo hay que esperar 15 minutos por si acaso se trata de un positivo lento.
VIII. INTERPRETACION DE RESULTADOS
NEGATIVO: Solo aparece una banda verde en la ventana central del sitio marcado con laletra C (línea de control).
POSITIVO: Además de la banda verde de control a través de la ventana central delsitio marcado con la letra C (línea de control), aparece una banda roja (línea de test)en el sitio marcado con la letra T (región de resultados). Toda banda roja, por tenueque sea o truncada que esté, debe considerarse muestra positiva.
NO VALIDO: Ausencia total de banda coloreada en C. Revisar el procedimiento y repetirusando un nuevo Stick con otra muestra similar del caldo LEB, sin partículas de alimento.
POSITIVO:BANDAROJA DELTEST YVERDEDEL
CONTROL
NEGATIVO:SÓLOBANDA
VERDE DELCONTROL
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IX. CONTROL DE CALIDAD INTERNO
Los controles internos están incluidos en el test. La línea de color verde que aparece en la región de control (C) es un control interno.Confirma un suficiente volumen de muestra y una correcta técnica de uso del test. Si desea un control positivo de Listeriamonocytogenes emplee preferentemente cepas de referencia como L.monocytogenes (por ejemplo la NCTC 11994)
X. PRECAUCIONES ESPECIALES Y LIMITACIONES DEL KIT
‐Solo para profesionales de laboratorio. ‐No utilizar ningún reactivo después de su fecha de caducidad. ‐Seguir las buenas prácticas de laboratorio: ropa protectora, guantes desechables y no comer, beber o fumar en la zona... ‐Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y ser manejadas igual que un agente infeccioso. ‐Los tubotes y tubos de caldos deben permanecer cerrados hasta el momento de su uso, guardados en lugar fresco, seco y oscuro. ‐Siga al pie de la letra las instrucciones de enriquecimiento, ya que otras combinaciones y otros medios como el agua peptonadatamponada en pre‐enriquecimiento, han demostrado no ser válidos, al disminuir drásticamente la efectividad del kit. ‐La turbidez o el viraje de color en los tubos no es indicadora de presunta presencia de Listeria y debe realizarse el Stick. ‐Los medios de enriquecimiento contienen Ac.Nalidíxico, Acriflavina y Cicloheximida, por lo que deben trabajarse con precaución(guantes, máscaras) y evitar tocar y respirar el polvo y el líquido. ‐No se puede prescindir del post‐enriquecimiento; aunque en algunas muestras una incubación del pre‐enriquecimientoprolongada otras 18 h permite obtener positivos reales con el Stick, la mayoría de muestras tomadas directamente de la soluciónmadre son demasiado espesas o grasas y no migran adecuadamente en la membrana del inmunocromatograma. ‐La adición de 0,1 ml de pre‐enriquecimiento (en lugar de 1 ml) a 10 ml del tubo de post‐enriquecimiento que defienden algunosautores, no da tan buenos resultados cuando hay presentes pocas ufc de Listeria y muchas ufc de interferentes y acompañantes, porlo que en todos los casos resulta mejor añadir 1 ml; sin embargo, se pueden añadir 0,1 ml si la muestra enriquecida es demasiadoespesa o coloreada y esto impide su correcta difusión en el stick, ya que el límite de detección sigue siendo el adecuado. ‐Las tarjetas inmunocromatográficas deben permanecer en sus bolsas selladas hasta el momento de su uso. ‐No utilizar las tarjetas inmunocromatográficas cuyas bolsas están dañadas.
‐El test debe realizarse dentro de las 2 horas siguientes a la apertura de la bolsa de la tarjeta inmunocromatográfica. ‐Una vez utilizado el kit, aunque se deje secar, no funcionará correctamente con una segunda muestra aunque incluyamos altasconcentraciones de Listeria: Los Sticks NO son reutilizables en ningún caso. ‐Un exceso de muestra de alimento en el pocillo del Stick podría provocar resultados erróneos (aparecen bandas marrones). Ental caso, dejar reposar el tubo y extraer muestra limpia de la zona superior y media del tubo, para repetir el test en otro Stick. ‐Algunas muestras de ciertos alimentos pueden disminuir la intensidad de la línea de control verde. Otras muestras (alimentosmuy grasos…) pueden migrar con más dificultad por la membrana e incluso no llegar a formar la línea verde (test invalidado). ‐Puede solicitar para estos ultimos casos, una caja de 5 sticks sin tubotes ni tubos, pida la ref: KMTC86‐TT ‐Ciclos de congelación y descongelación en la muestra no son recomendables ya que pueden causar resultados erróneos. ‐Las tarjetas inmunocromatográficas y los tubos empleados deben eliminarse en un recipiente adecuado biohazard después delos ensayos. ‐Esta prueba proporciona un diagnóstico presuntivo de listeriosis o ausencia/ presencia de Listeria monocytogenes en muestrasde alimentos, pero un resultado negativo podría eventualmente indicar que la concentración de Listeria monocytogenes en lamuestra es demasiado pequeña o que las células están demasiado sub‐letales y no han conseguido replicarse lo suficiente comopara ser detectadas. La determinación de Listeria monocytogenes debe llevarse a cabo sobre la muestra adecuadamenteenriquecida con el protocolo que se explica en este folleto. ‐Todo positivo debe confirmarse con Agar Cromocytogenes (ref: PPL970) y si aparecen colonias verdes con halo, conXylosa/Rhamnosa (ref: KMT012), para evitar reportar falsos positivos; aunque el medio de aislamiento de la ISO 12290 obtiene hastaun 45% de falsos positivos si están presentes ciertos acompañantes Gram positivos (frente a sólo el 5% de falsos positivos delMICROSTICK‐LISTERIA), las colonias verdes y con halo en dicho medio que además resulten Xilosa – y Rhamnosa + se consideranL.monocytogenes. Sin embargo, este Agar Cromocytogenes no obtiene ni un solo falso negativo (sensibilidad >99,9%) incluso estandopresente la Listeria monocytogenes en cantidades ínfimas (confirmado desde 6‐10 ufc/25 g) y la mencionada flora acompañante einterferente en cantidades muy superiores (confirmado desde 102‐103 ufc/25 g).
XI. RENDIMIENTO
A.Límite de detecciónEl límite de detección del MICROSTICK‐LISTERIA es 6.25x104 L. monocytogenes /mL de caldo post‐enriquecido, que equivale, según lavalidación con el protocolo aquí explicado, a menos de 6 ufc de L. monocytogenes/25 g de alimento (por cuestiones de incertidumbremicrobiológica, nadie puede apostar en un método que el límite de detección sea 1 ufc).
B. Sensibilidad y EspecificidadSe estudiaron diversas cepas de colección con MICROSTICK‐LISTERIA con el método tradicional (ISO 11290). Los resultados fueron > el99% de sensibilidad y > 96% de especificidad. La utilización de un anticuerpo monoclonal de ratón en el kit asegura un alto grado deespecificidad para la detección de estas bacterias. Los anticuerpos utilizados para preparar este test reconocen epítopos de Listeria quese encuentra en los cultivos de bacterias. Estos valores preliminares deben tomarse con precaución hasta que haya más de datos deevaluación disponibles en matrices alimentarias (ver más abajo) y con cepas salvajes.
C. Reactividad cruzadaSe realizó una evaluación para determinar la reactividad cruzada de Listeria monocytogenes con MICROSTICK‐LISTERIA. No se ha
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encontrado reactividad cruzada con patógenos comunes de alimentos, otros organismos ni otras sustancias presentesocasionalmente en los alimentos, como Escherichia coli O157, Campylobacter y Salmonella.
D. Validación con muestras naturales de alimentosSe analizaron 20 muestras positivas y 20 muestras negativas paraListeria de diferentes alimentos, con toda clase demicroorganismos acompañantes Gram ‐ (Salmonella nottingham,Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, E.coli) e interferentesGram + (Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus,Staphylococcus epidermidis,) en mezclas muy diversas y a muysuperior concentración (>102‐103 ufc/25 g) que losmicroorganismos diana (Listeria monocytogenes, Listeria grayii,Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria inocua), que estaban(sólo una de ellas en cada una de las diferentes matrices) a unnivel ínfimo de presencia (6‐10 ufc/25 g). Los alimentosimplicados en la validación fueron hamburguesa cruda deternera, leche pasteurizada, pescado crudo, ensaladas vegetales,huevo crudo, patatas con ajo, cebolla y pimienta, harina de trigo,pollo crudo, papilla infantil de frutas, barritas dietéticas conchocolate, salsa rosa, paella‐arroz a banda, pasteles variados,crema catalana, helado de vainilla, chorizoloncheado, queso curado, mariscos, galletas deperro, espaguettis. Los resultados fueron, paratan ajustado inóculo de Listeria y tan elevadacarga interferente, de una sensibilidad del 95%‐100% (el único falso negativo de 20 fué en lechepasteurizada con L.ivanovii, por lo que no afectaa la búsqueda de Listeria monocytogenes) y deuna especificidad del 95% (falso positivo débil,en harina de trigo).
De este modo queda validado MICROSTICK‐LISTERIA en alimentos por su inmejorablesensibilidad (100%, no hay falsos negativospara L.monocytogenes), por su excelenteespecificidad (95%, solo un 5% de falsospositivos) y por su inmejorable límite dedetección (demostrado para 6 ufc/25 g, lo cualno significa que no pueda llegar a 1 ufc/25g, elproblema es que es estadísticamenteimposible de evaluar a causa de laincertidumbre microbiológica).
XIII. REFERENCIAS
1. BOTTELDOORN N, et al. “Microbiological and molecular investigation of an increase of human listeriosis in Belgium, 2006‐2007”. Euro Surveill. 2010;15(6):pii=19482.2. BORTOLUSSI, R. “Listeriosis: a primer”. CMAJ, October , 2008 Vol 179(8), p 795‐7973. ISO 11290:2000‐2004 ALIMENTOS, método horizontal para aislamiento de Listeria monocytogenes.
El usuario final es el único responsable de la eliminación de los microorganismos crecidos, de acuerdo con la legislación medioambiental vigente.Autoclavar antes de desechar en la basura.
Protocolo y componentes del MICROSTICK‐LISTERIA diseñados y fabricados por/para MICROKIT desde el 19 de Diciembre de 2011.
