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Microrganismos e Património - Novas abordagens

Ana Teresa Caldeira1,2*, Tânia Rosado2, Mara Silva2, Marina Gonzalez2 e António Candeias1,2

1 Departamento de Química, Escola de ciências e Tecnologia, Universidade de Évora, Rua Romão Ramalho 59, 7000-

671 Évora, Portugal Évora; 2 Laboratório HERCULES, Universidade de Évora, Largo Marquês de Marialva 8, 7000-809

Évora, Portugal

*correspondência: atc@uevora.pt

A implementação de estratégias de investigação integradas para o estudo e valorização

do património cultural é hoje em dia considerada uma questão fulcral na perpetuação das

obras para as gerações futuras mas pode constituir igualmente um notável contributo para

o desenvolvimento socio-económico das regiões.

Nesse sentido, a Universidade de Évora criou em 2009, o Laboratório HERCULES – Herança Cultural Estudos e Salvaguarda, uma infra-estrutura analítica e científica que desenvolve investigação integrada, dedicada ao estudo e valorização do património cultural. A nossa equipa é uma equipa multidisciplinar e engloba diferentes áreas do conhecimento: química, bioquímica, microbiologia, geologia, ciência dos materiais, conservação e restauro, arqueologia, história de arte, permitindo uma abordagem verdadeiramente interdisciplinar para o estudo do património cultural. O estudo material de obras de arte e bens patrimoniais recorrendo a técnicas de análise in-situ ou através da análise laboratorial encontra-se hoje em dia estabelecido em metodologias que, de um modo geral, estão bem definidas e, apesar das pequenas diferenças observadas nas abordagens analíticas, é normalmente possível obter a informação dos materiais constituintes e dos produtos de degradação resultantes de processos físicos e químicos. No entanto, no que respeita aos processos de biodegradação, o conhecimento ainda está no início, não apenas no estudo dos biomecanismos mas também na extensão dos seus efeitos e no desenvolvimento de novas metodologias preventivas e de tratamento.

A biodeterioração é um processo indesejável, desencadeado por organismos vivos, que

pode danificar o património cultural, incluindo artístico, arqueológico e edificado. Esta questão é muito relevante na conservação de monumentos e artefactos culturais, os quais representam um conjunto diversificado de nichos ecológicos para muitos microrganismos. De facto, as diversificadas condições bióticas e abióticas, tais como humidade, temperatura, luz, e fatores químicos, como a natureza do substrato, podem acelerar os processos de biodegradação/biodeterioração, muito embora os microrganismos sejam os seus principais promotores (Rojas et al., 2009).

Muitos organismos, tais como, bactérias, fungos, algas e líquenes podem produzir graves danos nos materiais históricos, os quais estão sujeitos a decomposição por ação de enzimas específicas e/ou ácidos orgânicos, ou outros metabolitos produzidos pelas comunidades microbianas (Urzì et al., 2007). Assim, o controle dos processos de biodegradação no contexto do património cultural é de extrema importância, com vista a uma melhor compreensão da ação deletéria dos microrganismos colonizadores. A ocorrência de microrganismos colonizadores de obras de arte pode causar diversas patologias, incluindo danos estéticos e/ou danos estruturais (Fig. 1), devido a alterações físicas e químicas dos seus constituintes. A presença dos microrganismos pode levar ao aparecimento de manchas, à formação de biofilmes nas superfícies das obras, ao destacamento de fragmentos ou ao aparecimento de fendas e fraturas (Capodicasa et al., 2010; Pepe et al., 2011).

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Fig. 1 Exemplos de peças estudadas com evidentes sinais de biodegradação e danos estéticos.

Desafios e abordagens

Embora o envolvimento de microrganismos no processo de deterioração do património cultural seja bem reconhecido, o papel específico dos diferentes grupos e espécies que compõem as comunidades ainda não está bem compreendida. Os fungos são particularmente perniciosos porque as suas hifas podem ter um alto nível de proliferação e os esporos, num estado dormente, estão geralmente presentes e disponíveis para germinação (Fig 2 a-d). Do seu metabolismo podem resultar diversos derivados de ácidos carboxílicos (por exemplo, oxálico, cítrico, sucínico, fórmico, málico, acético, fumárico , glioxílico, glucónico, ácido tartárico) ou outros metabolitos (Fig 2 e-f) que podem desempenhar um papel significativo no ataque químico (Rosado et al., 2013a; 2013b; Trane t al., 2012).

O desenvolvimento de fungos pode induzir a descoloração e deterioração das superfícies das obras de arte, levando ao aparecimento de manchas, que alteram a cor. Por outro lado, a penetração das hifas podem levar à separação de fragmentos da peça colonizada. O crescimento bacteriano é frequentemente associada à formação de biofilmes, promovendo descoloração (Milanesi et al., 2006; Rosado et al., 2014). A importância da realização de ações de remediação adequadas para materiais históricos com contaminação microbiológica é de importância vital e tendo em conta os diferentes agentes envolvidos no processo de degradação é necessária a utilização de uma abordagem multidisciplinar para compreender as alterações que afetam a obras de arte e desenvolver processos de intervenção eficazes.

Quando se estuda bens patrimoniais deve ter-se em consideração uma série de questões éticas designadamente a necessidade de informar o proprietário/responsável pelo bem sobre a necessidade e o impacto da amostragem, a manutenção de amostras para exames futuros e a dimensão da amostra que deve ser o mínimo exigido para fins de análise. No nosso grupo de trabalho os processos de amostragem envolvendo bens patrimoniais são sempre acompanhados por

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conservadores-restauradores e usam-se métodos não-invasivos (eg. recolha de biofilmes superficiais) e micro-invasivos (recolha de microamostras do material de suporte). A Fig. 3 apresenta o esquema metodológico desenvolvido e habitualmente utilizado pelo nosso grupo de investigação. De uma forma geral, procura-se o isolamento de microrganismos presentes nas obras degradadas, por metodologias convencionais de isolamento em meios de cultura, complementadas com técnicas

independentes de cultura. Embora a metodologia de isolamento não permita a caracterização completa das comunidades microbianas e alguns microrganismos não possam ser cultivados em condições laboratoriais, a presença de culturas puras de isolados permite efetuar estudos de simulação laboratorial, em condições controladas e a utilização de elevadas densidades celulares pode tornar-se uma ferramenta útil na compreensão de alguns processos.

Fig.2. Biodegradação em pintura mural a) micrografia em eletrões secundários de biofilme em argamassa, b) correspondente mapa combinatório de composição elementar (C, N, S, O) por espetrometria de raios X de dispersão de energias, c) pormenor de Penicilium sp na superfície da argamassa, d) esporos fúngicos, e) espetro Raman de argamassa contaminada evidenciando presença de oxalatos de cálcio, f) espetro Raman com alteração cromática evidenciando a presença de carotenoides.

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Fig. 3. Esquema metodológico habitualmente utilizado na deteção de agentes biodeteriogénicos.

As técnicas independentes de cultura, com utilização de DNA metagenómico (DNA total dos microrganismos presentes), possibilitam a diferenciação de microrganismos dentro de comunidades microbianas complexas e permitem avaliar a dinâmica das comunidades (González and Saiz-Jiménez, 2005; Portillo and González, 2009; Rosado et al., 2014).

Paralelamente, nos estudos desenvolvidos recorre-se à análise in situ dos bens patrimoniais recorrendo a técnicas de análise não invasivas, designadamente espetrometria de fluorescência de raios X dispersiva de energias (composição elementar do suporte), colorimetria / espetrometria de emissão no visível (parâmetros de cor) e espetrometria de infravermelhos (informação molecular) ou à análise de microfragmentos removidos de diferentes zonas, incluindo áreas visualmente biodegradadas, utilizando diversas técnicas de microanálise, incluindo microespetrometria Raman (µ-Raman), microespetrometria de infravermelhos (µ-FTIR), e microscopia eletrónica de varrimento de pressão variável acoplada a espetrometria de raios X por dispersão de energia (VP-SEM-EDX), a fim de, por um lado, caracterizar as peças do ponto de vista material e, por outro, confirmar a presença de contaminação microbiana e detetar produtos

de alteração resultante da atividade metabólica dos microrganismos (Rosado et al., 2014c). Com efeito a complementaridade destas abordagens permite uma maior compreensão dos processos de degradação das obras de arte, abrindo caminho para estratégias de mitigação/remediação dirigidas e com maior nível de eficácia

Emboras estas metodologias nos permitam uma caraterização dos microrganismos presentes e a avaliação da sua ação deletéria, torna-se fundamental o desenvolvimento de metodologias analíticas simples que se adaptem às necessidades dos sectores da conservação e reabilitação de património, de modo a poder promover estratégias de atuação eficientes e em tempo útil, por exemplo a aplicação de estratégias de mitigação utilizando biocidas eficazes. Por outro lado, as técnicas moleculares mais utilizadas são baseadas na amplificação de DNA que embora muito úteis na deteção de microrganismos não dão qualquer informação sobre a relação entre microrganismo e a própria superfície da obra. Neste sentido, o nosso grupo tem desenvolvido novas abordagens para a identificação de microrganismos biodeteriogénicos de bens patrimoniais “at point-of-care”.

Um dos pontos de partida foi o facto da tecnologia FISH (Fluorescence In-situ

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Hybridisation) com sondas fluorescentes de DNA se ter revelado uma simples e poderosa ferramenta noutras áreas de investigação para estudar as comunidades microbiológicas presentes em matrizes complexas, não requerendo equipamento sofisticado nem dispendioso (Warrick et al., 2014; Douterelo et al., 2014). Recentemente, desenvolvemos esta metodologia para ser aplicada na deteção de fungos filamentosos e bactérias em argamassas, permitindo, de forma micro-invasiva, a identificação específica de células individuais e

promovendo o conhecimento da comunidade microbiológica em termos de distribuição tridimensional (Fig. 4). O objetivo último é criar um conjunto de protocolos e ferramentas analíticas que possam ser utilizados por técnicos não especializados (ex. conservadores-restauradores) na identificação de microrganismos e consequente aplicação de ações de mitigação mais eficientes (eg. aplicação de biocidas direcionados)

.

Fig. 4. Aplicação de sondas FISH na identificação de fungos filamentosos em argamassas.

Para controlar o crescimento microbiano em bens patrimoniais e património edificado, são normalmente aplicados tratamentos com biocidas químicos de uso geral. No entanto, poucos estudos têm sido realizados para avaliar a eficácia destes biocidas e a sua compatibilidade para com os materiais de que as obras são constituídas (Nugari et al., 2009; Koestler and Salvadori, 1996). Além disso, os próprios biocidas, devido ao seu modo de ação e possível toxicidade podem causar danos nos edificados e no ambiente (Marcotte et al., 2013; Wörle et al., 2012; Rosado et al., 2014).

Seguindo as tendências recentes para o desenvolvimento "verde" de materiais sustentáveis e bio-ferramentas destinadas a enfrentar as necessidades e novos desafios no domínio da investigação aplicada ao património cultural, o Laboratório HERCULES iniciou em 2011 um programa de investigação com vista à descoberta e produção de novas moléculas bioativas e o desenvolvimento de novos biocidas mais eficazes e seguros para o utilizador e o ambiente, concebidos com metodologias biotecnológicas, passíveis de ser utilizados na prevenção de patologias e tratamento em

Conservação e Restauro e/ou como aditivos de novos produtos (por exemplo. tintas e consolidantes), a utilizar em Património Cultural.

A investigação realizada tem permitido o desenvolvimento de uma estratégia para a produção de novos produtos (BEVOTECH - Biocide Évora Technology), a partir de culturas líquidas de Bacillus amyloliquefaciens. Estes bio tensioativos anfifílicos são lipopéptidos da família da iturina e fengicina e apresentam um largo espectro de ação como fungicidas, com resultados superiores aos de produtos comerciais. Por outro lado, na nossa estratégia de produção de novos biocidas verdes e sustentáveis procuram-se implementar tecnologias alternativas e complementares. A quitina, segundo biopolímero natural mais abundante e um recurso pouco utilizado, foi selecionado para esta nova abordagem. A desacetilação de quitina produz quitosano, produto relativamente reativo podendo ser fabricado em várias formas, tais como em pó, em pasta, filme ou fibra, possíveis de utilizar em Conservação e Restauro. A atividade antifúngica e antibacteriana do quitosano é

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reconhecida na literatura para outras aplicações, pelo que se pretende produzir novos produtos biofuncionais, derivados de modificação química do quitosano, com ação antimicrobiana e posteriormente a criação de novos biocidas resultantes da ação sinérgica dos diferentes produtos.

Considerações finais

A biodegradação/biodeterioração de bens patrimoniais é um processo complexo que deve ser entendido no contexto de estratégias de salvaguarda e valorização dos mesmos. No estudo dos processos

biológicos e bioquímicos de degradação das obras são necessárias abordagens integradas utilizando metodologias de micro-análise sensíveis, aliadas a novas ferramentas moleculares. Os ensaios de simulação laboratorial em condições controladas e o recurso a marcadores bioquímicos podem ainda contribuir para um entendimento dos agentes efetivamente biodeteriogénicos e para o estabelecimento de estratégias de mitigação dirigidas e eficazes. Neste sentido, a microbiologia e a biotecnologia desempenham um papel relevante na procura de soluções inovadoras..

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