CUARTA UNIDAD

MICROPROPAGACIÓN DE VEGETALES

NICROPROPAGACIÓN

CONCEPTO Es el conjunto de técnicas y métodos

de cultivo de tejidos utilizados para

multiplicar vegetales asexualmente en forma

rápida, eficiente y en grandes cantidades. La

micropropagación se utiliza para multiplicar o

propagar vegetales nuevas, tales como

aquellas creadas por ingeniería

genética, mutagénesis o mejoramiento

genético. Se utiliza también la

micropropagacion para obtener vegetales

libres de enfermedades (tales como virosis) u

obtener grandes cantidades de vegetales

que no se propagan eficientemente.

PROPAGACIÓN DE VEGETALES

POR CULTIVO IN VITRO

El cultivo in vitroconsiste en tomar un trocito de hoja, unembrión, una porción pequeñita de tallo(de 0,2 a 1 milímetro) o cualquier otraparte de un vegetal y ponerla a cultivaren un tubo de ensayo sobre un medioacuoso nutritivo.

La asepsia en cultivo in vitro

Esta consiste eliminar todos losgérmenes, bacterias o virus en ellaboratorio, en otras palabras es elcontrol de todos los factores queafectan el crecimiento.

Condiciones de laboratorio

Requieren condiciones delaboratorio que reúnantodos los factoresambientales de la plantaen la naturaleza quetécnicamente es muycomplejo. El cultivo in vitrode plantas es una técnicaque exige un controlespecífico del ambiente,tanto físico como químico,en el que se sitúa alexplante, conviene portanto, conocer cuáles sonlos principales factoresque deberían sercontroladas.

La micropropagacióno propagación clonal

Es una de lasaplicaciones másgeneralizadas delcultivo in vitro, através de lamicropropagación, apartir de unfragmento (explante)de una planta madre,se obtiene unadescendenciauniforme, con plantasgenéticamenteidénticas,denominadas clones.

Factores que afectan el desarrollo del cultivo in vitro

Ambiente químico.

Composición del

medio de cultivo.

Ph.

Ambiente físico.

Temperatura.

luz y fotoperíodo.

Humedad.

Fases o etapas del proceso de micropropagación

0: Selección y Preparación

de la planta madre.

1: Desinfección de las

yemas de la planta y/o

desinfección de semillas.

2: introducción del material

seleccionado in vitro.

3: Multiplicación de brotes.

4: Enraizamiento.

5: Aclimatación

PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre,es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puedeoscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condicionescontroladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitariasóptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir uncrecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Trabajar en cabinas de flujo laminar para extraerlos explantes a partir del material vegetal.

Introducir en un tubo de cultivo conteniendo mediode iniciación para poder controlar la sanidad y laviabilidad.

Realizar la desinfección del material conhipoclorito de sodio (agua clorada comercial), purao diluída durante un período de 5 a 15 minutos,seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

Lavar el material biológico con detergente yenjuagar para eliminar polvo, insectos etc.…

Mantener el material en un ambiente aséptico,donde se sumerge por unos minutos en etanol al70%.

Sumergir el material biológico en el agentedesinfectante para eliminar los microorganismos.El tiempo de desinfestación es importante ya quesi es prolongado puede dañar el tejido del inóculoy si es corta los microorganismos no seránremovidos.

Lavar el material biológico con agua destiladaestéril para eliminar el agente desinfectante, elinóculo debe mantenerse en agua destilada hastael momento de la siembra (2010).

INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO

Luego de la desinfecciónsuperficial, las semillas o lasyemas dependiendo delmaterial seleccionado, seponen en medio de cultivoestéril. En un período deuna semana o quince días,comienza el proceso degerminación o regeneraciónde nuevos tejidos vegetales,iniciando el ciclo de cultivoin vitro.

MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

• Estas operaciones se realizan en lacámara de flujo laminar o en un lugaraislado que nos permita mantener lascondiciones de asepsia. De estaforma aumenta el número de plantasen cada repique o división de lasplantas.

• El número de plantas que se obtienedependerá de la especie vegetal y delas condiciones del medio de cultivo.El número de plantas que se obtienepor la vía de la micropropagaciónpermite alcanzar incrementosexponenciales, considerando quetodos los factores que afectan elcrecimiento hayan sido optimizados.

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS

EXPLANTOS

Para enraizar losexplantes se utilizanprincipalmente plantinesindividuales de un tamañoaproximado de 2centímetros. Los brotesobtenidos durante la fasede multiplicación setransfieren a un mediolibre de reguladores decrecimiento o que solocontenga hormonas deltipo auxinas.

ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales,de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de laaclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo quepermitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En elmomento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de losfrascos, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estosexplantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muyelevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular latranspiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamentefuncionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tantodemasiado lentos para evitar la desecación del explante.

Aplicaciones prácticas del cultivo in vitro

a) Propagación vegetativa. Esto es lo máspráctico. Dos técnicas

Micropropagación de estaquillas.

Organogénesis de callos

b) Producción de plantas libres de virusmediante dos técnicas

Cultivo de meristemos.

Microinjerto in vitro

c) Permite hacer germinar semillas que son muy difícil de hacer en condiciones normales. Ejemplo: algunas Orquídeas tienen en los campos unos parásitos obligados y en viveros no se pueden reproducir; se inoculan esos parásitos o in vitro.

d) Eliminar la inhibición de germinación de las semillas. El cultivo in vitro es lo más eficaz porque tiene determinados inhibidores y algunos huesos de frutales no son capaces de germinar ya que no tiene desarrollado el embrión.

e) Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad. Se da en cruces de interés científico o intergenéticos, sobre todo en plantas herbáceas. Los cruces incompatibles dan abortos.

f) Aplicación en mejora genética para obtener híbridos, para introducir material genético, etc.

g) Acortar los ciclos de mejora genética. No hay que esperar que pase el periodo juvenil del árbol para ver resultados.

h) Producción de haploides. Cruzamientos o cultivo de polen (anteras). Ventajas:

Obtención rápida de homocigotos.

Producción de híbridos (frutos puros).

Equipos necesarios para el cultivo in vitro

Autoclave

Cámara de

flujo laminar.

Medio de

cultivo.

Planta.

Cámara de

cultivo

Condiciones del cultivo in vitro

En la cámara de flujo laminar no puede entrar materialcontaminado.

En el autoclave no se pueden meter determinadas sustancias,como vitaminas, antibióticos, ácido giberélico, sacarosa,encimas, extractos vegetales, etc., ni tampoco recipientes queno soporten altas temperaturas.

El vidrio ha de ser de muy buena calidad para que nosuministre a las medias sustancias contaminantes para laplanta.

Los reguladores de crecimiento (hormonas) sonimprescindibles, ya que sin ellos no se puede hacer el mediode cultivo.

El pH ideal es 6, pero puede oscilar entre 5,5 y 6,5.

Se necesita agar y medio sólido 0,6-0,9%.

El medio de cultivo realmente sólo tiene que llevar agua,fuente de energía (azúcares) y reguladores de crecimiento.

El medio de cultivo es secreto, y se pueden tardar dos añosen prepararlo.

En la cámara de cultivo se aplican cantidades variables de luz(16-20 horas). También existen plantas que se desarrollan enla oscuridad. Las temperaturas también varían. Lo normal son22-26ºC, aunque en ocasiones se exigen fríos de 4ºC ytambién 28-30ºC para plantas tropicales.

Igualmente, en el éxito de esta técnica de propagacióntambién influyen determinadas características de la planta,como el tipo, genética e incluso el tipo de implante, parte másjuvenil o más adulta.

En cuanto a los recipientes, deben permitir el intercambio degases, pero evitar la pérdida de agua, lo que provocaría unaumento de la concentración de sales, y por tanto la muertede la planta. De ahí la importancia del cierre.

Subcultivos o replicado

El medio nutritivo se

agota y se seca.

El material vegetal

ocupa todo el tubo.

Se produce un cambio

de olor en el medio

(sustancias tóxicas).

El medio se hace

líquido.

Fases del cultivo de meristemos

a) Toma un ápice meristemático (0,2-1 mm).

b) Siembra en el medio del tubo.

c) Fase de proliferación: crecimientode brotes. Subcultivos.

d) Fase de enraizamiento (cambiarel medio).

e) Primera fase de aclimatación. Esmuy importante el que la plantapueda llegar o no al campo.Invernaderos, bolsas de plástico,bandejas de vidrio, etc.

f) Segunda fase de aclimatación.Siempre en invernadero.

g) Plantación en el campo.

Fases del cultivo de embriones

a) Se desinfecta el fruto enalcohol. Se flamea.

b) Se coge el embrión de lasemilla.

c) Se inocula en el tubo.

d) A las 1-2 semanas, laplanta está más o menosreconocible.

e) Se deja crecer y se pasapor las fases deaclimatación.

Micropropagacióna) Se parte de una yema, de bráctea o axilar.

b) Se empieza a desarrollar en el medio de cultivo.

c) Entre la fase de proliferación y de enraizamiento hay muchos subcultivos (para obtener más plantas).

d) El número de subcultivos depende del material vegetal. Ejemplo de micropropagación de Kiwi:

Se parte de un trozo de tallo.

Al cabo de 4 semanas se obtiene una yema y crece un brote.

En la fase de proliferación intentamos obtener gran cantidad de brotes.

Sacamos microestaquillas del primer brote, haciendo subcultivos cada 6-8 semanas hasta llenar el vidrio.

Al aumentar la concentración de auxinas se obtienen plantas enraizadas.

Puede hacerse de forma industrial y la fase de enraizamiento se hace en vivo.

Cultivo de callo in vitroSe parte de un trozo de hoja o de tallo; bien de una planta madre de maceta ode una planta que viene de cultivo in vitro.

El medio puede ser sólido o líquido.

Se forma entonces una estructura de callo, de la que parten brotes, otambién proembriones, que al unirse forman una estructura similar alembrión.

A partir de entonces se desarrolla normalmente.

Obtención de plantas haploidesNormalmente se trabaja con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yemade flor se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis uorganogénesis.

Embriogénesis: se forman células (poliembriones).

Organogénesis: se forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera(diploide), o bien del grano de polen (haploide).

No se riega nunca por aspersión (riesgo de patógenos), siempre con regadera.

Problemas en el cultivo in vitro

La contaminación es el problemamás grave en los cultivos in vitro,como en otras actividades delhombre y la mujer, de maneraparticular en la aplicación de latecnología de micropropagaciónde las especies vegetales, que elser humano lo necesita, paraseguir alimentándose,industrializando las bondades dedel reino vegetal. Vitrificación: esuna reacción de las plantas quelas hace adquirir apariencia devidrio. La única solución es hacerun subcultivo de material sano, esdecir, se saca y se cortan lostrocitos que estén bien.

III. CULTIVO IN VITRO CASEROMaterial del

laboratorio

FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo).

Olla a presión.

Guantes.

Mascarilla de papel.

Espátula.

Bisturí.

Mechero de alcohol.

Soporte y rejilla.

Varilla de vidrio.

Pinzas metálicas.

Trapo.

Papel de aluminio (o papel film).

Gasa estéril.

Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas.

Reactivos Lejía.

Ácido clorhídrico.

Hidróxido sódico.

Lavajillas.

MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1 litro)

100g de plátano maduro hecho puré o licuado.

10 g de agar-agar.

15 g de azúcar.

900 ml de agua destilada.

1,2 g Tiamina *

Material

biológico

Cápsula semillas orquídea u otra semilla de especies vegetales a

propagarse.