Microcultivo. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de

1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí estéril y caliente.

Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri (previamente esterilizada).

Tomar con el asa él inoculo del moho previamente seleccionado.

Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar.

Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio

6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri.

7. Incubar la caja a 28° C durante 48 h.

Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta Pasteur.

Adicionar 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15 minutos

Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente.

Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón, colocar un cubreobjetos

sobre el colorante y sellar la preparación. Observar las preparaciones a 10X y 40X.

Auxonograma: basado en la asimilación de H de C en presencia de O2 en un medio base sin azúcares con discos impregnados con H de C. Se forma halo si la cepa estudiada asimila el azúcar

Zimograma: basado en la fermentación de azúcares. Se usa un medio líquido al que se añade un azúcar determinado, más un indicador de pH. Si vira el indicador, se produce ácido y gas en forma de burbujas. La fermentación del azúcar es + .

La fermentación y asimilación de compuestos de carbono son las pruebas más utilizadas en la identificación de levaduras. El auxonograma o capacidad de las levaduras para utilizar o asimilar diferentes compuestos de carbono es hoy día el criterio taxonómico más aceptado

Examen directo microscópico. Se realiza a partir de muestras obtenidas de lesiones. Es el método

más simple y más rápido para establecer un diagnóstico presuntivo de micosis, ya que no necesita de incubación. Si la muestra no es abundante hay que dar prioridad al cultivo, frente al examen directo.

Preparación de la muestra:

En el caso de tejidos: cortar, trocear, machacar, etc.

En el caso de líquidos: concentrar por centrifugación.

En el caso de uñas: trocear, repartir en fragmentos, etc.

Si son otras muestras como escamas, pelos, etc, no es necesaria una preparación previa, sino que se hace directamente el examen

Líquidos de montaje en el lab. De micología.

Examen Directo con Solución Salina

Colocamos una gota de la muestra líquida en un porta y añadimos una gota de solución salina. Ponemos el cubre y observamos al microscopio con poca luz y variando el aumento.

Los hongos se observan refráctiles o brillantes, ligeramente verdosos. En el caso de las levaduras pueden aparecer inclusiones. También se pueden observar burbujas de diferentes tamaños. No debemos confundir las levaduras con hematíes y con burbujas de aire. Se diferencian porque las levaduras presentan pequeñas inclusiones en la célula y las burbujas van a ser siempre de diferentes tamaños

Hidróxido Potásico con Dimetil Sulfóxido

No es necesario calentar la preparación, de esta forma no aparecen precipitados. Las muestras de pelos, escamas y biopsias se observan con poca luz.

Es importante no confundir artefactos como fibras de tejidos, granos de polen, etc, con hongos. Otra causa de error es lo que se denomina “hongos en mosaico”, que suele aparecer cuando las muestras están muy queratinizadas. Suelen ser acúmulos lipídicos que desaparecen cuando se calienta la preparación.

Colocamos la muestra en pequeñas porciones sobre un porta y añadimos varias gotas de KOH + Dimetil y ponemos el cubre. Observamos los elementos fúngicos (hifas, levaduras, etc).

Si la muestra observada son uñas muy queratinizadas, el tiempo que actúa del KOH es de varias horas. Es conveniente dejar el porta en una cámara con ambiente húmedo (placa de petri con un algodón empapado en agua dentro).

Azul Algodón de Lactofenol

Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompañante y organismos; el ácido láctico conserva las estructuras fúngicas y el azul algodón tiñe la quitina de las paredes fúngicas.

Añadimos una gota de la muestra o una porción del hongo en un porta. Sobre ella colocamos una gota de azul algodón y ponemos el cubre. Observamos al microscopio.

Blanco de Calcofluor

Se realiza un examen directo sea cual sea la muestra. Es útil en cortes de tejidos.

Colocamos en un porta la muestra + 1 gota de KOH dimetil sulfóxido + 1gota de calcofluor. Mezclamos y ponemos el cubre. Después de varios se ha producido la clarificación, y se observa en un microscopio de fluorescencia (verde brillante o blanco azulado). Las fibras elásticas y colágeno se observan con fluorescencia amarillo verdosa. Estas se pueden confundir con hongos y levaduras y se diferencian en la fluorescencia.

Hay algunos hongos (“hongos dematiaceos”) que producen enfermedades como micetomas que se tiñen con gran dificultad usando el blanco de calcofluor.

Colorante de Cobre ( tinta parker-KOH)

Para el diagnóstico de Malassecia furfur se tiñen intensamente de color azul. La tinta china se utiliza en muestras de LCR y exudados. La usamos siempre que busquemos Criptococcus neoformans.

La técnica consiste en añadir 1gota de tinta china junto con 3 gotas de la muestra, dejar reposar, apareciendo un color marrón (la cápsula se rodea con un halo blanco).

Métodos de tincion.Tincion de Gram

Se realiza para la identificación de hongos. Suelen ser Gram+ y la única consideración a tener en cuenta es que el cristal violeta hay que mantenerlo por más tiempo.

Fundamento:

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea .

Primer colorante: violeta cristal

Gram +: Colorante violeta cristal se queda en la celula no puede traspasar la pared

Gram -: Colorante violeta cristal se intercambia por alcohol blanco.

Segundo colorante: fucsina basica

Gram +: violeta+fucsia violeta

Gram -: blanco+fucsia fucsia

Tincion de cápsulas

Primer colorante: fucsina basica: tiñe todo menos la capsula

Segundo colorante: nigrosina: tiñe el medio capsula queda contrastada en blanco.

Tincion de esporas

Primer colorante: verde de malaquita: tiñe las esporas

Segndo colorante: fucsinna basica: tiñe el resto de la celula se observan endosporas dentro de la celula.

Tinción de giemsa.Fundamento

Estos organismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.

Procedimiento Desparafinar e hidratar. Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10 minutos. Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios. Aclarar con xilol, 3 cambios.

Resultados Citoplasma: rosa Núcleos: azul Eritrocitos: rosa - naranja Gránulos de las células cebadas: púrpura Bacterias: azul Parásitos: azul

Tinción de Wright

Fundamento

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky.

Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.

La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico.

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Tinción acido-alcohol resistente.

Fundamento

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

El procedimiento es el siguiente:

desparafinar e hidratar los cortes ácido periódico 5%, 10 min lavar con agua destilada fucsina fenicada, 15 min decolorar en alcohol ácido al 50% lavar con agua destilada hematoxilina, 10 min azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio deshidratar, aclarar y montar preparaciones

Tinción hematoxilina-eosina

Fundamento:

La tinción hematoxilina-eosina corresponde a la mezcla de hematoxilina y eosina. La tinción hematoxilina y eosina es uno de los métodos mas populares de tinción utilizado en histología y medicina diagnostica.

El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y purpura,como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.

Técnica

Sumergir los preparados histológicos en xilol para eliminar los excesos de parafina. El xilol es un alcohol algo tóxico, pero existen reactivos (como el Hemo-D) que ejercen la misma función aclarante de parafina sin la toxicidad del xilol.

Luego pasan por una serie de alcoholes en concentración decreciente para rehidratar la muestra (100°. 95° y 70°).

Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar excesos y se pasa

rápidamente por alcohol ácido. Se lava nuevamente Se sumerge 30 segundos en eosina. Se pasa por otra serie de alcoholes,esta vez en orden creciente(70°, 95° y 100°) para deshidratar la

muestra y que se pueda realizar el montaje con un pegamento no soluble en agua. Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

Tinción de acido periódico de shiff (PAS)

La técnica de Schiff, es una reacción colorimétrica que se usa comúnmente en citoquímica. Utiliza PAS, ácido peryódico de Schiff, o leucofucsina, un colorante incoloro pero que se torna rojo estable al contacto con los grupos aldehídos.

La técnica de PAS se utiliza en los preparados para microscopia óptica, permite la tinción de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, células caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que están rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta técnica, el ácido peryodico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehídos compuestos por carbono, oxigeno y hidrogeno. así la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tinción rojiza.

Se emplea para determinar la presencia de moléculas como el glucógeno , glucoproteínas y glucosaminoglucanos.

Lo que hace es romper la unión de los anillos de las hexosas formando grupos aldehído o rompen los enlaces de las hexoaminas de los glucosaminoglucanos, también formando grupos aldehído y haciéndolos reaccionar a estos grupos con el reactivo de Schiff. También sirve para identificar membranas basales y fibras reticulares.

Plata metanamina de Gomori

La plata metanamina de Gomori es un método de tinción especial más empleado para hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina (o metenamina) produciendo una coloración de café a negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.

También se utiliza para la identificación de la melanina. Este pigmento es producido en la piel por los melanocitos. En los humanos la melanina se encuentra en piel, cabello, en el recubrimiento de la retina. Aunque los seres humanos generalmente poseen una concentración similar de melanocitos en su piel, estos expresan en algunos individuos y en algunas etnias más frecuentemente el gen productor de melanina, por lo que se confiere una mayor concentración de melanina en la piel.

Procedimiento

Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de instrumentos metálicos, ya que la plata precipitaría sobre ellos.

1. Desparafinar e hidratar.

2. Añadir ácido peryódico 0,5%, 12 minutos.

3. Lavar con agua destilada.

4. Sumergir los cortes en la solución de plata metanamina, 1 hora mínimo a 60 ºC; a partir de este tiempo comprobar regularmente al microscopio.

5. Lavar con agua destilada.

6. Añadir cloruro de oro, 1 minuto.

7. Lavar con agua destilada.

8. Añadir tiosulfato sódico 3%, 1-2 minutos.

9. Lavar con agua corriente.

10. Tinción de contraste (rojo nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto.

11. Deshidratar, aclarar, montar.

Mucicarmina de Mayer

Las mucinas o mucoproteínas son proteínas con H.C. en una proporción superior al 4 %. La técnica del mucicarmín de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas, pero no reconoce su naturaleza bioquímica.

1º-Desparafinado.Estufa durante 30 min. a 60º.Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.

6º - Solución diluida de mucicarmín ( 1:4 ) 30 min.

2º- Hidratación.Alcohol absoluto-5min.Alcohol 96º-5min.Alcohol 70º-5min.

7º - Lavar con agua corriente 10 min.

3º- Lavar en H2O destilada.

8º-Deshidratar.Alcohol de 70ºAlcohol de 96º.Alcohol absoluto.Xilol.

4º- Teñir con Hematoxilina de Weigert 10 min.

9º- Montaje.

5º - Lavar con agua corriente 3 min.

Tinción de toluidina.

Colorante que tiñe estructura basófilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromático (tiñe de color azul) o metacromático (tiñe de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza química de la sustancia teñida.

Como colorante ortocromático, se usa frecuentemente para teñir tejido nervioso, donde tiñe la heterocromatina y los gránulos de Nissl (acúmulos de cisternas de retículo endoplásmico rugoso de los somas neuronales, así como las fibras nerviosas amielínicas y células de glía. También se utiliza para la tinción de cortes semifinos.

El azul de toluidina tiñe metacromáticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparán sulfato, presente - por ejemplo - en el cartílago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en los gránulos de las células cebadas

Azul de alcian

se ha comprobado que usando el azul alcián en condiciones de pH en torno a 2,4 -2,6 se colorean los mucopolisacáridos ácidos sulfatados y los carboxílicos.

Si por el contrario se emplea a un pH muy bajo, en torno a 1, sólo se colorea los mucopolisacáridos sulfatados, los carboxílicos no se tiñen.

Si se sigue disminuyendo el pH hasta 0,5 se incrementa la selectividad de la tinción y en este caso sólo se tiñen los mucopolisacáridos fuertemente sulfatados

Modo de operar:• Desparafinar e hidratar.• Tratar con la solución deseada de azul alcián durante 30 min.• Si se usó la solución a pH 2,5, lavar con agua (d) ; si se usó cualquiera de

los otros dos, secar sólo con papel de filtro.• Contrastar si se desea con rojo nuclear.• Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:▪ Azul alcián a pH 2,5 los mucopolisacaridos ácidos (carboxilos y

sulfatos) se tiñen de azul.▪ Azul alcián a pH 1 sólo se tiñen de azul los mucopolisacaridos ácidos

sulfatados.▪ Azul alcián a pH 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacaridos ácidos

fuertemente sulfatados