INTRODUCCIÓNEn su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños

para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.

Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición, estructura, tamaño, composición entre otros aspectos;

es por ello que se emplea el estudio microscópico el facilita notablemente la observación; principalmente en las bacterias se

facilita al tratarlas con colorantes o tintes los cuales facilitan también la observación de ciertas estructuras celulares.

En este informe vamos a distinguir la estructura intracelular de algunos microorganismos.

La coloración celular y tejidos son una combinación de fenómenos físicos y químicos de absorción: los fenómenos físicos de absorción, capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que hay reacción química.

Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es que producen color y grupo de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la propiedad cromógena al colorante y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un

colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se

combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no

produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de

bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de

las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes

celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad

está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Preparación de Frotis Bacteriano para Coloración:

Entes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro líquido en un porta objeto limpio y son extendido en

una película uniforme y delgada. Se deja que la película seque en el aire y los microorganismos son fijados por

sustancias químicas o por el calor moderado.

Tinciones:Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no

vivos); en estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de microorganismos.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores.

Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante.

Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Tinción Simple: utiliza un solo colorante.Tinción de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg)

Tinción Ácido Resistente:Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido

mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los demás

microorganismos son decolorados por el ácido y toman el color azul.Tinción de Giensa:

El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos

de la células.Tinción de Esporas:

Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.

Tinción de Cápsula:Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos

encapsulados creando resistencias.Tinción de Flagelos:

Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.Endósporas:

Son unos cuerpos resistentes que se producen en el interior de la célula los cuales contienen los componentes necesarios para

conservar la vida.Las esporas pueden situarse en el centro de la célula o en situaciones excéntricas cerca de un extremo de la misma.

Levaduras:Son esféricas, elípticas y cilíndricos, su tamaño varía

notablemente. Son hongos cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular

Las Cápsulas:Son estructuras grueso viscosas gelatinosas que rodean las células

de algunas especies.Sarcina:

Son anaerobios obligados y son extremadamente ácido – tolerantes que pueden fermentar azúcares y crecer a pH inferior a 2.

Este género comprende 2 especies de bacterias que se dividen en tres planos perpendiculares para producir paquetes de 8 en una

célula.Bacillus Cereus:

La mayoría se encuentra en el suelo o en partículas de polvo en suspensión y son uno de los organismos del género Bacillus que

pueden ser aislados fácilmente.Puesto que los formadores de esporas pueden aislarse

selectivamente a partir del suelo, alimentos o de otro material dejando las muestras a 80 ºC durante 10 minutos.

Los bácillus suelen crecer en medios sistemáticos que contengan azúcares, ácidos orgánicos, alcoholes, etc, como única fuente de

carbono y amoníaco como única fuente de nitrógeno.

La tinción de Gram se utiliza para identificar bacterias tratándolas con un tinte azul y observando cómo responden a esta coloración. La forma en que se colorean los distintos tipos de células depende de las variaciones de estructura de la pared celular. Las bacterias Gram positivas, como Lactobacillus acidophilus, retienen el tinte y se colorean de azul.

La tinción de Gram, diseñada en 1884 por el bacteriólogo danés Christian Gram clasifica a las bacterias en dos grandes

grupos: Gram Positivas y Gram Negativas. Esta tinción diferencial depende de la estructura de la pared celular de las

bacterias. 

En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules.

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

Las bacterias Gram negativas tienen una membrana externa de la que carecen las bacterias Gram positivas.

Neisseria meningitidis

                                                                          

La bacteria Neisseria meningitidis que muestra esta imagen, produce meningitis bacteriana así como otras enfermedades. Su carácter Gram negativo se debe a su incapacidad para captar un tipo específico de colorante bacteriano denominado tinción de Gram.

En las tinciones simples se usa un único colorante de carácter básico. Todas las células de la preparación quedan teñidas y se observan del mismo color. Se realiza la fijación, por calor, de la muestra al portaobjetos. Se añade el colorante y se deja actuar el tiempo necesario para que se absorba. Posteriormente se retira el exceso de colorante y la preparación está lista para ser observada.

-Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). -El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.-La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.

Las tinciones diferenciales se utilizan para distiguir entre tipos de microorganismos. Se basan en el uso de dos colorantes. Se realiza una tinción primaria, con la misma técnica de la tinción simple y posteriormente una tinción de contraste para teñir las células que no se hayan teñido previamente. La tinciones diferenciales más importantes son la tinción de Gram y la tinción de Ácido-Alcohol Resistencia

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos.

Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de mas de una sustancia tintórea. En algunas

técnicas de coloración, las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y

la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener informacion acerca de la composición de las capas de la

pared celular de las células bacterianas.

La tinción de Wirtz-Conklin permite diferenciar las esporas de las células vegetativas. La tinción primaria se realiza con Verde de Malaquita en caliente que tiñe las células de verde. El calor es necesario para que las endosporas se tiñan. Si la preparación se lava con agua, sólo las células vegetativas se decoloran mientras que las esporas retienen el color.La tinción de contraste se realiza con rosa safranina que tiñe las células vegetativas de color rosa, mientras que las esporas permanecen verdes.

Algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán

teñidas con el segundo colorante.

Esporas de Microsporidium Glugea anomala

Espora de Nosema tractabile, con el filamento polar expulsado  transformado en un tubo.  El esporoplasma diplocariota se encuentra de forma visible afuera del tubo.

Encephalitozoon spp. Detectados con  un reactivo de inmunofluorescencia. (A) Sedimentos urinarios; (B)

control positivo de esporas