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Villaca Terrones Walter. MICROBIOLOGÍA GENERAL Profesor: Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz Integrantes: Cortijo Palacios Kiara. Gamboa Cruzado Wagner. Taboada Rosales Yakcy. Villaca Terrones Walter. Universidad Nacional del Santa Facultad de Ingeniería Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial

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MICROBIOLOGÍA GENERAL

Profesor: Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz

Integrantes:

Cortijo Palacios Kiara.

Gamboa Cruzado Wagner.

Taboada Rosales Yakcy.

Villaca Terrones Walter.

MICROBIOLOGÍA GENERAL

Profesor: Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz

Integrantes:

Cortijo Palacios Kiara.

Gamboa Cruzado Wagner.

Taboada Rosales Yakcy.

Villaca Terrones Walter.

Universidad Nacional del SantaFacultad de Ingeniería

Escuela Académico Profesional de Ingeniería Agroindustrial

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ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DE LOS MICROORGANISMO. METABOLISMO GENERALPRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

I. INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos tienen la capacidad de efectuar una serie de reacciones que les permiten

incorporar y transformar diversos compuestos. Estas transformaciones son catalizadas por

enzimas y son acompañadas por reacciones energéticas. Aún cuando todas las reacciones

biológicas son catalizadas por enzimas el tipo de estas o de los sistemas enzimáticos varía en los

diferentes microorganismos. De este modo para estudiar el metabolismo de un microorganismo se

utiliza una batería de sustratos y después de incubar se procede a reconocer el tipo de reacciones

que se efectuaron mediante la determinación de los productos que se formaron.

La suma de las actividades enzimáticas, así como las características nutricionales permiten la

identificación de las bacterias. Existen sistemas especializados en la identificación de bacterias.

Las bacterias completan varias actividades bioquímicas usando los nutrientes que el ambiente les

ofrece. Las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y fuera de la célula y son mediadas

por las enzimas. Una vez las bacterias realizan estas actividades de degradación, los organismos

liberan productos que pueden ser utilizados para su caracterización o para la confección y

producción de materiales y alimentos.

I. OBJETIVO

• Demostrar e interpretar la acción degradativa de un microorganismo sobre un

determinado sustrato contenido en un medio de cultivo específico.

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II. FUNDAMENTO TEÓRICO

En cualquier ecosistema existen condiciones constantes y dinámicas en las que cada miembro compite con los demás en busca de un nicho favorable. En la mayoría de los casos, los efectos destructores de los microorganismos durante el desarrollo de una enfermedad se deben a la satisfacción de sus necesidades particulares de supervivencia. La enfermedad constituye un subproducto de sus actividades metabólicas, los microorganismo deben competir para asegurar su alimento de manera que deben tratar de ajustar el medio (Temperatura, pH y potenciales de oxidación y reducción a sus condiciones óptimas. En ciertos casos la patogénesis de la enfermedad incluye:

1. El consumo de tejidos efectuado por enzimas extracelulares.

2. El bloqueo físico de capilares debido a un crecimiento limitado.

3. La inhibición competitiva de las reacciones en la cadena respiratoria que interfiere con el pigmento análogo del huésped.

El estudio del metabolismo microbiano es esencial para comprender completamente la relación huésped-parásito.

Las numerosas y variadas reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo sintético (ANABOLISMO) y energético (CATABOLISMO) de los microorganismos se realizan y controlan por medio de las enzimas extracelulares e intracelulares.

Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biológicos. Por ejemplo, pueden producir luz, como en la fosforescencia de los peces muertos y pueden producir combustión espontánea en almiares, pajares y graneros de lúpulo. Ciertas formas anaerobias desprenden, por descomposición de la celulosa, gas de los pantanos en charcas

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estancadas; otras bacterias favorecen la formación de depósitos de hierro ocre y manganeso en los pantanos. Las bacterias también afectan a la naturaleza y composición del suelo.

Como resultado de su actividad, los restos de sustancias orgánicas de las plantas y los animales se

descomponen en partículas inorgánicas. Este mecanismo es una fuente importante de alimento

para las plantas. El proceso fotosintético en que se basan las plantas fue, casi con certeza,

desarrollado en primer lugar en las bacterias; el reciente descubrimiento de una bacteria

fotosintetizadora denominada Heliobacterium chlorum puede ayudar a la comprensión de este

desarrollo fundamental en la evolución de la vida.

Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A

este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran número de

reacciones químicas destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos que

posteriormente serán utilizados para la síntesis de los componentes estructurales; como pueden

ser las proteínas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la

energía que está contenida en una reacción química en algún proceso que requiera de energía,

como puede ser el trabajo o el movimiento.

Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en

ningún caso el alimento contiene todas las moléculas que una célula requiere. Esto se vio con

claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que sólo contenía

glucosa como única fuente de energía. Así pues, se pensó que la síntesis de todos los componentes

celulares se llevaba a cabo en el interior de las levaduras.

Hoy sabemos que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que,

por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una

función específica a no ser la de formar parte de lo que se conoce como vía metabólica. La

transformación de los nutrientes en compuestos útiles para la subsistencia de un organismo se

lleva a cabo por medio de las reacciones químicas que realizan unas proteínas conocidas como

enzimas.

III. MATERIALES

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a. Material Biológico

• Cultivos puros bacteriano: 1) Bacillus subtilis, 2) Escherichia coli, 3) Proteus vulgaris, 4) Pseudomonas fluorescens, 5) Staphylococcus aereus.

• Placas petri con agar almidón.

• Tubos de ensayo con Caldo glucosa rojo de fenol incluida una campana de Durham.

• Tubos de ensayo con agar gelatina.

• Tubos de ensayo con caldo urea.

• Placas de petri con agar Tributirina.

b. Material de laboratorio

• Asa Bacteriológica calibrada.

• Asa Bacteriológica en punta.

• Mechero de alcohol.

IV. PROCEDIMIENTO:

4.1. DEGRADACIÓN DE CARBOHIDRATOS

HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN:

• Dividir una placa de agar almidón en tres sectores.

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• Con el asa bacteriológica en punta previamente esterilizada por flameado coger la

muestra del cultivo puro bacteriano 1.

• Sembrar en el centro de uno de los sectores por PUNTURA.

• Sembrar los cultivos puro bacteriano 2 y 3 en los otros sectores respectivamente.

• Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

• Leer la hidrólisis del almidón cubriendo la superficie de la placa con solución de lugol.

FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA:

• Sembrar por SUSPENSIÓN el cultivo puro bacteriano 1 en un tubo con CALDO GLUCOSADO.

• Sembrar de la misma forma anteriormente descrita los cultivos puros bacterianos 2 y 3.

• Incubar a 37°C por 24 horas.

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1

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• Observa los tubos en cuanto al cambio de color y formación de gas.

4.2. DEGRADACIÓN DE SUSTANCIAS NITROGENADAS:

LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA

• Sembrar por PICADURA PROFUNDA en tubos con agar gelatina los cultivos

puros bacterianos 2 y 4 respectivamente.

• Incubar por 37°C entre 24 a 48 horas.

• Transcurrido el tiempo de incubación colocar ambos tubos en refrigeración por

2 horas. Observar la licuefacción de la gelatina en cada uno de los tubos.

HIDRÓLISIS DE LA UREA

• Sembrar por MASIVA EN SUPERFICIE en tubos con agar urea inclinado los cultivos puros bacterianos 2, 3 y 4.

• Incubar a 37°C por 24 horas.

• Observar la formación o no de un color rojo cereza.

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4.3. DEGRADACIÓN DE LIPIDOS

HIDRÓLISIS DE TRIBUTIRINA

• Dividir una placa de agar Tributirina en tres sectores.

• Con el asa bacteriológica en punta previamente esterilizada por flameado coger la

muestra del cultivo puro bacteriano 2.

• Sembrar en el centro de uno de los sectores por PUNTURA.

• Sembrar los cultivos puro bacteriano 3 y 5 en los otros sectores respectivamente.

• Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.

• Leer la hidrólisis de la Tributirina.

Incubamos

V. RESULTADOS:

1. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

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2

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2. FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA

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Cultivo 1 : Bacillus

Cultivo 2 : Escherichia coli

Cultivo 3 : Proteus vulgaris

Se observaron zonas claras nos coloreadas después de agregar unas cuantas gotas de lugol, este caso fue del Bacillus subtilis, donde se observaron resultados instantáneos, y también de Proteus vulgaris, pero después de cierto tiempo de espera. Pero, en el caso de Escherichia coli, no se observaron zonas claras.La formación de las zonas claras nos indican que el microorganismo, en este caso las bacterias, hidrolizan el almidón, es decir nos indican que el microorganismo es alfa-amilasa (+).

Cultivo 1 : Bacillus

Cultivo 2 : Escherichia coli

Cultivo 3 : Proteus vulgaris

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MICROORGANISMO GLUCOSA

ÁCIDO/GAS

1. Bacillus subtilisLa solución tornó de un color rojo a amarillo, pero en la campana de Durham tenía un color anaranjado claro. No hubo formación de gas (CO2).

2. Escherichia coliLa solución tornó al igual que la anterior de color rojo a amarillo, y sí se formó gas dentro de la campana de Durham.

4. Proteus vulgaris

Al igual que los resultados anteriores, la solución final fue de color amarilla, y se observaron pequeñas burbujas de gas.

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NEGATIVO

POSITIVO

POSITIVO

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3. LICUEFACCIÓN DE GELATINA

Después de llevar a la refrigeradora por un tiempo determinado de 30 min. Se observaron los siguientes resultados:

MICROORGANISMO GELATINASA

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El cambio de color de la solución después de la incubación, de color rojo a amarillo, nos indica la formación de ácidos a partir de la degradación de la glucosa, lo cual hace virar el indicador pH contenido en el medio; por ende podemos decir que en estos tres resultados hubo la formación de ácidos. Entonces, el viraje a amarillo indica fermentación (+).Ahora, la formación de gas se observa dentro de la campana de Durham en el tubo de ensayo que contenía a la bacteria Escherichia coli y Proteus vulgaris.

Cultivo 2 : Escherichia coli

Cultivo 4 : Pseudomonas fluorescens

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Escherichia coliEl resultado fue sólido, es decir, no hubo acción de la proteína de la gelatina, es decir no hubo hidrólisis de gelatina.

Pseudomonas fluorescensEl resultado fue una solución licuada, esto indica la acción de la proteína de la gelatina por acción enzimática. Es decir hubo hidrólisis de la gelatina.

Datos Bibliográficos:

La gelatina es una proteína que se obtiene por hidrólisis parcial del colágeno y proporciona un sustrato útil para determinar la acción de las enzimas proteolíticas de los microorganismos.

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Proteína + H2O polipéptidos + H2O aminoácidos

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4. HIDRÓLISIS DE UREA

MICROORGANISMO UREASA

Escherichia coli

El color inicial del tubo fue anaranjado, tornándose de color amarillo, además de la formación de un espacio en la parte inferior del tubo.

Pseudomonas fluorescens

El color inicial anaranjado, no cambió a ningún otro, pues no se observaron cambios en este tubo, el cual contenía a la bacteria Proteus vulgaris

Proteus vulgaris

Esta fue una reacción positiva, ya que el color final fue rojo, esto indica que, los gérmenes que forman la enzima ureasa utilizan la urea dando como resultado la formación de amoniaco que alcaliniza el medio y por presencia de un indicador de pH este vira a

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Cultivo 2 : Escherichia coli

Cultivo 3 : Proteus vulgaris

Cultivo 4 : Pseudomonas fluorescens

POSITIVO

NEGATIVO

NEGATIVO

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color rojo.

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Entonces, se puede decir según las fuentes consultadas que los cultivos ureasa (+) producen reacción alcalina (color rojo cereza)

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Datos Bibliográficos: La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que se transforma por algunos microorganismos del suelo, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad microbiana el nitrógeno es liberado al suelo en forma inorgánica. Cuando esta reacción ocurre en medio de cultivo se alcaliniza y el indicador permite percibir visualmente el cambio en acidez del medio.

Fuente: http://www.monografias.com/trabajos14/bacterias/bacterias.shtml

5. HIDRÓLISIS DE TRIBUTIRINA

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VI. DISCUSIONES

• BACTERIOLOGÍA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO. Evelyn

Rodriguez Caballin Página 195:

Hidrólisis del almidón

El almidón es un homopolisacárido de glucosa, cuyos componentes son la amilosa línea

y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima

llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa1-4, liberan maltosa e

isomaltosa, que ingresan a la célula y pueden metabolizarse.

Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidón forma un complejo

de color azul con el yodo. Las cadenas de amilopectina solo dan un color café rojizo y el

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Cultivo 2: Escherichia coli

Cultivo 4: Pseudommonas fluorescens

Cultivo 5: Staphylococcus aureus

Se observó un halo transparente alrededor de la colonia formada por las Pseudomonas fluorescens, esto, indicando la hidrólisis del sustrato de tributirina. Pero, el Escherichia coli y el Staphylococcus aureus no formaron un halo transparente alrededor de su colonia, pues no hidrolizaron la tributirina.

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almidón hidrolizado no da ninguna coloración. Por lo tanto la ausencia del color azul

indica que el almidón ha sido hidrolizado.

• MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA Y MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS.

Luis Roberto Alarcón. Página 36 - 37

Hidrólisis de la gelatina

La gelatina es una proteína fibrosa que se obtiene al hervir huecos, cartílago y otros

tejidos conectivos que al enfriarse forman gel.

Ciertos microorganismos tienen habilidad para romper la molécula mediante la

exoenzima gelatinasa, liberando aminoácidos que se usan como nutrientes.

La gelatina hidrolizada se vuelve líquida.

Hidrólisis de la urea

La urea o carbamida es una diamida que se degrada por medio de una amidasa llamada

ureasa. Se rompe el enlace del nitrógeno con el carbono, con liberación de amoniaco y

CO2. El medio con urea es adicionado un indicador de pH (rojo de fenol). El amoniaco

libre alcaliniza el pH y el indicador vira a color violeta.

• MICROBIOLOGÍA CLÍNICA PRÁCTICA. Pedro García Martos, Fernando Paredes Salido,

María Teresa Fernández del Barrio. Página 117:

Metabolismo de Lípidos

Los lípidos no constituyen cuantitativamente un elemento nutritivo de importancia

para las bacterias; sólo unas pocas especies pueden metabolizar algunos de ellos por

contener lipasas, lectinasas u otras enzimas.

Investigación de lipasas:

Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido. La existencia de lipasa se traduce

por la aparición de un halo opaco alrededor de las colonias, a causa de la precipitación

de los ácidos grasos.

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VII. CONCLUSIONES

• Se evidencio el desarrollo de diferentes microorganismos en diferentes sustratos.

• Los microorganismos pueden degradar a casi todo tipo de sustancias orgánicas o inorgánicas, también en su manera de actuar y bajo qué condiciones estrictas (aerobias, anaerobias, etc.).

• Se llego a entender cómo actúan los mecanismos de estos microorganismos que se valen de enzimas para degradar el sustrato presente en el exterior para así poder absorberlos y realizar sus distintas vías metabólicas necesarias para su supervivencia.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia tiene la acción degradativa de un determinado sustrato por parte de un determinado microorganismo?

Las bacterias actúan sobre las proteínas, glúcidos y lípidos (moléculas voluminosas) para

convertirlas en fragmentos más pequeños y así puedan penetrar a través de la membrana

citoplasmática, mediante la participación de exoenzimas.

Por ejemplo:

• Los microorganismos disponen de carbohidratos en forma de polímeros, la celulosa y

el almidón, siendo sus enzimas de tipo extracelular la celulasa y amilasa

respectivamente, las que son secretadas a través de la pared celular para ser

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degradadas hasta unidades (maltosa, glucosa) que puedan penetrar a la célula con

facilidad.

• La acción degradativa de un organismo sobre una proteína, por ejemplo la gelatina es

debido a la enzima gelatinasa quien logra producir unidades de aminoácidos.

• Por otro lado, muchos microorganismos degradan grasa y aceites (lipólisis) y obtener

un acetato para el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de aminoácidos.

“Los tres procesos metabólicos que parecen independientes, relacionados con los carbohidratos,

proteínas y lípidos, en realidad están muy relacionados entre sí. Los tres pueden suplir

compuestos activos dentro del ciclo de Krebs, proporcionando energía para la síntesis y

proveyendo unidades estructurales para componentes celulares”

2. Mencione cual es la razón de añadir indicadores acido – base a algunos medios de cultivo. Ejemplos.

Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar

variaciones de pH. Por ejemplo:

Fermentación de la glucosa: el cambio de color de rojo a amarillo indica formación de ácidos a

partir de la degradación de la glucosa, lo cual hace virar el indicador de ph contenido en el medio.

La formación de gas se observa dentro de la campana de Dirham en el tubo de ensayo.

Hidrólisis de la urea: Los gérmenes que forman la enzima ureasa utiliza la urea dando como

resultado la formación de amoniaco que alcaliniza el medio y por presencia de un indicador de ph

este vira a un color rojo. Este es un resultado positivo.

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También, la adición de algunas sustancias indicadoras al medio, los convierte en medios

diferenciales debido a que permiten el desarrollo de las bacterias con una apariencia colonial

distintiva, según la especie. En virtud de la composición química de estos medios, se pueden

caracterizar ciertos géneros bacterianos por la apariencia colonial distintiva en el medio, por

ejemplo el medio agar-eosina-azul de metileno (EMB) y el agar-MacConkey contienen Lactosa y un

colorante o un indicador de pH. Las colonias fermentadoras de lactosa y productoras de aldehído,

producen colonias de un color especial.

3. Mencione las diferentes formas de siembras realizadas en cada uno del los procedimientos y en qué se diferencian.

Siembra por puntura:

Se realiza sobre un medio solido preparado en una placa petri, generalmente usado para

transportar una cantidad mínima de microorganismos y ver su crecimiento. Se realiza con la aza en

codo.

Siembra por suspensión en caldo:

Se realiza en tubos ya sean inclinados o no inclinados y tiene como finalidad transportar y disolver

la muestra de microorganismos para determinar la turbidez de dicho caldo luego de ser inoculado.

Para este procedimiento se usa la aza de siembra o aza calibrada (0,1ml).

Siembra por picadura profunda:

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Esta técnica se puede realizar en tubos con medios inclinados o no inclinados y suele usarse para

determinar la movilidad de los microorganismos. Se hace regularmente con el asa de siembra en

punta.

Siembra por estría en superficie masiva:

Realizada mayormente en tubos inclinados con pico de flauta extendiendo a los microorganismos

sobre toda la superficie para ver su efecto de degradación sobre el sustrato utilizado.

4. Describa el fundamento de cada uno de los resultados obtenidos en cada uno de los procedimientos por medio de un cuadro sinóptico o mapa conceptual

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HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrólisis de almidón es analizada en HYPERLINK "http://www.monografias.com/trabajos14/medios-comunicacion/medios-comunicacion.shtml"medios conteniendo almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

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FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA

Las bacterias anaerobias o anaeróbicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a ácidos orgánicos y gas (H

2 o CO

2). Estos pueden

detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azúcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entéricas.

LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA

La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.

La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.

HIDRÓLISIS DE LA UREA

Este enzima hidroliza la urea (H2N-CO-NH2) y origina amonio lo que producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador.

Las bacterias se inoculan en un medio con glucosa-peptona y urea al 2%. Como indicador de pH se utiliza rojo fenol.

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IX. BIBLIOGRAFÍA

• http://www.slideshare.net/breid/pruebas-bioqumicas-y-medios-de-cultivo-en-bacterias

• http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismos.shtml

• http://www.monografias.com/trabajos14/bacterias/bacterias.shtml

• http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html

• BACTERIOLOGÍA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRÁCTICAS DE LABORATORIO. Evelyn Rodriguez

Caballin Página 195:

• MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA Y MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS.

Luis Roberto Alarcón. Página 36 – 37

• MICROBIOLOGÍA CLÍNICA PRÁCTICA. Pedro García Martos, Fernando Paredes Salido, María

Teresa Fernández del Barrio. Página 117:

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En la hidrólisis de lípidos (en este caso tributirina), se debe a la rotura de los enlaces ésteres que unen los ácidos grasos a alcoholes como la glicerina o glicerol. Esto gracias a la segregación de una enzima llamada lipasa.

HIDRÓLISIS DE LÍPIDOS

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