Microalgas modificadas genéticamente para producir biodiesel
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Grupo de investigación “Biotecnología de Productos Naturales. Laboratorio de Genética III. Tesis doctoral Microalgas modificadas genéticamente para producir biodiesel Yasmeen Younes Dautor Universidad de Almería Diciembre 2014
Transcript of Microalgas modificadas genéticamente para producir biodiesel
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Tesis doctoral
Microalgas modificadas genéticamente
para producir biodiesel
Yasmeen Younes Dautor
Universidad de Almería Diciembre 2014
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Los resultados contenidos en esta tesis corresponden a los trabajos realizados por la doc-
toranda Dª Yasmeen Dautor durante su estancia en nuestro laboratorio. Autorizamos a la
doctoranda a defender la presente tesis:
Director: Diego López Alonso Co-director: Federico García-Maroto
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Índice
Contenido Introducción ........................................................................................................................ 1
Las microalgas ................................................................................................................ 1
Estado de desarrollo actual de la Ingeniería genética de microalgas .............................. 8
Una aplicación concreta: producción de biodiesel ........................................................ 12
Las propuestas: un proyecto de investigación ............................................................... 15
Material y métodos ........................................................................................................... 25
Material biológico ......................................................................................................... 25
Scenedesmus almeriensis .......................................................................................... 25
Agrobacterium tumefaciens ...................................................................................... 26
Medios de cultivo para S. almeriensis .......................................................................... 26
Medio TAP ................................................................................................................ 26
Medio DWNA ........................................................................................................... 27
Condiciones de cultivo .............................................................................................. 28
Cultivo de Agrobacterium tumefaciens ........................................................................ 28
Medidas para controlar el crecimiento .......................................................................... 28
Ensayos de sensibilidad frente a antibióticos ................................................................ 29
Higromicina B ........................................................................................................... 29
Cefotaxima ................................................................................................................ 29
Higromicina más cefotaxima .................................................................................... 30
Zeocina y fleomicina ................................................................................................. 30
Técnicas de biología molecular..................................................................................... 30
Extracción de DNA genómico .................................................................................. 30
Tinción GUS ............................................................................................................. 34
Actividad enzimática GUS........................................................................................ 34
Vectores empleados ...................................................................................................... 36
pCAMBIA 1305.1 ..................................................................................................... 36
pCAMShble .............................................................................................................. 38
Construcciones empleadas ............................................................................................ 39
Construcción del vector con EpDGAT1 ................................................................... 39
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Construcción del vector con CrScDGAT2 ................................................................ 40
Preparación de A. tumefaciens para usarla en transformación...................................... 41
Preparación de células competentes .......................................................................... 42
Transformación de células competentes de A. tumefaciens ...................................... 42
Cultivo de Agrobacterium para transformación de Scenedesmus ............................. 42
Transformación de S. almeriensis mediante A. tumefaciens ........................................ 43
Mantenimiento de clones .............................................................................................. 44
Análisis de lípidos ......................................................................................................... 45
Transmetilación directa ............................................................................................. 45
Extracción de lípidos totales ..................................................................................... 45
Fraccionamiento lipídico ........................................................................................... 46
Separación de clases lipídicas ................................................................................... 46
Cromatografía de gases ............................................................................................. 47
Métodos estadísticos ..................................................................................................... 47
Diseño estadístico de experimentos de transformación ............................................ 47
Cribado ...................................................................................................................... 47
Ensayo comparativo de las cepas genéticamente modificadas .................................. 48
Resultados ......................................................................................................................... 49
Trabajos preparatorios ................................................................................................... 49
Parámetros de control del crecimiento ...................................................................... 49
Ensayos con antibióticos ........................................................................................... 53
Transformación con higromicina como antibiótico de selección .................................. 57
Criterios de transformación ....................................................................................... 57
Cribado de los factores que influyen en la eficiencia de la transformación .............. 59
Transformación con zeocina como antibiótico de selección ......................................... 61
Criterios de transformación ....................................................................................... 63
Estabilidad genética de los clones transformados ..................................................... 66
Transformación con genes DGAT ................................................................................ 66
Evidencias de transformación con EpDGAT1 .......................................................... 67
Evidencias de transformación con CrScDGAT2 ....................................................... 67
Composición en ácidos grasos de los clones transformados con DGAT .................. 68
Discusión ........................................................................................................................... 85
Sensibilidad a los antibióticos de S. almeriensis ........................................................... 85
Desarrollo de un método de transformación genética ................................................... 86
Problemática del nivel de expresión ......................................................................... 90
Transformación con genes DGAT ................................................................................ 93
Análisis de conglomerados: SD2C7 y SD1E52 diferentes ....................................... 93
Estructura de la variación .......................................................................................... 93
Heterogeneidad entre clones de la misma línea transgénica .................................... 95
Efecto global de los dos transgenes .......................................................................... 95
Comparaciones con la cepa silvestre......................................................................... 96
Efecto sobre el contenido de TFA ............................................................................. 97
Resultados de la transformación con DGAT en plantas ........................................... 98
Transformación con DGAT en microalgas ............................................................... 99
Conclusiones ................................................................................................................... 103
Agradecimientos ............................................................................................................. 105
Referencias ...................................................................................................................... 107
Apéndice ......................................................................................................................... 117
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Parte de los resultados de esta tesis fueron presentados públicamente en:
1st International Symposium about Microalgae Biotechnology, “Devel-
opment of a genetic transformation method for Scenedesmus almeriensis via Ag-
robacterium tumefaciens”, Almería, 12/07/2012. Póster.
20th International Symposium of Plant Lipids, “Genetic engineering of
Scenedesmus almeriensis for biofuel production”, Sevilla, 9-13/07/2012. Póster
EMBS2014 “Genetic engineering of microalgae for biofuel: reality or
myth”. Almería, 19-25/10/2014. Lecture.
También han sido publicados en:
Dautor Y, Chileh T, Úbeda-Mínguez P, Mañas-Fernández A, García-
Maroto F, Alonso DL (2013) Microalgas para biodiesel: desarrollo de un método
de transformación genética para Scenedesmus almeriensis, una especie con poten-
cial industrial. Chronica Naturae. 3:10-7
Dautor Y, Úbeda-Mínguez P, Chileh T, García-Maroto F, Alonso DL
(2014) Development of genetic transformation methodologies for an industrially-
promising microalga: Scenedesmus almeriensis. Biotechnol Lett 1-8, doi:
10.1007/s10529-014-1641-z
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INTRODUCCIÓN
Las microalgas Las microalgas son microorganismos fotosintéticos que reúnen en sí mis-
mas características propias de microorganismos y de plantas. La gran mayoría de
las especies microalgales crecen en autotrofía utilizando la luz del sol, como fuen-
te de energía, y sustancias minerales junto con el dióxido de carbono del aire, para
sintetizar sustancias orgánicas complejas. Algunas especies crecen heterotrófica-
mente, obteniendo tanto la energía como el carbono de fuentes orgánicas, y otras
son capaces de crecer mixotróficamente, utilizando simultáneamente la energía
solar y sustancias orgánicas.
Figura 1-1. Posibles usos de las microalgas. Representación esquemática del funcionamiento de
una microalga: las cosas que consume/utiliza y las cosas que produce/podría producir.
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Desde un punto de vista teórico, las microalgas son capaces de producir un
gran número de sustancias de interés a partir de fuentes de energía y de materiales
muy baratas: luz solar, CO2 del aire, agua y sales minerales (Figura 1-1) de tal
modo que, podrían ser utilizadas para una serie de propósitos prácticos tales co-
mo, biocombustibles, fármacos, proteínas recombinantes, aditivos alimentarios,
aminoácidos esenciales, etc. (Figura 1-1).
Por otra parte, el cultivo de microalgas se supone que reúne una serie de
ventajas:
Medio de cultivo muy barato: agua (marina, en muchos casos), mi-
nerales y CO2. (Escenario ideal. Habitualmente siempre hay que
añadir algunas substancias adicionales aunque siguen siendo me-
dios de cultivo muy baratos.)
Energía la obtienen del sol. (No hay coste energético para la foto-
síntesis pero cualquier reactor de cultivo de microalgas supone un
coste energético que va, desde leve, para reactores a cielo abierto
(“open-ponds”), a costoso, para reactores cerrados (tubulares, de
paneles, etc.). También se consume mucha energía en el proceso de
cosechado de la biomasa.)
Tabla 1-1. Productividad en aceite. Comparación de la productividad en aceite (L/ha·año) de dos
microalgas y dos plantas oleaginosas.
Organismo Productividad (L/ha·año) Fuente
Scenedesmus almeriensisa
20.000 Datos propios
Colza 1.300 Rötting et al. 2010
Palma 5.950 Rötting et al. 2010
Nannochloropsis spb
32.600 Rodolfi et al. 2008 a Contenido en ácidos grasos totales de 7%.
b Contenido en lípidos totales de 30%.
Alta eficiencia-crecimiento rápido-productividad. (Esta ventaja pa-
rece bastante indiscutible y puede ser ilustrada con datos de la pro-
ducción de aceite. La palma aceitera, que es de largo la planta su-
perior más productiva en aceite, alcanza casi 6.000 L/ha. Por su
parte, se estima que algunas microalgas pueden llegar a producir
por encima de 30.000 L/ha y año (Rodolfi et al. 2009), y nuestras
propias estimaciones, muy conservadoras y nada por encima de la
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Introducción 3
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realidad, nos dicen que S. almeriensis podría producir entre 10.000
y 20.000 L de aceite por hectárea y por año (Tabla 1-1).)
Fácil extracción de productos (por ser unicelulares).
No desvía recursos del circuito alimentario. (Esta afirmación es ri-
gurosamente cierta y, aunque parezca trivial, a nuestro modo de ver
es una de las más importantes como tendremos ocasión de ver más
adelante cuando hablemos del conflicto alimentos frente a combus-
tibles.)
Menor consumo de agua. (También es bastante verosímil porque
no sería técnicamente complicado reciclar el agua resultante del
cosechado de la biomasa.)
Pueden crecer fijando directamente el dióxido de carbono emitido
por una central térmica. (Aunque teóricamente es cierto, dista mu-
cho de ser una situación técnicamente resuelta.)
No compite con la agricultura por el agua y la tierra. También esta
ventaja parece verosímil porque un gran número de microalgas es
capaz de crecer en aguas salobres o salinas y en tierras improducti-
vas.
No requieren herbicidas ni pesticidas. (Esto es cierto, siempre que
sean cultivadas en sistemas cerrados a salvo de depredadores,
competidores, y parásitos.)
No hay riesgo de flujo de genes al ecosistema (para transgénicas).
(En el caso de cultivar microalgas transgénicas, de manera relati-
vamente sencilla, pueden ser cultivadas en régimen de confina-
miento evitando el flujo de genes al ecosistema.)
Junto a estas ventajas potenciales pero verosímiles, frecuentemente, se rea-
lizan unas afirmaciones o se proporcionan unos datos que no resisten el más mí-
nimo análisis. Por ejemplo respecto del uso para producir lípidos, reiteradamente
se afirma que puede incrementarse mediante la deprivación de nutrientes (gene-
ralmente el nitrógeno), ocultando el hecho de que, si bien es verdad que aumenta
el contenido en lípidos (Alonso et al. 2000), se produce al mismo tiempo un des-
plome del crecimiento del cultivo y, como consecuencia, realmente se origina una
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disminución de la productividad, que es el parámetro clave en cualquier proceso
productivo industrial. En este mismo contexto, siendo el objetivo la producción de
ácidos grasos o de glicerolípidos (por ejemplo, para biodiesel), la mayoría propor-
ciona datos sobre el contenido en lípidos totales de las microalgas “olvidando” el
detalle de que, entre los lípidos extraídos de las microalgas con los métodos usua-
les, se incluyen una cantidad significativa (a veces el 50% o más), de “lípidos”
tales como pigmentos, esteroles, etc., completamente inútiles para la producción
de biodiesel. En cualquier caso, en función de lo que hemos comentado, parecería
razonable un “boom” de la producción industrial de microalgas. Repasemos cual
es la situación.
El mercado actual de las microalgas
Los cultivos comerciales a gran escala de Chlorella se iniciaron a princi-
pios de los años 60 seguidos por los de Spirulina (Arthrospira) en los años 70. A
partir de los 80, se establecieron instalaciones de producción de microalgas en
Asia, India, EE.UU., Israel y Australia. Actualmente unas 200 especies de micro-
algas son utilizadas en todo el mundo. Las especies más usadas fototróficamente
son Arthrospira (= Spirulina, una cianobacteria), Chlorella, Dunaliella y Haema-
tococcus para ser utilizadas directamente como alimentos o para extraer de ellas
aditivos alimentarios. Crypthecodinium, Schizochytrium y Ulkenia son cultivadas
heterotróficamente para la producción de ácidos grasos omega-3 de larga cadena.
Como alimentos en acuicultura las microalgas comúnmente usadas son Chlorella,
Isochrysis, Pavlova, Phaeodactylum, Chaetoceros, Nannochloropsis, Skeletone-
ma, Thalassiosira, Haematococcus, y Tetraselmis (Enzing et al. 2014).
Aunque el volumen total de producción y el tamaño del mercado de las
microalgas son, en general, relativamente pequeños, ha habido una alta tasa de
crecimiento desde 1999. En ese año la producción global fue estimada en 1.000
toneladas de peso seco. En cinco años, en 2004, la producción se había incremen-
tado hasta 5.000 toneladas de peso seco con un valor global de un billón de euros.
En el año 2011 el volumen de producción total alcanzó las 9.000 toneladas de
peso seco. El valor global del mercado de biotecnología marina en 2011, con las
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microalgas como su componente principal, fue estimado en 2,4 billones de euros
con una expectativa de crecimiento del 10% anual (Enzing et al. 2014).
Nótese que este volumen es aún muy pequeño comparado con otros más
tradicionales. Por ejemplo, la producción global de trigo en 2011 fue 700 millones
de toneladas: ¡cerca de 80.000 veces más! Estos datos ponen de manifiesto que,
aunque algunas aplicaciones de las microalgas tienen una larga tradición, la pro-
ducción comercial a gran escala de las microalgas puede ser aún considerada co-
mo “an infant industry” (Enzing et al. 2014).
Tabla 1-2. Productos de microalgas comercializados actualmente.
Producto Microalga Precio ($/kg) Compañía
beta-caroteno Dunaliella 300-3.000 Varias
Astaxantina Haematococcus 10.000 Varias
LC-PUFA Crypthecodinium
Schizochytrium
60.000 Varias
Metabolitos marcados con isóto-
pos
¿? 1-20 millones Spectra Stable Isotopes
Ficoeritrina Algas rojas
Cianobacterias
15 millones BlueBiotech Int.
GmbH
Cyanotech
Anticancerígeno ¿? ¿? PharmaMar
Fármacos proteicos Chlamydomonas ¿? Rincon Pharmaceuti-
cals
Biocombustibles Varias ¿? Varias a Rosenberg et al. 2008; Enzing et al. 2014
Los datos que acabamos de describir obviamente se ven reflejados en el
reducido número de productos microalgales que hay en el mercado (Tabla 1-2)
aparte de su uso bien establecido como alimento en acuicultura y como comple-
mentos nutricionales en humanos (Alonso y Garcia-Maroto 2011). Lo que suscita
la pregunta de por qué no se ha desarrollado una potente industria microalgal.
El coste de producir microalgas
La respuesta está en que el coste de producir microalgas es, hoy por hoy,
extraordinariamente elevado. Aunque las diferentes estimaciones varían conside-
rablemente unas de otras, los datos que aparecen en la Tabla 1-3 pueden tomarse
como válidas en su orden de magnitud. El coste de la materia prima, la biomasa
microalgal, y por ende, el aceite de microalgas, es extraordinariamente elevado
(Tabla 1-3). El coste extraordinariamente alto de la producción de biomasa mi-
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croalgal y de su procesamiento son las principales razones que limitan el gran
potencial de las microalgas (Alonso y Garcia-Maroto 2012) y, al mismo tiempo,
justifican el escepticismo manifestado por algunos expertos (Ratledge y Cohen
2008; Ratledge 2011) a despecho de las grandes expectativas manifestadas por
otros (Chisti 2007; Mayfield 2011).
Tabla 1-3. Coste del aceite procedente de distintos orígenes. Comparación de costes entre
microalgas, varias plantas oleaginosas y el crudo de petróleo. a proyección del coste en base a la
mejora del contenido de aceite (30%); bcoste actual
Materia prima Biomasa
(coste $/ton)
Contenido en
aceite (%)
Aceite
(coste $/ton)
Fuente
S. almeriensisa
6.000 30 21.200 Datos propios
S. almeriensisb
6.000 7 91.000 Datos propios
Microalgas 5.000 30 20.000 Benemann 2012
Microalgas 40.000 50 80.000 Ratledge 2011
Petróleo crudo 500 Ratledge 2011
Colza 1.294 USDA 2013
Girasol 1.452 USDA 2013
Soja 1.039 USDA 2013
Palma 500 Wijffels et al. 2010
Por tanto, la clave para el desarrollo de una potente industria microalgal
estriba en reducir el coste de producción de la biomasa microalgal. En este senti-
do, parece haber un consenso general en que sólo mediante un avance sustancial
de la biotecnología de microalgas será posible el desarrollo de una auténtica in-
dustria microalgal. El proceso completo, desde la mejora de las cepas cultivadas
hasta el cosechado, pasando por todas las etapas intermedias del proceso produc-
tivo, tiene que ser significativamente desarrollado con el fin de reducir los altos
costos actuales (Alonso y Garcia-Maroto 2011; Chisti 2013; Enzing et al. 2014).
Aparentemente la distancia es insalvable: bajar el precio de la biomasa se-
ca ¡desde 5.000-6.000 hasta ~150 $/ton!. Pero estamos hablando de microorga-
nismos, y creemos que es aplicable lo que ha sucedido en otros casos. Por ejem-
plo, la productividad de penicilina de las cepas modernas es 5.000 veces superior
a la original, incremento que se consiguió en unos 50 años (Wijffels y Barbosa
2010). ¿Cómo se consiguió ese aparente milagro? Mejorando todo el proceso pro-
ductivo: cepas mejoradas (incluso transgénicas), mejores reactores, procedimien-
tos de extracción optimizados, etc. En suma, desarrollando la biotecnología de los
hongos productores de antibióticos.
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Introducción 7
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Biotecnología de microalgas
Entre las más de 40.000 especies de microalgas hemos visto como sólo
poco más de una decena de especies son explotadas comercialmente. Todas éstas
son utilizadas “tal cual”, es decir, no ha sido objeto de ningún proceso de “domes-
ticación”. Como ha sido sugerido, para convertir el cultivo de microalgas en una
actividad comercial a gran escala será necesario domesticar las microalgas, del
mismo modo que las plantas cultivadas actuales fueron objeto de un proceso de
domesticación, que las transformó ampliamente hasta convertirlas en especies
útiles desde el punto de vista agrícola. Las microalgas deberán ser objeto de un
proceso análogo. En este caso, el proceso de domesticación consiste en gran parte
en el desarrollo de la biotecnología de microalgas.
En nuestra opinión, este proceso debe prestar una atención preferente a las
especies microalgales que muestren gran potencial industrial para ser selecciona-
das y mejoradas genéticamente (Alonso y Garcia-Maroto 2011). Por “potencial
industrial” queremos decir especies que reúnan la mayoría, o todas, de las siguien-
tes características:
Una tasa de crecimiento alta (o, lo que es lo mismo, elevada pro-
ductividad)
Capacidad para crecer en reactores de cultivo en masa durante pro-
longados periodos de tiempo
Suficiente robustez para soportar condiciones ambientales varia-
bles (pH, temperatura, etc.).
En muchos casos, estas y otras mejoras tendrán que conseguirse mediante
la modificación genética de las microalgas, lo que implica que se ha de desarrollar
la ingeniería genética de microalgas, hoy por hoy, todavía muy en sus inicios
(León y Fernández 2007; Rosenberg et al. 2008; Chisti 2008; Wijffels y Barbosa
2010). Como se recoge en un reciente informe (Enzing et al. 2014), “los principa-
les retos biotecnológicos son el desarrollo de sistemas de transformación para
una variedad de microalgas y la mejora de la estabilidad de las cepas.”
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Estado de desarrollo actual de la Ingeniería genética de
microalgas Desde 1990 la ingeniería genética de microalgas está progresando signifi-
cativamente pero aún se encuentra poco desarrollada comparativamente con otros
microorganismos o con las plantas superiores.
El número de genomas de microalgas secuenciados es todavía muy redu-
cido (Tabla 1-4) lo que dificulta el progreso de la ingeniería genética en estos mi-
croorganimos (por ejemplo, a la hora de clonar un gen concreto).
Tabla 1-4. Genomas secuenciados de microalgas.
De las más de 40.000 especies de microalgas, sólo está descrita la trans-
formación genética de algo más de 20 y de éstas, sólo para un par de ellas, C.
reinhardtii y P. tricornutum, se han desarrollado sistemas robustos de transforma-
ción. Esta situación deberá ser completamente invertida: existe un consenso prác-
ticamente unánime que considera el desarrollo de esta tecnología como un ele-
mento clave del desarrollo de la biotecnología de microalgas, sea cual sea la apli-
cación práctica que se persiga con ellas (Chisti 2007; Rosenberg et al. 2008; Hu
et al. 2008; Courchesne et al. 2009; Wijffels y Barbosa 2010; Greenwell et al.
2010; Radakovits et al. 2010; Enzing et al. 2014).
Como hemos dicho, la transformación genética está bien establecida (es
decir, herramientas y métodos fiables están disponibles) para la especie modelo C.
reinhardtii pero a despecho de su reivindicación como microorganismo industrial,
esta especie parece estar bastante lejos de reunir los requisitos antes mencionados.
Por consiguiente, herramientas de ingeniería genética están siendo desarrolladas
Algas rojas:
Cyanidioschyzon merolae (2007).
Diatomeas:
Thalassiosira pseudonana (2004).
Phaeodactylum tricornutum (2008).
Fragilariopsis cylindrus (¿?).
Algas verdes:
Ostreococcus tauri (2006).
Ostreococcus lucimarinus (2007).
Chlamydomonas reinhardtii (2007).
Micromonas pusilla (2009).
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Introducción 9
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específicamente para especies microalgales (por ejemplo, Chlorella, Nannochlo-
ropsis, etc.) que están más adaptadas a la producción industrial (Jinkerson et al.
2013). En este sentido el objetivo principal de esta tesis, que constituye la primera
parte, ha sido desarrollar las herramientas de transformación genética de S. alme-
riensis, una especie, como veremos, industrialmente prometedora.
Tabla 1-5. Genes marcadores usados en transformación de microalgas. Se muestra el gen
marcador, el carácter que confiere y la especie en que se ha utilizado.
Gen Carácter Especie
hpt Resistencia a higromicina H. pluvialis
UidA (GUS) Color azul H. pluvialis
AphVIII Resistencia a neomicina y otros Chlamydomonas
Shble Resistencia a bleomicina
Resistencia a zeocina
Chlamydomonas
Phaeodactylum
NptII Resistencia a G418 Chlamydomonas
Diatomeas
Dinoflagelados
eGfp Fluorescencia Phaeodactylum
ChGfp Fluorescencia Chlamydomonas
Herramientas de transformación genética
Como cabría esperar, cuando se han llevado a cabo experimentos de trans-
formación genética, los genes marcadores utilizados frecuentemente han sido los
mismos que en plantas superiores: genes de resistencia a antibióticos y genes re-
porteros (Tabla 1-5). Todos estos genes, se han probado fundamentalmente en
Chlamydomonas y Phaeodactylum existiendo un gran desconocimiento en el resto
de las especies.
Con relación a los promotores, la historia es similar (Tabla 1-6): se han
utilizado promotores heterólogos habituales en plantas como por ejemplo, el pro-
motor 35S del CaMV y se ha avanzado en el uso de promotores propios tales co-
mo, el del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa
(RbcS2) o el del gen de la proteína de respuesta a choque térmico (Hsp70A), pro-
cedentes ambos de C. reinhardtii, así como, promotores propios de diatomeas
procedentes de Phaeodactylum (Tabla 1-6).
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Tabla 1-6. Promotores usados en transformación de microalgas. Se muestra el promotor, la
especie de procedencia y la especie en que se ha utilizado.
Promotor Origen Receptora
CaMV35S CaMV H. pluvialis
Chlamydomonas
nos Agrobacterium Chlamydomonas
fcp-a o fcp–c P. tricornutum P. tricornutum
RbcS2 Chlamydomonas Chlamydomonas
Nia1 (Nit1) Chlamydomonas Chlamydomonas
Hsp70 Chlamydomonas Chlamydomonas
p1'2' Agrobacterium Dinoficeas
Ubi1 maíz D. salina
En la corta historia de esta tecnología aplicada a las microalgas se han en-
sayado un buen número de procedimientos diferentes para conseguir la transfor-
mación de las células microalgales (Tabla 1-7):
Tabla 1-7. Métodos de transformación usados en microalgas.
Microalga Método de transformación
Clorofitas (algas verdes)
C. reinhardtii Todos
Chorella ellipsoidea Electroporación, bombardeo
Chorella saccharophila Electroporación
Chorella vulgaris Transformación de protoplastos
Chorella sorokiniana Bombardeo
Chorella kessleri Bombardeo
Ulva lactuca* Bombardeo
Dunaliella viridis Bombardeo
D. salina Electroporación, bombardeo
Haematococcus pluvialis Bombardeo, Agrobacterium
Volvox carteri Bombardeo
Bacilariofitas (diatomeas)
Thalassiosira pseudonana Bombardeo
T. weissflogii Bombardeo
P. tricornutum Bombardeo
Navicula saprophila Bombardeo
Cylindrotheca fusiformis Bombardeo
Cyclotella cryptica Bombardeo
Rodofitas (algas rojas)
Cyanidioschyzon merolae Bombardeo
Porphyra yezoensis* Bombardeo, Agrobacterium
Kappaphycus alvarezii* Bombardeo
Gracillaria changii* Bombardeo
Porhyridium sp. Bombardeo
Dinoflagelados
Amphidinium sp. Fibras de carburo de Si
Symbiodinium microadriaticum Fibras de carburo de Si
Feofitas
Laminaria japonica* Bombardeo
Undaria pinnatifada* Bombardeo
Otras
Nannochloropsis sp. Bombardeo, Agrobacterium
Euglena gracilis Bombardeo
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Bombardeo con microproyectiles (o biolística).
Agitación celular con micro- o macro-partículas (por ejemplo, bo-
las de vidrio).
Electroporación de protoplastos o de células intactas.
Transformación de protoplastos mediante polietilenglicol.
Transformación mediante A. tumefaciens.
Todos estos procedimientos han sido ensayados en Chlamydomonas (Ta-
bla 1-7). El resto de las especies microalgales transformadas lo han sido con un
solo procedimiento en general (Tabla 1-7). El procedimiento más utilizado con
mucha diferencia ha sido el bombardeo con microproyectiles (Tabla 1-7), pese a
tratarse de un método bastante ineficiente y que requiere de un dispositivo muy
costoso. Probablemente, el hecho de que el procedimiento es operativo para cual-
quier especie, incluso en especies recalcitrantes a la transformación, motiva que se
recurra a él como un procedimiento con resultados seguros pese a su ineficiencia.
La electroporación se está utilizando con éxito en algunas especies y tiene la ven-
taja de ser sencillo, repetible, y barato (el aparato de electroporación). La trans-
formación mediante Agrobacterium, que es el procedimiento preferido y más uti-
lizado en plantas superiores, curiosamente ha sido poco empleado en microalgas,
pese a ofrecer indudables ventajas (Úbeda-Mínguez et al. 2014).
Aplicaciones
Respecto de las aplicaciones buscadas mediante la transformación, más
allá del desarrollo de la propia técnica, se pueden reconocer tres tipos de objeti-
vos:
Mejora de la eficiencia fotosintética.
Mejora de la productividad de los productos seleccionados.
Nuevos productos desarrollados mediante ingeniería genética.
Un campo emergente en la biotecnología microalgal es la introducción de
genes o de rutas metabólicas con el fin de producir componentes de alto valor
económico, especialmente proteínas recombinantes. Las microalgas reúnen las
ventajas de los microbios (rapidez de crecimiento y sencillez de cultivo) con las
de las plantas superiores (ser capaces de llevar a cabo modificaciones post-
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traduccionales). Sin embargo, varios obstáculos entorpecen el desarrollo de siste-
mas de expresión microalgales económicamente viables (Enzing et al. 2014):
Carencia de métodos de transformación efectivos y consistentes
para una variedad de especies.
Productividad de proteínas recombinantes baja o inconsistente.
Carencia de sistemas de producción optimizados para cultivo y co-
sechado a gran escala bajo condiciones fotoautotróficas.
Carencia de conocimiento del metabolismo microalgal y su regula-
ción.
Todo ello lleva a que en este informe se concluya, pese a la extraordinaria
ilusión generada:
“The technology for genetic modification of algae is still rather immature, and a lot
needs to be done before commercial production of products from GM algae will take
place.”
Una aplicación concreta: producción de biodiesel Tratando de ir un paso más allá del desarrollo del método de transforma-
ción, en esta tesis nos planteamos aplicar el proceso de transformación desarrolla-
do a la producción de biodiesel a partir de microalgas.
El problema: agotamiento de los combustibles fósiles
El funcionamiento de las sociedades modernas descansa sobre el consumo
de energía. En especial, es crítica la energía destinada al funcionamiento industrial
y el transporte que, en su gran mayoría, proviene del consumo de combustibles
fósiles tales como el petróleo, el carbón, el gas natural, etc. Aunque las estimacio-
nes sobre la duración de las reservas de combustibles fósiles varían grandemente,
es obvio que en algún momento se producirá su agotamiento puesto que son fini-
tas y no renovables. Por consiguiente, hay una necesidad de buscar fuentes alter-
nativas de combustibles renovables y, a ser posible, poco o nada contaminantes.
Estamos refiriéndonos específicamente a los combustibles (gasolina, diesel, kero-
seno, etc.) que hacen funcionar muchos tipos de motores.
Los biocombustibles, son combustibles producidos a partir de los seres vi-
vos y, por tanto, son una fuente ilimitada y renovable, asumiendo que somos ca-
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paces de criar o cultivar tanta biomasa como sea necesaria. Los biocombustibles
actualmente producidos son el bioetanol y el biodiesel, que se distribuyen a través
de los circuitos comerciales. El biohidrógeno también es objeto de investigación
sin que haya llegado a la fase de explotación comercial.
El biodiesel, procedente de plantas oleaginosas (palma aceitera, soja, col-
za, etc.), y el bioetanol, de la caña de azúcar, están siendo producidos en cantida-
des crecientes como biocombustibles renovables (Chisti 2007). En algunas de
nuestras gasolineras ya podemos encontrar biodiesel y, por otro lado, el bioetanol
es el biocombustible de transporte más ampliamente utilizado en Brasil. Sin em-
bargo, debe notarse que estos biocombustibles, como otras muchas energías reno-
vables, sólo son producidos comercialmente porque están subvencionados por los
gobiernos, pero su coste real es bastante superior al de los combustibles conven-
cionales procedentes de la industria petroquímica que explota la reservas fósiles.
Figura 1-2. Evolución del precio de los aceites vegetales. Se presenta el cambio anual en el
precio de mercado (en $/ton) de las principales plantas oleaginosas en los EE.UU en los diez últi-
mos años.
La creciente demanda de productos agrícolas para ser destinados a la pro-
ducción de biocombustibles ha generado un incremento de precios de las materias
primas (cereales, colza, caña de azúcar, etc.) y ha reducido la disponibilidad para
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500
1000
1500
2000
2500
Soja Algodón Girasol Canola Cacahuete Maíz
Pre
cio
en
$/t
on
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2005/06
2006/07
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la ganadería y el consumo humano de muchos de estos productos. A este respecto,
es ilustrativo observar cómo han evolucionado los precios en dólares americanos
por tonelada, de algunos aceites vegetales en los mercados internacionales durante
la última década (Figura 1-2). Se puede ver que en todos los casos se ha producido
un incremento (50-100%) de los precios de los distintos aceites en los diez años
(Figura 1-2). Situaciones similares se han producido con los cereales, en este caso
demandados para la producción de bioetanol. Esta situación ha provocado un serio
conflicto en los Estados Unidos de América conocido como “foods vs. fuels”
(alimentos frente a combustibles) (Stephens et al. 2010).
Paralelamente, cálculos aritméticos elementales permiten demostrar cómo,
el abastecimiento de la demanda de biocombustibles, conduciría a un incremento
disparatado e imposible de la superficie cultivada, acompañado de un aumento en
el consumo de agua de riego, que es un bien absolutamente escaso en todo el pla-
neta. Es fácil prever lo que supondría en cuanto al encarecimiento del suelo y del
agua de uso agrícola, además de una clarísima amenaza ambiental en forma de
roturación de bosques, para satisfacer la demanda de superficie de cultivo, y la
sobreexplotación de los ya sobreexplotados acuíferos. Por lo tanto, se llega a la
conclusión de que es absolutamente imposible suplir la demanda de biocombusti-
bles partiendo únicamente de las plantas cultivadas.
El reto es extraordinario. Expresado en palabras del profesor Ratledge
(Ratledge 2011), uno de los críticos más escépticos: “desafortunadamente, por
muy excitante que pueda parecer la perspectiva de conseguir aceites baratos para
biodiesel utilizando algas, hay graves problemas que, todavía, parecen insupera-
bles.” No obstante, la propia conclusión de Ratledge deja una puerta abierta:
“[...]sin un gran rediseño genético de los procesos metabólicos de las algas, es
mi opinión que las perspectivas de producir biodiesel de este modo no serán fac-
tibles dentro de un futuro cercano”… O sea, se necesita hacer ingeniería metabó-
lica con las microalgas y se requiere tiempo para desarrollarla.
La solución: modificación genética de microalgas
En la línea de lo que venimos hablando, nos planteamos la segunda parte
del trabajo que constituye esta tesis doctoral. Se trata de probar la aplicación de
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las herramientas genéticas moleculares, desarrolladas en la primera parte de la
tesis, a la producción de biodiesel, (aunque, como hemos comentado anteriormen-
te, esta tecnología una vez desarrollada puede ser de aplicación universal).
En el momento en que se plantea un proyecto de ingeniería genética espe-
cíficamente para biodiesel los siguientes aspectos son críticos para el desarrollo de
la producción de biodiesel a partir de microalgas:
Una especie adecuada, entendiendo la “adecuación” como el cum-
plimiento de los siguientes requisitos:
capacidad contrastada para ser cultivada a escala masiva
(“adecuación industrial”); y,
susceptible de ser modificada genéticamente (“adecuación
genética”).
Un método eficiente de transformación genética estable.
Genes y secuencias reguladoras apropiadas, en el sentido de ser úti-
les desde el punto de vista de su aplicación concreta a la produc-
ción de biodiesel.
Todos estos aspectos, han sido cuidadosamente tenidos en cuenta en el
presente trabajo desde el momento de su inicio, como vamos a ver.
Las propuestas: un proyecto de investigación Las propuestas de investigación para transformar genéticamente una espe-
cie microalgal industrialmente prometedora con vistas a producir biodiesel consti-
tuyeron un proyecto de investigación —y un proyecto de tesis— planteado en los
siguientes términos.
S. almeriensis: una especie con potencial industrial
Varias especies del género Scenedesmus están siendo investigadas con
propósitos industriales (por ejemplo, para la producción de biodiesel) debido a las
altas tasas de crecimiento, a la capacidad para crecer bajo amplias condiciones de
cultivo, etc. (Choi et al. 1987; Chen y Smith 2012; Damiani et al. 2014). Una
nueva especie local, S. almeriensis, fue descubierta hace unos pocos años (Sán-
chez et al 2008). Esta especie parece estar particularmente adaptada a condiciones
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estresantes dado que su pH óptimo es 8 pero es capaz de crecer dentro del interva-
lo de pH 7-10; su temperatura óptima de crecimiento es 35°C pero crece razona-
blemente bien entre 26 y 40 °C, sobreviviendo incluso a 48 °C durante cortos pe-
riodos; asimismo, pese a tratarse de una especie de agua dulce crece en concentra-
ciones salinas de hasta 5 g/L y no muestra signos de fotoinhibición frente a altas
intensidades lumínicas (Sánchez et al. 2008a; Sánchez et al. 2008b). Más aún, esta
especie ha sido cultivada en un fotobioreactor tubular de 4.000 L durante meses,
libre de contaminación, alcanzando productividades de biomasa de 1,2 g/L·d
(Sánchez et al. 2008a; Sánchez et al. 2008b). Globalmente, S. almeriensis se com-
para ventajosamente con la mayoría de otras especies microalgales. Por ejemplo,
pese a tener solamente un 12% de lípidos totales (un valor verdaderamente bajo
dentro de las microalgas), muestran una productividad lipídica de 144 mg/L·d,
que es la mayor de todas las cepas investigadas hasta donde nosotros sabemos
(Liu et al. 2012; Dautor et al. 2013). Por consiguiente, S. almeriensis reúne la ma-
yoría de los prerrequisitos que la convierten en una especie industrialmente pro-
metedora, justificando los esfuerzos realizados para desarrollar herramientas de
ingeniería genética para esta especie.
Además de estas cualidades “industriales” tiene otras muy apropiadas para
trabajar con ella en laboratorio:
Crece rápido.
Crece en diferentes medios, tanto inorgánicos (en autotrofía) como
orgánicos (en mixotrofía).
Crece bien en medio solidificado con agar.
Por otra parte, acerca de la susceptibilidad de ser genéticamente transfor-
mable, hasta donde sabíamos, había publicado un único trabajo de transformación
genética de una especie (S. obliquus) del género Scenedesmus (Guo et al. 2013).
No obstante, eran relativamente numerosos los trabajos que presentaban datos
sobre la transformación genética de otras especies de algas verdes. Por ejemplo,
C. reinhardtii, varias especies de Chlorella, Dunaliella salina, etc. (Hall et al.
1993; Tang et al. 1995; Dawson et al. 1997; El-Sheekh 1999; Chen et al. 2001;
Sizova et al. 2001; Kim et al. 2002; Geng et al. 2003; Kumar et al. 2004). Por lo
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tanto, parecía verosímil que fuésemos capaces de transformar genéticamente otra
especie de alga verde como es S. almeriensis. Más aún, el método de transforma-
ción mediante microbombardeo parece ser universalmente efectivo (Apt et al.
1996; Dawson et al. 1997; El-Sheekh 1999; Falciatore et al. 1999; Zaslavskaia et
al. 2000; León-Bañares et al. 2004), de modo que lo contemplamos desde el pri-
mer momento como una posible alternativa.
Método de transformación
Con respecto a la transformación genética, se han desarrollado métodos
para algunas especies de microalgas, mayoritariamente con interés de laboratorio,
siendo el reto extender la aplicabilidad del proceso a microalgas específicas con
interés comercial (León-Bañares et al. 2004; Courchesne et al. 2009; Enzing et al.
2014). El presente trabajo de tesis afrontó el reto de desarrollar un método de
transformación genética para S. almeriensis.
Como hemos comentado anteriormente, el bombardeo con microproyecti-
les es el método más frecuentemente usado con microalgas (Coll 2006). Este tie-
ne la ventaja de que, como ya se ha dicho, es virtualmente aplicable a cualquier
especie (Apt et al. 1996; Dawson et al. 1997; El-Sheekh 1999; Falciatore et al.
1999; Zaslavskaia et al. 2000; León-Bañares et al. 2004; Coll 2006). De hecho, la
biobalística es el método de elección para algas verdes y diatomeas (Apt et al.
1996; Dawson et al. 1997; El-Sheekh 1999; Falciatore et al. 1999; Zaslavskaia et
al. 2000; León-Bañares et al. 2004) y, por tanto, fue una opción alternativa para la
transformación de Scenedesmus.
Conocíamos varios trabajos sobre la transformación de especies de algas
verdes mediante A. tumefaciens, concretamente C. reinhardtii (Kumar et al.
2004), Haematococcus pluvialis (Kathiresan et al. 2009), Dunaliella salina
(Anila et al. 2011) y Chlorella vulgaris (Cha et al. 2012) lo cual sugería que el
método podría ser aplicable a S. almeriensis, que es también una Clorofícea. La
transformación vía A. tumefaciens ofrece una serie de ventajas (Úbeda-Mínguez
et al. 2014): sencillez tecnológica (no requiere de dispositivos tales como la pisto-
la de partículas), especificidad del segmento de DNA transferido y, por los datos
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proporcionados (Kumar et al. 2004; Kathiresan et al. 2009), alta eficiencia de
transformación.
Genes
Los genes que se pretenda sobre-expresar tienen que estar directamente re-
lacionados con el objetivo biotecnológico (la producción de biodiesel en este ca-
so). Al mismo tiempo, debe prestarse una atención especial al sesgo en el uso de
codones por parte de la microalga receptora de los genes (León-Bañares et al.
2004).
El diesel es un producto formado por ésteres de los ácidos grasos. El bio-
diesel se produce, básicamente, mediante la esterificación del aceite obtenido de
una biomasa. Y el aceite, a su vez, consiste mayoritariamente en triacilgliceroles
(TAG). Por consiguiente, si se quiere producir una biomasa para obtener de ella
biodiesel, el aspecto crítico es que ésta sea lo más rica posible en TAG (y, en ge-
neral, en acil-lípidos).
Algunas especies de microalgas han sido manipuladas genéticamente con
el propósito de incrementar el contenido en lípidos sin haber conseguido el objeti-
vo. Por ejemplo, se ha sobre-expresado el gen de la acetil-CoA carboxilasa, que
sintetiza el malonil-CoA, que es el precursor de la síntesis de los ácidos grasos
sin éxito (revisado en Courchesne et al. 2009). Desde los conocimientos actuales
sobre la biosíntesis de TAG (resumidos en la Figura 1-3), dichos fracasos se ex-
plican por una mala elección de la actividad enzimática a incrementar.
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Figura 1-3. Biosíntesis de lípidos en microalgas. Los principales procesos metabólicos relacio-
nados con la síntesis de lípidos aparecen representados. El trabajo de la tesis se centra en la etapa
final (DAGAT=DGAT) que culmina la ruta de Kennedy produciendo triacilglicerol (TAG).
En este sentido, está bien establecido que la actividad enzimática crítica
para incrementar los TAG, tanto en animales como en plantas, es la diacilglicerol
aciltransferasa (DGAT) (Lung y Weselake 2006; Courchesne et al. 2009), que
cataliza directamente la síntesis de TAG a partir de diacilglicerol y acil-CoA. Se
conocen los genes que codifican dicha actividad por lo que está abierta la posibili-
dad de utilizarlos para incrementar el contenido en TAG en las microalgas, sin
embargo, hay algunos trabajos con microalgas en este sentido. El presente trabajo
de tesis se planteó específicamente conseguir un incremento superior al 30% en
TAG en la microalga a través de la sobre-expresión de genes DGAT.
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Se sabe que existen dos familias génicas para DGAT, designadas DGAT1 y
DGAT2. Hasta el momento no está claro cuál de las dos DGAT tiene el peso fun-
damental en la biosíntesis de TAG. La DGAT1 juega un papel principal en la
acumulación de TAG en Arabidopsis thaliana (Katavic et al. 1995; Jako et al.
2001; Lu et al. 2003; Mhaske et al. 2005) así como en maíz (Zheng et al. 2008) y
en Tropaelum majus (Xu et al. 2008), por ejemplo. En cambio, la DGAT2 parece
ser la actividad principal en otras especies vegetales (Kroon et al. 2006; Shockey
et al. 2006). Por consiguiente, y así se planteó en el presente trabajo de tesis, pa-
recía lógico ensayar ambos genes en microalgas y determinar cuál de las dos ac-
tividades DGAT tiene un mayor impacto en cuanto al objetivo de incrementar los
TAG.
Como se ha dicho, la sobre-expresión de los genes DGAT determina un in-
cremento significativo de los TAG en plantas superiores. Como es obvio, a la hora
de sobre-expresar un gen en un organismo determinado (en nuestro caso S. alme-
riensis, una Clorofícea), es mejor que la “fuente” del gen (el organismo del cual se
clona el gen) sea, evolutivamente, la más próxima posible al organismo receptor.
Por tanto, nuestra primera opción fue buscar un gen ortólogo a DGAT1 dentro de
las Clorofíceas. Con ese propósito, realizamos búsquedas restringidas a “green
algae” (todas las algas verdes), “C. reinhardtii” (un alga verde cuya secuencia-
ción genómica estaba muy avanzada) y “Ostreococcus tauri” (cuyo genoma esta-
ba completamente secuenciado). Condujimos las búsquedas mediante BLASTp
en GenBank sin obtener ninguna proteína con un nivel de similitud secuencial
significativo con respecto a una DGAT1 de una planta superior (Vernicia fordii)
utilizada como “sonda” de búsqueda. De manera que, sorprendentemente nos
encontramos con que, al parecer, entre las Clorofitas no existe una proteína ortó-
loga a DGAT1. (Posteriormente, puestos ya en marcha los trabajos de esta tesis,
supimos que se había identificado el gen DGAT1 de C. reinhardtii pero que había
sido imposible clonarlo y determinar completamente su secuencia (RW.ERROR -
Unable to find reference:2230) de manera que no era factible su uso.) Puesto que
las Clorofitas son las algas más cercanas a las plantas terrestres, pensamos utilizar
el gen DGAT1 de Echium pitardii (Boraginaceae) cuya funcionalidad no ofrecía
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dudas ya que la habíamos comprobado mediante sobre-expresión en la levadura
Saccharomyces cerevisiae (Mañas-Fernández et al. 2009).
Elementos reguladores
Un aspecto clave para la expresión correcta de un transgén son los elemen-
tos reguladores que la controlan: promotor y terminador. Está bastante comproba-
do que el terminador no es una secuencia crítica en este sentido. Se han utilizado
una gran variedad de terminadores de muy diversa procedencia (bacterias, plantas,
virus, etc.) sin mayores problemas. Por el contrario, la elección del promotor se
convierte en una cuestión crítica. En algunos casos, como en la mayoría de las
diatomeas investigadas, el uso de promotores heterólogos se ha demostrado com-
pletamente ineficaz hasta el punto de no producirse una adecuada expresión del
gen. En este caso, hubo que recurrir al uso de promotores homólogos procedentes
de la propia especie de diatomea transformada (Apt et al. 1996; Falciatore et al.
1999; Siaut et al. 2007; De Riso et al. 2009).
En otros casos, algunos promotores parecen ser especialmente proclives a
ser silenciados por la microalga hospedadora (Úbeda-Mínguez et al. 2014). En los
casos más leves, lo que se observa simplemente es una baja tasa de transcripción
del gen.
Las algas verdes no parecen ser especialmente problemáticas en este senti-
do. En general las algas verdes que han sido transformadas genéticamente han
funcionado con un gran número y diversidad de promotores. No obstante, es ob-
vio que no todos los promotores son igualmente eficientes. Un estudio exhaustivo
llevado a cabo con C. reinhardtii ensayando diversos promotores naturales y de
fusión puso de manifiesto que el promotor de la ribulosa bifosfato carboxilasa
(RbcS2) unido al primer intrón de dicho gen y antecedido por el promotor de la
proteína de respuesta a choque térmico (Hsp70A) era el promotor más potente
(Schroda et al. 2000). Este promotor de fusión fue el elegido para llevar a cabo
este trabajo. En cuanto al terminador se eligió la secuencia 3’ no-traducida (3’-
UTR) del gen RbcS2. Todas estas secuencias reguladoras procedentes de C. rein-
hardtii.
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Vectores de transformación y expresión
Los vectores de transformación y expresión utilizados en transformación
de microalgas son idénticos o derivados de los usados con plantas superiores
(Hall et al. 1993; Tang et al. 1995; Apt et al. 1996; Dawson et al. 1997; El-Sheekh
1999; Falciatore et al. 1999; Zaslavskaia et al. 2000; Chen et al. 2001; Sizova et
al. 2001; Kim et al. 2002; Geng et al. 2003; Kumar et al. 2004; León-Bañares et
al. 2004; Coll 2006). Muchos de los utilizados en trasformación vía A. tumefa-
ciens pertenecen a una familia de plásmidos desarrollados específicamente para
trabajar con plantas, denominados pCAMBIA (Kumar et al. 2004; Kathiresan et
al. 2009; Anila et al. 2011; Cha et al. 2012). En nuestro laboratorio disponíamos
de bastantes miembros de esta colección de vectores y también habíamos utilizado
con buenos resultados algunos de ellos en transformación de plantas (Esteban-
Garcia et al. 2010; Chileh et al. 2010; Mañas-Fernández et al. 2013; Arroyo-Caro
et al. 2013). De modo que, por todas estas razones decidimos usar este tipo de
vectores.
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Objetivos
Los objetivos de este trabajo han sido:
El desarrollo de un método eficiente de transformación estable para
S. almeriensis, de manera que se abran todas las posibilidades de
producción de diversas substancias (proteínas recombinantes, fár-
macos, biocombustibles, etc.) en una microalga industrialmente
prometedora.
Realizar una “prueba de concepto” de la tecnología genética desa-
rrollada aplicándola en S. almeriensis para la producción de biodie-
sel.
Comprobar el impacto de la sobreexpresión de genes DGAT sobre
la síntesis de TAG en microalgas.
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MATERIAL Y MÉTODOS
Material biológico Las especies con las que se ha trabajado son: la microalga S. almeriensis
(Figura 2-1), como organismo para ser genéticamente transformado, y la bacteria
A. tumefaciens como instrumento de transformación.
A B
Figura 2-1. Fotografía de células de S. almeriensis. A) Vistas con un microscopio electrónico
de barrido; B) vistas con un microscopio óptico. (Cortesía del Dept. de Ingeniería Química.)
Scenedesmus almeriensis
La especie con la que se ha trabajado ha sido S. almeriensis CCAP
276/24, perteneciente a la Clase Chlorophyceae (vulgarmente denominada algas
verdes), Orden Sphaeropleales, y Familia Scenedesmaceae. Esta especie de agua
dulce fue aislada por miembros del grupo de investigación “Biotecnología de Mi-
croalgas Marinas” del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de
Almería. Fue identificada, descrita y caracterizada como una especie nueva y pa-
tentada para diversos usos (patente WO/20067087405, Fernández Sevilla et al.
2006). La muestra de partida, en condiciones axénicas, fue generosamente propor-
cionada por la Dra. Maike Lorenz en nombre del Prof. Thomas Friedl (Universi-
dad de Gottingen, Alemania). Su uso para los propósitos de esta investigación fue
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autorizado por el Dr. José Mª Fernández Sevilla como primer inventor de la paten-
te antes mencionada.
Agrobacterium tumefaciens
En este trabajo hemos utilizado la cepa LBA4404 (Hoekema et al. 1983)
de A. tumefaciens ampliamente usada en transformación genética de plantas en
general, en la que nuestro laboratorio tiene una amplia y acreditada experiencia.
Medios de cultivo para S. almeriensis Por razones de conveniencia de investigación hemos utilizado diversos
medios de cultivo para la microalga S. almeriensis.
Medio TAP
TAP son las siglas de Tris-Acetato-Fosfato que hace referencia a los com-
ponentes fundamentales de este medio parcialmente orgánico por la presencia de
acetato. TAP es el medio corrientemente utilizado para cultivar C. reinhardtii, que
es una especie de alga verde relativamente cercana a S. almeriensis. El medio se
prepara del modo descrito a continuación.
Para un volumen final de medio de cultivo de 1000 mL se añaden las can-
tidades siguientes (en volumen) de las correspondientes soluciones concentradas:
25 mL de sales TAP (NH4Cl 15,0 g/L, MgSO4·7H2O 4,0 g/L, CaCl2·2H2O 2,0
g/L), 1 mL de solución fosfato (en 100 mL K2HPO4 28,8 g, KH2PO4 14,4 g) y 1
mL de solución de elementos traza (en 100 mL, Na2EDTA·2H2O 5,0 g,
ZnSO4·7H2O 2,2 g, H3BO3 1,14 g, MnCl2·4H2O 0,5 g, FeSO4·7H2O 0,5 g,
CoCl2·6H2O 0,16 g, CuSO4·5H2O 0,16 g, (NH4)6 MoO3 0,11 g).
Se cogen 850 mL de H2O doble destilada y se le van añadiendo un com-
ponente después del otro después de que cada uno se haya mezclado totalmente.
Se añade Tris(hidroximetil)-aminometano, H2NC(CH2OH)3 2,42 g y 1 mL de áci-
do acético concentrado (CH3COOH). Finalmente, se completa con agua doble
destilada hasta 1000 mL. Se ajusta el medio al pH final de 6,0, o al deseado, con
ácido acético y se autoclava a 121 oC durante 20 min.
La solución de elementos traza debe de prepararse de la siguiente manera.
Primero se disuelve el Na2EDTA·2H2O en 100 mL de H2O doble destilada calen-
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tando a 60-80 ºC, después se ajusta el pH a 5 con KOH. Se añaden todos los
elementos traza por separado y se comprueba el valor de pH constantemente. El
valor de pH no debe superar 6,8 pues
el ZnSO4 puede precipitar. Se deja la
solución guardada a 4 ºC; cuando el
color cambia de naranja a rojo, des-
pués de 2 semanas aproximadamente,
se filtra y se almacena en teflón o en
un envase de policarbonato a -20 oC
(no se deben usar contenedores de cris-
tal para los elementos traza porque
éstos tienden a adsorberse en la super-
ficie de cristal). Después de la adición
del ácido acético el pH debe ser apro-
ximadamente 7.
Medio DWNA
DWNA son las siglas de “distilled-water nutrient agar”. Es un medio sóli-
do que se prepara con un agar nutritivo comercial (por ej. Oxoid CM3) y agua
destilada. Nosotros hemos utilizado el
agar nutritivo de CULTIMED PAN-
REAC, que es un medio deshidratado
con la siguiente composición (en g/L): 5
g de sales biliares nº 3, 1 g de extracto de
carne, 2 g de extracto de levadura, 5 g de
NaCl, 15 g de agar. Se prepara con 28 g
de agar nutritivo para 1 L de agua desti-
lada.
El medio DWNA a pH 8 ha sido
el medio sólido estándar usado para cultivos de S. almeriensis en placa petri.
Figura 2-2. Cultivos de S. almeriensis en medio
liquido. El medio utilizado es TAP a pH 8. A la
izquierda está el de la cepa silvestre ("wild type",
WT) y a la derecha el de un clon transgénico.
Figura 2-3. Aspecto típico de las colonias de S.
almeriensis crecidas en medio DWNA (sólido)
pH 8.
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Condiciones de cultivo
Todos los cultivos de microalgas en placa (medio sólido) se han llevado a
cabo en una cabina climática MEMMERT HPP 108L con iluminación continua
(10.000 lux), a 26 ºC y 85% de humedad relativa.
Los cultivos líquidos se han llevado a cabo en un agitador órbital ilumina-
do Infors MULTITRON II a 26 oC, 150 rpm, con ciclos luz-oscuridad 18 h/6 h,
sin control de humedad.
Cultivo de Agrobacterium tumefaciens El cultivo de A. tumefaciens para utilizarlo en la transformación genética
de S. almeriensis se ha llevado a cabo en medio YEB (Yeast Extract Beef) prepa-
rado del modo siguiente. Por cada litro de medio se ponen: 5 g de extracto de buey
no cristalizado, 5 g de sacarosa, 1 g de extracto de levadura, 5 g de triptona, 2 mL
de MgSO4 1 M, y agua doblemente destilada hasta 1 L. Se ajusta a pH 7 y se
autoclava.
Medidas para controlar el crecimiento El crecimiento de las microalgas en medio líquido se ha monitorizado,
cuando ha sido necesario, por alguno de los procedimientos siguientes:
Determinando el número de unidades formadoras de colonias
(UFC).
Por recuento de células en un hemocitómetro.
Por medida de la turbidez a 600 nm (DO600).
Para determinar las UFC se cogía un volumen conocido (100-200 µL) y
se sembraba en placa con medio sólido. Las placas sembradas se incubaban en las
condiciones adecuadas hasta que aparecían de modo patente las colonias de mi-
croalgas (10-15 d). Se contaban las colonias de cuatro placas para estimar la me-
dia de UFC.
Para determinar la densidad óptica a 600 nm se cogía una pequeña muestra
del cultivo líquido, se ponía en una cubeta desechable de espectrofotometría y se
medía la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic mo-
delo HeλIOS ε. Si la absorbancia era muy superior a 1,0 se diluía apropiadamente
para realizar la medida dentro del rango adecuado de valores (<1,0).
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El número de células se estimó a partir de un recuento llevado a cabo me-
diante una cámara Neubauer mejorada de alto contraste. Para este fin, se cogía
un poco de cultivo líquido y se ponía una gota en la zona de recuento y se cubría
con el cubreobjetos. Se recontaban aleatoriamente 8 cuadrículas (4 en cada cua-
drante elegido) y se calculaba el número de células por µL mediante la siguiente
fórmula:
( ) ( )
Donde c es el número de células contadas, s es la superficie contada (ex-
presada en mm2), p es la profundidad de la cámara de recuento (0,1 mm) y d la
dilución empleada.
Ensayos de sensibilidad frente a antibióticos Con carácter previo a los experimentos de transformación, dado que pre-
tendíamos utilizar un gen de resistencia a antibiótico como marcador de selección,
necesitábamos establecer la dosis adecuada de cada antibiótico. Esto se hizo del
modo siguiente en cada caso.
Higromicina B
Inicialmente trabajamos con el antibiótico higromicina B (Hyg) que es
usado universalmente para la selección, tanto de células eucariotas como de pro-
cariotas, transformadas con el gen higromicina fosfotransferasa II (hptII) que con-
fiere resistencia frente a la Hyg (HygR). Para determinar la resistencia/sensibilidad
de S. almeriensis a la higromicina, sembramos en placas con medio TAP sólido
con cantidades crecientes del antibiótico: 0, 2, 5, 10, 25, 50, y 100 mg/L. Para
cada concentración del antibiótico sembramos 4 placas y dejamos crecer las mi-
croalgas hasta que aparecieron colonias bien visibles.
Cefotaxima
La cefotaxima se utiliza en transformación genética mediada por A. tu-
mefaciens rutinariamente en los medios selectivos después del co-cultivo para
eliminar las bacterias (A. tumefaciens) cuando ya no son necesarias ni convenien-
tes. Por consiguiente, también tuvimos que determinar la sensibilidad de la micro-
alga frente a la cefotaxima.
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Para determinar la resistencia/sensibilidad de S. almeriensis a la cefotaxi-
ma sembramos en placas con medio TAP sólido con cantidades crecientes del
antibiótico: 0, 50, 100, 250, 500, 1000, y 2000 mg/L. Para cada concentración del
antibiótico sembramos 4 placas. Dejamos crecer las microalgas hasta que apare-
cieron colonias bien visibles.
Higromicina más cefotaxima
Puesto que se había de trabajar con presencia de ambos antibióticos simul-
táneamente en algunas fases del proceso de transformación, abordamos también la
determinación de la sensibilidad de S. almeriensis frente a diferentes combinacio-
nes de ambos antibióticos simultáneamente por si hubiese alguna interacción entre
ambos (sinergia o antagonismo). Esto se llevó a cabo mediante un experimento
factorial 4 x 4 con las siguientes concentraciones de Hyg: 0, 10, 20, y 30 mg/L y
de Cef: 0, 250, 500, y 750 mg/L, en placas con medio DWNA.
Zeocina y fleomicina
Como se discutirá en el momento apropiado, tuvimos que cambiar de mar-
cador de selección, del gen hptII, que confiere resistencia a higromicina (HygR) al
gen Shble, que confiere resistencia a zeocina (ZeoR) y a fleomicina (Phl
R). De
modo que llevamos a cabo también experimentos de sensibilidad de S. almeriensis
frente a estos dos antibióticos del modo siguiente.
Se prepararon placas con medio DWNA pH 8,0 con un contenido fijo de
250 mg/L de cefotaxima (Cef) previamente determinado en anteriores experimen-
tos, y con concentraciones diferentes de Zeo (0, 2, 5, 8, 10 y 20 mg/L). En otras
placas se pusieron diferentes concentraciones de Phl (0, 3, 5, 7 y 10 mg/L). Se
sembraron con microalgas y se cultivaron en las condiciones habituales hasta ob-
servar crecimiento (donde lo había).
Técnicas de biología molecular
Extracción de DNA genómico
Hemos extraído el DNA genómico de tres maneras diferentes:
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Material y métodos 31
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Método de Newman modificado
Preparamos DNA genómico mediante el método de Scott Newman
(Newman et al. 1990). Las células pueden proceder de cultivos en cesped o líqui-
dos. Se raspan las células de una placa (o se coge un cultivo líquido de 3-5 mL
de aprox. 5 días) y se ponen en un tubo eppendorf de 1,5 mL conteniendo 0,5 mL
de tampón TEN. Se resuspenden las células mediante una agitación vigorosa
(“vórtex”), se centrifugan 10 s a 10.000 rpm y se aspira el sobrenadante. Se re-
suspenden las células en 150 µL de H2O previamente enfriada en hielo y se man-
tienen los tubos en el hielo. Se añaden 300 µL de tampón SDS-EB manteniendo
los tubos en hielo. Vórtex vigoroso (aprox. 1 min) para mezclar y se dejan los
tubos a temperatura ambiente. Se hace una extracción con 350 µL de fe-
nol/cloroformo isoamílico (CIA) (1:1; v/v) durante unos pocos minutos mediante
vórtex. Se separan bien las fases centrifugando 5 min a 13.000 rpm Se transfiere
la fase acuosa teniendo mucho cuidado de no arrastrar de la fase fenólica (aprox.
300 µL) a un nuevo tubo. Se hace una nueva extracción sobre el nuevo tubo con la
fase acuosa con 300 µL de CIA (24:1; v/v) y se transfiere la fase acuosa a un
nuevo tubo. Al volumen obtenido se le añaden 2 volúmenes de EtOH absoluto y
se mezcla todo muy bien invirtiendo el tubo repetidamente. Se incuba en hielo 30
min, se centrifuga 10 min a 13.000 rpm, se elimina cuidadosamente el sobrena-
dante y se lava el precipitado con 200 µL de EtOH 70%. Se seca el precipitado y
se resuspende en aprox. 25 µL de tampón EB.
La solución TEN es 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, y 150 mM NaCl. La
disolución SDS-EB es 2% SDS, 400 mM NaCl, 40 mM EDTA, 100 mM Tris-
HCl, pH 8,0.
Método comercial
Cuando se ha requerido DNA de alta pureza hemos recurrido a un kit co-
mercial de QIAGEN (DNAeasy Plant Mini Kit) siguiendo estrictamente las ins-
trucciones del fabricante.
Método rápido
El método está tomado de un manual de Invitrogen para Chlamydomonas
reinhardtii. Se prepara un extracto bruto de DNA directamente a partir de colonias
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microalgales para utilizarlo en PCR. Se trata de un método muy simple, barato y
rápido, muy útil, pero no siempre efectivo. Se lleva a cabo de la manera siguiente.
Se pica una colonia con la punta de una pipeta P-20 y se echa en un tubo
de PCR conteniendo 10 µL de agua. Se puede repetir el repicado con hasta 20
colonias adicionales. Se calientan los tubos a 95 oC durante 30 min (puede usarse
un termociclador). Después de los 30 min, se resuspende cada colonia en el agua
pipeteando repetidamente. Este es el lisado celular. Se usan 4 µL de lisado para 20
µL de volumen final de reacción.
Las reacciones se llevaron a cabo utilizando un termociclador GeneAmp
PCR System 2400 (Perkin-Elmer).
Cebadores empleados
En los trabajos de esta tesis se han usado diferentes combinaciones de ce-
badores para verificar la presencia de cuatro genes: GUS, Shble, EpDGAT1, y
CrScDGAT2. Los cebadores (“primers”) han sido los siguientes:
“Primers” Secuencia (5’→3’)
Gus-Lp TACGGGAAAGGACTGGAAGAGAAGTG
Gus-Rp TCCTCATCCACGACCGACACTTTCAC
Gus-New For ACACCGAGACCCGTGGCGTCTTCGACC
Gus-New Rev CCACGTTACCGCTCAGGCCCTCGGTGC
Zeo-New For CTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCTGCC
Pzeo-Super Up GAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGG
Pzeo-Super Down ACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGC
Mic-EpDGAT1-For ATCCTCAGATGTGATCCCGCCGTTC
Mic-EpDGAT1-Rev GCCAACTCCTTAGGCATCCCATTCC
Sc-DGAT-Chlor-For ACAGCATCAACCTGAAGTCCAACAGC
Sc-DGAT-Chlor-Rev GCTCAGCACGTTGTAGCAGTCCACCTC
El tamaño esperado de los fragmentos amplificados era: 580 pb para el par
Gus-Lp/Gus-Rp, 700 pb para el par Gus-New For/Gus-New Rev, 730 pb para la
pareja Pzeo-Super down/Pzeo-New For, 644 pb para la pareja DGAT1 (Mic-
EpDGAT1-For/Mic-EpDGAT1-Rev) y 460 pb para la pareja DGAT2 (Sc-
DGAT-Chlor-For y Sc-DGAT-Chlor-Rev).
PCR para GUS en transformadas con pCAMBIA 1305.1
Los análisis de PCR se realizaron en un volumen de reacción de 15 µL que
contenía: 2,5 µL del extracto de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de
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Material y métodos 33
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dNTPs, 0,25 mM de cada cebador, 0,5 µL de polimerasa Taq Platinum (PROME-
GA), y 1,5 µL de cada uno de los cebadores específicos para GUS.
Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 94 oC durante
5 min, y luego 38 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, hibridación
(“annealing”) a 56 º C durante 30 s, y extensión a 72 ºC durante 40 s. Se termina-
ba con una etapa de extensión final de 10 min a 72 oC para, a continuación, man-
tener la temperatura a 4 ºC indefinidamente.
PCR para GUS en transformadas con pCAMShble
Los análisis de PCR se realizaron en un volumen de reacción de 15 µL que
contenían: 2,5 µL del extracto de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de
dNTPs, 3 µL de cada cebador (Gus new for y Gus new rev) y la polimerasa Taq
Platinum (PROMEGA).
Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 94 oC durante
5 min, y luego 38 ciclos de: desnaturalización a 95 ºC durante 30 s, hibridación
(“annealing”) a 56 º C durante 30 s, y extensión a 72 ºC durante 40 s. Se termina-
ba con una etapa de extensión final de 10 min a 72 oC para, a continuación, man-
tener la temperatura a 4 ºC indefinidamente.
PCR para Shble
Las condiciones de PCR para el gen Shble: desnaturalización inicial a 95
ºC durante 2 min, y luego 35 ciclos de: desnaturalización a 95 º C durante 30 s,
hibridación a 68 º C durante 30 s, y extensión a 72 º C durante 45 s. Por último se
incluyó una etapa de extensión final de 5 min a 72 ºC, para a continuación, man-
tener la temperatura a 4 ºC.
PCR para EpDGAT1
Los análisis de PCR se realizaron en un volumen de reacción de 20 µL,
que contiene 5µL del extracto de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de
dNTPs, 0,12 µL de polimerasa Go-Taq y 4 µL de cada uno de los cebadores es-
pecíficos para DGAT1.
Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 95 ºC durante
2 min, y luego 38 ciclos de: desnaturalización a 95 º C durante 30 s, hibridación a
56 º C durante 30 s, y extensión a 72 º C durante 45 s. Por último se incluyó una
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etapa de extensión final de 5 min a 72 ºC para, a continuación, mantener la tempe-
ratura a 4 ºC.
PCR para CrScDGAT2
Los análisis de PCR se realizaron en un volumen de reacción de 20 µL,
que contiene 5µL del extracto de DNA genómico, 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de
dNTPs, y 0,12 µL de polimerasa Go-Taq y 4 µL de cada uno de los cebadores
específicos para DGAT2.
Las condiciones de PCR fueron: desnaturalización inicial a 95 ºC durante
2 min, y luego 38 ciclos de: desnaturalización a 95 ºC durante 30 s, hibridación a
55 ºC durante 30 s, y extensión a 72 ºC durante 30 s. Por último se incluyó una
etapa de extensión final de 5 min a 72 ºC para, a continuación, mantener la tempe-
ratura a 4 ºC.
Tinción GUS
El gen GUS codifica la enzima β-glucuronidasa que es capaz de metaboli-
zar un sustrato y producir un precipitado de color azul. Por tanto podemos detectar
la expresión del gen GUS mediante la observación de la reacción coloreada en
respuesta a la adición del sustrato adecuado. Las células transformadas con GUS
en las que este gen se esté expresando correctamente y dando lugar a una proteína
activa, se teñirán de azul. El procedimiento de tinción es el siguiente.
Se coge una colonia de S. almeriensis y se cultiva en medio líquido. Cuan-
do el cultivo está bien crecido se centrifuga a 6.500 rpm durante 5 min, se lava
con 1 mL de agua destilada, se lava dos veces con 500 µL de tampón fosfato
(fosfato 200 mM, EDTA 4 mM) y se centrifuga. A continuación, las células se
resuspenden en 500 µL de solución de tinción GUS (Kathiresan y Sarada, 2009),
se transfieren a una placa multi-pocillos, se someten a vacío intermitente durante
10 min y se incuban a 37 oC en la oscuridad, durante la noche bajo agitación sua-
ve.
Actividad enzimática GUS
Se ensaya la actividad enzimática β-glucuronidasa con un sustrato que da
lugar a un producto fluorescente que es cuantificado mediante un fluorímetro
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Material y métodos 35
35
FLx800 Microplate Reader de BIO-TECK INSTRUMENTS INC., controlado por
ordenador mediante un software específico.
Preparación del extracto proteico bruto
Centrifugar 20 mL de un cultivo denso a 12.000 rpm 2 min. Eliminar el
sobrenadante y comenzar el proceso, o congelar la muestra a -70 oC. Sacar la
muestra del congelador y romper con la varilla antes de que se descongele. Poner
en hielo. Añadir 300 µL de tampón de extracción 1x recién preparado. Machacar
con el émbolo y, cuando esté homogeneizado, sin sacar el émbolo, añadir una
pizca de arena y machacar bien. Añadir 300 µL de tampón de extracción 1x. Cen-
trifugar 10 min a 12.000 rpm a 4 oC. Recoger el sobrenadante (unos 200-250 µL).
Repetir los dos pasos anteriores una vez más. Sin apurar, repartir el líquido en
alícuotas de 50 µL. Guardar congelado a -70 oC hasta su uso.
Tampón de extracción 1x
Para 10 mL: 2 mL de tampón de extracción 5x, 8 mL de agua destilada y 7
µL de β-mercaptoetanol.
Tampón de extracción 5x
Para 250 mL: 125 mL de tampón fosfato 0,25 M a pH 7,0 (39 g/L), 50 mL
de EDTA 0,5 M a pH 8,0 (190,1 g/L), 1,25 mL de Tritón X-100 y 1,25 g de lauril-
sarcosina. Enrasar a 250 mL con agua destilada estéril. Ajustar a pH 7,0. (No se
debe autoclavar.)
Medida de actividad β-glucuronidasa
Descongelar alícuotas del extracto proteico y del MUG guardadas a -70oC.
Preparar una tanda de eppendorf (tantos como muestras) que llamaremos T0, don-
de se añaden 1 mL de la solución de parada. (Todo el proceso se hace trabajando
en frio.) Preparar otra tanda de eppendorf que llamaremos 30 min, a la cual tam-
bién añadiremos 1 mL de la solución de parada. Otra tanda de eppendorf que lla-
maremos R, donde preparamos las muestras para la reacción (solución de reac-
ción). En estos tubos se añade, por este orden:
25 µL de MUG (4-MUG)
15 µL de solución de extracción 1x
10 µL del extracto.
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Coger 15 µL de esta solución de reacción y añadirlos al correspondiente
eppendorf T0. Hacerlo con cada uno de los tubos de la tanda T0. Coger todos los
tubos con la solución de reacción y ponerlos a incubar a 37oC durante 30 min (pa-
ra dejar que la reacción GUS tenga lugar durante 30 min). Transcurridos los 30
min, cogemos 15 µL de cada uno de los tubos y los vamos añadiendo al tubo co-
rrespondiente de la tanda 30 min (para parar la reacción.) Ponemos muestras de
200 µL en una placa multipocillos organizadas del siguiente modo:
En la primera columna la curva patrón, de más a menos: 100 mM,
75 mM, 50 mM, 25 mM y 10 mM, más tres blancos de solución de
parada.
Seguidamente T0 y después T30min, ordenadamente.
Se mide la IF con el fluorímetro y se procesan los datos con una hoja de
cálculo.
Las diferentes soluciones mencionadas son las siguientes:
Solución de parada 1x
Na2CO3 0,2 M (disolver 21,2 g en 1 L de agua destilada estéril).
Tampón de extracción 1x
El previamente visto.
Tampón de extracción 5x
El previamente visto.
Solución de extracción 1x
1 mL de 5x y 4 mL de agua.
Solución sustrato
4-MUG 2 mM (pesar 0,7 mg/mL y disolver en tampón de extracción 1x).
Vectores empleados Para transformar se han utilizado dos vectores: pCAMBIA 1305.1 (Figura
2-4) y un vector derivado de éste que hemos llamado pCAMShble (Figura 2-5).
pCAMBIA 1305.1
El vector de transformación pCAMBIA 1305.1 lleva en su T-DNA el gen
de la higromicina fosfotransferasa II (hptII) que confiere resistencia a higromicina
(HygR), como gen marcador, controlado por un doble promotor del gen del RNA
35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y con un terminador del mismo
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gen (Figura 2-4). En el T-DNA también lleva el gen de la β-glucuronidasa (colo-
quialmente conocido como GUS) como reportero, bajo el control de un promotor
35S del CaMV y con un terminador del gen de la nopalina sintetasa (nos) (Figura
2-5) de A. tumefaciens. Entre ambos está situado el sitio de clonación múltiple
(MCS) o, como se denomina frecuentemente, el “polylinker”, que agrupa una se-
rie de diferentes dianas de restricción (Figura 2-5).
Figura 2-4. Vector pCAMBIA 1305.1. Se muestran los componentes fundamentales (especial-
mente importante en este contexto, los bordes derecho e izquierdo del T-DNA que marcan sus
límites).
Figura 2-5. Organización del T-DNA del vector pCAMBIA 1305.1. Se representan los dos
genes que contiene, hpt y GUS, flanqueados cada uno de ellos por sus respectivos promotores
(35S) y señales de terminación (poly-A); en medio queda el sitio de clonación múltiple (MCS) y
en los extremos los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que delimitan el T-DNA.
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pCAMShble
Como se explica en el sitio apropiado, en un momento dado, necesitamos
modificar nuestro vector pCAMBIA 1305.1 sustituyendo el gen hptII (HygR) por
el gen Shble que confiere resistencia a los antibióticos fleomicina y zeocina
(PhlR/Zeo
R) obteniendo de este modo el plásmido que hemos denominado
pCAMShble (Figura 2-6).
Se encargó a la empresa GeneArt (Life Technologies) que sintetizara el
gen Shble y lo introdujese en el sitio apropiado, con la orientación correcta en el
vector pCAMBIA 1305.1. El resultado es un nuevo T-DNA (Figura 2-7).
Figura 2-6. Vector pCAMShble. Este vector se ha obtenido por sustitución del gen hpt (Hyg
R)
por el gen Shble (ZeoR, Phl
R) en el plásmido pCAMBIA 1305.1.
Figura 2-7. T-DNA del vector pCAMShble. Se ha sustituido el gen hpt por el gen Shble con
respecto al T-DNA original del pCAMBIA 1305.1.
pCAMShble
11133 pb
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Construcciones empleadas Para la introducción de los genes DGAT hemos utilizado el vector
pCAMShble en el que se ha insertado previamente en el MCS el módulo de ex-
presión correspondiente llevando el gen EpDGAT1 o bien CrScDGAT2.
Construcción del vector con EpDGAT1
El módulo de expresión de EpDGAT1 consta de un promotor de fusión
compuesto por los siguientes elementos y en el orden mencionado: el promotor
Hsp70A, el promotor RbcS2, y el primer intrón del gen RbcS2. Después va inser-
tado el propio gen EpDGAT1 que queremos expresar y, como terminador, la se-
cuencia 3,-UTR del gen RbcS2. Todos los elementos reguladores proceden de C.
reinhardtii.
Se disponía del vector pSI104, gracias a la generosa donación hecha por la
Dra. Rosa Mª León Bañares (Universidad de Huelva), en el que estaban localiza-
dos los elementos reguladores planeados (el promotor Hsp70A:RbcS2:Intr y el
terminador 3,-UTR; Figura 2-8). Para construir el vector de transformación con el
módulo de expresión completo con EpDGAT1 se siguió el procedimiento esque-
matizado en la Figura 2-8. En primer lugar se procedió a sustituir en el plásmido
pSI104 el gen AphVIII por el gen EpDGAT1 (Figura 2-8A). A este fin se realizó
una doble digestión BstBI/BamHI, por un lado, sobre el plásmido pSI104, para
deshacerse del gen AphVIII, y por otro lado, para preparar nuestro inserto con el
gen EpDGAT1. Tras aislar y purificar las moléculas correspondientes se procedió
a combinarlas y ligarlas generando el plásmido pSI104-EpDGAT1 conteniendo el
módulo de expresión perseguido completo (Figura 2-8B). En segundo lugar, se
extrajo el módulo de expresión íntegro mediante una doble digestión SacI/KpnI.
Paralelamente se abrió el plásmido pCAMShble por el MCS en el que existían
unas dianas de restricción apropiadas SacI/KpnI. Finalmente, se combinaron am-
bas moléculas y se ligaron para generar el plásmido pCMAShble-EpDGAT1 (Fi-
gura 2-8C).
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Figura 2-8. Construcción del vector con el módulo de expresión EpDGAT1. Esquema del
proceso seguido para construir el módulo de expresión con EpDGAT1 e insertarlo en el vector
pCAMShble.
Construcción del vector con CrScDGAT2
El módulo de expresión de CrScDGAT2 es idéntico al anterior salvo por el
gen que lleva en este caso. El vector pCAMShble-CrScDGAT2 fue construido de
manera muy similar a la descrita para el pCAMShble-EpDGAT1. Brevemente,
primero se sustituyó el gen EpDGAT1 por el gen CrScDGAT2 en el plásmido
pSI104; luego se extrajo el módulo de expresión completo mediante una doble
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digestión XbaI/KpnI y, finalmente, se insertó el módulo en el plásmido
pCAMShble, abierto por idéntico procedimiento en su MCS (Figura 2-9).
Figura 2-9. Construcción del vector con el módulo de expresión CrScDGAT1. Esquema del
proceso seguido para construir el módulo de expresión con CrScDGAT2 e insertarlo en el vector
pCAMShble.
Preparación de A. tumefaciens para usarla en
transformación Para utilizar las células de A. tumefaciens LBA4404 en los experimentos
de transformación de S. almeriensis se les introdujo previamente el plásmido ade-
cuado (pCAMBIA 1305.1 o pCAMShble). Para ello se prepararon células compe-
tentes de A. tumefaciens que, posteriormente, fueron transformadas con el plásmi-
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do elegido. Estas células transformadas se cultivan para infectar las microalgas
con las que se mezclan.
Preparación de células competentes
Coger 0,2 mL del “stock” de A. tumefaciens e inocular en 5 mL de YEB.
Cultivar toda la noche a 28 oC. Inocular 1 mL del cultivo de la noche anterior en
100 mL de YEB con los antibióticos rifampicina (200 µL de un “stock” de 50
mg/mL) y estreptomicina (100 µL de un “stock” de 300 mg/mL). Dejar crecer
logarítmicamente durante 3-4 h hasta una DO600 entre 0,4-0,5. Centrifugar a
3.000g durante 15 min a 4 oC. Lavar una vez el precipitado celular con solución
TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, a pH 7,5) preenfriada y volver a cetrifugar. Re-
suspender en 20 mL de medio YEB fresco. Hacer alícuotas de 500 µL para utili-
zarlas directamente o congelarlas en N2 líquido y almacenarlas a -70 oC hasta tres
meses.
Transformación de células competentes de A. tumefaciens
Descongelar suavemente las células competentes en hielo (aprox. 30 min).
Mezclar las células competentes con 0,5-1,0 µg de DNA plasmídico. Incubar las
células, sucesivamente, en hielo (5 min), en N2 líquido (5 min), y a 37 oC en baño
maria (5 min). Transferir las células a un tubo estéril conteniendo 1 mL de YEB e
incubar con agitación 2-4 h a 28 oC. Plaquear 200 µL por placa en medio YEB
sólido con el antibiótico apropiado. Se incuban 2 d a 28 oC.
Cultivo de Agrobacterium para transformación de Scenedesmus
Inocular 200 µL del stock de glicerol de A. tumefaciens en 5 mL de me-
dio YEB con los antibióticos rifampicina (10 µL de un “stock” a 50 mg/mL), es-
treptomicina (5 µL de un “stock” a 300 mg/mL) y kanamicina (5 µL de un
“stock” a 25 mg/mL). Incubar a 28 oC a 200 rpm durante 1,5 d aprox. Se escala el
cultivo de 5 mL añadiéndole 50 mL de YEB con los antibióticos antes indicados
en las mismas proporciones y se deja crecer a 28 oC a 200 rpm hasta DO600=0,8-
1,2 (toda la noche). Centrifugar y resuspender en TAP líquido con AS 100 mM
hasta DO600= 0,5 (o 1).
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Transformación de S. almeriensis mediante A.
tumefaciens S. almeriensis fue transformada con A. tumefaciens LBA4404, portando
uno de los dos tipos de vectores (pCAMBIA 1305.1 o pCAMShble) utilizados en
esta tesis. La transformación fue llevada a cabo básicamente siguiendo el proce-
dimiento descrito por Dautor et al. (2013) (Figura 2-10).
Siete factores involucrados
en el procedimiento fueron ensayados
para los dos valores que se explicitan
más adelante en cada caso. Los culti-
vos fueron iniciados a partir de una
colonia simple que era inoculada en 4
mL de medio TAP y se incubaba en
el agitador orbital. Cuando el cultivo
alcanzaba una DO600=0,5, se sembra-
ban 200 µL del cultivo (alrededor de
106 células) en una placa con medio
DWNA, a pH 5,5 (o a pH 6,7), con
acetosiringona 150 µM y se cultiva-
ban hasta que se formaba un cesped
de microalgas (aprox. 5-7 d). Enton-
ces se seguían dos modos de infec-
ción alternativos:
El modo de infección A) las células eran cosechadas lavando las
placas con 10 mL de medio TAP de inducción, conteniendo aceto-
siringona 150 µM, a pH 5,5 (o a pH 6,7). Las células cosechadas
eran centrifugadas a 1.500g durante 5 min y el sobrenadante era
descartado. El precipitado celular se mezclaba con 200 µL de un
cultivo de A. tumefaciens de DO600= 0,5 (o 1,0) y se plaqueaba in-
mediatamente en medio de inducción DWNA sólido al pH especi-
ficado.
Figura 2-10. Esquema del proceso de trans-
formación genética (tomado de Dautor et al.
2013).
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El modo de infección B) 200 µL de un cultivo de A. tumefaciens de
DO600=0,5 (o 1,0) se vertían sobre el césped de microalgas, las cé-
lulas se mezclaban bien y entonces se extendían sobre la superficie
de la placa.
Se dejaban de este modo en co-cultivo durante 2 días (o 3 días), sin luz (o
con ella), a una temperatura de 22 oC (o a 26
oC) y a pH 5,5 (o 6,7). Transcurrido
el periodo de co-cultivo, se cosechaban las células lavando cada placa dos veces
con 7 mL de medio líquido TAP conteniendo 250 mg/L de cefotaxima. Entonces
se seguían dos procedimientos alternativos:
El tratamiento post-cosecha A) se centrifugaban las células a
1.000g durante 5 min, a 4 °C inmediatamente y se eliminaba el so-
brenadante. Se resuspendían en TAP conteniendo 250 mg/L de ce-
fotaxima (TAP+Cef250) dos veces más repitiéndose la centrifuga-
ción después de cada resuspensión.
El tratamiento post-cosecha B) se incubaban las células en medio
TAP+Cef250 durante 2 días, en oscuridad, para eliminar el A. tu-
mefaciens y entonces se seguía el mismo procedimiento que en el
caso anterior.
Finalmente, en ambos casos, se resuspendían las células en 1 mL de medio
TAP y se sembraban cuatro placas (200 µL por placa) por cada ejecución en me-
dio DWNA selectivo, a pH 8, conteniendo Cef 250 mg/L más el antibiótico de
selección (Hyg 15 mg/L en los primeros experimentos; después Zeo 10 mg/L).
Mantenimiento de clones Seguimos un protocolo de replicación de los clones transformados riguro-
so en cuanto a mantener la presión de selección. Cada mes aproximadamente los
clones transformados, mantenidos rutinariamente en placas petri con medio sólido
DWNA+Zeo10, son transferidos a placas con idéntico medio fresco. La transfe-
rencia no se hace por repicado simple, como es habitual sino que procedemos a
resuspender el inóculo en medio líquido conteniendo Zeo 10 mg/L, para facilitar
que todas las células entren en contacto con el antibiótico, de esta suspensión se
hacen diluciones seriadas (10-1
-10-3
) y se siembra una gota de 10 µL de cada dilu-
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ción en medio sólido DWNA+Zeo10. De este modo creemos que impedimos que
células no transformadas puedan sobrevivir acantonadas dentro de un acúmulo de
células transformadas que las protejan.
Análisis de lípidos El análisis de lípidos en su gran mayoría se ha limitado a la determinación
del contenido total de ácidos grasos de los clones transformados mediante trans-
metilación directa. En los clones transgénicos prometedores (y en la cepa no mo-
dificada, como control) se han llevado a cabo análisis lipídicos más detallados que
han requerido la extracción de los lípidos, su fraccionamiento y su separación en
las diferentes clases lipídicas. A continuación se describen estos métodos.
Transmetilación directa
Se ha seguido el procedimiento desarrollado en nuestro laboratorio (Ro-
driguez-Ruiz et al. 1998). Brevemente. Pesar entre 5-10 mg de biomasa liofiliza-
da. Añadir 5 L de patrón. (El patrón se prepara con 25 mg de 19:0 o 17:0 en 1
mL de benceno:MetOH (3:2).) Añadir 1 mL de cloruro de acetilo:MetOH (1:20)
más 1 mL de hexano. Meter 5 min en el baño de ultrasonidos. Poner en el termo-
bloque a 100º C durante 10 min. Sacar los tubos del termobloque y dejar enfriar.
Añadir 1 mL de agua destilada. (Si es necesario se centrifuga a 4.000 rpm durante
4 min para separar mejor las dos fases.) Extraer cuidadosamente la fracción de
hexano y transferirla a un vial del cromatógrafo. Las muestras pueden analizarse
en el cromatógrafo de gases inmediatamente o pueden guardarse los viales
a -20 ºC hasta su utilización.
Extracción de lípidos totales
El procedimiento es una modificación del descrito por Kochert (Kochert
1978).
Se parte de 100 mg de biomasa liofilizada. Se pone la biomasa en un tubo
con tapón de rosca y se cubre con 5 mL de isopropanol caliente. Se cierra el tubo
y se calienta a 75 oC 15 min. Dejar enfriar a RT. Centrifugar 5 min a RT y 3.500
rpm. Transferir el sobrenadante —que se pueda— a un tubo nuevo y reservarlo
tapado. Se debe extremar el cuidado de no arrastrar precipitado en ningún caso.
Resuspender el precipitado con 1 mL de MetOH y transferirlo a un homogeneiza-
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dor. Lavar los restos con 1 mL de CHCl3 y transferirlos también al homogeneiza-
dor. Se homogeneiza bien y se transfiere la mezcla a un tubo de ensayo con tapón
de rosca. Se lava el homogeneizador con 1 mL de MetOH y 1 mL de CHCl3 para
arrastrar los restos y se suman a los 2 mL del tubo. Añadir 3 mL de HCl 0,1 N y
0,3 mL de MgCl2 al 0,5% al contenido del tubo para precipitar las proteínas. Vór-
tex intenso (aprox. 3 min). Centrifugar 5 min a RT y 3500 rpm. Tomar la fase
orgánica (la inferior) con una pipeta Pasteur y hacerla pasar por otra pipeta Pas-
teur con un poco de lana de vidrio en el cuello para filtrar. Re-extraer la biomasa
con 1 mL de MetOH y 1 mL de CHCl3 dos veces más. Combinar todos los ex-
tractos y llevar a sequedad con corriente de N2. Resolubilizar inmediatamente en 2
mL de CHCl3. Reservar 200 µL para GC. Almacenar a -20 oC.
Fraccionamiento lipídico
Se toman 2 mL de los lípidos totales extraídos y se vierten en un cartucho
de sílice Sep-Pak Classic (WATERS). Se hacen pasar por el cartucho 30 mL de
CHCl3 para eluir los lípidos neutros (NL). A continuación se eluyen los “glicolí-
pidos” (GL) haciendo pasar por el cartucho 30 mL de acetona y 20 mL de CHCl3-
MetOH 15%. Finalmente, se hacen pasar 30 mL de MetOH para eluir los fosfolí-
pidos (PL). Se eliminan los disolventes de todas las fracciones en el rotavapor y se
resuspende cada fracción por separado en 2 mL de hexano.
Separación de clases lipídicas
Cada una de las fracciones lipídicas se somete a cromatografía en capa fi-
na (TLC) para separar las clases lipídicas. El procedimiento detallado es el si-
guiente.
Verter en la cámara de desarrollo de 60-80 mL de la fase móvil apropiada
(ver abajo) y dejar equilibrar durante 1-2 h. Poner la placa de TLC con las mues-
tras y dejar que la fase móvil ascienda hasta 1-2 cm de la parte superior de la pla-
ca. Extraer la placa de la cámara de desarrollo y dejar secar en la campana de ga-
ses (o secar con nitrógeno para lípidos altamente insaturados). Teñir el cromato-
grama inmediatamente. Marcar en la placa las áreas de las diferentes clases lipídi-
cas observadas. Raspar las áreas y someter el raspado al procedimiento de trans-
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metilación antes descrito para determinar su composición en ácidos grasos me-
diante GC.
Las fases móviles utilizadas han sido:
para los lípidos neutros: éter de petróleo-éter etílico-ácido acético
(80:20:1, v/v/v),
para fosfolípidos y glicolípidos: CHCl3-MetOH-ácido acético-agua
(25:15:4:2, v/v/v/v).
Cromatografía de gases
Las muestras preparadas han sido procesadas en un cromatógrafo de gases
por los compañeros del Departamento de Ingeniería Química de la UAL con una
experiencia de décadas en el manejo de esta técnica. Los resultados de los análisis
han sido procesados por nosotros mediante el software específico GC ChemSta-
tion desarrollado por Agilent Technologies.
Métodos estadísticos Siempre que ha sido posible, el diseño de los experimentos se ha realizado
con Statgraphics Centurión XVI y con éste mismo software se ha llevado a cabo
el tratamiento estadístico de los datos experimentales.
Diseño estadístico de experimentos de transformación
Cribado
Se hizo la transformación mediante pCAMBIA 1305.1 con las siguientes
variables:
luz ( presencia o ausencia ) durante el co-cultivo,
duración del co-cultivo (2dias o 3 días),
temperatura de co-cultivo (22 o 26 oC),
pH del co-cultivo (5,5 o 6,7),
La densidad óptica de inoculo de A. tumefaciens
(0,5 y 1,0) ,
el modo de la infección (A o B),
el modo de tratamiento post-cosecha (A o B).
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Se diseñó el experimento de “cribado” (“screening”) con el Asistente de
Diseño de Experimentos de Statgraphics Centurion XVI, para 5 variables cuantita-
tivas y 2 cualitativas, cada una con dos niveles. El tipo de diseño escogido fue
Plackett-Burman plegado 2^7*3/1 que comprendía 24 “ejecuciones” (cada “ejecu-
ción” corresponde a un experimento con una combinación específica de los siete
factores estudiados), con 4 “muestras” (placas sembradas) por ejecución. La va-
riable de respuesta era el número de colonias HygR que crecían en las placas de
selección.
Ensayo comparativo de las cepas genéticamente modificadas
Todas las comparaciones se han hecho entre cultivos de 12 d iniciados to-
dos con una DO600 = 0,1. Los cultivos se han realizado en erlenmeyer de 250 mL
con un volumen de cultivo de 60 mL. Cada cepa transgénica se ha cultivado y
analizado por triplicado.
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RESULTADOS
Trabajos preparatorios
Parámetros de control del crecimiento
Muchas de las actividades que teníamos que realizar requerían un conoci-
miento puntual del estado de crecimiento del cultivo de S. almeriensis. Este se
puede saber mediante un recuento de células vivas con un hemocitómetro, proce-
dimiento muy laborioso y consumidor de tiempo, que lo hace poco operativo co-
mo medida rutinaria (una o dos veces al día). Por ello, habitualmente, se sigue la
cinética de crecimiento del cultivo mediante la medida de densidad óptica del cul-
tivo utilizando un espectrofotómetro, que es un procedimiento sencillo y econó-
mico. Para que esta medida sea útil necesitábamos relacionarla con las variables
de verdadero interés tales como, el número de células por mililitro, el número de
unidades formadoras de colonias (UFC), etc. De tal modo que, a partir de la
DO600, se pueda estimar la concentración celular. Para ello, se necesitaba determi-
nar las ecuaciones que relacionasen las diferentes medidas de crecimiento celular
con la DO600 y con el tiempo de cultivo. A este fin se llevaron a cabo una serie de
cultivos en medio líquido de S. almeriensis en los que se medía diariamente, el
número de células por mL, la DO600, y el número de unidades formadoras de co-
lonias. Para medir este último, obviamente, debíamos esperar al menos una sema-
na para contar las colonias crecidas en las placas de agar. (Todos estos datos apa-
recen recogidos en la Tabla A1 del Apéndice.)
Los datos de los diferentes parámetros de crecimiento celular fueron anali-
zados por regresión mediante el software Statgraphics Centurion XVI. En concre-
to computamos las siguientes regresiones: OD600 vs. días de cultivo, nº de células
por mL vs. OD600, y nº de células por mL vs. días, donde, en todos los casos, la
variable independiente, x, es la citada en segundo lugar, y la variable dependien-
te, y, es la primera de cada pareja de las mencionadas. Los resultados de estos
cálculos junto con las ecuaciones ajustadas se presentan en la Tabla 3-1. En todos
los casos presentamos los valores estimados de los coeficientes de las respectivas
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ecuaciones (el intercepto y la pendiente), sus respectivos niveles de significación
(valor P), el coeficiente de correlación lineal, el coeficiente de determinación (R2)
y la bondad de ajuste del modelo.
Tabla 3-1.Regresión lineal de los estimadores de crecimiento celular. Se presentan los paráme-
tros (a y b) de cada ecuación y la ecuación respectiva. Asimismo se proporciona el valor del coefi-
ciente de correlación lineal de Pearson y el coeficiente de determinación (R2). Los valores de pro-
babilidad de los parámetros de la ecuación (Valor P) y el de la carencia de ajuste nos indican la
robustez de las ecuaciones.
OD600 vs. día Estima Valor P
Intercepto (a) -0,841177 0,0000
Pendiente (b) 0,758448 0,0000
Ecuación √ √
o
√
Correlación 0,953725
R2 90,959%
Carencia de ajuste 1,36 0,3046
cel/mL vs. OD600 Estima Valor P
Intercepto (a) 12,0745 0,0000
Pendiente (b) 4,04194 0,0000
Ecuación
( √
)
o
( ) √
Correlación 0,974909
R2 95,0447%
Carencia de ajuste 0,09 0,9998
cel/mL vs. día Estima Valor P
Intercepto (a) 13,3453 0,0000
Pendiente (b) 1,47519 0,0000
Ecuación
( )
o
( )
Correlación 0,951453
R2 90,5262%
Carencia de ajuste 1,12 0,4194
Los coeficientes de las ecuaciones nos permiten definir las relaciones ma-
temáticas entre la variable independiente y la variable dependiente. El coeficiente
de correlación mide el grado de asociación lineal entre ambas variables. El coefi-
ciente de determinación, R2, representa el porcentaje de la varianza de “y” que se
explica por el modelo de regresión ajustado. Finalmente, la bondad de ajuste nos
dice, en qué medida, el modelo ajustado explica adecuadamente la relación entre
las dos variables analizadas. Este valor tiene un interés primordial porque nos in-
dica, si es pequeño, que el modelo seleccionado describe adecuadamente la rela-
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ción observada. La significación estadística de la bondad de ajuste viene dada por
su valor P correspondiente.
Como era de esperar, en todos los casos, la ecuación que mejor describía
las relaciones entre las variables estudiadas no era meramente una recta sino que
se adaptaban mejor otros modelos de ecuaciones que son los que se presentan en
la Tabla 3-1. El modelo, finalmente ajustado, elegido es el que minimizaba la ca-
rencia de ajuste y maximizaba el valor P correspondiente.
Por ejemplo, la relación entre la DO600 y el tiempo (medido en días) resul-
tó ser mejor representada por la ecuación:
√ √
con alto nivel de significación estadística (P=0.0000), un coeficiente de determi-
nación del 91%, y una pequeña carencia de ajuste de 1.36 (P=0.30) (Tabla 3-1).
La ecuación resultante del modelo aparece representada en la Figura 3-1. La línea
central corresponde estrictamente a la ecuación en tanto que las dos líneas inme-
diatamente más externas (verde) son los límites de confianza al 95% y las más
periféricas (gris) son los límites de predicción (Figura 3-1).
Figura 3-1.Representación gráfica de la ecuación de regresión lineal que relaciona la densi-
dad óptica del cultivo a 600 nm (OD600) con el número de días de cultivo.
Gráfico del Modelo Ajustado
OD600 = sqrt(-0.841177 + 0.758448*sqrt(dia))
0 3 6 9 12 15
dia
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
OD
600
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Relaciones análogas se establecieron, mediante otras dos ecuaciones, entre
los otros parámetros de crecimiento celular. Las ecuaciones y estadísticos relacio-
nados aparecen recogidos en la Tabla 3-1. En ambas ecuaciones la carencia de
ajuste era pequeña y el coeficiente de determinación grande, lo que indica que las
ecuaciones son buenas predictoras. En las Figuras 3-2 y 3-3 se representan las
otras dos ecuaciones.
Figura 3-2. Representacióngraficade la ecuación de regresión lineal que relaciona el número
de células por mL con la densidad óptica del cultivo a 600 nm.
Figura 3-3. Representación gráfica de la ecuación de regresión lineal que relaciona el núme-
ro de células por mL con el número de días de cultivo.
Gráfico del Modelo Ajustado
c/mL = exp(12.0745 + 4.04194*sqrt(OD600))
0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
OD600
0
4
8
12
16
20
24(X 1.E6)
c/m
L
Gráfico del Modelo Ajustado
c/mL = exp(13.3453 + 1.47519*ln(dia))
0 3 6 9 12 15
dia
0
4
8
12
16
20
24(X 1.E6)
c/m
L
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Resultados 53
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En definitiva pudimos desarrollar una serie de ecuaciones que relaciona-
ban nuestros parámetros de crecimiento de interés de un modo estadísticamente
robusto (Tabla 3-1). De tal modo que dispusimos de una serie de ecuaciones que
nos permitían predecir o establecer el estado de crecimiento de nuestros cultivos
de S. almeriensis.
Ensayos con antibióticos
Dado que pensábamos utilizar antibióticos como agentes selectivos de las
células transformadas, como trabajos previos al abordaje de la transformación
genética de S. almeriensis realizamos una serie de ensayos de sensibilidad frente a
los antibióticos previstos: higromicina B (Hyg) y cefotaxima (Cef), planeados en
primera instancia, y, fleomicina (Phl) y zeocina (Zeo) que fueron los finalmente
utilizados por las exigencias de los resultados experimentales que comentaremos
en su momento.
Higromicina
El antibiótico higromicina B es el antibiótico de selección cuando se trans-
forma con el vector pCAMBIA 1305.1 que lleva el gen de la higromicina fosfo-
transferasa II o hptII (HygR) como marcador de selección (Figura 2-4). Por consi-
guiente, llevamos a cabo una serie de ensayos para determinar la sensibilidad de S.
almeriensis a este antibiótico. Con este fin, sembramos la microalga en placas con
medio TAP sólido a pH 8 con diversas concentraciones de higromicina (0, 2, 5,
10, 25, 50, y 100 mg/L; cuatro placas sembradas por cada dosis). Después de un
periodo de incubación suficiente (7-14 d) contamos el número de colonias (UFC,
unidades formadoras de colonias) en cada placa y calculamos el nº de UFC por
mL capaces de crecer en presencia de cada dosis de Hyg. Tomando el número de
UFC como referencia calculamos la supervivencia relativa (%) para cada concen-
tración de Hyg ensayada. Estos resultados se presentan gráficamente en la Figura
3-4.
Como se puede observar, la Hyg parecía ser muy tóxica para S. almerien-
sis pues desde la menor concentración ensayada (2 mg/L; Figura 3-4) hubo una
fuerte reducción del porcentaje de supervivientes que crecieron en presencia de
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Hyg. Aunque gráficamente casi no se percibe, algunas colonias crecieron todavía
frente a 5 y 10 mg/L y no aparecieron a partir de 25 mg/L.
Figura 3-4. Supervivencia relativa (%) de S. almeriensis frente a higromicina. (Tomada de
Dautor et al. 2014.)
Cefotaxima
La transformación genética de S. almeriensis se pensaba abordar, y se
abordó de hecho, mediante el uso de A. tumefaciens. Después de la etapa de co-
cultivo (véase la sección correspondiente de Material y métodos), en la que el
contacto entre microalgas (células de S. almeriensis ) y bacterias (células de A.
tumefaciens) posibilita la transferencia del T-DNA y la consiguiente transforma-
ción de S. almeriensis, las bacterias han cumplido su misión y deben eliminarse. A
este objeto se suele usar el antibiótico cefotaxima (Cef) para eliminar la bacteria
una vez que ya no es necesaria su presencia sino objetable. Tanto en plantas supe-
riores como en las pocas microalgas transformadas mediante Agrobacterium, sue-
len utilizarse concentraciones de Cef de 250-500 mg/L, pero, a priori, descono-
cíamos su efecto sobre S. almeriensis, solo o en combinación con la Hyg, y si se
producía interacción entre ambos antibióticos. De modo que, la Cef fue ensayada
0
20
40
60
80
100
0 2 5 10 25 50 100
Su
rviv
al
(%)
[Hyg] mg·l-1
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también aisladamente (sin presencia de Hyg), en seis concentraciones diferentes:
0, 50, 100, 250, 500, 1000, y 2000 mg/L. En este caso se observó que la Cef es
ligeramente tóxica para S. almeriensis siendo esta microalga capaz de crecer en
un buen número en presencia de Cef, soportando concentraciones de hasta 2000
mg/L. No obstante, el número de UFC que crecieron disminuía abruptamente a
partir de [Cef] >>250 mg/L (datos no mostrados).
Higromicina más cefotaxima
Dado que en el método de transformación estaba previsto el uso simultá-
neo de los dos antibióticos antes estudiados, Hyg y Cef, en los medios de cultivo,
con células de S. almeriensis, pareció conveniente estudiar el efecto combinado de
ambos antibióticos sobre la viabilidad de S. almeriensis. No sabíamos si ambos
antibióticos actuaban independientemente o podían interaccionar positivamente
(sinergia) o negativamente (antagonismo), de modo que para responder a todas
estas interrogantes diseñamos un experimento factorial 4 x 4 para concentraciones
de Hyg de 0, 10, 20, y 30 mg/L, y concentraciones de Cef de 0, 250, 500 y 750
mg/L. El diseño constaba de 16 ejecuciones (experimentos con diferentes combi-
naciones Hyg x Cef) en 1 solo bloque con 4 muestras por ejecución (Tabla A5).
Tanto el diseño como los resultados experimentales están en la Tabla A5 del
Apéndice.
Los datos fueron analizados por el Asistente para Diseño de Experimentos
(Experimental Design Wizard) de Statgraphics Centurion XVI, que había diseña-
do el experimento, y que aplicó el análisis estadístico apropiado para el experi-
mento y los datos, un análisis de la varianza (ANOVA) con los siguientes resulta-
dos:
Tabla 3-2. ANOVA de la acción combinada de los antibióticos higromicina (Hyg) y cefotaxima
(Cef) sobre la supervivencia de S. almeriensis. La primera columna indica las fuentes de variación.
La última columna nos indica el nivel de significación estadística de cada una de las fuentes de
variación.
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
A:Hyg 1990,01 1 1990,01 8,91 0,0114
B:Cef 281,25 1 281,25 1,26 0,2837
AB 506,25 1 506,25 2,27 0,1580
Error total 2680,05 12 223,338
Total (corr.) 5457,56 15
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Se puede ver que solamente la concentración de Hyg tiene un efecto esta-
dísticamente significativo sobre la supervivencia (P=0,0114). Ni la Cef ni la inter-
acción entre Hyg y Cef (AB) tienen un efecto estadísticamente significativo sobre
la supervivencia.
La cepa silvestre de S. almeriensis fue incapaz de crecer en presencia de
Hyg desde la mínima concentración ensayada (10 mg/L). En cambio demostró ser
capaz de soportar hasta 750 mg/L de Cef con una supervivencia relativa respecto
del control (sin antibióticos) de un 36±3,8%.
Zeocina y fleomicina
Por razones que serán comentadas más adelante, se decidió cambiar de gen
marcador y de antibiótico de selección, lo que supuso que tuviésemos que realizar
nuevos experimentos para determinar la sensibilidad de S. almeriensis a los nue-
vos antibióticos, zeocina y fleomicina. Puesto que, de experimentos previos, te-
níamos establecida la concentración adecuada de Cef en 250 mg/L, todos los en-
sayos con estos nuevos antibióticos se hicieron con un contenido fijo de Cef de
250 mg/L. Los resultados de tres experimentos independientes aparecen resumi-
dos en la Tabla 3-3.
Tabla 3-3. Sensibilidad de S. almeriensis a zeocina. Número de colonias y porcentaje de super-
vivencia en diferentes concentraciones de zeocina (mg/L) en placas con medio DWNA pH 8 con
250 mg/L de cefotaxima. La tabla resume los resultados de 3 experimentos, en los que se sembra-
ron por cada concentración de antibiótico, 16 placas (4 placas x 4 diluciones). La columna E.E.
recoge los errores estándar del número medio de colonias.
[Zeo] mg/L Colonias
(media)
E.E. Supervivencia (%)
0 4,91·107 8,29 ·10
4 100
2 161 34,7 0,0033
5 18,5 3,9 0,00037
8 0 0 0
10 0 0 0
13 0 0 0
El número medio de colonias microalgales por mL se observa que se des-
plomaba desde unos 50 millones (±82.900), en ausencia de Zeo, a tan sólo
18,5±3,9 en placas con 5 mg/L de Zeo. En concentraciones de Zeo iguales o ma-
yores de 8 mg/L no se desarrollaban colonias (Tabla 3-3). El efecto se ve quizás
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Resultados 57
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mejor reflejado en el porcentaje de supervivencia que cae de 100%, en 0 de Zeo, a
0,00037% en presencia de 5 mg/L (Tabla 3-3).
Transformación con higromicina como antibiótico de
selección Siguiendo el procedimiento descrito en Material y métodos llevamos a ca-
bo un primer experimento de transformación, con A. tumefaciens llevando el
plásmido pCAMBIA 1305.1 con la mayoría de las condiciones fijas. Sembramos
S. almeriensis en placas DWNA pH 5.5 para formar un césped microalgal. Pro-
bamos placas sin (4 placas) y con acetosiringona (AS) (otras 4 placas). Tras ha-
berse desarrollado el césped microalgal inoculamos las placas con 600 µL de un
cultivo de A. tumefaciens DO600 = 0.2, mezclamos bien las células y co-
cultivamos 3 d, bajo luz continua y 26 oC. Transcurrido el periodo de co-cultivo
cosechamos y lavamos dos veces con medio TAP+Cef250 y finalmente plaquea-
mos en medio DWNA pH 8 con diferentes concentraciones de Hyg (10, 15, y 20
mg/L) porque en aquel momento todavía no habíamos establecido claramente la
concentración selectiva de Hyg. Tras esperar aproximadamente 2 semanas las
colonias empezaron a aparecer en buen número:
en placas sin AS, 50 colonias en Hyg15, y 25 colonias en Hyg20,
en placas con AS, 100 colonias en Hyg10, 25 colonias en Hyg15, y
25 colonias en Hyg20.
Todas las colonias HygR fueron repicadas en placas con Hyg 15 mg/L co-
mo transgénicas putativas. A expensas de corroborar que estas colonias HygR eran
verdaderamente transformadas, los resultados preliminares eran muy esperanzado-
res respecto de la eficacia y eficiencia del procedimiento.
Criterios de transformación
La capacidad de crecer en presencia de Hyg15 en las transferencias suce-
sivas (cada mes) llevadas a cabo tomando una muestra celular, resuspendiéndola
en medio TAP+Hyg15, y sembrando una gota de 10 µL en medio DWNA+Hyg15
era un primer criterio de que el clon celular estaba transformado. Las diferencias
de comportamiento eran claramente visibles a los pocos días (Figura 3-5A) y el
proceso seleccionaba eficazmente los clones HygR.
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Figura 3-5. Crecimiento de S. almeriensis en medio sólido selectivo. A) [Hyg] = 10 mg/L. B)
[Zeo] = 10 mg/L. Las columnas corresponden a diferentes grados de dilución del inóculo sembra-
do (una gota de 15 µL). Las filas (#1-#8) son cepas transgénicas putativas (HygR , panel A; Zeo
R,
panel B). WT es la cepa silvestre (“wild type”). (Tomada de Dautor et al. 2014.)
Una muestra aleatoria representativa de los clones HygR fue escogida para
extraerle el DNA genómico y realizar una amplificación de un fragmento del gen
GUS mediante PCR. De 44 clones HygR probados, la gran mayoría dieron una
amplificación positiva (Figura 3-6) demostrando la presencia del gen GUS for-
mando parte del genoma de estos clones microalgales.
Figura3-6. Amplificación mediante PCR de un fragmento del gen GUS. Las calles 1-21 y 22-
44 corresponden a colonias transgénicas putativas (HygR) de S. almeriensis. La calle C+ es de A.
tumefaciens (control positivo). La calle C- es de una colonia WT de S. almeriensis (control negati-
vo). (Tomada de Dautor et al. 2014.)
La actividad GUS de los clones positivos fue inicialmente chequeada
usando el ensayo histoquímico habitual para GUS. Ninguno de los clones transgé-
nicos HygR desarrolló visiblemente la tinción azul característica después de la
incubación con el sustrato cromogénico X-gluc.
Para llevar a cabo la detección de actividad GUS de forma más sensible se
midió dicha actividad en extractos proteicos obtenidos a partir de tres clones
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Resultados 59
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transgénicos y de la cepa silvestre (WT). El extracto bruto de proteínas de cada
una de las cepas fue sometido al procedimiento establecido utilizando un sustrato
fluorescente (MUG) para de-
tectar la actividad enzimática especí-
fica de la β-glucuronidasa (la proteína
codificada por el gen GUS). Los tres
clones transgénicos mostraron una
actividad enzimática moderada pero
significativamente superior en todos
los casos a la basal exhibida por el
WT (Figura 3-7). No obstante, es
llamativa la diferencia de actividad
enzimática entre estos clones transgé-
nicos de S. almeriensis y el control
positivo (un clon transgénico de Te-
traselmis chuii obtenido por un pro-
cedimiento similar en nuestro labora-
torio; Úbeda-Mínguez et al. 2014)
incluido como referencia (Figura 3-7). Hay una diferencia de varios órdenes de
magnitud, entre los clones transgénicos de S. almeriensis y el clon transgénico de
T. chuii, en cuanto a la actividad β-glucuronidasa (Figura 3-7) indicativa de una
diferencia substancial en la expresión del gen GUS entre los clones transformados
de ambas especies de microalgas.
Cribado de los factores que influyen en la eficiencia de la
transformación
Tras confirmar, como hemos visto, por diversos procedimientos, que la
gran mayoría de las colonias HygR obtenidas estaban realmente transformadas,
nos planteamos optimizar las condiciones de transformación. A partir de la litera-
tura revisada seleccionamos una serie de siete factores como potencialmente im-
portantes para la eficiencia del proceso de transformación vía A. tumefaciens. Se
Figura 3-7. Actividad enzimática específica de
GUS. Se muestra la actividad en tres clones
transgénicos (#15, #20, y #43) comparados con la
cepa no transformada (WT) y un control positivo
(C+) correspondiente a un clon transgénico de
Tetraselmis chuii. (Tomada de Dautor et al.
2014.)
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estudió la influencia de estos siete factores de operación sobre la eficiencia de la
transformación (medida como número de colonias HygR crecidas en primera ins-
tancia en las placas con medio selectivo). Los factores fueron: temperatura (22º o
26º C), periodo de co-cultivo (2 d o 3 d), pH del medio de co-cultivo (5,5 o 6,7) e
iluminación durante el co-cultivo (oscuridad o luz). Además se estudiaron dos
métodos de tratamiento post-cosecha (A y B; ver material y métodos), dos modos
de infección (A y B; ver material y métodos) y diferentes DO de A. tumefaciens
(0,5 y 1,0).
El experimento se diseñó con el Asistente de Diseño de Experimentos de
Statgraphics Centurion XVI. El tipo de diseño elegido fue Plackett-Burman ple-
gado 2^7*3/1, con un total de 24 ejecuciones y 4 muestras por ejecución. Una vez
obtenidos los datos de los 24 experimentos (el número de colonias HygR en cada
caso) y proporcionados al programa, el Asistente aplica automáticamente el trata-
miento estadístico apropiado. El análisis aplicado fue un ANOVA multifactorial
que puso de manifiesto que solo la temperatura durante el co-cultivo tenía un efec-
to estadísticamente significativo sobre el número de colonias HygR obtenidas. Los
resultados del análisis aparecen gráficamente reflejados en un diagrama de Pareto
(Figura 3-8).
Figura 3-8. Diagrama de pareto mostrando el efecto de diferentes factores sobre la eficiencia
de la transformación (número de colonias HygR). La línea vertical marca el umbral de significa-
ción estadística. (Tomada de Dautor et al. 2014.)
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Todos los factores mostraron la misma tendencia: mayor eficacia de la
transformación con los menores valores de cada factor. No obstante, sólo la tem-
peratura durante el co-cultivo mostró un efecto estadísticamente significativo (Fi-
gura 3-8). Statgraphics sugirió una serie de valores óptimos que fueron: tempera-
tura de co-cultivo 22 ºC, pH durante el co-cultivo 5,5, duración del co-cultivo 2 d,
infección de Agrobacterium con un cultivo de DO600=0,5, sin luz durante el co-
cultivo y los modos A, para el método de infección y el tratamiento post-cosecha.
Alrededor de 10-4
colonias HygR por cada célula sembrada al inicio eran
típicamente obtenidas en los experimentos de transformación sucesivos. Para veri-
ficar más a fondo el fenotipo resistente a higromicina de los clones transformados
putativos, las colonias que crecía en placas de selección
(DWNA+Hyg15+Cef250) fueron inmediatamente repicadas, diluidas en medio
TAP líquido conteniendo 15 mg/L de higromicina y transferidas a placas frescas
DWNA conteniendo igual concentración de higromicina. Los clones fueron trans-
feridos mensualmente a placas frescas con idéntica composición. Los más viejos
han sido transferidos más de 24 veces reteniendo el fenotipo de resistencia a hi-
gromicina, una indicación de la presencia de un gen hpt activo en el genoma de
Scenedesmus. Las diferencias de crecimiento entre los clones HygR y el genotipo
silvestre eran claramente visibles después de unos pocos días de cultivo en placas
selectivas (Figura 3-5A).
Transformación con zeocina como antibiótico de selección Aunque la Hyg demostró ser útil para seleccionar clones transformados de
S. almeriensis, en el curso del desarrollo del trabajo se constató una cierta incon-
sistencia en la actividad entre los distintos lotes comerciales que se traducía en la
existencia de numerosos escapes (colonias no transformadas que crecían en pre-
sencia de Hyg). Por otra parte, de modo paralelo, nuestro grupo había empezado a
trabajar en la transformación genética de dos microalgas marinas, Tetraselmis
chuii y Nannochloropsis gaditana. Los ensayos de sensibilidad a Hyg de estas
microalgas marinas habían puesto de manifiesto su ineficacia, especialmente en
medio salino. Conocedores de la existencia de una potente familia de antibióticos
(bleomicina y derivados) que habían sido utilizados con éxito con diferentes mi-
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croalgas marinas en medios salinos, en concentraciones moderadas/bajas para los
que existía un gen de resistencia, Shble, que había mostrado ser muy efectivo,
nuestro grupo había desarrollado un nuevo vector de transformación. El nuevo
vector (pCAMShble) incorporaba el gen Shble como marcador de selección confi-
riendo resistencia a los antibióticos fleomicina y zeocina. De modo que decidimos
utilizar este vector de transformación también con S. almeriensis. Esto nos obligó
a realizar, con carácter previo, los experimentos adicionales de sensibilidad a los
nuevos antibióticos de trabajo que hemos mostrado anteriormente.
La transformación con el nuevo plásmido pCAMShble se realizó de modo
idéntico al utilizado con pCAMBIA 1305.1 salvo, obviamente, el uso de Zeo en
vez de Hyg, utilizando las condiciones de transformación sugeridas como mejores
por los experimentos anteriores. Concretamente los experimentos de transforma-
ción con pCAMShble se hicieron en las condiciones siguientes:
Temperatura de co-cultivo 22oC.
2 días de co-cultivo.
Modo de post-cosecha 1 o A.
pH 5,5 durante el co-cultivo.
Cultivo de A. tumefaciens a DO600 0,5.
Modo de infección 1 o A.
Sin luz durante el co-cultivo.
Realizamos los experimentos de transformación con el plásmido
pCAMShble seleccionando en placas petri con medio sólido DWNA, con 15
mg/L de Zeo y 250 mg/L de Cef, a pH 8.
La eficiencia de la transformación osciló desde 0,3·10-4
hasta 0,9·10-4
co-
lonias ZeoR obtenidas respecto de las células inicialmente sembradas en los expe-
rimentos de transformación. La estabilidad del fenotipo ZeoR fue chequeado para
todos los clones transformados putativos mediante selección repetida en placas
Zeo10 siguiendo un modo de operación similar al descrito con Hyg. Alrededor del
30% de los clones iniciales sobrevivieron tras dos rondas de selección y retuvie-
ron el fenotipo ZeoR de manera estable durante al menos 12 meses, incluso en
ausencia de presión selectiva. El sistema utilizado para transferir los clones a tra-
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vés de las diferentes rondas (resuspensión de las células en medio líquido con
Zeo15) aseguraba un mayor contacto de las células con el antibiótico evitando
pues escapes sucesivos. Las diferencias de crecimiento entre los clones ZeoR y la
cepa silvestre de S. almeriensis eran claramente aparentes después de unos pocos
días de crecimiento en presencia del antibiótico (Figura 3-5B). Esto es indicativo
de la realidad de la transformación y de la expresión apropiada del gen Shble.
Criterios de transformación
Resistencia a zeocina
Un primer criterio de transformación es lógicamente la resistencia a Zeo,
cuya estabilidad puede constatarse a lo largo del tiempo paralos clones transfor-
mados. Mensualmente, los clones son transferidos a placas nuevas con medio
fresco con Zeo. En la primera, e incluso en la segunda transferencia, ha sucedido,
que un mínimo número de clones han sido incapaces de crecer en presencia de
Zeo, pero los clones supervivientes mantienen establemente el fenotipo ZeoR. El
sistema de transferencia asegura el contacto de las células con el antibiótico de
modo que se eviten los “escapes” y los resultados no admiten ambigüedad alguna
pues las diferencias de crecimiento son claramente observables a simple vista (Fi-
gura 3-5B). Obsérvese cómo no crece nada en absoluto el clon WT en tanto que
los clones transformados exhiben un vigoroso crecimiento en la placa con Zeo10
(Figura 3-5B). Se puede observar también que hay grados en la resistencia a Zeo;
por ejemplo, el clon transformado #8 crece bastante más pobremente que los de-
más clones transformados, algo que cabe esperar dada la aleatoriedad del proceso
de inserción del T-DNA y la consecuente variabilidad en la expresión de los
transgenes (Figura 3-5B).
PCR para el gen Shble
Para comprobar la presencia de los transgenes del T-DNA en los posibles
transformante realizamos experimentos de PCR para amplificar un fragmento del
gen Shble. El DNA genómico usado como molde se obtuvo inicialmente mediante
un procedimiento rápido de extracción a partir de colonias, y los resultados fueron
satisfactorios. Después de separar por electroforesis aparecía la banda del tamaño
esperado en los tres clones transformados chequeados (Figura 3-9A). El DNA
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extraído mediante un kit comercial también funcionó como molde, apareciendo en
el gel de agarosa la banda esperada, aunque algo más tenue, en otros cuatro clones
transformados ensayados (Figura 3-9B). No se observaron bandas de amplifica-
ción ni en el control negativo (Figura 3-9A) ni en la cepa no transformada (WT en
Figura 3-9A y B).
Figura 3-9. Amplificación por PCR de un fragmento del gen Shble (paneles A y B) y de otro
del gen GUS (panel C). Las diferentes calles corresponden a la cepa silvestre de S. almeriensis
(WT), a diferentes clones ZeoR putativamente transgénicos (#1-#64)), a los marcadores de tamaño
(M), y un control positivo (C+; una muestra de un clon transgénico de la microalga Tetraselmis
chuii). El DNA genómico utilizado como molde ha sido extraído con el método rápido (A) y con
un kit comercial (B). (Tomada de Dautor et al. 2014.)
PCR para el gen GUS
Aplicamos la técnica de PCR para comprobar también la presencia del otro
de los transgenes mediante la amplificación de un fragmento del gen GUS. En este
caso, el DNA extraído por el procedimiento rápido a partir de colonias no funcio-
nó adecuadamente como molde pues no apareció ninguna banda de amplificación
en ninguna de las muestras procedentes de cuatro clones transformados. En cam-
bio, los resultados fueron positivos para esos mismos cuatro clones transformados
cuando se utilizó como DNA molde el extraído mediante el kit comercial (datos
no mostrados). Extraído el DNA genómico mediante el kit comercial, en 9 de 19
clones ZeoR ensayados aparecían bandas de amplificación correspondientes a
GUS (Figura 3-9C). No aparecían bandas de amplificación ni en el control negati-
vo (sin DNA molde) ni en la muestra procedente de la cepa no transformada
(WT). No obstante, cuando volvimos a ensayar la PCR para GUS, con DNA mol-
de extraído por el método rápido, utilizando una nueva pareja de oligonucleótidos
cebadores mejor optimizados, aproximadamente la mitad de las muestras de clo-
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nes transformados mostraron la banda de amplificación esperada (datos no mos-
trados), lo que indica que la técnica de extracción de ADN es adecuada para el
rastreo inicial de los clones.
Tinción GUS
Para acumular una evidencia más, investigamos también la presencia de
actividad GUS mediante tinción histoquímica en los clones transformados. Todos
nuestros intentos dieron resultado negativo excepto uno. Cultivamos en medio
líquido el clon transformado #20 que era uno de los clones positivos en la PCR
para GUS. Se hicieron tres cultivos con diferentes concentraciones de Zeo: 5, 7, y
10 mg/L. Únicamente el cultivo con 10 mg/L de Zeo desarrolló coloración azul
(Figura 3-10) no tiñéndose los otros dos cultivos del clon transformado #20 ni,
como era de esperar, el WT. Tantas cuantas veces hemos repetido este experimen-
to, nunca hemos vuelto a conseguir tinción azul en S. almeriensis en ningún otro
clon transformado. Aunque, empleando idéntica técnica, en nuestro laboratorio
hemos detectado rutinariamente actividad GUS para numerosos clones de T. chuii
transformados con el mismo procedimiento y el mismo vector, pCAMShble. Co-
mo en el caso de los clones transformados con pCAMBIA 1305.1, los extractos
proteicos brutos de los transformados con la versión modificada del vector,
pCAMShble, presentaban una débil actividad β-glucuronidasa aunque significati-
vamente superior al WT (resultados no mostrados).
Figura 3-10.Tinción GUS. Todos los pocillos corresponden a cultivos con idéntico tratamiento
para teñir. El clon transgénico #20 ha sido cultivado en medio líquido con 5, 7, y 10 mg/L de zeo
cina. Se observa tinción solo en las células de máxima concentración de antibiótico.
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Estabilidad genética de los clones transformados
Actualmente seguimos un protocolo de replicación de los clones transfor-
mados riguroso en cuanto al mantenimiento de la presión de selección. Cada 15
días aproximadamente los clones transformados, mantenidos rutinariamente en
placas petri con medio sólido DWNA+Zeo10, son transferidos a placas con idén-
tico medio fresco. La transferencia no se hace por repicado simple, como es habi-
tual y como veníamos haciendo, sino que procedemos a resuspender el inóculo en
medio líquido conteniendo Zeo 10 mg/L, para facilitar que todas las células entren
en contacto con el antibiótico, de esta suspensión se hacen diluciones seriadas
(100-10
-3) y se siembra una gota de 15 µL de cada dilución en medio sólido
DWNA+Zeo10 (procedimiento idéntico al usado y presentado en la Figura 3-5B).
De este modo creemos que impedimos que células no transformadas puedan so-
brevivir acantonadas dentro de un acúmulo de células transformadas que las prote-
jan. Siguiendo este sistema bastantes clones procedentes directamente de las pla-
cas de transformación, presuntamente ZeoR, han sido eliminados. Los restantes, se
mantienen establemente desde hace meses mostrando que el fenotipo ZeoR es ge-
néticamente estable.
Transformación con genes DGAT Una vez desarrollado satisfactoriamente un procedimiento fiable y eficien-
te de transformación genética para S. almeriensis, se procedió a aplicarlo como
prueba de concepto de que la transformación genética podía ser útil para incre-
mentar la cantidad de TAG con una posible utilidad en la obtención de biodiesel.
Nuestra hipótesis de trabajo era que se podría alcanzar el objetivo mediante la
introducción y sobreexpresión de genes DGAT controlados por elementos regula-
dores apropiados. Una vez decididos los genes a introducir, EpDGAT1 y CrScD-
GAT2, y los elementos reguladores, el promotor Hsp70A:RbcS2:Intr y el termina-
dor 3’-UTR se procedió a su ensamblaje en el orden adecuado e introducción en el
vector pCAMShble. Las construcciones en este plásmido binario permitirían
transferir los módulos de expresión apropiados a las células de S. almeriensis y
generar los correspondientes clones transgénicos sobreexpresando bien EpD-
GAT1o bien CrScDGAT2. Las correspondientes construcciones se realizaron se-
gún se ha descrito en Material y Métodos.
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Evidencias de transformación con EpDGAT1
Aunque los ensayos previos acreditaban que el proceso de transformación
se producía efectivamente de la forma esperada mediante la transferencia del T-
DNA y su incorporación aleatoria al genoma de la célula transformada, no obstan-
te, en todos los casos, llevamos a cabo pruebas adicionales que comprobasen la
realidad de lo esperado. De modo que, una muestra de clones transformados pri-
marios (ZeoR) fueron sometidos a PCR para verificar la presencia del transgén de
interés (EpDGAT1) y, sistemáticamente, todos los clones transgénicos eran anali-
zados respecto de su composición en ácidos grasos (por triplicado: tres cultivos
independientes y tres análisis correspondientes).
Análisis por PCR
El análisis por PCR sobre DNA genómico, de una muestra aleatoria de 15
clones ZeoR, transformados con pCAMShble-EpDGAT1, demostró que la gran
mayoría de los clones ZeoR tenían integrado en su genoma el gen EpDGAT1 como
se manifestaba por la presencia de las bandas correspondientes a la amplificación
esperada (Figura 3-11) y su ausencia en el clon no transformado (WT) y en la ca-
lle con el control negativo (sin DNA molde) (Figura 3-11).
Figura 3-11.PCR de un fragmento del gen EpDGAT1. Los números del #1-#15 corresponden a
colonias putativamente transgénicas (ZeoR).
Evidencias de transformación con CrScDGAT2
El protocolo de verificación seguido para el gen EpDGAT1 se aplicó
igualmente a los clones transformados con CrScDGAT2.
Análisis por PCR
Una muestra de cuatro clones ZeoR transformados con CrScDGAT2 fueron
chequeados para la presencia del gen con dos tipos de extractos de DNA genómi-
co: uno procedente de células viejas (mantenidas en placa de agar nutritivo más de
50 días) y el otro procedente de células jóvenes (alrededor de 16 días). Las cuatro
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calles con DNA genómico de células jóvenes dieron amplificación para el gen.
No así las células viejas (Figura 3-12).
Figura 3-12. PCR de un fragmento del gen CrScDGAT2. Los números (#1, #2, etc.) correspon-
den a colonias putativamente transgénicas (ZeoR). Las cuatro primeras calles corresponden a colo-
nias “viejas” (50 días aprox.) frente a las cuatro siguientes que son los mismos clones pero con
muestras tomadas de colonias “jóvenes” (16 días aprox.). M, marcadores; WT, “wild type”, y C-,
control negativo.
Composición en ácidos grasos de los clones transformados con
DGAT
En experimentos previos habíamos determinado que la cepa “wild type”
de S. almeriensis (SWT), partiendo de cultivos a DO600 = 0,1, alcanzaba la fase
estacionaria en 12 d. Los clones transformados (SD1E# para DGAT1 y SD2C#
para DGAT2) alcanzaban fase estacionaria en 12 d o incluso algunos días antes.
Puesto que presuponíamos, de acuerdo con un cuerpo abundante de literatura, que
la acumulación de lípidos es máxima en fase estacionaria, nos pareció apropiado
comparar la composición lipídica de todos los clones en esta fase. Ante la variabi-
lidad observada entre los clones trasformados en alcanzar la fase estacionaria, y
habida cuenta de la necesidad de aplicar un criterio idéntico a todos los clones
para hacer comparaciones legítimas, optamos por un criterio temporal y fijamos
12 d de cultivo como criterio que determinaba el momento en que se cosechaban
los cultivos.
Clones DGAT1
Cada clon ZeoR estable fue cultivado y analizado por triplicado. En total se
han estudiado de este modo 30 clones SD1E# (transformados con DGAT1). La
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Tabla 3-4. Composición en ácidos grasos (mg/g de biomasa seca) de los diferentes clones
transgénicos con EpDGAT1 de S. almeriensis (SD1E#). Los valores corresponden a la media
(arriba, banda gris) y el error estándar (debajo, banda blanca) de tres cultivos independientes para
cada clon. Todos los cultivos se iniciaron simultáneamente con DO600=0,1 y se cosecharon a los 12
días.
Clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 TFA PUFA MUFA SFA
SD1E1 14,6 20,6 7,0 14,9 76,5 31,8 26,1 18,2
0,6 0,9 0,3 0,6 2,0 0,3 1,2 1,0
SD1E4 11,4 17,1 5,9 15,6 66,7 29,5 21,7 15,5
0,6 1,2 0,1 0,4 3,2 1,2 1,3 0,7
SD1E10 11,9 16,8 4,2 15,1 65,4 31,9 21,3 12,3
1,6 2,2 0,6 2,1 9,0 4,4 2,8 1,9
SD1E11 15,9 25,2 7,2 15,6 83,2 34,7 31,7 16,9
0,6 0,9 0,3 0,4 3,2 1,4 1,3 0,6
SD1E12 10,3 11,0 5,1 16,3 61,7 34,6 16,7 10,4
0,8 0,5 0,3 1,2 4,4 2,6 0,9 0,9
SD1E13 14,7 18,5 4,9 18,8 75,1 37,0 23,0 15,1
1,7 3,0 0,3 0,8 8,2 2,3 4,4 2,0
SD1E16 15,7 24,5 7,2 16,6 82,3 35,6 30,3 16,4
0,9 1,4 0,6 1,1 5,5 2,8 1,8 0,9
SD1E25 14,6 22,1 8,4 14,7 79,9 35,3 29,3 15,4
1,3 3,8 1,5 2,5 10,1 4,5 3,6 2,5
SD1E26 16,4 20,7 9,0 23,8 93,5 48,7 28,4 16,4
3,3 4,2 1,9 4,4 19,3 10,4 5,6 3,3
SD1E28 12,1 15,9 6,5 15,0 66,8 30,1 19,8 16,9
0,5 0,6 0,4 0,8 3,1 1,6 0,8 0,9
SD1E29 11,7 19,0 4,1 15,5 65,6 26,7 22,4 16,6
1,2 2,1 0,6 1,7 7,4 3,3 2,5 1,6
SD1E30 8,6 10,1 5,6 10,9 46,6 22,9 13,2 10,6
0,6 0,6 0,4 1,0 3,6 1,9 0,9 0,8
SD1E36 13,8 20,6 5,8 19,2 79,6 37,9 28,0 13,8
1,3 1,7 0,6 1,6 6,5 3,2 2,1 1,3
SD1E38 16,2 17,1 14,1 20,2 95,5 53,1 26,2 16,2
3,5 3,9 3,0 4,1 20,9 11,6 5,9 3,5
SD1E41 13,3 26,2 7,1 14,5 80,0 33,8 32,2 14,0
1,3 3,1 0,7 1,2 8,4 2,9 4,2 1,4
SD1E43 13,2 20,8 5,7 16,2 75,0 35,9 25,6 13,5
0,7 2,3 0,2 0,1 3,6 0,5 2,2 0,9
SD1E47 9,0 14,6 4,9 13,8 57,3 29,2 19,0 9,0
1,5 2,8 0,8 1,8 9,6 4,5 3,7 1,5
SD1E48 15,1 32,5 6,2 20,0 96,3 40,3 40,9 15,1
4,2 9,5 1,7 5,4 27,4 10,6 12,7 4,2
SD1E51 21,3 27,2 7,8 27,1 112,8 53,6 37,9 21,3
3,8 4,5 1,7 6,4 22,9 12,0 7,3 3,8
SD1E52 21,5 36,9 13,0 16,3 115,0 46,6 46,0 22,4
5,7 10,2 3,1 3,4 28,5 10,1 12,4 5,9
SD1E53 12,9 21,9 6,7 19,1 78,9 39,1 26,6 13,3
2,8 4,8 1,5 4,1 17,6 8,7 5,7 3,2
SD1E55 15,7 35,4 8,2 17,1 93,9 37,8 39,5 16,6
1,8 4,4 0,9 1,6 10,6 3,7 4,9 2,0
SD1E63 12,9 20,2 5,8 15,5 72,2 33,6 25,6 12,9
1,4 1,8 0,5 1,6 7,4 3,4 2,7 1,4
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Clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 TFA PUFA MUFA SFA
SD1E64 16,5 21,8 8,5 14,6 81,4 33,9 30,8 16,8
3,0 3,6 1,5 2,7 14,2 6,1 5,2 2,8
SD1E68 14,9 20,9 6,7 18,5 80,8 38,1 27,7 14,9
2,0 2,8 0,9 2,3 10,5 5,1 3,6 2,0
SD1E70 14,0 19,8 5,3 18,1 74,3 35,9 24,4 14,0
0,3 0,4 0,3 1,0 2,6 1,9 0,6 0,3
SD1E72 11,6 12,4 4,8 17,5 62,6 34,4 16,6 11,6
1,7 1,7 0,7 2,2 8,5 4,7 2,2 1,7
SD1E77 13,6 26,0 4,8 14,7 75,1 30,7 30,8 13,6
1,5 3,1 0,4 1,3 7,5 2,7 3,7 1,5
SD1E78 19,1 33,0 6,1 14,0 89,5 30,4 38,9 20,2
1,5 3,2 0,5 1,1 7,6 2,3 3,6 1,7
SD1E79 10,6 13,3 5,4 15,6 60,8 32,2 17,9 10,6
0,4 0,7 0,2 1,0 3,2 2,7 0,5 0,4
Media 14,1 21,4 6,7 16,8 78,1 35,8 27,3 15,0
E.E. 3,1 6,8 2,3 3,1 15,3 7,0 7,8 3,1
composición en ácidos grasos de los clones estudiados en este trabajo (medias y
desviaciones típicas) se muestran en las Tablas 3-4 (en mg/g de biomasa seca) y
3-5 (en % del total de ácidos grasos). Solo se incluyen en las tablas los ácidos gra-
sos mayoritarios. Los datos completos, de cada cultivo, se proporcionan en la Ta-
bla A# del Apéndice.
Los ácidos grasos mayoritarios fueron 16:0, 18:1n9, y 18:3n3, presentes en
cantidades substanciales, en promedio: 14, 21, y 17 mg/g, respectivamente (Tabla
3-4). El contenido medio de TFA, PUFA, MUFA, y SFA fue 78, 36, 27, y 15
mg/g (Tabla 3-4). El nivel de variación entre los clones es muy elevado. Por
ejemplo, el contenido en TFA oscila entre 46,6±3,6 mg/g del clon SD1E30 y
115±28,5 mg/g del clon SD1E52. Algo similar sucede entre las muestras dentro
de cada clon donde, por ejemplo, el error estándar de la media de SD1E52 es 28
mg/g (Tabla 3-3). Aparentemente el “ruido” experimental es elevado pese a que
hemos tomado todas las medidas que hemos podido para tratar de minimizarlo.
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Tabla 3-5. Composición en ácidos grasos (% del total de ácidos grasos) de los diferentes
clones transgénicos con EpDGAT1 de S. almeriensis (SD1E#). Los valores corresponden a la
media (arriba, banda gris) y el error estándar (debajo, banda blanca) de tres cultivos independien-
tes para cada clon. Todos los cultivos se iniciaron simultáneamente con DO600=0,1 y se cosecharon
a los 12 días.
clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 18:4n3 PUFA MUFA SFA
SD1E1 19,1 26,9 9,2 19,5 3,4 41,5 34,2 23,7
0,3 0,8 0,3 0,7 0,1 0,8 1,1 0,8
SD1E4 17,1 25,6 8,8 23,5 5,1 44,2 32,5 23,3
0,1 0,5 0,3 0,9 0,2 0,3 0,4 0,1
SD1E10 18,2 25,6 6,4 23,1 6,0 48,8 32,6 18,7
0,1 0,2 0,1 0,0 0,1 0,3 0,3 0,4
SD1E11 19,1 30,3 8,7 18,7 3,4 41,7 38,1 20,3
0,1 0,1 0,1 0,3 0,0 0,3 0,3 0,1
SD1E12 16,7 17,8 8,3 26,5 4,7 56,1 27,1 16,9
0,3 0,5 0,1 0,3 0,1 0,2 0,5 0,3
SD1E13 19,5 24,5 6,6 25,2 4,6 49,5 30,4 20,1
0,1 1,4 0,3 2,3 0,5 3,4 2,9 0,6
SD1E16 19,0 29,8 8,8 20,2 2,5 43,3 36,8 19,9
0,1 0,5 0,1 0,3 0,0 0,6 0,4 0,2
SD1E25 18,3 27,5 10,4 18,3 5,8 44,1 36,7 19,2
0,8 1,5 0,7 1,4 0,8 1,4 0,2 1,6
SD1E26 17,6 22,1 9,7 25,5 5,1 52,0 30,4 17,6
0,2 0,4 0,2 0,6 1,0 0,7 0,5 0,2
SD1E28 18,2 23,7 9,7 22,4 5,2 45,0 29,7 25,3
0,5 0,5 0,5 0,3 0,2 0,3 0,5 0,6
SD1E29 17,8 29,0 6,3 23,6 6,0 40,7 34,1 25,3
0,1 0,1 0,2 0,4 0,1 0,5 0,2 0,4
SD1E30 18,4 21,8 12,0 23,3 5,4 49,0 28,3 22,7
0,2 0,4 0,1 0,5 0,1 0,4 0,3 0,1
SD1E36 17,3 25,8 7,3 24,1 5,1 47,6 35,1 17,3
0,2 0,2 0,2 0,2 0,1 0,4 0,6 0,2
SD1E38 17,0 17,9 14,8 21,2 4,5 55,6 27,4 17,0
0,1 0,6 0,3 0,3 0,1 0,5 0,4 0,1
SD1E41 16,6 32,7 8,9 18,1 3,4 42,4 40,2 17,5
0,4 0,6 0,3 0,5 0,1 0,8 1,1 0,4
SD1E43 17,6 27,7 7,6 21,6 4,2 47,9 34,1 18,0
0,1 1,7 0,1 1,1 0,3 1,7 1,3 0,4
SD1E47 15,8 25,4 8,5 24,3 4,7 51,1 33,1 15,8
0,2 0,7 0,1 1,1 0,1 0,8 0,9 0,2
SD1E48 15,7 33,7 6,4 20,9 5,3 42,1 42,2 15,7
0,2 0,4 0,1 0,5 0,9 1,4 1,6 0,2
SD1E51 19,0 24,2 6,9 23,9 6,0 47,4 33,7 19,0
0,5 1,1 0,4 1,1 0,3 1,7 1,3 0,5
SD1E52 18,7 31,9 11,3 14,2 4,1 40,7 39,9 19,4
0,4 0,9 0,1 0,5 0,2 1,2 0,9 0,4
SD1E53 16,3 27,8 8,5 24,2 4,2 49,5 33,7 16,8
0,3 0,8 0,2 0,3 0,2 0,6 0,5 0,4
SD1E55 16,7 37,6 8,7 18,2 3,6 40,3 42,0 17,7
0,2 0,5 0,0 0,4 0,1 0,7 0,6 0,1
SD1E63 17,9 28,0 8,1 21,5 6,6 46,6 35,5 17,9
0,1 0,3 0,2 0,1 0,2 0,6 0,5 0,1
SD1E64 20,2 26,8 10,4 17,8 3,8 41,6 37,8 20,6
0,5 0,4 0,1 0,2 0,1 0,3 0,1 0,2
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72
clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 18:4n3 PUFA MUFA SFA
SD1E68 18,5 25,8 8,3 22,9 5,8 47,2 34,3 18,5
0,2 0,7 0,4 0,4 0,3 1,0 0,8 0,2
SD1E70 18,8 26,7 7,1 24,4 5,0 48,3 32,8 18,8
0,3 0,8 0,2 0,6 0,0 1,0 0,7 0,3
SD1E72 18,5 19,8 7,7 27,9 6,1 55,0 26,6 18,5
0,4 0,6 0,1 0,4 0,0 0,8 0,5 0,4
SD1E77 18,1 34,6 6,4 19,6 5,2 40,9 41,0 18,1
0,5 1,2 0,1 1,0 0,2 1,5 1,1 0,5
SD1E78 21,3 36,9 6,8 15,6 2,9 34,0 43,4 22,6
0,1 0,4 0,0 0,5 0,1 0,3 0,3 0,2
SD1E79 17,5 21,9 8,9 25,7 4,8 53,0 29,5 17,5
0,3 1,4 0,1 0,5 0,2 1,8 1,6 0,3
Media 18,0 27,0 8,6 21,9 4,7 46,2 34,4 19,3
E.T. 1,3 5,0 1,9 3,3 1,0 5,3 4,7 2,6
Respecto del contenido total de ácidos grasos, TFA, hay dos clones,
SD1E51 y SD1E52, que tienen un elevado valor, 112 y 115 mg/g, respectivamen-
te. Estos valores son claramente superiores a la media de todos los clones, 78
mg/g suponiendo un incremento en TFA superior al 40%. El clon SD1E52 mues-
tra también un elevado contenido en 16:0, 22 mg/g frente a una media de 14 mg/g
(incremento del 57%), en ácido oleico (OA, 18:1n9), 37 mg/g frente a una media
de 21 mg/g (incremento del 76%), así como en MUFA y SFA. En el otro extremo
encontramos el clon SD1E30 con un pobre contenido en ácidos grasos de sólo 47
mg/g, que es el reflejo del bajo contenido en ácidos grasos individuales. También
es notable el contenido en ácido α-linolénico (ALA, 18:3n3) del clon SD1E51, 27
mg/g, frente a la media de los clones, 17 mg/g. También aparecen valores extre-
mos inferiores, por ejemplo, el clon SD1E30, que muestra 9, 10, y 11 mg/g de
16:0, 18:1n9, y 18:3n3, respectivamente (Tabla 3-4).
También hemos calculado el porcentaje de cada ácido graso sobre el total
de ácidos grasos (Tabla 3-5). Los ácidos grasos principales, 16:0, 18:1n9, y
18:3n3 constituyen por término medio el 18%, 27% y 22% del TFA, respectiva-
mente. El porcentaje medio de PUFA es 46%, los MUFA comprenden el 34%,
mientras que los SFA son el 20% (Tabla 3-5). Aunque a niveles bastante más re-
ducidos que para los datos de peso seco (mg/g), todavía se observan niveles subs-
tanciales de variación entre clones y entre muestras de un mismo clon. Por ejem-
plo, el contenido en OA (18:1n9) varía entre 17,8±0,5% en el clon SD1E12 y
37,6±0,5% en SD1E55 (Tabla 3-5), algo más del doble. Respecto del contenido
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Resultados 73
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porcentual (Tabla 3-5) las diferencias en general son menos extremas, excepto
para el contenido en OA donde, frente al promedio de 27%, se observan valores
por encima del 37% en SD1E55 y SD1E78.
Clones DGAT2
Por causas ajenas a la planificación de esta tesis, se dispuso del gen
DGAT2, optimizado en el uso de codones para Chlamydomonas, bastante más
tarde. Por consiguiente, todos los trabajos relacionados con este gen han tenido un
menor desarrollo puesto que han dispuesto de menos tiempo. En este trabajo se
han estudiado solamente cuatro clones transformados con DGAT2.
Tabla 3-6. Composición en ácidos grasos (mg/g de biomasa seca) de los diferentes clones
transgénicos con CrScDGAT2 de S. almeriensis (SD2C#). Los valores corresponden a la media
(arriba, banda gris) y el error estándar (debajo, banda blanca) de tres cultivos independientes para
cada clon. Todos los cultivos se iniciaron simultáneamente con DO600=0,1 y se cosecharon a los 12
días.
Clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 18:4n3 TFA PUFA MUFA SFA
SD2C1 14,2 21,9 11,2 18,9 2,9 92,6 50,4 27,3 14,9
0,7 1,5 0,6 0,9 0,1 4,8 2,6 1,7 0,8
SD2C2 12,2 15,6 6,7 16,0 4,1 72,2 39,6 20,2 12,4
0,8 0,8 0,5 1,5 0,3 5,0 3,2 1,1 0,7
SD2C7 20,8 33,1 9,3 32,3 6,6 135,3 70,8 42,7 21,9
6,6 10,0 2,6 10,6 2,2 43,3 23,0 13,4 6,9
SD2C8 13,5 17,4 7,2 17,7 4,2 80,7 43,7 23,0 14,0
3,1 4,2 2,0 3,2 0,8 17,8 9,0 5,7 3,2
Media 15,2 22,0 8,6 21,2 4,5 95,2 51,1 28,3 15,8
E.E. 3,8 7,8 2,1 7,5 1,5 28,0 13,9 10,0 4,2
En la Tabla 3-6 se presentan los datos de composición de los ácidos grasos
principales expresados en mg/g de peso seco. Destaca en ellos las cifras corres-
pondientes al clon SD2C7: 21 mg/g de ácido palmítico (PA, 16:0), 33 mg/g de
OA (18:1n9) y 32 mg/g de ALA (18:3n3) frente a un contenido medio de 15 mg/g
de 16:0, 22 mg/g de 18:1n9, y 21 mg/g de 18:3n3. El clon SD2C7 muestra un alto
contenido en ácidos grasos resultando en 131 mg/g de TFA frente a la media de
los clones que es 95 mg/g.
En cuanto a los datos porcentuales (tabla 3-7) no parecen observarse gran-
des diferencias entre los cuatro clones DGAT2.
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Tabla 3-7. Composición en ácidos grasos (% del total de ácidos grasos) de los diferentes
clones transgénicos con CrScDGAT1 de S. almeriensis (SD2C#). Los valores corresponden a la
media (arriba, banda gris) y el error estándar (debajo, banda blanca) de tres cultivos independien-
tes para cada clon. Todos los cultivos se iniciaron simultáneamente con DO600=0,1 y se cosecharon
a los 12 días.
Clon 16:0 18:1n9 18:2n6 18:3n3 18:4n3 PUFA MUFA SFA
SD2C1 15,4 23,6 12,1 20,4 3,2 54,5 29,5 16,1
0,0 0,7 0,2 0,2 0,1 0,6 0,6 0,0
SD2C2 16,9 21,7 9,3 22,1 5,7 54,8 28,1 17,1
0,1 0,5 0,1 0,5 0,1 0,7 0,6 0,4
SD2C7 15,4 24,5 7,0 23,8 4,9 52,2 31,6 16,2
0,1 0,5 0,4 0,4 0,1 0,5 0,3 0,2
SD2C8 16,8 21,5 8,9 22,1 5,2 54,2 28,4 17,4
0,1 0,4 0,4 0,8 0,1 0,8 0,7 0,1
Media 16,1 22,8 9,3 22,1 4,7 53,9 29,4 16,7
E.E. 0,8 1,5 2,1 1,4 1,1 1,2 1,6 0,7
Fuentes de la variación de la composición de ácidos grasos
Hemos estimado los componentes de la varianza de los datos mediante un
ANOVA encajado (“nested” ANOVA) que nos proporciona los porcentajes con
los que cada factor contribuye a la variación total. Este análisis nos permitirá
comprender la estructura de la variación, las fuentes de la variación de los datos.
Hemos diferenciado tres fuentes de variación jerarquizadas, de la superior
a la inferior, el transgén que recogerá la variación debida al gen presente en el
clon transformado (DGAT1, DGAT2 o ninguno), el clon, que recogerá la variación
debida a las diferencias individuales entre los clones (los 30 clones SD1E#, los 4
clones SD2C#, y el clon no transformado SWT), y las muestras tomadas de cada
clon (3) que recogerá la variación debida a las diferencias entre los tres cultivos y
los tres análisis lipídicos de cada clon o sea, el error experimental.
En una observación global de la Tabla 3-8 se aprecia que, en general, la
fuente principal de variación es el clon. La proporción de la variación debida al
clon oscila entre 27%, para el contenido en PUFA en peso seco, y 95% para el
contenido en ALA expresado en porcentaje sobre TFA. Solo para el contenido en
PUFA en peso seco es el transgén la fuente principal de variación (47%). El error
muestral tiene una contribución importante a la variación, oscilando entre 2%,
para el porcentaje de OA, y 42%, para el contenido en SFA en peso seco. En todos
los casos la contribución del error muestral, aun siendo substancial, es siempre
inferior a la del clon.
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Tabla 3-8. Componentes de la varianza (%) para las variables lipídicas. La varianza de cada
variable aparece descompuesta en tres componentes: la varianza debida al transgén, la debida al
clon, y la debida al error muestral.
Ácido graso Transgén Clon Error muestral
16:0a 0,00 58,61 41,39
18:1n9 a 0,00 73,73 26,27
18:3n3 a 27,74 39,08 33,18
TFA a 20,36 41,57 38,06
PUFA a 47,17 27,18 25,65
MUFA a 0,00 68,03 31,97
SFA a 0,00 57,23 42,77
16:0 b
30,23 65,77 4,01
18:1n9 b
12,96 84,95 2,09
18:3n3 b
0,00 95,10 4,90
PUFA b
22,34 74,38 3,28
MUFA b
2,03 93,28 4,69
SFA b
13,36 84,08 2,56 a En mg/g de peso seco.
b En % del total de ácidos grasos.
Es de destacar que el error muestral es significativamente menor para los
valores expresados como porcentajes sobre TFA (rango 2%-5%) (mitad inferior
de la Tabla 3-8). Paralelamente es para estas variables para las que la contribución
del clon es superior (rango 66%-95%). Podemos observar que el error muestral es
sensiblemente inferior para los porcentajes de ácidos grasos. Esto nos indica que
la composición lipídica expresada en % se ve mucho menos afectada por las va-
riaciones entre cultivos y entre análisis cromatográficos y, por consiguiente, son
mejores indicadores de la influencia de los factores genéticos (el transgén y el
clon) sobre la composición en ácidos grasos. Esto significa que estos porcentajes
son más estables frente a las variaciones experimentales no controladas. Como
consecuencia, los valores porcentuales son más sensibles a los factores genéticos
y, en general, serán más sensibles a los test estadísticos. Dicho de otro modo, será
más fácil detectar un efecto genético significativo en las variables expresadas en
% de TFA que en las expresadas como mg/g de biomasa seca.
Adicionalmente, este análisis nos indica que son los factores genéticos (el
transgén y el genotipo del clon individual), los determinantes fundamentales de la
variación en la composición de ácidos grasos y que el gen introducido tiene una
influencia marginal frente a la del clon concreto. Esto significa que cada clon,
resultado de un evento de transformación independiente, más allá del T-DNA re-
cibido (que es idéntico dentro de cada familia de clones, SD1E# y SD2C#), posee
rasgos diferenciadores respecto de otros clones, que tienen una influencia decisiva
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sobre la composición de ácidos grasos. Esta influencia es cuantitativamente más
determinante sobre los porcentajes de los diferentes ácidos grasos que sobre el
contenido neto de estos ácidos grasos (nótese la diferencia entre los valores de la
mitad superior de la tabla respecto de los de la mitad inferior). Por ejemplo, el
transgén explica el 28% de la variación del contenido de ALA en peso seco y el
0% del contenido porcentual, mientras que el clon explica el 39% del contenido
en peso seco y el 95% del contenido porcentual de este ácido graso (Tabla 3-8).
Solamente, y llamativamente, el contenido en PUFA, expresado en mg/g de bio-
masa seca (47%) o como % TFA (22%), exhibe valores elevados para el compo-
nente del trasgén (Tabla 3-8).
Análisis de grupos
Hemos llevado a cabo también un análisis de grupos de todos los clones
transgénicos junto con la cepa silvestre. El propósito de este tipo de análisis es
establecer un agrupamiento de los distintos clones transgénicos basado en su simi-
litud para un cierto número de variables cuantitativas. En este caso, las variables
utilizadas han sido los contenidos en los diferentes ácidos grasos. Como veremos,
cada grupo queda caracterizado por su composición lipídica.
El agrupamiento se ha hecho dos veces basándose en dos conjuntos de va-
riables diferentes: uno, los contenidos de todos los ácidos grasos expresados en
mg/g de biomasa seca, y dos, los contenidos de todos los ácidos grasos expresados
en porcentaje. El número de grupos es definido por el propio usuario, es decir, no
es objetivamente determinado. Para definir un número de grupos razonable para
los datos, llevamos a cabo el procedimiento probando desde uno a siete grupos. La
observación de los diferentes resultados nos llevó a la conclusión de que un núme-
ro de tres grupos era el más natural para nuestros datos, en el sentido de que los
grupos formados presentaban claras diferencias de perfil de ácidos grasos, como
vamos a ver.
Este procedimiento crea 3 conglomerados (grupos = “clusters”) a partir de
35 clones. Los conglomerados son grupos de clones con características similares.
Para formar los conglomerados, el procedimiento comienza con cada clon en gru-
pos separados. Después, combina los dos clones que resultan los más cercanos,
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basándose en una medida de distancia/identidad computada a partir de todas las
variables (contenido de cada uno de los ácidos grasos), para formar un nuevo gru-
po. Después de recalcular la distancia entre grupos, se combinan los dos grupos
ahora más cercanos. Este proceso se repite hasta que quedan solamente 3 grupos.
Figura 3-13.Dendrogramas mostrando el agrupamiento de los clones y las distancias entre los
grupos. El de la izquierda se generó a partir del contenido en ácidos grasos en mg/g de peso seco
mientras que el de la derecha se generó a partir del contenido en ácidos grasos en % de TFA.
En el análisis que hemos llevado a cabo, cada Grupo o “conglomerado”
queda caracterizado por una serie de “centroides” que proporcionan una descrip-
ción global de la composición en ácidos grasos de cada grupo.
El primer agrupamiento se ha basado en 22 variables (los 22 ácidos grasos
analizados expresados en mg/g) y aparece representado en un dendrograma (Figu-
ra 3-13 izquierda). Como se puede observar la mayoría de los clones transgénicos
se agrupan juntos (32 de 35; grupo II), hay un grupo monoclonal, formado por un
único clon (SD2C7; grupo III), y el grupo restante constituido por dos clones
(SWT y SD1E52; grupo I). Llama la atención en el dendrograma que, dentro del
grupo II, todos los clones DGAT2 (SD2C#, excepto SD2C7) forman una única
rama lo que indica que tienen una composición muy similar y diferenciada respec-
to de otros clones del grupo II. También nos indica este análisis que, desde el pun-
to de vista del contenido en ácidos grasos en mg/g, la inmensa mayoría de los clo-
nes transgénicos son esencialmente idénticos, estando caracterizados por la com-
posición del grupo II tal y como aparece en la Tabla 3-9: un bajo contenido en
16:0 (14 mg/g frente a 20 mg/g aproximadamente de los grupos I y III) y, en gene-
ral, en todos los ácidos grasos mayoritarios,18:1n9, 18:2n6, 18:3n3, y 18:4n3,
Dendograma
Método de Promedio de Grupo,Euclideana Cuadrada
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25
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28
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30
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36
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38
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41
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48
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siempre respecto de los grupos I y III (Tabla 3-9). Dicho de otro modo, el efecto
que, de modo general, ha tenido la transformación (tanto con DGAT1 como con
DGAT2), ha sido reducir el contenido en ácidos grasos (en mg/g). No obstante,
aparecen clones transgénicos concretos con un elevado contenido, por ejemplo
SD2C7, que presenta los valores mayores en todos los ácidos grasos principales
(compárense los valores del grupo III con cualquiera de los otros grupos; Tabla 3-
9).
Tabla 3-9. Análisis de grupos. Se muestran los valores de los centroides de cada grupo para los
ácidos grasos más importantes. Se han agrupado los 35 clones (34 clones transgénicos más el clon
silvestre) en tres grupos por el método del Promedio de Grupo siguiendo una métrica de distancia
Euclideana Cuadrada a partir del contenido en ácidos grasos (mg/g).
I II III
16:0 19,5 13,8 20,8
16:1t 3,6 2,6 3,5
16:3n3 4,2 3,0 7,2
16:4n3 6,5 4,8 8,6
18:0 0,7 0,8 1,1
18:1n9 29,6 20,6 33,1
18:1n7 2,9 2,0 2,0
18:2n6 12,1 6,7 9,3
18:3n3 19,5 17,0 32,3
18:4n3 4,7 3,7 6,6
El agrupamiento construido a partir de los valores de los 22 ácidos grasos
expresados en porcentajes genera un grupo con 33 de los 35 clones (grupo I) y dos
grupos formados exclusivamente por un clon cada uno de ellos (Figura 3-13 dere-
cha). Notablemente, la rama que primero se bifurca del grupo I, reúne a los cuatro
clones DGAT2, lo que indica la alta similitud entre ellos en las proporciones de
los diferentes ácidos grasos que habíamos notado anteriormente. El grupo I, el
mayoritario, que incluye a SWT, se caracteriza, frente a los grupos II y III, esen-
cialmente, por un bajo contenido en 16:0 (18% vs. 20%) y un alto contenido en
18:3n3 (22% vs. 18-19%) y en 18:4n3 (5% vs. 3-4%) (Tabla 3-10). El clon
SD1E1, conforma en exclusiva el grupo II, cuyos rasgos más notables son porcen-
tajes elevados de 16:0, 16:1t, 16:3n3, 18:0, y 18:1n9. Rasgos similares presenta el
grupo III (clon SD1E64) diferenciándose del anterior sólo en ácidos grasos mino-
ritarios (por ejemplo, 16:1t y 18:0; Tabla 3-10.).
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Tabla 3-10. Análisis de grupos. Se muestran los valores de los centroides de cada grupo para los
ácidos grasos más importantes. Se han agrupado los 35 clones (34 clones transgénicos más el clon
silvestre) en tres grupos por el método del Promedio de Grupo siguiendo una métrica de distancia
Euclideana Cuadrada a partir del contenido en ácidos grasos (% del total de ácidos grasos).
I II III
16:0 17,8 19,1 20,2
16:1t 3,3 5,2 3,6
16:3n3 3,7 6,5 6,5
16:4n3 6,2 0,0 3,1
18:0 1,2 4,6 0,4
18:1n9 26,8 26,9 26,8
18:1n7 2,6 2,0 4,5
18:2n6 8,6 9,2 10,4
18:3n3 22,1 19,5 17,8
18:4n3 4,8 3,4 3,8
El análisis de grupos a partir de los porcentajes de cada ácido graso sobre
el total sugiere tres ideas: primera, la mayoría de los clones transgénicos no se
diferencian de la cepa SWT; segunda, las diferencias observadas afectan al 16:0,
18:1n9 y 18:3n3, dentro de los ácidos grasos mayoritarios; y, tercera, los clones
transformados con DGAT2 son muy similares entre sí en su perfil de ácidos gra-
sos.
El análisis de grupos es una herramienta estadística meramente descripti-
va, nos proporciona pistas sobre los clones más destacados por su composición en
ácidos grasos, y cuáles de estos ácidos grasos marcan la diferencia, pero no pro-
porciona criterios estadísticos para establecer cuáles de esas diferencias son signi-
ficativas. Para este fin aplicamos a los datos otras herramientas estadísticas.
Comparaciones de la composición en ácidos grasos en clones transformados
con DGAT
Todas las comparaciones se han realizado mediante análisis de la varianza
(ANOVA) para un solo factor. Antes de aplicar el ANOVA hemos determinado si
las diferentes variables lipídicas (ácidos grasos, PUFA, etc.) se distribuyen esta-
dísticamente de manera aproximadamente normal, ya que éste es un requisito exi-
gido para poder realizar ANOVA. En los casos en los que la variable no se ajusta-
ba a una distribución normal, se ha procedido a transformarla aplicándole la utili-
dad de transformación de potencia disponible en STATGRAPHICS para este pro-
pósito. Generalmente, la variable transformada de este modo pasa a tener una dis-
tribución normal o aproximadamente normal. En los contados casos en los que la
variable transformada tampoco se ajustaba a la normalidad estadística, hemos
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aplicado una prueba no paramétrica, el test de Kruskal-Wallis, equivalente al
ANOVA aunque menos sensible. Esta prueba se ha utilizado igualmente cuando
no se cumplía un requisito fundamental de ANOVA, la homogeneidad de las va-
rianzas entre las muestras. La no homogeneidad de las varianzas se comprueba
mediante el test de Levene, de manera que, cuando esta comprobación ponía de
manifiesto este problema, automáticamente aplicábamos el test de Kruskal-Wallis.
Comparación entre transgenes: EpDGAT1 vs. CrScDGAT2
Esta comparación pretende encontrar efectos diferenciales, si es que exis-
ten, entre los dos genes DGAT que se han utilizado para transformar. Como he-
mos comentado en la introducción los dos tipos de genes pertenecen a familias
evolutivamente muy diferentes y cabría esperar, como se ha encontrado en mu-
chos casos, que los dos productos proteicos desempeñen actividades metabólicas
diferentes y, por tanto, produzcan efectos diferentes en la composición lipídica de
las células transformadas.
Tabla 3-11. Comparación entre la composición en ácidos grasos entre los dos tipos de trans-
génicos (DGAT1 y DGAT2). Se muestran los valores de las medias de cada grupo para los ácidos
grasos más importantes y la probabilidad (P) del test de significación estadística de la diferencia
entre las medias.
DGAT1 DGAT2 P
16:0a 14,1±3,1 15,2±3,8 n.s.
18:1n9a 21,4±6,8 22,0±7,8 n.s.
18:2n6a 6,7±2,3 8,6±2,1 0,0050
18:3n3a 16,8±3,1 21,2±7,5 0,0093
18:4n3a 3,7±1,0 4,5±1,5 0,0499
TFA a 78,1±15,3 95,2±28,0 0,0465
PUFA a 35,8±7,0 51,1±13,9 0,0008
MUFA a 27,3±7,8 28,3±10,0 n.s.
SFA a 15,0±3,1 15,8±4,2 n.s.
16:0b 18,0±1,3 16,1±0,8 0,0003
18:1n9b 27,0±5,0 22,8±1,5 0,0167
18:2n6b 8,6±1,9 9,3±2,1 n.s. 0,0924
18:3n3b 21,9±3,3 22,1±1,4 n.s.
18:4n3b 4,7±1,0 4,7±1,1 n.s.
PUFAb 46,2±5,3 53,9±1,2 0,0032
MUFAb 34,4±4,7 29,4±1,6 n.s. 0,0562
SFAb 19,3±2,6 16,7±0,7 0,0057
a En mg/g de biomasa seca;
b en % del total de ácidos grasos.
Los resultados completos de esta comparación se muestran en la Tabla 3-
11 y se representan gráficamente en la Figura 3-14 respecto de los ácidos grasos
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principales así como de las variables globales (TFA, etc.). En términos medios los
clones transgénicos DGAT2 muestran un mayor contenido en mg/g de biomasa
seca de todas las variables lipídicas (Tabla 3-11) siendo estadísticamente signifi-
cativas en todos los casos excepto para 16:0, 18:1n9, MUFA y SFA (Tabla 3-11;
véanse también, los diagramas de barras de la parte izquierda de la Figura 3-14).
No obstante, en cuanto a los ácidos grasos mayoritarios sólo es estadísticamente
significativa la diferencia en contenido del ácido linoléico (18:3n3, Tabla 3-11 y
Figura 3-14). Consistentemente el contenido en PUFA es significativamente ma-
yor en las líneas DGAT2, 51 mg/g, que en las DGAT1, 36 mg/g (Tabla 3-11 y
Figura 3-14). Asimismo el contenido en ácidos grasos totales (TFA) es mayor de
manera estadísticamente significativa en las transgénicas DGAT2 (Tabla 3-11 y
panel inferior izquierdo de la Figura 3-14).
Figura 3-14. Comparación de la composición en ácidos grasos entre transgénicas con
DGAT1 y con DGAT2.Se representan los datos de las medias correspondientes a las dos series de
clones transgénicos (SD1E#/DGAT1 y SD2C#/DGAT2) de S. almeriensis. En la parte superior se
representan datos individuales de los ácidos grasos mayoritarios; en la parte inferior datos de los
valores colectivos (TFA, PUFA, MUFA, y SFA). En la parte derecha se representan datos en %
del total de ácidos grasos; a la izquierda datos en mg/g de biomasa seca. Los asteriscos (*) indican
el nivel estadístico de significación: * P<0,05; ** P<0,01; y *** P<0,001.
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La situación es algo diferente cuando se observan las proporciones o por-
centajes de las variables lipídicas. Así se puede ver, que los porcentajes de ácido
palmítico (16:0) y de ácido oleico (18:1n9) son superiores en las transgénicas
DGAT1 siendo esta diferencia significativa estadísticamente en ambos casos (Ta-
bla 3-11 y Figura 3-14, panel superior derecho). Se observa asimismo que los por-
centajes de MUFA (no significativamente pero cercano a serlo, P=0,0562) y de
SFA (este último de modo estadísticamente significativo) son superiores en los
clones DGAT1 (mitad inferior de la Tabla 3-11 y Figura 3-14, panel inferior dere-
cho). El porcentaje de PUFA es en cambio superior en las transgénicas DGAT2
significativamente (mitad inferior de la Tabla 3-11 y Figura 3-14, panel inferior
derecho).
Comparación entre los clones transgénicos
La comparación se ha hecho entre los diferentes clones transformados con
DGAT1 aplicando también ANOVA. Todas las variables presentaban heteroge-
neidad para la varianza detectada por el test de Levene por lo que sólo se podía
aplicar legítimamente el test de Kruskal-Wallis para detectar si las diferencias
eran significativas. Esta prueba estadística resultó altamente significativa (test no
mostrados) lo que indica que las diferencias en el contenido en ácidos grasos ob-
servadas entre los diferentes clones están genéticamente determinadas y no son
una cuestión del azar. De modo que, la transformación genética provoca diferen-
cias significativas en la composición en ácidos grasos de los diferentes clones
transformados todos con EpDGAT1.
En principio, habría cabido esperar pocas diferencias entre los clones indi-
viduales transformados con el mismo módulo de expresión
(Hsp70A:RbcS2:Intr::EpDGAT1). Como vemos esta suposición es completamen-
te rechazada por las evidencias experimentales. Las diferencias genéticas indivi-
duales entre estos clones DGAT1 pueden ser debidas a un número variable de
inserciones del T-DNA (desde una a múltiples), a diferente actividad del módulo
de expresión según el entorno genómico en el que se ha integrado, etc. En suma,
la población de nuestros 30 clones transgénicos DGAT1 es genéticamente hetero-
génea como se manifiesta fenotípicamente (en la composición en ácidos grasos).
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Básicamente una situación similar se encontró entre los clones DGAT2
(datos no mostrados). De nuevo, cabe hacer el mismo comentario que hicimos
para los clones DGAT1: parecería que debíamos esperar una grosera homogenei-
dad de composición en ácidos grasos para clones transgénicos transformados con
una construcción idéntica (Hsp70A:RbcS2:Intr::CrScDGAT2::3’UTR) y de nuevo
nos encontramos con que, salvo el contenido en PUFA, todas las variables exhi-
ben diferencias inter-clonales significativas. Aparentemente, es más determinante
sobre el fenotipo de la composición en ácidos grasos el genotipo individual de
cada clon, que el compartido colectivamente.
Comparaciones con la cepa silvestre
También comparamos todos los clones entre sí y con la cepa silvestre
(SWT) mediante ANOVA seguida de un test LSD (“less significant diference”).
Un resumen de los resultados globalmente considerados se presenta en la Tabla 3-
12. Para las diferentes variables lipídicas en porcentaje del TFA, se muestra el
número de clones con media significativamente superior a SWT y significativa-
mente inferior a SWT (Tabla 3-12). Por ejemplo, para TFA 28/30 clones DGAT1
tienen un contenido en TFA significativamente inferior a SWT y 0/30 se muestran
significativamente superiores (Tabla 3-12). En cambio, 2/4 clones DGAT2 son
inferiores a SWT en TFA pero 1/4 es superior significativamente (Tabla 3-12). La
gran mayoría de los clones DGAT1 son superiores en los porcentajes de 16:0
(28/30), 18:1n9 (26/30), MUFA (23/30) y SFA (21/30) lo que indica claramente
que EpDGAT1 ha tenido un efecto colectivo provocando aumento de las propor-
ciones relativas de estas variables lipídicas (Tabla 3-12). Por su parte, los clones
DGAT2, aunque son un número pequeño (4), en su mayoría son superiores a
SWT en 18:1n9 (4/4), 18:3n3 (3/4), 18:4n3 (3/4) y SFA (4/4).
Finalmente, se compararon los mejores clones transgénicos de cada tipo
(SD1E52 y SD2C7), tomando como criterio de “mejores” los de mayor contenido
medio en ácidos grasos totales (TFA), frente a SWT (Figura 3-15).
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Figura 3-15. Comparación de la composición en ácidos grasos entre la cepa silvestre (SWT) y
los dos clones transgénicos con más alto contenido en ácidos grasos (SD1E52 y SD2C7). En la
parte superior se representan los datos individuales de los ácidos grasos mayoritarios; en la parte
inferior, los valores colectivos (TFA, PUFA, MUFA, y SFA). A la derecha los datos representados
son porcentajes del total de ácidos grasos; a la izquierda son mg/g de biomasa seca. Las letras
sobre las barras aparecen cuando las diferencias son estadísticamente significativas; cada letra
indica un grupo de pertenencia determinado mediante LSD; cuando hay dos letras quiere decir que
el valor comparado podría encuadrarse en cualquiera de los grupos.
SD2C7 mostró un contenido superior en todas las variables expresadas en
mg/g de biomasa seca respecto de SWT (paneles del lado izquierdo de la Figura
3-15) si bien solo era significativamente superior el contenido de 18:3n3. Este
mismo ácido graso mostraba un porcentaje significativamente superior (Figura 3-
15, panel superior derecho).
SD1E52 mostró un contenido de 18:1n9 significativamente superior a
SWT, en mg/g y en porcentaje, (paneles superiores de la Figura 3-15), y de 16:0
así como de MUFA y SFA en porcentaje (paneles derechos de la Figura 3-15). El
porcentaje de PUFA, en cambio, es significativamente inferior (Figura 3-15, panel
inferior derecho).
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DISCUSIÓN Está ampliamente reconocido que el desarrollo de la ingeniería genética de
microalgas es un requisito para el avance de la industria microalgal más allá de los
usos actuales en acuicultura y como alimentos saludables. El desarrollo de estas
herramientas biotecnológicas debería estar enfocado sobre especies industrialmen-
te prometedoras, es decir, especies que reúnan cualidades que las hagan útiles para
ser cultivadas masivamente a escala industrial. En este sentido, las numerosas
investigaciones, concentradas fundamentalmente en Chlamydomonas reinhardtii
son útiles, indudablemente, como ciencia básica, pero, en nuestra opinión, las
reivindicaciones del posible uso industrial de esta especie son poco verosímiles.
C. reinhardtii es un alga de agua dulce, con reproducción sexual, de baja veloci-
dad de crecimiento y poco robusta para soportar condiciones extremas de pH,
temperatura, luz, etc. Por esa razón, son cada día más frecuentes los trabajos sobre
especies microalgales más prometedoras tales como, Chlorella y Nannochlo-
ropsis, por ejemplo. Como presentamos al principio de esta tesis, Scenedesmus
almeriensis reúne características que la hacen interesante como microorganismo
industrial y por ello ha sido objeto de desarrollo y aplicación de la ingeniería ge-
nética en esta tesis.
Sensibilidad a los antibióticos de S. almeriensis La mayoría de los trabajos anteriores que habían transformado microalgas
mediante A. tumefaciens habían utilizado el antibiótico higromicina B como agen-
te selectivo con resultados satisfactorios (Kumar et al. 2004; Kathiresan et al.
2009; Anila et al. 2011; Cha et al. 2011; Cheng et al. 2012). La concentración de
Hyg usada no había sobrepasado los 30 mg/L en ningún caso. Por consiguiente,
con S. almeriensis, ensayamos concentraciones de Hyg en torno a este valor, des-
de 2-100 mg/L y llegamos a la conclusión de que entre 10-15 mg/L de Hyg, com-
binada con la presencia de Cef a 250 mg/L, era una concentración selectiva para
S. almeriensis que podía ser útil y, de hecho, lo fue, pues nuestros primeros clones
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transgénicos de S. almeriensis se seleccionaron en esas concentraciones de anti-
bióticos.
No obstante, con posterioridad, coincidiendo con un nuevo lote de Hyg, se
dieron algunos resultados inesperados obteniéndose un excesivo número de esca-
pes, es decir colonias resistentes a Hyg que no resultaron estar transformadas.
Pensamos que estas anomalías podrían ser atribuidas a variaciones en el contenido
de antibiótico activo entre los lotes de dicho antibiótico. (Estas variaciones eran
evidentes a simple vista al menos en lo que respecta al color de la suspensión de
higromicina que variaba notoriamente desde un marrón claro casi amarillo a un
marrón pardo profundamente oscuro.)
Sin embargo, ninguno de los trabajos anteriores sobre transformación de
microalgas de agua dulce con A. tumefaciens, recoge ningún problema con el uso
de la higromicina como antibiótico de selección, siendo su uso generalizado
(Kumar et al. 2004; Kathiresan et al. 2009; Anila et al. 2011; Cheng et al. 2012;
Cha et al. 2012). En cualquier caso, aún ignorando la causa de estos resultados
anómalos, optamos por cambiar de antibiótico de selección.
En agudo contraste, el comportamiento frente a la zeocina ha sido consis-
tente y repetitivo.
El gen Shble proporciona resistencia frente a los antibióticos Zeo y Phl y
había sido usado con éxito en la transformación de varias microalgas (Apt et al.
1996; Falciatore et al. 1999; Zaslavskaia et al. 2000). En nuestro propio laborato-
rio, lo habíamos utilizado satisfactoriamente en la transformación de T. chuii
(Úbeda-Mínguez et al. 2014). De modo que, era sencillo cambiar el gen de resis-
tencia ya que disponíamos incluso del vector pCAMShble con el gen Shble incor-
porado. Tras ensayar ambos antibióticos, Zeo y Phl, optamos por usar Zeo a una
concentración de 10 mg/L, concurrentemente con Cef a 250 mg/L. Estas concen-
traciones de trabajo han funcionado correctamente en todos los experimentos de
transformación llevados a cabo.
Desarrollo de un método de transformación genética El primer objetivo de esta tesis ha sido el desarrollo de un procedimiento
para la transformación genética de S.almeriensis.
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Discusión 87
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El método seguido se ha basado en la utilización de A. tumefaciens. Me-
diante el co-cultivo de células de S. almeriensis con células de A. tumefaciens se
ha conseguido la transferencia del T-DNA del vector (pCAMBIA 1305.1) al ge-
noma nuclear de la microalga. El resultado fueron colonias de células resistentes
al antibiótico higromicina (HygR). Como se ha visto, se utilizó el mismo procedi-
miento con un vector diferente, pCAMShble, también con éxito, obteniéndose este
caso colonias de células resistentes al antibiótico zeocina.
Han sido varias las líneas de evidencia que sostienen el éxito de la trans-
formación genética. La primera de ellas es que las colonias mostraron un fenotipo
resistente a la presencia del antibiótico utilizado como agente selectivo, bien fren-
te a higromicina (HygR) o bien frente a zeocina (Zeo
R). La manifestación de este
fenotipo es indicativa de la presencia del gen correspondiente, hpt (HygR) o Shble
(ZeoR), en el genoma nuclear de la microalga procedente del T-DNA insertado
como resultado del proceso de transformación. La segunda línea de evidencia
proviene de los resultados obtenidos mediante PCR, en los que se vio que apare-
cían los fragmentos de amplificación esperados correspondientes a los genes
Shble y GUS. Por consiguiente, se evidenciaba de nuevo, por una metodología
diferente, la presencia en el genoma de la microalga de los genes transferidos me-
diante el T-DNA. En tercer lugar, como hemos visto, los clones transformados
mostraban actividad enzimática β-glucuronidasa (GUS), significativamente supe-
rior a la actividad basal determinada en la cepa silvestre. No obstante, se observa-
ba que la actividad enzimática GUS de los clones de S. almeriensis era bastante
inferior al de un clon transgénico de T. chuii que se utilizó como control positivo
de la reacción (el significado de esta observación será discutido posteriormente).
El hecho de que los clones transgénicos de S. almeriensis mostrasen actividad
enzimática GUS demostraba de nuevo la presencia en el genoma nuclear de la
microalga del gen GUS pero, además, ponía de manifiesto, que el gen se estaba
transcribiendo activamente y el mensajero resultante era traducido eficazmente en
una proteína completamente activa. En cuarto lugar, las células transformadas con
DGAT1 o DGAT2, mostraban, después de la PCR, bandas correspondientes a los
fragmentos de amplificación esperados para cada uno de esos genes. Finalmente,
la última evidencia sería la modificación observada en la composición lipídica en
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determinados clones transgénicos que solo tendría explicación por la presencia y
actividad de un gen DGAT. Por consiguiente, las evidencias acumuladas son
abrumadoras sosteniendo la realidad de la transformación de las células de S. al-
meriensis en un buen número de experimentos diferentes y con diversas metodo-
logías independientes.
Como se ha visto, el procedimiento funcionó con dos tipos de vectores con
diferentes marcadores de selección, hptII (HygR) y Shble (Zeo
R/Phl
R), para dos
antibióticos distintos, higromicina y zeocina, respectivamente. Métodos esencial-
mente idénticos han sido utilizados en nuestro laboratorio para transformar con
éxito otras dos especies de microalgas, T. chuii (Úbeda-Mínguez et al. 2014) y N.
gaditana (resultados no publicados). Procedimientos similares han sido utilizados
con éxito por otros investigadores con C. reinhardtii (Kumar et al. 2004), H. plu-
vialis (Kathiresan et al. 2009), D. salina (Anila et al. 2011), C. vulgaris (Cha et al.
2012), y Schizochytrium (Cheng et al. 2012). Esto pone de manifiesto que la trans-
formación mediada por Agrobacterium puede funcionar de modo muy generaliza-
do con muy diferentes especies de microalgas, especialmente dentro del grupo de
las algas verdes (clorofitas). El procedimiento es sencillo y no requiere equipa-
mientos costosos (ej. pistola de partículas) o preparar las células de algún modo
especial (ej. sin pared). Además, en general, es mucho más eficiente que los mé-
todos que no utilizan Agrobacterium.
Respecto de los valores de operación óptimos para los diferentes factores
que influyen sobre la eficiencia de la transformación, en nuestro caso, de los siete
factores ensayados, solo la temperatura resultó ser determinante. La temperatura
adecuada resultó ser la inferior usada (22 °C) mientras que en un reciente trabajo
publicado por nuestro laboratorio (Úbeda-Mínguez et al. 2014) encontrábamos la
tendencia opuesta en la transformación de T. chuii, para la cual se encontró que 27
°C era la temperatura más efectiva (Úbeda-Mínguez et al. 2014). Se sabe que
temperaturas superiores a 32 ºC inhiben los genes vir de Agrobacterium (Cha et
al. 2012). disminuyendo o aboliendo completamente la capacidad infectiva de la
bacteria que es necesaria para la transferencia del T-DNA. C. vulgaris fue trans-
formada usando intervalos de temperatura de 24-25 ºC, superiores a los 23 ºC
usados en C. reinhardtii (Kumar et al. 2004) y los 22 ºC reportados para H. plu-
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vialis (Kathiresan et al. 2009). La temperatura parece ser un factor crítico sobre la
eficiencia del proceso pero no se observa que haya un modelo a seguir sino que
hay que determinar en cada caso (para cada especie) la temperatura óptima.
La literatura publicada sobre transformación de microalgas mediada por
Agrobacterium (Kumar et al. 2004; Kathiresan et al. 2009; Anila et al. 2011; Cha
et al. 2011; Cha et al. 2012; Cheng et al. 2012; Úbeda-Mínguez et al. 2014) refleja
algunas tendencias comunes (por ejemplo, la preferencia por un pH fuertemente
ácido durante el co-cultivo) y muchas variaciones en la mayoría de los parámetros
del procedimiento. Todo ello sugiere, como cabría esperar, que los valores ópti-
mos de operación dependen de la especie que se pretende transformar, y deben ser
ajustados en cada caso. Por ejemplo, la presencia de luz durante el co-cultivo era
clave en la transformación de H. pluvialis (Kathiresan et al. 2009), en cambio,
resultó irrelevante tanto en la transformación de T. chuii (Úbeda-Mínguez et al.
2014) como en S. almeriensis. En general, los valores sugeridos como óptimos
para S. almeriensis coinciden con los propuestos para T. chuii (Úbeda-Mínguez et
al. 2014) y C. vulgaris (Cha et al. 2012), con las salvedades indicadas.
Las colonias crecidas en medio selectivo, ZeoR (recuérdese que al princi-
pio transformamos con el vector pCAMBIA 1305.1 por lo que inicialmente obtu-
vimos colonias HygR), eran rutinariamente transferidas a medio sólido fresco con
10 mg/L de Zeo siguiendo el procedimiento descrito anteriormente que asegura el
máximo contacto de cada célula con el antibiótico. Las transferencias se hacían
cada mes aproximadamente. Algunos de los clones transgénicos han sido transfe-
ridos de este modo más de 3 años sin haber perdido su resistencia a la zeocina. Por
otra parte, también se han cultivado clones en medio líquido sin Zeo durante 6
meses y cuando se han plaqueado estos cultivos en medio selectivo con 10 mg/L
de Zeo han demostrado ser ZeoR. Parece pues fuera de toda duda que los clones
transgénicos son genética y fenotípicamente estables, condición muy importante
para una presunta aplicación práctica.
La eficiencia de transformación fue calculada como la ratio entre el núme-
ro de colonias ZeoR crecidas en las placas de los experimentos de transformación
y el número inicial de células. La eficiencia estimada del método de transforma-
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ción fue de alrededor de 10-4
colonias por célula que es de un orden similar al de-
terminado en T. chuii (Úbeda-Mínguez et al. 2014), C. reinhardtii (Kumar et al.
2004), H. pluvialis (Kathiresan et al. 2009), y D. salina (Anila et al. 2011), todas
ellas del phyllum Chlorophyta y transformadas mediante Agrobacterium. Eficien-
cias significativamente inferiores fueron determinadas en dinoflagelados (ten
Louis 1998) y diatomeas (Apt et al. 1996; Dunahay et al. 1996) transformadas
con otros procedimientos.
La transformación genética es una técnica multi-propósito que no condi-
ciona el tipo de aplicación al que vaya destinada. El procedimiento de transforma-
ción desarrollado, junto con las técnicas auxiliares, abre la puerta a su aplicación
para diversos fines tales como, la producción de fármacos, proteínas recombinan-
tes, o cualquier otra sustancia de interés. Asimismo puede ser utilizado para modi-
ficar el metabolismo de la microalga para adecuarlo a algún propósito concreto
como, por ejemplo, la producción de aceite para ser utilizado en la fabricación de
biodiesel. De hecho, como veremos un poco más adelante, parte de esta tesis ha
estado dedicada a prospectar las posibilidades de la técnica para incrementar el
contenido de aceite en la microalga.
Problemática del nivel de expresión
El éxito del procedimiento de transformación no está exento de algunos
problemas que probablemente requerirán mejoras técnicas. Nos estamos refiriendo
concretamente al hecho del bajo nivel de expresión del gen GUS. Como se ha vis-
to, en general, no conseguimos suficiente actividad GUS como para obtener la
esperada coloración azul en el ensayo histoquímico. Además, aunque se obtuvie-
ron resultados positivos respecto de la actividad enzimática GUS con extractos
proteicos, ésta era muy inferior a la demostrada por el control positivo (un clon
transgénico de T. chuii). Esta situación sugiere un problema de silenciamiento del
transgén, circunstancia que han sido descrita como un problema común en el te-
rreno de la transformación genética de microalgas, en concreto (León y Fernández
2007), y de plantas, en general.
En transformaciones de Nicotiana benthamiana con construcciones que
portaban el promotor 35S y el gen GFP, se ha sugerido, que podrían haber sido
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reconocidas en plantas como una secuencia parásita ubicua y, por lo tanto, susci-
tado el silenciamiento génico dependiente de homología (HDGS, “homology-
dependent gene-silencing”), un mecanismo de silenciamiento transcripcional que,
a través de la hipermetilación de la región promotora, controla la difusión de ele-
mentos transponibles o de virus, reprimiendo y, en algunos casos, suprimiendo
permanentemente la transcripción (Lee et al. 2012). El proceso de silenciamiento
del 35S parece ser gradual y progresivo, avanzando con el curso de las generacio-
nes. La respuesta HDGS se desencadena por promotores virales dobles, integra-
ción de T-DNA multicopia o por silenciamiento génico endógeno (Lee et al.
2012) por lo que se recomienda escoger plantas transformadas que tengan un úni-
co T-DNA integrado.
En Arabidopsis thaliana se demostró que el nivel de integraciones de T-
DNA que estaban silenciadas era mucho más elevado de lo que habitualmente se
suponía (Francis y Spiker 2005). También se ha visto que la repetición de los
mismos promotores en una construcción de transformación en algunos casos pro-
mueve el silenciamiento transcripcional a través de la metilación e inactivación
del promotor (Peremarti et al. 2010). Concretamente, todas las plantas contenien-
do más de una única inserción de T-DNA estaban metiladas en el “enhancer” del
CaMV35S y su actividad estaba reducida (Peremarti et al. 2010). Estudios en to-
mate, recientes, han demostrado que hay una correlación entre el silenciamiento y
el número de inserciones (Khuong et al. 2013).
Buena parte, si no la totalidad, de las circunstancias mencionadas como
promotoras de silenciamiento génico, son pertinentes o de aplicación a nuestro
caso. Tenemos el gen GUS controlado por un promotor 35S que hemos visto pro-
penso a ser silenciado, especialmente cuando está repetido (nuestro T-DNA con-
tiene un promotor 35S y un doble promotor 35S en el que la secuencia “enhancer”
está duplicada).
Refiriéndonos al caso de las microalgas, el silenciamiento se ha considera-
do como la causa probable de la falta de expresión de un gen de fusión, gfp-gusA,
en C. vulgaris transformada con la misma cepa de A. tumefaciens usada por noso-
tros y bajo el control del mismo promotor utilizado en S. almeriensis, el 35S del
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CaMV (Cha et al. 2012). En dinoflagelados, aunque usaron un método de trans-
formación diferente (“silica carbide whiskers”), el gen GUS estaba controlado por
el mismo promotor, se producía un decaimiento progresivo de la expresión del
gen hasta desaparecer completamente a los 6 meses de cultivo libre de antibióti-
cos. La presencia continua de antibióticos frenaba la caída pero no la impedía (ten
Lohuis y Miller 1998).
Recientemente, hemos demostrado un problema similar en T. chuii donde
el silenciamiento génico (evidenciado por la pérdida de la tinción GUS) se esta-
blecía progresivamente entre la progenie de una línea transgénica clonal (Úbeda-
Mínguez et al. 2014). En ambos casos (en S. almeriensis y en T. chuii) el proble-
ma parece tener un origen idéntico, el promotor 35S del CaMV, que parece inca-
paz de dirigir la expresión del gen GUS hasta un nivel conveniente. No obstante,
hay diferencias notables entre ambos casos, o sea, entre ambas microalgas. En S.
almeriensis en general los clones transgénicos no mostraron tinción, salvo un caso
aislado, por contra, generalmente todos los clones transgénicos de T. chuii se te-
ñían de azul. Y, aunque se detecta actividad enzimática GUS en S. almeriensis,
como se ha visto, ésta es muy inferior a la determinada para el clon transgénico de
T. chuii utilizado como control positivo. Más notable es la diferencia con la gene-
ralidad de las microalgas transformadas mediante A. tumefaciens, en las que no se
ha encontrado ningún problema de actividad GUS controlada por el promotor 35S
(Kumar et al. 2004; Kathiresan et al. 2009; Cheng et al. 2012). Lo que proporcio-
na soporte adicional a la afirmación antes realizada de que el comportamiento
parece ser específico de la especie.
Asimismo, llama la atención que el gen Shble no haya sido nunca silencia-
do de forma apreciable, a pesar de estar ligado al gen GUS en el T-DNA. Se pue-
de especular sobre mecanismos de silenciamiento que afecten de manera diferente
a diferentes regiones del DNA (ej. la metilación) o que la vida media de los dos
mensajeros sea diferente, etc. Alternativamente, la diferencia existente entre los
promotores de GUS (35S simple) y de Shble (2x35S más “enhancer”) podría ex-
plicar el diferente silenciamiento. Pudiera ser que el 2x35S con el “enhancer” es-
tuviese parcialmente silenciado, y pese a ello, mantuviese una actividad residual al
menos suficiente para otorgar resistencia frente a Zeo. Claramente, se requieren
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estudios adicionales para elucidar el mecanismo particular que causa este fenó-
meno.
Transformación con genes DGAT Como hemos comentado repetidamente, nos propusimos avanzar una po-
sible aplicación del procedimiento de transformación desarrollado ensayando su
utilidad para incrementar el contenido en TAG. Con esta finalidad, introdujimos
en el genoma nuclear de S. almeriensis bien el gen EpDGAT1 o bien el gen
CrScDGAT2, controlados ambos genes por secuencias reguladoras (promotor y
terminador) procedentes de C. reinhardtii. En esta tesis discutimos los resultados
obtenidos a partir de 30 clones DGAT1 y 4 clones DGAT2.
Análisis de conglomerados: SD2C7 y SD1E52 diferentes
La gran mayoría de los clones son esencialmente similares en su composi-
ción de ácidos grasos agrupándose en un conglomerado caracterizado por tener la
composición mostrada por el grupo II de la Tabla 3-9: 13,8 mg/g de 16:0, 20,6
mg/g de 18:1n9 y 17,0 mg/g de 18:3n3, valores muy inferiores a los otros grupos.
El análisis de conglomerados detecta la excepcionalidad del clon SD2C7 que
constituye en exclusiva el grupo III con 20,8 mg/g de 16:0, 33,1 mg/g de 18:1n9 y
32,3 mg/g de 18:3n3, los valores superiores de todos los determinados. Asimismo
destaca el clon SD1E52 que constituye el grupo I con SWT (la cepa silvestre)
diferenciándose del SD2C7 esencialmente por un menor contenido en ácido α-
linolénico (18:3n3). Tendremos ocasión de destacar repetidamente estos dos clo-
nes, SD2C7 y SD1E52 a lo largo de esta discusión.
Estructura de la variación
Mediante el análisis de la varianza encajado pudimos cuantificar la estruc-
tura de la variación de nuestros datos sobre la composición en ácidos grasos. Dis-
tinguimos tres niveles jerárquicos de factores que contribuyen a la variación: el
transgén, el clon, y el error experimental. La variación debida al transgén es la
originada por estar transformada con DGAT1 o DGAT2. La variación debida al
clon es la originada por diferencias inter-clonales en el sitio de inserción del T-
DNA dentro del genoma de la microalga, por el número de copias del T-DNA que
se han insertado, etc. Finalmente el error experimental recoge todas las demás
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fuentes de variación, por ejemplo, diferencias entre muestras de biomasa, diferen-
cias entre dos análisis, etc.
Los dos primeros factores (transgén y clon) eran la causa principal de la
variación, siendo en todos los casos, cuantitativamente superiores al error experi-
mental. Esto indicaba que los factores genéticos eran los principales determinantes
de la variación en la composición en ácidos grasos y que el error experimental,
aunque notable en algunos casos, había estado bien controlado generalmente. Di-
cho de otro modo, las diferencias en el contenido de ácidos grasos eran debidas,
fundamentalmente, a la transformación genética. O sea, la transformación con
genes DGAT tenía un impacto reconocible en la composición en ácidos grasos de
las células de S. almeriensis. Cuando se realizaron los experimentos, uno de los
supuestos implícitos era, que la introducción de un gen DGAT debería afectar la
composición lipídica de las células transformadas. Los resultados que estamos
discutiendo proporcionan soporte a esta hipótesis: los genes DGAT estaban efec-
tivamente modificando la composición lipídica de las células transformadas. Aun-
que este tipo de análisis no nos dice nada sobre la dirección de esos cambios que
serán discutidos posteriormente.
Por otra parte, el componente de la variación debida al clon era en todos
los casos excepto uno, bastante superior cuantitativamente (Tabla 3-8). Además,
sin necesidad de recurrir a complicados análisis estadísticos, la mera inspección
ocular de los datos de composición en ácidos grasos nos transmite la heterogenei-
dad existente entre los clones transgénicos, incluso los transformados con el mis-
mo tipo de gen DGAT. Dado que todos los clones de una línea de transformación,
supuestamente, reciben el mismo T-DNA, en principio, desde un punto de vista
simple, lo que hubiera cabido esperar es un comportamiento groseramente homo-
géneo de todos los clones transformados con un mismo gen y diferencias mayores
con los clones transformados con el otro gen. Por el contrario, como hemos hecho
notar, las diferencias entre los clones dentro de una misma línea de transgénicos
son las más importantes. Esto sugiere que, al menos dentro de la muestra de clo-
nes transgénicos que hemos estudiado, las circunstancias que cambian de un clon
a otro (el número de copias del T-DNA insertadas en el genoma, el sitio de inser-
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ción, etc.), tienen una importancia mayor que el tipo de gen DGAT que se ha in-
troducido.
Heterogeneidad entre clones de la misma línea transgénica
Numerosos estudios de transformación en plantas superiores ponen de
manifiesto una gran heterogeneidad entre los clones de una misma línea de trans-
formación que obliga a seleccionar solo los clones mejores dentro de cada línea de
transformación. “Aparentemente, vastas diferencias en el nivel de expresión de los
genes introducidos son observadas entre plantas transgénicas generadas bajo idén-
ticas condiciones y usando la misma construcción transgénica” (Butaye et al.
2005). “De hecho, la transformación genética de plantas resulta generalmente en
una alta frecuencia de plantas caracterizadas por una expresión no deseada e im-
predecible del transgén. […] Por ejemplo, la expresión β-glucuronidasa dirigida
por el promotor 35S del CaMV parece producir un patrón de expresión típicamen-
te bimodal caracterizado por múltiples bajo-expresadores de un lado y unos pocos
alto-expresadores por otro lado” (Butaye et al. 2005).
Dentro de cada clon es donde menos variación se produce pues todos los
descendientes de un clon son verdaderamente idénticos en todos sus genes y de-
más elementos genéticos auxiliares. Cada evento de transformación es eventual-
mente diferente de cualquier otro evento pese a que la transformación se esté lle-
vando a cabo con el mismo procedimiento.
Efecto global de los dos transgenes
Lo que se está diciendo no significa que no se estén produciendo efectos
debidos al tipo de transgén (DGAT1 o DGAT2). El impacto del tipo del transgén
se deja notar cómo se vio en la Tabla 3-11. En dicha tabla vimos que la DGAT2
daba lugar a un aumento del contenido (mg/g) en 18:3n3, en PUFA y en ácidos
grasos totales, por ejemplo. Estos y otros efectos adicionales pueden ser observa-
dos inspeccionando la Tabla 3-11 y mirando la Figura 3-16. Aparentemente, el
gen DGA1, procedente de Saccharomyces cerevisiae, que es de la familia DGAT2
(por eso lo hemos denominado como CrScDGAT2) sobre-expresándose en S. al-
meriensis da lugar a un incremento especial de ALA respecto del gen EpDGAT1.
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Estos resultados parecen contradictorios con nuestra caracterización de la
actividad enzimática de EpDGAT1 (Mañas-Fernández et al. 2009). En su momen-
to pusimos de manifiesto que la proteína codificada por el gen de Echium pitardii
tenía preferencia por los ácidos grasos poliinsaturados, 18:3n3 entre ellos, de tal
modo que la sobre-expresión del gen daba lugar a un incremento significativo de
PUFA. De hecho, nuestros propios datos de otras especies de microalgas trans-
formadas sostienen esta especificidad enzimática.
Hemos transformado T. chuii y C. reinhardtii (esta última especie en un
trabajo en colaboración con el equipo de León Bañares de la Universidad de
Huelva, que se encargó de la transformación y cultivo) introduciendo en las célu-
las microalgales el mismo módulo de expresión que en S. almeriensis con resulta-
dos diametralmente opuestos (resultados propios no publicados). En estas especies
la presencia del gen EpDGAT1 en los clones transgénicos determina incrementos
significativos de 18:3n3 y de PUFA, concurrentemente con una disminución sig-
nificativa de 18:1n9. Por consiguiente, parece ser que el efecto de un determinado
transgén no es independiente del entorno biológico en el cual se integra sino que,
las características metabólicas de la especie receptora pueden condicionar sensi-
blemente el resultado final de la sobreexpresión de un transgén.
Comparaciones con la cepa silvestre
Como se acaba de discutir, el tipo de transgén tenía un impacto constatable
sobre la composición en ácidos grasos y, como discutimos un poco antes, el tipo
de clon individual era todavía más determinante sobre la composición lipídica
(Tabla 3-8). Prácticamente la totalidad de las variables lipídicas mostraron dife-
rencias significativas entre clones. Comparando todos ellos con la cepa silvestre,
observamos que son significativamente diferentes (superiores o inferiores) respec-
to de ésta la mayoría de los clones transgénicos, tanto DGAT1 como DGAT2 (Ta-
bla 3-12). Esto quiere decir que la transformación con genes DGAT tenía un im-
pacto fundamental sobre la composición en ácidos grasos confirmando plenamen-
te las expectativas sobre la importancia de la actividad DGAT sobre la composi-
ción lipídica. Estudios previos en plantas superiores habían confirmado la impor-
tancia tanto de DGAT1 como de DGAT2 sobre la composición lipídica. La pre-
ponderancia de una u otra dependía de la especie vegetal en concreto. Un patrón
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emergente general parecía ser que la DGAT1 era de capital importancia en las
plantas con ácidos grasos comunes en tanto que la DGAT2 era fundamental en
especies caracterizadas por tener ácidos grasos raros (para una revisión reciente
véase (Liu et al. 2012)
Efecto sobre el contenido de TFA
El efecto de la transgénesis sobre el contenido en ácidos grasos totales (va-
lores de TFA) fue generalmente negativo. Por ejemplo, 28 sobre 30 clones
DGAT1 fueron inferiores significativamente en su contenido en TFA. Ninguno
fue significativamente superior (el clon SD1E52 está cerca de ser estadísticamente
superior pero no lo es). En cambio, entre los cuatro clones transgénicos DGAT2
estudiados, dos fueron inferiores, uno significativamente superior (SD2C7), y uno
indiferenciable de la cepa silvestre. En términos porcentuales el clon SD1E52
exhibió un incremento del 7,5%, modesto y estadísticamente no significativo. En
cambio, el clon SD2C7 mostraba un incremento de 22,4% que era estadísticamen-
te significativo y muy notable desde el punto de vista práctico.
Esto viene a coincidir de nuevo con lo comentado anteriormente: unos po-
cos de los transgénicos que sobre-expresan un gen son mejores que el WT y la
mayoría son peores (Butaye et al. 2005).
Estos resultados parecen indicar un mayor efecto de DGAT2 sobre TFA
dado que 1 de 4 clones estudiados muestra un contenido muy superior a la cepa
silvestre mientras que 1 de 30 clones DGAT1 muestra un contenido superior pero
sólo muy ligeramente (7,5%) y siendo no significativo estadísticamente. Se nece-
sitarían más clones DGAT2 analizados para verificar si este indicio se confirma
más sólidamente. No obstante, con los datos presentes, se puede pensar en la ex-
plicación más simple y obvia, que la actividad de la proteína CrScDGAT2 es ma-
yor que la de la proteína alternativa, EpDGAT1, bien por las propias característi-
cas de cada una de ellas o bien como resultado del entorno metabólico propio de
S. almeriensis. Pero también se puede especular que la secuencia del gen CrScD-
GAT2 se sintetizó optimizada para el sesgo en el uso de codones de C. reinhardtii
mientras que la del gen EpDGAT1 no fue optimizada sino que retiene los codones
usados por una planta superior de la familia Boraginaceae, Echium pitardii. Esta
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diferencia podría haber determinado una traducción más ineficiente de EpDGAT1
y, en consecuencia, menor producción de la enzima DGAT1.
Los datos todavía no publicados de nuestro laboratorio sobre otras algas
verdes nos proporcionan otra visión. En T. chuii se han analizado idéntico núme-
ro (12) de clones transgénicos para ambos genes, y los módulos de expresión eran
idénticos a los usados en S. almeriensis. Pues bien, en T. chuii el clon transgénico
de más alto contenido en TFA está transformado con EpDGAT1 y supera el con-
tenido del clon silvestre en 39% mientras que el clon transgénico DGAT2 de más
alto contenido en TFA sólo tiene un incremento de un 6%. Conociendo estos da-
tos, las especulaciones anteriores probablemente deberían descartarse y remitir las
diferencias observadas al limitado tamaño muestral estudiado en todos los casos
(como máximo 30, que es un tamaño muestral razonable pero tampoco excesivo).
Posiblemente, cuando se estudie un mayor número de clones transgénicos de am-
bos tipos será más probable encontrar los clones más raros: los de muy alto conte-
nido en TFA. Aunque, con los datos actuales, podría ser también explicables co-
mo diferentes respuestas de las diferentes especies de microalgas transformadas.
En cualquier caso, los resultados son muy esperanzadores si consideramos
que con una muestra limitada de clones transgénicos analizados, en nuestro labo-
ratorio, hemos aislado un clon DGAT2 de S. almeriensis con un 22,4% de incre-
mento en TFA y otro DGAT1 de T. chuii con un 39% (datos propios no publica-
dos).
Resultados de la transformación con DGAT en plantas
Las evidencias existentes en plantas superiores demuestran que la activi-
dad DGAT soporta la mayor contribución a la síntesis de TAG en semillas (Bao y
Ohlrogge 1999; Cahoon et al. 2007). El mutante AS11 de Arabidopsis, que tiene
una actividad DGAT reducida, mostraba una reducción del 75% de los lípidos de
la semilla (Katavic et al. 1995). A la inversa, la sobre-expresión de DGAT1 de-
terminaba un incremento neto en los lípidos de la semilla en Arabidopsis (Jako et
al. 2001). Evidencias adicionales han sido publicadas en estudios de soja (Settlage
et al. 1998), colza (Perry et al. 1999), olivo (Giannoulia et al. 2000) y maíz
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(Zheng et al. 2008). De tal modo que el papel de la actividad DGAT en la síntesis
de TAG, especialmente en semillas, está bien establecido. Sin embargo, los resul-
tados obtenidos en plantas superiores con sobre-expresión de alguna DGAT han
sido más bien modestos.
Se transformó soja (Glycine max) con un gen DGAT2 de un hongo (Umbe-
lopsis ramanniana) que por sobre-expresión dio lugar a un incremento en aceite
del 1,5% (Lardizabal et al. 2008). En canola (un tipo de colza especial) se sobre-
expresó el gen DGAT1 de Brassica napus y el de A. thaliana consiguiéndose au-
mentos en el contenido de aceite de la semilla del 1,5% y superiores (Weselake et
al. 2008; Taylor et al. 2009). Experimentos similares produjeron resultados de
similar magnitud (véase la revisión de (Liu et al. 2012).
Transformación con DGAT en microalgas
Los primeros intentos de transformación de microalgas para incrementar el
contenido en aceite se hicieron en diatomeas, sobre-expresando la acetil-CoA car-
boxilasa (ACC) y fracasaron completamente (Dunahay et al. 1996). Hasta donde
sabemos, hay muy pocos experimentos de transformación y sobre-expresión de
genes DGAT en microalgas.
El problema se complica en microalgas por la existencia de múltiples ge-
nes DGAT. Aparentemente hay un solo gen DGAT1 en tanto que son numerosos
los genes DGAT2. Por ejemplo, en C. reinhardtii hay un único gen DGAT1, que ni
siquiera ha podido ser probado por faltar un fragmento de la secuencia que parece
ser recalcitrante a la secuenciación (Boyle et al. 2012). En cambio hay hasta cinco
genes DGAT2 en C. reinhardtii (Boyle et al. 2012; Deng et al. 2012; La Russa et
al. 2012). así como en otras algas verdes (para una revisión véase (Chen y Smith
2012)), llegando hasta diez en Nannochloropsis.
En el caso de los genes DGAT2 de C. reinhardtii, a la redundancia génica
se une una nomenclatura confusa donde unos han denominado los genes como
DGTT1, DGTT2, etc. (Boyle et al. 2012), otros como DGAT2a, DGAT2b, etc. (La
Russa et al. 2012) y otros como DGAT2-1, DGAT2-2, etc. (Deng et al. 2012), con-
tribuyendo a hacer confuso el tema.
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Se han estudiado algunos genes DGAT pero, habitualmente, sobre-
expresándolos en levaduras con el mero propósito de demostrar la funcionalidad y
caracterizar la actividad. Por ejemplo, en el cuádruple mutante deficiente en TAG
de S. cerevisieae se ensayó el gen PtDGAT2B demostrándose su funcionalidad y
su preferencia por FA insaturados de 16C y 18C (Gong et al. 2013). Hasta el mo-
mento, la única DGAT1 de microalgas que se ha caracterizado bioquímicamente
ha sido la de P. tricornutum en un sistema de levadura (Guihéneuf et al. 2011).
También se ensayaron cuatro de los cinco genes DGAT2 que hay en C. reinhardtii
en una estirpe mutante de levadura (Hu et al. 2013). Sin aportar novedad alguna al
mismo tipo de experimento llevado a cabo anteriormente también con el sistema
de levaduras sensibles a ácido oleico (Boyle et al. 2012).
En el primer estudio en que se sobre-expresaron tres de los genes CrD-
GAT2 (a, b, y c, en la terminología de (La Russa et al. 2012)) en la propia especie:
[…] the relative Nile Red fluorescence signals in all strains increased ca. 6.6-9.8 times
when the cells were subjected to nitrogen or sulfur starvation conditions.
However, no statistically significant difference could be observed when the wt was com-
pared to the overexpression strains under any condition tested.
Por lo que se concluía que la cantidad de transcrito de cada uno de los genes
DGAT2 no jugaba ningún papel en la acumulación de lípidos (La Russa et al.
2012). Como tampoco afectaba a la composición de ácidos grasos in vivo la sobre-
expresión de ninguno de los tres genes (La Russa et al. 2012).
En una carta al editor (Deng et al. 2012) proporcionaban datos muy limita-
dos aunque interesantes sobre “noqueo” por RNAi y sobre-expresión de algunos
de los genes DGAT2 de C. reinhardtii. En este desgraciado, por confuso, panora-
ma, resultaba que CrDGAT2-5 (=CrDGAT2a =¿CrDGTT1?) al ser sobre-
expresado incrementaba un 48% el contenido lipídico y sobre-expresado en el
sistema de levaduras, el incremento fue de 17% (Deng et al. 2012). En abierta
contradicción, el mismo gen, llamado en este caso CrDGAT2a, no produjo cambio
alguno en el contenido lipídico al ser sobre-expresado en la propia especie, como
hemos visto antes (La Russa et al. 2012). También se publicaron resultados con-
tradictorios para el gen CrDGAT2-4 (=CrDGAT2d) (Deng et al. 2012; La Russa et
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al. 2012). Todos estos resultados procedían de experimentos en los que se cultivó
C. reinhardtii en condiciones estándar, sin limitación de nutrientes.
Recientemente (Iwai 2014), se ha demostrado que algunas líneas transgé-
nicas de C. reinhardtii transformadas con DGTT4 (=¿CrDGAT2d? =¿CrDGAT2-
4?) bajo el control de un promotor inducible por deprivación de P, crecidas hasta
fase logarítmica y transferidas después a un medio sin P, incrementaban notable-
mente su contenido en TAG comparadas con la línea control, después de 8 días en
ausencia de P. El resultado es interesante como demostración de la posible utili-
dad del promotor inducible por deprivación de P pero no encontramos que sea un
avance en el objetivo de definir un procedimiento para incrementar la producción
de TAG. El cultivo con limitación de P crece peor que uno en medio sin limita-
ción y, aunque tenga más contenido en TAG, en último término puede que pro-
duzca menos en términos de tiempo.
Recientemente, también, se ha sobre-expresado una DGAT2 de P. tricor-
nutum en la propia microalga, flanqueado el gen por el promotor fcpC y el termi-
nador fcpA de la misma especie (Niu et al. 2013). Se determinó un “35% de in-
cremento en el contenido en lípidos neutros por célula medido por tinción fluores-
cente de Nile Red” (Niu et al. 2013). El contenido en NL de las células WT fue
27,5% en peso seco determinado gravimétricamente (Niu et al. 2013). Este trabajo
presenta un cúmulo de omisiones que cuestionan su validez. Primero, no se dice
nada sobre el número de líneas transgénicas obtenidas y utilizadas en los cálculos,
aspecto muy importante puesto que, como hemos visto con todo detalle, las dife-
rencias en composición en ácidos grasos entre las diferentes líneas transgénicas
generadas con una misma construcción suelen ser grandes —en plantas y en mi-
croalgas—. No es extraño, dentro de esta peculiar publicación, que los datos de
composición en ácidos grasos de su Tabla 1 aparezcan sin error estándar ni ningún
otro estadístico de dispersión (varianza, coeficiente de variación, etc.). Segundo,
se habla siempre de NL como asimilándolos a TAG cuando está perfectamente
claro que en los NL hay otros lípidos que no son TAG. Y por último, la determi-
nación del contenido se hace con Nile Red que, además del enorme error experi-
mental que tiene, no es específico de TAG sino de lípidos en general. En este es-
cenario no es extraño tampoco que el incremento en ácidos grasos totales de la
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mencionada Tabla 1, computado por nosotros a partir de los datos de esa tabla, sea
un 35%, ¡exactamente igual al incremento en NL! Y todas las estimaciones sin
error alguno… No parece un estudio que cumpla los estándares mínimos del rigor
científico y por lo tanto debe ser tomado con toda precaución.
En suma, el modesto incremento en TFA del clon transgénico SD1E52,
~6%, situado en perspectiva, aparece como un valor notable y el ~22% del clon
SD2C7 como un valor extraordinario. Si a estos unimos el ~39% de incremento
en TFA de un clon de T. chuii que hemos comentado, todo parece indicar que la
transformación con genes DGAT es muy prometedora como estrategia para in-
crementar notablemente el contenido en TFA en microalgas. Debe tenerse en
cuenta que estos datos proceden de cultivos en pequeño volumen, con simple agi-
tación orbital e iluminación reducida, en un medio (Mann y Myers) sin modifica-
ciones. Habrá que ver si en mejores condiciones de iluminación, disponibilidad de
CO2, y composición del medio adaptada a las necesidades reales del clon transgé-
nico en concreto, mejora la productividad de aceite de la microalga.
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CONCLUSIONES Primera, se ha desarrollado con éxito un método de transformación genéti-
ca para S. almeriensis. El método es sencillo, eficiente y fiable abriendo el camino
para el desarrollo de la producción biotecnológica de substancias en una microal-
ga industrialmente muy prometedora como es S. almeriensis.
Segunda, se ha transformado S. almeriensis con sendos genes DGAT inde-
pendientemente, EpDGAT1 y CrScDGAT2. La introducción de genes DGAT ha
modificado significativamente la composición en ácidos grasos de S. almeriensis.
Tercera, el efecto de ambos genes sobre la composición en ácidos grasos
es diferente: EpDGAT1 provoca un aumento de 18:1n9 y MUFA, en tanto que
CrScDGAT2 determina un aumento de 18:3n3 y PUFA.
Cuarta, se han generado algunos clones con un contenido en ácidos grasos
totales superior a la cepa silvestre de partida. En este sentido destaca significati-
vamente el clon SD2C7 que muestra un contenido en TFA un 28% superior al de
la cepa silvestre.
Quinta, parece verosímil que, tras escrutar un número sensiblemente ma-
yor de clones transgénicos DGAT2 se puedan encontrar algunos con un incremen-
to en TFA superior al 28% hasta ahora encontrado.
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AGRADECIMIENTOS Estamos muy agradecidos a nuestros colegas, el Dr. José Mª Fernández-
Sevilla (Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Almería), junto con
el Dr. Thomas Friedl y la Dra. Maike Lorenz (University of Gottingen, Germany)
por proporcionarnos la cepa original de Scenedesmus almeriensis.
Este trabajo ha sido económicamente apoyado por la Consejería de Inno-
vación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía (Proyecto P10-CVI-5869), y el
Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Proyecto IPT-
2011-0842-920000).
La estancia de investigación de la doctoranda Yasmeen Dautor ha sido fi-
nanciada por una beca pre-doctoral del Gobierno de Siria.
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117
APÉNDICE
Tabla A1. Medidas de densidad óptica a 600 nm en los cultivos de la cepa silvestre y
de algunos clones transgénicos. El seguimiento se hizo desde el día de la inoculación y
comienzo del cultivo (día 0; DO=0,100) hasta el día 20 como máximo. Cada muestra (M)
fue registrada independientemente.
Clon M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SWT 1 0,100 0,182 0,282 0,504
SWT 2 0,100 0,183 0,297 0,517
SWT 3 0,100 0,166 0,306 0,501
SWT 1 0,100 0,158 0,347 0,430 0,513 0,616 0,668 0,673
SWT 2 0,100 0,112 0,231 0,418 0,490 0,615 0,678 0,716
SWT 3 0,100 0,170 0,293 0,435 0,523 0,624 0,698 0,713
SWT 1 0,100 0,175 0,299 0,486 0,512 0,643 0,690 0,713
SWT 2 0,100 0,182 0,313 0,475 0,515 0,652 0,708 0,721
SWT 3 0,100 0,167 0,291 0,479 0,514 0,645 0,758 0,816
SD1E52 1 0,100 0,121 0,206 0,228 0,314 0,381 0,486 0,548 0,600 0,679
SD1E52 2 0,100 0,116 0,258 0,313 0,398 0,506 0,602 0,677 0,709 0,845
SD1E52 3 0,100 0,195 0,296 0,357 0,473 0,530 0,550 0,717 0,725 0,874
SD1E52 1 0,100 0,204 0,313 0,366 0,452 0,525 0,622 0,755 0,769 0,919
SD1E52 2 0,100 0,186 0,304 0,365 0,431 0,516 0,599 0,715 0,772 0,888
SD1E52 3 0,100 0,180 0,302 0,379 0,441 0,492 0,545 0,730 0,770 0,924
SD1E26 1 0,100 0,382 0,569
SD1E26 2 0,100 0,389 0,608
SD1E26 3 0,100 0,406 0,607
SD1E25 1 0,100 0,386 0,505
SD1E25 2 0,100 0,397 0,530
SD1E25 3 0,100 0,341 0,502
SD1E51 1 0,100 0,459 0,710
SD1E51 2 0,100 0,435 0,646
SD1E51 3 0,100 0,445 0,661
SD1E38 1 0,100 0,412 0,647 0,820
SD1E38 2 0,100 0,436 0,686 0,846
SD1E38 3 0,100 0,431 0,608 0,786
SD1E48 1 0,100 0,290 0,472 0,620
SD1E48 2 0,100 0,280 0,481 0,600
SD1E48 3 0,100 0,305 0,522 0,630
SD1E68 1 0,100 0,382 0,669 0,772
SD1E68 2 0,100 0,389 0,575 0,736
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118
Clon M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SD1E68 3 0,100 0,430 0,666 0,835
SD1E64 1 0,100 0,301 0,502 0,594
SD1E64 2 0,100 0,315 0,496 0,652
SD1E64 3 0,100 0,323 0,510 0,534
SD1E36 1 0,100 0,336 0,495
SD1E36 2 0,100 0,554 0,520
SD1E36 3 0,100 0,326 0,478
SD1E63 1 0,100 0,377 0,549
SD1E63 2 0,100 0,403 0,501
SD1E63 3 0,100 0,391 0,556
SD2C1 1 0,100 0,135 0,186 0,451 0,524
SD2C1 2 0,100 0,148 0,194 0,460 0,520
SD2C1 3 0,100 0,165 0,215 0,488 0,555
SD2C2 1 0,100 0,137 0,237 0,395
SD2C2 2 0,100 0,135 0,243 0,386
SD2C2 3 0,100 0,115 0,219 0,370
SD2C7 1 0,100 0,282 0,330 0,716 0,815
SD2C7 2 0,100 0,262 0,299 0,665 0,769
SD2C7 3 0,100 0,266 0,310 0,673 0,732
SD2C8 1 0,100 0,112 0,183 0,322 0,437
SD2C8 2 0,100 0,117 0,183 0,333 0,465
SD2C8 3 0,100 0,122 0,209 0,362 0,490
SD1E1 1 0,100 0,227 0,373 0,537
SD1E1 2 0,100 0,250 0,395 0,536
SD1E1 3 0,100 0,230 0,385 0,516
SD1E4 1 0,100 0,184 0,337 0,451
SD1E4 2 0,100 0,233 0,327 0,415
SD1E4 3 0,100 0,246 0,396 0,530
SD1E28 1 0,100 0,211 0,506
SD1E28 2 0,100 0,219 0,538
SD1E28 3 0,100 0,224 0,591
SD1E29 1 0,100 0,286 0,665
SD1E29 2 0,100 0,268 0,625
SD1E29 3 0,100 0,266 0,656
SD1E30 1 0,100 0,225 0,596
SD1E30 2 0,100 0,212 0,546
SD1E30 3 0,100 0,212 0,535
SD1E72 1 0,100 0,298 0,494 0,787
SD1E72 2 0,100 0,326 0,506 0,816
SD1E72 3 0,100 0,323 0,514 0,697
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Apéndice 119
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Clon M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SD1E53 1 0,100 0,262 0,593
SD1E53 2 0,100 0,263 0,550
SD1E53 3 0,100 0,281 0,604
SD1E55 1 0,100 0,205 0,439
SD1E55 2 0,100 0,195 0,419
SD1E55 3 0,100 0,190 0,392
SD1E70 1 0,100 0,251 0,532
SD1E70 2 0,100 0,258 0,533
SD1E70 3 0,100 0,294 0,605
SD1E77 1 0,100 0,456 0,781
SD1E77 2 0,100 0,497 0,847
SD1E77 3 0,100 0,424 0,718
SD1E79 1 0,100 0,303 0,612
SD1E79 2 0,100 0,360 0,624
SD1E79 3 0,100 0,451 0,714
SD1E43 1 0,100 0,395 0,739
SD1E43 2 0,100 0,502 0,929
SD1E43 3 0,100 0,437 0,769
SD1E13 1 0,100 0,430 0,768
SD1E13 2 0,100 0,405 0,674
SD1E13 3 0,100 0,401 0,652
SD1E78 1 0,100 0,409 0,673
SD1E78 2 0,100 0,407 0,632
SD1E78 3 0,100 0,395 0,659
SD1E47 1 0,100 0,454 0,746
SD1E47 2 0,100 0,455 0,791
SD1E47 3 0,100 0,470 0,800
SD1E10 1 0,100 0,488
SD1E10 2 0,100 0,548
SD1E10 3 0,100 0,481
SD1E11 1 0,100 0,477
SD1E11 2 0,100 0,441
SD1E11 3 0,100 0,445
SD1E12 1 0,100 0,314
SD1E12 2 0,100 0,285
SD1E12 3 0,100 0,352
SD1E41 1 0,100 0,177
SD1E41 2 0,100 0,155
SD1E41 3 0,100 0,156
SD1E16 1 0,100 0,202 0,557
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120
Clon M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SD1E16 2 0,100 0,181 0,529
SD1E16 3 0,100 0,194 0,550
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.
Apéndice 121
121
Clon M 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20
SWT 1
SWT 2
SWT 3
SWT 1 0,805 0,874 0,914
SWT 2 0,799 0,863 0,900
SWT 3 0,801 0,852 0,900
SWT 1 0,785 0,859 0,989 1,013 1,070 1,120 1,185 1,265 1,317 1,332
SWT 2 0,800 0,845 0,947 1,007 1,040 1,137 1,194 1,272 1,284 1,296
SWT 3 0,831 0,924 1,015 1,096 1,105 1,186 1,226 1,427 1,275 1,330
SD1E52 1 0,765 0,846 0,900
SD1E52 2 0,934
SD1E52 3 0,970
SD1E52 1 1,011 1,055 1,123 1,150
SD1E52 2 0,975 1,085 1,157 1,193
SD1E52 3 1,053 1,089 1,165 1,200
SD1E26 1 0,744 0,790
SD1E26 2 0,650 0,793
SD1E26 3 0,728 0,830
SD1E25 1 0,583 1,150
SD1E25 2 0,660 0,765
SD1E25 3 0,542 0,703
SD1E51 1 0,913 0,977
SD1E51 2 0,850 0,941
SD1E51 3 0,811 0,956
SD1E38 1 0,904
SD1E38 2 0,934
SD1E38 3 0,898
SD1E48 1 0,750
SD1E48 2 0,720
SD1E48 3 0,772
SD1E68 1 0,916
SD1E68 2 0,856
SD1E68 3 0,975
SD1E64 1 1,182
SD1E64 2 1,188
SD1E64 3 1,162
SD1E36 1 0,620
SD1E36 2 0,599
SD1E36 3 0,592
SD1E63 1 0,704
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. Transformación genética de S. almeriensis 122
122
Clon M 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20
SD1E63 2 0,750
SD1E63 3 0,739
SD2C1 1 0,765
SD2C1 2 0,727
SD2C1 3 0,776
SD2C2 1 0,544 0,658
SD2C2 2 0,540 0,688
SD2C2 3 0,486 0,624
SD2C7 1 1,032
SD2C7 2 0,941
SD2C7 3 1,022
SD2C8 1 0,490
SD2C8 2 0,501
SD2C8 3 0,590
SD1E1 1 0,901
SD1E1 2 0,936
SD1E1 3 0,887
SD1E4 1 0,819
SD1E4 2 0,720
SD1E4 3 0,866
SD1E28 1 0,870
SD1E28 2 0,948
SD1E28 3 0,975
SD1E29 1 1,029
SD1E29 2 0,976
SD1E29 3 1,034
SD1E30 1 0,000 0,885
SD1E30 2 0,843
SD1E30 3 0,829
SD1E72 1 0,913
SD1E72 2 1,018
SD1E72 3 1,054
SD1E53 1 0,784 0,931
SD1E53 2 0,830 0,900
SD1E53 3 0,853 0,925
SD1E55 1 0,624 0,719
SD1E55 2 0,607 0,688
SD1E55 3 0,630 0,694
SD1E70 1 0,758 0,860
SD1E70 2 0,781 0,856
Gru
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.
Apéndice 123
123
Clon M 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20
SD1E70 3 0,857 0,930
SD1E77 1 1,080
SD1E77 2 1,169
SD1E77 3 1,020
SD1E79 1 0,875
SD1E79 2 0,900
SD1E79 3 0,997
SD1E43 1 0,995
SD1E43 2 1,175
SD1E43 3 1,046
SD1E13 1 1,074
SD1E13 2 0,900
SD1E13 3 0,906
SD1E78 1 0,911
SD1E78 2 0,896
SD1E78 3 0,906
SD1E47 1 0,999
SD1E47 2 1,064
SD1E47 3 1,070
SD1E10 1 0,870
SD1E10 2 0,967
SD1E10 3 0,944
SD1E11 1 0,941
SD1E11 2 0,877
SD1E11 3 0,880
SD1E12 1 0,733
SD1E12 2 0,805
SD1E12 3 0,888
SD1E41 1 0,677
SD1E41 2 0,680
SD1E41 3 0,656
SD1E16 1 0,884
SD1E16 2 0,907
SD1E16 3 0,929
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. Transformación genética de S. almeriensis 124
124
Tabla A2. Diseño y resultados del experimento de sensibilidad a los antibióticos hi-
gromicina (Hyg) y cefotaxima (Cef). Los datos proporcionados a Statgraphics son el
número de colonias crecidas (Sample 1, etc.). Statgraphics aplica entonces automática-
mente los cálculos correspondientes al diseño experimental.
BLOQUE Hyg Cef Supervivencia Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4
1 10.0 750.0 0 0 0 0 0
1 20.0 500.0 0 0 0 0 0
1 0.0 750.0 26 23 24 27 30
1 20.0 0.0 0 0 0 0 0
1 0.0 500.0 11.75 13 12 12 10
1 30.0 750.0 0 0 0 0 0
1 20.0 250.0 0 0 0 0 0
1 30.0 0.0 0 0 0 0 0
1 30.0 250.0 0 0 0 0 0
1 0.0 250.0 23 23 23 23 23
1 30.0 500.0 0 0 0 0 0
1 10.0 0.0 0 0 0 0 0
1 10.0 500.0 0 0 0 0 0
1 20.0 750.0 0 0 0 0 0
1 0.0 0.0 72.25 71 100 76 42
1 10.0 250.0 0 0 0 0 0
Figura A1. Diagrama de pareto mostrando los efectos de los antibióticos higromicina
(Hyg) y cefotaxima (Cef) en la supervivencia de la cepa silvestre de S. almeriensis.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Superv iv encia
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Efecto estandarizado
B:Cef
AB
A:Hyg
+-
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.
Apéndice 125
125
Tabla A3. Composición en ácidos grasos de la cepa silvestre (SWT) y de los clones transgéni-
cos de S. almeriensis. Datos expresados en mg/g de biomasa seca.
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SWT 0 1 4 1 0,0 18,8 2,6 2,8 0,0 0,0
SWT 0 2 4 1 0,6 15,0 2,2 2,2 0,0 0,6
SWT 0 3 4 1 0,6 16,4 2,7 2,3 0,0 0,6
SWT 0 1 12 3 0,8 20,0 3,2 3,1 0,0 0,6
SWT 0 2 12 3 0,6 17,3 2,5 3,0 0,0 0,5
SWT 0 3 12 3 0,6 15,2 2,2 2,6 0,0 0,5
SWT 0 1 13 3 0,7 17,9 2,9 2,8 0,6 0,7
SWT 0 1 20 4 0,7 23,7 2,9 4,3 0,5 0,6
SWT 0 2 20 4 0,5 15,3 1,9 2,6 0,0 0,0
SWT 0 3 20 4 0,4 14,0 1,5 2,8 0,0 0,3
SWT 0 1 38 5 0,5 15,6 2,3 2,5 0,5 0,6
SD1E1 11 1 12 3 0,8 33,2 2,7 6,4 0,5 0,6
SD1E1 11 1 12 3 0,0 15,2 0,0 4,1 0,0 0,0
SD1E1 11 2 12 3 0,0 14,7 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E1 11 3 12 3 0,0 14,0 0,0 3,7 0,0 0,0
SD1E2 12 1 12 3 0,7 19,7 2,2 2,7 0,5 0,9
SD1E3 13 1 12 3 0,6 33,8 2,1 5,8 0,0 0,6
SD1E4 14 1 12 3 0,0 27,0 2,7 4,3 0,0 1,1
SD1E4 14 1 12 3 0,0 11,8 0,0 2,9 0,0 0,0
SD1E4 14 2 12 3 0,0 10,7 0,0 2,7 0,0 0,0
SD1E4 14 3 12 3 0,0 11,7 0,0 2,8 0,0 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 13,5 1,2 1,8 0,0 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 10,2 0,9 1,4 0,0 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 12,0 1,0 1,5 0,0 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 16,3 1,0 3,3 0,3 0,6
SD1E11 111 2 12 3 0,0 15,3 0,9 3,0 0,0 0,5
SD1E11 111 3 12 3 0,0 16,2 1,0 3,1 0,0 0,6
SD1E12 112 1 12 3 0,5 11,0 1,6 1,5 0,5 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,5 10,5 1,6 1,6 0,4 0,4
SD1E12 112 3 12 3 0,4 9,4 1,4 1,4 0,4 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 13,1 0,0 1,5 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 14,5 1,2 2,1 0,0 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 16,4 1,2 2,3 0,0 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 16,4 1,1 2,6 0,0 0,6
SD1E16 116 2 12 3 0,0 16,0 1,0 2,5 0,0 0,6
SD1E16 116 3 12 3 0,0 14,6 0,9 2,3 0,0 0,6
SD1E25 125 1 12 3 0,0 13,1 2,1 0,0 2,0 0,0
SD1E25 125 2 12 3 1,2 15,7 0,0 3,0 0,0 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 14,9 0,0 3,3 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 20,2 1,7 3,3 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 14,1 1,3 2,3 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 15,0 1,4 2,5 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 0,0 12,0 0,0 2,7 0,0 0,0
SD1E28 128 2 12 3 0,0 12,7 0,0 3,0 0,0 0,0
SD1E28 128 3 12 3 0,0 11,6 0,0 2,7 0,0 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 12,9 0,0 2,7 0,0 0,0
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. Transformación genética de S. almeriensis 126
126
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SD1E29 129 2 12 3 0,0 11,7 0,0 2,5 0,0 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 10,4 0,0 2,2 0,0 0,0
SD1E30 130 1 12 3 0,0 8,2 0,0 1,9 0,0 0,0
SD1E30 130 2 12 3 0,0 9,3 0,0 2,2 0,0 0,0
SD1E30 130 3 12 3 0,0 8,3 0,0 2,0 0,0 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 15,1 1,3 2,8 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 12,6 1,0 2,4 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 13,6 1,2 2,6 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 0,0 18,1 2,3 4,0 0,0 0,0
SD1E38 138 2 12 3 0,0 18,4 2,2 3,9 0,0 0,0
SD1E38 138 3 12 3 0,0 12,1 1,5 2,7 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 12,2 0,8 2,6 0,0 0,7
SD1E41 141 2 12 3 0,0 12,9 0,8 3,1 0,0 0,8
SD1E41 141 3 12 3 0,3 14,7 1,0 3,3 0,4 0,9
SD1E43 143 1 12 3 0,0 12,6 1,2 1,5 0,0 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,0 14,0 1,1 1,8 0,0 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,4 13,0 1,2 1,5 0,4 0,0
SD1E47 147 1 12 3 0,0 9,8 0,8 2,1 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 7,4 0,7 1,3 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 0,0 9,9 1,0 2,2 0,0 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 10,3 0,0 2,8 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 17,8 1,5 5,1 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 17,2 1,5 4,7 0,0 0,0
SD1E51 151 1 12 3 0,0 18,0 1,3 3,0 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 0,0 20,5 1,7 3,6 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 25,5 2,3 4,4 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 0,0 15,1 1,1 2,5 0,4 0,9
SD1E52 152 2 10 2 0,0 11,8 1,2 2,0 0,0 0,6
SD1E52 152 3 10 2 0,4 14,9 1,4 2,5 0,0 0,7
SD1E52 152 1 14 3 0,0 27,8 1,5 5,6 0,0 0,7
SD1E52 152 2 14 3 0,0 20,1 1,2 4,1 0,0 0,5
SD1E52 152 3 14 3 0,0 16,7 1,0 3,5 0,0 0,5
SD1E53 153 1 12 3 0,0 9,8 0,0 2,2 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 13,4 0,0 3,5 0,0 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 15,4 0,0 3,3 0,0 0,0
SD1E55 155 1 12 3 0,0 17,0 0,0 4,5 0,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 0,0 16,4 0,0 4,3 0,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 0,0 13,6 0,0 3,6 0,0 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 12,7 0,9 2,2 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 14,4 1,0 2,4 0,0 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 11,7 0,0 2,1 0,0 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 19,9 0,0 3,6 2,6 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 14,4 0,0 2,6 1,8 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 15,1 0,8 2,7 1,8 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 12,9 1,1 2,4 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 16,8 1,4 3,0 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 15,2 1,2 2,9 0,0 0,0
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.
Apéndice 127
127
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SD1E70 170 1 12 3 0,0 13,9 0,0 3,1 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 14,3 0,0 3,2 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 13,7 0,0 3,0 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 10,4 0,0 2,0 0,0 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 13,5 0,0 2,5 0,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 10,8 0,0 2,0 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 15,3 1,2 2,5 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 12,5 0,9 1,8 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 13,0 1,2 2,1 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 18,8 0,8 2,4 0,0 0,0
SD1E78 178 2 12 3 0,0 20,8 0,8 2,7 0,0 0,0
SD1E78 178 3 12 3 0,0 17,7 0,7 2,3 0,0 0,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 10,4 1,2 1,4 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 10,4 1,2 1,4 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 11,1 1,2 1,3 0,0 0,6
SD2C1 21 1 12 3 0,0 14,7 0,9 2,1 0,0 0,4
SD2C1 21 2 12 3 0,0 14,6 1,0 2,0 0,0 0,4
SD2C1 21 3 12 3 0,0 13,4 0,9 2,0 0,0 0,0
SD2C2 22 1 12 3 0,0 11,9 0,5 2,5 0,4 0,4
SD2C2 22 2 12 3 0,0 11,6 0,5 2,4 0,4 0,4
SD2C2 22 3 12 3 0,0 13,2 0,6 2,6 0,5 0,0
SD2C7 27 1 12 3 0,0 13,3 1,2 2,1 0,5 0,0
SD2C7 27 2 12 3 0,6 23,7 2,2 3,9 1,0 0,0
SD2C7 27 3 12 3 0,6 25,5 2,5 4,3 1,0 0,0
SD2C8 28 1 12 3 0,0 17,0 0,9 3,4 0,8 0,6
SD2C8 28 2 12 3 0,0 11,3 0,5 2,4 0,5 0,4
SD2C8 28 3 12 3 0,0 12,3 0,6 2,6 0,3 0,5
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III
. Transformación genética de S. almeriensis 128
128
Tabla A3. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) Fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SWT 0 1 4 1 1,5 5,8 8,9 0,0 0,0
SWT 0 2 4 1 1,1 4,7 7,6 0,6 0,0
SWT 0 3 4 1 1,2 5,4 8,7 0,0 0,0
SWT 0 1 12 3 1,4 6,8 9,7 0,6 0,0
SWT 0 2 12 3 1,3 5,6 7,7 0,5 0,0
SWT 0 3 12 3 1,1 4,9 6,9 0,5 0,0
SWT 0 1 13 3 1,3 4,9 9,9 0,6 0,0
SWT 0 1 20 4 1,3 5,3 10,2 0,7 0,0
SWT 0 2 20 4 0,8 3,0 7,1 0,5 0,0
SWT 0 3 20 4 0,8 3,0 5,7 0,4 0,0
SWT 0 1 38 5 0,8 5,6 6,8 0,4 0,0
SD1E1 11 1 12 3 0,9 4,2 12,4 0,9 0,0
SD1E1 11 1 12 3 1,0 5,1 0,0 4,0 0,6
SD1E1 11 2 12 3 1,0 4,8 0,0 3,5 0,0
SD1E1 11 3 12 3 0,9 5,1 0,0 3,1 0,6
SD1E2 12 1 12 3 0,7 2,8 10,8 0,5 0,0
SD1E3 13 1 12 3 1,3 4,6 9,3 1,4 0,0
SD1E4 14 1 12 3 1,1 5,4 12,1 0,8 0,0
SD1E4 14 1 12 3 0,6 2,8 0,0 4,3 0,0
SD1E4 14 2 12 3 0,0 2,7 0,0 4,0 0,0
SD1E4 14 3 12 3 0,6 2,6 0,0 4,1 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 2,2 6,1 0,5 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 1,7 4,5 0,0 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 1,9 5,4 0,6 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 2,7 4,8 0,9 0,0
SD1E11 111 2 12 3 0,0 2,3 4,8 1,0 0,0
SD1E11 111 3 12 3 0,0 2,6 5,1 1,0 0,0
SD1E12 112 1 12 3 0,0 4,2 4,8 0,0 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,0 4,0 4,7 0,4 0,0
SD1E12 112 3 12 3 0,0 3,5 4,2 0,0 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 1,6 7,6 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 2,1 7,1 0,6 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 2,2 7,7 0,7 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 4,6 4,4 0,7 0,0
SD1E16 116 2 12 3 0,0 4,3 4,2 0,7 0,0
SD1E16 116 3 12 3 0,0 3,9 3,8 0,7 0,0
SD1E25 125 1 12 3 0,0 3,4 3,6 0,0 0,0
SD1E25 125 2 12 3 0,0 2,3 4,8 2,4 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 2,5 5,3 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 4,5 8,8 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 3,1 6,5 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 3,2 6,8 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 0,0 2,2 0,0 4,8 0,0
SD1E28 128 2 12 3 0,0 2,8 0,0 5,1 0,0
SD1E28 128 3 12 3 0,0 2,5 0,0 4,4 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 2,5 0,0 5,3 0,0
Gru
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Bio
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.
Apéndice 129
129
Clon code Muestra Edad (d) Fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SD1E29 129 2 12 3 0,0 2,2 0,0 4,9 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 1,8 0,0 4,5 0,0
SD1E30 130 1 12 3 0,0 3,0 0,0 1,8 0,0
SD1E30 130 2 12 3 0,0 3,4 0,0 2,2 0,0
SD1E30 130 3 12 3 0,0 3,1 0,0 2,0 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 3,5 6,1 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 2,9 5,2 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 3,1 5,6 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 1,8 2,7 10,9 0,0 0,0
SD1E38 138 2 12 3 1,8 2,6 10,9 0,0 0,0
SD1E38 138 3 12 3 1,2 1,7 7,5 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 2,9 3,3 0,6 0,0
SD1E41 141 2 12 3 0,0 3,2 3,9 0,7 0,0
SD1E41 141 3 12 3 0,0 3,4 3,9 0,8 0,0
SD1E43 143 1 12 3 0,0 2,4 6,5 0,0 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,5 2,6 6,4 0,5 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,5 2,8 6,2 0,4 0,0
SD1E47 147 1 12 3 0,0 3,6 4,4 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 2,7 3,5 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 0,6 3,8 4,3 0,0 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 1,6 4,5 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 3,0 7,7 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 2,8 6,9 0,0 0,0
SD1E51 151 1 12 3 0,0 2,5 6,7 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 0,0 2,9 8,9 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 3,5 11,3 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 0,0 1,9 5,8 0,5 0,0
SD1E52 152 2 10 2 0,0 1,9 4,8 0,0 0,0
SD1E52 152 3 10 2 0,5 2,4 5,9 0,4 0,0
SD1E52 152 1 14 3 0,0 3,2 5,7 1,1 0,0
SD1E52 152 2 14 3 0,0 2,3 4,8 0,8 0,0
SD1E52 152 3 14 3 0,0 2,0 4,1 0,6 0,0
SD1E53 153 1 12 3 0,0 2,4 4,7 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 3,7 6,6 0,6 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 3,9 7,3 0,7 0,0
SD1E55 155 1 12 3 1,3 5,9 2,7 1,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 1,2 5,6 2,7 1,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 1,0 4,9 2,4 0,8 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 1,9 5,0 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 2,0 5,9 0,0 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 1,4 4,8 0,0 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 6,5 2,9 0,0 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 4,5 2,2 0,0 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 4,8 2,4 0,8 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 1,7 5,6 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 2,4 6,9 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 2,1 6,0 0,0 0,0
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de
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. Transformación genética de S. almeriensis 130
130
Clon code Muestra Edad (d) Fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SD1E70 170 1 12 3 0,0 2,9 6,1 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 3,1 6,1 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 2,8 5,5 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 1,5 5,8 0,0 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 2,2 6,8 0,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 1,7 5,5 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 1,9 5,8 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 1,6 5,0 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 1,4 6,1 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 2,5 4,8 1,1 0,0
SD1E78 178 2 12 3 0,9 3,0 4,6 1,3 0,0
SD1E78 178 3 12 3 0,7 2,5 4,2 1,0 0,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 2,1 5,6 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 2,1 5,3 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 2,1 6,1 0,0 0,0
SD2C1 21 1 12 3 1,7 5,6 4,8 0,7 0,0
SD2C1 21 2 12 3 1,7 6,1 4,8 0,7 0,0
SD2C1 21 3 12 3 1,6 5,1 4,5 0,6 0,0
SD2C2 22 1 12 3 0,8 2,3 5,1 0,0 0,0
SD2C2 22 2 12 3 0,8 2,1 4,9 0,4 0,0
SD2C2 22 3 12 3 1,0 2,6 5,9 0,0 0,0
SD2C7 27 1 12 3 0,8 4,5 5,2 0,7 0,0
SD2C7 27 2 12 3 1,4 8,3 10,0 1,2 0,0
SD2C7 27 3 12 3 1,5 8,8 10,5 1,2 0,0
SD2C8 28 1 12 3 1,2 3,9 6,4 0,6 0,0
SD2C8 28 2 12 3 0,7 2,3 4,8 0,4 0,0
SD2C8 28 3 12 3 0,8 2,7 5,1 0,4 0,0
Gru
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Bio
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rale
s. L
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III
.
Apéndice 131
131
Tabla A3. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) Fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:3n6 18:3D?
SWT 0 1 4 1 25,3 1,8 10,7 0,0 0,0
SWT 0 2 4 1 20,4 1,3 8,2 0,5 0,6
SWT 0 3 4 1 20,4 1,6 9,1 0,6 0,7
SWT 0 1 12 3 24,5 2,5 13,6 1,4 1,5
SWT 0 2 12 3 22,7 2,2 10,8 1,2 1,2
SWT 0 3 12 3 19,6 1,9 9,4 1,1 1,1
SWT 0 1 13 3 21,5 2,9 10,9 1,4 1,8
SWT 0 1 20 4 32,4 2,9 12,5 1,6 1,9
SWT 0 2 20 4 20,2 1,9 7,7 1,0 1,2
SWT 0 3 20 4 20,5 1,5 6,9 0,8 1,0
SWT 0 1 38 5 18,6 2,9 9,8 1,2 1,7
SD1E1 11 1 12 3 52,8 2,7 8,0 0,7 1,3
SD1E1 11 1 12 3 20,5 1,5 7,0 0,0 0,7
SD1E1 11 2 12 3 21,5 1,7 7,3 0,0 0,0
SD1E1 11 3 12 3 19,7 1,5 6,7 0,0 0,0
SD1E2 12 1 12 3 26,7 1,9 7,0 0,6 0,9
SD1E3 13 1 12 3 51,9 1,4 9,4 0,7 1,2
SD1E4 14 1 12 3 40,4 2,5 10,2 1,1 1,1
SD1E4 14 1 12 3 18,0 1,8 5,9 0,0 0,6
SD1E4 14 2 12 3 15,8 1,8 5,8 0,0 0,9
SD1E4 14 3 12 3 17,5 1,8 5,9 0,0 0,8
SD1E10 110 1 12 3 18,8 2,1 4,7 0,7 0,0
SD1E10 110 2 12 3 14,4 1,7 3,6 0,5 0,0
SD1E10 110 3 12 3 17,0 2,0 4,1 0,6 0,0
SD1E11 111 1 12 3 25,8 1,7 7,5 0,7 0,0
SD1E11 111 2 12 3 24,2 1,6 6,9 0,6 0,0
SD1E11 111 3 12 3 25,7 1,7 7,3 0,7 0,0
SD1E12 112 1 12 3 11,4 1,9 5,3 0,7 0,0
SD1E12 112 2 12 3 11,2 1,8 5,3 0,7 0,0
SD1E12 112 3 12 3 10,4 1,5 4,8 0,5 0,0
SD1E13 113 1 12 3 15,4 1,4 4,6 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 18,7 1,9 4,9 0,0 0,0
SD1E13 113 3 12 3 21,3 2,0 5,3 0,5 0,0
SD1E16 116 1 12 3 25,3 1,8 7,6 0,4 0,0
SD1E16 116 2 12 3 25,4 1,8 7,4 0,4 0,0
SD1E16 116 3 12 3 22,9 1,6 6,5 0,3 0,0
SD1E25 125 1 12 3 17,7 3,4 6,7 0,0 0,0
SD1E25 125 2 12 3 24,1 3,4 9,0 1,0 0,0
SD1E25 125 3 12 3 24,3 3,4 9,4 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 25,4 4,3 11,3 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 17,7 3,1 7,9 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 19,0 3,1 7,9 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 16,5 1,4 6,3 0,0 1,1
SD1E28 128 2 12 3 15,9 1,2 6,9 0,0 1,1
SD1E28 128 3 12 3 15,2 1,1 6,3 0,0 1,0
SD1E29 129 1 12 3 21,1 1,0 4,7 0,0 0,0
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. Transformación genética de S. almeriensis 132
132
Clon code Muestra Edad (d) Fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:3n6 18:3D?
SD1E29 129 2 12 3 19,2 0,9 4,2 0,0 0,0
SD1E29 129 3 12 3 16,8 0,7 3,5 0,0 0,0
SD1E30 130 1 12 3 9,7 0,9 5,2 0,0 0,7
SD1E30 130 2 12 3 10,8 1,2 6,0 0,0 0,8
SD1E30 130 3 12 3 9,9 1,0 5,5 0,0 0,7
SD1E36 136 1 12 3 22,3 3,4 6,5 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 19,0 3,2 5,3 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 20,3 3,0 5,7 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 18,6 4,2 16,2 1,3 0,0
SD1E38 138 2 12 3 20,1 4,0 15,6 1,3 0,0
SD1E38 138 3 12 3 12,7 2,6 10,6 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 22,9 1,5 6,6 0,4 0,0
SD1E41 141 2 12 3 26,7 1,5 6,9 0,4 0,0
SD1E41 141 3 12 3 29,0 1,8 7,9 0,5 0,3
SD1E43 143 1 12 3 19,2 1,7 5,5 0,0 0,7
SD1E43 143 2 12 3 23,4 1,7 6,0 0,0 0,7
SD1E43 143 3 12 3 19,8 1,7 5,7 0,7 0,4
SD1E47 147 1 12 3 15,9 1,9 5,3 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 11,4 1,4 4,0 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 16,5 1,9 5,4 0,5 0,0
SD1E48 148 1 12 3 21,5 1,9 4,2 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 38,3 3,2 7,3 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 37,6 3,1 7,0 0,8 0,0
SD1E51 151 1 12 3 23,6 3,0 6,0 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 25,8 3,9 7,9 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 32,2 4,9 9,4 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 22,4 3,3 10,4 1,8 0,6
SD1E52 152 2 10 2 16,5 2,4 7,3 1,2 0,0
SD1E52 152 3 10 2 21,4 2,9 9,2 1,5 0,5
SD1E52 152 1 14 3 48,1 4,4 16,4 3,0 0,8
SD1E52 152 2 14 3 34,5 3,4 12,4 2,4 0,7
SD1E52 152 3 14 3 28,1 2,7 10,2 1,9 0,5
SD1E53 153 1 12 3 16,8 1,4 5,0 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 22,6 1,8 7,4 0,7 0,0
SD1E53 153 3 12 3 26,4 1,8 7,8 0,7 0,0
SD1E55 155 1 12 3 38,3 0,0 8,8 0,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 37,4 0,0 8,6 0,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 30,3 0,0 7,1 0,0 0,0
SD1E63 163 1 12 3 20,0 2,5 5,9 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 22,2 2,8 6,3 0,8 0,0
SD1E63 163 3 12 3 18,5 2,3 5,4 0,8 0,0
SD1E64 164 1 12 3 25,9 4,5 10,1 0,0 0,0
SD1E64 164 2 12 3 19,1 3,2 7,4 0,0 0,0
SD1E64 164 3 12 3 20,3 3,3 7,9 0,0 0,0
SD1E68 168 1 12 3 17,7 2,5 5,9 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 23,2 3,1 7,8 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 21,6 2,9 6,4 0,0 0,0
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III
.
Apéndice 133
133
Clon code Muestra Edad (d) Fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:3n6 18:3D?
SD1E70 170 1 12 3 19,5 1,5 5,3 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 20,3 1,5 5,6 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 19,7 1,3 5,0 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 11,0 1,9 4,3 0,7 0,0
SD1E72 172 2 12 3 14,3 2,4 5,6 0,7 0,0
SD1E72 172 3 12 3 11,8 1,9 4,5 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 29,5 1,7 5,3 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 23,7 1,4 4,5 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 24,7 1,7 4,7 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 32,7 1,7 6,0 0,0 0,0
SD1E78 178 2 12 3 36,4 1,8 6,7 0,0 0,0
SD1E78 178 3 12 3 30,1 1,6 5,7 0,0 0,0
SD1E79 179 1 12 3 12,4 2,3 5,3 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 13,8 1,9 5,3 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 13,6 2,0 5,6 0,0 0,0
SD2C1 21 1 12 3 23,4 2,0 11,4 0,0 0,8
SD2C1 21 2 12 3 21,9 2,0 11,6 0,0 0,9
SD2C1 21 3 12 3 20,3 1,8 10,6 0,0 0,8
SD2C2 22 1 12 3 15,6 1,2 6,4 0,0 0,6
SD2C2 22 2 12 3 14,8 1,1 6,4 0,0 0,5
SD2C2 22 3 12 3 16,4 1,2 7,3 0,0 0,6
SD2C7 27 1 12 3 21,6 1,3 6,4 0,0 0,0
SD2C7 27 2 12 3 37,5 2,2 10,5 0,0 0,6
SD2C7 27 3 12 3 40,1 2,5 11,2 0,0 0,7
SD2C8 28 1 12 3 22,2 1,6 9,5 0,0 0,8
SD2C8 28 2 12 3 14,3 1,1 5,7 0,0 0,5
SD2C8 28 3 12 3 15,8 1,0 6,5 0,0 0,6
Gru
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. Transformación genética de S. almeriensis 134
134
Tabla A3. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9 Rt4 Rt5
SWT 0 1 4 1 0,0 24,8 5,2 0,0 1,5 0,0
SWT 0 2 4 1 0,0 20,4 4,3 0,0 1,2 0,0
SWT 0 3 4 1 0,0 23,3 4,9 0,0 1,4 0,0
SWT 0 1 12 3 0,0 26,8 5,5 0,0 2,3 0,0
SWT 0 2 12 3 0,0 22,1 4,7 0,0 1,8 0,0
SWT 0 3 12 3 0,0 19,7 4,1 0,0 1,6 0,0
SWT 0 1 13 3 0,0 25,5 5,4 0,0 2,4 0,0
SWT 0 1 20 4 0,0 27,4 5,0 0,6 2,3 0,0
SWT 0 2 20 4 0,0 18,2 3,4 0,0 1,4 0,0
SWT 0 3 20 4 0,0 15,2 2,8 0,0 1,2 0,0
SWT 0 1 38 5 0,0 23,8 3,3 0,0 1,8 0,0
SD1E1 11 1 12 3 0,0 31,3 6,5 0,7 3,0 0,7
SD1E1 11 1 12 3 0,0 15,6 2,7 0,0 0,0 0,0
SD1E1 11 2 12 3 0,0 14,4 2,7 0,0 1,4 0,0
SD1E1 11 3 12 3 0,0 14,7 2,5 0,0 1,7 0,0
SD1E2 12 1 12 3 0,0 27,0 5,0 0,5 1,8 0,0
SD1E3 13 1 12 3 0,0 26,5 6,7 0,9 2,1 0,7
SD1E4 14 1 12 3 0,0 32,4 7,5 0,0 2,1 0,0
SD1E4 14 1 12 3 0,0 16,1 3,4 0,0 1,0 0,0
SD1E4 14 2 12 3 0,0 15,4 3,4 0,0 0,0 0,0
SD1E4 14 3 12 3 0,0 15,3 3,4 0,0 1,0 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 17,1 4,4 0,0 1,0 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 13,0 3,4 0,0 0,8 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 15,3 4,0 0,0 0,8 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 15,7 2,8 0,6 0,5 0,0
SD1E11 111 2 12 3 0,0 15,1 2,7 0,6 0,0 0,0
SD1E11 111 3 12 3 0,0 15,9 2,9 0,6 0,6 0,0
SD1E12 112 1 12 3 0,0 17,4 3,1 0,0 1,0 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,0 16,7 3,0 0,0 1,0 0,0
SD1E12 112 3 12 3 0,0 15,0 2,6 0,0 1,0 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 18,7 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 18,0 3,2 0,0 0,0 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 19,6 3,6 0,0 0,8 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 17,6 2,1 0,5 0,6 0,0
SD1E16 116 2 12 3 0,0 16,8 2,1 0,5 0,5 0,0
SD1E16 116 3 12 3 0,0 15,5 1,8 0,5 0,0 0,0
SD1E25 125 1 12 3 0,0 11,9 4,6 0,0 0,0 0,0
SD1E25 125 2 12 3 0,0 15,3 4,9 0,0 0,0 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 16,8 4,4 0,0 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 28,8 7,2 0,0 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 21,1 3,7 0,0 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 21,4 3,8 0,0 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 0,0 15,5 3,7 0,0 2,2 0,0
SD1E28 128 2 12 3 0,0 15,4 3,4 0,0 1,4 0,0
SD1E28 128 3 12 3 0,0 14,0 3,2 0,0 1,2 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 17,3 4,4 0,0 1,1 0,0
Gru
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.
Apéndice 135
135
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9 Rt4 Rt5
SD1E29 129 2 12 3 0,0 15,3 3,9 0,0 1,1 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 13,9 3,5 0,0 0,8 0,0
SD1E30 130 1 12 3 0,0 10,0 2,3 0,0 0,0 0,0
SD1E30 130 2 12 3 0,0 12,0 2,7 0,0 0,0 0,0
SD1E30 130 3 12 3 0,0 10,6 2,5 0,0 0,0 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 20,8 4,4 0,0 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 17,7 3,9 0,0 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 19,0 4,0 1,1 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 0,0 22,5 4,7 0,0 0,0 0,0
SD1E38 138 2 12 3 0,0 22,6 4,8 0,0 0,0 0,0
SD1E38 138 3 12 3 0,0 15,4 3,3 0,0 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 13,2 2,5 0,0 1,4 0,0
SD1E41 141 2 12 3 0,0 14,8 2,7 0,4 1,3 0,0
SD1E41 141 3 12 3 0,0 15,5 2,9 0,4 1,4 0,0
SD1E43 143 1 12 3 0,0 16,2 3,2 0,0 1,2 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,0 16,1 3,1 0,0 1,2 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,0 16,2 3,1 0,3 0,0 0,0
SD1E47 147 1 12 3 0,0 15,0 2,9 0,0 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 11,7 2,1 0,0 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 0,0 14,7 3,0 0,0 0,0 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 13,8 4,0 0,0 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 23,8 5,9 0,0 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 22,5 5,0 1,5 0,0 0,0
SD1E51 151 1 12 3 0,0 20,9 5,9 1,5 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 0,0 26,7 6,3 0,0 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 33,8 8,0 2,5 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 0,0 17,3 4,4 0,0 1,3 0,0
SD1E52 152 2 10 2 0,0 14,3 3,8 0,0 1,0 0,0
SD1E52 152 3 10 2 0,0 17,5 4,8 0,0 1,3 0,0
SD1E52 152 1 14 3 0,0 19,9 5,7 0,0 1,9 0,0
SD1E52 152 2 14 3 0,0 15,8 4,6 0,0 1,5 0,0
SD1E52 152 3 14 3 0,0 13,0 3,8 0,0 1,2 0,0
SD1E53 153 1 12 3 0,0 14,5 2,6 0,0 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 20,4 3,4 0,0 0,0 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 22,3 3,7 0,0 0,0 0,0
SD1E55 155 1 12 3 0,0 18,0 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 0,0 18,0 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 0,0 15,2 3,0 0,0 0,0 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 15,2 4,8 0,0 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 17,3 5,1 0,0 0,0 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 14,1 4,4 0,0 0,0 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 17,6 3,6 0,0 0,0 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 12,4 2,7 0,0 0,0 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 13,6 2,9 0,0 0,0 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 16,3 3,9 0,0 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 20,9 5,6 0,0 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 18,3 4,6 0,0 0,0 0,0
Gru
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. Transformación genética de S. almeriensis 136
136
Clon code Muestra Edad (d) Fase Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9 Rt4 Rt5
SD1E70 170 1 12 3 0,0 18,6 3,7 0,0 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 18,8 3,8 0,0 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 17,0 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 16,3 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 20,0 4,4 0,0 0,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 16,1 3,5 0,0 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 15,5 4,3 0,0 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 13,2 3,4 0,0 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 15,3 4,0 0,0 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 14,3 2,6 0,9 0,0 0,0
SD1E78 178 2 12 3 0,0 14,9 2,7 1,0 0,0 0,0
SD1E78 178 3 12 3 0,0 12,8 2,4 0,8 0,0 0,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 15,4 3,0 0,0 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 14,7 2,7 0,0 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 16,7 3,1 0,0 1,0 0,0
SD2C1 21 1 12 3 1,2 19,4 3,0 0,5 2,5 0,7
SD2C1 21 2 12 3 1,2 19,4 3,0 0,6 2,4 0,7
SD2C1 21 3 12 3 1,2 17,9 2,8 0,5 2,4 0,7
SD2C2 22 1 12 3 0,7 15,5 4,0 0,0 1,8 0,7
SD2C2 22 2 12 3 0,7 14,8 3,9 0,0 1,8 0,7
SD2C2 22 3 12 3 0,8 17,6 4,5 0,0 2,1 0,8
SD2C7 27 1 12 3 0,8 20,1 4,1 0,6 1,9 0,7
SD2C7 27 2 12 3 1,3 37,5 7,6 1,0 3,2 1,2
SD2C7 27 3 12 3 1,4 39,4 8,2 1,1 3,5 1,2
SD2C8 28 1 12 3 1,1 21,4 5,1 0,6 2,9 1,0
SD2C8 28 2 12 3 0,8 15,3 3,5 0,0 2,0 0,8
SD2C8 28 3 12 3 0,8 16,5 3,8 0,5 2,1 0,9
Gru
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de
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aci
ón “
Bio
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gía
de
Pro
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os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
e G
enét
ica
III
.
Apéndice 137
137
Tabla A3. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) Fase TFA PUFA MUFA SFA
SWT 0 1 4 1 109,7 58,4 32,5 18,8
SWT 0 2 4 1 91,4 49,1 26,7 15,6
SWT 0 3 4 1 99,9 55,9 27,7 16,4
SWT 0 1 12 3 124,3 69,6 34,1 20,6
SWT 0 2 12 3 105,7 56,9 30,9 17,8
SWT 0 3 12 3 92,9 50,4 26,8 15,7
SWT 0 1 13 3 114,1 64,2 31,4 18,6
SWT 0 1 20 4 136,6 68,0 44,2 24,4
SWT 0 2 20 4 86,9 44,0 27,1 15,8
SWT 0 3 20 4 78,8 37,7 26,6 14,4
SWT 0 1 38 5 98,8 55,4 27,4 16,0
SD1E1 11 1 12 3 170,2 69,5 66,6 34,1
SD1E1 11 1 12 3 78,1 32,1 26,2 19,2
SD1E1 11 2 12 3 77,2 31,7 27,3 18,1
SD1E1 11 3 12 3 74,2 31,5 25,0 17,1
SD1E2 12 1 12 3 112,8 57,4 35,2 20,2
SD1E3 13 1 12 3 161,0 62,9 62,8 35,2
SD1E4 14 1 12 3 151,8 74,1 49,9 27,8
SD1E4 14 1 12 3 69,4 30,6 22,7 16,1
SD1E4 14 2 12 3 63,1 28,1 20,2 14,8
SD1E4 14 3 12 3 67,6 29,7 22,1 15,7
SD1E10 110 1 12 3 74,0 36,2 23,9 14,0
SD1E10 110 2 12 3 56,1 27,4 18,4 10,2
SD1E10 110 3 12 3 66,2 32,1 21,5 12,6
SD1E11 111 1 12 3 85,2 35,3 32,7 17,2
SD1E11 111 2 12 3 79,5 33,1 30,2 16,2
SD1E11 111 3 12 3 85,0 35,7 32,1 17,2
SD1E12 112 1 12 3 64,7 36,3 17,4 11,0
SD1E12 112 2 12 3 63,7 35,9 17,0 10,8
SD1E12 112 3 12 3 56,7 31,6 15,6 9,4
SD1E13 113 1 12 3 67,3 36,0 18,2 13,1
SD1E13 113 2 12 3 74,3 35,4 23,8 15,1
SD1E13 113 3 12 3 83,6 39,7 26,9 17,1
SD1E16 116 1 12 3 86,5 38,0 31,4 17,1
SD1E16 116 2 12 3 84,3 36,3 31,2 16,7
SD1E16 116 3 12 3 76,0 32,5 28,2 15,3
SD1E25 125 1 12 3 68,4 30,1 25,2 13,1
SD1E25 125 2 12 3 87,2 37,3 31,7 18,1
SD1E25 125 3 12 3 84,3 38,4 31,0 14,9
SD1E26 126 1 12 3 115,6 60,7 34,8 20,2
SD1E26 126 2 12 3 80,8 42,3 24,4 14,1
SD1E26 126 3 12 3 84,0 43,1 26,0 15,0
SD1E28 128 1 12 3 68,3 30,9 20,6 16,8
SD1E28 128 2 12 3 68,9 31,1 20,0 17,8
SD1E28 128 3 12 3 63,2 28,3 18,9 16,0
SD1E29 129 1 12 3 72,9 30,0 24,7 18,1
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
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tori
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ica
III
. Transformación genética de S. almeriensis 138
138
Clon code Muestra Edad (d) Fase TFA PUFA MUFA SFA
SD1E29 129 2 12 3 65,9 26,6 22,6 16,7
SD1E29 129 3 12 3 58,1 23,4 19,8 14,9
SD1E30 130 1 12 3 43,7 21,2 12,5 10,0
SD1E30 130 2 12 3 50,6 25,0 14,1 11,5
SD1E30 130 3 12 3 45,6 22,4 12,9 10,3
SD1E36 136 1 12 3 86,2 41,3 29,8 15,1
SD1E36 136 2 12 3 73,3 35,0 25,7 12,6
SD1E36 136 3 12 3 79,3 37,4 28,4 13,6
SD1E38 138 1 12 3 107,2 60,1 29,0 18,1
SD1E38 138 2 12 3 108,0 59,4 30,1 18,4
SD1E38 138 3 12 3 71,4 39,7 19,5 12,1
SD1E41 141 1 12 3 71,5 30,9 27,9 12,8
SD1E41 141 2 12 3 80,1 34,0 32,5 13,7
SD1E41 141 3 12 3 88,4 36,7 36,2 15,5
SD1E43 143 1 12 3 71,8 35,7 23,5 12,6
SD1E43 143 2 12 3 78,9 36,5 27,9 14,5
SD1E43 143 3 12 3 74,3 35,6 25,3 13,5
SD1E47 147 1 12 3 61,7 31,1 20,7 9,8
SD1E47 147 2 12 3 46,3 24,1 14,8 7,4
SD1E47 147 3 12 3 63,9 32,4 21,5 9,9
SD1E48 148 1 12 3 64,7 28,1 26,2 10,3
SD1E48 148 2 12 3 113,6 47,7 48,1 17,8
SD1E48 148 3 12 3 110,6 45,0 48,4 17,2
SD1E51 151 1 12 3 92,4 42,0 32,4 18,0
SD1E51 151 2 12 3 108,4 52,7 35,1 20,5
SD1E51 151 3 12 3 137,6 66,0 46,2 25,5
SD1E52 152 1 10 2 89,8 44,4 29,8 15,7
SD1E52 152 2 10 2 68,9 34,9 22,2 11,8
SD1E52 152 3 10 2 88,3 44,3 28,6 15,4
SD1E52 152 1 14 3 145,9 57,4 59,6 28,9
SD1E52 152 2 14 3 109,2 45,2 43,2 20,9
SD1E52 152 3 14 3 89,9 37,3 35,3 17,3
SD1E53 153 1 12 3 59,4 29,2 20,4 9,8
SD1E53 153 2 12 3 84,0 42,1 27,9 14,0
SD1E53 153 3 12 3 93,4 45,8 31,5 16,1
SD1E55 155 1 12 3 101,1 40,2 42,9 18,1
SD1E55 155 2 12 3 98,8 39,6 41,8 17,4
SD1E55 155 3 12 3 81,8 33,6 33,8 14,4
SD1E63 163 1 12 3 70,9 32,7 25,6 12,7
SD1E63 163 2 12 3 80,1 37,4 28,4 14,4
SD1E63 163 3 12 3 65,5 30,9 22,9 11,7
SD1E64 164 1 12 3 97,3 40,8 36,7 19,9
SD1E64 164 2 12 3 70,2 29,2 26,6 14,4
SD1E64 164 3 12 3 76,7 31,7 29,1 15,9
SD1E68 168 1 12 3 70,1 33,4 23,8 12,9
SD1E68 168 2 12 3 91,1 43,6 30,8 16,8
SD1E68 168 3 12 3 81,2 37,4 28,7 15,2
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
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Pro
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Natu
rale
s. L
abora
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enét
ica
III
.
Apéndice 139
139
Clon code Muestra Edad (d) Fase TFA PUFA MUFA SFA
SD1E70 170 1 12 3 74,6 36,6 24,1 13,9
SD1E70 170 2 12 3 76,8 37,4 25,0 14,3
SD1E70 170 3 12 3 71,5 33,8 24,0 13,7
SD1E72 172 1 12 3 57,4 32,0 15,0 10,4
SD1E72 172 2 12 3 72,4 39,7 19,1 13,5
SD1E72 172 3 12 3 57,9 31,4 15,7 10,8
SD1E77 177 1 12 3 83,0 32,8 34,9 15,3
SD1E77 177 2 12 3 68,0 27,6 27,8 12,5
SD1E77 177 3 12 3 74,2 31,6 29,6 13,0
SD1E78 178 1 12 3 88,7 30,4 38,5 19,9
SD1E78 178 2 12 3 97,4 32,8 42,6 22,0
SD1E78 178 3 12 3 82,4 28,1 35,5 18,7
SD1E79 179 1 12 3 59,0 31,3 17,3 10,4
SD1E79 179 2 12 3 58,8 30,1 18,3 10,4
SD1E79 179 3 12 3 64,5 35,3 18,1 11,1
SD2C1 21 1 12 3 95,9 51,5 28,9 15,4
SD2C1 21 2 12 3 94,9 52,2 27,4 15,2
SD2C1 21 3 12 3 87,0 47,5 25,6 14,0
SD2C2 22 1 12 3 70,4 38,3 20,2 11,9
SD2C2 22 2 12 3 68,4 37,2 19,2 12,1
SD2C2 22 3 12 3 77,8 43,2 21,4 13,2
SD2C7 27 1 12 3 85,7 44,3 27,4 14,0
SD2C7 27 2 12 3 154,9 81,6 48,5 24,9
SD2C7 27 3 12 3 165,4 86,4 52,2 26,7
SD2C8 28 1 12 3 101,0 53,9 29,4 17,7
SD2C8 28 2 12 3 67,4 36,8 18,8 11,7
SD2C8 28 3 12 3 73,8 40,3 20,8 12,7
Gru
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stig
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III
. Transformación genética de S. almeriensis 140
140
Tabla A4. Composición en ácidos grasos de la cepa silvestre (SWT) y de los clones transgéni-
cos de S. almeriensis. Datos expresados en % de TFA.
Clon code Muestra Edad (d) fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SWT 0 1 4 1 0,0 17,2 2,4 2,5 0,0 0,0
SWT 0 2 4 1 0,6 16,4 2,4 2,4 0,0 0,6
SWT 0 3 4 1 0,6 16,4 2,7 2,3 0,0 0,6
SWT 0 1 12 3 0,6 16,0 2,5 2,5 0,0 0,5
SWT 0 2 12 3 0,6 16,4 2,3 2,8 0,0 0,5
SWT 0 3 12 3 0,6 16,4 2,3 2,8 0,0 0,5
SWT 0 1 13 3 0,7 15,7 2,6 2,4 0,5 0,6
SWT 0 1 20 4 0,5 17,3 2,1 3,1 0,4 0,4
SWT 0 2 20 4 0,5 17,6 2,2 3,0 0,0 0,0
SWT 0 3 20 4 0,5 17,8 1,9 3,5 0,0 0,4
SWT 0 1 38 5 0,5 15,8 2,4 2,6 0,5 0,6
SD1E1 11 1 12 3 0,5 19,5 1,6 3,7 0,3 0,4
SD1E1 11 1 12 3 0,0 19,5 0,0 5,3 0,0 0,0
SD1E1 11 2 12 3 0,0 19,0 0,0 5,4 0,0 0,0
SD1E1 11 3 12 3 0,0 18,9 0,0 5,0 0,0 0,0
SD1E2 12 1 12 3 0,6 17,5 2,0 2,4 0,4 0,8
SD1E3 13 1 12 3 0,4 21,0 1,3 3,6 0,0 0,4
SD1E4 14 1 12 3 0,0 17,8 1,8 2,8 0,0 0,8
SD1E4 14 1 12 3 0,0 17,0 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E4 14 2 12 3 0,0 17,0 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E4 14 3 12 3 0,0 17,3 0,0 4,1 0,0 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 18,2 1,6 2,4 0,0 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 18,2 1,6 2,5 0,0 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 18,1 1,5 2,3 0,0 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 19,1 1,1 3,9 0,3 0,7
SD1E11 111 2 12 3 0,0 19,2 1,1 3,7 0,0 0,7
SD1E11 111 3 12 3 0,0 19,0 1,2 3,7 0,0 0,7
SD1E12 112 1 12 3 0,8 17,0 2,5 2,4 0,8 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,8 16,4 2,5 2,4 0,7 0,6
SD1E12 112 3 12 3 0,8 16,6 2,5 2,5 0,7 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 19,4 0,0 2,2 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 19,5 1,6 2,8 0,0 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 19,7 1,5 2,7 0,0 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 19,0 1,3 3,0 0,0 0,7
SD1E16 116 2 12 3 0,0 19,0 1,2 3,0 0,0 0,8
SD1E16 116 3 12 3 0,0 19,2 1,2 3,0 0,0 0,8
SD1E25 125 1 12 3 0,0 19,2 3,1 0,0 2,9 0,0
SD1E25 125 2 12 3 1,4 18,0 0,0 3,4 0,0 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 17,7 0,0 3,9 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 17,5 1,5 2,9 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 17,5 1,6 2,9 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 17,8 1,7 3,0 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 0,0 17,6 0,0 3,9 0,0 0,0
SD1E28 128 2 12 3 0,0 18,4 0,0 4,3 0,0 0,0
SD1E28 128 3 12 3 0,0 18,4 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 17,6 0,0 3,7 0,0 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
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gía
de
Pro
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os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
e G
enét
ica
III
.
Apéndice 141
141
Clon code Muestra Edad (d) fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SD1E29 129 2 12 3 0,0 17,8 0,0 3,8 0,0 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 17,9 0,0 3,7 0,0 0,0
SD1E30 130 1 12 3 0,0 18,7 0,0 4,3 0,0 0,0
SD1E30 130 2 12 3 0,0 18,3 0,0 4,3 0,0 0,0
SD1E30 130 3 12 3 0,0 18,3 0,0 4,4 0,0 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 17,5 1,5 3,3 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 17,2 1,4 3,3 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 17,1 1,6 3,3 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 0,0 16,9 2,1 3,7 0,0 0,0
SD1E38 138 2 12 3 0,0 17,0 2,0 3,6 0,0 0,0
SD1E38 138 3 12 3 0,0 17,0 2,2 3,8 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 17,0 1,2 3,6 0,0 1,0
SD1E41 141 2 12 3 0,0 16,2 1,0 3,8 0,0 1,0
SD1E41 141 3 12 3 0,3 16,7 1,1 3,8 0,4 1,1
SD1E43 143 1 12 3 0,0 17,6 1,6 2,1 0,0 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,0 17,7 1,4 2,3 0,0 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,5 17,6 1,6 2,1 0,5 0,0
SD1E47 147 1 12 3 0,0 15,9 1,4 3,4 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 15,9 1,5 2,9 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 0,0 15,6 1,5 3,4 0,0 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 16,0 0,0 4,3 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 15,7 1,3 4,5 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 15,5 1,3 4,3 0,0 0,0
SD1E51 151 1 12 3 0,0 19,5 1,4 3,2 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 0,0 18,9 1,6 3,4 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 18,5 1,6 3,2 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 0,0 16,9 1,3 2,8 0,4 1,0
SD1E52 152 2 10 2 0,0 17,2 1,8 2,8 0,0 0,8
SD1E52 152 3 10 2 0,5 16,9 1,5 2,9 0,0 0,8
SD1E52 152 1 14 3 0,0 19,1 1,0 3,8 0,0 0,5
SD1E52 152 2 14 3 0,0 18,4 1,1 3,8 0,0 0,5
SD1E52 152 3 14 3 0,0 18,5 1,1 3,9 0,0 0,5
SD1E53 153 1 12 3 0,0 16,5 0,0 3,7 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 15,9 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 16,5 0,0 3,5 0,0 0,0
SD1E55 155 1 12 3 0,0 16,9 0,0 4,5 0,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 0,0 16,6 0,0 4,4 0,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 0,0 16,6 0,0 4,4 0,0 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 18,0 1,3 3,1 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 17,9 1,3 3,0 0,0 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 17,8 0,0 3,1 0,0 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 20,5 0,0 3,7 2,7 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 20,5 0,0 3,6 2,5 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 19,7 1,1 3,6 2,4 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 18,4 1,6 3,4 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 18,4 1,5 3,3 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 18,7 1,4 3,6 0,0 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
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III
. Transformación genética de S. almeriensis 142
142
Clon code Muestra Edad (d) fase Rt1 16:0 16:1n7 16:1t 16:1? 16:2n6
SD1E70 170 1 12 3 0,0 18,7 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 18,6 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 19,1 0,0 4,2 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 18,1 0,0 3,5 0,0 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 18,6 0,0 3,5 0,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 18,7 0,0 3,5 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 18,4 1,5 3,0 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 18,4 1,4 2,6 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 17,6 1,6 2,8 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 21,2 0,9 2,8 0,0 0,0
SD1E78 178 2 12 3 0,0 21,3 0,8 2,8 0,0 0,0
SD1E78 178 3 12 3 0,0 21,5 0,8 2,8 0,0 0,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 17,6 2,0 2,4 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 17,7 2,1 2,4 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 17,2 1,8 2,1 0,0 1,0
SD2C1 21 1 12 3 0,0 15,3 1,0 2,1 0,0 0,4
SD2C1 21 2 12 3 0,0 15,4 1,0 2,1 0,0 0,5
SD2C1 21 3 12 3 0,0 15,4 1,0 2,3 0,0 0,0
SD2C2 22 1 12 3 0,0 16,9 0,7 3,5 0,5 0,6
SD2C2 22 2 12 3 0,0 17,0 0,8 3,5 0,5 0,6
SD2C2 22 3 12 3 0,0 16,9 0,8 3,4 0,7 0,0
SD2C7 27 1 12 3 0,0 15,5 1,4 2,5 0,6 0,0
SD2C7 27 2 12 3 0,4 15,3 1,4 2,5 0,6 0,0
SD2C7 27 3 12 3 0,4 15,4 1,5 2,6 0,6 0,0
SD2C8 28 1 12 3 0,0 16,9 0,9 3,4 0,8 0,6
SD2C8 28 2 12 3 0,0 16,8 0,8 3,6 0,8 0,7
SD2C8 28 3 12 3 0,0 16,6 0,9 3,5 0,5 0,6
Gru
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Bio
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.
Apéndice 143
143
Tabla A4. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SWT 0 1 4 1 1,3 5,3 8,1 0,0 0,0
SWT 0 2 4 1 1,2 5,1 8,3 0,7 0,0
SWT 0 3 4 1 1,2 5,4 8,7 0,0 0,0
SWT 0 1 12 3 1,1 5,5 7,8 0,5 0,0
SWT 0 2 12 3 1,2 5,3 7,3 0,5 0,0
SWT 0 3 12 3 1,2 5,3 7,4 0,5 0,0
SWT 0 1 13 3 1,1 4,3 8,7 0,6 0,0
SWT 0 1 20 4 1,0 3,9 7,5 0,5 0,0
SWT 0 2 20 4 0,9 3,5 8,2 0,6 0,0
SWT 0 3 20 4 1,0 3,8 7,2 0,5 0,0
SWT 0 1 38 5 0,8 5,7 6,9 0,4 0,0
SD1E1 11 1 12 3 0,5 2,5 7,3 0,5 0,0
SD1E1 11 1 12 3 1,3 6,5 0,0 5,1 0,8
SD1E1 11 2 12 3 1,3 6,3 0,0 4,5 0,0
SD1E1 11 3 12 3 1,2 6,8 0,0 4,2 0,9
SD1E2 12 1 12 3 0,6 2,5 9,6 0,4 0,0
SD1E3 13 1 12 3 0,8 2,9 5,8 0,9 0,0
SD1E4 14 1 12 3 0,7 3,6 8,0 0,5 0,0
SD1E4 14 1 12 3 0,9 4,1 0,0 6,2 0,0
SD1E4 14 2 12 3 0,0 4,2 0,0 6,4 0,0
SD1E4 14 3 12 3 0,9 3,9 0,0 6,0 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 2,9 8,3 0,7 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 3,0 7,9 0,0 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 2,9 8,1 0,9 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 3,2 5,7 1,1 0,0
SD1E11 111 2 12 3 0,0 2,9 6,1 1,2 0,0
SD1E11 111 3 12 3 0,0 3,0 6,0 1,2 0,0
SD1E12 112 1 12 3 0,0 6,4 7,4 0,0 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,0 6,4 7,4 0,6 0,0
SD1E12 112 3 12 3 0,0 6,2 7,5 0,0 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 2,4 11,3 0,0 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 2,9 9,5 0,8 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 2,6 9,2 0,8 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 5,3 5,0 0,8 0,0
SD1E16 116 2 12 3 0,0 5,1 5,0 0,9 0,0
SD1E16 116 3 12 3 0,0 5,2 5,0 0,9 0,0
SD1E25 125 1 12 3 0,0 5,0 5,2 0,0 0,0
SD1E25 125 2 12 3 0,0 2,6 5,5 2,8 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 3,0 6,3 0,0 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 3,9 7,6 0,0 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 3,8 8,1 0,0 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 3,8 8,0 0,0 0,0
SD1E28 128 1 12 3 0,0 3,3 0,0 7,0 0,0
SD1E28 128 2 12 3 0,0 4,1 0,0 7,3 0,0
SD1E28 128 3 12 3 0,0 4,0 0,0 7,0 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 3,4 0,0 7,2 0,0
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. Transformación genética de S. almeriensis 144
144
Clon code Muestra Edad (d) fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SD1E29 129 2 12 3 0,0 3,3 0,0 7,5 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 3,0 0,0 7,8 0,0
SD1E30 130 1 12 3 0,0 6,8 0,0 4,2 0,0
SD1E30 130 2 12 3 0,0 6,7 0,0 4,4 0,0
SD1E30 130 3 12 3 0,0 6,8 0,0 4,3 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 4,0 7,1 0,0 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 4,0 7,1 0,0 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 3,9 7,0 0,0 0,0
SD1E38 138 1 12 3 1,7 2,5 10,1 0,0 0,0
SD1E38 138 2 12 3 1,6 2,4 10,1 0,0 0,0
SD1E38 138 3 12 3 1,7 2,4 10,5 0,0 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 4,1 4,6 0,9 0,0
SD1E41 141 2 12 3 0,0 3,9 4,8 0,9 0,0
SD1E41 141 3 12 3 0,0 3,9 4,4 0,9 0,0
SD1E43 143 1 12 3 0,0 3,3 9,0 0,0 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,6 3,3 8,1 0,6 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,6 3,8 8,4 0,6 0,0
SD1E47 147 1 12 3 0,0 5,8 7,1 0,0 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 5,9 7,6 0,0 0,0
SD1E47 147 3 12 3 1,0 6,0 6,8 0,0 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 2,5 7,0 0,0 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 2,6 6,8 0,0 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 2,5 6,2 0,0 0,0
SD1E51 151 1 12 3 0,0 2,7 7,3 0,0 0,0
SD1E51 151 2 12 3 0,0 2,7 8,3 0,0 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 2,6 8,2 0,0 0,0
SD1E52 152 1 10 2 0,0 2,1 6,5 0,6 0,0
SD1E52 152 2 10 2 0,0 2,7 7,0 0,0 0,0
SD1E52 152 3 10 2 0,6 2,7 6,7 0,5 0,0
SD1E52 152 1 14 3 0,0 2,2 3,9 0,7 0,0
SD1E52 152 2 14 3 0,0 2,1 4,4 0,7 0,0
SD1E52 152 3 14 3 0,0 2,3 4,6 0,7 0,0
SD1E53 153 1 12 3 0,0 4,0 8,0 0,0 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 4,4 7,8 0,7 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 4,2 7,9 0,8 0,0
SD1E55 155 1 12 3 1,3 5,8 2,7 1,0 0,0
SD1E55 155 2 12 3 1,2 5,6 2,7 1,0 0,0
SD1E55 155 3 12 3 1,2 5,9 2,9 1,0 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 2,6 7,1 0,0 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 2,5 7,3 0,0 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 2,2 7,3 0,0 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 6,7 3,0 0,0 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 6,5 3,2 0,0 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 6,2 3,1 1,1 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 2,4 7,9 0,0 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 2,7 7,6 0,0 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 2,6 7,4 0,0 0,0
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III
.
Apéndice 145
145
Clon code Muestra Edad (d) fase 16:2n4 16:3n3 16:4n3 18:0 Rt2
SD1E70 170 1 12 3 0,0 3,9 8,2 0,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 4,0 7,9 0,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 4,0 7,7 0,0 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 2,6 10,1 0,0 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 3,0 9,4 0,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 3,0 9,4 0,0 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 2,3 7,0 0,0 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 2,4 7,3 0,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 1,9 8,2 0,0 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 2,9 5,4 1,2 0,0
SD1E78 178 2 12 3 0,9 3,1 4,7 1,3 0,0
SD1E78 178 3 12 3 0,8 3,0 5,1 1,3 0,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 3,6 9,4 0,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 3,6 9,0 0,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 3,3 9,5 0,0 0,0
SD2C1 21 1 12 3 1,8 5,8 5,1 0,7 0,0
SD2C1 21 2 12 3 1,8 6,4 5,1 0,7 0,0
SD2C1 21 3 12 3 1,8 5,9 5,1 0,7 0,0
SD2C2 22 1 12 3 1,2 3,2 7,2 0,0 0,0
SD2C2 22 2 12 3 1,2 3,1 7,2 0,6 0,0
SD2C2 22 3 12 3 1,3 3,4 7,6 0,0 0,0
SD2C7 27 1 12 3 0,9 5,3 6,0 0,8 0,0
SD2C7 27 2 12 3 0,9 5,3 6,5 0,8 0,0
SD2C7 27 3 12 3 0,9 5,3 6,3 0,8 0,0
SD2C8 28 1 12 3 1,2 3,9 6,3 0,6 0,0
SD2C8 28 2 12 3 1,0 3,4 7,1 0,6 0,0
SD2C8 28 3 12 3 1,1 3,7 6,9 0,6 0,0
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III
. Transformación genética de S. almeriensis 146
146
Tabla A4. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:2n6 18:3n6
SWT 0 1 4 1 23,1 1,6 9,7 9,7 0,0
SWT 0 2 4 1 22,3 1,4 9,0 9,0 0,6
SWT 0 3 4 1 20,5 1,6 9,1 9,1 0,6
SWT 0 1 12 3 19,7 2,0 11,0 11,0 1,1
SWT 0 2 12 3 21,5 2,0 10,2 10,2 1,1
SWT 0 3 12 3 21,1 2,1 10,1 10,1 1,2
SWT 0 1 13 3 18,8 2,5 9,6 9,6 1,2
SWT 0 1 20 4 23,7 2,1 9,1 9,1 1,1
SWT 0 2 20 4 23,3 2,1 8,9 8,9 1,2
SWT 0 3 20 4 26,0 1,9 8,7 8,7 1,0
SWT 0 1 38 5 18,8 3,0 9,9 9,9 1,2
SD1E1 11 1 12 3 31,0 1,6 4,7 4,7 0,4
SD1E1 11 1 12 3 26,3 1,9 9,0 9,0 0,0
SD1E1 11 2 12 3 27,8 2,2 9,4 9,4 0,0
SD1E1 11 3 12 3 26,6 2,0 9,0 9,0 0,0
SD1E2 12 1 12 3 23,7 1,7 6,2 6,2 0,6
SD1E3 13 1 12 3 32,3 0,9 5,8 5,8 0,4
SD1E4 14 1 12 3 26,6 1,6 6,7 6,7 0,7
SD1E4 14 1 12 3 25,9 2,6 8,6 8,6 0,0
SD1E4 14 2 12 3 25,0 2,8 9,1 9,1 0,0
SD1E4 14 3 12 3 25,9 2,7 8,7 8,7 0,0
SD1E10 110 1 12 3 25,4 2,8 6,4 6,4 0,9
SD1E10 110 2 12 3 25,7 3,1 6,5 6,5 0,9
SD1E10 110 3 12 3 25,7 3,0 6,2 6,2 0,9
SD1E11 111 1 12 3 30,3 2,0 8,8 8,8 0,8
SD1E11 111 2 12 3 30,4 2,0 8,7 8,7 0,8
SD1E11 111 3 12 3 30,2 2,0 8,6 8,6 0,8
SD1E12 112 1 12 3 17,6 2,9 8,1 8,1 1,0
SD1E12 112 2 12 3 17,5 2,8 8,3 8,3 1,1
SD1E12 112 3 12 3 18,4 2,7 8,4 8,4 0,9
SD1E13 113 1 12 3 22,9 2,0 6,8 6,8 0,0
SD1E13 113 2 12 3 25,1 2,5 6,7 6,7 0,0
SD1E13 113 3 12 3 25,5 2,4 6,3 6,3 0,6
SD1E16 116 1 12 3 29,3 2,1 8,8 8,8 0,5
SD1E16 116 2 12 3 30,1 2,1 8,8 8,8 0,5
SD1E16 116 3 12 3 30,1 2,2 8,6 8,6 0,4
SD1E25 125 1 12 3 25,9 4,9 9,7 9,7 0,0
SD1E25 125 2 12 3 27,7 3,9 10,4 10,4 1,1
SD1E25 125 3 12 3 28,8 4,0 11,2 11,2 0,0
SD1E26 126 1 12 3 22,0 3,7 9,8 9,8 0,0
SD1E26 126 2 12 3 21,9 3,8 9,8 9,8 0,0
SD1E26 126 3 12 3 22,6 3,7 9,5 9,5 0,0
SD1E28 128 1 12 3 24,1 2,1 9,2 9,2 0,0
SD1E28 128 2 12 3 23,1 1,7 10,1 10,1 0,0
SD1E28 128 3 12 3 24,0 1,7 10,0 10,0 0,0
SD1E29 129 1 12 3 28,9 1,3 6,4 6,4 0,0
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.
Apéndice 147
147
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:2n6 18:3n6
SD1E29 129 2 12 3 29,1 1,3 6,4 6,4 0,0
SD1E29 129 3 12 3 29,0 1,3 6,1 6,1 0,0
SD1E30 130 1 12 3 22,1 2,1 12,0 12,0 0,0
SD1E30 130 2 12 3 21,3 2,3 11,9 11,9 0,0
SD1E30 130 3 12 3 21,8 2,2 12,1 12,1 0,0
SD1E36 136 1 12 3 25,9 3,9 7,5 7,5 0,0
SD1E36 136 2 12 3 26,0 4,3 7,2 7,2 0,0
SD1E36 136 3 12 3 25,6 3,8 7,2 7,2 0,0
SD1E38 138 1 12 3 17,4 3,9 15,1 15,1 1,3
SD1E38 138 2 12 3 18,6 3,7 14,4 14,4 1,2
SD1E38 138 3 12 3 17,7 3,6 14,9 14,9 0,0
SD1E41 141 1 12 3 32,0 2,1 9,2 9,2 0,5
SD1E41 141 2 12 3 33,3 1,9 8,6 8,6 0,5
SD1E41 141 3 12 3 32,8 2,0 8,9 8,9 0,6
SD1E43 143 1 12 3 26,7 2,4 7,6 7,6 0,0
SD1E43 143 2 12 3 29,6 2,1 7,5 7,5 0,0
SD1E43 143 3 12 3 26,7 2,2 7,7 7,7 1,0
SD1E47 147 1 12 3 25,8 3,0 8,5 8,5 0,0
SD1E47 147 2 12 3 24,6 3,1 8,6 8,6 0,0
SD1E47 147 3 12 3 25,8 3,0 8,5 8,5 0,7
SD1E48 148 1 12 3 33,3 2,9 6,5 6,5 0,0
SD1E48 148 2 12 3 33,7 2,8 6,5 6,5 0,0
SD1E48 148 3 12 3 34,0 2,8 6,3 6,3 0,8
SD1E51 151 1 12 3 25,5 3,3 6,5 6,5 0,0
SD1E51 151 2 12 3 23,8 3,6 7,3 7,3 0,0
SD1E51 151 3 12 3 23,4 3,5 6,8 6,8 0,0
SD1E52 152 1 10 2 25,0 3,7 11,5 11,5 2,0
SD1E52 152 2 10 2 24,0 3,5 10,6 10,6 1,8
SD1E52 152 3 10 2 24,3 3,2 10,4 10,4 1,7
SD1E52 152 1 14 3 33,0 3,0 11,2 11,2 2,0
SD1E52 152 2 14 3 31,6 3,1 11,4 11,4 2,2
SD1E52 152 3 14 3 31,2 3,1 11,3 11,3 2,2
SD1E53 153 1 12 3 28,3 2,3 8,5 8,5 0,0
SD1E53 153 2 12 3 26,9 2,2 8,7 8,7 0,8
SD1E53 153 3 12 3 28,2 1,9 8,4 8,4 0,8
SD1E55 155 1 12 3 37,9 0,0 8,7 8,7 0,0
SD1E55 155 2 12 3 37,9 0,0 8,7 8,7 0,0
SD1E55 155 3 12 3 37,0 0,0 8,7 8,7 0,0
SD1E63 163 1 12 3 28,1 3,5 8,3 8,3 0,0
SD1E63 163 2 12 3 27,7 3,5 7,8 7,8 1,0
SD1E63 163 3 12 3 28,3 3,5 8,2 8,2 1,2
SD1E64 164 1 12 3 26,6 4,7 10,4 10,4 0,0
SD1E64 164 2 12 3 27,2 4,5 10,5 10,5 0,0
SD1E64 164 3 12 3 26,5 4,3 10,4 10,4 0,0
SD1E68 168 1 12 3 25,3 3,6 8,5 8,5 0,0
SD1E68 168 2 12 3 25,5 3,4 8,5 8,5 0,0
SD1E68 168 3 12 3 26,6 3,6 7,8 7,8 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
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Pro
duct
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Natu
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s. L
abora
tori
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enét
ica
III
. Transformación genética de S. almeriensis 148
148
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:1n9 18:1n7 18:2n6 18:2n6 18:3n6
SD1E70 170 1 12 3 26,1 2,0 7,0 7,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 26,4 1,9 7,3 7,3 0,0
SD1E70 170 3 12 3 27,6 1,8 6,9 6,9 0,0
SD1E72 172 1 12 3 19,2 3,4 7,6 7,6 1,2
SD1E72 172 2 12 3 19,7 3,3 7,8 7,8 1,0
SD1E72 172 3 12 3 20,4 3,3 7,8 7,8 0,0
SD1E77 177 1 12 3 35,6 2,0 6,4 6,4 0,0
SD1E77 177 2 12 3 34,9 2,0 6,6 6,6 0,0
SD1E77 177 3 12 3 33,3 2,3 6,3 6,3 0,0
SD1E78 178 1 12 3 36,8 1,9 6,8 6,8 0,0
SD1E78 178 2 12 3 37,3 1,8 6,9 6,9 0,0
SD1E78 178 3 12 3 36,5 2,0 6,9 6,9 0,0
SD1E79 179 1 12 3 21,1 3,9 9,0 9,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 23,5 3,3 9,0 9,0 0,0
SD1E79 179 3 12 3 21,1 3,1 8,7 8,7 0,0
SD2C1 21 1 12 3 24,4 2,0 11,9 11,9 0,0
SD2C1 21 2 12 3 23,1 2,1 12,3 12,3 0,0
SD2C1 21 3 12 3 23,4 2,1 12,1 12,1 0,0
SD2C2 22 1 12 3 22,2 1,7 9,1 9,1 0,0
SD2C2 22 2 12 3 21,7 1,6 9,4 9,4 0,0
SD2C2 22 3 12 3 21,1 1,6 9,4 9,4 0,0
SD2C7 27 1 12 3 25,2 1,6 7,4 7,4 0,0
SD2C7 27 2 12 3 24,2 1,4 6,7 6,7 0,0
SD2C7 27 3 12 3 24,3 1,5 6,8 6,8 0,0
SD2C8 28 1 12 3 22,0 1,6 9,4 9,4 0,0
SD2C8 28 2 12 3 21,2 1,6 8,5 8,5 0,0
SD2C8 28 3 12 3 21,4 1,3 8,8 8,8 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
de
Pro
duct
os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
e G
enét
ica
III
.
Apéndice 149
149
Tabla A4. (continuación).
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:3D? Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9
SWT 0 1 4 1 0,0 0,0 22,6 4,8 0,0
SWT 0 2 4 1 0,7 0,0 22,3 4,7 0,0
SWT 0 3 4 1 0,7 0,0 23,3 4,9 0,0
SWT 0 1 12 3 1,2 0,0 21,5 4,4 0,0
SWT 0 2 12 3 1,1 0,0 20,9 4,4 0,0
SWT 0 3 12 3 1,2 0,0 21,2 4,4 0,0
SWT 0 1 13 3 1,5 0,0 22,4 4,7 0,0
SWT 0 1 20 4 1,4 0,0 20,0 3,7 0,4
SWT 0 2 20 4 1,4 0,0 20,9 3,9 0,0
0SWT 0 3 20 4 1,3 0,0 19,3 3,6 0,0
SWT 0 1 38 5 1,7 0,0 24,1 3,4 0,0
SD1E1 11 1 12 3 0,7 0,0 18,4 3,8 0,4
SD1E1 11 1 12 3 0,8 0,0 20,0 3,5 0,0
SD1E1 11 2 12 3 0,0 0,0 18,7 3,5 0,0
SD1E1 11 3 12 3 0,0 0,0 19,7 3,3 0,0
SD1E2 12 1 12 3 0,8 0,0 23,9 4,4 0,5
SD1E3 13 1 12 3 0,7 0,0 16,4 4,1 0,6
SD1E4 14 1 12 3 0,7 0,0 21,4 4,9 0,0
SD1E4 14 1 12 3 0,9 0,0 23,2 4,9 0,0
SD1E4 14 2 12 3 1,3 0,0 24,5 5,4 0,0
SD1E4 14 3 12 3 1,2 0,0 22,7 5,1 0,0
SD1E10 110 1 12 3 0,0 0,0 23,1 5,9 0,0
SD1E10 110 2 12 3 0,0 0,0 23,1 6,0 0,0
SD1E10 110 3 12 3 0,0 0,0 23,1 6,0 0,0
SD1E11 111 1 12 3 0,0 0,0 18,4 3,3 0,8
SD1E11 111 2 12 3 0,0 0,0 19,0 3,4 0,7
SD1E11 111 3 12 3 0,0 0,0 18,7 3,4 0,7
SD1E12 112 1 12 3 0,0 0,0 26,8 4,7 0,0
SD1E12 112 2 12 3 0,0 0,0 26,2 4,7 0,0
SD1E12 112 3 12 3 0,0 0,0 26,5 4,6 0,0
SD1E13 113 1 12 3 0,0 0,0 27,8 5,1 0,0
SD1E13 113 2 12 3 0,0 0,0 24,3 4,3 0,0
SD1E13 113 3 12 3 0,0 0,0 23,5 4,3 0,0
SD1E16 116 1 12 3 0,0 0,0 20,4 2,4 0,6
SD1E16 116 2 12 3 0,0 0,0 19,9 2,5 0,6
SD1E16 116 3 12 3 0,0 0,0 20,4 2,4 0,6
SD1E25 125 1 12 3 0,0 0,0 17,3 6,7 0,0
SD1E25 125 2 12 3 0,0 0,0 17,6 5,6 0,0
SD1E25 125 3 12 3 0,0 0,0 19,9 5,2 0,0
SD1E26 126 1 12 3 0,0 0,0 24,9 6,2 0,0
SD1E26 126 2 12 3 0,0 0,0 26,1 4,6 0,0
SD1E26 126 3 12 3 0,0 0,0 25,4 4,5 0,0
SD1E28 128 1 12 3 1,5 0,0 22,7 5,4 0,0
SD1E28 128 2 12 3 1,6 0,0 22,4 5,0 0,0
SD1E28 128 3 12 3 1,6 0,0 22,2 5,1 0,0
SD1E29 129 1 12 3 0,0 0,0 23,7 6,0 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
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Pro
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os
Natu
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s. L
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tori
o d
e G
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ica
III
. Transformación genética de S. almeriensis 150
150
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:3D? Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9
SD1E29 129 2 12 3 0,0 0,0 23,2 5,9 0,0
SD1E29 129 3 12 3 0,0 0,0 23,9 6,0 0,0
SD1E30 130 1 12 3 1,6 0,0 22,9 5,3 0,0
SD1E30 130 2 12 3 1,5 0,0 23,8 5,4 0,0
SD1E30 130 3 12 3 1,6 0,0 23,2 5,4 0,0
SD1E36 136 1 12 3 0,0 0,0 24,2 5,1 0,0
SD1E36 136 2 12 3 0,0 0,0 24,2 5,3 0,0
SD1E36 136 3 12 3 0,0 0,0 23,9 5,0 1,4
SD1E38 138 1 12 3 0,0 0,0 21,0 4,4 0,0
SD1E38 138 2 12 3 0,0 0,0 20,9 4,4 0,0
SD1E38 138 3 12 3 0,0 0,0 21,6 4,6 0,0
SD1E41 141 1 12 3 0,0 0,0 18,4 3,4 0,0
SD1E41 141 2 12 3 0,0 0,0 18,5 3,4 0,5
SD1E41 141 3 12 3 0,3 0,0 17,5 3,3 0,5
SD1E43 143 1 12 3 0,9 0,0 22,6 4,4 0,0
SD1E43 143 2 12 3 0,9 0,0 20,4 3,9 0,0
SD1E43 143 3 12 3 0,5 0,0 21,8 4,2 0,5
SD1E47 147 1 12 3 0,0 0,0 24,3 4,7 0,0
SD1E47 147 2 12 3 0,0 0,0 25,3 4,6 0,0
SD1E47 147 3 12 3 0,0 0,0 23,1 4,6 0,0
SD1E48 148 1 12 3 0,0 0,0 21,3 6,2 0,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 0,0 21,0 5,2 0,0
SD1E48 148 3 12 3 0,0 0,0 20,3 4,5 1,3
SD1E51 151 1 12 3 0,0 0,0 22,6 6,3 1,6
SD1E51 151 2 12 3 0,0 0,0 24,7 5,8 0,0
SD1E51 151 3 12 3 0,0 0,0 24,5 5,8 1,8
SD1E52 152 1 10 2 0,7 0,0 19,2 4,9 0,0
SD1E52 152 2 10 2 0,0 0,0 20,8 5,6 0,0
SD1E52 152 3 10 2 0,6 0,0 19,9 5,5 0,0
SD1E52 152 1 14 3 0,6 0,0 13,6 3,9 0,0
SD1E52 152 2 14 3 0,6 0,0 14,5 4,2 0,0
SD1E52 152 3 14 3 0,6 0,0 14,5 4,2 0,0
SD1E53 153 1 12 3 0,0 0,0 24,3 4,5 0,0
SD1E53 153 2 12 3 0,0 0,0 24,3 4,1 0,0
SD1E53 153 3 12 3 0,0 0,0 23,9 4,0 0,0
SD1E55 155 1 12 3 0,0 0,0 17,8 3,4 0,0
SD1E55 155 2 12 3 0,0 0,0 18,2 3,6 0,0
SD1E55 155 3 12 3 0,0 0,0 18,6 3,7 0,0
SD1E63 163 1 12 3 0,0 0,0 21,4 6,7 0,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 0,0 21,6 6,4 0,0
SD1E63 163 3 12 3 0,0 0,0 21,5 6,7 0,0
SD1E64 164 1 12 3 0,0 0,0 18,1 3,7 0,0
SD1E64 164 2 12 3 0,0 0,0 17,7 3,8 0,0
SD1E64 164 3 12 3 0,0 0,0 17,8 3,8 0,0
SD1E68 168 1 12 3 0,0 0,0 23,2 5,6 0,0
SD1E68 168 2 12 3 0,0 0,0 22,9 6,2 0,0
SD1E68 168 3 12 3 0,0 0,0 22,5 5,6 0,0
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
de
Pro
duct
os
Natu
rale
s. L
abora
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o d
e G
enét
ica
III
.
Apéndice 151
151
Clon code Muestra Edad (d) fase 18:3D? Rt3 18:3n3 18:4n3 20:1n9
SD1E70 170 1 12 3 0,0 0,0 24,9 5,0 0,0
SD1E70 170 2 12 3 0,0 0,0 24,5 5,0 0,0
SD1E70 170 3 12 3 0,0 0,0 23,7 4,9 0,0
SD1E72 172 1 12 3 0,0 0,0 28,4 6,1 0,0
SD1E72 172 2 12 3 0,0 0,0 27,6 6,0 0,0
SD1E72 172 3 12 3 0,0 0,0 27,9 6,1 0,0
SD1E77 177 1 12 3 0,0 0,0 18,7 5,2 0,0
SD1E77 177 2 12 3 0,0 0,0 19,3 5,0 0,0
SD1E77 177 3 12 3 0,0 0,0 20,7 5,4 0,0
SD1E78 178 1 12 3 0,0 0,0 16,2 3,0 1,1
SD1E78 178 2 12 3 0,0 0,0 15,2 2,8 1,1
SD1E78 178 3 12 3 0,0 0,0 15,5 2,9 1,0
SD1E79 179 1 12 3 0,0 0,0 26,1 5,0 0,0
SD1E79 179 2 12 3 0,0 0,0 25,1 4,5 0,0
SD1E79 179 3 12 3 0,0 0,0 25,9 4,9 0,0
SD2C1 21 1 12 3 0,9 1,3 20,2 3,1 0,6
SD2C1 21 2 12 3 0,9 1,3 20,4 3,2 0,6
SD2C1 21 3 12 3 0,9 1,4 20,5 3,3 0,6
SD2C2 22 1 12 3 0,8 1,0 22,0 5,7 0,0
SD2C2 22 2 12 3 0,8 1,1 21,7 5,7 0,0
SD2C2 22 3 12 3 0,8 1,0 22,6 5,8 0,0
SD2C7 27 1 12 3 0,0 0,9 23,5 4,7 0,7
SD2C7 27 2 12 3 0,4 0,8 24,2 4,9 0,7
SD2C7 27 3 12 3 0,4 0,9 23,8 4,9 0,7
SD2C8 28 1 12 3 0,8 1,1 21,2 5,1 0,6
SD2C8 28 2 12 3 0,8 1,1 22,7 5,3 0,0
SD2C8 28 3 12 3 0,8 1,1 22,4 5,2 0,7
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
de
Pro
duct
os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
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enét
ica
III
. Transformación genética de S. almeriensis 152
152
Tabla A4. (continuación).
Clon code Muestra Edad
(d)
fase Rt4 Rt5 PUFA% MUFA% SFA%
SWT 0 1 4 1 1,4 0,0 53,2 29,6 17,2
SWT 0 2 4 1 1,3 0,0 53,7 29,2 17,1
SWT 0 3 4 1 1,4 0,0 55,9 27,7 16,4
SWT 0 1 12 3 1,9 0,0 56,0 27,4 16,5
SWT 0 2 12 3 1,7 0,0 53,9 29,2 16,9
SWT 0 3 12 3 1,8 0,0 54,2 28,9 16,9
SWT 0 1 13 3 2,1 0,0 56,3 27,5 16,3
SWT 0 1 20 4 1,6 0,0 49,8 32,4 17,9
SWT 0 2 20 4 1,7 0,0 50,6 31,2 18,2
SWT 0 3 20 4 1,6 0,0 47,9 33,8 18,3
SWT 0 1 38 5 1,8 0,0 56,1 27,7 16,2
SD1E1 11 1 12 3 1,7 0,4 40,8 39,2 20,0
SD1E1 11 1 12 3 0,0 0,0 41,1 33,5 24,6
SD1E1 11 2 12 3 1,9 0,0 41,1 35,4 23,5
SD1E1 11 3 12 3 2,3 0,0 42,4 33,6 23,1
SD1E2 12 1 12 3 1,6 0,0 50,9 31,2 17,9
SD1E3 13 1 12 3 1,3 0,4 39,1 39,0 21,9
SD1E4 14 1 12 3 1,4 0,0 48,8 32,8 18,3
SD1E4 14 1 12 3 1,4 0,0 44,1 32,7 23,3
SD1E4 14 2 12 3 0,0 0,0 44,6 32,0 23,4
SD1E4 14 3 12 3 1,5 0,0 44,0 32,8 23,3
SD1E10 110 1 12 3 1,3 0,0 48,8 32,3 18,9
SD1E10 110 2 12 3 1,5 0,0 49,0 32,8 18,2
SD1E10 110 3 12 3 1,3 0,0 48,5 32,6 19,0
SD1E11 111 1 12 3 0,6 0,0 41,4 38,4 20,2
SD1E11 111 2 12 3 0,0 0,0 41,6 38,0 20,4
SD1E11 111 3 12 3 0,7 0,0 42,0 37,8 20,2
SD1E12 112 1 12 3 1,5 0,0 56,0 26,9 17,0
SD1E12 112 2 12 3 1,6 0,0 56,3 26,7 17,0
SD1E12 112 3 12 3 1,7 0,0 55,8 27,6 16,6
SD1E13 113 1 12 3 0,0 0,0 53,5 27,1 19,4
SD1E13 113 2 12 3 0,0 0,0 47,6 32,0 20,3
SD1E13 113 3 12 3 1,0 0,0 47,4 32,1 20,5
SD1E16 116 1 12 3 0,7 0,0 43,9 36,3 19,8
SD1E16 116 2 12 3 0,6 0,0 43,1 37,0 19,8
SD1E16 116 3 12 3 0,0 0,0 42,8 37,1 20,1
SD1E25 125 1 12 3 0,0 0,0 44,0 36,8 19,2
SD1E25 125 2 12 3 0,0 0,0 42,8 36,4 20,8
SD1E25 125 3 12 3 0,0 0,0 45,6 36,7 17,7
SD1E26 126 1 12 3 0,0 0,0 52,5 30,1 17,5
SD1E26 126 2 12 3 0,0 0,0 52,4 30,2 17,5
SD1E26 126 3 12 3 0,0 0,0 51,3 30,9 17,8
SD1E28 128 1 12 3 3,2 0,0 45,3 30,1 24,7
SD1E28 128 2 12 3 2,0 0,0 45,1 29,1 25,8
SD1E28 128 3 12 3 1,9 0,0 44,8 29,9 25,3
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
de
Pro
duct
os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
e G
enét
ica
III
.
Apéndice 153
153
Clon code Muestra Edad
(d)
fase Rt4 Rt5 PUFA% MUFA% SFA%
SD1E29 129 1 12 3 1,6 0,0 41,2 33,9 24,9
SD1E29 129 2 12 3 1,6 0,0 40,4 34,3 25,3
SD1E29 129 3 12 3 1,3 0,0 40,3 34,0 25,7
SD1E30 130 1 12 3 0,0 0,0 48,6 28,6 22,9
SD1E30 130 2 12 3 0,0 0,0 49,4 27,9 22,7
SD1E30 130 3 12 3 0,0 0,0 49,1 28,3 22,6
SD1E36 136 1 12 3 0,0 0,0 47,9 34,6 17,5
SD1E36 136 2 12 3 0,0 0,0 47,8 35,0 17,2
SD1E36 136 3 12 3 0,0 0,0 47,1 35,8 17,1
SD1E38 138 1 12 3 0,0 0,0 56,1 27,1 16,9
SD1E38 138 2 12 3 0,0 0,0 55,0 27,9 17,0
SD1E38 138 3 12 3 0,0 0,0 55,7 27,3 17,0
SD1E41 141 1 12 3 1,9 0,0 43,2 39,0 17,9
SD1E41 141 2 12 3 1,6 0,0 42,4 40,6 17,0
SD1E41 141 3 12 3 1,6 0,0 41,5 40,9 17,5
SD1E43 143 1 12 3 1,7 0,0 49,6 32,8 17,6
SD1E43 143 2 12 3 1,5 0,0 46,3 35,4 18,3
SD1E43 143 3 12 3 0,0 0,0 47,9 34,0 18,1
SD1E47 147 1 12 3 0,0 0,0 50,5 33,6 15,9
SD1E47 147 2 12 3 0,0 0,0 52,0 32,1 15,9
SD1E47 147 3 12 3 0,0 0,0 50,7 33,7 15,6
SD1E48 148 1 12 3 0,0 0,0 43,5 40,5 16,0
SD1E48 148 2 12 3 0,0 0,0 42,0 42,3 15,7
SD1E48 148 3 12 3 0,0 0,0 40,7 43,7 15,5
SD1E51 151 1 12 3 0,0 0,0 45,5 35,1 19,5
SD1E51 151 2 12 3 0,0 0,0 48,7 32,4 18,9
SD1E51 151 3 12 3 0,0 0,0 47,9 33,5 18,5
SD1E52 152 1 10 2 1,5 0,0 49,4 33,2 17,4
SD1E52 152 2 10 2 1,4 0,0 50,7 32,2 17,2
SD1E52 152 3 10 2 1,4 0,0 50,2 32,4 17,4
SD1E52 152 1 14 3 1,3 0,0 39,3 40,9 19,8
SD1E52 152 2 14 3 1,4 0,0 41,4 39,5 19,1
SD1E52 152 3 14 3 1,3 0,0 41,5 39,3 19,2
SD1E53 153 1 12 3 0,0 0,0 49,2 34,3 16,5
SD1E53 153 2 12 3 0,0 0,0 50,1 33,3 16,6
SD1E53 153 3 12 3 0,0 0,0 49,1 33,7 17,2
SD1E55 155 1 12 3 0,0 0,0 39,8 42,4 17,9
SD1E55 155 2 12 3 0,0 0,0 40,1 42,3 17,6
SD1E55 155 3 12 3 0,0 0,0 41,0 41,4 17,6
SD1E63 163 1 12 3 0,0 0,0 46,0 36,0 18,0
SD1E63 163 2 12 3 0,0 0,0 46,7 35,4 17,9
SD1E63 163 3 12 3 0,0 0,0 47,2 35,0 17,8
SD1E64 164 1 12 3 0,0 0,0 41,9 37,7 20,5
SD1E64 164 2 12 3 0,0 0,0 41,6 37,9 20,5
SD1E64 164 3 12 3 0,0 0,0 41,3 37,9 20,8
SD1E68 168 1 12 3 0,0 0,0 47,7 33,9 18,4
SD1E68 168 2 12 3 0,0 0,0 47,8 33,8 18,4
Gru
po
de
inve
stig
aci
ón “
Bio
tecn
olo
gía
de
Pro
duct
os
Natu
rale
s. L
abora
tori
o d
e G
enét
ica
III
. Transformación genética de S. almeriensis 154
154
Clon code Muestra Edad
(d)
fase Rt4 Rt5 PUFA% MUFA% SFA%
SD1E68 168 3 12 3 0,0 0,0 46,0 35,3 18,7
SD1E70 170 1 12 3 0,0 0,0 49,0 32,3 18,7
SD1E70 170 2 12 3 0,0 0,0 48,8 32,6 18,6
SD1E70 170 3 12 3 0,0 0,0 47,2 33,6 19,1
SD1E72 172 1 12 3 0,0 0,0 55,8 26,1 18,1
SD1E72 172 2 12 3 0,0 0,0 54,9 26,5 18,6
SD1E72 172 3 12 3 0,0 0,0 54,2 27,1 18,7
SD1E77 177 1 12 3 0,0 0,0 39,6 42,1 18,4
SD1E77 177 2 12 3 0,0 0,0 40,6 41,0 18,4
SD1E77 177 3 12 3 0,0 0,0 42,6 39,9 17,6
SD1E78 178 1 12 3 0,0 0,0 34,2 43,4 22,4
SD1E78 178 2 12 3 0,0 0,0 33,7 43,7 22,6
SD1E78 178 3 12 3 0,0 0,0 34,2 43,1 22,7
SD1E79 179 1 12 3 0,0 0,0 53,1 29,3 17,6
SD1E79 179 2 12 3 0,0 0,0 51,2 31,2 17,7
SD1E79 179 3 12 3 1,5 0,0 54,7 28,1 17,2
SD2C1 21 1 12 3 2,6 0,8 53,8 30,2 16,1
SD2C1 21 2 12 3 2,5 0,7 55,0 28,9 16,1
SD2C1 21 3 12 3 2,8 0,8 54,6 29,4 16,1
SD2C2 22 1 12 3 2,5 1,1 54,5 28,6 16,9
SD2C2 22 2 12 3 2,6 1,1 54,4 28,0 17,6
SD2C2 22 3 12 3 2,6 1,1 55,6 27,5 16,9
SD2C7 27 1 12 3 2,2 0,8 51,7 31,9 16,4
SD2C7 27 2 12 3 2,1 0,8 52,7 31,3 16,1
SD2C7 27 3 12 3 2,1 0,7 52,3 31,6 16,2
SD2C8 28 1 12 3 2,9 1,0 53,3 29,1 17,5
SD2C8 28 2 12 3 2,9 1,3 54,7 27,9 17,4
SD2C8 28 3 12 3 2,8 1,2 54,6 28,2 17,2
