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A Dios por ser nuestro guía, quien ha permitido que sigamos de pie, Por darnos la fuerza necesaria para seguir adelante.

A nuestros padres, por darnos la vida, por brindarnos su apoyo Incondicional siempre, por estar con nosotros en las buenas y en las malas.

A nuestros hermanos por ser parte de nuestra vida A nuestros familiares por estar con nosotros y darnos ánimos para seguir adelante. A nuestros amigos por compartir con nosotros su amistad, su sinceridad por ser parte importante de nuestra vida estudiantil.

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RESUMEN

A la Universidad Nacional de Ingeniería en especial al laboratorio de microbiología de la facultad de ingeniería ambiental por habernos permitido cumplir con nuestro laboratorio, y formarnos día a día como futuros profesionales. Al Dr. Alejandro Mendoza por su asesoramiento y valiosa colaboración en el presente laboratorio.

A nuestros compañeros que con su apoyo hicieron posible la culminación de este proyecto de laboratorio.

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INDICE

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1.INTRODUCCIÓNDebido a que los microorganismos son ubicuos, -se encuentran presentes en todas partes como el aire, el agua, el suelo, los alimentos, sobre las superficies de los objetos y sobre el exterior e incluso en el interior de todos los organismos- influencian o actúan en diversos campos de nuestra vida como n la salud, industria etc… y también son objetos de estudio por las diferentes ramas de la microbiología como lo son en:

La microbiología médica para la prevención, diagnóstico y control de las enfermedades causadas por microorganismos patógenos como por ejemplo los estafilococos, Salmonella, Shinguella, etc. Además estudia la epidemiología, antibiosis e inmunización.

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La microbiología agrícola en donde los microorganismos nos ayudan a fertilizar las plantas y en los animales permiten la degradación interna de sus alimentos como en los vacunos al descomponer sus alimentos y formar el rumen. También el aspecto médico en plantas y animales.

La microbiología ambiental donde se da importancia a los microorganismos ya que estos regulan y mantienen los procesos geofisiológicos como lo son la temperatura, química atmosférica y la circulación de nutrientes.

La microbiología industrial en el cual los microrganismos intervienen en la producción de sustancias como medicinas, alcoholes, ácidos grasos que son producto del metabolismo bacteriano.

También influencian en campos como lo son la microbiología de alimentos, microbiología bélica, biotecnología microbiológica, y también por los demás campos de la ciencia.

Debido a que la presencia y los campos de acción de los microorganismos son muy amplios y variados-generan problemas (como las enfermedades) pero también beneficios(biorremedación)-es de vital importancia identificarlos y estudiarlo, es por ello que se realizó el presente informe de investigación para determinar la presencia de bacterias en diversas muestras de la Universidad Nacional de Ingeniería para conocer los métodos de cultivo y de siembra, y también la lectura e identificación de las muestras a nivel de género, mas no de especie (para este tipo de identificación se deben hacer pruebas bioquímicas de los microorganismos analizados, pero se puede suponer cierto tipo de especies sin estas pruebas) para lo cual se cultivó bacterias de diversas muestras en diferentes medios los cuales fueron: SS Agar, TSA, agar saburado (medios de cultivo sólido), BHI, caldo lactosado(medios de cultivo líquido) que luego se dieron las lecturas: dentro del ámbito macroscópico se caracterizó las colonias de las bacterias encontradas (tamaño, forma, elevación, superficie, borde, consistencia, cromogénesis, grado de transparencia), mientras que en el ámbito microscópico se describió la morfología bacteriana.

2. MARCO TEORICOPara efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra

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parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad .La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito específico del estudio.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada.

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.

Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:

- Agua. Se debe usar agua destilada.- Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se

obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.

- Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.

- Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.

- Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio.

Clasificación de los medios de cultivo

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

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c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Según su consistencia

a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.

b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15 g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido".

c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio.

Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar.

Según su composición:

A causa de los requerimientos químicos del mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar componentes químicos del medio.

a) MEDIOS COMUNES O UNIVERSALES: Tienen los componentes esenciales y destinados para cultivar la mayoría de las bacterias. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemplo: Agua peptonada, Agua común, Agar común o Caldo común.

b) MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se forman a partir de un medio basal o común. Al que se le añade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada y pueden ser:

1. ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Ejemplos:

- Agar Sangre: Cuando a un medio basal o común se le añade entre 5 a 10% de sangre (mayoría de bacterias patógenas)

- Agar Ogawa o Lowenstein-Jensen (bacilo de Koch)- Agar Chocolate: Cuando el agar sangre se calienta entre 60- 80

°C hasta que tome un color chocolate ( gonococos y mengicocos)- Caldo Cerebro- Corazón (Brain Heart Infusion), microorganismos

exigentes. 2. SELECTIVOS:

Son medios en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de

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medio sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo:

- Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos).

- Agar Mc Conkey (E. coli y otras enterobacterias).- Agar EC (E. coli).- Agar Centrimide (Pseudomonas).- Agar Mitis Salivarius (Estreptococos orales).- Agar TCBS (Vibrio cholerae).- Agar Sabouraud (Hongos).- Agar SS (Salmonella y Shigella).

Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:

’ Cambio de pH: por ejemplo agregando ácido acético para favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil para la mayoría de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. Faecalis a pH 9,6.

’ Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece óptimamente entre 20º C y 40º C. Los cultivos típicos de S. Faecalis requieren 60º C de temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4º C.

’ Alteraciones osmóticas: se acrecientan las propiedades osmóticas un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la selección de bacterias halófilas como Staphylococcus spp. (7,5%).

’ Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de aerobios y anaerobios.

’ Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión más allá de la atmosférica.

Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables tenemos: ’ Antisépticos: sustancias antibacterianas inespecíficas que pueden actuar como inhibidores. Por ejemplo: el medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que contiene verde brillante (inhibe las bacterias Gram-positivas) y sales biliares (que inhiben un gran número de Gram-negativas menos enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal violeta (inhibe las Gram-positivas pero no las enterobacterias)

’ Antibióticos: sustancias antibacterianas específicas que impiden el crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa que crezcan en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer - Martin con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aislamiento de gonococos. La penicilina en una concentración de 5,50 unidades/ ml inhibe la mayoría de las Gram-positivas. Otro ejemplo es el medio de Sabouraud - cloranfenicol para el aislamiento de Cándida albicans.

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3. DIFERENCIALES:Son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya única fuente de carbono es el citrato sódico, entonces en él solo crecerán las bacterias capaces de desarrollarse utilizando como única fuente de carbono ese componente. A menudo la separación se basa en la diferencia de color de las colonias aisladas, como en el agar con azul de metileno - eosina que permite diferenciar E. coli (colonias oscuras y de brillo metálico) de Enterobacter aerogenes (colonias rosadas de centro azul sin brillo). Estos dos microorganismos en agar nutritivo producen colonias de color gris blancuzco.

Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecerán determinadas bacterias (pueden ser dos o más tipos) que al actuar sobre alguno de los componentes específicos del medio, demuestran algunas de sus propiedades o características y nos permite diferenciar entre ambos tipos.

Ejemplos:

- Medio Ox- Ferm (Oxidación- Fermentación).- Citrato de Simons (Determinación del uso de citrato como fuente

de Carbono)- TSI (Triple azúcar hierro). Determinar el uso de lactosa, glucosa y

además la producción de H2S.- LIA (Lisina agar). Determinar el metabolismo de lisina.- Agar manitol salado (Determinar el uso de manitol).- Agar urea.- Agar SIM.

4. DE TRANSPORTE:

Son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de su extracción hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se recomienda un límite de dos horas desde la recolección de las muestras y su estudio en el laboratorio, pero este límite de tiempo es superado (frecuentemente cuando se trata de muestras tomadas en un consultorio). Esta demora hace necesario el uso de medios de transporte adecuados. Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies y Carey - Blair. Existe una unidad descartable de cultivo de transporte llamada Culterette que consiste en un tapón estéril de poliestireno y una ampolla en la parte inferior que se rompe cuando se ejerce presión liberando el medio de transporte de Stuart alrededor del extremo del tapón impregnado en la muestra.

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Hasta hace algunos años los componentes orgánicos mencionados debían ser obtenidos por el microbiólogo y el medio de cultivo se preparaba en el laboratorio. Actualmente se dispone comercialmente de la mayor parte de los medios e incluso de sus componentes adicionales.

Un gran número de medios de cultivo usados en el laboratorio de microbiología son mixtos, es decir que tienen como finalidad la de varios grupos de los mencionados, por ejemplo, el agar S- S es selectivo (pues tiene un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (lleva lactosa y un indicador) que permite diferenciar las bacterias fermentadoras o no de dicho polisacárido. El medio de Thayer y Martin para

Neisseria es un medio enriquecido (contiene plasma) y es selectivo (tiene 3 antibióticos inhibidores de la flora bacteriana y fúngica: colistina, vancomicina y nistatina).

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS

BHI (Brain Heart Infusion)

La infusión cerebro-corazón es una fórmula muy rica que puede emplearse, ya sea como caldo o medio, sólido para el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. Los componentes clave incluyen infusión de distintos tejidos animales con el agregado de peptona, tampón fosfato y una pequeña concentración de glucosa que proporciona una fuente de energía fácilmente accesible a los microorganismos.

Los caldos infusión cerebro-corazón se emplean con frecuencia como medio para hemocultivo y como medio base para muchas pruebas metabólicas, en especial para la identificación de estreptococos.

Caldo Lactosado

Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano. Permite recuperar células injuriadas, diluye sustancias toxicas o inhibitorias s y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias. El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrógeno mientras que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Por la fermentación de la lactosa se produce ácido y gas (el cual se evidencia al utilizar las campanas de Durham).

Medio recomendado como prueba presuntiva de la presencia de bacterias del grupo coliforme en aguas y alimentos. También está

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indicado para el preenriquecimiento no selectivo en los protocolos de investigación de Salmonella spp. a partir de alimentos.

Agar SS (Salmonella- Shigella)

Es un medio selectivo y diferencial, diseñando para el aislamiento de Salmonella y Shigella. La inhibición de las bacterias del grupo coliforme (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella) así como de Gram positivas, se logra con la mezcla de sales biliares, citrato de sodio y tiosulfato de sodio (agentes quelantes) y verde brillante. Además, el medio tiene incorporado lactosa como único carbohidrato y rojo neutro como indicador de pH. Salmonella y Shigella no fermentan lactosa y forman colonias traslucidas o incoloras, los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollarse, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Este medio también contiene sales de Hierro como indicador para detectar la producción de sulfuro de hidrogeno (H2S), las bacterias que lo produzcan forman colonias con un centro negro debido a la precipitación de sulfuro férrico (Fe2S3).

Debido a que algunos componentes del medio pueden precipitar con el calentamiento, este medio se prepara calentándolo hasta la ebullición por 2 o 3 min. Hasta su disolución completa y no autoclava.

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TSA (Tripteina Soya Agar)

El TSA Agar es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias. Permite visualizar reacciones hemolíticas que producen muchas especies bacterianas.

Tiene por base una fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sódico (mantiene el balance osmótico) y 5% de sangre.

Es un medio recomendado para la detección y recuento de una amplia gama de microorganismos. La presencia de Lectina y Tween permite neutralizar la actividad antibacteriana, facilitando la investigación de los gérmenes en productos o superficies que contengan: Aldehídos, derivados fenólicos, o amonio cuaternario.

La aportación de caseína y peptonas de soja al Agar de Tripticasa-soja hace el medio muy nutritivo por el suministro de nitrógeno orgánico, particularmente aminoácidos y péptidos de cadena más larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de gérmenes aerobios y anaerobios que crecen rápidamente, así como los del género Candida. También permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. Resultados:

Agar Sabouraud

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Es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de hongos, particularmente los asociados con infecciones cutáneas (piel, pelo).

En el medio de cultivo, la peptona, la tripteína y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol y el pH ácido, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es el agente solidificante.

Puede ser suplementado con otros agentes selectivos de crecimiento.

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

. Que se efectúen asépticamente

. Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados

. Que se realicen solo los manipuleos indispensables

. Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar.

Medios líquidos:

- Siembra por inoculación: Con el asa de siembra previamente esterilizada tomar una cantidad suficiente de inoculo y ponerla en contacto con el medio líquido.

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Medios sólidos:

- Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.

- Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.

- Siembra por puntura o picadura: Consiste en tomar una pequeña cantidad de la muestra, con la aguja de Kolle y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo: del tubo que contiene el medio sólido (es útil para ver el comportamiento bioquímico de las bacterias).

- Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

- Siembra por agotamiento o dispersión: Consiste en repartir el inóculo sobre la superficie del medio sólido en zigzag en 3 o 4 campos de la placa o por estriado simple en toda la placa. Es útil para obtener colonias aisladas.

- Siembra en estría: Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas

Técnica A Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en

la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se gira la placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

• Técnica B

Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, Se hacen3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y serepite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.

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OBSERVACIÓN DE LAS BACTERIAS:

a) Observación macroscópica:

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc...

b) Observación microscópica:

Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio. Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el

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portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.

TINCIÓN GRAM

El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram, llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram-positivas s tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico.

Esta tinción además, correlaciona con otras propiedades como endotoxinas, susceptibilidad a antibióticos, sensibilidad o resistencia a sales biliares, punto isoeléctrico y tensión superficial.

1. Tinción inicial: Las células se tiñen con cristal violeta, el cual es el colorante primario. En este paso todas las células se tiñen de morado.

2. Mordente: Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con el cristal violeta y forma un complejo violeta- yoduro. En este punto todas las células continúan de color morado.

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3. Decoloración: Se adiciona un solvente no polar, el cual actúa lavando el complejo cristal violeta- yoduro de las células Gram (-). De esta manera las bacterias Gram (+) continúan moradas y las Gram (-) quedan incoloras. Este es el paso crítico de esta tinción, pues si se exagera, decolora las Gram (+) y si se hace muy débil no decolora las Gram (-).

4. Contratinción: Se vuelve a teñir con safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram (-), que habían sido decoloradas, se tiñen de rosado a fucsia según el colorante empleado; en tanto, las bacterias Gram (+) no se afectan con la contratinción y permanecen moradas debido a lo intenso de esta coloración.

8. PARTE EXPERIMENTAL:8.1. LUGAR DE INVESTIGACIÓN La presente investigación se llevó a cabo en la Universidad Nacional de Ingeniería.Laboratorio de Microbiología y Biología de la Facultad de Ingeniería Ambiental.

8.2. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MUESTRA VEGETAL:

Para la investigación se utilizó césped del parque de la facultad de ingeniería de petróleo.

MUESTRA BIOLÓGICA:

Se empleó carne cruda.

MUESTRA LIQUIDA:

Se empleó agua de maracuyá de la facultad de ingeniería mecánica.

MUESTRA AMBIENTAL:

Se empleó aire ambiental del laboratorio de microbiología de la facultad de ingeniería ambiental.

MUESTRAS DE ALIMENTOS:

Se empleó ají preparado del restaurante chaparral y mostaza procesada.

MATERIALES DE LABORATORIO

Vasos de precipitación

Placas Petri

Mechero bunsen

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Asas de siembra

Porta y cubre objetos

Tubos de ensayo

Gradilla

Piseta

Termómetro

Embudo

Pipetas

Probeta

Matraces

Varilla de vidrio

Trípode

Guantes

Mascarilla

Pera de succión

Pinzas para tubos

Algodón

Fósforo

EQUIPOS: Balanza analítica

Refrigerador

Estufa

Horno

Autoclave

Computadora

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8.3 METODOLOGIA:

TABLA 1°: TOMA DE MUESTRAS PARA CADA MEDIOBHI CALDO

LACTOSADOSALMONELLA S AGAR

TRITISOYA AGAR

AGAR SABORAUD

Ají del chaparral

X X X X X

Césped FIP X X X X X

Agua maracuyá

FIM

X X X X X

Carne X X X X X

Aire Ambiental

- - - X X

Mostaza X X X - -

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO:Obtener el medio de cultivo, en nuestro caso Agar SS, buscar en el rótulo del envase la proporción (gr/ml) para la correcta preparación, luego en un Erlenmeyer previamente esterilizado se mezclan 100 ml de agua destilada y 6gr del medio de cultivo Agar SS, y se tapará con un pedazo de algodón, se procederá a calentar la mezcla-agitando frecuentemente-con un horno o

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mechero hasta que entre en ebullición, luego se calentará por 1 minuto más aprox. enfriar el Erlenmeyer y esperar que el medio se solidifique, finalmente rotular debidamente y colocar en la refrigeradora.

OBS: ¿Por qué no se esteriliza el medio de cultivo?-Es simple, el Agar SS como se puede apreciar en su rótulo, tiene productos que enriquecen el medio y evitan el crecimiento de otros microorganismos, si se coloca en el autoclave estos compuestos comenzarán a desnaturalizarse (degradarse) por la acción del calor y se malogrará el medio.

PREPARACION DE LAS PLACAS PETRI PARA EL SEMBRADO:Sacar el medio de cultivo de la refrigeradora y calentar hasta ebullición, luego se verterá el contenido en 5 placas Petri de la siguiente manera:

-En un área de trabajo limpio y estéril se procederá a quitar el algodón con los dedos meñique y anular de la mano que usted prefiera, luego con la otra mano se acercará la boca del Erlenmeyer al mechero y pasarlo por la flama suavemente, con la misma mano del algodón abrir la placa Petri, no del todo, solo la parte por donde se va a verter el medio y rápidamente se tapará la placa, y nuevamente se pasará la boca del recipiente por la flama, el procedimiento se repite para las demás placas, todo este procedimiento se realizará cerca del mechero con la cautela debida.

ETAPA DE LA SIEMBRA DE LAS MUESTRAS:-Esperar a que las el medio en las placas se solidifique y luego invertirlas, proceder a sembrar las diferentes muestras en las placas, por dispersión o agotamiento, de la siguiente manera:

-En un área de trabajo limpio y estéril, destapar parcialmente una de las placas, con un asa de siembra, previamente esterilizada, tomar una muestra del cultivo a sembrar (inóculo) y extender sobre un área pequeña de la superficie de la placa con el medio (Agar SS), en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar, girar la placa un poco y volver a sembrar en formas de estrías, así sucesivamente y al final sembrar-en forma de estría-en el centro de la placa, después se colocará de cabeza la placa y se rotulará para su identificación en la lectura de colonias, realizar estos pasos para las diferentes muestras (Ají del chaparral, Césped FIP, agua de maracuyá FIM, carne, mostaza de tienda).

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Para el sembrado de la muestra de Césped FIP y carne, se procedió a meter en una bolsa la muestra y verterle agua destilada, para luego obtener una solución de la cual se obtendrá el inóculo.

Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de gérmenes para el análisis de las bacterias en procesos posteriores.

Luego de tener todas las placas sembradas, llevar las placas-siempre de cabeza-a la incubadora durante 24-48 horas (en el desarrollo del laboratorio fue por un lapso de 48h) con una temperatura de 37°C +/-1.

Luego de las 48horas transcurridas se procede a sacar las muestras de la incubadora, y colocarlas en la refrigeradora las placas invertidas hasta el día que se continuará con la respectiva coloración e identificación.

¿Por qué se colocan las placas de forma invertida en la incubadora y en la refrigeradora?

-El motivo es que las placas al calentarse y enfriarse en los distintos pasos y recipientes su forma vapor de agua al calentarse en las placas, que luego al enfriarse se convierten en gotas de agua que pueden precipitar en el medio malogrando el experimento.

ETAPA DE COLORACION DE BACTERIAS TRAS LA FORMACION DE COLONIAS:Se sacarán las muestras de la refrigeradora para luego proceder con la coloración con los siguientes pasos:

Colocar con el asa de siembra una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Flamear el asa y dejar enfriar. Tomar, cerca del mechero, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y diluirlo en la gota de agua. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjetos a la llama del mechero. Con cautela para evitar que las células se deformen o rompan. Fijar la muestra al portaobjetos pasándolo 2 o 3 veces por la llama del mechero.

Luego de la fijación se procederá a rotular el portaobjeto con un marcador o un corrector y a colorear con la tinción Gram:

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Primero: Colocar la placa en un soporte y cubrir con colorante cristal violeta por un minuto aprox.

Lavar con agua de caño.

Segundo: Cubrir la placa con lugol de Gram por 1 a 2 minutos.

Lavar con agua de caño.

Tercero: Cubrir la placa con alcohol-acetona por 5 segundos aproximadamente (movimiento de vaivén).

Lavar con agua de caño.

Cuarto: Cubrir la placa con fucsina básica (safranina) por 30 segundos.

Lavar con agua de caño y secar.

OBS: En una placa se puede proceder a colocar 2 muestras para facilitar o acelerar el proceso de coloración.

ETAPA DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA:Se coloca la placa previamente colorada en el microscopio óptico, se preparará la correcta iluminación y se enfocará con el objetivo de menor resolución, luego colocar un poco de aceite de inmersión a la muestra y se observará con el objetivo de 100X (el objetivo debe estar inmerso en el aceite).

ETAPA DE LECTURA E INTERPRETACION DE LAS COLONIAS:

[Esc

riba

el tí

tulo

del

doc

umen

to]

23

Se procederá a apuntar todo lo observado en la placa como tamaño, forma, elevación, superficie, borde, consistencia, etc… para las observaciones y discusiones.

9. RESULTADOS

TABLA 1: VISTA MACROSCOPICAS BHI

NOTA:

Orden de turbidez de mayor a menor: 2 1 3 4 5

Película: 1 2

Sedimentación: 2 1 4 3

OBS: No se obtuvieron observaciones microscópicas debido a que este grupo trabajó con un microscopio sin mantenimiento, y por tanto no pudieron visualizar nada.

PELICULA SEDIMENTACION TURBIDEZ FLOCULOS

Ají del chaparral

X X X -

Césped FIP

X X X -

Agua maracuyá

FIM -

X X -

Carne - X X -

Mostaza - - X -

24

TABLA 2: MEDIO CALDO LACTOSADO

Muestras Vista Macroscópica Vista MicroscópicaAjí de Chaparral

Se observó presencia de gas en la campana de Durham.SedimentaciónPelículaTurbidez que fue la más turbia en comparación con las otras muestras

No pudimos observar nada con el objetivo de 100

Césped Se observó presencia de gas en la campana de DurhamPelículaTurbidez que fue la segunda más turbia en comparación a las otras muestras

No pudimos observar nada con el objetivo de 100

Maracuyá Se observó una pequeñísima cantidad de gas en la campana de DurhamTurbidezSedimentaciónPelícula( mínima )

Observamos en el microscopio cocos que en nuestro caso fueron la especie de estafilococos

Carne Se observó presencia de gas en la campana de DurhamPelículaSedimentación

No pudimos observar nada con el objetivo de 100

Mostaza Tan solo se observó una muy pero muy pequeña sedimentación

No pudimos observar nada con el objetivo de 100

MUESTRA OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

[Esc

riba

el tí

tulo

del

doc

umen

to]

25

AJI DEL RESTAURANTE

CHAPARRAL

Tamaño: aproximadamente 1mm de diámetro.Borde: entero.Elevación: convexa.Superficie: granular.Forma: redonda.Pigmentación: anaranjado-amarillo.Grado de transparencia: opaco.

Se observaron: estreptococos y bacilos.

CESPED DEL JARDIN DE PETROLEO

Tamaño: aproximadamente 4mm de diámetro.Borde: entero.Elevación: convexa.Superficie: granular.Forma: redonda.Pigmentación: anaranjado-amarillo.Grado de transparencia: opaco.

Se observaron: bacilos, Vibrio y bastones.

AGUA DE MARACUYA DE

LA FACULTAD DE MECÁNICA

Tamaño: irregular, borde: irregular, elevación: convexa,Superficie: granular, Forma: redonda,Pigmentación: púrpura. Existe una colonia circular y otra plana alargada.

Se observaron gran cantidad de cocos.

CARNE Existen tres tipos de colonias: la primera posee forma redonda, la segunda es irregular y la tercera alargada.Superficie: cremosa.Elevación: convexa.Pigmentación: morado.

Se observaron: bacilo cocos, cocos y bacilos.

AIRE AMBIENTAL DEL

LABORATORIO FIA

No se hizo la prueba ya que ni la Salmonella ni Shiguella están en el aire. Por tanto no se obtendrá crecimiento.

MOSTAZA No se encontró crecimiento de colonias.TABLA 3: MEDIO AGAR SS

26

[Esc

riba

el tí

tulo

del

doc

umen

to]

27

TABLA 4: MEDIO TSA

LECTURA MACROSCÓPICA LECTURA MICROSCÓPICA

1° Ají de “El chaparral” Numerosas colonias de distintos tamañosForma: redondeadaElevación: convexaSuperficie: lisa y granularBorde: enteroConsistencia: cremosaCromogénesis: color crema y en algunos casos amarillenta

No se logró observar microorganismos (error

sistemático).

2° Césped FIP Presencia de abundantes coloniasForma: redondeada e irregularElevación: convexaSuperficie: lisaBorde: enteroConsistencia: cremosaCromogénesis: coloración crema, amarillenta y anaranjada.

Se encontró presencia de abundantes racimos de cocos(estafilococos) y

bacilos

3° Agua de maracuyá FIM

Se encontró menor cantidad de coloniasForma: irregulares y en rocíoElevación: convexa, plana y umbilicadaSuperficie: lisa y granularBorde: irregularConsistencia: cremosaCromogénesis: coloración crema, amarillenta y partes anaranjadas.

Se observó presencia de cocos

4° Carne Formación de pequeñas colonias alrededor de la placa Petri.Forma: redondeada e irregularElevación: convexa y umbilicadaSuperficie: lisaBorde: enteroConsistencia: cremosaCromogénesis: coloración crema, blanquecino y anaranjado.

Se observó presencia de estafilococos y pequeñas

cadenas de cocos(estreptococos)

5° Aire ambiental (Lab. 20)

Se encontró 5 coloniasForma: redondeada y esféricaElevación: convexa y crateriformeSuperficie: lisaBorde: enteraConsistencia: cremosa y algodonosaCromogénesis: coloración crema, anaranjada, roja y opaco

Se observó presencia de cocos y bacilos

28

TABLA 5: AGAR SABORAUD

MUESTRA OBSERVACIONES MACROSCOPICAS

OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

AJI DEL RESTAURANTE CHAPARRAL

Forma: AmeboideElevación: ConvexaBorde: OnduladoConsistencia: GomosaCromogénesis: Pigmentos de color blancoGrados de transparencia: OpacoSuperficie: Rugosa Escamosa

Se observaron tipos de hongos miceliales (hifas) y levaduras

CESPED DEL JARDIN DE LA FACULTAD DE PETROLEO

Forma: IrregularElevación: ConvexaBorde: IrregularConsistencia: AlgodonosaCromogénesis: Pigmentos de color verdeGrados de transparencia: OpacoSuperficie: Rugosa

Se observaron tipos de hongos miceliales

AGUA DE MARACUYA DE LA FACULTAD DE MECÁNICA

Forma: IrregularElevación: ConvexaBorde: OnduladoConsistencia: GomosaCromogénesis: Pigmentos de color blancoGrados de transparencia: OpacoSuperficie: Rugosa Escamosa

Se observaron dos tipos de hongos miceliales (hifas) y levaduras.

CARNE Forma: RocíoElevación: Plana convexaBorde: EnteroConsistencia: CremosaCromogénesis: Pigmentos de color blancoGrados de transparencia: OpacoSuperficie:

Se observaron tipos de hongos miceliales

AIRE AMBIENTAL DEL LABORATORIO FIA

Forma: FilamentosaElevación: CrateriformeBorde: EspiculadoConsistencia: AlgodonosaCromogénesis: Pigmentos de color mostazaGrados de transparencia: OpacoSuperficie: Rugosa

Se observaron dos tipos de hongos miceliales (hifas).