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Métodos de Ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)
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Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)
• LAL es un extracto de las células de sangre del cangrejo herradura, Limulus polyphemus
• El reactivo LAL forma un coágulo en la presencia de endotoxina in vitro
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Endotoxina
Factor B Factor G
Coagulógeno
Enzima de coagulación
Coagulina
Factor Activado B/G
Enzima de coagulación activada
Factor C Factor Activado C -Glucano
gel-clot/coáguloModified from Iwanaga et al., 1985
*
Cascada de Activación
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Métodos de Ensayo de LAL
• Los métodos principales son:• Método de coagulación o gel-clot • Método turbidimétrico• Método cromogénico
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El Método Gel-Clot
• Más simple y utilizado con más frecuencia
• El método establecido por la USP y EP
• La sensibilidad de la etiqueta del reactivo LAL () es la concentración mínima de endotoxina que forma un coágulo bajo condiciones standard
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Método Gel-clot
= 0.125 EU/ml• El punto final confirma la sensibilidad de la
etiqueta• El error del ensayo es +/- un tubo de dilución
Concentraciones del Standard (EU/ml)
0.25 0.125 0.06 0.03
+ + - -
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Método Gel-clot
• El ensayo se puede correr como una prueba de límites (pasa o no pasa a un límite determinado de endotoxina) o como una cuantificación.
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Una Prueba de Límites
= 0.125 EU/ml Límite de Endotoxina = 2 EU/ml
Curva 0.25 0.125 0.06 0.03 (EU/ml) ctrl. -Standard + + - - -
+ + - - -
Muestras Prueba Ctrl. + Producto InterpretaciónMuestra A (1:16) + + No Pasa
+ +Muestra B (1:16) - + Pasa
- +Muestra C (1:16) - - Inválida
- -
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Cuantificación con Gel-clot
• El punto final es la última dilución de una serie que de un resultado positivo.
• Se multiplica el factor de dilución del punto final por la sensibilidad de la etiqueta del reactivo LAL para obtener la concentración de endotoxina.
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Expresión de Diluciones
• Una dilución es expresada como un número de partes en un número total de partes.
• 1:2 significa una parte en un total de dos partes (volúmen igual de muestra y diluyente).
• 1:10 es una parte muestra, nueve partes diluyente.
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Máxima Dilución Válida
• La Máxima Dilución Válida (MVD) es la mayor dilución que se le puede hacer al producto y aún detectar el límite de endotoxina con el método de LAL que se esté utilizando.
• El MVD incrementa con la sensibilidad del ensayo.
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Cuantificación con Gel-clot
Ejemplo con un lisado de sensibilidad = 0.125 EU/ml (standards omitidos)Diluciones de Muestra1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 ctrl.pp +
+ + + + + - - - + + + + + + - - - +
Control Positivo de 1:1 Producto (0.25 EU/ml)
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Cuantificación con Gel-clot
• El punto final es la dilución de 1:16
• La concentración de endotoxina = 16 x 0.125 EU/ml = 2 EU/ml
• Los resultados se reportan como un valor específico - no un rango. e.g., 2 EU/ml, no >1 EU/ml pero <4 EU/ml
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Media Geométrica (MG)
• Use la MG para calcular el promedio de los valores.
• Divida la sumatoria de los logaritmos de los puntos finales por el número de réplicas para obtener la media de los logaritmos.
• Tome el antilogaritmo de esta media para obtener la media geométrica.
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Ejemplo del Cálculo
Curva Standard: 0.25 0.125 0.06 0.03 (EU/ml) Ctrl - + + - - -
+ + - - - + - - - -
+ + - - -
Puntos Finales: log10
0.125 EU/ml -0.90 Media = -3.31/4 = -0.830.125 -0.90 MG = antilogaritmo (-0.83) 0.25
-0.60 = 0.15 EU/ml0.125 -0.90Suma -3.31
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MG para una Cuantificación
Diluciones de la muestra ( 0.125 EU/ml)1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 + + + + + - - + + + + - - -Punto final Concentración de endotoxina log10 1:16 2.0 0.30 1:8 1.0 0Suma 0.30Media = 0.30/2 = 0.15Media Geométrica = antilogaritmo (0.15) = 1.41 EU/ml
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Seleccionando la Sensibilidad
• Se debe considerar:• el tipo de muestra que se analizará• límite de endotoxina y • consecuentemente, el MVD
• Haga las pruebas preliminares • Si la interferencia no se puede
sobrepasar, use un reactivo de mayor sensibilidad
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Métodos Fotométricos
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Métodos Turbidimétricos
• Conforme la coagulina se aglutina, la reacción desarrolla turbidez.
• La velocidad de incremento de turbidez es una función de la concentración de endotoxina.
• Los ensayos de LAL son cinéticos o de punto final.
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Método Turbidimétrico Cinético
• El umbral de DO (una DO fija) es utilizado como punto de referencia para la colecta de datos
• Mientras más alta la concentración de endotoxina, más corto el tiempo necesario para alcanzar el umbral de DO
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Método Turbidimétrico Cinético
• El tiempo que le toma a una reacción alcanzar el umbral de DO es el “onset time”
• Se construye la curva standard representando una gráfica del log10 del onset time frente al log10 de la concentración de endotoxina
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densidadóptica
tiempo
coagulación (fija)coagulación (fija)
tiempo de incubación fija
Umbral de DO
0.25 EU/ml0.125 EU/ml0.0625 EU/ml
0.03125 EU/ml
0.5 EU/ml
Cinética de la Reacción
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Curva de Regresion
OnsetOnsettime (s)time (s)
Concentración de Endotoxina (EU/ml)Concentración de Endotoxina (EU/ml)
10001000
20002000
1.00.1
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• Los principios son similares a la reacción turbidimétrica.
• La secuencia de los aminoácidos del péptido sintético imita la de coagulógeno, el sustrato natural.
• BOC-Leu-Gly-Arg-CONH - - NO2
• El sustrato intacto carece de color.
Métodos Cromogénicos
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Método Cromogénico de Punto Final
• Se mide la intensidad del color amarillo (densidad óptica) después de un período fijo de incubación.
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Método Cromogénico Cinético
• Se mide la absorbancia durante todo el período de incubación.
• Se toma nota del onset time.
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Seleccione un Método: Gel-clot?
• Costo bajo de reactivos y equipos
• Método establecido por la USP y EP
• Método resistente, menos sensible a interferencias que los otros métodos
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Seleccione un Método: Turbidimétrico?
• Más sensible (máxima de 0.001 EU/ml)
• Rango de detección amplio (hasta 100 EU/ml)
• El control de la temperatura en lectores de tubos es muy bueno y el cronometraje de ensayos es preciso
• Opción del uso de microplacas
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Seleccione un Método: Cromogénico?
Punto Final:
• sensible (máxima de 0.005 EU/ml)
• el lector de microplacas es de precio moderado y puede ser utilizado para otros ensayos
• opción diazo permite el ensayo de muestras amarillas
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Seleccione un Método: Cromogénico?
Cinético:
• es sensible (máxima de 0.005 EU/ml)
• el rango de detección es amplio (hasta 50 EU/ml)
• el lector puede ser utilizado para otros ensayos
![Page 31: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/31.jpg)
Interferencia: Varía Según el Método
Penicilina ClindamicinaGel-clot 1:16 1:32Cromogénico (punto final) 1:10 1:20Turbidimétrico Cinético 1:200 1:100
• Diluciones necesarias para sobrepasar interferencia para dos productos parenterales (concentración inicial: penicilina, 200,000 Unidades/ml; clindamicina, 150 mg/ml).
![Page 32: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/32.jpg)
Interferencia: Varía Según el Método
Penicilina Clindamicina
Gel-clot 640 2,784( = 0.03 EU/ml)
Cromogénico (Punto Final) 4,000 17,400( = 0.005 EU/ml)
Turbidimétrico Cinético 20,000 87,000( = 0.001 EU/ml)
![Page 33: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/33.jpg)
Inhibición y Realce
• Inhibición es una disminución en la sensibilidad del ensayo.
• Un inhibidor conduce a que la cantidad de endotoxina presente se subestime.
• La eliminación de controles positivos (inhibición) del producto puede resultar en un resultado negativo inválido.
![Page 34: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/34.jpg)
Realce
• Es un incremento en la sensibilidad del ensayo y conduce a que la cantidad de endotoxina presente se sobrestime.
• Los controles positivos del producto en ensayos de gel-clot no indican la presencia de realce.
• Los métodos fotométricos indican claramente si hay realce (o inhibición).
![Page 35: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/35.jpg)
Falsos Positivos
• El realce no es un falso positivo!
• Un falso positivo es algo diferente a endotoxina que da un resultado positivo.
![Page 36: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/36.jpg)
Falsos Positivos
• Sólo se puede probar que un resultado positivo es falso en la ausencia de endotoxina.
• Falsos positivos son poco comunes. Tripsina y ß-glucanos son los únicos conocidos.
![Page 37: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/37.jpg)
Sobrepasando Interferencia
• Las muestras frecuentemente interfieren con la reacción de LAL.
• La interferencia puede ser causada por- un efecto de la muestra sobre el reactivo
LAL
- un efecto de la muestra sobre la endotoxina
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Causas de Interferencia - pH
• Reactivo LAL tiene una capacidad limitada de tamponación.
• El pH crítico es el de la mezcla muestra/reactivo.
![Page 39: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/39.jpg)
Regulación del pH
• Dilución
• Pyrosol (buffer)
• Ajustar pH de muestra (o dilución de muestra) con NaOH o HCl
![Page 40: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/40.jpg)
Causas de Interferencia - Proteínas
• Pueden enlazar endotoxina.
• Las proteasas pueden desnaturalizar proteínas de la cascada enzimática.
• El tratamiento por calor puede permitir la liberación de endotoxina de la proteína que la enlaza.
• Puede causar también el desenlace.
![Page 41: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/41.jpg)
Para Resolver los Problemas
• Pruebe primero la dilución.
• Use un Pyrotell de una mayor sensibilidad para incrementar el MVD.
• Use un método mas sensible.
• Reconstituya el Pyrotell con Pyrosol.
![Page 42: metodos2.ppt](https://reader034.fdocuments.ec/reader034/viewer/2022042702/55cf9df5550346d033b00ade/html5/thumbnails/42.jpg)
2005
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