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DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE LOWRY

INSTITUTO POLITCNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

Nombre del alumno:

Grupo 5QM2

FUNDAMENTOEl mtodo de Lowry basa en el desarrollo de color, mediante una reaccin que se efecta en dos etapas. La primera de ellas consiste en la formacin de un complejo colorido entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. Cu2+ se acompleja con 4 NH. La segunda es la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-protena, dando finalmente un color azul, la intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) que se lee a 590nm, la coloracin permanece estable por 2 horas. El color producido depende del contenido de tirosina y triptfano en la protena.

El mtodo de Bradford para la determinacin de protenas implica la reaccin del azul brillante de Coomassie G-250 con las protenas, originando un complejo colorido que se lee a 595 nm, el color desarrollado permanece estable por 1 hora. Esta reaccin es independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

OBJETIVOS Elaborar una curva de calibracin para la cuantificacin de protenas empleando un mtodo fotomtrico. Determinar si hay diferencia estadsticamente significativa entre la precisin y la exactitud entre los mtodos de Bradford y Lowry. Conocer el efecto de sustancias no protenicas, en el desarrollo de color. Analizar las ventajas y desventajas del mtodo de Lowry, con respecto a otros mtodos para la cuantificacin de protenas. RESULTADOS Lowry AlbuminaCurva de calibracin por mtodo de Lowry.

No. TuboCantidad de protena (g)A 590 nm

Serie "a"Serie "b"

1250.073n/a*0.073

2500.111n/a*0.111

3750.1230.1520.137

41000.1570.1610.159

51250.1990.1880.387

Replicas para el anlisis estadstico

No. TuboA 590 nmCantidad de protena (g)

10.21189.037

20.17776.444

30.17977.185

40.19683.481

50.20988.296

60.19282.000

70.20586.815

80.15969.778

90.16572.000

100.263108.296

83.33

S11.014

S^2121.30

% C.V.13.22

91.2114147

75.4552519

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Lowry

No. TuboSustanciaA 590 nmCantidad de protena (g)Tipo de Interferencia

1Tris 1 M, pH 7.00.08542.37Negativa

2Glicerol al 1% (v/v)0.05631.63Negativa

3Detergente comercial 1%0.01516.44Negativa

4SDS al 1.0%0.04627.93Negativa

5TCA al 5%0.03925.33Negativa

6Fenol al 1%0.21791.26Positiva

7Mercaptoetanol al 0.1%0.02319.41Negativa


9Urea al 5%0.04627.93Negativa

10(NH4)2SO40.03222.74Negativa

Prueba "t" de Student

61.67Hay diferencia significativa

Bradford AlbuminaCurva de calibracin por mtodo de Bradford.


Serie "a"Serie "b"

1250.2330.2140.224

2500.330.3360.333

3750.4710.4150.443

41000.4810.4490.465

51250.5010.5180.510

174.21

S30.415

S^2925.06

% C.V.17.46

195.967089

152.455133



10.44493.000

20.435172.000

30.424167.926

40.474186.444

50.47184.963

60.507198.667

70.495194.222

80.458180.519

90.432170.889

100.493193.481

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford


1Tris 1 M, pH 7.00.927354.22Positiva

2Glicerol al 1% (v/v)0.932356.07Positiva

3Detergente comercial 1%0.921352.00Positiva


5TCA al 5%0.877335.70Positiva


7Mercaptoetanol al 0.1%0.967369.04Positiva


9Urea al 5%0.975372.00Positiva

10(NH4)2SO40.908347.19Positiva



Lowry Hemoglobina

Curva de calibracin por mtodo de Lowry.


Serie "a"Serie "b"

1250.0980.0980.098

2500.2010.2090.205

3750.2360.2660.251

41000.3470.3280.337

51250.4130.4050.409



10.28783.552

20.29686.501

30.27679.948

40.26676.671

50.27378.965

60.26476.016

70.30589.450

80.2571.429

90.29686.501

100.27679.948

80.90

S5.576

S^231.10

% C.V.6.89

84.8866339

76.90891

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Lowry



2Glicerol al 1% (v/v)0.22763.89Negativa

3Detergente comercial 1%0.19854.39Negativa


5TCA al 5%0.19453.08Negativa


7Mercaptoetanol al 0.1%0.24569.79Negativa


9Urea al 5%0.26777.00Negativa

10(NH4)2SO40.28883.88Negativa



Bradford Hemoglobina

Curva de calibracin por mtodo de Bradford.


Serie "a"Serie "b"

1250.2760.2220.249

2500.3760.3820.379

3750.5030.4770.490

41000.5460.4920.519

51250.5340.5120.523



10.47891.715

20.49296.802

30.48694.622

40.48995.712

50.599.709

60.4788.808

70.47289.535

80.47992.078

90.52106.977

100.518106.250

96.22

S6.401

S^240.97

% C.V.6.65

100.799309

91.6425513

Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford



2Glicerol al 1% (v/v)0.505101.53Positiva

3Detergente comercial 1%0.49497.53Positiva

4SDS al 1.0%0.119-38.74Negativa

5TCA al 5%0.501100.07Positiva


7Mercaptoetanol al 0.1%0.532111.34Positiva


9Urea al 5%0.504101.16Positiva

10(NH4)2SO40.507102.25Positiva



DISCUSIN DE RESULTADOS DE LOWRY- Curva de calibracinLa grafica relaciona valores de absorbancia con la concentracin conocida de nuestros estndares, se observa que hay un aumento en el valor de absorbancia relacionado al aumento de la concentracin, donde se podra suponer que cumple la Ley de Bouguer y Beer; sin embargo los lmites establecidos donde el error es mnimo en el estudio espectrofotomtrico de una sustancia estn entre 0.2 y 0.8 para la absorbancia. Comparando los datos obtenidos, que sealan que la mxima absorbancia trabajada fue de 0.405; podemos decir que la curva tipo posee un error considerable para la determinacin de Hemoglobina, ya que el mtodo es poco sensible y es recomendado para la determinacin de protenas a concentraciones mayores a 100 g/mL.-Anlisis estadstico De acuerdo a la tcnica, las replicas eran del tubo numero tres de la curva de calibracin, la concentracin utilizada de protena fue de 75 g/mL, de acuerdo a las lecturas de absorbancia las concentraciones utilizadas fueron de 80.90 g/mL en promedio. Esto nos indica que el mtodo de lowry es menos sensible en comparacin con el mtodo de Bradford, esto se ve reflejado en los resultados de este anlisis, esto quiere decir que podemos tener mas margen de error en lowry, esta variacin pudo deberse a una mala medicin de los volmenes del analista. El coeficiente de variacin nos dio de 6.89, podemos decir que existe error en cuanto a precisin en los resultados, pues el valor mximo aceptado es del 5%.-Interpretacin de los resultados del efecto de las interferencias.Segn los lmites de confianza calculados, obtenemos que una interferencia positiva es aquella que aumenta la lectura de absorbancia sobre los intervalos de confianza para la concentracin y una interferencia negativa aquella que provoca una disminucin en los valores de absorbancia sobre los lmites de confianza para la concentracin.Y de acuerdo a la bibliografa consultada los agentes que acidifican la reaccin en este caso el Tris, el EDTA y los reductores de Cu como el mercaptoetanol, sern interferentes de la reaccin. El fenol por su estructura dara falsos positivos.

DISCUSION DE RESULTADOS DE BRADFORD-Curva de calibracinAl igual que en el mtodo de Lowry, se observa que hay un aumento en el valor de absorbancia relacionado al aumento de la concentracin de la Hemoglobina, sin embargo aqu la pendiente es mayor, esto nos indica que la sensibilidad de este mtodo es mayor que en el mtodo de Lowry, ya que permite trabajar con concentraciones ms bajas de protena.-Anlisis estadstico. A pesar de que el mtodo de Bradford es ms sencillo y rpido, el % de coeficiente de variacin obtenido fue mayor que en Lowry, que podemos adjudicarlo a la sensibilidad del mtodo.-Comparacin entre los dos mtodos para Hemoglobina AlbuminaNo. TuboM. de Prueba (B)M de Estndar(L)DiferenciaDi - D-(Di - D-)2

19389.0373.963-86.9147554.04983

217276.44495.5564.67921.8888821

3167.92677.18590.741-0.1360.0185464

4186.44483.481102.96312.086146.059758

5184.96388.29696.6675.79033.520669

6198.66782.000116.66725.790665.1241

7194.22286.815107.40716.530273.247022

8180.51969.778110.74119.864394.587324

9170.88972.00098.8898.01264.192144

10193.481108.29685.185-5.69232.4022371

90.877

HemoglobinaNo. TuboM. de Prueba (B)M de Estndar(L)DiferenciaDi - D-(Di - D-)2

191.71583.5528.163-7.15951.2479783

296.80286.50110.301-5.02125.2069797

394.62279.94814.674-0.6480.41935385

495.71276.67119.0413.71913.8306978

599.70978.96520.7445.42229.4022768

688.80876.01612.792-2.5306.39952068

789.53589.4500.085-15.237232.15219

892.07871.42920.6495.32728.3814952

9106.97786.50120.4765.15426.5672692

10106.2579.94826.30210.980120.569725

15.322

No hay diferencia significativa en la exactitud.37.28 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos.50.94 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos. No hay diferencia significativa en la precisin.1.31< 3.78 No existe diferencia significativa en precisin entre los dos mtodos.

Mtodos colorimtricos

MtodoRango de sensibilidad (g)VentajasDesventajas

Lowry25-100 a 500 nm 2-30 a 660 nm1-2 a 750 nmTiene bastante SensibilidadPresenta alta estabilidadNo todas las protenas reaccionan igual.Muestra muchas interferencias comodetergentes no inicos, sulfato amnico etc

Bradford1-15Muy sensibleRpido y de fcil desarrolloMuestra interferencias con detergentes

CONCLUSIONES Se elaboraron las curvas de calibracin para la cuantificacin de Hemoglobina empleando el mtodo de Lowry y Bradford. De acuerdo a los resultados obtenidos experimentalmente existe diferencia significativa en la exactitud entre ambos mtodos siendo Lowry el ms exacto. De acuerdo a los resultados obtenidos experimentalmente no existe diferencia significativa en la precisin entre ambos mtodos. Las interferencias de sustancias no protenicas pueden ser positivas o negativas. El glicerol, el detergente comercial, SDS, urea son interferentes negativos. El tris, fenol, sulfato de amonio, TCA, mercaptoetanol son interferentes positivos. El mtodo de Lowry no es muy sensible en comparacin con el mtodo de Bradford.

BIBLIOGRAFA http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Proteinas_8075.pdf http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf

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