MÉTODOS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS

APLICACIONES BIOLÓGICAS

CROMATOGRAFIA

INTRODUCCION A LAS SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS

Características básicas de análisis químico Sensible Selectivo Específico (pocos casos)

DESCRIPCION GENERAL

Mikhail Tswett1906

CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

Las primeras “unidades cromatográficas” de M. Tswett para el análisis de pigmentos vegetales.

CLASIFICACION

Sgn. la manera en que la fase movil y la fase estacionarias se ponen en contacto Cromatografia en columna (FM: liquido, gas, fluido

supercritico) Cromatografia plana (FM: liquido)

Sgn. tipo de fase movil y estacionaria, y los procesos de transferencia de los solutos entre las fases Cromatografia de liquidos (FM: liquido) Cromatografia de gases (FM: gas) Cromatografia de fluidos supercriticos (FM: fluido

supercritico)

Cromatografia en columnaBlas. Gral. F. Movil F. Estacionaria Fenomeno de interaccion

LC Liquido L-L Distribucion entre liquidos inmiscibles

L-fase enlazada Distribucion entre liquido y superficie enlazada

L-S Adsorcion

Intercambio ionico Intercambio ionico

Exclusion por tamano

Distribucion / Exclusion

L-receptor Adsorcion por afinidad

GC Gas G-L Distribucion entre gas y liquido

G-fase enlazada Distribucion entre gas y superficie enlazada

G-S Adsorcion

SFC Fluido supercritico

Distribucion entre fluido supercritico y superficie enlazada

BASES DE LA SEPARACION

Fig. 3.1 y 3.2 Q

Interacciones posibles que condicionan la afiniadad de los distintos componentes Hidrofobicas Hidrofilicas Puente hidrogeno Dipolares Electrostaticas

Constante de distribucion:

MCC

K Am

Ae

A ;

NOMENCLATURA

Cromatograma Linea de base Volumen de elucion: Vi

Tiempo de retencion: tRi

Tiempo de retencion corregido: t’Ri=tRi-t0

Volumen de F. Movil: V0

Tiempo de elusion de F. Movil: t0

Fig 3.4 q

VELOCIDAD DE MIGRACION DE LOS COMPONENTES

Velocidad lineal media:

Velocidad lineal media del analito:

Factor de capacidad: k’i

Relacion entre K y tR

Relacion entre k’ y vel. lineal

Factor de selectividad:

min;

cmtL

R

v

min0

; cm

tL

u

m

e

V

VK

uv

1

1

0

0'

t

ttk R

'

'

A

B

kk

'1

1

kuv

CARACTERIZACION DE k’ y k’

K’ adecuado: 2-10 (pocos analitos) 0,5-20 (muchos analitos)

Ajustes de k’ mediante fuerza de elusion de F. Movil: modificacion de la proporcion del solvente de F. Movil de mayor afinidad con los analitos

Cambio en la proporcion del componenete activo de la F. Movil

referencia: 1 depende de la afinidad del

analito con la F. Movil y la F. Estacionaria

Ajustes de a variando la interaccion entre el analito-F. Movil-F. Estacionaria: Cambiando componente

activo de la F. Movil (MeOH, ACN)

Variacion de pH de F. Movil

Agregados de aditivos Cambio de Fase

estacionaria

ENSANCHAMIENTO DE BANDA – EFICIENCIA DE LA COLUMNA

Numero de platos teoricos: N

Altura de plato teorico: H Sgn. Martin y Synge

(picos gausianos simetricos)

Sgn. Foley y Dorsey (picos gausianos asimetricos)

Fig 3.5 y 3.7Q

2

5,0

'2'

545.5;16

W

tN

W

tN RR

H

LN

25.17.41

2

1,0

AB

Wt

N

R

FACTORES QUE AFECTAN A H Y N

PROPIO DE COLUMNA Particulas de la F.

Estacionaria Diametro Morfologia Calidad de particula

Empacamiento de la F. Estacionaria Calidad Envejecimiento Canales (producido por

golpes)

EXTERNO A COLUMNA Tuberias

Longitud Diametro

Detector Volumen Geometria

Geometria del pico Anterior Posterior

UTILIDAD DE N Y H

Comparacion de materiales y metodos bajo iguales condiciones de trabajo

Optimizacion de metodo analitico Control de idoneidad de un metodo analitico Control del estado de la columna durante su vida util

PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO DE BANDAS

Ensanchamiento de banda intracolumnar (H) Caudal de fase movil Difusion longitudinal Resistencia a la transferencia de masas en la F.

Estacionaria Resistenca la transferencia de masas en la F. Movil Proceso multipasos

Ensanchamiento de banda extracolumnar (2) Detector Volumen de las partes del cromatografo entre el

inyector y el detector Volumen de inyeccion

Ensanchamiento de banda intracolumnarCaudal de fase movil

Magnitud de efectos cineticos dependen del tiempo de contacto entre FE y FM

Los Hmin para LC se dan a caudales menores que para GC debido a los caudales de trabajo

En general HLC<HGC

Longitud de columnas de LC<<GC => eficiciencia GC>>LC

Fig 24.7 SL

Ensanchamiento de banda intracolumnar

Difusion longitudinal

Difusion de analitos desde zonas mas concentradas a mas diluidas

El ensanchamiento long. se produce en la direccion del flujo de la FM

A > u < tiempo de residencia del analito < difusion

B/uL 0; B/uG>0

Fig 24.7 SLu

Dk

u

B MD2

Ensanchamiento de banda intracolumnarCoeficientes de trasferencia de masa (CE y CM)

El equilibrio de particion entre las dos fases es MUY LENTO por lo que siempre se trabaja fuera del equilibrio. Las moleculas mas afectadas son las que se encuentran en el frente o cola de la banda.

Los analitos necesitan tiempo para difundir desde el interior de las fases hasta la interfase donde se produce el reparto

El ensanchamiento long. se produce perpendicular a la direccion del flujo de la FM

Ensanchamiento de banda intracolumnar Transferencia de masas en la F. Estacionaria

L-L: CE es directamente proporcional al cuadrado del espesor de pelicula inmobilizada e inversamente proporcional a la velocidad de difusion del analito

L-S: CE es directamente proporcional al tiempo necesario para adsorberse/desorberse de la superficie solida e inversamente proporcional a la constante de velocidad de primer orden con que se da este proceso

E

fE Dk

udqkuC

L 2'

2'

)1( 2'

'

)1(

2

k

uktuC D

ES

Ensanchamiento de banda intracolumnaTransferencia de masas en la F. Movil

Proceso muy complejo. Solo se conocen las variables que lo gobiernan. Velocidad de transferencia de masa: Inversamente proporcional a la velocidad de difusion

del analito en la fase movil Directamente proporcional al cuadrado del diametro

de la particula de la soporte solido Directamente proporcional a la velocidad lineal de la

F. Movil

uD

udfuC

M

pM

),( 2

Ensanchamiento de banda intracolumnaDifusion de Eddy (proceso multipaso)

Multitud de caminos posibles por donde puede atravesar el analito. A u > nro de transferecia de caminos por lo que la

velocidad analito tiende velocidad media A umod < nro de transferecia de caminos por lo que habra

mayor ensanchamiento de banda A u el efecto de ensanchamiento de banda por multiplicidad

de caminos es independiente del caudal.

Fig 24.8 SL y 3.8 Q

Ensanchamiento de banda intracolumna Difusion de Eddy

Fracciones de F. Movil estancada en fase estacionaria: el analito debe difundir de los liquidos estancados antes que pueda producirse la transferencia con la F. Movil en movimiento y la F. Estacionaria: Fenomeno directamente proporcional u Fenomeno inversamente proporcional a la DM

Fenomeno directamente proporcional al diametro de particulas debido a que aumenta el tamano de poro

Ensanchamiento de banda intracolumnarEcuacion de Van Deemter

Variable influyentes en el ensanchamiento de bandas Diametro de particulas Viscosidad de la F. Movil Diametro de columna Mejor empacamiento de

columna Temp.: reduce D Grosor de la F.

Estacionaria

Fig. 24.9 y24.10 SL

uCuCu

BH ME

Ensanchamiento de banda extracolumnar

Dispersion del pico: T2

En la T2, ec

2 es constante. Esto implica que el ec2 es mas

relevante: Para picos poco retenidos H pequenos Menor radio de la columna

porosidadHLr TTic

inyeccionectorunionestuberiaicT

ecicT

:;)( 222

22det

2222

222

Ensanchamiento de banda extracolumnarDetector

Contribuciones: Componenete hidraulicos:

Tuberia y uniones: Longitudes minimasDiametros minimos

Volumen de celda: 1/10 volumen del pico Geometria de celda: tal que evite turbulencias

Componente electronico Constante de tiempo (): 10% W½

muy pequena (rta. rapida): senal ruidosamuy elevada (rta. lenta): perdida del pico,

aplastamiento o confusion con el adyacente

Ensanchamiento de banda extracolumnarVolumen de partes del cromatografo (inyector –

detector); Volumen de inyeccion

Volumen de partes del cromatografo (inyector –detector) Longitudes y diametros de tuberias y conexiones minimos Efecto menos notorios para picos con k’ elevados

Volumen de inyeccion: Viny.max.

2=(Kr2)2HL incremento de variancia permitido (5%) K: cte. Dependiente del perfil de inyeccion (K2=12, perfil de

inyeccion normal) Valores recomendados:

Dolan: 1/6 volumen del pico de interes Novotny: 17 l, col. Convencionales y 1.7 l para col.

microbore

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA Finalidad: lograr separacion de analitos en el menor

tiempo posible mediante: Reduccion de ensanchamiento de picos: H Modificacion de la velocidad relativa de migracion: y

k’ Resolucion: medida cuantitativa de la capacidad de

separacion R=1,5: separacion completa de 2 analitos R=0,75: separacion incompleta de 2 analitos

Fig 24.11 SL

22BA WW

zR

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA

Influencia de la R sobre el tB

Efectos cineticos que contribuyen al ensanchamiento de bandas

Termino de selectividad que depende del analito Termino dependiente del analito y la columna Factores termodinamicos que no dependen de N ni L

Influencia de k’ y sobre R

4

1

1'

' N

k

kR

B

B

2

2'

3'2

1

116

B

BB

k

k

u

RHt

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA

Efecto de la variacion de k’ sobre R

Qk

kR

B

B

1'

'

3

2'

'' 1

B

BB

k

kQt

Orden de variacion:

1. N

2. k’

3.

APLICACIONES: ANALISIS CUALITATIVO

Mediante identificacion de picos En función datos cromatograficos solamente

Tiempo de retencion Grafica de Log tR vs. Nro. de atomos de carbono Indice de Kovats Multiples columnas Respuesta de dectores relativas Pretratamiento de muestra Cromatografias secuenciales

En función datos cromatograficos y otros datos Analisis de grupos funcionales y elementales Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas Retencion de picos

Sin identificacion de picos

ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion

Principios fundamentales de la identificacion

1. Si el tR de un componenete A es igual al del componenete desconocio, esto no prueba que el compuesto desconocido es el componente A

2. Si el tR de un componenete A no es igual al del componenete desconocio, esto prueba que el compuesto desconocido no es el componente A

3. Si no se observa ningun pico al tR del compuesto A, esto prueba que el componente A no esta presente en la muestra, al menos a los niveles de deteccion de la tecnica

Factores a tener en cuenta en la precision de los datos

Control de temperatura 1% repetividad en tR, debe mantenerse la T en ± 0.3

oC Control de flujo del F. Movil

1% de variacion de flujo afectara 1% el tR

Volumen de inyeccion Sobrecarga varia los tR

Empaque, cantidad de F. Estacionaria, antigüedad, usos previos, etc.

ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion

tr = f(condiciones experimentales)Comparación anlito y compuesto de referencia analizado igual

condicionesMás aconsejable añadirlo a la mezcla

Cpto noretenido

Cpto referencia

Analito

tm tR(S)tR(a)

tR’ = tR - tm

r(a,s) = t’R(a)/t’R(s)

ANALISIS CUALITATIVO En función de tiempo de retencion

Basada en la dependencia lineal entre entre Log tR y Nro. de atomos de carbono de una serie homologa

Sencilla de armar: basta con 2 puntos Fig 7.3, pag399,Grob

ANALISIS CUALITATIVO En función de grafica de Log tR vs. Nro. de atomos de carbono

ANALISIS CUALITATIVO En función de Indice de Kovats

Basado en una serie normal de alcanos como referencia Teoria:

A: anlitoN y n: nro. de C alcanos

VA’: volumen de eluc. de A corregido Practica: requerimientos

Al menos 3 alcanos de serie homologa Al menos uno eluira antes y el otro luego del analito A

Fig 7.4 400 Grob

''

''

loglog

loglog100100

Nn

NA

VV

VVNI

El uso de 2 o mas columnas incrementa la probabilidad de acertar la identificacion de un pico desconocido, pero no es conclusivo

Las columnas deben ser diferentes basadas en los indices de Mc Reynolds

La caracterizacion se basa en el indice de retencion relativo del pico desconocido

Tambien debe corresponder la caracterizacion cuantitativa del pico desconocido con las distintas columnas

ANALISIS CUALITATIVO En función de multiples columnas

ANALISIS CUALITATIVO En función de respuesta de dectores relativas

Detectores selectivos El flujo de la salida de la

columna es dividido hacia 2 o mas detectores

Cromatografia de peso molecular (GC) Basada en la senal de

dos detectores de ensidad de gas, dos columnas y dos gases de distinta densidad (Ej: CO2 y SF6)

Fig 7.5 403 Grob

12

1

12

12

AA

K

MWMWAA

K

MWGCGC

ANALISIS CUALITATIVO En función de cromatografias secuenciales

Cromatografia bidimensional Precolumnas de retencion Precolumnas de reaccion Pirolisis controlada (GC)

Analisis de grupos funcionales y elementales Examinacion preliminar Medicion de variables fisicas (bp, ind. de refraccion,

densidad…) Reacciones selectivas

Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas LC-ESI-MS, LC-CI-MS, LC-TOF MS, LC-AAS, LC-

ICP-OES, LC-ICP-MS…. Retencion de picos

Purge and trap

ANALISIS CUALITATIVO En función de datos cromatograficos y otros datos

Fingerprints Para identificacion de un grupo de picos No se realiza una identificacion individual del pico Basado en la apariencia general de los picos, tR vs. Conc. y la

relacion de area de picos definidos

ANALISIS CUALITATIVO Sin identificacion de picos

APLICACIONES: ANALISIS CUANTITATIVO

Normalizacion de areas Estándar externo

Sin agregado de estándar interno Con agregado de estandar interno

ANALISIS CUALITATIVO

Tiempo de retencion Grafica del Log tR vs. Numero de carbono Indices de Kovats Multiples columnas Respuesta de diferentes detectores Pretratamiento de muestra Cromatografia en serie

Analisis cuantitativo Rapidez Simplicidad Costo bajo Gran aplicabilidad Informacion cuantitativa

APLICACIONESAnalisis cuantitativo

Calibracion baseada en: Altura de pico Area de pico

Metodos de cuantificacion: Estándar externo

Sin agregado patron Con agregado patron

Normalizacion de areas

CROMATOGRAFIA DE GASES

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Analisis de grupos funcionales y elementales

APLICACONES