MÉTODOS E INTRODUCCIÓN DE

MATERIAL GENÉTICOEquipo #6

Landa Valero Ana Beatriz

García Murguía Gerardo Uriel

Rebolledo Pérez Samantha

Santiz López Johnny Alexander

Vera Pedro Antonio

Introducción

1.Transfección

Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante procesos químicos o físicos, utilizando plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para la transferencia.

2.Transducción

Introducción del gen exógeno mediante vectores virales.

• Adenovirus• Retrovirus• Lentivirus• Herpes virus• Adeno-associated virus

3. Transformación

Es la alteración genética de una bacteria resultante de la absorción directa, incorporación y expresión del material genético exógeno.

El ADN exógeno se encuentra en el ambiente y se introduce a través de la membrana de la célula bacteriana.

La transformación ocurre de forma natural en algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios artificiales.

Clasificación

Métodos Físicos

Electroporación

Microinyección

“Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun”

Magnetofección

Métodos Químicos

Cloruro de calcio

Coprecipitación con fosfato cálcico

DEAE-dextrano

Lípidos catiónicos

Polietilenimina (PEI)

Métodos FísicosElectroporación

Es un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado externamente.

Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros.

Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula.

Es habitual en biología molecular, como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.

Microinyección

Proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido.

La microinyección de genes dentro de óvulos fertilizados es un vector comúnmente utilizado en la producción de animales trasngénicos.

Para la microinyección es necesario contar con los siguientes elementos:

1. Microscopio de micromanipulación. Estos microscopios también disponen de una platina térmica que se puede calentar a 37ºC.

2. Micropipeta de inmovilización.

3. Pipeta de microinyección, extremadamente fina.

Para llevar a cabo la microinyección, los huevos extraídos, tratados con hialuronidasa y colocados en una gota de aceite o parafina líquida se depositan en la placa soporte del micromanipulador que está a 37°C.

Bajo el microscopio se procede a una primera observación para controlar el aspecto y la correcta visibilidad de los pronúcleos. Se descartan aquellos cigotos que no tengan claramente visible el pronúcleo masculino.

Manipulando las agujas de inmovilización (el cigoto es sujeto mediante presión negativa) y microinyección, el ADN purificado, en solución salina (cargado en la segunda aguja por capilaridad) es introducido con un movimiento certero en el pronúcleo masculino.

Posteriormente, estos óvulos fecundados se introducen en los oviductos de madres adoptivas, previamente tratadas con hormonas que inducen el momento adecuado de su ciclo ovárico para recibir el embrión y para que progrese el embarazo.

AplicacionesMicroinyección de células adherentes en cultivo.

Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto)Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

“Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun”

Introducción del DNA adherido a micropartículas de oro o tungsteno que se disparan directamente sobre el núcleo de la célula diana.

Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales; sirve para la creación de plantas transgénicas.

Magnetofección

El principio es asociar ácidos nucleicos, reactivos de transfección o virus con nanopartículas magnéticas específicas. 

Los complejos moleculares resultantes se concentran y se transportan en las células soportadas por un campo magnético apropiado. 

De esta manera, la explotación de una fuerza magnética ejercida sobre vectores de genes permite una muy rápida concentración de la dosis aplicada en todas las células, de modo que 100% de las células entran en contacto con una dosis vector significativo, y promueve la captación celular.

Los ácidos nucleicos se liberan en el citoplasma por diferentes mecanismos, dependiendo de la formulación utilizada.

La captación celular del material genético se logra mediante endocitosis y pinocitosis. En consecuencia, la arquitectura y estructura de la membrana permanecen intactos.  

Las partículas magnéticas se concentran luego a las células por la influencia de un campo magnético externo generado por una placa magnética específica. 

Las nanopartículas magnéticas están hechas de óxido de hierro, recubiertas con moléculas catiónicas patentadas específicas. Su asociación con el ADN se logra mediante la agregación coloidal inducida por sal y la interacción electrostática. 

Métodos QuímicosCloruro de calcio

Está basada en estudios realizados por Mandel e Higa en 1970, en los que se observaron que la incorporación del ADN del fago λ por células bacterianas se incrementaba sustancialmente en presencia de cloruro de calcio.

En este procedimiento las células y el ADN plasmídico se incuban en una solución hipotónica de CaCl2, que forma un complejo con el ADN que facilita su entrada por endocitosis a la célula competente.

Además se aplica un breve choque térmico a 42°C por 90 segundos que incrementa la permeabilidad de la membrana celular.

Ruta endocítica La ruta endocítica. Es la ruta por la que componentes

solubles y de membrana entran en la célula. Esta ruta abarca a su vez:

Método del fosfato cálcico

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos.

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

ADN + CaCl2

Añadir Na2PO4 en tampón

Precipitados de CaPO4 con ADN

endocitosis

Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares.

El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.

La eficiencia de transfección puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamaño y calidad del precipitado que se forma.

Ventajas Altamente efectivo en cultivos celulares.Sin limitaciones en tamaño de transgen.Relativamente simple.Rápido y repetible

Desventajas Limitado en términos de aplicaciones clínicas.Algunas formulaciones son costosas.Dependencia del tipo celular.

Método del DEAE-Dextrano

 

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano  o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA.

Cuando estos complejos son adicionados a las células, se unen la membrana plasmática que está cargada negativamente y son internalizados por endocitosis. Se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol. Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

La eficiencia de la transfección por este método es alta, reportándose eficiencias mayores al 80%.

Péptidos fusiogénicos

Los péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita evitar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada a la célula.

Estos péptidos fusiogénicos se utilizan para compactar DNA y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipo Histonas.

En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactúan con aminoazúcares de la membrana plasmática con (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas.

En este punto el transportador con el vector han de salir al citoplasma, ya que si no recibirán ataques lisosomales que digerirán el conjunto.

El péptido fusiogénico por su capacidad de romper las vesículas endocíticas, fue aislado de hemaglutinina HA2 del virus de la influenza.

Vector de transferencia génica mediada por receptor.

El ligando (a) activaría la endocitosis al unirse a su receptor específico. La poli-L-lisina (b) tiene la función de unir al ligando y al DNA.

DNA plasmídico (c) que contiene el gen de interés.

La nueva generación de vectores de transferencia génica mediada por receptor que resulta de la adición del péptido fusiogénico (d) y el péptido cariofílico (e) al vector original DNA plasmídico que contiene el gen de interés.

PF= péptido fusiogénico tiene la misión de rescatar oportunamente al DNA antes de que aumente la acidez del endosoma. PC = péptido cariofílico, encargado de direccionar al DNA al núcleo. péptidos virales que tienen la capacidad de dirigir material genético exógeno al núcleo.

Lipofección

Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA.

El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol.

Existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE).

En condiciones específicas se obtiene entre el 70 y el 90% de las células de la placa.

Las desventajas son el elevado precio de los lípidos y el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares.

Procedimiento

Día 1- Las células de la

placa, resuspender y congelar el reactivo de liposomas

Día 2- Diluir el DNA en el

medio

Añadir el reactivo de liposomas

descongelado al ADN,

mezclar el medio y

agitar en el vórtex

brevemente

Incubar el reactivo de

ADN/liposoma, mezclar por 10 a 15 minutos a

temperatura ambiente.

Retirar el medio de

crecimiento de las células

Añadir la mezcla de transfección a las células y devolverlos a la incubadora a 37°C

Después de un periodo de incubación (1hora generalmente), añadir el medio de crecimiento completo a las células

Devolver las células a la incubadora durante el período de tiempo apropiado antes del análisis

Realizar el enzayo deseado

Polietilenimina PEI

Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis.