Transferencia de material genético II

Transferencia de material genético II

Purificación restricción (Digestión)17.04.12

ESQUEMA GENERAL

SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un

antibiótico

SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y

visualizar en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina

Plásmido

Son cadenas dobles de DNA circular de 1 kb a 200 kb que se pueden encontrar en las bacterias.

Superenrrollamiento Linealizado: Es decir cuando se ha

cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez.

Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas

DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado.

Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado

Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

Características

1. ORIGEN DE REPLICACIÓNCapaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hospedero

2. MARCADORES DE SELECCIÓN

Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a un antibiótico

3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM) Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmido e insertar DNA.

Son pequeños 5,000 -40,000 pb.

Suelen llevar sólo uno o pocos genes.

Molécula de DNA circular.

Pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee.

Son transmisibles. Resistencia a antibióticos.

Permiten obtener preparaciones de Permiten obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son cantidad y calidad adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos la base de la mayoría de los protocolos en biología molecular.en biología molecular.

La mayoría toma en cuenta las La mayoría toma en cuenta las diferencias topológicas entre los diferencias topológicas entre los plásmidos circulares y los fragmentos plásmidos circulares y los fragmentos cromosomales lineales, y el tamaño de cromosomales lineales, y el tamaño de ambos.ambos.

Uno de los métodos más utilizados es el de Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina en presencia del desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS).detergente dodecil sulfato de sodio (SDS).

o Puentes de hidrógeno de Puentes de hidrógeno de cadenas cadenas complementarias complementarias de DNA se rompen y las de DNA se rompen y las cadenas permanecen cercanas entre sí.cadenas permanecen cercanas entre sí.

o Cadenas lineales o rotas de DNA se liberan o separan completamente.

o Si una mezcla de plásmido desnaturalizado y de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente, la fidelidad de la reasociación es diferente para ambas macromoléculas.

o La renaturalización de los La renaturalización de los plásmidos circulares es plásmidos circulares es rápidarápida debido a que las debido a que las cadenas están próximas.cadenas están próximas.

o Las moléculas lineales de Las moléculas lineales de DNA se renaturalizan DNA se renaturalizan menos precisamentemenos precisamente, , formando redes de DNA o formando redes de DNA o agregados que pueden ser agregados que pueden ser removidos de la suspensión removidos de la suspensión por centrifugación. por centrifugación.

o El El plásmido permanece plásmido permanece en la soluciónen la solución y puede ser y puede ser precipitadoprecipitado con alcohol con alcohol después de que el DNA después de que el DNA cromosomal ha sido cromosomal ha sido removido.removido.

Se han desarrollado un gran número de métodos para la purificación de DNA plasmídico de bacterias y todos ellos implican invariablemente tres pasos:

1.Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo

2.Recogida y lisis de las bacterias3.Purificación del DNA plasmídico

1.- Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)Disuelve la membrana

Se une a las proteínas y las desnaturaliza

2.- NaOH Desnaturaliza DNA 2.- NaOH Desnaturaliza DNA (rompe los puentes de (rompe los puentes de hidrógeno entre ambas hidrógeno entre ambas cadenas)cadenas)

2.- Acetato de potasio/ ácido acéticoA)Neutraliza el NaOH (renaturalización de DNA plasmídico, se restablecen los puentes de hidrógeno).

B) Convierte al SDS soluble a la forma insoluble PSD

Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Dodecil Sulfato de Potasio (PDS) (H2O sol. = 10%) (H2O sol. < 0.02%)

Determinación de concentración de DNA

Pureza del DNA Determinación de pureza

A260/A280

Relación de 1.9-2.0 alta pureza

Determinación de contaminantes de DNA

Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea

DNA plásmidico separado de los DNA plásmidico separado de los contaminantes por centrifugacióncontaminantes por centrifugación      El sobrenadante contiene:      El sobrenadante contiene:         - El DNA del plásmido         - El DNA del plásmido         - Los componentes          - Los componentes celulares solublescelulares solubles            Pellet contiene:      Pellet contiene:         - PDS         - PDS         - Lípidos         - Lípidos         - proteínas         - proteínas         - El DNA cromosómico         - El DNA cromosómico

Restricción

Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Enzimas de restricción

· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

Enzimas de restricción Tipo IUna sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN, Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Tipo IIEnzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.

Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda)

Extremos romos

Extremos cohesivos

Enzimas de restricciónNomenclatura Ejemplo Corresponde a:E Escherichia Género de la bacteriaco coli Especie de la bacteriaR RY13 Cepa de la bacteriaI La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima

Plásmido

Usos de las enzimas de restricción

Identificación de muestra