METODOS Y TECNICAS DE MICROBIOLOGIA I

CLASE 8

METODOS DE SIEMBRA

MEDIOS DE TRANSPORTE

• El control de calidad en el laboratorio clínico implica un control preanalítico, es decir, anterior a la obtención de la muestra.

• La exactitud comienza al asegurarse una obtención adecuada de ésta mediante la utilización de recipientes apropiados para su recolección y otras técnicas.

• Hay que tener en cuenta que una vez que se haya obtenido la muestra, pueden originarse errores en su transporte y manejo.

Hay que tener en cuenta una serie de aspectos fundamentales:

1. La muestra debe ser representativa del proceso que se va a estudiar.

2. La cantidad recogida debe ser suficiente para asegurar un examen completo y adecuado.

3. Si es posible, debe obtenerse la muestra antes de iniciar el tratamiento. Si esto no fuera posible debe informarse al laboratorio sobre los antibióticos que está recibiendo el paciente.

4. La muestra debe ser tomada del lugar en el que sea más probable hallar los microorganismos sospechosos.

5. Asegurar la mínima contaminación externa.6. Recoger la muestra en el estadio de la

enfermedad más adecuado.7. Tomar muestra en cantidad suficiente.8. Emplear recipientes estériles.

Las causas más frecuentes de fracaso son las siguientes:

a. Fallo en las técnicas de cultivo.b. Toma de muestras inadecuada.c. Deficiencias en el transporte.d. Tipos de muestra.

Las muestras utilizadas en el análisis microbiológico se pueden clasificar en tres tipos:

Muestras de zonas que albergan flora normal: • Piel, boca, tracto respiratorio, genitales

externos, exudados vaginales, uretrales etc. Una muestra de estas zonas tendrá flora normal, lo que debe tenerse presente al valorar los resultados de los exámenes microbiológicos.

Muestras de zonas normalmente estériles que no son secreciones o exudados: Sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), etc

Muestras de zonas normalmente estériles: • Pero cuya secreción o exudación implica el paso a

través de una segunda zona que contiene flora normal. A este grupo pertenece la orina, secreciones de vías respiratorias inferiores, etc. Se realiza una toma de muestra lo más aséptica posible que minimice la contaminación por la flora normal.

• La toma de muestra se realiza por métodos cruentos asépticos y deben tomarse todas las precauciones necesarias para evitar contaminaciones.

Manejo de las muestras

• Las muestras deben ser inoculadas en el medio de cultivo adecuado.

• Si no pueden ser inoculadas nada más llegar al laboratorio, deben ser conservadas de forma adecuada (tabla 1).

• Como norma general, las muestras deben ser refrigeradas a 4-6 ºC. El período de refrigeración varía con el tipo de muestra.

• Con la refrigeración se pretende evitar un crecimiento excesivo de flora acompañante y mantener viables los posibles patógenos.

TABLA 1: CONSERVACION DE ALGUNOS TIPOS DE MUESTRA MICROBIOLOGICAS.

NEVERA (4ºC) ESTUFA (37ºC)Hongos LCRParásitos HemocultivoMicobacteriasUrocultivoExudados vaginal y uretralExudado de heridasExudado faríngeos y nasalesEsputoCoprocultivo

• Las muestras normalmente asépticas, como la sangre o LCR, deben ser mantenidas en estufa, no refrigeradas.

• Dado que en estas localizaciones no existe flora normal.

• Se presume que los posibles microorganismos que puedan contener serán agentes patógenos (tabla 2), así que lo que se intenta es favorecer su crecimiento.

• Tabla 2: Principales microorganismos aislados en diferentes muestras biológicas:

HERIDAS:• Staphylococcus aureus• Streptococcus pyogenes• Pseudomonas. EXUDADO CONJUNTIVAL• Streptococcus pneumoniae• Neisseria gonorrheae.

EXUDADO FARINGEO• Streptococcus pyogenes• Staphylococcus aureus• Neisseria meningitidis

EXUDADO URETRAL Y VAGINAL

• Neisseria gonorrheae• Cándida albicans• Gardnerella vaginalis• Trichomonas

ESPUTO• Hongos• Mycobacterium tuberculosis• Mycoplasma.

COPROCULTIVO• Salmonella• Shigella• Yersenia• Escherichia coli

UROCULTIVO• Proteus mirabilis• Pseudomona• Serratia

• Desde que la muestra es recogida hasta su procesamiento es fundamental que no se contamine, que no se produzca una proliferación excesiva de flora bacteriana y que los posibles microorganismos patógenos presentes en la muestra permanezcan viables.

• Para esto es importante que la muestra sea recogida, transportada y manipulada de forma adecuada.

• A continuación veremos los diferentes, medios de trasporte de los microorganismos.

• Envase estéril de boca ancha:

Para: biopsias, tejidos, orinas, escamas, líquidos, esputos, secreciones bronquiales.

• Estudia: micobacterias, aerobios, hongos, antígeno de Legionella y Neumococo.

• Port-A-Cul vial (medio de Cary Blair):

Para: líquidos y exudados obtenidos por aspiración.

• Estudia: aerobios, anaerobios, hongos y micobacterias.

Port-A-Cul tubo (medio de Cary Blair):

Para: raspados de heridas, escaras, abscesos, úlceras, pequeñas biopsias y tejidos.• Estudia: aerobios, anaerobios y hongos.• Hisopo con medio de transporte Stuart:

Para: abscesos y heridas recogidas con escobillón. • Estudia: aerobios y hongos. • No válido para: anaerobios

y micobacterias

• Tubo estéril de tapón verde:

Para: líquidos estériles.• Estudia: micobacterias, aerobios y hongos.• No válido para: anaerobios, ni para líquidos con alto

contenido hemático.

• Medios de transporte para virus• Para: aspirados nasofaríngeos, exudados

y biopsias. • Estudia: virus.

• Tubo de plástico estéril:

Para: catéteres (no más de 4 cm), tejidos y líquidos.

• Estudia: aerobios, hongos, micobacterias. • Precisa 3-4 ml por frasco.

Hemocultivos adultos (Bactec):

Para: sangre y líquidos estériles. • Estudia: aerobios, anaerobios y

hongos levaduriformes. • Precisa 10 ml por frasco.

Hemocultivos pediátricos (Bactec):

Para: sangre y líquidos estériles.• Estudia: aerobios y hongos levaduriformes.

Isolator (I. Adulto - 10, I. Pediátrico - 1.5):

Para: sangre. • Estudia: infecciones de catéter,

micobacterias, brucelosis, legionella, bartonella y hongos filamentosos.

Contenedor especial Para-Pak:

Para: heces. • Estudia: aerobios y hongos.• Nota: Para el estudio de Clostridium difficile, Rotavirus y

Cryptosporidium, RECIPIENTE ESTÉRIL DE BOCA ANCHA

Medio de transporte para Chlamydias:

Para: muestras vaginales y balano-prepuciales.

• Estudia: Chlamydias.

AISLAMIENTO BACTERIANO• Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir

de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

• Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales.

• Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente.

• En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos

• Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre.

BACTERIAS AEROBICAS

• El género Bacillus está compuesto por bacilos Grampositivas grandes caracterizados por su capacidad para producir endosporas. El género incluye microorganismos aerobios estrictos y anaerobios facultativos.

• Proliferan bien en placas con agar sangre. La proliferación máxima se obtiene con un pH de 7-7.4 en condiciones aerobias, pero se produce desarrollo también en ausencia de oxígeno.

Bacillus anthracis es causante de enfermedad en el ser humano, es un bacilo recto que mide de 3 a 5 micras de largo y de 1 a 1.2 micras de ancho, es inmóvil. Están encapsulados durante la proliferación en el animal infectado.

Bacillus cereus : Es una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia, es móvil y no es susceptible a la penicilina.

Haemophilus influenzae, anteriormente llamado bacilo de Pfeiffer o Bacillus influenzae, es un cocobacilo Gram-negativo no móvil productor de gripe. Es generalmente aerobio. Crece en medio agar chocolate .

Bordetella pertussisBacterias Gram - ,aerobias y anaerobias facultativas, no produce esporas pero si tiene capsula y fimbrias, se aloja en el aparato respiratorio y el paciente puede ingresar al cuarto de urgencia en horas de la madrugada.

Corynebacterium, • Encontradas con mayor frecuencia en los

laboratorios clínicos como patógenos oportunistas de huéspedes comprometidos o como agente causal de difteria incluyen:

• C. diphtheeriae, ulcerans, aquaticum, pseudodiphthericum (hofmannii), xerosis, renale, pseudotuberculosis (ovis), bovis, minutissimum, haemolyticum, pyogenes, equi, matruchotii.

• Incubar a 37°C Observar características 48 hrs. macro y microscópicas. Caldo tioglicolato+ carne de res con tapón de parafina

Agua Peptonada• Medio de enriquecimiento no selectivo,

recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos fisicoquímicos, a los que ha sido sometido el alimento.

• Escherichia coli • Staphylococcus aureus • Pseudomonas aeruginosa

• Incubación Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

• Características del medio:Medio preparado: ámbar claro.

• Almacenamiento:Medio deshidratado: a 10-35 ºC.Medio preparado: a 2-8 ºC.

Nutritivo AgarMedio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos

• SiembraEn superficie o por la técnica de pour plate, según el uso a que se destine.

IncubaciónEn aerobiosis, a 35-37 ºC

durante 24 horas.

• P. mirabilis E. coli • S. aureus B. cereus • E. faecalis P. aeruginosa • Agar nutritivo suplementado con 5% de sangre de

carnero:• S. pyogenes• S. pneumoniae • Características del medio

Medio preparado: ámbar claro a medio ligeramente opalescente.

Lowenstein-Jensen Medio Base.• Siembra

Se recomienda, en procedimientos de rutina, inocular la muestra previamente descontaminada, sobre la superficie del medio de cultivo.

• IncubaciónA 35-37°C. A los 7 días de incubación, se observa por primera vez si hubo crecimiento. Luego, observar cada semana, hasta un total de 8 semanas.

• ResultadosObservar las características morfológicas y la presencia o ausencia de pigmento en las colonias.

• Crecimiento, Excelente• Características de las colonias

Grandes, secas, amarillentas, granulares.

Agar Mac Conkey : • Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos

Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos.

APC Agar plate count • Medio de cultivo

recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas.

Baird Parker Medio Base

• Medio de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

EMB (eosina-azul de metileno)

• Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

YGC (extracto de levadura, glucosa, cloramfenicol)

• Medio selectivo recomendado para el recuento genérico de mohos y levaduras.

Caldo lactosado• Se recomienda como prueba presuntiva para

investigar la presencia de bacterias del grupo coliforme en agua, productos lácteos, etc. Actualmente también está indicado para el pre enriquecimiento no selectivo en la búsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos

VRBL Violeta Rojo Bilis Lactosa

• Medio selectivo para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos y productos lácteos.

• Es importante aclarar que este medio en particular no debe esterilizarse en autoclave.

• Resultados : Microorganismos• Escherichia coli• Klebsiella pneumoniae• Salmonella typhimurium• Shigella flexneri• Proteus mirabilis• Enterococcus faecalis• Características del medio

Medio preparado: rojo púrpura • Almacenamiento:

Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC.

BACTERIAS ANAEROBICAS

a. Aprox. 99% de tipo endógeno.b. Asociadas a una mucosa cerca del sitio anatómico

de la infección. c. Llegada de anaerobios a sitio diferente, muerte de

los anaerobios muy estrictos, crecimiento defacultativos y predominio de anaerobios menosestrictos.

d. Factores de virulencia.e. Flora mixta: 3-4 anaerobios.

Medios selectivos para anaerobios

BBE: grupo Bacteroidesfragilis y bilophila se usa • Gentamicina (inhibición

de aerobios)• Bilis (inhibición de otros • anaerobios) • Esculina y hierro (colonias negras de B.fragilis

B. fragilis vs. B. vulgatus

B. bilophila

KVLB: Bacteroides yPrevotella • –Kanamicina (inhibiciónde aerobios y otros anaerobios G-) • –Vancomicina (inhibiciónde G+) • –Sangre lisada (pigmentode Prevotella) KVLB AS Prevotella

PEA: crecimiento de anaerobios• –Feniletilacohol (Inhibición de aerobios y del

“swarming”, • –La morfología de anaerobios es similar a la de AS

Clostridium septicum

Anaerobio facultativo

• Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del aire (oxígeno de 21%).

Microaerofílico

• Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%).

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO

• Tubo # 1: Aerobio estricto• Tubo # 2: Anaerobio

facultativo• Tubo # 3: Anaerobio

aerotolerante ( Microaerofílico )

• Tubo # 4: Anaerobio estricto