Métodos de estudio de la

biología molecular

Introducción

De acuerdo a lo que nos hemos dado cuenta hemos visto con diferentes

profes todo el desarrollo con una serie de temas relacionados con biología

celular, constitución química, moléculas inorgánicas y orgánicas haciendo

estructuras de mayor nivel y aparecen las partes de la célula , membrana ,

citoplasma, citoesqueleto, y con otros profesores vieron aspectos relacionados

con el citoplasma membranoso núcleo y cromosomas y en las ultimas clases la

diferenciación y procesos de meiosis y especificación de las células para

cumplir su función específica en los seres vivos. Con eso más o menos esta

completo respecto a célula. Pero esto es también molecular, asique daremos

nociones (no es un curso de biología molecular) como funciona y trabaja con

sus principales aspectos, con este tan importante boom de la biología

molecular, metodologías para obtener la información necesaria, y en la

próxima clase para ácidos nucleídos y proteínas involucradas directamente en

biología molecular. Finalizando con la aplicación de estas técnicas a los

diferentes seres vivos que constituyen la biotecnología y terapia génica. Solo

saber que existen y como funciona.

METODOS DE BIOLOGIA

MOLECULAR

Como les decía, la biología molecular se entretiene estudiando moléculas,

especialmente 2, proteínas y ácidos nucleídos, por ende las metodologías

están dirigidas a estudiar estas 2 moléculas, una de estas 2 metodologías

importantes son las que tienen que ver con la separación con las diferentes

moléculas de un organismo, ya que en un organismo hay miles de proteínas

aquí se separan y se estudian en forma única para reconocer y manipular sus

características en forma específica, que es la ELECTROFORESIS eso es una

cámara típica, es vertical, porque la muestra corre de arriba hacia abajo, hay

otras que son horizontales, esto separa diferentes moléculas sea proteína o

acido nucleído, se hace por medio de un gel, que es una estructura que

físicamente está entre solido y liquido, lo disolvemos y según su concentración

es duro o blando, dependiendo del tipo de sustancia que tenemos que

separar, si son muy grandes el gel tiene que ser lo más blando posible con

espacio grandes entre sus moléculas para que las otras moléculas puedan

pasar. Si son chicas el gel tiene que ser más concentrado, entonces el gel

depende de la concentración para ver que separar.

Electroforesis trabaja con electricidad,

cátodo y ánodo, con diferencia de

potencial eléctrico por electrodo

circula corriente por el buffer, por ahí

pasan los iones de ahí los electrones

pasan por el gel y de ahí al otro buffer

llegando al ánodo haciendo el

recorrido, con esa circulación las

partículas del gel empiezan a

movilizarse según peso. Si son positivas

se van al polo negativo, y si son

negativas van al ánodo. Hay que

hacer algo para que todas las

muestras sean negativas, “WELLS” pocillos para poner la muestra (la rafa lo

pregunto *o*)

Para que todas las moléculas sean negativas se tratan con una sustancia que

las carga negativamente, SDS se pega a las moléculas de proteína y todas las

proteínas están cargadas negativamente, y así corren al polo positivo.

Una vez que el gel ha corrido y las moléculas de acuerdo al tamaño se

posicionan, las mas chicas corren mas y pasan por los orificios y las más

grandes solo pasan por los orificios grandes y así se quedan más atrás y se

demoran más tiempo.

Una vez que se

separan las moléculas

hay que moverlas del

gel porque ya el

proceso siguiente es

manipular esas bandas

que se generaron y

manipular un gen es

difícil es quebradizo y

resbaladizo, lo más

probable es que se

caiga, para que evitar

eso se hace otro

proceso en el cual se

traspasa desde el gel

hacia un papel de

nitrocelulosa. Este papel tiene la capacidad de absorber acido nucleído y

proteínas, entonces si lo colocamos pegado al papel de nitrocelulosa y

hacemos circular agua, es algo simple y barato, de manera que el buffer pasa

por el gel y lleve las moléculas al papel de nitrocelulosa, arriba de ese hay

papel absorberte normal

Otro método que es más simple y rápido es un método eléctrico, se pone todo

en un sistema eléctrico y así las moléculas del gel se van al papel.

De esa manera se obtiene que todo quede en el papel de nitrocelulosa y el

gel queda sin nada, ese papel es mucho mas manipulable, tiene las bandas

de las moléculas igual que el gel igual eso se puede trabajar para reconocer

que tipo de moléculas son las diferentes bandas que se generaron. Si busco

algo especifico lo podemos hacer con anticuerpos, si queremos saber la

insulina ponemos en la bolsa el anticuerpo anti insulina y luego se reconocerá

la banda marcada, una es por anticuerpos

Lo interesante y general del procedimiento es que podemos tener en forma

separada moléculas especificas esa es su capacidad, de un conjunto de una

célula o tejido en forma única limpia y separada una de otra

Así podemos hacer varias cosas podemos diluir, cortamos y diluimos la proteína

en un buffer o bien cortamos el papel de micro celulosa y lo diluimos en tubo

de ensayo y ahí está la proteína o acido núcleos que se necesita.

Northen blot reconoce la presencia de ácidos ribonucleicos ARN los marca

con acido desoxirribonucleico, se pone un gel papel y se marca, esa

marcación se hace con radio actividad, una molécula de ADN con

radioactividad reacciona con el papel. Reaccionara solo moléculas parecidas

que tengas bases complementarias esas bases complementarias se unirán en

el papel y verán la radioactividad del papel. Esa banda son los ácidos

nucleídos que andamos buscando. Se buscan con acido desoxirribonucleico

mas por ejemplo carbono 14 , algo radioactivo,

Se verá solo que

esta marcado.

Se prepara la

secuencia y

se maca con

carbono 14,

entonces esa

molécula estará marcada radioactivamente y esa reacción con la molécula

se le pone al papel y se marcara solo la que tenga la secuencia

complementaria, y así la molécula se pegara, si no la tiene simplemente no se

pega no hay complementariedad, y ahí aparecerá la banda. Porque esa está

marcada,.

Otra tecnología utilizada de separación es la CROMATOCRAFIA se usan

sistemas simples, en que simplemente es una probeta, que se pone una

sustancia que es un polvo blanco y sobre el una mezcla de sustancias, esa

mezcla tiene diferentes compuestos y algunos de esos compuestos tendras

afinidad mayor o menor con la sustancia que hay en la columna, las que no

tengan ninguna afinidad pasaran rápidamente, eso pasa rápidamente y sale

primero, lo que sea de mayor tamaño o mas afinidad se demorara mas y

saldrá en segundo lugar, y si hay otra más grande o mas afín saldrá en tercer o

cuarto dependiendo el numero de moléculas de la mezcla. Lo principal es

colocar la mezcla

ahí arriba y se

separa,

La idea es tener

compuestos

distintos de un

volumen mas o

menos grandes.

Unos 100ml. Pero a

veces la muestra

son unos pocos

micro litros o 1 o 2

ml. De ahí se usan

otros métodos.,

Cromatografía en papel, en esas manchas se ponen las mezclas de diferentes

compuestos unos mas grandes o pequeños con mas o menos carga y se

ponen en forma coloreada, marcando en colores, se ponen las gotas en un

trozo de papel con un solvente que puede ser alcohol o acetona

dependiendo que queremos separar, cuando ponemos papel en el liquido el

liquido sube por capilaridad llegando a las manchas arrastrándolas los mas

pesados se quedan atrás y los livianos suben y al final hay como un arcoíris

pasando los conjuntos de moléculas y tenerlos individualmente, se corta el

papel y se tendrá esa molécula específicamente.

Lo otro es la cromatografía de columna, es

una técnica bastante desarrollada , hay

diferentes tipos de cromatografía, la parte

básica es una columna de vidrio o de lo que

sea, pero el principio es el mismo, ocurre que

en la columna de vidrio se coloca una matriz

es una sustancia generalmente solida

partículas muy pequeñas en polvo y gránulos

dependiendo del tipo de matriz porque hay

una que separa sustancias eléctricamente

que separan por tamaño que separan que no

están cargadas eléctricamente etc.

Consiste en que la muestra que es una mezcla de varias moléculas se colocan

en la superficie de la matriz y se hace pasar a través de ella generalmente de

un solvente. Esta mezcla pasa a través de la matriz y las diferentes moléculas

tienen diferente afinidad por la matriz, abran unas que se retrasan o que van

más rápido. Y al final se van separando de manera que la roja sale primero

luego la verde y luego la negra se queda pegada al sistema de esa manera

recogeremos las sustancias prácticamente puras, porque es muy difícil que

existan 2 moléculas iguales.

El sistema puede ser de intercambio iónico

es decir que la matriz en la columna está

cargada positivamente, aquellas que no

tienen carga pasan sin fijarse, las que tienen

carga positiva se repelen y pasan

positivamente y las negativas se pegan, esas se

quedan adheridas a la matriz, entonces solo

quedaran las moléculas rojas , se agrega un

buffer y se sueltan.

También puede ser que

la columna tenga

partículas en la matriz

con partículas con

espacios de manera que las

moléculas pasan por esos

espacios y eso muestra que las

que pasan por ahí se

demoraran mas entonces es

una separación por tamaño,

cromatografía de filtración en

gel

Y por último la de afinidad es cuando está marcada

por anticuerpo, la separación acá es especifica solo se

pega el antígeno, lo único que se pegara ahí es la

insulina. Luego con el buffer se obtiene la insulina en un

tubo.

Otro procedimiento bastante utilizada ahora es el sistema MICROARRAYS o

micro ordenadores, esa tecnología es un sistema que utiliza básicamente unas

tarjetitas con weas pequeñas donde se ponen las mezclas, en volúmenes no

más de 5 o 10microlitros, y en esos orificios se hacen reacciones, compuestos

necesarios para que reacciones y den algún color

Luego en la tarjeta se verán diferentes colores , en cada uno de los orificios se

coloca en la parte de abajo un trozo de ADN o ARN , eso se llaman oligos

porque son moléculas chicas de 8 y 20 bases no mas, entonces esos oligos

tienen la característica de que se les coloca una secuencia de bases que es la

que nosotros queremos reconocer , si queremos reconocer si hay o no un ADN

modificado como la de la muestra del ratón ,o si hay un ADN que tiene que

ver con cáncer, entonces se sabe la secuencia, y si queremos saber la

presencia o ausencia ponemos la secuencia mas característica, sacamos ese

ADN y lo marcamos con radioactividad o fluorescencia debería traer la

secuencia complementaria, es decir en el oligo esta la complementaria y se

pegan por lo tanto ese ADN queda pegado en el fondo del orificio si no la

tiene no se pega y cuando se lava se sale,. Y no abran marcas y si se pega

abra marcas y el color rojo en los orificios es la marca en el ADN.

En ese tipo de tecnología se pueden hacer para hacer muchas cosas, el

microarray a dado mucha información respecto a composición de ácidos

nucleícos de diferentes componentes en los seres vivos.

Otra tecnología es la FISH

“Florence in situ hybridization”

Estudio de cromosomas si hay

una secuencia especifica en

un cromosoma específico. Hay

que obtener células para sacar

el cromosoma, ese cromosoma

con dna tiene secuencias de

nucleótidos, si queremos

reconocer alguna secuencia

especifica hacemos un oligo

especifico pero

complementario. Con esa secuencia marcada con fluorescencia se hace la

reacción con esa molécula con el cromosoma, y la región en donde esta esa

secuencia se marca, viendo la fluorescencia en el cromosoma y esa

secuencia esta, se observa el cromosoma completo o regiones chicas, como

enzimas, donde reaccionara el oligo? En aquella región que tendrá la

secuencia complementaria. También pueden marcarse sin buscar un gen

específico, esperamos encontrar para cualquier gen 2 cromosomas y si hay 3

hay porque hay problemas (trisomia)

Una de las herramientas claves que ha tenido

la responsabilidad del desarrollo de la biología

molecular, son las enzimas de restricción, son

unas proteínas que están en las bacterias,

estas son enzimas, de restricción. Porque

cortan las moléculas de ADN en ciertas

regiones especificas, las bacterias las usan

para romper las proteínas que ingresan los

virus, cuando los virus la infecta la bacteria

hace la proteína y así corta la proteína del

virus, así sacaron las proteínas de las bacterias

y vieron la especificidad, cortan secuencias

especificas, una proteína no la corta la

pepsina en el estomago, no la corta en

cualquier lugar sino que elige en una

secuencia de aminoácidos especifico.

EcoR1 corta entre G y A de esa manera podemos elegir la enzima para cortar

donde queramos, que se puede hacer?

Uno de los tantos uso de las enzimas de restricción es el de insertar trozos de

dna complementario en el plásmido que es un ADN extra celular de la

bacteria, se abre el plásmido con la secuencia pegajosa libre, por ende si

querernos ponerle otro trozo de ADN echo o sacado de otra célula , como la

insulina 150 nucleótidos, y en los extremos le ponemos la secuencia

complementaria que corto ecor1 y con ligasa se pegan y se les une al

plásmido y queda con DNA recombinante que es la mezcla del dna de

plásmido con el dna extraño. Que no es la de la bacteria,

Pero el sistema es universal, entonces cuando coloquemos el plásmido en la

bacteria lo reconocerá como propio y hará insulina.

Una vez que se ha producido el dna recombinante se pone en el interior de la

bacteria esta la reconoce como si fuera propio y empieza a dividirse y a

producir la proteína que el trozo de ADN le permite hacer.

Otra tecnología importante es el uso de genes reporteros, ustedes saben

que las proteínas son 30.000 en mamíferos, si hay 5 coloreados son mucho,

hemoglobina es de color rojo y se seguimos buscando es difícil buscar

proteínas con color. Entonces en nuestras preparaciones será difícil saber si hay

o no hay proteína porque no se ve nada, como la albumina con agua no se

ve nada, entonces hay que hacer una reacción específica para colorearla.

Entonces el gen reportero tiene como finalidad permitir la identificación la

identidad de determinados genes para ver si están o no están presentes, estos

son secuencias que pueden generar proteínas coloreadas, se colocan en

forma siguiente al gen que queremos estudiar., que ocurrirá? Que el gen que

tiene para proteína X le ponemos después el gen reportero que son chicos

producirá una proteína coloreada ya que la proteína x no tiene color. Pero

siempre irán juntas, en cualquier experimento la proteína estará en la cantidad

y lugar que esta la proteína reportera, entonces si esta gen reportero esta la

proteína, solo interesa que diga si está o no y en qué cantidad.

Un gen reportero muy utilizado es la proteína fluorescente verde. Que se

extrajo de una medusa que es chica como 50-60 entonces es un gen pequeño

de 100 y algo bases. Que produce una proteína de color verde fluorescente,

entonces si lo ponemos al lado de uno que estamos estudiando veremos

cómo reacciona, se agregan secuencias hasta que coincidan. Es una

molécula que nos permite ubicar lo que queremos con mucha facilidad

Otra tecnología importantísima es el PCR

Fue creada por kary mullis gano el nobel con 20mil dólares, y vendió la patente

por 300.000.000 . aweonao.

Es importante porque permite hacer dna a partir de una muestra muy

pequeña, lo hace por 3 cosa: desnaturacion, annealing de primers y luego la

extensión.

Básicamente esa técnica fue posible porque ese científico estudio una

polimerasa, que trabaja a temperatura muy altas sobre 90ºC, eso dice que las

bacterias tienen moléculas que trabajan a esa temperatura ese fue el

descubrimiento el tomo las enzimas y las utilizo en ese procedimiento porque la

desnaturacion del dna tiene que ser a 94ªc que es donde se separan los

enlaces de hidrogeno y quedan las 2 cadenas complementarias separadas,

luego la otra es a 54ªc donde trabaja la polimerasa, y luego es a 72ºC todas

las reacciones son bastante altas,

Cualquier polimerasa se desnaturaria entonces tiene que ser esa polimerasa

especifica. Puede partir teóricamente de una molécula de dna.

Separar en el paso 1, luego en el annealing se ponen los primer que son los

trozos de dna que queremos reproducir

El primer es lo mismo que en el caso de los mircroarrays que son entre 8 y eo

nucleótidos con secuencia específica para saber si hay o no, tendremos el

dna de una célula x ,tenemos que replicar un trozo determinado de ese dna,

Se pone una secuencia de la región en un lado y luego en la cadena

complementaria. Así se acota el trozo. Porque cuando coloquemos el primer

será la secuencia complementaria de eso. Se pegara justo ahí, porque ahí

está su secuencia complementaria.

¿Y donde se pega el otro primer?

Ocurrirá que empieza a formarse la molécula ahí en cada extremo de las

hebras, y en la tercera etapa en la extensión lo que continua haciendo la

polimerasa es seguir poniendo los nucleótidos después del primer, hasta que

encuentre la otra y cuando se encuentran las 2 se termina la síntesis. Con eso

lo que estamos haciendo es seleccionar el trozo de dna que se quiere

reproducir.

Eso se realiza

muchas

veces 1 a 2 a

4 a 8 y así

2^35 en 140

minutos

2horas 20

minutos hay

esa cantidad

de copias

que es lo que

ocurre

La secuenciación es saber el orden de los nucleótidos en la secuencia de

ADN.

La secuenciación es muy importante para saber que enzimas utilizar.

El año 2000 se secuencio casi en 98% el genoma del ser humano, para eso se

necesitaba esa técnica, cada vez se ha ido mejorando, secuencia el dna

preparar el gel que toma un día, tomaba 2 días para la secuencia, ahora la

secuenciación es muy tecnológica en donde simplemente se pone el dna en

la maquina y esta hace todo. Se basa el procedimiento en que es muy similar

de PCR, hay igual 3 etapas

Se desnatura se corta a 94ºc y se separan las 2 cadenas

Luego un annealing con primer para hacer el trozo de ADN que nos

interesa, no nos interesa todo el ADN solo partes especificas

En la tercera etapa (extencion) está la diferencia, con el PCR se pone

ddntp`s solo nucleótidos mientras que en la secuenciación se usa una mezcla

de nucletipos con dntp`s que significa?Una secuencia de nucleótidos de dna

que es lo que se observa ahí, unidos por el oxigeno entre fosfato y azúcar, esa

es dexosi porque es dexoxi

ribosa, porque el carbono

no tiene el oxigeno se le

saco por eso es dexosi ,

entonces ese es el

nucleótido que se agrega

para la secuenciación

para el PCR , que tiene un

oh que no tiene el oxigeno

porque es deoxi

nucleótido para PCR. Pero

en la secuenciación se

agrega el deoxinucleotido y el dideoxinucleotido no tiene ninguno de los dos

oxígenos. Porque es importante el deoxi = porque la unión es importante al

oxígeno por eso tiene que tener el oh y si no lo tiene no se une y no hay

reacción y cuando no lo tendrá? Cuando nosotros usemos la molécula de

didexoxi. Cuando tenemos los deoxis hay reacción y entra otro tro tro pero si

entra un dideoxi ahí se para la reacción porque no encontrara el oxigeno y se

detiene la reacción. El dideoxi puede entrar en cualquier parte porque es al

azar .al principio al medio o al final de la reacción. Significa que se van

generando trozos de dna de diferente tamaño dependiendo en donde

ingrese el dideoxi que terminan en un nucleótido determinado. Porque se

ponen nucleótidos marcados diferente. Al final tendremos una mezcla de

trozos de diferente tamaño de los ácidos nucleícos unos muy chicos y unos

muy grandes. Y se les hace una

electroforesis, ósea que pasan por el

gel que se van separando de acuerdo

a su tamaño que se separan según

tamaño. El sistema actual que es

automático hace una cosa así igual.

Se ponen los nucleótidos en el gel y en

el computador se obtiene la

información, si sabemos el color del

nucleótidos etc. se sabe la secuencia

ddTTP ddGTP etc.