metodo de separacion de proteinas
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Método de identificación y separación de las proteínas: SESIÓN IV:
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Método de identificación y
separación de las proteínas:
SESIÓN IV:
Describe y explica los diversos métodos
de separación de las proteínas,
experimenta a través del método de la
electroforesis el cálculo de los pesos
moleculares de las proteínas y valora su
importancia en la búsqueda del
conocimiento de la ciencia.
COMPETENCIA
Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se
llevaban a cabo por métodos clásicos como son la
precipitación, destilación y extracción. Los esfuerzos
por conocer más sobre la composición y función de las
proteínas han obligado a buscar nuevas técnicas.
Unas tienen que ver con las propiedades físicas y
estructurales de las moléculas que se pretende
separar, otras se derivan de los objetivos del análisis
(sensibilidad, resolución, tiempo de análisis,
necesidad de una detección específica).
El método de selección incluye los pasos necesarios para
la obtención, preparación y posible fraccionamiento de la
muestra. Las técnicas analíticas pueden englobarse en
dos grandes grupos: Técnicas espectroscópicas y las
Técnicas de separación. La primera, proporcionan, para
cada compuesto analizado, una información compleja,
relacionada con sus características estructurales
específicas. La segunda se utilizan para resolver los
componentes de una mezcla y la señal obtenida puede
utilizarse con fines analíticos cuantitativos o cualitativos.
Actualmente las separaciones analíticas se realizan
fundamentalmente por cromatografía y electroforesis.
La cromatografía comprende un conjunto importante y
diversos de métodos que permite a los científicos
separar componentes estrechamente relacionados en
mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones
resulta imposible por otros medios. Se pueden separar
moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas
moleculares. También a través de la polaridad de sus
enlaces, sus potenciales redox, etc.
La cromatografía no solo permite la separación de los
componentes de una mezcla, sino también su
identificación y cuantificación. El análisis cualitativo
está basado en la medida de parámetros
cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención)
mientras que el análisis cuantitativo está basado en la
medida de alturas o áreas de picos cromatográficos
que se relacionan con la concentración. La columna
cromatográfica y la forma con la que se diseña,
constituye el corazón de la separación.
La electroforesis capilar es una técnica
alternativa de la electroforesis convencional y
surge debido a que la velocidad de separación y
resolución de los compuestos mejora a medida
que aumenta el campo eléctrico aplicado.
El mecanismo de separación está basado en las
relaciones carga/masa de los analitos. Su
utilidad está en la separación de proteínas y
péptidos entre otras sustancias (ADN por
ejemplo)
Electroforesis Capilar
En resumen la cromatografía y la
electroforesis son ahora técnicas
ampliamente utilizadas en la
resolución de macromoléculas de
interés en la industria biotecnológica,
biológica y bioquímica.
Electroforesis
1. Se realiza sobre un soporte
sólido o semisólido, para
minimizar efectos de difusión
Muestra
+-2. Se somete el conjunto a un
campo eléctrico constante, a un
pH fijo; las proteínas migran
conforme a su carga eléctrica
3. Terminada la carrera
electroforética, las proteínas se
tiñen con un colorante adecuado
(p.e., Azul de Coomassie)
La palabra Cromatografía significa "escribir en colores",
ya que cuando fue desarrollada los componentes
separados eran colorantes. Las técnicas
cromatográficas se basan en la aplicación de la mezcla
en un punto (punto de inyección o aplicación) seguido
de la influencia de la fase móvil. Existen varios tipos de
cromatografía:
Cromatografía:
Cromatografía en columna
Cromatografía en capa fina.
Cromatografía en papel.
Cromatografía de líquidos de alta eficiencia.
Cromatografía de gases
La Cromatografía en columna.- Utiliza columnas de
vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de
magnesio. Este método de separación necesita hacer
pasar la mezcla, empleando un disolvente.
La Cromatografía en capa fina.- utiliza una placa de
vidrio recubierta con fase estacionaria (generalmente
del tipo de escrito para la cromatografía en columna
con variantes).
La Cromatografía en papel.- utiliza tiras de papel
cromatográfico los cuales se introducen en la cuba
cromatográfica.
La Cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC).-
es parecida a la Cromatografía en columna, sólo que se
aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi), el tamaño
de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la
columna es entre 5 y 25 cm y requiere de equipo
sofisticado.
La Cromatografía de gases.- En este tipo de
Cromatografía la fase móvil es un gas llamado gas portador
o acarreador y la fase estacionaria puede ser un sólido o
una película de líquido de alto punto de ebullición
(generalmente Polietilén - Glicol o Silición).
Fundamento de la cromatografía
Muestra:
tres componentes
mezclados
Fase móvil
Fase
estacionaria
Se hace fluir una
fase móvil sobre la
estacionaria
Dependiendo de la
afinidad relativa por
ambas fases, los
componentes de la
mezcla primitiva
se separan
Se dispone una mezcla
sobre una fase
estacionaria
1. Intercambio iónico
- Separa según carga eléctrica
- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un
soporte insoluble
- Fase móvil: gradiente de sal o de pH
Tipos de cromatografía
2. Partición
- Separa según solubilidad en solventes
- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte
sólido
- Fase móvil: El otro solvente fluyendo
3. Afinidad
- Separa según la afinidad de la proteína
por un ligando inmovilizado
- Fase estacionaria: ligando unido a
soporte insoluble
- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2)
solución con ligando libre.
4. Hidrofóbica
- Separa según hidrofobicidad
- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos
unidos a un soporte insoluble
- Fase móvil: gradiente inverso de sal
5. Exclusión molecular
- Separa según tamaño molecular
- Fase estacionaria: dextrano o agarosa
entrecruzados
- Fase móvil: solución tamponada
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Proteínas adsorbidas
al intercambiador
iónico
A baja concentración
de sal, se desprenden
las proteínas menos
electronegativas
A mayor concentración
de sal se desprenden
las proteínas más
electronegativas
Intercambio iónico
Peso molecular de las proteínas
4. Cálculo directo a partir de
estructura primaria
1. Métodos primitivos: presión osmótica,
ultra centrifugación analítica, etc.
2. Cromatografía de exclusión molecular
3. Electroforesis SDS-PAGE
Cromatografía de exclusión molecular
ABSORCION a 280 nm
Se fundamenta en la absorción a 280 nm
producida por los aminoácidos
aromáticos Phe, Tyr y Trp
- Sensible y fácil de practicar
- Requiere soluciones puras de proteína;
no es aplicable a mezclas
- Distintas proteínas dan diferente grado
de absorción, dependiendo de su
contenido en aa. aromáticos
INTERÉS CLÍNICO PARA LA
DETECCIÓN ANTICUERPOS ANTI-VIH
El síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA), es una enfermedad
infecciosa de origen viral,
caracterizada por una fuerte
depresión de la inmunidad.
Como se ha reconocido en la mayoría de los agentes
infecciosos, los humanos responden a la infección por
VIH produciendo una antigenemia y anticuerpos. Aun
cuando la dinámica de la respuesta puede diferir, la
mayoría de los individuos producirán una antigenia y
anticuerpos a los productos virales durante el curso
de la infección.
Se han aislado dos tipos de virus relacionados
al grupo de lentivirus, de linfocitos de
pacientes que sufrían SIDA.
El primero conocido como VIH-1 aislado en
Francia y más tarde en USA. El segundo VIH-
2, aislado de dos pacientes que vivían en África
comprobándose era el responsable de un nuevo
foco de SIDA en África Occidental.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Es una prueba de enzima-inmunoensayo
indirecto para la detección de varios
anticuerpos VIH-1 y VIH-2 en suero o plasma
humano. Su principio está en una fase sólida
recubierta con antígenos purificados (proteína
recombinandte GP-160 y péptidos y
glicoproteínas de envoltura del VIH-1 y VIH-2),
y anticuerpos de cabra anti-IgG e IgM
humanos, purificados por cromatografía de
afinidad y conjugados con peroxidasa.
EL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO INCLUYE
LOS SIGUIENTES PASOS DE REACCIONES:
1.- Las muestras de suero y controles adeterminar se distribuyen en las celdillas de lamicroplaca. Si existen anticuerpos VIH-1 y VIH-2 se fijan al antígeno inmobilizado en la fasesólida.
2.- Luego del período de incubación, se lavanlas celdillas y se añaden anticuerpos anti-IgG eIgM humanos conjugados con la peroxidasa,formando un complejo en la fase sólida enfunción de la captura de fracción de IgG p IgM.
3.- La presencia de la enzima inmovilizada enel complejo se desarrolla mediante la reacciónpor la adición del sustrato después de que lasfracciones libres del complejo hayan sidoeliminadas
4.- La reacción enzimática separa medianteadición del ácido sulfúrico 4N, y se realiza lalectura en un espectrofotómetro a 492/620 nm
Las absorbancias obtenidas en la lectura de
una muestra permite determinar la presencia
o ausencia de anticuerpos VIH-1 y VIH-2
El Ensayo Wester Blot es el inmunoblot más conocido,
también como ensayo Wester blot(WB), es la prueba
suplementaria más frecuentemente usada para el
diagnóstico de infección por VIH. Este ensayo se usa para
demostrar los anticuerpos de VIH en individuos
asintomáticos o sintomáticos, cuyos resultados del ELISA
(Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay) son negativos en
repetidas oportunidades. Las proteínas que son
codificadas por genes estructurales del VIH son
separadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida
El peso molecular de estas proteínas difiere y por lo
tanto migra a diferentes sitios en el gel. Las proteínas de
peso molecular más bajo migra hacia la parte más baja
del gel. Las proteínas derivadas de VIH generalmente
incluyen p17, p24, p31, gp41, p55, p66, gp120 y gp160.
Las proteínas separadas por electroforesis son
transferidas a un papel de nitrocelulosa, el cual es
cortado en tiras para uso en el ensayo. Estas tiras de
proteínas virales se incluyen en kits de WB comercial.
Representación esquemática de los resultados
de Wester blot (A) resultado positivo.(reactivo
con todos los antígenos (B) resultado negativo
INFECCIÓN VIRAL POR EL
VIH EN EL LINFOCITO
