Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Separación de proteínasSeparación de proteínasalimenticias por electroforesis :alimenticias por electroforesis :

Estudio de los cambios inducidosEstudio de los cambios inducidospor el procesado, identificación depor el procesado, identificación deespecies y detección de proteínasespecies y detección de proteínas

en mezclasen mezclas

Olivera Carrión, Margarita

1988

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.

Cita tipo APA:Olivera Carrión, Margarita. (1988). Separación de proteínas alimenticias por electroforesis :Estudio de los cambios inducidos por el procesado, identificación de especies y detección deproteínas en mezclas. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2092_OliveraCarrion.pdf

Cita tipo Chicago:Olivera Carrión, Margarita. "Separación de proteínas alimenticias por electroforesis : Estudio delos cambios inducidos por el procesado, identificación de especies y detección de proteínas enmezclas". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. 1988. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2092_OliveraCarrion.pdf

n) xTesis2092Ej. 2

S U OS IRES

SEPARACION DE PROTEINAS ALIMENTICIAS POR ELECTROFORESIS:

ESTUDIO DE LOS CAMBIOS INDUCIDOS POR EL PROCESADO,

IDENTIFICACION DE ESPECIES Y DETECCION DE PROTEINAS

EN MEZCLAS.

MARGARITA OLIVERA CARRION

mm: MIRTAEVAVALENCIA

LQQAB_DE_IBABA¿Q: DEPTO. DE BROMATOLOGIA Y NUTRICIONEXPERIMENTAL - FACULTAD DE FARMACIA YBIOQUIMICA - UBA.

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE

DOCTORA EN QUIMICA

já 92¿y 2­

Juan y a Dies?m1'taní111a'dá - o

mi familia'del ómia amigos

Agradezco especialmente a la Dra. Mir­

ta E. Valencia su constante apoyo du­rante la realización de esta tesis

y el tiempo dedicado a1 análisis de

los resultados obtenidos, en estos

largos años de paciente trabajo.

AG AD C IENTO

- A la Dra. Maria Elena Sambucetti, que permitió la realizaciónde esta tesis en el ámbito de su cátedra y que estimuló connuevos enfoques la continuacion de la misma.

- A la Dra. Maria Luz Pita Martin, por su constante buena predis­posición a responder las inquietudes nutricionales que surgieron.

- Al Dr. Juan M. Castagnino, por haber aceptado ser el consejerode tesis. '

- A la Bca. Cristina Aguirre, por su colaboración en la determi­nación de la composición centesimal de los productos cárnicos.

- A la Bca. Adriana del Cerro por su inestimable ayuda en elmanejo de la computadora.

- A la Dra. Silvia Friedman, por su colaboración en el tratamien­to estadistico de los datos.

- A las Dras. Nora H. Slobodianik y Alcira Batlle, quienes mefacilitaron el comienzoy la oficialización de esta tesis.

- Al Lic. R. H. Calabrese del INIDEP y al Dr. F. Bordallo de INDAHnos.. por el suministro de las muestras de pescado procesadoscon identificacion de especie.

- A1 Instituto de Tecnologia de Alimentos de Santa Fe, por elsuministro de las muestras de proteina de soja.

- A1 Dr. Julio Roncaroli, por suministrar muestras comerciales deproductos cárneos y materias primas utilizadas en su elaboración.

- A la Ing. Maria Angélica Bianchi, por permitir la elaboraciónde embutidos de pasta fina en la planta piloto de UITEUA(INTI).y su asesoramiento en dicha elaboracion.

- A Molinos Florida, por el suministro de harinas y muestrasprocesadas.

- A la Universidad de Buenos Aires, que mediante el otorgamientode subsidios permitió la adquisición de parte de las drogas ymateriales empleados.

- A los compañeros de Cátedra y a todas las personas que de una uotra manera, contribuyeron a la elaboración de esta tesis.

Resultados parciales de esta tesis, han sido publicados enlos siguientes trabajos:ESTUDIO DE LAS CONDICIONES PARA LA SEPARACION DE PHOTEINASDE PESCADO SOMETIDAS A DISTINTOS TRATAMIENTOS TERMICOS PORELECTROFORESIS EN PLACAS DE GEL DE POLIACHILANIDA CON SDS.Olivera Carrion, M.; Valencia,M.E.; Sambucetti, M.E. ySanahuja, J.C.Anales de Bromatología (España), XXXIII-2, 273-282, 1981.

INFLUENCIA DEL pH Y DE LA CONCENTRACION DE ACRILAHIDA EN LASEPARACION DE PROTEINAS DE PESCADO POR ELECTHOFOHESIS ENPRESENCIA DE SDS.Olivera Carrión, M. y Valencia, M.E.Anales de Bromatología (España), XXXVII-2, SSE-340,1985.

1.1NTRODUCCIDN

1.1

1.2

MATERIAS PRIMAS UTILIZADAS EN LA ELABORACION DEALIMENTOS

PRODUCTOS CARNICOS1.2.1 Propiedades funcionales de las distintas pro­teinas carnicas1.2.2 Propiedades funcionales de las proteinas

extrínsecas agregadas: caseina, gluten, soja,plasma, suero vacuno, hemoglobina, globina.

1.2.3 Problemas originados con la utilizacion deproteínas thrinsecas:- nutricionales;- legales: a) minimode proteinas carnicas;

b) proteinas extrinsecas permiti"das

1.2.4 Identificacion de especiesOTROS PRODUCTOS1.3.1 Utilización de diversas proteinas en otros

productos alimenticios1.3.2 Productos texturizados1.3.3 Alimentos para enfermos celíacos

REVISION DE LOS METODOS PARA LA DETECCION Y/OCUANTIFICACION DE PROTEINAS EN MEZCLAS.1.4.1 MétodosMicroscopicos e histológicos1.4.2 Métodos Inmunológicos1.4.3 Analisis de aminoácidos y péptidos1.4.4 Métodosindirectos

ELECTROFORESIS1.5.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida:

- sistemas continuos y discontinuos;- agentes disociantes y disruptores.Electroforesis en alimentos:- muestras sin tratamiento termico- muestras con tratamiento termicügproceso

de desnaturalización proteica.Aplicaciones particulares:- Identificación de especies de

productos enlatados;pescados;

- Proteinas extrinsecas en productos cárnicos- Identificación de proteinas de cereales: pro­

teinas de trigo; detección de gluten enalimentos para celíacos; otros cereales.

IMPORTANCIA DE LA EXISTENCIA DE METODOS ANALI_TICDS PARA LA IDENTIFICACION Y CUANTIFICACIÜNDE PRDTEINAS EN ALIMENTOS.

1.6

Identificacion de especie en productos cárnicos;

(¡J

N'ÜLH

zi 'T,_ ._.

26

2929

35

2.DBJETIVÜS

3. MATERIALES Y METODOS3.1 DROGAS Y REACTIVÜS3.2 MUESTRAS

3.2.13.2.23.2.33-2-4

3.2.53.2.63.2.7

3.3 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PARA SU ANALISIS ELECTRO“FORETICD3.3.1 Desgrasado3.3.2 Extracción de proteinas: proteinas patrones3.3.3

Especies de pescado; muestras frescas yesterilizadas industrialmente.Soja: variedades de harina yprocesados.Carne vacuna y porcina.Adulteraciún de carneporcina por carne vacuna.Sistemas modelo carnetratamiento termico.Proteinas extrinsecas (diferentes de soja)en productos cárnicos.

productos

vacuna-soja;

Influencia de las sales de curado. Elaboracionde emulsiones con soja en planta piloto.Productos cárnicos comerciales:- muestras sin tratamiento termico—muestras con tratamiento térmicoOtros productos comerciales: productos de soja,no cárnicos; harinas de cereales; +ideos alhuevo; productos lacteos; productos texturizados.

y muestras

3.4 ELECTRDFÜRESIS3.4.13.4.23.4.33.4.4

Determinación de proteinas en la soluciónextractiva

Sistema discontinuo de Laemmli ymodificaciones del mismo.Sistema continuo de Webermodificaciones del mismo.Equipos. Preparacion de los geles: tubos yplacas.Siembray corrida electroforética. Fijac'tinción y destinción. Densitometria

y Üsb or"n y

3.5 CALCULOESTADISTICÜ.

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 INFLUENCIA DEL pH y CONCENTRACION DE ACRILAMIDAEN EL SISTEMA DISCÜNTINUO DE LAEMMLI4.1.14.1.24.1.3

Proteínas patronesProteinas de pescado.Proteinas vegetales y musculares

41

41

43

44

46

4.2 IDEM EN SISTEMA CONTINUO DE WEBER Y OSBORN 58

4.3 EFECTO DEL TRATAMIENTO TERMICO EN PROTEINAS DEPESCADOInfluencia del pHy P.M. de las proteinas. Identifica­ción de especies de pescadoesterilizadas industrial­mente 59

4.4 ESTUDIO DEL METODO DE CUANTIFICACIÜN DE PROTEINASEN EL EXTRACTO 63

4.5 SISTEMAS MODELO CARNE —SOJA4.5.1 Extractabilidad. Influencia del pH óó4.5.2 Elección de bandas características 674.5.3 Cuantificación de proteínas de soja en mezclas

con proteínas carnicas en sistema modelo. 684.6 PROTEINAS DE SOJA

4.6.1 Extractabilidad proteica: influenciade la variedad de harina y procesado. 70

4.6.2 Perfiles electroforéticos: influencia de lavariedad de harina y tipo de procesado. 72

4.6.3 Cuantificación de soja a partir de los densi­togramas:- Error del metodo para una misma muestra- Influencia de 1a variedad de harina y del

procesado en las areas específicas. 724.6.4 Error global del metodo 7?

4.7 PROTEINAS CARNICAS4.7.1 Extractabilidad de proteinas 7B4.7.2 Proteínas de origen vacuno y porcino:

- Identificación del origen 7B- Detección y Cuantificación en mezclas. 79- Determinación de proteinas carnicas totales 80

4.8 INFLUENCIA DE LAS SALES DE CURADO Y DELTRATAMIENTO TERMICO EN EMULSIONES CARNICAS CON SOJA.4.8.1 Extractabilidad4.8.2 Perfiles obtenidos y cuantificación de proteínas 824.8.3 Productos sometidos a esterilización

industrial; utilización de otros disruptores 834.9 PROTEINAS DIFERENTES DE SOJA UTILIZADAS EN

PRODUCTOS CARNICOS.Perfil electroforético de diversas proteinas; P.M.delas principales bandas proteicas. Viabilidad de su de­tección. B4

4.10 PRODUCTOS CARNICOS COMERCIALES.4.10.1 Productos industriales de composición conocida;

detección de proteínas agregadas 87

4.10.2 Productos comerciales de composición desconocida:- productos sin calentamiento SB—productos con calentamiento suave; extracta­

bilidad de proteínas; perfiles electrofore­ticos obtenidos. SS

4.10.3 Cuantificación de soja presente. 904.10.4 Determinación de carne magra y relación de pro­

teinas carne vacuna/carne porcina. 924.10.5 Niveles de sustitución de proteinas carnicas

por proteinas de soja. Valores establecidos porCAAy Codex Alimentarius. 94

4.11 DETECCION DE PROTEINAS DE TRIGO EN MEZCLAS4.11.1 Estudio de la diferenciación de proteinas de ye­

ma, huevo entero, plasma bovino, soja y proteí­nas carnicas y de proteinas de trigo. 100

4.11.2 Detección de huevo y plasma bovino en muestrascomerciales de pastas al huevo. Cumplimiento conel CAA. 102

4.12 IDENTIFICACION DE HARINAS DE CEREALES. 105

4.13 IDENTIFICACION DE PROTEINAS EN PRODUCTOS TEXTURIZADÜSY EXTRUDIDOS 106

4.14 PRODUCTOS COMERCIALES DE SOJA (ND CARNICÜS) 107

4.15 PRODUCTOS LACTEOS:- Quesos: detección de proteina de soja 108- Leche en polvo a base de hidrolizado proteico:

identificación de la proteína utilizada 1Ü94.16 IDENTIFICACION DE MATERIAS PRIMAS 110

4.17 NIVEL DE DETECCION DEL METODO 110

5. CONCLUSIONES 112

ó. REFERENCIAS lló

1. 1UflIEBlBíEBIÜBíJIILLZfiRfiífiILLB.__EI=QEQRBQ LQN. BLIMENIQS"

En las epocas donde la elaboración artesanal de alimentosera predominante, la producción de los mismosse realizaba enpequeña escala y en general se desconoclan las propiedades ocaracteristicas que cada uno de los constituyentes aportaba alproducto final, existiendo poca variación en las materias primasque participaban en la elaboración de cada tipo de alimentos.

En la producción industrial, los principales objetivos bus­cados son a grandes rasgos: a) obtención a nivel masivo de grancantidad de alimentos; b) que sean disponibles en cualquier epocadel año y en cualquier lugar; c) que tengan buenas característi­cas organolépticas.

Esto ha sido posible gracias a una constante investigación ydesarrollo en el area de alimentos, que ha permitido relacionaren forma racional las caracteristicas del producto final y elcomportamiento en la elaboración, con los constituyentesquimicos. Esto a su vez ha permitido la formulación constante denuevos alimentos de buenas caracteristicas sensoriales y a vecestambién nutritivas, asi comotambien incorporar modificaciones enlas elaboraciones tradicionales.

Actualmente, debido al elevado costo de determinadasmaterias primas, su escasez y la continua necesidad de disponercada vez de mayor cantidad de alimentos, son objetivosfundamentales la sustitución de materias primas(fundamentalmenteproteinas) y la utilización de subproductos.

Asi, la utilización de proteínas extrinsecas en reeemplazoparcial de las proteínas intrínsecas del alimento, es cada vezmás frecuente. Ademas, la diversidad de proteínas disponible alpresente, ha dado origen a la sustitución de proteínasextrínsecas habituales por otras de muydiferente origen.

La utilización de materias primas proteicas en la elabora­ción de alimentos, puede deberse a motivos tecnológicos, nutri­cionales o económicos.

Desde el punto de vista tecnológico, el agregado deproteínas extrínsecas se realiza en bajas concentraciones (comoaditivos), y su uso se justi+ica por determinadas propiedadesfuncionales de la misma, que confiere al producto final ciertaspropiedades deseables: aspecto, brillo, comportamientoreolóqico,etc. Asi mismo pueden producir un aumento del rendimiento de laproducción que repercute en el aspecto económico.

Desde el punto de vista nutricional, se pueden agregarproteínas de alto Valor Biológico (V.B.) para complementar pro­teinas de bajo V.B. Por ejemplo la formulación de galletitas,panes, etc se puede realizar con meaclas de cereales y soja dondela soja aporta, ademas de un mayor contenido proteico, altaconcentración de lisina, aminoacidoesencial naturalmente defici­tario en los cereales.

Desde el punto de vista económico, el alto costo de lasproteínas de origen animal, ha originado su reemplaao por proteí­nas vegetales (fundamentalmente soja), o bien subproductos deorigen animal (suero, plasma).

El desarrollo de nuevas técnicas productivas, en algunoscasos no ha sido acompañadopor el desarrollo de tecnicas decontralor que puedan verificar la composición de los productos.Actualmente dado un producto terminado o semielaborado se puededeterminar quimicamenteel porcentaje de proteinas totales. E1V.B. de las mismas se puede determinar por métodos químicos obiológicos, pero cada vez interesa mas determinar también lasdistintas proteínas que lo constituyen; por ejemplo en materiasprimas procesadas donde han desaparecido las caracteristicasmorfológicas (pastas congeladas de pescado y de carnes en gene­ral, harina de pescado, huevo y yema en polvo, harinas de ce­reales y de leguminosas, mezclas de las mismas, etc.), alimentosprocesados y/o formado por mezclas de proteinas (embutidos, ex"trudidos, nuevos tipos de leche fluida y en polvo, pastas, pro­ductos enlatados sometidosa esteriliaación industrial, etc.).

1.2-_EBD.D_U_HD.S__CBBN_LDD_S

1.2. LPRDPIEDADES FUNCIONALES DE _I._f-‘ÉS__[{:B_(HJ_Ï_[_E_.figfigúggfi“;QfL.

Las propiedades funcionales de las proteínas desempeñan unpapel importante en la tecnología de alimentos, tanto en loreferente a los procesos de fabricación comopor su incidencia enlos atributos de calidad del producto final. Entre ellas merecencitarse la capacidad de absorción de agua, de emulsificación degrasas, de gelificación, de formación de espuma, cohesividad,viscosidad, etc. Las propiedades funcionales difieren segun elorigen de la proteína, y hasta ahora no se dispone de una proteí­na que reuna todas las características de funcionalidad que senecesitan en tecnología de alimentos (1).

Las propiedades funcionales de las proteinas miofibrilares(capacidad de retención de agua, de emulsificación de grasas y degelificación), tienen gran importancia en la elaboración de pro­ductos carnicos, fundamentalmente en los llamados de pasta fina.En estos productos, los mas complejos desde el punto de vista desu obtención y estabilidad, las propiedades funcionales juegan unrol preponderante.

, Los embutidos de pasta fina se consideran una emulsión detipo aceite en agua; en realidad son una dispersión donde la fasecontinua esta constituida por agua, encontrandose en solucionsal, fosfatos, azucares y las proteinas sarcoplasmicas y miofi­brilares. La fase dispersa esta constituida por fibras de tejidomuscular y conectivo, proteínas sarcoplasmicas no solubles, gra­nulos de almidón, tejido adiposo y grasa libre 2).

En la emulsión cruda las proteinas miofibrilares disueltasse encuentran recubriendo los glóbulos de grasa; estos productosson normalmente sometidos a una etapa de calentamiento, a bajatemperatura (en general 75 C ), durante la cual las proteinasmiofibrilares coagulan formandouna matriz alrededor de los gló­bulos grasos, dando estabilidad a la emulsión; a 60 DCel cola­qono se contrae y si rodea un glóbulo graso, lo comprime provo­

cando la separación de grasa (2).Esquematicamente, las etapas de elaboración de los productos

de pasta fina y el tipo de interacciones que se producen son:1) picado de la carne a baja velocidad en presencia de sales

para solubilizar las proteínas miofibrilares; la interacciónproteína-agua que se produce, es importante en la capacidad deligar agua.

2) agregado de grasa + hielo a temperatura controlada pararegular la fusión parcial de la grasa. La principal interacciónque se produce es entre la proteina y la grasa, dependiendo de lacapacidad de emulsificación de las proteínas.

3) calentamiento a 60-70 C. Se produce fundamentalmenteinteracción proteína-proteína, siendo importante 1a capacidad degelación de las proteínas

De acuerdo a esto, se desea que las proteinas utilizadastengan .alta solubilidad en soluciones salinas concentradas, demanera que puedan ligar gran cantidad de agua, alta capacidad deemulsificación que favorezca la formación de la emulsión y altacapacidad de gelación de manera que contribuya a la estabilidadde la emulsión luego del calentamiento.

Asi, las propiedades funcionales deben estudiarse tanto enfrio comoen caliente, ya que si una proteina es un buen emulsi­ficante en frio pero no estabiliza la emulsión luego del calenta­miento, provocara pérdidas de agua o grasa y repercutirá negati­vamente en la producción.

Las propiedades funcionales de las distintas proteinascárnicas pueden resumirse:

- miofibrilares: son solubles en soluciones salinas y po­seen alta capacidad de liga de agua, alta capacidad de emulsifi­cación de grasa y alta capacidad de gelación.

- sarcoplásmicas: son solubles en agua pero poco solublesen soluciones salinas; tienen baja capacidad de liga de aguasu importancia en la formación de emulsión es relativa.

- colágeno: tiene alta capacidad de liga de agua alhidrolizarse y de gelación, pero baja capacidad emulsionante;debido a esto, si bien se utiliaa comomaterial de relleno, suproporción esta limitada tecnologicamente por la estabilidad dela emulsión.

1,2,2. PROPIEDfiDES FUNCIONALES DE LAS PROTEINAS EXTRINS_Qfig_UTILIZADAS

De acuerdo a las propiedades funcionales de las proteinasmiofibrilares, estas son indispensables para la producción yestabilidad de la emulsión.

Si se dispusiera de abundante carne y de buena calidad, nosería necesario el agregado de proteínas extrinsecas, material derelleno, sales. Pero a menudo, la calidad de la carne es mediocrey de alto costo, por lo que se agregan sales comolos fosfatosque favorecen la solubilidad de las proteinas y aumentan el poder

de retencion de agua, y proteinas extrinsecas que favorecen laestabilidad de las emulsiones y son en general de costo inferioren base seca a las proteinas miofibrilares (3).

Las proteinas extrinsecas pueden utilizarse en dos concen­traciones diferentes: en baja proporcion a nivel de aditivo, ocomo extensor cuando sustituyen una parte importante de lasproteinas cárnicas. Sin embargo, pocas proteinas pueden ser uti­lizadas comoextensores, ya que deben presentar excelentes pro­piedades de emulsificacion, gelacion y capacidad de retencion deagua, a efectos de contribuir a la estabilidad de la emulsion.

Las proteinas que por sus propiedades funcionales mas seutilizan para la elaboracion de productos de pasta fina, son:

1) Caseinato: posee alto poder emulsificante (utilizándoseen general preemulsificado con grasa y agua)(4), pero bajo podergelificante, por lo que provoca perdida de agua por calentamientocuando se encuentra en alta proporcion (5).

2) Glutén: posee alta capacidad de liga de agua (absorbe 100veces su peso en agua y uno de grasa)(3) y alta capacidad degelación , pero su capacidad emulsificante en muybaja. La harinade trigo y el almidón, utilizados comomaterial de relleno,presentan comportamiento similar (5).

3) Soja: la proteina de soja puede comercializarse comoharina, concentrado o aislado. Si bien las propiedades funcio­nales de los aislados dependen del procesamiento (a), en generalse considera que poseen alta capacidad de liga de agua, altacapacidad de emulsificación y de gelacion. Las harinas no poseentan buenas propiedades funcionales, debido a su menor solubili­dad, baja capacidad de emulsificacion y de que en general, seconsidera que aportan gusto desagradable (3)(5). Sin embargo, eltexturizado de harina de soja (TSP: texturized soy protein), esuna de las materias primas elegidas para la elaboracion de pro­ductos extendidos con soja, debido a su importante contribuciónen la estructura del producto (5)(7).

La incorporacion de soja tambien se puede realizar enproductos de pieza entera, inyectando a traves de agujas lasolución de soja disuelta junto a la salmuera; el rendimiento dela producion aumenta asi considerablemente, habiendose estudiadoincluso la elaboracion de jamones extendidos con proteinas desoja (8).

4) Plasma bovino: es muybuen emulsificante y gelificante(9) (superior a la ovoalbumina)(10). En general se agrega enforma congelada durante la elaboracion en lugar del hielo. Sibien su utilizacion, comenzoen los últimos años, se ha genera­lizado enormemente. En la bibliografía figura la utilizacion enotros paises de aislado de plasma bovino (PPI:protein plasmaisolates), utilizándose tanto a nivel de aditivo comode exten­sor (11)(12).

5) Suero vacuno: posee excelentes propiedades funcionales,similares al plasma bovino; se puede utilizar congelado o enpolvo, aunque 1a utilizacion de suero se encuentra en desuso porencontrarse 1a sangre en general tratada con anticoagulantes.

ó) Hemoglobina (Hb): puede-utilizarse en chacinados cocidospara reforzar el color (13). El agregado de cantidades importan­tes de glóbulos rojos lisados aumenta el color en chacinados conbaja proporcion de carne (3); sin embargo, altas proporciones noson posibles debido a la excesiva intensificación del color ysabor desagradable (14).

7) Blobina: Para evitar los problemas de la incorporación dela Hb en chacinados, se esta trabajando intensamente a nivelinternacional en la búsqueda de un metodo de separacion del grupohemo de la globina. En este proceso debe obtenerse globina debuenas propiedades funcionales siendo rentable industrialmente.Por ser un area en estudio, los resultados no son concluyentes,atribuyendose en general a la globina elevada capacidad de geli­ficacion (15)(ló), de emulsificacion y espumado (17)(18) y deabsorción de agua (19), dependiendo estas propiedades del procesode obtención.

¿.2.3, PROBLEMASDRIGINADOS CDN LA UTILIZACION pg PRÜTEINASEXTRINSECQQ

Los problemas que se originan a partir de la utilizacion deproteinas extrínsecas son de diversa índole:

A) NUTRICIONAL

La utilizacion de proteinas extrlnsecas, en particular enproductos cárnicos se debe a problemas tecnologicos y economicospero no nutricionales, ya que las proteinas miofibrilares poseenalto V.B.

Inicialmente las proteinas miofibrilares eran imprescindi­bles para la elaboracion de los mismos, pero se han ido susti­tuyendo cada vez mas por otras proteinas y esta practica tiendea intensificarse. '

En general, se considera a los embutidos de pasta fina,equivalentes nutricionalmente a la carne bovina o porcina. Sinembargo, este concepto se halla en revisión y a nivel internacio­nal se considera actualmente que se desconoce el verdadero valornutritivo (V.N.) que poseen (20). En el suplemento especialdedicado a este tema del American Journal of Clinical Nutritionde setiembre 1984 (21) se plantea la necesidad de evaluar estosproductos. Tambien se plantea la necesidad de que la Food andDrug Administration, (FDA), organismo que establece las normasque deben cumplir alimentos y drogas en EEUU, establezca paraaislados de proteina de sangre, productos con alto contenido decolágeno, subproductos cárnicos, etc., parametros similares a los

U!

ya establecidos para soja y suero.Si bien pocas proteinas extrinsecas, pueden utilizarse como

extensores de las proteinas cárnicas, puede agregarse más de unaproteina comoaditivo, pudiendo representar un proporcion impor­tante del producto final, por ejemplo agregado de gluten a unproducto que ya tiene colágeno, ambos de muy bajo V.H. Debido aesto, algunos paises comoFrancia autoriaan unicamente el agrega­do de un solo tipo de proteinas (22).

Comoextensor podrian utilizarse soja, plasma y en un futuroglobina. De estas proteinas tanto la soja comoel plasma presen­tan muybuen V.B., pero no asi la globina. Esta proteina tienemuy bajo V.B. por marcada deficiencia de isoleucina y por eldesequilibrio que presenta de la relacion leu/isoleu, respectodel valor recomendado por el patron de FAO85 (23). La relacionde estos dos aminoácidos esenciales, varía segun la fuente bi­bliográfica desde 14 hasta 38,7 (24), mientras que el valorrecomendado por FAOes de 2,3 para lactantes y 1,4 para adultos(23).

Asi 1a posible sustitucion de proteinas cárnicas por globinaconstituye un problema nutricional a tener en cuenta.

B) LEBQL

A nivel legal se plantean varios problemas:

1) MINIMO DE PRDTEINAS CARNICAS

La posibilidad del agregado de proteinas de distintos ori­genes en proporciones variables y el agregado de aditivos (salesy almidon que aumentan la retencion de agua), originó a nivelinternacional la necesidad de asegurar la presencia de un minimode proteinas cárnicas en los productos cárnicos (19)(20).

Tradicionalmente se consideran por proteinas cárnicas, lasproteinas musculares o carne magra. El colágeno extraido de losgeles de cuero de cerdo, el plasma bovino, suero vacuno , Hb oglobina, son todos subproductos cárnicos que no corresponden aproteína muscular.

Surge la necesidad de redefinir que se entiende porproteinas cárnicas, ya que si bien se descartan obviamente lasproteinas vegetales y otras comola caseina, no esta claro comodeben clasificarse las proteinas aportadas por los subproductoscárnicos. El enfoque legal de este problema varia en los distin­tos paises (11).

Alemania exige un minimo de proteinas libre de colágeno yautoriza el agregado de plasma hasta un máximode 10 Z (25).Francia no exige minimo de proteinas, sino un porcentaje máximode colágeno respecto del total de proteinas (colágeno/proteí­nas), siendo este valor variable para cada tipo de producto.Permite el agregado de un solo tipo de materia prima proteica(sangre, plasma, caseinato, suero lácteo), en cantidad máHimade1 Z ' el plasma bovino no debe utilizarse en productos elaborados!únicamente a base de cerdo (22). En EEUUse planteó exigir a

partir de mayode 1985 un minimo de proteinas libres de grasa(PFF: protein fat free) (26), con lo cual solo se asegura unminimo de proteinas totales y no su origen. En un exhaustivoanálisis sobre el tema realizado por los organismos canadienses(19)(20), se propone estudiar la viabilidad de 1a determinacionde las distintas proteinas carnicas presentes (actina y miosina,colageno y elastina) por cuantificación de aminoácidos especifi­cos de cada fraccion, considerando que por el momentola únicasolucion es el control a nivel de elaboracion.

A nivel de investigacion se estudio el contenido de actinacomomedida del contenido de carne por diversos metodos (27)28),no hallándose aún resultados concluyentes.

El Código Alimentario Argentino (CAA) (29) se encuentra muydesactualizado en este aspecto. No exige minimode proteinas,considerando que se controla indirectamente a traves de exigir unmaximo de agua y grasa (art. 319 y 322).

2) PRDTEINAS EXTRINSECAS PERMITIDAS

El CAA contempla actualmente la posibilidad del agregadode harinas y proteina de soja; en el articulo 323 bis (Res. 126del año 1960) se contempla la inclusion en chacinados de "harinasasí comode aislados proteinicos de soja, texturizados o no, comoligantes o extensores, asi como otras sustancias amiláceasalimenticias similares", admitiéndose el agregado de "hasta unmáximo de 3,50 Z en el producto terminado, para harinas o susmezclas con aislados proteinicos y un máximode 2 Z cuando setrate de aislado proteínico solo“.

Para dichos agregados se exige declaración de susporcentajes en la lista de ingredientes consignados en el rótulo.En el mismoarticulo se prohibe expresamente el agregado de sojaen chacinados de pieza entera como lomo de cerdo, jamon, paleta ybondiola.

En el caso del agregado de texturizado de soja se admite"hasta un maximode 10 Z en base seca en el producto terminado,debiendo declararse este agregado en la denominación de dichoproducto (por ejemplo: salchichas con soja, hamburguesas consoja) y su porcentaje en 1a lista de ingredientes en elrotulado".

El CAA en la modificación citada no propone ningunametodologia de detección o cuantificacion por carecerse de ella.

El Codex Alimentarius Internacional (30) recomienda quecuando la proteína de soja se utiliza comoaditivo, el maximoseade 2-3 Z , referido al producto seco y se declare su utilizaciónen la lista de ingredientes. Especifica que no se debera reempla­zar las proteínas principales del alimento por las del aditivo(31); cuando se utiliza como extensor, aconseja un maximode 30 Zde proteina aportada por soja respecto de la proteina total,debiéndose denominar dichos productos "...con soja". En este casoaconseja colocar en el rótulo el métodode evaluación utilizadopor reconocer la inexistencia de una metodologia adecuada para ladetección y cuantificación de proteína de soja en chacinados

recomendando la búsqueda de métodos validos (30).

1.2.4 IDENTIFICACION DE ggPECIE EN PRODUCTOSCARNICÜQ

La elaboracion de chacinados, de acuerdo al articulo 302 delCAA,debe realizarse "sobre la base de carne y/o sangre, víscerasy otros subproductos de cerdo, sola o mezclada con los de otrasespecies animales que hayan sido autorizados para el consumohumano“.

La sustitución de carne de determinado origen por otra dedistinto origen, puede deberse: a) búsqueda de utilización deotras fuentes proteicas en productos que poseen ya aceptación enel mercado (32), comopor ejemplo, elaboración de salchichas tipoViena a base de pescado (33); b) fraudes, por sustitución deespecies de elevado costo, por otras especies de costo inferior(34). Debido a esto se comenzó a contemplar en algunos paises laexigencia de declarar 1a especie/s utilieadas (35).

1¿J¿_DIBQE_EBQDQQIQ&

1.3.1 UTILIZACION QE DIVEHQAS PRUTEINAS EN, ÜTHÜS PRODUCTDS_ALIMENTICIQQ

En el camponutricional, para solucionar el problema de laescasez mundial de proteínas de alto V.B., se creyó durante muchotiempo en el desarrollo de alimentos en los que pudieran emplear­se proteinas alto V.B. hasta el momentono utilizadas para ali­mentación humana(por ej. krill, proteinas unicelulares, pro­teinas vegetales).

Actualmente se considera que la solución se hallará a travésde ingenieria genética, cuando se logre modificar el V.B. deproteinas de uso generalizado, comopor ejemplo proteinas detrigo, sin perdida de sus caracteristicas funcionales (36). Es deesperar que estos objetivos puedan realmente concretarse.

Esto sin embargono invalida los esfuerzos por ampliar lautilización de subproductos o la búsqueda de nuevos alimentos,siendo la incorporación de fuentes no convencionales de proteinasen el campotecnológico, un tema de constante investigación.

En este aspecto, la proteina de soja ocupa un lugar privile­giado por su alto V.H., su bajo costo, y sus propiedades funcio­nales, poseyendopor tanto gran Versatilidad.

Asi, la utilización de soja no se limita al campo de loschacinados, incorporándose también en otros productos carnicoscomorellenos de aves y pechugas entera, en mezclas en pastas conpescados (37), etc.

Comocomplemento nutricional, debido a su alto V.B. se hautilizado soja en la formulación de productos de galletitería enplanes de asistencia alimentaria. Tambiense ha promovido elconsumode leche de soja en paises con problemas nutricionales decarencia proteica. Los productos que se estudian son enormementevariables de acuerdo a las costumbres de las distintas zonas. Asi

se ha estudiado la viabilidad de mezclas datiles—soja (38),.salchichas tipo Viena de pescado y soja, desarrollo de copos depapa, huevo y soja (39), etc.

Desde el punto de vista nutricional, el consumode leche desoja también se produce en el caso particular de intolerancia ala leche vacuna.

Su empleo no se limita sin embargo al de complemento nutri­cional, ya que por ejemplo en EEUU se permite el agregado deharina de soja en pan, tortas, galletitas, para aumentar en todoslos casos la absorción de agua con mejor calidad de la miga,mejor corteza y mejor color. El mayor consumo sin embargo escomosustituto de leche, tanto fluida comoen polvo.

En este aspecto, el aumento del costo de las proteinaslácteas, estimuló los estudios de sustitución de las mismas porproteina de soja en diversos productos lacteos (quesos, yogur,flanes), productos de panaderia, helados, salsas, polvos parapreparar tortas-postres-helados, etc. (40). Tambiense ha estu­diado la formulación de quesos de soja-suero de leche (41), quesotipo muzzarella de soja (42).

En el pais, el CAAno permite actualmente la incorporaciónde proteina de soja en productos lácteos, aunque se tienen refe­rencias de su utilización.

La utilización del plasma bovino, que comovimos presentaexcelentes propiedades funcionales de gelación, emulsificación ycapacidad de retención de agua, tampoco se limita su uso a chaci­nados, utilizándose también comosustituto de proteinas de hueyo(43) en productos de panaderia (44), helados y merengues (19).

En el pais se lo comercializa para ser utilizado en laproducción de fideos a1 huevo, milanesas, productos de panadería,aunque tal práctica no esta permitida por el CAA.

De acuerdo a los estudios que se estan realizando sobre laspropiedades funcionales de 1a globina, parecería que tambien serauna proteina de aplicación versatil. Debidoa su alta capacidadde emulsificación y espumado, se ha estudiado la formulación deemulsiones tipo mayonesaa partir de esta proteina (18).

En todos estos productos, al igual que en los productoscárnicos, 1a detección y/o cuantificación de las proteinaspresentes es un problema a resolver.

12E.2.PRDDUCTDS TEXTURIZADÜS

Los productos texturizados, de gran difusión actual, puedenconsiderarse como nuevos alimentos cuya producción es posiblegracias al desarrollo del proceso de texturización.

En la texturización común, la materia prima entre placas sesomete a presión y temperatura con separación brusca de lasplacas. Cuandoel proceso de texturización se realiza por extru­sión (texturización termoplastica), las materias primas

proteinicas o amilaceas, en general prehumidificadas, se sometena presión, temperatura, fuerzas mecánicas de corte y bruscodescenso de presión a la salida del extrusor con expansión- delmaterial. El esfuerzo de corte que se produce en el tornillo esfundamental para los cambios en la estructura de la materiaprima, considerándose que la desnaturalización de las proteinasglobulares con alineación de las cadenas peptidicas, gelatiniza­ción del almidón y vaporización brusca del agua a la salida delestrusor, son los cambios fisico-quimicos fundamentales que seproducen.

Desde el punto de vista quimico, en el proceso se producenuniones no covalentes (uniones hidrógeno, iónicas e hidrifóbicas)y ruptura de puentes disulfuro, siendo esta reacción fundamentalen la texturización, y descartandose otro tipo de unionespeptídicas (45).

Los productos extrudidos presentan determinada estructurafilamentosa que en el caso de la soja los hace especialmenteaptos para mezclas con carne; debido a esto en los productoscárnicos extendidos con soja,se utilizan basicamente texturiza­dos.

En la elaboración de productos extrudidos, se pueden emplearmezclas de cereales o agregado de otras proteinas, comoleche; enalgunos casos se someten a proceso posterior de fritura, sobretodo en los productos que se utilizan para copetin.

En general, en los productos de origen farinaceo, la identi­ficación del cereal se realiza por metodosmicroscópicos, identi­ficando los granulos de almidón. Sin embargo en los productosextrudidos los granulos de almidón sufren una modificación inten­sa no siendo posible la identificación del cereal que le dióorigen. En el caso que existan mezclas de cereales o agregado deleche o queso, la comprobación de los mismoses dificultosa.

En estos productos, disponer de metodologías capaces deidentificar la materia prima proteica utilizada, no solo tieneinterés desde el punto de vista de control bromatológico, sinotambién para permitir la inscripción de nuevos productos, enmuchos casos dificultada por no poseer las autoridades métodosque permitan corroborar lo declarado por el fabricante.

1.5.3 ALIMENIUS PARA ENFERMDQCELIACUg

La enfermedad celiaca o enteropatia por gluten, consiste enuna enfermedad de origen genético que se manifiesta con distintosgrados de anulación de las vellosidades intestinales provocandoun sindrome generalizado de malabsorción.

La intolerancia permanente al gluten que la caracteriza, sepresenta tanto en adultos comoen nifios, provocando desnutriciónmas o menos acentuada.

El problema es especialmente grave en los lactantes y niñosde corta edad, ya que es necesario el diagnóstico de la enferme­dad en forma temprana, a efectos de evitar desnutrición grave e

incluso muerte.En Argentina hay 6.000 celíacos diagnosticados, estimandose

el número total de los mismos en 30.000, ya que la incidenciaa nivel mundial es de 1/1.000 (46). El número seguira en aumentoa nivel nacional y en el mundopor tratarse de una enfermedadgenetica.

La reaccion se produce frente a las proteínas del glutende Trigo, Avena, Cebada y Centeno, utiliaandose la sigla TACCpara involucrar a estos cuatro cereales.

Aúnse discute cuales son las fracciones proteícas causantesde la intolerancia permanente al gluten que caracteriza laenfermedad (47).

Mediante el empleo de electroforesis en gel de almidón conlactato de aluminio a pH3,2, la gliadina se divide enfracciones: dlfi , 3' ya) -gliadina, cada una de las cualescontiene a su vez varios subcomponentes (47).

Se consideraba que solo la d -gliadina inducía laenfermedad, siendo la A-gliadina la fraccion mayoritariamenteresponsable. Estudios posteriores sugirieron que tambien lasfracciones y la inducen, aunque no la ; recientemente se hasugerido incluso que todas las fracciones del gluten puedeninducir la enfermedad (47).

Existe una gran limitación en los alimentos que laspersonas celíacas pueden adquirir en el comercio, en la medidaque se desconoce en muchos alimentos , la existencia de alguno deestos cereales, no solo comocomponenteprincipal sino tambiencomo aditivo; esto provoca que los enfermos celíacos debanconsumir fundamentalmente alimentos de origen casero.

Con fecha 7/9/85 se modifico al art. 235 del CAApermitiendola inclusión de la sigla "Sin TACC"en los productos que nocontengan los cereales mencionados; esto facilitara enormementela adquisición de alimentos por parte de los enfermos celíacos entodo el país.

Sin embargoes difícil controlar la existencia de gliadinadel grupo de los cereales TACC, estableciéndose en muchos casos,por parte de determinados industriales el compromisofrente a lasorganiaaciones de madres de celíacos, de que sus productos estenlibres de gluten.

Sin embargo, mas alla de la buena voluntad de los producto­res, es necesario el control de las materias primas con que estenelaborados los alimentos, a efectos de detectar presencia de loscereales TACC.

LLBEYJSJQN..DE_LQ&_HETDDD_S_EBBA_La-DEJEQQLQN._.Y¿D__..C.U.ANI IELQAQIQN.-.WMLBELos metodos que se han estudiado para identificacion y

detección de proteínas, varían de acuerdo a las característicasde la muestra. En los casos que la muestra ha sido sometida a

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algun tipo de tratamiento termico, los metodos posibles se redu­cen.

La detección de proteinas vegetales (especialmente soja) enproductos cárnicos ha sido uno de los problemas mas estudiados.

Los métodos ensayados se clasifican principalmente en mi­croscópicos e histológicos, inmunológicos, electroforeticos yvarios (4B)(49)(50).

1.4.1 METODOSMICRÜSCÜPICÜS E HISTÜLÜÜICÜS

Los métodos microscópicos se han aplicado durante muchosaños para detectar la presencia de harina de soja y concentradosde soja en productos cárnicos, debido a las celulas caracteris­ticas en forma de empalizada que presenta la soja; la utilizaciónde luz polarizada permite incluso la detección de proteinastexturizadas en salchicha tipo frankfurt (48).

Tambien se han utilizado metedos microscópicos para laidentificación de 1a especie empleada en pastas de pescadocongelados por el tipo de escamas e de celulas caracteristicaspresentes.

En los métodos histológicos se realiza el examen microscó­pico de pequeñoscortes, sometidos a distintas tinciones parafacilitar la identificación (49). Se recomiendanoficialmente enalgunos paises comoFrancia, para determinar la composición delas materias primas utilizadas: tejidos animales, vegetales,algunos ligantes y aditivos (51). El examenhistometrico de unnúmerosuficiente de cortes, permite el analisis semicuantitativode tejido conjuntivo, órganos y proteinas vegetales. Así porejemplo, la histómetria permite diferenciar y dosar el agregadofraudulento de colágeno (por ejemplo de cuero de cerdos), delcolágeno de constitución.

Sin embargo, cuando los productos han sido sometidos aprocesos de salado, congelación, esterilización, se modifican lostejidos, dificultando la identificación (49).

Las proteínas vegetales ofrecen cada una en principio, unaimagencaracteristica; los productos texturizados, harinas yconcentrados de soja, no ofrecen dificultad de identificación,no asi el aislado, cuyas imagenes son muy variables (4B)(49).Segun Olsman (48), la coloración con azul de toluidina permitediferenciar entre proteina de soja texturizada y carne en mezclascrudas y calentadas, habiendo sido los resultados aceptados portribunales de Inglaterra comoevidencia de que muestras de sal­chichas y hamburguesas eran deficientes en carne; el metodopermitiría tambien la identificación de harina y concentrado,pero no de aislado de soja.

El aislado de colza tambien presentan imagenes caracteris­ticas (49).

La ventaja del métodoes que permite identificar todas lasproteinas vegetales, asi comodetectar cualquier otro tipo deconstituyente no usual (glándulas salivares, órganos, colageno deconstitución o agregado, pelo, etc).

Presenta sin embargograndes desventajas: requiere personalaltamente especializado, con buenos conocimientos de histología ygran experiencia, capaz de identificar no solo las imagenescaracterísticas de las proteínas vegetales, sino todas las demasproteínas que puedan estar presentes (49). Otras desventajas son:la lentitud del metodo (5 dias en total) ademas de lo difi­cultoso, y las modificaciones introducidas por el procesado (51).

1, 4. 2 METODOS¡ngugtpggpg

Los metodos inmunológicos se caracterizan por poseer altaespecificidad y sensibilidad.

Para su aplicacion se debe preparar el antisuero con unafraccion proteíca caracteristica de la especie a identificar, demanera de evitar reacciones cruzadas con otras proteínas.

Para identificar una especie vegetal en un producto carnico,el antisuero debe ser específico para alguna fraccion proteiáa deese vegetal, descartando reacciones cruaadas con otros vegetaleso proteínas animales.

En lo posible, se debería utilizar comoantígeno fraccionesproteicas o antígenos modificadosespecíficos, resistentes a lostratamientos tecnologicos y al calor; esto significa que nosufran reacciones de desnaturalizacion o de tipo Maillard queafecten su capacidad antigénica, modificando consecuentemente surespuesta con el antisuero.

Esto, no siempre es posible. En el caso de la soja se hatrabajado con éxito utilizando 2 antisueros : uno para productoscalentados hasta 70 C y otro para productos calentados a tempera­turas superiores, no siendo posible la utilización indistinta delos antisueros (4B). Estos antisueros presentaron reaccionescruzadas con algunas especias, hidroliaados vegetales y otrasproteínas (harina de arVejas, harina de porotos, etc.). Al probarambos antisueros con distintos productos (harinas concentrados,aislados, extrudidos de harinas y de concentrados, alimentoscárnicos, etc.) se obtuvieron solo reacciones negativas en aque­llos productos que contenían proteínas texturizadas, por lo quese podría pensar que el proceso de temturiaacion modifica laestructura de la proteina, alterando su capacidad antigénica. Porotro lado, en Europa se utilizo a nivel comercial suero anti-sojapreparado para la variedad de soja de mayor difusión en el merca­do, pero posteriormente se encontró que no reaccionaba con otrasvariedades de soja (49).

Otro de los requisitos previos para la aplicación de losmétodos inmunológicos, es la solubilizacion de las proteínasantígenicas, ya que el calor disminuye sensiblemente 1asolubilidad proteica, y en caso que se desee cuantificar, laextracción debe ser constante y cercana al 100 Z .

Se considera que los tratamientos con solubilizantes, comourea o dodesilsulfato de sodio (SDS), actuan destructivamentesobre las estructuras proteícas responsables de la capacidadantigénica, modificando la reactividad con los anticuerpos. Sinembargo esto no siempre sucede: se han ensayado extracciones de

caselna en presencia de urea 7 My 2-mercaptoetanol (ME) conposterior diálisis, comprobandoque la capacidad de reaccion conel anticuerpo se restablecia; lo mismoparece suceder con ex­tracciones de proteina de soja con 2 Z de SDS, removiendo poste—riormente el SDSdel extracto (48).

En el caso de la caseina, Janssen y col. (52) ensayaron conéxito su cuantificación en productos cárnicos esterilizados porelectroinmunodifusion de acuerdo a la tecnica de Laurell: elextracto con solucion 7,7 Murea con 0,2 Z HE. El mismo metodo nopudo ser aplicado a 1a soja por falta de precipitación. En elcaso de la caseina, los resultados obtenidos podrian deberse aque la capacidad antigénica este determinada por 1a secuencia deaminoácidos mas que por la estructura terciaria o a que 1acaseina reconstituya rapidamente su estructura terciaria cuandose diluye el agente desnaturalizante en la electroforesis.

En sintesis, podria decirse que los metodos inmunológicosposeen grandes ventajas: alta especificidad y sensibilidad; sonrelativamente sencillos y no costosas, no requiriendo personalaltamente especializado.

Sin embargo, las desventajas que presentan los hacendificilmente aplicables para analizar alimentos en laboratorio derutina:

—es necesario disponer de los antisueros especificos; enEuropa se han comercializado unicamente sueros antisoja y anti­gluten.

- existe gran diversidad de la capacidad antígenica de lasproteinas segun la variedades.

—es necesario extraer el antígeno del producto; esto suponeque la proteina no ha sufrido trastornos severos que destruyano modifiquen su capacidad antigénica, sea por desnaturalizacion opor reacciones tipo Maillard.

- la solubilidad de las proteinas debe ser constante ycercana al 100 Z si se desea cuantificar.

En la aplicacion de los metodos inmunológicus en alimentos,debe tenerse siempre presente que los resultados negativos noson prueba de ausencia de 1a proteina investigada, siendo validolos positivos cuando se descartan reacciones cruzadas.

Sin embargo, se continúa trabajando en la obtención deantisueros capaces de reaccionar especificamente con ciertosantígenos termoestables (53), con antígenos modificados específi­cos, lo cual hasta el momentoparece ser un camino analíticopromisorio sobre todo para la identificacion de diferentes pro­teinas animales.

El Código Oficial frances de chacinados (51), recomienda laspruebas serologicas por inmunodifusion (tecnica de Üuchterlony)para estudiar el origen de especies animales y proteinas extrañasa la carne. Pero la ausencia de antisueros especificos necesariospara la especie en estudio, origina que se recurra generalmente aotras tecnicas (34).

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1.4.3 ANALISIS DE AMINÜACIDUS Y PEPTIDÜQ

En general se considera que no es posible emplear comocaracteristica la composición en aminoácidos, ya que las proteinasvegetales difieren solo ligeramente entre ellas y poco de lasproteinas animales; tampoco poseen aminoacido especificos.

Sin embargo, Lindqvist y col. han utilizado un programacomputarizado en el que la composición en aminoácidos es compa­rada por medio de regresión múltiple con la composición dedistintas proteinas archivadas en banco de datos; se han obtenidobuenos resultados con sistemas modelos con agregados de proteinasextrafias y distintas cantidades de tejido muscular y conectivo;el metodo pierde exactitud con la utilización de proteinas decomposición similar y con el aumento del número de las fuentesproteicas utilizadas (4B).

La identificación de las proteinas por HPLCes posible enproductos crudos; en los productos calentados, la disminución dela solubilidad proteica no permite la utiliaacion del metodo (48).

Bailey y Hitchcok han estudiado la identificación de pépti­dos especificos luego de digestión enzimática; la muestra seca ydesengrasada se autoclava 3 hs a 120 C y luego se realiza unadigestión con tripsina durante 16 hs. a temperatura ambiente conposterior separación de péptidos por cromatografia en columna. Elmétodo es aplicable a harinas, concentrados y aislados de sojacon un nivel de detección del 5 Z de proteina de soja respectodel total de proteinas (4B).

Noexistiendo metodologia capaz de identi+icar y cuantificartodas las proteinas agregadas, los organismos canadienses,propusieron un nuevo enfoque del problema tratando de determinarla cantidad de proteinas carnicas presentes (20). Para esto sepropuso la cuantificación de 3 aminoácidoscaracterísticos de lasdistintas proteinas carnicas: desmosina (e isodesmosina) para laelastina, S-hidroxilina ( y alo-S-hidroxilina) para el colágeno(descartando la HÜ-prolina por encontrarse en algunos vegetales)y metil-histidina para la actina y miosina.

Tambien se estudió la determinación del contenido de carnepor cuantificación de la actina presente por doble marcaciónisotópica de la mismay posterior separación por electroforesis,digestión con quimotripsina y aislamiento de un péptido caracte­rístico con revelación por autoradiografia. Trabajando en sistemamodelo, se encontró que el proceso de curado disminuye la marca­ción, a pesar de lo cual se obtiene buena correlación con elcontenido de actina (27). Dtro método propuesto para cuantificarla actina es la medición de la metil-histidina como aminoácidocaracterístico de la actina, (separación por HPLCen el hidroli­zado y detección fluorimétrica)(28).

1.4.4. METODOSINDIRECTDS

Estos metodos se basan en la detección de niveles mas omenos fluctuantes de ciertos constituyentes no proteicos, que

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pueden ser especificos de soja o en general de vegetales; asi sehan estudiado polisacaridos, oligosacaridos, aminoácidos libres,fitatos, saponinas, esteroles y metales.

Los componentesquímicos a identificar, idealmente deberíanser químicamente estables durante los procesos y durante elalmacenamiento, independientes de factores comovariedades biolo­gicas, madurez y condiciones de crecimiento, asi comodel tipo deproducto (harina, concentrados, texturiaados, aislados).

Para detectar la presencia de soja se ha estudiado la iden­tificacion de fibra cruda, dosaje de pentosa y pentosanos, peroestos metodos solo son aplicables a harinas y concentrados desoja que contienen apreciables cantidades de hemicelulosa (48).Del mismomodo se ha sugerido la determinacion de estaquiosa porT.L.C. o H.P.L.C. para revelar la presencia de harina de soja ode un texturizado de la misma, aun cuando este y otros oligosa­cáridos se encuentran también en otras leguminosas (4B).

Canavanina [2 amino—4(guanidino-oHy) acido butirico] es unaminoácido presente en todos los preparados de soja, inclusoaislados, pero en niveles muyvariables, al igual que los {ita­tos, por lo que estos indices tienen interes cualitativo mas quecuantitativo.

El contenido de Mg, tambien se ha propuesto como metodoindirecto, ya que el contenido en Mgde la soja es aproximadamen­te 20 veces superior al de la carne, pero solo es aplicable aharinas y concentrados y no a aislados (49). Por otro lado elcontenido de Mgde las especias agregadas puede modificar apre­ciablemente su contenido. Las determinaciones de Mn y fibra,tiene las mismaslimitaciones (48).

Tambiense ha estudiado la identificacion de esteroles vege­tales residuales, pero tienen el inconveniente de que muchosproductos vegetales son desgrasados.

En la medida en que el aislado de soja esta practicamentelibre de componentesnaturales que pudieran servir para su de­tección en productos cárnicos, en EEUUse utilizan métodos demarcado, siendo obligatorio el agregado de 0,1 Z de dióxido deTitanio a estos productos; en otros países comoFrancia y Canadaesta practica no se permite.LLELEDIBQEQBLSIB.

1.5.1 ELECTRDFORESIS EN GEL DE PDLIACRILAMIDA

La electroforesis es un tecnica analítica basada en ladistinta migracion de partículas cargadas (iones o moleculas),sometidas a un campoelectrico.

Asi, la aplicacion de un campoelectrico a una mezcla deproteinas en solucion, a pHdistinto de sus puntos isoelectricosproducirá la migracion proteica a distinta velocidad hacia algunode los electrodos. Sin embargo, si las proteinas estan presentesen toda la solución, la separacion sera mínima; la electroforesisde zona es un modificacion en la cual la mezcla de moleculas aseparar se siembra en una zona o banda lo mas fina posible, acierta distancia de los electrodos, de maneraque durante la

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migración las particulas de distinta movilidad sean gradualmenteseparadas (54).

Sin embargo en medio liquido, la producción de calor provocaefectos de convección, ademas de efectos de difusión de lasproteinas separadas en zonas vecinas.

Para evitar estos problemasse introdujo la estabilizaciónde 1a solución en un soporte fijo, teniendo 1a ventaja de poderfijar las proteinas una vez separadas, facilitando su observacióny evitando la difusión post-electroforesis.

Los soportes principalmente utilizados son: papel, acetatode celulosa y geles de agar, agarosa, almidón, poliacrilamida.Algunos de estos geles contribuyen activamente en 1a separaciónproteica debido al efecto tamiz mas o menos pronunciado quepresentan, dependiendo la separacion de la densidad de carga ydel tamaño de la partícula. Así, la gelificacion del almidón y dela poliacrilamida, puede regularse de manera que los gelespresenten poros del orden del tamaño de las moleculas, contribu­yendo al efecto tamiz molecular; en cambio, el gel de agar yagarosa presentan gran tamaño de poro, produciendo la separaciónfundamentalmente por densidad de carga.

Siendo el almidón un producto natural, presentacontaminantes y no es posible obtener buena reproducibilidad delgel; ademas el rango de variación del tamaño de poro es limitado,formando geles opacos no aptos para densitometria.

La gran difusión del gel de poliacrilamida se debe a que porser un polímero sintetico que se obtiene a partir del monómeroacrilamida, es posible obtener geles de alta reproducibilidadcuando se estandarizan todas las condiciones de gelificación;además es posible regular el tamafio del poro del gel dentro delimites amplios; por otro lado, presenta las ventajas de serquímicamente inerte, estable en un rango amplio de pH, temperatu­ra y fuerza iónica y de formar geles transparentes (55). Poseeademas alta capacidad resolutiva de mezclas proteicas complejas(55). Presenta la desventaja de la fuerte toxicidad de 1a acrila­mida, que es un potente neurotóxico (54).

A grandes rangos, actualmente se puede establecer lassiguientes aplicaciones de los distintos soportes: a) gel dealmidón: se aplica ampliamente para estudiar isoenaimas; b) gelde agarosa: se aplica fundamentalmente para moleculas o complejosde gran P.M., que no son separables por acrilamida, sobretodoacidos nucleicos y nucleoproteinas; tambien se utiliza, al igualque el agar para inmunoelectroforesis; c) gel de poliacrilamida:es el medio elegido en general para la electroforesis de zona.

SISTEMAS CDNTINUÜS Y DISCÜNTINUÜS

En la electroforesis de zona, pueden utilizarse tantosistemas continuos comodiscontinuos (S4).

Los sistemas continuos (CZE: continuous zone electrophore­sis) son aquellos en que se utiliza el mismobuffer, con igual pHy fuerza iónica a lo largo de todo el sistema (gel y buffer decorrida). En los sistemas discontinuos (o multifasicos) (MZEImultiphasic zone electrophoresis) la composición de los buffer

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utiliaados en la corrida y en el gel son distintos; ademasdentrodel gel, existen dos zonas de distinta concentracion de acrilami"da (gel concentrador y de separacion), siendo el buffer de ambosde igual composicion química, pero de distinto pH y fuerza ionica.Un ejemplo de sistema discontinuo, es el sistema de Davis (56),uno de los primeros utilizados y de gran difusion.

Si bien tanto los sistemas continuos como discontinuos,tienen como objetivo la obtención de una mejor resolucion conmayor nitidez de bandas, la ventaja de un sistema sobre otro esaún discutida (55). .

En general, se considera que la principal ventaja de lossistemas discontinuos, es que aún sembrando volúmenes relativa"mente grandes de solucion proteica, se obtiene buena resoluCion ynitide: de bandas debido al efecto concentrador del poro grueso ode concentracion, ya que durante la migracion de las proteínas atraves de este gel se produce la concentracion de las mismas, demanera que penetren al gel de separacion como en una sola linea.

Para lograr esto, de acuerdo a la teoria de Ürnstein (S7),debe existir un ion de alta movilidad en el del, (ion rapido,cloruro), y otro de baja movilidad en el buffer de corrida (iónlento, glicinato) ; el contraion debe ser comúnentre el bufferde los geles y el buffer de corrida (fig. 1).

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Las proteinas deben presentar movilidad electroforeticaintermedia entre el ion rapido y el ion lento al pH del gelconcentrador, de manera de quedar limitadas a una {inlsima zonaal llegar al gel de separacion; una vez que lo cruzan, el aumentode pH del poro de separacion respecto del poro concentrador,provoca un aumento de movilidad del ion lento, +ormandose unlímite o frente movil ion rapido/ion lento, debiendo ser lamovilidad de las proteinas menor a 1a del límite movil y asi seseparan de acuerdo a su carga (y a su tamaño si se utiliza unsoporte con efecto tamiz comola acrilamida).

AGENTES DISDCIANTES Y DISRUPTÜRES

Actualmente, al aplicar electroforesis de zona en sistemascontinuos o discontinuos, se utilizan en numerososcasos agentesdisociantes, que actúan sobre las proteinas separandolas en suspolipeptidos; el agente disociante mas utilizado es eldodecilsulfato de sodio (SDS), detergente anionico.

Shapiro y col.(58), utilizando SDSen sistema contínuo en­contraron una relación lineal entre la distancia recorrida porlos complejos polipeptido-DS en funcion del log. del P.M. Estemetodo empírico, de determinacion del P.M. de los polipeptidos,es rapido y el error es no mayor del 10 Z .

El metodo, con ligeras modificaciones fue utilizado porWeber y Dsborn (59) con+irmando 1a confiabilidad de la tecnica.

El primer sistema discontinuo en presencia de SDSfue utili­zado por Laemmli (60) en proteinas virales. Este sistema es unode los másutilizados por su excelente resolucion, utilizándosetambién para determinar el P.M. de las proteinas. En algunoscasos se presentan anomalías sin explicacion en la determinacióndel P.M. (migracion de algunas proteínas en desacuerdo con suP.M.)(61). '

El SDSse une a los polipeptidos formando complejos en unarelación constante de 1,4 g SDSpor g de polipeptido (alrededorde una molécula de SDSpor cada dos restos de aminoácido)(62).

La naturaleza de estos complejos es aun discutida, Histien­do distintos modelosque tratan de explicar sus caracteristicas(63). Uno de los mas difundidos, admite que los complejos proteí­na-DS presentan forma alargada con un diametro de 1,8 A y unalongitud proporcional al P.M. de la cadena polipeptidica. Losgrupos dodecilo de caracter alifatico se encuentran en el inte­rior del complejo, mientras que los grupos acido sulfónico estanen la superficie (62).

Existe un alto grado de disociación de los radicales -DS alpH de trabajo, y esta carga rodeando las proteínas enmascara ominimiza la carga inicial proteica; debido a esto, los complejospolipeptido-DS tienen esencialmente 1a mismadensidad de carga, ymigran en gel de poliacrilamida de acuerdo a su P.M. admitiendoseque la carga intrínseca de las proteínas es mínima comparada conla gran cantidad de cargas negativas aportadas por el detergenteunido; asi, ademásde realizar el analisis de proteinas se puedeconocer el P.M. de las cadenas polipeptidicas, por comparacióncon proteínas patrones de P.M.

A pesar de que son numerosos los trabajos explicando lasbases teóricas del sistema discontinuo, no sucede lo mismocuandoel SDSesta presente, desconociéndose hasta que punto la teoríadel sistema discontinuo, donde los saltos de movilidad son tanimportantes, sigue teniendo vigencia en presencia de SDS; es asique no existen datos sobre si la movilidad de los complejosproteina-DS continúa siendo intermedia entre el ión rapido ylento al pH del gel concentrador y menor a la movilidad de ambosal pH del gel de separación.

A pesar de esto, la simplicidad, velocidad del metodo y la

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pequeña cantidad de muestra necesaria, hicieron de la electrofo­resis en gel de poliacrilamida con SDS (PAGE-SUS), uno de losmétodos mas utilizados para estudiar proteínas complejas y elP.M. de sus subunidades. Actualmente, tanto los sistemas conti­nuos (CZE), como los discontinuos (MZE)en presencia de SDS, sonprofusamente utilizados.

La urea tambien se utiliza comoagente disociante y actuapor ruptura de uniones hidrógeno (54); se requieren altas concen­traciones de urea (alrededor de 8 M), y la presencia de un tiolpara producir la ruptura de puentes disulfuros.

La urea no afecta la carga intrínseca, separandose lospolipeptidos por tamaño y carga. Ademasde no poder utilicar lossistemas que contienen solo urea y tioles para determinar el P.M.es un agente disociante menos eficaz que el SDS.

Deben utilizarse soluciones frescas de urea 8 My extractosrecientes para evitar la formacion de isocianatos.

En general, la electroforesis con urea 8 My SDSse utilizapara estudiar proteinas de bajo P.M.(ó4).

Al consultar los antecedente bibliograficos, tanto enalimentos comoen el campobiológico en general, se encuentrauna gran diversidad de sistemas y condiciones sin quedarestablecido cuales son las ventajas o limitaciones de cada uno, aefectos de su mejor aplicación.

Cuando se quiere proceder a la separacion de determinadotipo de proteínas, solo excepcionalmente se hace un estudioprevio de las condiciones a utilizar.

Muyrecientemente, algunos investigadores (65)(óó) han enca­rado un estudio comparativo de diferentes sistemas, a efectos deuna necesaria clarificación del tema. Si bien se considerancuatro de los sistemas mas utiliaados (2 continuos y 2 disconti­nuos), en cada sistema solo se estudió una concentración deacrilamida y un solo pH, sin estudiar la influencia de sus varia­ciones.

Por otro lado, si bien se ha estudiado aisladamente en formaexhaustiva la influencia de la concentración de acrilamida, bis­acrilamida (54)(55), SDS(67), etc., poco se ha estudiado sobrelos efectos de la diferencia de pH en sistemas SBS-PAGE.

1.5.2 ELECTROFOREBIS EN ALIMENTOS

No existen dos especies animales o dos variedades vegetalescuyas proceinas sean idénticas; la separacion electroforeticapermite obtener una serie de bandas cuyo número y posición conti­tuye una autentica huella dactilar, que permite la identificaciónde la especie animal o variedad vegetal de la que procede lamuestra (óB)(ó9).

Debido a esto, de todos los metodos ensayados para la de­tección e identificación de proteínas en mezclas y/o alimentosprocesados, la metodologia que se presenta comomas satisfactoriay a la que se dedican mayores esfuerzos es la electroforesis

2'

(4B); también se la considera como uno de los metodologías masracionales (49).

De acuerdo a la bibliografia,.se observa en general una grandiferencia de conocimientos y tecnicas electroforeticasutilizadas en el campobiológico con respecto al existente enanalisis de alimentos. Incluso en nuestro medio existe una escasadifusión de 1a electroforesis en laboratorio bromatológico adiferencia de los laboratorios de analisis biológicos. Esto nopuede ser atribuible a razones económicas, ya que otras tecnicasque requieren equipos muycostosos estan mas difundidas, sino aldesconocimiento de las posibilidades de su aplicación.

A nivel internacional, son numerosas las aplicaciones y lautilización de electroforesis en alimentos. Asi, comose vera masadelante, la FADrecomienda electroforesis comometodo oficialpara identificación de especies de pescado y comometodo confirma­torio para identificación de carnes y de leches de distintosorigenes (69).

Algunos organismos oficiales, comoel Departamento de Agri­cultura de EEUU(USDA), utilizan la electroforesis como pruebalegal frente a adulteraciones en alimentos (55).

Las tecnicas electroforéticas se han aplicado en alimentos,fundamentalmente para identificación de especies animales(68)(b9) y variedades vegetales (sobre todo cereales)(70)(71),diferenciación de los componentesde mezclas proteicas (72)(73),para controlar cambios inducidos por el procesado (74)(75), odeterioros durante el almacenamiento o contaminación (76); estasaplicaciones las hacen especialmente adecuadas para investigar odescartar la adulteración de alimentos (55).

El soporte de mayordifusión actualmente en electroforesisde alimentos es el gel de poliacrilamida, si bien el gel dealmidón se utilizó intensamente en identificación de cereales yel de agarosa se utiliza en aplicaciones de isoelectroenfoque(IEF).

Para 1a investigación de soja en productos cárnicos, Ülsmanen 1969 (4B) utilizó geles de almidón, pero practicamente apartir de 1970 todos los trabajos publicados se realizan con gelde poliacrilamida.

La alta capacidad resolutiva de la electroforesis con SDS,que puede ser aplicada a muestras calentadas, y el bajo costo ysencillez de la técnica, son las razones por las cuales es uno delos sistemas de mayores posibilidades de utilización en elanálisis de alimentos. Posee además la ventaja de sutransparencia para densitometrla (48).

Posee los inconvenientes de no ser una tecnica rapida, yaque debe sumarse a1 tiempo de la corrida electroforetica, el deltratamiento previo de la muestra y tinción y destinción de losgeles; otra desventaja muyimportante es la fuerte toxicidad de1a acrilamida, que es potente neurotóxico.

21

MUESTRAS SIN TRATAMIENTO TERMICO

Las proteinas pueden ser separadas por electroforesis sololuego de haber sido solubilizadas; en muestras sin tratamientotérmico, existen distintos sistemas electroforeticos maso menoscostosos y eficaces: gel de almidón, PAGE,IEF (77).

Cuandouna muestra es calentada, las proteínas sufren proce­sos mas o menos intensos de desnaturalización, disminuyendo par­cial o totalmente su solubilidad en agua o soluciones bufferdiluidas.

Debidoa esto, inicialmente la aplicación de electroforesisen alimentos se limitó a muestras sin tratamiento termico, dondelas proteinas extraídas en solucion acuosa eran utilizadasfundamentalmentepara la identificación de especies (7B)(79).

En especies de pescados utiliaadas para la producción depastas, congelados, liofilizados, filets, dondeel reconocimientopor los caracteres morfológicos es dificil, la aplicación deelectroforesis puede ser de gran utilidad (80)(81).

También se ha aplicado electroforesis para estudiar losposibles cambios proteicos en muestras almacenadas o distintosprocesos de congelamiento, secado, ahumado (82); en muchos casosse ha utilizado comotécnica complementaria de otras.

Otras aplicaciones de electroforesis han sido para estudiardiferencias de proteínas miofibrilares entre distintas tipos depeces. Perïanowska y col.(83), aplicaron SBS-PAGEen el sistemacontínuo de Webery Dsborn, para estudiar las diferencias entrepeces antarticos de sangre con y sin Hb, para observar posiblesdiferencias que expliquen las caracteristicas que les permiten aestos últimos sobrevivir en condiciones extremas de baja tempera­tura. Utilizarón también electroforesis con urea B M paraseparar proteinas de bajo P.M.

Para la detección de leche de una especie en leche de otraespecie, o mezclas de distintas leches en quesos, si bien la FADno recomienda ningún sistema de electroforesis en particular,cita como metodo posible, electroforesis en gel de almidón ypreferentemente en gel de poliacrilamida (69). La detección deeste tipo de adulteración puede ser importante para individuosque presentan reacciones alérgicas frente a leches de determinadoorigen o cuando por razones económicas, se diluyen las de mayorcosto con otras de precio inferior.

Tambien es de interés la detección de soja en mezclas conproductos lacteos. Shiga y col. (B4), compararondistintos meto­dos de detección: analisis de aminoácidos, cromatografía gaseosade los azucares y PAGE, con y sin SDS. Los dos primeros métodosson aplicables en forma cualitativa, PAGEes el mas adecuado parala detección y cuantificación de niveles de soja superiores al 5Z en alimentos mezcla leche-soja.

Sato y col. 1979 (85), formularon helados de crema y quesosconteniendo diferentes porcentajes de soja, realiaando PAGEconurea a pH 9,4, 8,0, 4,0 y 2,3 o bien con SDS a pH 4,0. Los

helados de crema y los quesos que contenían 5 Z de proteína desoja, arrojaron respectivamente valores de 3,0 y 6,2 Z con urea/PAGEy con SDS/PAGEde 2,7 y 5,2 Z . Comparando proteinogramas deleche, queso, yema de huevo, clara de huevo, trigo y soja, con­cluyen que con urea a pH 9,4 es posible distinguir proteinaslácteas de las demasproteinas, pero no es posible distinguirproteinas no lacteas entre si. Con SDS/PAGE,pueden distinguirseproteinas lacteas y soja, asi comodiferenciarlas de trigo yproteinas de huevo.

MUESTRAS CDN TRATAMIENTO TERMICO

Proceso de desnaturalización proteicaLa desnaturalización proteica se define comoun proceso que

involucra cambios conformacionales en la estructura nativa sinalteración de la secuencia aminoacidica, ni ruptura de unionescovalentes.

En la desnaturalización, el desplegamiento molecular haceque las cadenas laterales queden expuestas y se atraiganmutuamente por formación de uniones H, uniones hidrofóbicas ypuentes disulfuro, con la consiguiente formación de agregadosmoleculares de tamaño creciente; al crecer estos agregados,disminuye la solubilidad proteica y hay coagulación (Bb).

Por ser un proceso continuo que involucra cambios en lasestructuras cuaternaria, terciaria y secundaria , es dificil decaracterizar, siendo la modificación extrema el desdoblamientocompleto del péptido con formación de cadenas al azar. Estedesdoblamiente completo solo ocurre bajo condiciones especiales(altas concentraciones de desnaturalizantes fuertes comourea oguanidina) que no son normales en el procesamiento de alimentos.

En el caso de proteinas miofibrilares, Hamm(87) analizólos cambios producidos por calor en las proteinas aisladas.Estudiando los efectos del calentamiento por dispersión ópticarotatoria y actividad ATPasica de la miosina, pudo comprobar quecalentamientos hasta 60 OCproducen desnaturalización con des­pliegue de las d -helices. Calentamientos superiores a 60-70 DC,aumenta los grupos —SHdisponibles debido a la ruptura de o< ­helice, los cuales son enmascarados en 1a proteina nativa. Encalentamientos superiores, entre 70 y 120 C, el numero total de-SH disminuye debido a la formación de -S—S—.

La oxidación de -SH a ns—s— no es observable hasta 70 ° c,pero la coagulación de la actomiosina ocurre ya a 45 C, portanto la coagulación no es debida a la formación de disulfuros,sino a agregados intermoleculares por reacción entre otros grupos(87).

En proteinas aisladas se considera que existen cambios drás­ticos en las proteinas miofibrilares entre 30 y 50 C alcanzandosecasi totalmente a 60 C. Estos cambios se caracterizan por undesenrollamiento de las moleculas proteicas, acompañadapor aso­ciación molecular y resultando en una coagulación y perdida deactividad enzimática; la naturaleza de estas uniones no es cono­

Nu

cida, pero los grupos hidrofóbicos laterales ocupan un importanterol. A temperatura superior a 70 C ocurren cambios mas severostales como oxidación de grupos -SH (B7).

Los cambios en las proteinas miofibrilares no aisladas, sinoen el tejido, son esencialmente los mismospero 1a actividadenzimática dismingye mas lentamente en el tejido que en solución;por arriba de BO C, la perdida de —SHes debida a formación de ­S-S- y a formación de HÜS; este HÜSproviene de —SH(cisteina),no de -s—s—,ni de metioñina (87). ‘

Para estudiar la interacción proteica producida por calor,Peng y col. 1982, investigaron la interacción de la miosina y lafracción 11 S de la soja pos test de solubilidad y turbidez. Enel rango estudiado, 85-100 C, la subunidad 11 S acida de la sojano interactua con las cadenas pesadas de la miosina, mientras quesi lo hace la subunidad 11 S basica.

Si bien es dificil evaluar en un producto calentado el gradode formación de las uniones comprometidas, estas uniones seconsideran parcial o totalmente reyersibles mediante determinadasreactivos: (urea, detergentes, tioles), cuandoel calentamientono es severo. La proteina de soja calentada disminuye su solubi­lidad al ló Z en solución acuosa y en presencia de B Murea y0,1 M MEse disuelve el 76 Z (4B).

Cuando los calentamientos son drásticos, se considera quetambien existe formación de uniones amida responsables de lasreacciones tipo Maillard. Estas uniones se forman aún en ausenciade carbohidratos, siendo la reacción mas probable (intra eintercatenaria) entre el -amino de la lisina con el grupo carbo­xilico del acido aspartico o glutamico. Esto, junto a la rupturade -S-S—origina nuevos péptidos y agregados (86)(87).

Estas uniones se consideran no reversibles mediante la uti­lización de reactivos, lo cual provoca gran disminución de lasolubilidad proteica.

Cuando la muestra ha sido sometida a tratamientos térmicos,los metodoselectroforeticos útiles se limitan, fundamentalmentedebido a la necesidad de utilizar determinadas sustancias para lasolubilización proteica, las cuales deben seguir presentes duran­te la realización de la corrida electroforetica a efectos demantener su solubilización.

Estas sustancias comoSDS, urea, ME, ditiotreitol (DTT),ditioeritritol (DTE),reducen las posibilidades de utilización delos distintos sistemas, ya que no es posible someter a una pro­teina disuelta en presencia de tales disruptores a PAGEunicamen­te o IEF, puesto que no mantienen su carga original. Debido aesto, uno de los sistemas mas utilizados es PAGEcon SDS masalgun tiol.

Hofmann(BB) estudió 1a influencia del calentamiento en laresolución electroforetica de proteinas miofibrilares. Aplicótemperaturas de 100, 110 y 120 oC durante 15 y 30 min., realizan­do la extracción en buffer Tris-bórico pH 8,2, 1 Z SDSy poste­rior electroforesis en poliacrilamida con SDS.

Los resultados indican que a diferencia de la perdida de

movilidad de las proteinas en electroforesis comun, en estesistema no cambia la posición de las bandas con el calentamiento,tanto para la actina comopara la miosina; esto se debe a que elcalentamiento altera el númerode cargas de la proteina, lo cualno influye trabajando en presencia de SDS. Sin embargo informauna disminución de la intensidad de las bandas con el calenta­miento, sobretodo de la miosina; la actina tiene mayor termoesta­bilidad por tener menor P.M., siegdo perfectamente detectable aunen las muestras calentadas a 120 C. Debido a esto la relación deareas actina/miosina aumenta con el aumento de temperatura ytiempo de calentamiento, siendo este aumento drástico por encimade 100 C.

Tambienestudió la influencia de las sales de curado usualesen productos carnicos (NaCl, fosfato, nitrito y nitrato) en latinción de las bandas, encontrando que el NaCl y nitrato producendisminución moderadade la tinción, el nitrito provoca una dismi­nución drástica, mientras que el fosfato produce aumento de latinción. Para dicho investigador, estos resultados prueban quelos iones de las sales estan unidos por lo menosen parte a lasproteinas. El nitrito probablemente reaccione con el grupo deunión con el colorante en la proteina. El fosfato podria aumentarla tinción debido al caracter bivalente del ión.

Al estudiar la influencia del calor y sales en formaconjunta, el efecto depende del P.M. de las proteínas: todas lassales excepto el nitrito acentuan la disminución de la tinción dela miosina y la actina, desapareciendo la primera con calenta­mientos superiores a 100 C y la actina a los 140 C. La mioglo­bina en cambio no varia aun a temperaturas de 140 OC. En el casodel nitrito, decrece la tinción de las bandas en forma aun masacentuada: la tinción de 1a mio lobina decrece aproximadamente el30 Z a 120 C y casi 50 Z a 140 C. Todos los calentamientos serealizaron durante 30 min.

Normalmente aparece un fondo de tinción en las muestrascalentadas, ausente en las crudas. En presencia de sales el fondoes claro, aun con muestras calentadas a 140 C.

Hoffman señala comoposibles causas de la disminución debandas: a) disminución en la solubilidad proteica, pero soloencuentra disminuciones del 1-2 Z en guestras calentadas a 100 OCy 10 Z en muestras calentadas a 120 C; b) perdida de movilidadelectroforética, pero no aparecen proteinas retenidas en el lugarde siembra; c) división de las proteinas para formar fragmentosmenores, pero al realizar la detección proteica por radioactivi­dad, no hay disminución de las bandas proteícas entre muestrasteñida y sin teñir; d) disminución del número de grupos funcio­nales responsables de la unión al colorante.

Esta última seria la causa real de acuerdo a este investiga­dor, ya que el calentamiento segun lo sefialado por Hamm (87),provoca pérdida de grupos basicos por reacción de145-amino de lalisina y otros aminoácidos basicos, con grupos carboxilicos. ElCoomassie Brilliant Blue R-ESO,colorante con 2 residuos de acidosulfónico se une fundamentalmente mediante uniones electrovalen­tes a los grupos basicos de la proteina (también existen uniones

JUI

de carácter hidrofóbico con la proteína o con mas colorante)(89),por lo que podria unirse menor cantidad de colorante a 1aproteina.

La influencia de las sales podría explicarse, ya queprovocan un aumento de la solubilidad del complejo actomiosínico,aumentando su reactividad, por lo que disminuyen aun mas losgrupos basicos disponibles para unirse al colorante.

Wreede y col. 1982 (90), también estudiaron el efecto delcalentamiento en la resolución electroforetica pero en sistemasmodelos de emulsiones de pasta fina. El tratamiento termicocomprendió un rango de 80-130 GC, durante 10-40 min. En PAGE-SUSobtienen una mayor difusión de las bandas proteicas y tinción defondo con calentamientos prolongados. El IEF en gel de poli­acrilamida resuelve en alguna medidaproteínas calentadas, obser­vándose aumentode las fracciones acidas luego de cierto calenta­miento. La separación posterior por PAGE/SOSde estas proteínasproduce tinción difusa sin aparición de bandas.

MMMMMLQBEQIDENTIFICACION DE ESPECIES DE PESCADO

Cuando en un pescado no es posible el reconocimiento por lascaracteristicas morfológicas externas, o se dispone solo de unaporción de muestra, siendo el reconocimiento por caracteristicassensoriales imposible, es necesario un metodoobjetivo de anali­sis, cuando se sospeche sustitución de una especie por otra.

Asi, una de las primeras aplicaciones de la electroforesisen alimentos fue para la identificación de especies de pescado.Cornell en 1953 utilizó el sistema de Tiselius para analizarproteinas musculares de pescados con fines comparativos; Hewill ycol. en 1963 utilizarón electroforesis en papel y Rabay, 1964separó tambien las proteinas solubles en agua, pero en soporte deagar observando diferencias entre músculo blanco y rojo (91).

Mackie en 1969 (92) utilizó PAGEpara identificar especiesde pescados crudos y parcialmente calentados. Su metodologia yconsideraciones son practicamente transcriptos por la FADen losmétodos recomendadospara identificación de especies de pescadosen 1978 (69).

Mackie extrajo músculo blanco con agua destilada para mues­tras crudas, realizando la electroforesis en sistema continuoTris-glicina con ó Z de acrilamida. Según este investigador, elsistema contínuo presenta la ventaja, frente al discontinuo deDavis, de su mayor simplicidad tecnica.

Para muestras calentadas utilizó como solución extractivasolución fresca de urea ó o 10 M, dejando en contacto toda lanoche a temperatura ambiente. El control en este caso, debe seruna muestra calentada a baño de vapor durante 30 min. realizando1a electroforesis a 7,5 Z de acrilamida (con urea b Men el senodel gel, segun FAO).

Los perfiles obtenidos para muestras frescas y calentadas no

son iguales; el metodo es aplicable a muestras calentadas cuyadesnaturalización proteica por calor no impida cierto grado deextracción. Asi, se comprobó que muestras secas o ahumadas eranidentificables, aunque presentan mayor tinción de fondo; muestrasenlatadas o calentadas bajo presión no son identificables porpresentar tinción de fondo muy intensa, sin aparición desuficientes bandas que permitan la identificación (92).

Al analizar 14 especies diferentes, encuentra que puedehaber ligeras variaciones de intensidad en alguna banda, dentrode la misma especie, pero el perfil basico es siemprecaracterístico de 1a especie, no alterandose por almacenamientoocongelado; una vez identificada tentativamente la muestraproblema, la confirmación debe realizarse en la misma corridaelectroforetica para impedir ligeras variaciones en 1a migraciónde bandas (92).

Haen y col en 1969 (93), también trabajaron en gel de poli­acrilamida pero con buffer veronal a pH 8,6 y estudiaron lasdiferencias en la resolucion de proteinas solubles en agua demúsculo blanco. Al analizar muestras de distintas zonas delcuerpo (próximo a cabeza y cola), hallaron diferencias para 2especies de trucha; también encontraron diferencias graduales conla edad.

La merluza esta ampliamente distribuida en el mundo,existiendo varias especies muysimilares solo distinguibles poranalisis estadístico de los datos morfometricos. Sin embargoexisten diferencias importantes en su calidad y cualidades parael procesado, lo cual repercute en su valor comercial.

Mackieen 1977 (94) estudió si la electroforesis de protei­nas solubles en agua, ofrece diferencias en los patrones protei­cos que coincidan con la clasificación morfométrica y permitaindependizarse de estos parametros.

Es sabido que las diferencias en los proteinogramasdisminuyen en la medida que las especies esten relacionadas enforma cercana. Utilizando el sistema empleado en 1969, diferenció5 especies de merluza, basando la identificación en las diferen­cias relativas de tinción de bandas de igual movilidad; asi, conun solo ejemplar es posible establecer a que especie pertenece.

Valencia y col. en 1971 (79), aplicando el sistema discon­tinuo de Davis en tubo, a proteinas solubles en agua, estudiaronla identificación de especies de pescado de uso comercial en elAtlantico Sudoccidental, estableciendo los patrones electrofore­ticos para distintas especies.

Alvarez y Simal, 1974 (BO), aplicaron tambien electroforesisen disco de proteinas solubles en agua para estudiar 1a identifi­cación de variedades de merluza utilizada en la elaboración defilets y porciones congelados. Detectaron el empleo de pescado noprocedente de las costas españolas; también hallaron diferenciasen el proteinograma de merluza joven y adulta. Muestras de merlu­za y congrio son identificables luego del proceso de liofiliza­ción o secado a1 sol. Concluyen que 1a electroforesis les permiteno solo diferenciar especies, sino también variedades dentro deuna misma especie.

Seki, 1976 (95) utilizo PAGE-SOS,realizando la extraccióncon 1 Z SDS, 8 M urea y 1 Z de MEen buffer fosfato pH 7,2(sistema continuo). Trabajo sobre 10 especies de pescado, encon­trando que la cadena pesada de la miosina, actina y tropomiosinapresentan un migracion similar, por lo que no tienen valor iden­tificatorio; el complejo actomiosina libera 3 cadenas livianas deP.M. 14.000-27.000 D. , que junto al resto del proteinograma, sison caracteristicas de la especie. La extraccion es practicamentedel 100 Z, por lo que puede utiliaarse el metodo cuantitativamen­te. Tambienes aplicable a productos calentados como salchichasde pescado.

Mackie (1980)(9ó), estudio diferencias entre bacalao pro­veniente del Atlantico y del Pacifico, ya que ne son diferencia­bles morfologicamente. Separando las proteinas solubles en aguapor PAGE y IEF encontró que por cualquiera de las 2 tecnicasexisten diferencias suficientes para ser consideradas 2 especieso subespecies de bacalo, ya que las diferencias superan lasesperables para distintas poblaciones de una mismaespecie.

Mackie plantea que pueden existir diferencias menores entreespecies, sobre todo cuando estan relacionadas en forma Cercana,pero que dentro de la mismaespecie el patrón proteico no semodifica por sexo, edad o estado fisiológico; en caso de especiescon patrones semejantes, el IEF es mas sensible para detectar lasdiferencias, sea del total de proteínas o por enzimas especificascomolactato deshidrogenasa.

EDLUCIQÉLELL-ATQPE

En la medida que en los procesos de calentamientos drásti­cos, se forman uniones amida que se consideran irreversibles,Mackieestudió-la aplicabilidad de la electroforesis en la iden­tificacion de especies de pescado enlatados, luego del trata­miento de la muestra con CNHr(97). De esta manera hidrolizaselectivamente en medio acido las uniones peptídicas en queinterviene la metionina, obteniendo polipéptidos extraibles enurea 10 My realizando la electroforesis posterior en poliacrila­mida conteniendo urea ó M.

Si bien el metodo es largo (hidrolisis 24 hs. evaporacióndel acido en rotavapor, dialisis 24 hs., extraccion de polipép­tidos en urea 10 Muna noche y posterior electroforesis), seobtienen bandas caracteristicas para cada especies, ya que estandeterminadas por 1a estructura primaria establecida geneticamen­te. Según éste investigador, se obtiene una coloración de fondomuy intensa pero que no interfiere en la interpretacion de losresultados.

IDENTIFLQQCIQN_QE_ESPECIE EN PRODUCTOS CARNICÜS

Para la identificación de carnes cuando el examen veterina­rio no es posible y es necesario la confirmacion por analisis delaboratorio, la FADen 1978 recomienda entre otros, (analisis degrasas por CGLo UV), la electroforesis realizada en el mismo

sistema que para muestras de pescados calentados (69).Coduri y col. en 1972 (97), trabajaron con proteinas sarco­

plasmicas en la identificacion de carne fresca de distintasespecies. Utilizaron PAGEen placas en sistema discontinuo Tris­glicina, Tris-HCl en 7 Z acrilamida con 4 Murea, realizando laextraccion con buffer Tris-HCl a pH 6,7. Übtuvieron resultadossatisfactorios aún para la detección de mezclas de carne vacunacon carne de cerdo y con carne de caballo.

Lawrie en 1977 (98), estudió la identificacion de especiesen carnes frescas y alimentos procesados, utilizando gel dealmidón para proteinas solubles en agua y PAGE para proteinasmiofibrilares y sarcoplásmicas.

Hoffmannen 1978 (99), trabajo en la identificacion no solode carne de distintas especies, sino tambien de organos de ganadovacuno y porcino en PAGE-SDS(corazon, riñon, hígado, pulmones ymúsculo), encontrando que son diferenciables e identificables losdistintos tejidos en productos cárnicos.

Babiker y col (100), estudiaron la diferencia entre protei­nogramas de carne de caballo y de carne de vaca en muestrascalentadas hasta 120 C, obteniendo buenos resultados, utilizandogel de poliacrilamida para diferenciar muestras puras, sin mez­clas.

Sin embargo, la identificacion de especies por electrofore­sis, sigue siendo un tema de interes e investigacion, debidofundamentalmente a 1a obligatoriedad de declarar la especie em­pleada en los productos alimenticios en algunos paises. Asi,Schulze en 1984 (35), analizó los avances logrados por los dis­tintos métodos: osteologia, histologia, examende pelos, analisisde grasas, PAGE,IEF, serologia, incluyendo antisueros preparadosa partir de los productos calentados. A1 analizar productoscomerciales, encuentran que la especie hallada no siempre coin­cide con la declarada, no cumpliendo con las leyes vigentes.

PRÜIEINAS EXIEINSEQQS EN PRODUCTÜS CAHNIQQfi

Dlsman en 1969 (48), es de los primeros investigadores quetrabaja en productos cárnicos. Realiza la extraccion con bufferconteniendo urea-MEy la electroforesis utilizando como soportegel de almidón. Según este investigador, en este sistema fueposible detectar soja al nivel de 0,5 Z en muestras calentadas a115 C.

Flaherty en 1975 (101) es de los primeros investigadoresque aplican IEF para aislados de soja-carne, detectando nivelesde aislado del 1-5 Z en forma semicuantitativa y en cantidadessuperiores al 5 Z en forma cuantitativa. El método es aplicablesolo a hamburguesas o congelados, pero no a muestras con algunproceso de calentamiento.

A partir de 1970, practicamente se trabaja solo en gel depoliacrilamida utilizando distintos buffers extractivos.Thorson ycol. (1969) (102) trabajaron en la identificacion de caseina y

soja en productos cárnicos, utilisando extractos con urea 8 M yaplicando PAGE.Übtuvieron buenos resultados para detectar casei­na, pero la soja era enmascarada por las numerosas bandas de lacarne; proponen el metodo para detectar caseina y soja en aditi­vos alimentarios.

Freimuth y col. (1970)(103), estudiaron 1a detección declara de huevo en salchichas. Se basan en la extracción de lasproteinas que no son coagulables por calor y son solubles enagua. Realizan la electroforesis en PAGEcon buffer acetato pH4,8 conteniendo 5 Murea. Para la detección de soja (104) laextracción se realizó con buffer lactato conteniendo urea 5 M,realizando la electroforeis a pH3,1. Trabajando en placas conmuestras calentadas 15 min. a 90-95 C obtuvieron resultadossatisfactorios en formacuantitativa.

Parsons y Lawrie (105), trataron la muestra con HCl 0,1 Nprevio desgrasado por acetona y luego extracción del residuocalentado durante una hora a 100 C con urea 10 M y 2 Z de ME.Trabajando en placas de poliacrilamida, detectan soja aún enproductos calentados a 100 C 45 min., haciendo el metodo cuanti­tativo con un densitómetro laser. En muestras esterilizadas co­mercialmente la soja es detectable con disminución de la sensibi­lidad.

Tateo (106), confirmó los resultados de Parsons y Lawrie,trabajando con mezclas de carne con 10, 15 y 25 Z de soja,calentando durante 45 min. a 100 C o 25 min. a 125 C. Trabajandoen las mismas condiciones de Parsons y Lawrie, obtuvo respuestalineal para los diferentes porcentajes de soja en carne, en losproductos calentados a temperatura igual o inferiores a 100 C.Para los productos calentados a 125 C, solo es posible la de­tección no cuantitativa.

Hofmanny Penny (1973) (107), utilizaron poliacrilamida 8 Zcon SDS; como disruptor emplearon DTTpor considerarlo mas efec­tivo que el ME. La extracción de las muestras se realiaó conbuffer Tris pH 8,2 a 100 C ÉO min. con 1 Z de SDS y DTT. Ubtienenresultados satisfactorios pudiendocuantificar, aún en muestrascalentadas, cuando la muestra y patrones se corren simulta­neamente en la misma placa. En muestras con calentamientos supe­riores a 100 C es posible solo la detección.

Posteriormente Hofmann(108), utilizando el mismosistema,identificó mesclas de carne, soja, clara de huevo y leche.

Frouin y col. (1973) (109) trabajaron en la detección decaseinato y soja con el sistema de Hofmanny Penny; estudiaronpaté enlatado obteniendo que tanto la soja comola caseina sondetectables a nivel de 0,5 Z; en el caso de soja tthurizada, elnivel de detección es del 5 Z comoresultado de los cambios en laproteinas durante el proceso de extrusión.

Lee y col. en 1975 (110), tambien trabajaron en poliacrila­mida en tubos y sistema discontinuo: la muestra desgrasada variasveces con acetona, era extraída en buffer Tris-HCl a pH 6,8 con3 Z SDS y 1 Z ME, durante 15 min. a 100 C. Übtienen extractabi­lidad proteica promedio del 96 Z, tanto para muestras crudas comocalentadas y coeficientesde variacion en la extractabilidad del

1,5 Z . Para la separacion utilizaron el sistema de Laemmli,empleando para la cuantificación la relacion de areas de dospicos, el correspondiente a la actina para carne y otro parasoja. Al determinar 1a composicion de 12 muestras soja-carnepreparadas en laboratorio, obtuvieron una variación del 1,6 Z delcontenido real.

Benincasa y col. en 1978 (111), aplicaron el metodo de Leesin modificaciones a mezclas carne vacuna/soja con o sin agregadode leche en polvo, suero de leche, caseinato, clara de huevo,yema de huevo, harina de habas y pan. En este trabajo fue posiblediferenciar soja de las demasfuentes proteicas consideradas,siendo detectable en niveles superiores al 5 Z en mezclas concarne u otras proteínas.

Ring y col. en 1982 (112), también trabajaron en sistemadiscontinuo estudiando la detección de hidrolizados lacteos,clara de huevo y soja. En sistemas modelo, calentando a 70 °C,fueron detectables al nivel de 0,5 Z , las tres proteinas. Concalentamientos de 120 DCno pudieron detectar lactoalbümina nitrigo.

Los métodos citados son basicamente los mas relevantes, peroel tema ha sido estudiado por otros investigadores en distintascondiciones que corroboran en lineas generales los resultadosantes mencionados.

Homayounfar (1975) (11s), trabajo sobre muestra desgrasadadescartando la parte soluble en TCA. El insoluble era extraidocon una mezcla (fenol-ac. acetico- agua) y urea 5 a 10 M; laelectroforesis fue realizada en 7,5 Z de acrilamida. lrabajandocon muestras calentadas 24 min. a 127 C, pudo detectar la soja.

Buyy col. (1977) (114), analizaron las posibles interferen­cias que podrían existir para la detección de soja en mezclascárnicas; utilizaron PAGErealizando la extraccion con urea 8 My1 Z MEa pH 8,6 en buffer Tris-glicina. finalizaron hamburguesascon 20 Z de soja, crudas y calentadas 40 min. a 110 C utilizandocomo referencia en este ultimo caso un producto autoclavado.Encuentran que las mayores interferencias son producidas porcebollas y champiñones, cuando se encuentran en porcentajes supe­riores al 5 y 10 Z respectivamente en productos crudos y 3 y 4 Zpara autoclavados. El colágeno, sangre, plasma y huevos, nointerfieren cuandose utilizan en porcentajes usuales.

Lacourt y col. (115), trabajaron en mezclas de carne vacunay cerdo con 5,15,30 y 50 Z de proteínas extrañas (soja, girasol yhabas). Luego de autoclavar a 118°C 20 min. realizaron la ex­tracción con SDS a pH 8,5, calentando 20 min a 100°C. La elec­troforesis se realizo en poliacrilamida con 0,1 Z SDSy 7 Murea,utilizando comoidentificatorio de soja, la doble banda de albummina (Rf 0,73) y la banda de la actina (Rf 0,43) para la carne.Realizando los calculos por medio de la relacion de areas (picoidentificatorio vegetal/pico actina), obtuvieron una relacioncercana a la linealidad solo para soja. Cuandoel porcentaje desoja era de 5 Z la detección es dificil, siendo necesario un

trabajo meticuloso para obtener reproducibilidad.Persson y Appelquist en 1977 (116), trabajaron en placas de

PAGE/SOSy posterior densitometria. finalizaron en forma cuantita­tiva muestras comerciales de hamburguesas, obteniendo porcentajesde soja acorde con lo declarado: 0,8 vs 1 Z, 2,9 vs 3 Z, 5,6 vs 4y 9,8 vs 8 Z . Al analizar en forma cuantitativa otras proteinas(leche en polvo, concentrado de suero de leche, sangre, clara dehuevo en polvo), los resultados que obtienen son erróneos.

Hashieume y col. en 1978 (117), aplicando PAGE/SUSencuen­tran que es posible la detección de proteina de soja, pero no detrigo por la gran superposición de bandas que existen. En otrotrabajo, extrajeron la proteina con urea 10 My 2 Z ME, aplicandourea/PAGE a pH 3,5 con B M urea en el gel (118). En dichascondiciones, pueden distinguir soja y trigo simultaneamente enproductos cárnicos.

Sin embargo, Saio y col. en 1986 (119), utilizando tambienPAGE/urea,encontraron que si bien la soja es detectable a partirde 0,5 Z y el trigo a partir de 1 Z , no es lineal la relacion deareas con la cantidad sembrada, ya que algunos picos de la carney de huevo interfieren.

Chikuni y col. en 1979 (120), estudiaron electroforesisbidimensional para la detección de soja en salchichas utilizandogel en tubos con 8 Murea en la primera dimension y placas conSDSen la segunda. Estudiaron harina, aislado y texturiaados desoja, hallando que 1a harina de soja a1 nivel del 0,5 Z (aproxi­madamente2 Z en base seca) es detectable en forma cuantitativa.

Amstrong y col. en 1982 (121), estudiaron la cuantificaciónde soja en sistemas modelos de salchichas de Viena y jamon,calentando los productos a una temperatdra interna de 70 C.Realizaron electroforesis a ó Z de acrilamida en sistema continuocon urea 8 My SDS. No encontraron interferencias por presenciade otras proteinas vegetales o por la utilizacion de carne dife­rente a la vacuna y porcina. Pueden detectar 0,5 Z de aislado desoja en el producto terminado.

A efectos de proponer un metodo oficial de analisis convalor legal, se realizo en Noruega en 1977 (122), un estudiocolaborativo entre 11 laboratorios para detectar caseina y aisla­do de soja en productos cárnicos. Se utilizo PAGEen tubo o placae inmunodifusion doble en 10 productos carnicos diferentes (sal­chichas crudas y fermentadas, ahumadas, pasta de higado, carne,embutidos) conteniendo cantidades de caselna y soja conocidas yen bajas proporciones: Ow2Z .

Para la caseina, la electroforesis dio resultados correctosen un 83 Z de los casos, 11 Z falsos negativos y ó Z falsospositivos. La inmunodifusion dio B4 Z , 8 Z y 8 Z , repectiva­mente.

Para soja, la electroforesis dio 73 Z de resultados correc­tos, 22 Z falsos negativos, y 4 Z falsos positivos. La inmunodi­fusion dió 81 Z , 19,5 y O Z respectivamente.

Para reducir el númerode falsos positivos en la detecciónde la caseina, recomiendan 1a aplicacion de ambos metodos, mien­

u IJ

tras que para el caso de la soja, la inmunodifusión, es suficien­te. Descartan la posibilidad de analizar productos esterilizadosutilizando inmunodifusión.

Brehmer en 1983 (123), investigó la presencia de soja enproductos cárnicos comerciales, por medio de inmunodifusión doblede Duchterlony y PAGE.De 74 muestras con soja analizadas, encon­tró buena correlación en los resultados por ambosmetodos, excep­to en 3 muestras. Interpreta los resultados obtenidos comoevi­dencia del aumentode la utilización de soja en productos carni­cos.

IDENTIFICACION DE PRDTEINAS DE CEREALES

Los precios de los granos varían a menudode acuerdo a 1avariedad. Cuandosus caracteristicas morfológicas son similares,la electroforesis de las gliadinas ha sido adoptado por algunospaises comometodologia de identificación (124).

Las proteinas de los cereales se dividen de acuerdo a susolubilidad en : albúminas (solubles en agua), globulinas(solubles en solución salinas diluidas), prolaminas (solubles enmezclas alcohol-agua); glutelinas (solubles en medio acido o basediluido) y residuo. Las prolaminas se denominangliadinas en elcaso del trigo y hordeinas en el caso de la cebada.

PRDTEINfig DE Ifilfig

Ya en 1959, para separar las proteinas de trigo, se utilizóelectroforesis de frente movil. Luego, el gel de almidón conbuffer lactato de aluminio a pHacido, fue profusamente utilizadopara estudiar la fracción de gliadina del trigo, obteniéndose 4fracciones:zK,/3, K yéDgliadina con movilidad decreciente. Laaplicación posterior de electroforesis bidimensional (IEF y PAGE­SDS) reveló que la fracción gliadina incluye en realidad entre40 y 50 proteinas diferentes (47).

Si bien durante muchotiempo se siguió utilizando comosoporte el gel de almidón y aún hoy se lo utiliza en algunamedida, actualmente en la gran mayoría de los casos se utilizagel de poliacrilamida, tanto en medio acido (125) como basico(126), proponiendose en algunos casos nuevas denominaciones paralas distintas fracciones que se obtienen en este medio (127). Alcompararse electroforesis de gliadinas en gel de almidón y en gelde poliacrilamida para la identificación de trigo, Kramarik ycol.(128) encontraron que ambossistemas permiten la diferencia­ción, siendo de mayorutilidad el analisis conjunto del perfilque la movilidad relativa de cada banda.

Sherry y col. en 1978 (129), al trabajar sobre gliadina deltrigo, encontraron que SDS-PAGEpermite distinguir variedades detrigo no diferenciables en gel de almidón, siendo las variacionesprincipales en las fracciones de alto P.M. de la gliadina. Tkac­huk y col. (130) estudiaron también electroforesis de gliadinasde trigo para su clasificación, pero trabajando con buffer lacta­to. Encuentran que si bien el metodo permite diferenciar la

M ¡.4

mayoria de las variedades, algunas no pueden ser diferenciables.Jones y col. (131), trabajaron sobre BBvariedades de distintasregiones de EEUUobteniendo similares resultados.

Hussein y Stegemann en 1978 (126), separaron de acuerdo a lasolubilidad, las fracciones de distintas variedades de trigooriginarios de Egipto y Alemania. A cada fraccion le aplicaronPAGE, SDS-PAGE, gradiente de acrilamida y bidimensional (IEF­PAGE),estudiando las bandas obtenidas de acuerdo al P.M. Conclu­yeron que SOS-PAGEen buffer Tris borato a pH 8,9 del total deproteinas es un metodorapido para diferenciar variedades.

Sin embargo el tema no se considera agotado, ya que secontinúa trabajando en 1a identificacion de trigo por electrofo­resis en PAGE evaluando resultados y mejorando tecnicas(127)(130)(132)(133)(134).

El perfil de gliadina de trigo a traves de electroforesis,también se ha relacionado con el comportamiento reologico delgluten (149), encontrándose buena correlación entre determinadoperfil de la gliadina y la fuerza del gluten. Tambien se haestablecido relacion entre las fracciones de alto P.M. separadaspor SDS-PABEy diferencias en la calidad panadera (157)

DETECCIDN DE GLUTEN EN ALIMENIQQ_E_&ELQELLQQQQ

En los últimos años, se han desarrollado en el pais, conbuenos resultados, tecnicas inmunológicas para la detección degliadina. Sin embargo el estudio de tecnicas que puedan indepen­dizarse de la adquisición de antisueros especificos y de suconservación, serïa de gran utilidad a efectos de su aplicacionaún en laboratorios alejados.

Asi surge la necesidad de estudiar la posibilidad de detec­tar cereales TACCpor medio de una tecnica de alto poder resolu­tivo de proteinas y relativamente sencilla y difundida, comoesla electroforesis en gel de pocliacrilamida con SDS. Esta técnicapodria aplicarse tanto a nivel de los organismos de contralorcomo a nivel industrial para controlar las materias primas conque son elaborados los productos "Sin TACC“.

QIEQS CEREALES

El estudio de identificación por electroforesis se harealizado tambien en otros cereales distintos del trigo.

Ellis en 1969 (151), estudio la posibilidad de aplicar PAGEcomo metodo de rutina en la identificacion de trigo, cebada yavena. Conextractos acuosos de las proteinas, la diferenciaciónes posible con las bandas de menor movilidad.

Shewry y col. (152), estudiaron distintas variedades decebada a traves de distintos perfiles de las hordeinas, trabajan­do en SDS-PAGEpH 8,9. Las 88 variedades estudiadas fueron divi-_didas de acuerdo al perfil electroforetico en 29 grupos. Esposible la obtención de subgrupos por electroforesis bidimensio­nal. Los investigadores concluyen que es posible 1a identifica­ción por esta técnica, siendo un metodoaplicable para la identi­

ficacion comercial y una ayuda para confirmar diferencias entrevariedades cercanas.

Marchylo y col. en 1980 (153 y 154), trabajaron tambiénsobre cebada. Realizaron extraccion directa de las hordeinas ensolución alcohólica y posterior PAGEen medio acido. Encontraronque los proteinogramas son independientes de la zona de cultivo,año de produccion y contenido de proteinas. De 68 cultivaresanalizados, pueden diferenciar en la mayoria de los casos lacebada para malta de la cebada forrajera. Similares resultadosobtuvieron otros investigadores (155) trabajando en medio acido,o con SOS-PAGE (156). Smith (157) también ha establecido 1aposible relacion entre el perfil de hordeínas y 1a calidad de lacebada cervecera.

Taylor y col. en 1984 (158), trabajaron sobre las prolaminasde sorgo. Luegode estudiar 3 sistemas electroforeticos diferen­tes, eligieron urea-PAGEy comprobaron que al igual que en otroscereales, el patron electroforetico no se afecta por condicionesde cultivo, o largos tiempos de estacionamiento.

En el caso del maiz, al aplicar SbsnPHBEa distintas varie­dades de opaco-2 (159), no se hallaron diferencias en el perfilelectroforetico.

En el caso del arroz, Husamay col. (160), encontraron quevariedades de arroz que presentaron el mismoperfil electrofore­tico en SDS-PAGE,pero eran diferenciables por la distinta pro­porcion en que se encuentran algunas bandas proteicas.

En el caso de la avena, Lookhart, (161) trabajando sobre 23variedades pudo diferenciar 7, siendo el resto diferenciables porHPLC.

MQÁÏBÁQJALE.-.L.fi._..EÁ.I.&IENQI.B_..QE_ME IQ).D_SA,,_GN_6_L_LI_I_QQ..S.._.FÏ.ABB__L._6__LQENILELQQQIQN_1_CUQNTIFICACIDN QE,PROTEINAS EN ALIf'1_!::__!\¿JÏ_l;l_íL

Es necesario disponer de metodologías capaces de detectarlas materias primas proteicas y su posible cuantificación enalimentos procesados, a efectos de contemplar los siguientesaspectos:

- 1) legal: reglamentar a traves de las leyes vigentes (CAAy CodexAlimentarius), la utilizacion de nuevas materias primasproteicas en la elaboracion de alimentos.

- 2) bromatologico: - a nivel estatal, permitira controlarla composicionproteica en los distintos alimentos y su cuantif­cación.

- a nivel industrial, permitira laidentificacion de materias primas proteícas puras o en mezclas,por ejemplo, huevo en polvo, yemaen polvo, soja, caseína, pastasde pescado, de carne, harinas de cereales, etc.

- 3) nutricional: se podran evaluar proteinas de alto V.B.en aquellos alimentos que se consideren aportadores de dichasproteinas; maximopermitido de proteínas extrinsecas de bajo V.B.en alimentos que tradicionalmente se consideren aportadores deproteinas de alto V.E.; ausencia de gluten en productos paraenfermoscelíacos, etc..

4) economico: los alimentos que esten elaborados con “ Hten­sores" de proteínas comola soja, sin desmedro de su calidadnutricional o bromatologica, deberan tener diferente precio fren­te a los fabricados sólo con proteínas animales de alto costo.

5) higiénico-sanitario: en la medidaque se detecten otrasproteinas, se podran exigir nuevos parametros higiénico-sanita­rios para esos alimentos si su concentracion asi lo justifica.

ó) lealtad al consumidor: la detección permitira 1a exigen­cia real de la inclusion de dichas proteinas en la lista deingredientes, con lo que el consumidor podra ejercer su derecho aconocer y elegir lo que realmente consume.

7) impositivo: los recargos impositivos de los alimentosdeberan responder a su composiciOHreal.

Surge así la necesidad de disponer de una metodologia anali­tica que pueda ser utilizada en forma cuali y cuantitativa, en elanalisis de mezclas proteícas, para su aplicacion en el campobromatologico.

Dicha metodología debe cumplir ademas: a) que sea aplicablea muestras calentadas; b) que no sea de elevado costo, tanto porel equipo necesario o por los reactivos empleados; c) que norequiera reactivos muyespecíficos difíciles de obtener. Estasconsideraciones descartarían los metodos inmunológicos, isoelec­troenfoque, cromatografía líquida de alta presion o cromatografíagas-líquido.

A pesar de que la electroforesis es una tecnicarelativamente larga (3-4 dias en total), que requiere un trabajocuidadoso, se continúa trabajando en su simplificación y en laobtención de equipos que permitan acortar el tiempor de duracionde la corrida y de la tinción-destincion.

Si bien las tecnicas electroforeticas se utilizan en el paísen investigacion en forma corriente, se puede decir que su apli­cacion generalizada se limita al campode analisis clínicos. Enparticular en el analisis de alimentos, su aplicacion es escasa onula, tanto a nivel industrial comoen laboratorios estatales decontralor.

Esto no puede ser atribuible a razones economicas, sino aldesconocimiento de las posibilidades de su aplicacion, ya queotras tecnicas que requieren equipos muycostosos como por ej.HPLCo CGLestan más difundidas.

De acuerdo a la bibliografía, la electroforesis es una delas metodologías elegidas para la identificacion y cuantificaciónde proteínas en alimentos. Sin embargo, este tema de investiga­cion lejos de encontrarse agotado, es motivo de continuos estu­dios, apreciandose 1a diversidad de areas bromatologicas en quese aplican diferentes sistemas electroforeticos.

OBJETIVOS

La tendencia nacional e internacional a la producciónindustrial de alimentos elaborados o semielaborados, en cuyafabricación se utilizan mezclas de proteinas o proteinasextrinsecas, exige metodologías capaces de detectar y en loposible cuantificar las materias primas proteicas de los mismos.

La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, es unatécnica de gran poder resolutivo, poco costosa y sencilla, demanera tal que su utilización seria posible en cualquier laborantorio bromatológico en todo el pais.

El objetivo de esta tesis es estudiar la aplicabilidad deelectroforesis en gel de poliacrilamida con SDS para laseparación, identificación y posible cuantificación de proteinasalimenticias, con la posibilidad de incorporarla como metodoanalítico al CAAcuando los resultados sean satisfactorios.

Debido a que existen diVersas tecnicas electroforéticas enpoliacrilamida con SDS, se hace necesario un estudio básico de lametodologia a efectos de conocer sus limitaciones y aplicabili­dad, asi como también su optimización.

En este aspecto se estudiará la influencia del pH adiferentes concentraciones de acrilamida con mezclas de proteinaspatrones de P.M. y .en muestras complejas como proteinasmusculares.

Debido a que gran variedad de alimentos son sometidos a unproceso de calentamiento de distinta intensidad durante su ela­boración, se estudiará el efecto del mismoen muestras con calen­tamientos suaves comosecado, pasteurización, y calentamientosmas severos, comoesterilización o extrusión. En este caso, essnecesario un estudio previo de la solubilidad de las proteinas enpresencia de diversos agentes disociantes y disruptores que con­tribuyen a su solubilización.

La soja es la proteina vegetal de mayor uso potencial enmezclas, debido a la gran versatilidad que posee por suspropiedades funcionales y su alta concentración proteica. Seestudiará su detección y cuantificación en sistemas modelos conproteinas cárnicas, asi comola influencia de tratamientos tér­micos, presencia de aditivos, interferencia con otras proteinas,etc. Se estudiará tambien la influencia de la variedad de soja yde su procesado en el perfil electroforetico obtenido.

La identificación de soja tambien es importante en otrosalimentos. Asi la posible sustitución de caseina por proteina desoja en la elaboración de quesos, o su utilización en otros pro­ductos lacteos, hace que su detección sea de interés en este tipode alimentos.

Existen otras proteinas que tambien poseen gran versatilidaden su utilización, comolas proteinas de plasma bovino, una decuyas posibles aplicaciones es comosustituto de proteinas dehuevo. Se estudiara su posible diferenciación e identificación enpastas al huevo.

Tambiense estudiará la posible identificación de distintoscereales, asi comola posible detección de proteinas de gluten en

37

alimentos.Cuando los resultados obtenidos en sistema modelo asi lo

justifiquen, se estudiará la aplicacion de electroforesis enpoliacrilamida con SDSa muestras comerciales usuales en muestromedio. Esto permitira su traslación inmediata al analisis deaquellos alimentos en los que.puedaexistir interes particular,asi comoprimera aproximación al conocimento del nivel de difu­sion y utilización de proteinas extrinsecas en nuestro medio.

3.1 DROGAS Y REACTIVÜS

DROGAS:Todas las drogas utilizadas fueron grado analítico: a­crilamida: Fluka; N,N' metilenbisacrilamida Eastman, Fluka;N,N,N',N’, tetrametiletilendiamina (Temed): Eastman; CoomassieBrilliant Blue R-ZSO: Hopkin y Williams, Mallinckrodt; Reactivode Folin y Cicalteau: Merck; patrón de proteinas sericas: Versa­tol, General Diagnostics; albúmina bovina: Biochem; Tris(hidroxi­metil)aminometano: Wiener y Sigma; dodecilsulfato de sodio: Bio­chem; glicina: Biochem; 2-mercaptoetanol: Merck, UCB;ditiotrei­tol (DTT) :Sigma; ditioertritol (DTE): Sigma.

PRDTEINAS PATRONESDE P.M. Se utilizaron proteinas patrones debajo P.M. de:

a) Pharmacia Fine Chemicals, que contiene una meacla de Fosfo­rilasa b (94.000 D), seroalbúmina bovina (67.000 D), ovoalbúmina(43.000 D),anhidrasa carbonica (30.000 D), inhibidor de tripsinade soja (20.100 D) y a<-1actoa1búmina (14.400 D).

b) Sigma, se dispuso de las proteínas patrones individualmente:albúmina de plasma bovino (66.000 D), ovoalbúmina (45.000 D),pepsina porcina (34.700 D), tripsinogeno bovino (24.000 D), fi —lactoglobulina bovina (18.400 D), lisozima de huevo (14.300 D).

3.2.MUESTRAS

Se analizaron muestras comerciales y obtenidas en formaexperimental a escala de laboratorio o planta pliloto. Los trata­mientos termicos y/o quimicos a los que fueron sometidas, sedetallan a continuacion.

3.2.1 ESPECIES DE PESCADO.

Se trabajó sobre muestras frescas de merluza tratadas concalor seco ( una hora a 100 DCen estufa), con calor humedo (unahora a 100 DCen baño de agua) y autoclavadas (15 minutos a 120C). Se utilizó en todos los casos la parte correspondiente a

músculo blanco.Muestrasesterilizadas industrialmente con identificación de

especie fueron suministradas por la firma procesadora; el nombreque figuraba en el rótulo y el que le correspondía según el CAAart. 270 figuran en el siguiente cuadro:

ESPECIE RÜTULÜ CAAKatsuwonus pelamis atún en aceite _Pinguipes spp. — salomones de marSarda chilensis atún bonitoScomberJaponicus caballa caballaEngraulis anchoita sardinas argentinas anchoitaSardinella aurita sardinas (sardinella sardinela

aurita)

39,

Las restantes muestras enlatadas fueron obtenidas en elcomercio: atún albacora; atún sin identificación de especie,denominadoen este trabajo atún comercial;dos conservas de merlu­za de distintas marcas comerciales, denominadasen este trabajomerluza comercial 1 y 2. Se utilizó para su analisis la partecentral del contenido de la lata.

Todas las muestras de merluza, tanto frescas comoenlatadasse consideraron correspondientes a la variedad natural de lascostas argentinas (Merluccius merluccius hubsi, de aucerdo a loestablecido por el CAAen su art. 270).

3.2.2 SOJA

HARINA DE SOJA; Se dispuso de 3 variedades diferentes deharina de soja: Halesoy, Coker Hampton y Hardome. Ademas se contócon dos harinas industriales consideradas comomezcla de varie­dades sin tipificación correspondientes a las producciones 1982 y1983, provenientes en ambos casos de la Provincia de Santa Fe.

En las harinas de soja es usual el proceso de tostado,realizado para inhibir antitripsina; se estudió la influencia deeste calentamiento en la variedad Halesoy, disponiéndose de 2muestras con Indices de Dispersibilidad Proteica (PDI) distintos:15 y 85.

PRODUCTOSPRDCESADDS:Para estudiar el efecto del proceso deobtención, se dispuso de 2 aislados comerciales de importación(Supro 620), dos texturizados por extrusion obtenidos en plantapiloto y un concentrado proteico obtenido a nivel de laboratorio.

Todas estas muestras fueron suministradas por el Institutode Tecnologia de Alimentos (ITA) de Santa Fe.

3.2.3 CARNE VACUNA Y PÜRCINA

Se trabajó con distintos cortes de carne vacuna de diferen­tes animales; se utilizó la parte central del corte. Tambiénseutilizó muestras de carne picada mezcla de diferentes cortes.

El efecto del tratamiento termico se estudió calentando lamuestra un hora a 10000 con calor húmedo y seco y autoclavando a120 C 15 minutos.

Para carne porcina se utilizó la parte central del costillar.Todas las muestras fueron adquiridas en el comercio.

Adulteración de carne porcina por carne vacuna:El procedimiento para la adulteración de carne porcina por

carne vacuna es basicamente el siguiente: la carne vacuna cortadaen trozos planos se sumerge en solución diluida de hipoclorito operóxido de hidrógeno (1-2 Z) hasta la decoloración deseada.Estos trozos en su superficie tienen canaletas para facilitar lapenetración de la solución.

El tratamiento en laboratorio se realizó por inmersión decarne picada de un solo corte, en solución de hipoclorito (3 Z),peróxido de hidrógeno (3 Z de una solución al 25 Z) y aguadestilada durante una hora; este ultimo caso se realizó a efectosde contemplar la posible disminución de algunas bandas proteicas

40

por disolución de proteinas en agua.

3.2.4 SISTEMA MODELOCARNE VACUNA-SOJA.

Se realizaron en el laboratorio mezclas de carne fresca yharina de soja comosistema modelo, utilizando harina PDI 15 porser la de mayor daño térmico.

Se determinó el contenido proteico de la carne fresca magra(22,93 Z) y de la harina de soja (54,92 2) por Kjeldahl. Lasmezclas se realizaron de manera tal que 1a soja aportaba 4,9 Z,9,8 Z, 18,2 Z y 29,5 Z de la proteina total presente, lo queimplicaba porcentajes de harina de soja en la mezcla original del2,0 Z, 4,2 Z, 9,1 Z y 14,6 Z.

Dichos porcentajes cubren los valores usuales a nivel deaditivo, hasta el maximopermitido por el Codex Alimentarius paraun producto extendido, comose detallara en el punto 4.10.5.

Para +avorecer la homogeinizacion de las mezclas, la carnefresca magra se pasó por picadora y se le agrego la harina desoja y agua hasta obtener una pasta homogenea.

Todas las mezclas, asi comola carne y harina de soja sola,se calentaron a 100 C 15 minutos con calor húmedo, cubriendo asilas reacciones de desnaturalizacion proteica sufridas por produc­tos comerciales sometidos a cocción-pasteurizacion.3.2.5 PROTEINAS EXTRINSECAS (DIFERENTES DE SOJA) EN PRODUCTOS

' CARNICDS.

Comosubproductos de la industria +rigorifica, se dispuso deplasma vacuno congelado, suero vacuno en polvo, fraccion corpus­cular de sangre vacuna en polvo. Otras muestras analizadas fueroncaseinato de sodio, leche descremada en polvo, suero de leche enpolvo, gluten y huevo entero en polvo.

El plasma, suero vacuno y gluten fueron materias primasindustriales utilizadas por frigoríficos; el caseinato, suero deleche en polvo y sangre fueron suministradas por los productores.El huevo entero en polvo era industrial, utilizado comomateriaprima por industria alimenticia, quien los suministro. La lechedescremada fue obtenida en el comercio.

3.2.6 INFLUENCIA DE LAS SALES DE CURADO. ELABORACION DE EMUL­SIÜNES CON SOJA A ESCALA PILOTO

Para estudiar la influencia que las sales de curado y elproceso podrian tener en la proteina de soja presente en unchacinado, se procedió a elaborar en planta piloto emulsiones depasta fina con aislado de soja, con y sin sales de curado, si­guiendo todas las etapas del proceso. Dichas elaboraciones serealizaron en la planta piloto del Centro de Investigacion yTecnología de Carnes (CITECA)perteneciente al Instituto Nacionalde Tecnologia Industrial (INTI).

Esquematicamente, las etapas de produccion de chacinados sontres: 1) picado de la carne en presencia de agua o hielo y salespara solubilizar proteinas miofibrilares; 2) agregado de grasa y

4L

hielo para controlar la temperatura, con agitación intensa paraformación de la emulsión y 3) calentamiento a óO-7ÚDC.Cuando hayagregado de aislado de soja, este debe hidratarse durante 30minutos previa incorporación a la mezcla de carne y sales; lacantidad de agua que debe agregarse a1 aislado debe ser propor­cional a la cantidad de carne magra que sustituye.

Se realizó una sustitución del 10 Z de proteinas carnicaspor proteina de soja, lo que implicó un agregado en el productofinal de 1,18 Z de aislado de soja (conteniendo 85 Z de proteinasen base húmeda). Dicho agregado corresponde al nivel consideradocomoaditivo y que segun el CAA(art. 323 bis.) requiere unica­mente la declaración del porcentaje utilizado en la lista deingredientes.

Para 1 kg de emulsión, debia utilizarse 11,809 de aislado ehidratarlo con 38 m1de agua; debido a estas bajas cantidades nofue posible 1a hidratación previa por no poder agitarse mecanica­mente; el aislado y el agua se incorporaron directamente a lacarne picada en la etapa inicial.

Finalmente los pasos y las cantidades para obtener 1 Hg deemulsión figuran en el siguiente esquema:

11,8 G AISLADÜ DE SOJA + 60 ml AGUA;5 min. EN REPDSO PARA PERMITIR HIDRATACION

SE AGREGAN A: l450 G DE CARNE PICADA CONGELADA + 20 ml DE AGUA

89,3 G HIELÜ

LH——+

O seg. CUTTER 1500 RPM40 min. REPDSD PARA PERMITIR HIDRATACIÜN30 seg.CUTTER 1500 RPM

+ SALES )

ño seg. CUTTER 1500 RPM30 min. EN REPOSD PARA PERMITIR LA SDLUBI­

LIZACIDN DE LAS PROTEINAS MIDFIERILARES

+ 169,1 g DE HIELO + 200 g DE GRASA

1,5 min. 3.000 rpm

EMULSIÜN

Se prepararon 2 emulsiones: sin sales de curado y con lassales de curado usuales: 22,5 g de NaCl (concentracion usual 2­2,5 Z), 100 mg de nitrito (maximo permitido por CAA)y 4 g defosfatos (concentración usual O,3—O,5Z).

El tratamiento termico se realizó colocando la emulsión entubo de ensayo y posterior inmersión en BAa 100 C; se tomó latemperatura en el centro, retirando la muestra al llegar a latemperatura deseada. Inmeditamente se enfrió la muestra por in­mersión en agua iria.

El calentamiento drástico se realizó en autoclave a 121 C

4?

durante 15 minutos.El total de muestras fue el siguiente:

a) emulsión sin sales de curado con 1,2 Z de aislado de soja:- sin calentamiento- calentamiento a 65 C- “ a 75 C— “ a 121°C 15 minutos.

b) emulsión con sales de curado con 1,2 Z de aislado desoja: se calentaron muestras en paralelo con 1a muestra sin salesde curado

3.2.7 PRODUCTOS CARNICOS COMERCIALES.

MUESTRAS SIN TRATAMIENTO TERMICO:

Se analizaron las siguientes muestras:- l Hamburguesade composicion conocida obtenida del fabri­

cante con agregado de 9 Z de plasma y 2 Z de aislado de soja:H1.

- 4 Hamburguesascon diferentes denominaciones correspon­dientes a 3 frigoríficos diferentes: H2, H3, H4, H5.

MUESTRAS CDN TRATAMIENTO TERMICO:

Se analizaron los siguientes chacinados pasteurizados:—salchichas tipo Viena y frankfurt: 81.......8124 chorizo tipo aleman: Chi, Ch2.— lomo de cerdo: L- mortadela: MLa salchicha de Viena 85 se hallaba rotulada "de carne

vacuna".Tres de las muestras se obtuvieron de los fabricantes (Sl,

S2 y M). La muestra Sl contenia 25 Z de plasma, desconociendoseel resto de las materias primas. En el caso de la muestra SE seconocia exactamente la proporción de las materias primas utiliza­das ( carne vacuna 17,7 Z; carne de toro 24,0 Z; gordura de cerdo25,0 Z; gluten 2,1 Z; fecula de trigo 5,2 Z; hielo 24,0 Z); lamortadela (M) tenia composicion similar variando la fecula detrigo (11,8 Z) y el tocino (20 Z).

Los productos restantes correspondían a 8 frigoríficos dife­rentes y se obtuvieron en el comercio, en el periodo abril-mayo1984.

3.2.8 OTROS PRODUCTOS COMERCIALES.

— PRODUCTOS COMERCIALES DE SOJA, NO CARNICOS

Se analizaron los siguientes productos:- "milanesas de soja", que consistía en un producto seco de

aspecto similar a una galleta;- "harina mezcla de soja y arroz", rotulada erroneamente

43

comoharina de cereales, para preparar sopas y pures;- "fideos dietéticos de alto contenido en gluten con soja“;- "fideos de soja, trigo y mijo", (origen Brasil)- "leche de soja en polvo“: se dispuso de 4 marcas comer­

ciales diferentes, todas de producción extranjera elaboradas apartir de aislado de soja segun rótulo.

Todas las muestras eran comerciales, contando unicamente conla información brindada en el rótulo respecto de la composición;en el caso de mezclas se desconocía la proporción.

- HARINAS DE CEREALES Y OTRAS HARINAS.

Se dispuso de las siguientes muestras de harinas de ce­reales: harina de trigo blanca, harina de trigo integral, harinade avena, harina de cabada, harina de centeno, harina de maiz,harina de mijo, harina de arroz.

Si bien no constituyen cereales, también se analizó harinade mandioca, harina de garbanzo, asi como levadura.

La harina de cebada, harina de mandioca, harina de garbanzoy levadura fueron obtenidas en el comercio. E1 resto de lasmuestras fueron suministradas por el molino procesador.

- FIDEOS AL HUEVÜ.

Se dispuso de 7 muestras de fideos al huevo de diferentesmarcas comerciales. Estas muestras, asi comofideos de gluten, seobtuvieron en el comercio. La yema de huevo en polvo de usoindustrial fue suministrada por una industria alimenticia consu­midora.

- PRODUCTOS LACTEOS.

Se analizaron 5 muestras de quesos comerciales de diferentesproductores: 3 correspondían a quesos de pasta blanda (2 cremososy 1 blanco) y 2 a quesos de pasta dura (1 tipo provolone). Todaslas muestras fueron adquiridas en el comercio.

Se analizó una muestra de leche en polvo comercial a base dehidrolizado de proteinas, desconociéndose el origen de laproteina.- PRODUCTOS TEXTURIZADÜS.

Se dispuso de las siguientes muestras:- extrudido de maiz, de maiz-mijo (50-50), maiz-avena (60­

40), soja-maiz (40-60), arroz, trigo integral;todas estas mues­tras fueron procesadas industrialmente, siendo suministradas porel molino productor.

- extrudido de maiz-queso, de origen comercial.- texturizado de trigo integral.

44

3.3.TRATAMIENTÜ DE LAS MUESTRAS PARA SU ANALISIS ELECTRÜFÜRETICÜ

3.3.1 DESGRASADOEn los productos carnicos se procedió a homogeinización

previa de la muestra en picadora hasta obtener una pasta; en elcaso de salchichas se utiliaó la parte central. En estos produc­tos que pueden tener hasta 30 Z de grasa, se procedió al desgra­sado por acetona segun Lee y col., (110): se suspendió la muestraen relacion 1:8 en acetona, se agitó en Virtis durante 5 minutosy se centrifugó a 1500 rpm durante 25 minutos descartandose elsobrenadante; el residuo se trato 2 veces mas con acetona y seseco bajo lampara IR. La muestra desgrasada y seca se trituró pormolinillo o mortero hasta obtener una harina.

En el caso de cereales o productos secos tipo granulado, lahomogeinización previa en los casos en que fue necesario, se hizocon molinillo hasta obtener una harina. Por contener estos pro­ductos poca grasa, el desgrasado se realizó con una sola ex­tracción con acetona.

En el caso del plasma, por ser una muestra liquida, seprecipitaron las proteinas con acetona (1:1); luego de centrífu­gar el residuo se volvió a extraer 2 veces por acetona.

Para estudiar la posible influencia de la etapa de desgrasa­do, en la resolución de muestras con calentamientos drásticos, seestudiaron otros solventes de extracción de grasas: etanol-eter(2:3) y cloroformo-metanol (1:1).

Sobre la muestra seca y desgrasada se determinó proteinaspor método de Kjeldahl.

3.3.2. EXTRACCIONDE PRDTEINAS.

— PROTEINAS PATRONES.Para la separacion electroforética en sistema discontinuo,

se utilizaron las proteinas patrones de Pharmacia Fine Chemicalsde bajo P.M., según lo detallado en 3.1 y que cubre un rango deP.M. de 94.000 a 14.400 D. Las proteinas se extrajeron segúncatalogo (147) con buffer de electrodos (Tris-glicina) contenien­do 3 Z de SDS y 5 Z de ME, calentando en BA a 100 UC durante 5min.; la extracción se realizó con 300 ul de buffer inmediatamen­te antes de la siembra.

Para la separación en sistema continuo se utilizaron lospatrones Sigma; el vial contiene 13,5 mgde la mezcla de protei­nas en proporciones óptimas para su visualización; se disolviósegun catalogo (61) en 1 m1 de buffer de extracción 0,01 Mfosfa­to pH 7,0 con 1 Z de SDS y 5 Z ME calentando en HA a 100 Cdurante 5 min., inmediatamente antes de la siembra.

MUESTRASCuando se sembró en sistema discontinuo, la extracción se

realizó segun Lee y col.(110) con buffer Tris-HCl 0,0625 M, H6,8, con 5 Z de BDS y 1 Z de ME. Se calentó en BA a 100 Cdurante 5 min. con agitación; 1a Centrifugación se realizó a15.000 rpm 15 min. a 25 C en una centrífuga MSE. Se repitió 1a

45

extracción 2 veces, diluyendose con buffer a 25 ml. La cantidadde muestra utilizada varió de manera que la concentración finalen el extracto estuviera entre 4-8 mg/mlde proteinas; en el casode productos cárnicos, donde 1a muestra seca contiene alrededorde 90 Z de proteinas, se partio de aproximadamente 225 m9.,obteniéndose una concentración final en el extracto de alrededorde 7 mg/ml; para harina de soja y derivados, con concentraciónproteico de 50 Z la concentracion en el extracto fue de aproxima­damente 4 mg/ml. En el caso de cereales y derivados, se partio deaproximadamente 600 mg de muestra por contener solo alrededor de12 Z de proteinas; se disminuyó el volumen final a 20 ml, demanera que la concentración final fue de alrededor de 3,5 mg/ml.

Se estudio 1a influencia de variaciones en los pH del bufferde extraccion En el caso de productos con calentamientos drasti­cos. Tambien se estudiaron variaciones en la concentracion de Me,asi como se ensayaron otros disruptores: DTTy DTE.

3.3.3 DETERMINACION DE PRDTEINAS EN LA SOLUCIONEXTRACTIVA.

Para 1a determinación de las proteinas extraídas, eliminandolas interencias del buffer de extracción (SDS, ME, Tris), seadopto el prOCEdimientodel siguiente cuadro:

A) PRECIFITACIDN DE PRDTEINAS:PRÜTEINAS EXTRAIDAS

0,2 m1 (por dupl.) + 2 m1 ACETDNAAGREGADÜS CON AGITACIDN CONSTANFEEN VÜRTEX; CENTRIFUBACIÜN A 5.000RPM 25 min.

PRDTEINA'ÉRECIPITADA SN

RESUSPENSIDN Y LAVADÜ 2VECES MAS CDN ACETÜNA

PRUTEINÁ'PRECIPITADA SN

a) DISÜLUCIDN + 0,5 m1 NaÜH 1 N, AGITACIÜN 30' A 37°C;

LLEVAR A 2 m1 CDN AGUA DESTILADAl

|

(PRDTEINA DISUELTA EN NaÜH 0,25 NI LIBRE DE INTERFERENCIAS)|

0,2 m1 (PUR DUPLICADD DE CADA PRECIPITACIDN)

C) DETERMINACION DE PRDTEINAS PUR METODO DE LÜWRY

PRDTEINA PATRON: ALEUMINA SÜMETIDA AL MISMO TRATAMIENTO QUELA MUESTRA.

46

Se utilizó comoreferencia el valor de proteína determinadopor Kjeldahl en la muestra seca.El porcentaje de extractabilidadse calculo como:

E = proteinas por Lowry X 100proteinas por Hjeldahl

3.4 ELECTRÜFORESIS

3.4.1. SISTEMA DISCÜNTINUD DE LAEMMLI

Se utilizó basicamente el sistema de Laemmli: se trabajo consolución stock de 22,2 g de acrilamida y 0,6 g de metilenbisa­crilamida (relacion 37/1 p/p), en 100 m1, filtrada y conservadaen heladera.

Los buffers empleados fueron:- Buffer del gel de concentracion: Tris-HCl 0,5 M0,4 Z SDSpH 6,8—Buffer del gel de separacion: Tris-HCl 1,5 M, 0,4 Z SDS, pH 8,8- Buffer de corrida: 0,025 MTris, 0,192 H glicina, 0,1 Z SDSpH 8,3

El persulfato de amonio se fraccionú y conservo en desecadorconteniendo H2804conc. La solucion de trabajo (10 mg/ml), sepreparó en el dia; la concentracion final en el gel de separaciónfue de 0,023 Z y en el de concentración de 0,06 X

El TEMEDse agregó al agua destilada previa a su utilizacióny en cantidad tal que 1a concentración final en el gel fue de0,075 Z en el gel de separación y 0,1 Z en el de concentracion.

MÓDIFICACIDNES:Se estudiaron modificaciones en la concentracionde acrilamida, el pH del gel de separación y el pH del gel deconcentración.

Las concentraciones de acrilamida utilizadas en el gel deseparación fueron de 7,5, 10,0 y 12,6 Z; la concentracion del gelde concentracion se varió para muestras con calentamientos dras­ticos (entre 3 y 7 Z de acrilamida).

El pH de los buffers de los geles de separacion fue de 8,8,9,0 y 9,2.

El pH de los buffers de los geles de concentración fue de6,8, 7,8 y 8,8.

La determinacion del pHen estos buffer está dificultada porla presencia de SDS; el pH final se determinó luego de 24 hs desu preparacion por 1a lenta estabilización constatada.3.4.2 SISTEMA CONTINUO

Se utilizo basicamente el sistema de Weber y Üsborn. Losbuffers utilizados fueron:- Buffer de corrida: 0,05 Mfosfato pH 7,0, 0,1 Z SUS- Buffer del gel: 0,2 Mfosfato pH 7,0, 0,4 Z SDS

El persulfato, TEMEDy solucion madre de acrialmida, fueroniguales a los empleados en sistema discontinuo.

47

MODIFICACIONES:Se hicieron variaciones del pH del gel a 6,55 y7,45, siendo las variaciones en la concentración de acrilamidaiguales a las del gel de separacion del sistema discontinuo3.4.3 EQUIPOS

Se utilizo la cuba para electroforesis de Pharmacia GE-2/4con capacidad para 20 tubos o 4 placas chicas o É placas grandes.Esta cuba ofrece la ventaja de que los geles estan inmersos en elbuffer de corrida de la cuba inferior, evitando calentamiento delgel y la consecuente deformación de las bandas; tiene la desven­taja de requerir gran volumende buffer de corrida necesario.

La fuente de poder utilizada fue Pharmacia EPS 500/400 quepermite realizar la corrida a intensidad constante, con exactocontrol de este parametro.

Para las placas chicas y tubos, se utilizo la cuba de des­tinción, de Pharmacia Fine Chemicals.

La densitometria se realisúon equipo Cromatogram ScannerDual Wavelength, Shimadsu, Model CS 910.

PREPARACION DE LOS GELES

El orden de mezclado de las distintas soluciones fue: solu­ción de acrilamida + buffer + (agua + femed), desaireado y agre­gado de persulfato. En general, el tiempo de gelificación estuvoentre 20-30 min.

TUBOS. Se trabajo en tubos de vidrio de 5,0 X 75 mmy 5,0‘X18 mm; para la gelificación se utilizó la gradilla especial dePharmacia para polimerizacion de geles en tubo.

Los tubos se cerraron previamente en un exgremo con cintaresistente al agua y se calentaron un hora a 70 C, para evitarlas pérdidas favorecidas por el SDS.

En general se trabajó en tubos cuando se quiso compararnumerosas condiciones de separación di+erentes ( concentracionesde acrilamida y pHs), para una misma muestra, ya que si bien sontubos especiales para electroforesis con igual diametro interno,espesor de pared, etc., siempre hay pequeñas variaciones degelificación, largo, etc..

PLACAS: Se utilizaron placas de BD‘X B0 mmy 80 X 140 mmconcapacidad para ó muestras y 170 X 140 con capacidad para 14muestras; el espesor del gel fue en todos los casos de 2,7 mm.

Las placas chicas se sellaron lateralmente con cinta resis­tente a1 agua y se calentaron un hora a 70 OC; la gelificacionse realizó en una base con canaletas donde se introdujeron lasplacas, sellandolas con agar.

Una vez elegidas las mejores condiciones de separacion, setrabajo con placas para compararar distintas muestras, ya que sefacilita 1a comparación, evitandose pequeñas variaciones decondiciones de corrida o polimerizacifion del gel.

48

3.4,4 SIEMBRA Y CORRIDA ELECTRÜFÜRETICA'

Para la siembra se mezcló en tubos de Khan, 1 volumen demuestra + 0,5 volumen de glicerina 30 Z + 0,5 volumen de azul debromofenol como indicador del frente; se agitó en Vortex y sesembró en general 10-30 ul de la mezcla con micropipeta automa­tica, dejando caer la muestra por debajo del buffer de la cubasuperior. En el caso de los cereales y derivados, la relacion devolumen se alteró, sindo 1 vol de muestra + 0,1 vol de colorante+0,2 vol de glicerina 50 Z .

La cantidad de proteina sembrada en general fue entre 30 y60 ug; en el caso de los cereales se sembró 50 ul y la cantidadde proteina sembrada fue de alrededor 130 ug.

Cuandose realizó cuantificación, la muestra se sembró porlo menos por duplicado en la misma placa.

CORRIDA ELECTRÜFÜRETICA

En todos los casos el buffer de corrida de la cuba superiorfue nuevo, mientras el inferior se reutilizó varias veces.

Cuando1a separacion electroforetica se realizó en tubos ensistema discontinuo, se comenzo a 0,7 mA/gel; una vez que lamuestra alcanzó el gel de separacion, se continuó a 1,5 mA; ensistema continuo, se aplicó 8 mAdurante toda la corrida. Una ve:finalizada la corrida, los tubos se enfriaron 5 min. en congela­dora para facilitar la extracción del gel.

Para placas chicas se comenzó a 10 mA/placa y se continuó a25 mA/placa cuando la muestra atravesó el gel de separación; paraplacas grandes se aplicó 2C) y 40 mA/placa respectivamente.

El frente de colorante se indicfio en todos los casos porinserción de un pequeño alambre de cobre.

Las movilidades relativas (Rf), se calcularon comola rela­ción de 1a distancia migrada por la proteína con respecto a ladistancia migrada por el colorante.

FIJACIÜN, TINCIDN Y DESTINCIÜN

Para la fijación se utilizo una solucion de TCA15 Z prepa­rada en el dia; se dejo durante 30 min. con agitación como mínimoy remoción a los 15 min. ; esta solución ademas de fijar lasproteínas permite la remoción del SDSque interfiere en la tin­ción.

El paso de fijación es fundamental si luego se realizadestinción por corriente y para evitar la decoloración de lasbandas con el tiempo.

La tinción se realizó con Coomassie Brilliant Blue R 250 al0,25 Z en solución metanol 50 Z y ac. acético 9 Z, durante toda1a noche con agitación suave. La solución colorante se preparó yfiltró en el dia.

La destinción se realizó por difusión con solución metanol50 Z y ac. acetico 9 Z durante ó hs con remoción constante yagitación.

49

En las placas grandes se completo la destinción por difusioncon solucion ac. acético 7 Z y concentracion de metanol decre­ciente; para las placas chicas y los geles en tubo, la destincionse completo con corriente a 12 V durante 40 min. en solucionmetanol 5 Z y ac. acético 7 Z, utilizando la cuba especial dedestinción de Pharmacia GD-4II.

DENSITÜMETRIA

En el densitometro se realizo el barrido de las proteinastenidas, para establecer la longitud de absorción y de minimaabsorción para (utilizada comoreferencia). Dichas longitudesfueron de 550 y 400 nm, respectivamente.

Se estudió el tamaño del haz, a efectos de obtener maximaresolucion y altura de pico, estableciéndose 1X' 0,2 mm paradicho haz.

Las áreas de los picos se calcularon comoalturaX“ base a 1amitad de la altura. Las áreas especificas se calcularon comoáreapico/ ug de proteína sembrada.

3.5 CALCULOESTADISTICÜ

Para el estudio de la influencia de la variedad de harina desoja y tipo de procesado enla extractabilidad y areas específi­cas, se aplicó analisis de varianza (ANÜVA)de un factor. Luegose aplicó test de Student para diferencia de medias entre grupos.

Se estudio el error global del metodoen la extractabilidady cuantificación electroforética para proteina de soja.

50

4_-_LJNELUEMQIAHDEL._J?Ji_. .Y._..QQ._QEN.IBBQ_I_QL\L"9.5.398; L6.E1_I_QB___E_N__EL._.S_ISIE MA­DJQMLNULLDLLQEMIÁLL

4. 1. 1 F'RDTEINFLS PATRONES;

Se estudio 1a resolución obtenida para proteinas patrones deP.M. 14.400 a 94.000 D., a 3 concentraciones de acrilamida (7,5,10,0 y 12,6 Z), cada una a 3 pH distintos (8,8, 9,0 y 9,2).

Se trabajo en geles en tubo de 75 mmde largo, realizando lacorrida electroforetica de cada muestra por duplicado, en formasimultanea, a las 3 concentraciones de acrilamida y a todos lospH estudiados. Cada experimento fue repetido 2 veces con distin­tas mezclas de polimerizacion.

La electroforesis se interrumpió cuando el frente de colo"rante que se desplaaa junto al limite movil, alcanzaba el bordeinferior en el gel de mas rapida migracion.

En la {19.2 se muestran los densitogramas de las separa­ciones electroforeticas registradas. En los geles con 7,5 Z deacrilamida y pH 8,8 solo se separan las tres proteinas de mayorP.M. y migran con el frente de colorante o limite movil lasproteínas de P.M. 30.000 o menor. A pH 9,0 y 9,2 se resuelvetambien la anhidrasa carbónica (P.M. 30.000) pero las proteinasde menor P.M. migran con el limite movil.

Aparece asi un “frente proteico" coincidente con el frentede colorante o limite móvil, que no se resuelve aumentando eltiempo de corrida, comopudimos comprobar al realizar electrofo­resis en tubos de 180 mmde largo.

A 10 Z de acrilamida la variación de pH tiene un importanteefecto sobre la resolucion. A pH8,8, condiciones del sistemaoriginal de Laemmli, corren todavia con el limite movil las 2proteínas de menor P.M. (20.100 y 14.400 D). A pH 9,0 las bproteínas patrones se resuelven, pero la O<—1actoalbúmina (P.M.14.400 D) todavia se mueve con el limite movil. A pH 9,2 todaslas proteinas se resuelven independientemente del limite movil.

A 12,6 Z de acrilamida se alcanza una total resolución a lostres pH usados, observándose que el incremento de pH hasta 9,2acorta 1a distancia migrada por las proteinas.

Los mismos resultados se obtuvieron ampliando el rango de pHestudiados entre 8,6 y 9,30, a las mismas concentraciones deacrilamida.

Como los distintos geles se corrieron simultaneamente igualtiempo, 1a movilidad de cada proteina es directamente proporcio­nal a la distancia migrada.

La influencia del pH sobre la movilidad proteica en cadaconcentración de acrilamida, se ve mas claramente en la figura 3donde cada proteina patron se representa por una barra y ladistancia migrada por el frente de colorante o limite móvil comouna linea horizontal en la parte superior.

51

1518€­

*109

WL '¡ac.

ef ’ ¡es

MW.M

F

*

Fig.2:DensitogramasdeproteinaspatronesseparadasporSDS­ PAGEadiferentesconcentracionesdeacrilamidaydiferentespH. Elcomienzodelgeldeseparaciónyelfrentedecolorantese indicanconlasletrasSyFrespectivamente.ElP.M.delas proteinasutilizadases:fosforilasab(94.000D),seroalbúminabovina(67.000D),ovoalbúmina(43.000D),anhidrasacarbónica(37.000D),inhibidordetripsinadesoja(20.100D),°‘-lactoal­

bümina(14.000D).

0'w

VGVHÜIW VlONVlSlCI70­ 60­ 40­ 30­

7.5%Ac.

10.0%Ac.

l

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¡LDumnllllllllllllllIIIIIIIIIIIIIIIIIIllllllllll'l.l llllllllllllj l:

9.09.2

9.0

9.28.89.0

ELE;__Q=Distanciamigradaporlas pHyconcentracióndeacrilamida.Cadabarraproteinapatrón.Lalineahorizontalladistanciamigradaporelfrentedepatronescorrespondenalasindicadase

proteinaspatronesadiferente

colorante.

9.2

El incremento de pH produce efectos diferentes en cualquierade las concentraciones de acrilamida estudiadas:

- leve disminución de la movilidad de las proteinas quemigran independientemente del limite movil;

—aumento de la movilidad del limite movil con el consi­guiente aumento del largo total de corrida; este aumento essimilar en las tres concentraciones de acrilamida;

- las proteinas de bajo P.M. que migran con el límite movilmuestran aumento de su movilidad en tanto migran con el limitemovil, pero cuando por aumento de pH o de concentracion de acril"amida migran libremente, disminuye su movilidad como el resto delas proteinas.

Si en lugar de graficar la distancia migrada, se grafica lavariación de la movilidad relativa (Rf) vs pH (fig.4), se obsermva para todas las proteinas que migran independientemente dellimite movil, la disminución de la migracion con e] aumento delpH, siendo esta relacion lineal.Esta variación es idependiente dela concentración de acrilamida.

Si se comparan las movilidades de las proteinas corridas almismo pH y diferente concentracion de acrilamida (fig 3), seobserva el incremento del efecto tamiz al aumentar la concentra­cion de acrilamida, efecto ampliamente conocido. Este hecho seobserva solo levemente en el limite movil dado el pequeño tamañodel ión glicinato; por lo :anto la distancia migrada por elfrente de colorante no nos indica mayor o menor migración protei­ca, sobretodo cuando la concentracion de acrilamida es elevada.

Durante la corrida el frente de colorante puede ser muynitido o difuso, favoreciendo en general su nitide: bajas concen­traciones de acrilamida y bajos pH. Al teñir posteriormente, seobserva que la nitidez de este frente no guarda relacion ni conla resolución obtenida ni con la nitidez de las bandas proteícas.Asi a 7,5 Z de acrilamida y pH bajos se obtuvieron frentes decolorante nitidos, correspondiendo a las condiciones de corridade menor resolucion y mayores anchos de banda, mientras que a12,6 Z de acrilamida el frente de colorante fue muydifuso, conbuena resolución y bandas proteícas muynítidas. Los anchos de

,1banda obtenidos pueden compararse en la fig. ¿­

En la fig. 5 se representa la relacion entre el log del P.M.de las proteinas patrones y su movilidad relativa a las diferen"tes concentraciones de acrilamida y pH estudiados.

La desviación de la linealidad es diferente para cada condi­cion empleada. A 7,5 Z de acrilamida solo se obtiene linealidadpor encima de 30.000 D. A 1?,ü Z de acrilamida la linealidad semantiene entre 14,400 D, la proteina de menor F.M. incluido en elestudio y aproximadamente 50.000 D. A 10,0 Z de acrilamida y pH9,20 es donde la relacion lineal cubre un rango mas amplio de P.H.

Se incluyeron también variaciones en el pH del gel de perogrueso dentro del rango 6,8 a 7,8 sin observarse variaciones enla resolución. Masaun, la no inclusion de este gel concentrador,

7o’5Á)ac'PMx1O410,0%ac.

0

1“PMx1o4115Aac.PMn°4

1,44

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8

3‘:

8

8

r

3

8

3

pH

Fig.4:Variacióndelamovilidadrelativa(Rf)delasproteinaspatronesvspHadistintasconcentracionesdeacrilamida.ElP.M. decadaproteinaseindicaaladerechadelarecta.

(905”)'L"\!'cfl '901100E

80 60 40 20

15%Ac.MmzAc.ú5%AC.

4n.__..

0.5

05RELATIVA

¡VII'CI_ACi

o OÑ“

Fig.5:Log.delP.M.delasproteinaspatronesenfuncióndesu movilidadrelativaadiferentespHyconcentracionesdeacrila­ mida,ensistemadiscontinuo.

o—opH8,8;«0-9

pH9,0;A—npH9,2

no permitio detectar diferencias en la resolucion.

Se utilizó músculo blanco de merluza. Los extractos protei­cos se sembraron en volumenes de 10 ul conteniendo aproximadamen"te 35 ug de proteína total.

Las condiciones de los geles fueron las mismas que lasdetalladas para la separación de las proteínas patrones, exceptoen lo referente al rango de pH empleado que fue mas amplio (pH8,6 a 10,0). '

Las separaciones electroforeticas se repitieron 3 veces paracada condicion experimental de acrilamida y pH.

Las principales bandas proteicas fueron tentativamenteidentificadas por comparación con los P.N. informados por Booreny col. (148) y por Porïio y Pearson (149).

Para estudiar 1a influencia del pH sobre las proteinasmusculares de pescado, se tomo comorepresentativas 3 bandasproteicas cubriendo todo el rango de P.M.: miosina cadena pesada(P.M. estimado 220.000), actina (P.M. estimado 45.000) y lamioglobina-miosina cadena liviana 2 (ML"2)(P.M.estimado 17.500D).

En la figura ó se representa la distancia migrada por lasprincipales proteínas musculares a distintos pHs y concentracionde acrilamida. Se observa para estas proteínas un comportamientosimilar al de las proteinas patrones (figura 3).

En la fig.7 se observan separaciones electroforeticas re­presentativas y en 1a fig. 8 los densitogramas correspondientes.

A 7,5 Z de concentración de acrilamida y pH 8,8 (gel 1),solo se separan las proteinas de mayor P.M., xistiendo un frenteproteico. A pH 9,2 (gel 2), si bien 1a resolucion se extiendehasta las proteinas de 25.000 D, aun persiste un frente proteico.A pH 10 (gel 3) se logra una total resolución, pero las bandasproteícas se presentan mas difusas, comopuede observarse masclaramente en el densitograma.

A 10,0 Z de acrilamida, es necesario utiliear pH 9,20 (gel5) para lograr una completa resolucion de todas las proteinas. Enestas condiciones todas las bandas presentan ademas buena niti­dez. Las proteinas con P.M. 17.000-18.000 D se resuelven como unabanda única. En este gel se indica 1a identificación tentativa dela mayoria de las bandas proteicas, de acuerdo a sus P.M.

A 12, Z de acrilamida, 1a utilieacion de pH 8,8 (gel 7)permite lograr una total resolucion proteica pero existe ciertadifusion de las bandas con P.M. mayores a 1a actina. En estascondiciones la banda de 17.000-18.000 D del gel 5 se dividenitidamente en un doblete identificado tentativamente como 1acadena liviana 2 de 1a Miosina (ML-2: 17.800 D) y mioglobina (Mb:17.000 D). La banda identificada tentativamente comoTroponina­T(TT) en el gel 5, muestra tambien en el gel 7 dicha tendencia asubdividirse. Ello indicaria la presencia de otras proteinas desimilar P.M. que no se resuelven en otras condiciones.

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9,0 9,2 8,8 9,0 9,2 8,8 9,2 p H

7,5 10,0 12,6 96 AC­

Fig. 6: Distancia migrada por las principales proteínas muscu­lares a diferentes pHs y concentración de acrilamida. Las barrasrepresentantegmiosina (cadena pesada, P.M. estimado 200.000 D);actina (P.M. estimado 45.000 D); miosina cadena liviana 2*mioglo­bina (P.M. estimado 17.800» 17.000 D)EL

pH8.8

Ac

pH9.2

10.0SAc

_MQ5

¡WM¿,

pH10.0pH8.8pH9.2pH8.6

Fig.7:Separaciónelectroforeticadeextractosproteicos merluza(MerlucciusmerlucciusHubsi)adiferentespHy tracionesdeacrilamida.Mzmiosína;A:-actinina; T;Tm=tropomiosina;u=noidentificadas; miosina;TIztroponina-I: naliviana2demiosina;frenteproteico;

de

concen­

TT=troponina­

ML1:cadenaliviana1de

TC=troponina-C;Mb=mioglobina;ML=cade­

MLszcadenaliviana3demiosina?FP:­

Fc=frentedecolorantemarcadoconalambre.

pH12.6xAc

pH9.2

.MHHW-W ....,_4..... .

E1g¿g: Densitogramas de proteinas musculares de merluza corres­pondientes a las separaciones electroforéticas de fig. 7. Seindican con flechas los picos correspondientes a miosina cadenapesada, actina y miosina cadena liviana 2- mioglobina. El frenteproteico cuando aparece se indica como FP. El comienzo del gel deseparación se indica con la letra S.

A esta concentración de acrilamida, el incremento de pH a9,2 (gel 8) produce varios efectos negativos: a) las proteinas deP.M. por debajo de 17.000 D aparecen como una banda difusa, nobien resuelta y el doblete de proteinas tentativamente identifi­cadas como ML-2 y Mb aparece como una banda única; b) la longitudde la resolucion se ve muydisminuida a esta concentracion deacrilamida, dado que el incremento de pH disminuye la migracionproteica. Ello provoca una menor resolución de las bandas conmayor P.M. que la actina y 1a banda de miosina permanece muycerca de comienzo del gel de separacion.

De acuerdo a esto, a 12,6 Z, pH 8,8 se desdoblan 2 bandas,que al aumentar el pH a 9,20 y en todas las demas condiciones deacrilamida y pH, aparecieron comounicas.En e] gel 6 se estudióel efecto de la disminución del pH a 8,6 a esta concentracion deacrilamida para mejorar la resolucion de estas bandas. En dichogel y el densitograma correspondiente, se observa aparición de unpequeño frente proteico, pero mejor resolución del doblete co"rrespondiente a ML-Ey del correspondiente a TT.

A1 igual que con proteinas patrones, variaciones de pH en elgel concentrador de 6,8 a 7,8, o la no inclusion del mismo, noafectaron la resolucion obtenida.

4.1.3 PRDTEINAS VEGETALES Y MUQQQEQEEE

Se observó que variaciones hasta en una unidad en el pH delgel de concentracion o su ausencia, no afectaban la resolucion,tanto de proteinas patrones como de proteinas de pescado. Comoenestos casos los volúmenes de siembra habian sido muy bajos, seestudio si variaciones mayores de pH en el gel de concentraciono volúmenes de siembra superiores, influian en la resolucionobtenida.

Se trabajo con proteinas vegetales y musculares de origenbovino. La cantidad de proteina sembrada y los volúmenes desiembra fueron:

Proteina de soja Proteinas muscularesvolumen desiembra ul 50 50 10 10 50 50proteinasembrada ug 20,6 33 33 83,8 83,8 52,5

'\Así, de cada muestra se sembró igual cantidad de proteínas Eveces, pero en un caso el volumen de siembra fue 5 veces supe"rior; en el caso en que los volúmenes de siembra coincidieron, lacantidad de proteínas fue diferente.

Se corrieron simultaneamente 4 placas siendo el pH del gelde concentracion 6,8, 7,8 y 8,8. En el caso de pH 6,8, se corrie"ron dos placas variando el pH del gel de separacion: 8,9 y 9,10.En el resto, el pH del gel de separacion fue 8,9.

Los resultados hallados se observan en figura 9.

54

pHGELcomc. VOL.ul

U9

505010105050

20,53333838838525

Fig.9:InfluenciadelpHdelgeldeconcentracionenlaresolu­ciónelectroforética.ElpHdelgeldeconcentracionyelde separaciónseindicaencadacaso.Encadaplaca,las3muestrasdelaizquierdacorrespondenasojaylas3deladerechaa proteinasmusculares;entodaslasplacassesembraronlosmismosvolúmenesycantidadesdeproteinasindicadosenlaprimerplaca.

No aparecen diferencias en 1a resolución con los distintospHs del gel de concentración, ni en el caso en que se aumentó elvolumen de siembra, ni cuando se sembró muestra mas diluida.

En el caso en que se varió el pH del gel de separacion, seresuelven también las proteinas en la zona de bajo P.M.

La única diferencia apreciable es que a1 variar el volumende siembra, varia levemente el "largo" de las bandas proteicas.Esto podria deberse a que el lugar de siembra consiste en untrapecio invertido y a1 aumentar el volumen desiembra, aumenta 1a superficie donde se distribu"yen las proteínas, pareciendo tener mayornitidez la siembra devolúmenes menores por encontrarse igual cantidad de proteinas enuna superficie menor. Este efecto por ejemplo se observa masclaramente en la figura 32: el volumen de siembra de la meïclapatrón de P.M. fue muysuperior y las bandas de las proteinaspatrones de P.M. tienen un "largo" sensiblemente superior alresto.

DISCUSION

:___FF\'_E_’\1__E__FfiQIE_I.QQ.

De acuerdo a nuestros resultados, aparece en determinadascondiciones un "frente proteico" consistente en proteinas de bajoP.M. que migran junto al limite movil.

Es de remarcar que este “frente proteico" aparece como unabanda muynítida que se malinterpreta en numerosas ocasiones comofrente de colorante en diversos trabajos publicados (150)(151).Sin embargo, el azul de bromofenol utilizado comofrente de colo­rante durante la corrida, desaparece en la etapa de tincionmdeswtinción, debiendo marcarse por ejemplo con un alambre,1a distan­cia recorrida por el colorante si luego se desea calcular el Rf.

El frente proteico pueden formarlo tanto proteinas muscu“lares (con o sin tratamiento termico comose vera mas adelante,punto 4.3), asi comoproteinas patrones utilizadas para la deter­minacion de P.M. En este caso se constata el alejamiento de lalinealidad por parte de las proteínas de bajo P.M. o su agrupa"miento. Por tanto este comportamiento es inherente a1 sistema yno al tipo de proteinas. ­

La presencia del frente proteico podria erlicarse por losdistintos cambios de movilidad provocados en las proteínas y enel ion lento glicinato por 1a presencia de SDS: las proteínassufren un gran incremento en su movilidad al formarse complejosde gran tamaño altamente cargados proteina-DS, pero no sucede lomismo con el glicinato que debido a su pequeño tamaño, une pocosradicales "DS, resultando un complejo poco cargado.

Dejarian de cumplirse las condiciones requeridas por lateoria de Ürnstein (57) para la separacion proteica al pH del gelde separacion: la movilidad de las proteínas debe ser menor al delos iones rapido y lento que forman el limite movil.

- INFLUENCIA DEL DH DEL_@Í_—"_|=__.Qlí__.SEEfitï_GQ.llJJH

Siendo el pH uno de los parametros fundamentales que fija lacarga de las proteinas y por ende su movilidad, su determinacióne importancia es obvia en el sistema discontinuo de Davis (56).Sin embargo no se ha estudiado la influencia de variaciones de pHen presencia de SDS, probablemente por considerarse que la carganativa incide poco en la separacion.

No obstante, puede observarse en fig. a y 4, pequenosaumentos en el pH del gel de separacion producen dos efectosopuestos: un aumento de la movilidad del glicinato y una disminu"cion de 1a movilidad de los complejos proteina-DS capaces demigrar libremente.

A las concentraciones de acrilamida donde existe frenteproteico, este efecto opuesto produce la separacion de las pro­teinas que migran con el limite movil. A1 separase del frenteproteico los complejos proteinawDS, euiste un aumento aparente desu movilidad, pero cuando migran libremente, se comportan demanera general disminuyento la distancia recorrida con el aumentodel pH.

Hoffman y col. (152), han observado cambios en la resolucionproteica modificando el pH del gel de separacion en susupaee.Aumentandoel pH del gel de separacion de 8,90 a 9,20, conside­ran la resolución obtenida en sistema discontinuo a l2 Z de a­crilamida, superior a la obtenida en gradiente de poliacrilamida.

A los pH estudiados, a 7,5 Z de acrilamida, el efecto tamizes bajo y existen proteinas que migran en el frente movil. Elaumento de pHnecesario para resolver este frente proteico, esimportante provocando gran distorsión en la nitidex de las bandas

A 10 Z de acrilamida, el frente proteico se resuelve conpequeños aumentos en el pH.

A 2,6 Z de acrilamida no aparece frente proteico, perodisminuciones de pH pueden incidir en la resolucion de zonasintermedias de P.M. (entre 5.000 y 18.000 D), resolviendosealgunas bandas en dobletes, en el caso de proteínas musculares depescado.

La resolucion electroforetica de las proteinas en sistemadiscontinuo dependeria de los siguientes parametros:

—un aumento considerable de la movilidad de las proteinasal unirse al SDS, que no esta acompafiado por un aumento similarde 1a movilidad del ión lento glicinato;

—esto origina que complejos proteinauDS de bajo P.M. nopuedan migrar correctamente al ser frenados por la baja movilidaddel ion glicinato formandoun "frente proteico”;

- pH: aumentos del mismo provoca una disminución de lamovilidad de los complejos protnüñ y un aumento de la del glici"nato, siendo necmsario en los casos en que hay proteinas de bajoP.M. retenidas en el frente movil; disminuciones puede provocarmejores resoluciones de determinadas zonas.

- INFLUENCIA DEL pH DE|=_._filíl=_..llfá-12{EQEMLLQIQN

Aún estan en discusion las ventajas del sistema discontinuosobre el continuo, admitiendose que las ventajas relativas decada sistema se anulan cuando los volumenes de siembra son pcmquefios (55).

De nuestros resultados se concluye que el pH del gel deconcentracion no es importante, ya que variaciones hasta de dosunidades no arrojaron diferencias, aún cuando el volumen desiembra fue cinco veces superior en un caso que en otro. E1efecto del gel de concentracion también ha sido cuestionado porotros investigadores (153).

La falta de inclusion del gel de concentracion trabajando entubo tampoco influyo en la resolucion. Para trabajar en placas selo incluyo por razones tecnicas, ya que 1a gelificacion de] gelde separacion es dificultosa con el peine inmerso en presencia deSDS por formacion de pequeñas burbujas de muy dificil elimina»ción. Estas pequeñas imperfecciones en el gel de separacióninciden notoriamente en forma negativa en la resolucion obtenida.Se prefirió realizar la gelificacion del gel de separacion comoes habitual e incluir el gel de concentracion, fundamentalmentepor razones de practicidad (al igual que en sistema continuo altrabajar en placas). El "gel de concentracion“ seria en realidadunicamente un gel de menor concentración de acrilamida.

Dado que el buffer del “gel de concentracion" no difiere en1a composicion del buffer de separación sino en el pH, podriautilizarse el buffer del gel de separacion para los dos geles. Sedisminuye asi el tiempo de corrida considerablemente.

Existen por tanto 2 factores que influyen en la separacionde proteínas en presencia de SDS: el efecto filtrante del gel yel pH del gel de separación. Del estudio en paralelo de ambosfactores se concluye que el efecto del pH depende del efectofiltrante del gel.

De nuestros resultados se concluye : cuando interesa sola»mente la resolucion proteicas de una determinada xona de P.M.,puede trabajarse en las condiciones de Laemmlimodificando unica­mente la concentracion de acrilamida (7,5 Z o 12,5 Z de acrilamimda a pH 8,8 para proteinas de alto y bajo P.M. respectivamente).

Si se desea una correcta resolución proteica en todo elrango de P.M., se debe utilizar las condiciones de Laemmli (10 Zacrilamida) pero aumentando el pH a 9,20. Estas condicionesserian por ende las mas indicadas para el analisis y caracterira"cion de proteinas alimentarias, donde la resolucion electrofore­tica se utiliza comohuella dactilar característica para cadatipo de proteinas.

Sin embargo, cuando el interes se centraliza en un rangoparticular de P.M., la variación no solo de la concentración deacrilamida, sino tambien del pH pueden mejorar la resolucion enla zona de interes específica.

4.2 SISIEUB QQNTINQQ

Se estudiaron las mismasconcentraciones de acrilamida quepara sistema discontinuo. Weber y Osborn (59), utilizaron un pHen gel de corrida de 7. Para estudiar 1a incidencia del pH endicho sistema, se probaron modificaciones a 6,55 y 7,45.

Se utilizaron proteinas patrones de Sigma de 14.600 a 66.000D. La electroforesis tambien se interrumpió cuando el frente decolorante alcanza el borde inferior del gel de mas rapida migra­cion, aunque en este sistema las variaciones de distancia migradapor el frente de colorante fueron leves.

Las resoluciones electroforeticas obtenidas no presentabanfrente proteico a ningun pHni a ninguna concentración de acril­amida.

Se midió la distancia migrada por cada proteina y el frentede colorante en los densitogramas.

El aumento de pH a cualquier concentración de acrilamidaproduce muy leve aumento de 1a distancia migrada, tanto para elfrente de colorante, comopara cada proteina, de manera tal quela movilidad relativa se mantiene constante con el pH para cadaproteina ( diferencias con el sistema discontinuo, fig. 4).

En la fig. 10 se representa la relacion entre el log P.M.de las proteinas patrones y su movilidad relativa. En la medidaque el Rf no varia con el pH, se obtiene una sola recta para los3 pH a cada concentracion de acrilamida.Por otro lado, a las tresconcentraciones de acrilamida, la relacion obtenida es lineal.DISCUSION

En sistemas continuos, el aumento del pH produce sobre lasproteinas un efecto contrario al producido en el sistemadiscontinuo, ya que aumenta la movilidad de las proteinas con elpH, aunque levemente.

La falta de influencia del pH en sistema continuo en cuantoa la aparición o no de un frente proteico, se debe a la inexis"tencia de un frente movil (ion rapido/ion lento).

Debido a esto, aunque los complejos proteina-DS posean altamovilidad, migran libremente. Aun los complejos proteina-DS debajo P.M., al no ser frenados por el límite movil, migran libre­mente sin formacion de frente proteico.

Debido a la gran difusion del sistema de Laemmli y a laexcelente resolucion que se obtuvo de una muestra compleja comolas proteinas musculares, se decidio continuar utilizando dichosistema.

Por otro lado la falta de influencia del gel de concentre"ción, permite 1a no inclusión del mismoa1 trabajar en tubos;esta simplificación facilita su utiliaación (principal ventajadel sistema-continuo). Al trabajar en placas es necesario utili­

58

zar un gel de baja concentración de acrilamida ( al igual que ensistema continuo), pero no necesariamente con buffer de distintopH como el sistema originario de Laemmli (como se vera mas ade­lante).

WE.JEEÜMN_PBQLELNBS_REJES_CMQSe estudió el grado de similitud en el perfil electrofore­

tico obtenido de las proteinas calentadas respecto al de lasproteinas musculares de merluza fresca y la aparición de unfrente proteico segun el pH del gel de separación. Debido a que a10 Z de acrilamida se observa claramente la influencia del pH ensistema discontinuo, se eligio esta concentración de acrilamidapara estudiar el comportamientode las proteínas calentadas.

Se trabajó en placas de 80 X 80 mmcon capacidad para ómuestras. Se corrieron simultaneamente y al mismotiempo 4 placasdiferentes:- 2 placas con el mismo pH del gel de separación (8,72), y dife­rentes pHs del gel de concentración (6,8 y 7,8).- 2 placas con pH del gel de separacion 9,15, una de ellas con pHdel gel de concentración 6,8 y la otra con pH 7,8.

En cada placa se sembraron proteinas musculares de merluzafresca y con distintos grados de tratamiento termico:1 hora IOOOCcon calor seco;1 hora 100 OCcon calor humedo; autoclavado 1200015 min. y 2 muestras esterilizadas industrialmente de diferentesmarcas comerciales.

La variación del pH en el gel de concentración no produjodiferencias en la resolución. En la figura 11 se observan lasresoluciones electroforeticas obtenidas; los densitogramas co­rrespondientes se observan en las figuras 12 y 13.

En las resoluciones y densitogramas obtenidos se ob5erva: a)desaparición del frente proteico con el aumento del pH, desarro­llándose en 5 bandas bien diferenciadas; b) el paralelismo entrela resolución electroforetica de las proteinas musculares de lamerluza fresca y con distintos grados de calentamiento, existien­do constancia del Rf de las distintas proteínas que no se afec­taron por el calentamiento; c) que el calentamiento, seco ohúmedo, hasta 100 C no afecta la resolución electroforetica; d)que el perfil electroforetico de las muestras comerciales esteri­lizadas industrialmente, coincide con el perfil de la muestraautoclavada en el laboratorio.

Los tratamientos térmicos intensos comoel autoclavado a12000 por 15 min. o la esterilización industrial afectan laresolución, obteniéndose mas fondo y desapareciendo total o par­cialmente las bandas correspondientes a proteinas de alto P.M..Asi, no se detecta la banda correspondiente a miosina y decreceen forma apreciable la intensidad de la correspondiente a la B­actina.

Con el objeto de mejorar la resolución y disminuir el fondo

59

de ac.

pH:9,15

F CS CH IX MG MC

hflEfïLlJZ A

},

,;CI—C1 10.0

q

65.?‘81?.4.

12,6 % ac

‘ ..1 - v .

45'11:

elativa en sistema contiLog. del P.M. de las proteinas patrones en función de su

oI d

b

1movilidad r

S-Ol_x.|Nud

Fi

o F:C); C.H.:A.

Lasa der.:

tautocla­a 100

ie agua);esterilizadas industrial­

igual tiempo.De izq.

placas con diferente pH

eco (1 h.paño c

sen bC

o

/ muestra“

a calor sru

(1 H. 100a 12000; M.C.:

sometida

mente de distintas marcas comerciales.

8.:sembradas corresponden a merluza.

C.

11:Efecto del tratamiento térmico:

muestra fresca;

en el gel de separación corridas en paralelo,

sometida a calor húmedo

muestras

vada (15 min.

Fi

¡"gunA

LM..

CALORSECO

1h100‘C

3L

rQ

1h10°C

cnonHUIEDOíJ

AUTOCLAVADO

15'‘20"C

M.COMERCIAL

e\ CW

<5 É‘ 1 (5x” l:5

Á

M.COMERCIAL

1-0)— 1:9u o

- BuIIDV-O

Fig.12:Densitogramasdemerluzafrescaysome­ tidasadiferentestratamientostérmicos.ElpH delgeldeseparaciónes8,72.Elcomienzodel geldeseparaciónseindicaconlaletraS.

J'1

uuwn.

Papua.» A

’¡nanny‘

CALORseco

n.1oo-c_

CALORHUMEDO

1h100’C

/ AUTOCLAVADO

15-120'c

‘ju.couzncnu

uv"l I

Mu.COMERCIAL

grÉL. .

BUIJOV'

Eig.13:Densitogramasdemerluzafrescaysome’tidasadiferentestratamientostérmicos.ElpH delgeldeseparaciónes9,15.Elcomienzodel geldeseparaciónseindicaconlaletraS.

obtenido en las muestras con calentamientos drásticos, se ensaya­ron otros metodosde desengrasado, utilizando etanol-eter (2:3) ycloroformo-metanol (1:1), comprobandose que si bien la etapa dedesengrasado es necesaria, los diferentes solventes no presentanventajas apreciables entre si.

Tambien se ensayo 1a inclusion de EDTA en la solucionextractiva y de diálisis para descartar las interferenciasiónicas. En ninguno de estos casos mejoro la resolucion.

La distinta sensibilidad de las proteinas al tratamientotermico de acuerdo a su P.M. se estudio dividiendo el proteino­grama en 3 areas correspondientes a G-Actina (P.H. 45.000-47.000D), proteinas de P.M. intermedio ( 45.000- 28.000 D) y proteinasde bajo P.M. (menor de 28.000 D), identificadas como A,B y Crespectivamente (figura 13).

En la figura 14 se ha graficado la relacion de areas densi­tométricas; la comparacion de las mismasa traves de las rela­ciones B/A y C/A muestran que los tratamientos de autoclavado yesterilizacion industrial afectan en forma mas pronunciada a laG- Actina que a las proteínas de P.M. intermedio y bajo, por loque dichas relaciones aumentansignificativamente.

La relación C/B si bien se modifica en mucho menor medida,tambien demuestra una menor sensibilidad térmica de las proteinasde P.M. bajo con respecto a las de P.M. intermedio.

Aplicando esta metodologia para muestras esterilizadas in­dustrialmente de las que se conocia la especie, se obtuvieron lasresoluciones electroforéticas de la figura 15.

Se observa que los perfiles obtenidos son diferentes ycaracterísticos de cada especie, diferenciandose estos a su vezde los obtenidos para la merluza enlatada.

DISCUSION DEL TRATAMIENTO TERMICO

El comportamiento observado a 10 Z de acrilamida, conaparicion de un frente proteico o resolucion del mismosegún elpH del gel de separación y la no influencia del pH del gel deconcentracion, se observa no solo para proteinas musculares depescado fresco, sino tambien para muestras calentadas aun porarriba de 100 C.

Un calentamiento seco o húmedo hasta 100 oC durante unahora, no afecta la resolucion obtenida. Tampocoexiste diferen­cias en la movilidad de las bandas proteicas.

En los tratamientos térmicos por encima de 100 oC, deacuerdo a las resoluciones obtenidas y al grafico de areas, seobserva:

- la aparicion de un fondo continuo coincidiendo con losresultados de otros investigadores (88) (90). Esto indicaria laexistencia de nuevas proteinas no diferenciables por su F.M. Estose explicaría por formacion de uniones amida intercatenarias quese producen a temperaturas por arriba de 100 C (101). Las ruptu­ras y uniones al azar que se producen, darían origen a nuevas

60

RELACIONDEAREASDENSITOMETRICAS

T

B/AC/AC/B

Él:

z UO:H“UH<.—I

l: UOIHGOH<Q

<=>HOU>J<QO

:I:'uoxmon<A

I: UOZNMUH<A

<9HOUA<><DO

(Junin-anoumuuchaci-11.000

Fig.14:Relacióndeáreasdensitométricascorrespondientesalos densitogramasdelasmuestrasindicadasenFig.13,conpHdel geldeseparación9,15.AreaA:G-actina(P.M45.000-47.000D); áreaB:proteinadeP.M.28.000-45.000D;áreaC:proteinasde P.M.<28.000D.

m__u_u;mcnou_o:¡»cun .COIIEI

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4S

Big.15:Densitogramasdedistintasmuestrascomercialessometi­ dasaesterilizaciónindustrial.ElpHdelgeldeseparaciónfue 9,20.ElcomienzodelgeldeseparaciónseindicaconlaletraS.

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PELA.¡a

cadenas no separables de acuerdo a su P.M., originando el fondoobservado.

- la disminución de la solubilización proteica no seria lacausa de las modificaciones del perfil electroforetico, puestoque 1a aparición de un fondo continuo, esta indicando la solubi­lización de proteinas. A1estudiar posteriormente la solubilidadde proteinas musculares bovinas (punto 4.7.1), no se obtuvieroncambios en 1a solubilidad con muestras calentadas por arriba de100 C, aunque los cambios en la resolución electroforetica{ueron similares a los obtenidos para proteínas musculares depescado. Resultados similares se obtuvieron para proteinas desoja con calentamientos superiores a 100 C (punto 4.6.1).

- existe distinta sensibilidad de las proteínas al trata"miento termico segun su P.M.: las proteínas con P.H. por encimade 47.000 practicamente desaparecen (desaparece la miosina), elpico de la B-Actina sufre una gran disminución, siendo las pro­teinas de menor P.M. las que sufren menor deterioro.

Estos resultados coinciden con que la energia de activaciónde la miosina es inferior a la de 1a actina (154).

Esto indicaria que solo la G- actina y las proteinas deP.M. inferior podrian ser de utilidad para la identificación deproteinas animales sometidas a procesado termico severo.

La G-actina por ser un pico muy intenso en la muestrafresca, aun cuando se ve afectado por el calor, aparece comounpico importante, pudiendo ser utilieado comoreferencia en laresolución obtenida, ya que con fines identificatorios tiene pocovalor, por ser un banda importante en diferentes especies.

Al comparar estos resultados con los obtenidos por Hofmann(BB) en proteinas musculares de origen bovino, se encuentrasimilitud en cuanto a la falta de desplazamiento de las bandasproteícas, mayor disminución de la intensidad de la miosina conrespecto a la actina y aparición de fondo en muestras calentadaspor arriba de 100 C. Dicho ivestigador atribuye la disminuciónen la intensidad de las bandas a1 menor número de grupos funcionnales responsables de la unión a1 colorante; sin embargo 1aaparición de un fondo en todo el rango de P.M. esta indicando laexistencia de proteínas capaces de unirse a1 colorante.

Los cambios en el tipo de uniones peptidicas con apariciónde nuevas cadenas no diferenciables de acuerdo a1 P.M., podríaser la causa real de la disminución de la intensidad de bandas yde la aparición de fondo de tinción.

En los perfiles electroforeticos obtenidos para las distinwtas especies de pescado sometidos a esterilización industrial seconstata:

- a) la zona de P.M. mayor de 47.000 D, no puede ser utilimzada con fines de identificación ya que esta altamente influidapor el tratamiento termico, si bien se observa en algunas mues"tras (Pinguipes spp, ScomberJaponicus) aparición de picos dealto P.H.. Es de hacer notar que el proceso de esterilizaciónindustrial puede ser menosdrastico que el ensayado en laborato"rio debido al efecto protector de las sales presente en las

61

muestras;- b) existe constancia en la migracion de 1a Bmactina,

cuya mayor o menor intensidad depende en gran medida del procesa"do termico. De esta manera, la actina tiene poco valor identifiwcatorio, confirmando lo hallado por otros investigadores (94),siendo solo de utilidad comobanda de referencia.

—c) las zonas de proteinas de P.M. intermedio y bajo semantienen igualmente delimitadas en las distintas especies,radicando en 1a resolución de estas zonas la clave para la iden­tificación de las mismas.

- d) si bien en las distintas especies aparecen las mismasbandas proteicas, ellas presentan distinta intensidad relativa,siendo posible su identificacion. Aúnen aquellas muestras en lascuales el calentamiento produjo gran deterioro de las proteinas(Katsuwonus pelamis y Sardinella aurita), el perfil obtenido,observado en conjunto, permite su diferenciacion.Por tanto es demayOr utilidad el analisis global del perfil que la movilidadrelativa de cada banda en particular, al igual en en 1a identifiwcación de otro tipo de proteinas, por ejemplo cereales (128).

Se concluye que es posible la identificacion de muestrasesterilizadas industrialmente.

Se recomienda correr en paralelo la muestra problema y comoreferencia la especie a identificar, sin tratamiento termico ysometida a un tratamiento termico similar. Tambien Se recomiendatrabajar en placa, para facilitar la comparacion.

62

4.3 ESTUDIO DEL METODO DE CUANTIFICACIDN DE PROTEINAS EN ELEXTRACTO

La cuantificación proteica en la solucion extractiva esespecialmente dificultosa debido a las interferencias en el bufferde extraccion: SDS, 2-MEy Tris.

Para desechar diferencias en la cuantificación de proteinasde carne y soja y muestras con y sin calentamiento, se traba'ócon 3 muestras de harina de soja, una de ellas calentadas a 121 C15 min., 2 aislados de soja y 3 muestras de carne, una sin calen­tar, otra calentada a lOODCy la tercera calentada a 121 C 15min.

METODO DE BIURETEl método de Biuret se probo:- eliminando los tioles por calentamiento en B.A. a IOÜDC

durante 20 minutos, ya que según algunos investigadores (155), esposible asi eliminar hasta 1 Z de 2-ME.

- directamente en el extracto con algunas modificaciones,utilizando Na EDTAcomocomplejante para eliminar las interferen­cias de los tioles (156).

- eliminando previamente las interferencias segun Lee y col.(110), por precipitación previa de las proteinas con acetona,resuspension y lavado del residuo 2 veces con acetona y posteriordisolucion de las proteinas en NaÜH; una ve: eliminadas lasinterferencias se aplica el metodode Biuret clasico (157).

La eliminacion de los tioles por calentamiento en B.A., nodio resultados satisfactorios. En los otros dos casos se obtuvie­ron porcentajes de extractabilidad de alrededor del 70 Z respectode la proteina original determinada por Hjeldahl. Estos porcen­tajes de recuperacion se consideraron bajos.

METODO DE LDWRY

Se probó el método de Lowry (158) eliminando también lasinterferencias segun Lee (110), con proteinas sericas comoreferencia. Los resultados tambien oscilaron en 7D Z .

Se penso que podian existir diferencias entre los metodos deKjeldahl y de Lowry/Biuret ya que para proteinas de pescadoMartone y col.(159), encontraron diferencias del 30 Z entre losdos primeros métodos (Hjeldahl/Lowry = 1,3), valor que coincidiacon nuestros resultados.

Otra posible causa de los bajos porcentajes obtenidos podriaser ineficiencia de algun paso del procedimiento. nsi podria serincompleta la extraccion de proteínas en el buffer de extraccion,ya que en algunas muestras es comun la formacion de un residuo engeneral tipo gel. El grado de formacion de estos residuos serelaciona en general con el porcentaje de polisacaridospresentes, siendo muyelevado por ej. en productos farinaceos; enmuestras con bajo porcentaje o ausencia de polisacaridos ladisolución es total, por ej. aislados de soj, yemay huevo en

63

polvo, caseina, gelatina, etc. En los productos cárnicos tambienes comunla formación de cierta cantidad de gel, aunque en estecaso no se relacione con polisacaridos de alto P.M., sino confibra muscular insoluble.

Para establecer la posible causa/s de los bajos porcentajesde extractabilidad obtenidos, se procedió a realizar determina­ciones de N en cada paso por microneldahl. La última etapa serealizo microneldahl en paralelo con Lowry.

Se siguió el siguiente esquema, trabajando por duplicado concada muestra.

MUESTRADESGRASADA (Hieldahl)

extracción (buffer Tris, SUS,2_HE)

l |

RESIDUOM) Proteinas extraídaslavado 2 veces con PRECIPITAÜIUN CÜN ACETUNA

acetona l ÍI proteina precipitada SN(B)

Idisolución con NaÜHIl

precipitadom) SN«a—- a Hjeldahl

2 lavados con acetonaKjeldahl

disolución NaÜH

Kjeldahl Lowry(dup) (dup)

Proteinas no extraibles. El residuo de extracción (A) selavo 2 veces con acetona para extraer el Tris del buffer quepudiera quedar retenido, aunquepor las caracteristicas tipo gelde este residuo, era poco probable la eliminación completa delTris. En este residuo se realizó microneldal, hallandose valoresde proteínas no extraídas de 3,8 a 8,1 Z en las muestras de carney de 2,5 a 5,4 Z en las harinas de soja.

Precipitación de proteínas por acetona. Para determinar silas proteinas extraídas son insuficientemente precipitadas poracetona. el SN de cada precipitación (B), trabajando en cadamuestra por duplicado, mas los SNdel lavado del residuo, sejuntaron; luego de evaporar la acetona, el residuo se disolvió enNaDHy se realizó microKJeldahl. Se realizó un blanco de bufferde extracción para descontar el N del Tris. De las 5 muestras seobtuvo 4 Z de proteinas no precipitables, no siendo el Trisprecipitable con acetona.

Diferencias del Métodode Lowryy de Kjeldahl.Las proteínas

extraibles y precipitables por acetona (C), una vez disuelta enNaOH se les determinó proteinas en paralelo por Lowry y micro­Kjeldahl, cada muestra se analizó por duplicado. Las diferenciasentre ambos metodos fue del 5 al 10 Z .

El valor de proteina hallado por Lowry, respecto de la deter­minacion de Kjeldahl en la muestra de partida fue de 73 a B4 Z.

CAMBIO DE PRDTEINA DE REFERENCIA

Al cambiar de proteinas de re+erencia, de proteinas sericasa albúmina, los porcentajes de extractabilidad {ueron desparejosy superiores al 100 Z en algunos casos.

Si bien se habia descartado precipitación del Tris poracetona, se penso que podia quedar parte ocluido en el precipita“do de las proteinas.

Para estudiar cual era el patrón de proteinas mas convenien­te a utilizar, se sometió la albúmina al mismotratamiento que lamuestra; la precipitación con aCetona se realizó en paralelo conTCA20 Z para comparar ambas.

Se realizó Lowrysobrel- albúmina directa

albúmina pasada por acetona- albúmina pasada por acetona, disuel­

ta en bufier de extracción y precipitada con acetona- idem precipitada con TEA20 Z

Se observó: el pasaje por acetona elevaba levamente laabsorbancia de la albúmina; no habia practicamente diferencias en1a precipitación con acetona y TCAgla albúmina sometida al mismotratamiento que la muestra daba valores superiores en un 9 Zrespecto a la albúmina directa.

Esto canfirmaria que en la precipitación de proteinas poracetona o TCA,quedaria ocluido Tris en el precipitado aumentandoluego la cantidad de N.

Se trabajó con los extractos de una muestra de harina desoja y otra muestra de carne en la precipitación en paralelo conTCA20 Z y acetona. Se encontró que no existían diferencias entreambas precipitaciones. Los porcentajes de proteinas de estasmuestras, tomando como patrón albúmina sometida al mismo trata­miento fueron de-95, 48 Z para harina de soja y de 91,36 Z paraproteina de carne, respecto de la proteina en la muestra originaldeterminada por Kjeldahl.

Finalmente se eligió el metodo de Lowry realizado como sedetalló en materiales y metodos, punto 3.3.3.

65

942-5L5IEMBS_HQDEL-DnCARNETSQQ

4.5.1 EXTRAÜTABILIDAD

Influencia del pHde la solución extractiva

A] trabajar en presencia de SDS, algunos investigadores rea"lizan la extracción proteica a pH 6.8 (condiciones de Lamemmli)(72)(110), mientras que otros investigadores la realixan apH 8,5(115).

Dado que el pH es una variable fundamental en la solubilidadde proteínas, se considero de interes estudiar la influencia delmismo cuando la extraccion proteica se realiza en presencia deSDS.

Se determinó la extractabilidad y la resolucion proteicaobtenida a 2 pHsdiferentes. Se thrajeron proteinas muscularesde origen bovino y distintas muestras de proteina de soja consolucion extractiva de pH 6,80 y pH 8,60.

En las resoluciones electroforeticas obtenidas (fio. 16), nose observan diferencias tanto para proteinas musculares comoparaproteina de soja.

Se determinaron los porcentajes de extractabilidad a los dospH para las distintas muestras, ya que si bien no se encontrarondiferencias en la resolucion, podria obtenerse distinto grado deHtracción. Los valores hallados figuran en la tabla l.

'líálll I} 1EXTRACTAEILIDAD PROTEICA DE SOJA Y PRDTEINMS NUSUULHRES h DIFE"RENTES pHS.**************************i******E****%*****KN********ifi*%ü****ü*Muestra Porcentaje de extractabilidad

pH 6,80 pH B,ó0

Halesoy PDI 85 90,65 103,9" PDI 15 91,5 91,25" PDI 15

121 C 15 min. 9b,71 87,76Concentrado 93,27 V4,4

Prot. musc. 1 88,04 HV,5Prot. musc. 2 89,6 87.0******************'I'****-l'¡"l-ii **-*-*********** ¡6*"li-N-ü-I-H-‘K-Iii-ñ”)?­

Para las cuatro muestras de soja, se aplico test de Studentpara diferencia de medias. No se encontro diferenciasignificativa (D.S.) m con P í 0,0F. Para las 8 GHLÏGCCÍUHÜSseobtuvo un valor medio X = 93,56 con desviacion estandar s u 4,62.E1 error relativo de la extraccion medida por el coe+iciente devariación (C.V.) fue de 4,94 Z .

Para las dos muestras de proteinas musculares, tampoco se

66

encontró diferencia en la extractabiLidad a los 2 pHs. Para las 4extracciones, el valor medio fue de X=88,53, s=1,25 y C.V.=1,40 Z

Influencia del tiempo de calentamiento

A1 igual que con el pH, los tiempos de calentamiento a quese somete la muestra para la extraccion de proteinas (en bufferTris-HCl con SDSy ME), varian según los distintos investiga­dores. Tanto en el sistema original de Laemmli, como en poste­riores aplicaciones (72) (110), se realisa la extraccion concalentamiento de 15 min. en B.A. a 10000. Dado que otros investi­gadores realizan la extraccion con calentamientos de solo 3min.(160), se estudio la extractabilidad y resolucion electrofo­retica con tiempos de calentamientos diferentes.

Para estudiar la influencia del tiempo de calentamiento enla extraccion, se extrajeron muestras de soja y proteínas muscu­lares con tiempos de calentamiento de 5 y 15 min. No se encontra­ron di+erencias ni en la resolucion ni en la extractabilidad.

4.5.2 ELECCION DE BANDAS CARACTERISTICAS EN MEZCLAS

Para estudiar las mejores condiciones de separación de pro­teinas carnicas y proteinas de soja, se probaron las siguientescondiciones de concentración de acrilamida y pH del gel deseparación:- 10 Z de acrilamida, pH del gel de separacion 8,80 y 9,20.- 12.6 Z de acrilamida,pH del gel de separacion 8,60, 8,80 y 9,20

De las resoluciones electroforeticas obtenidas se pudo ob­servar:- a 10 Z de acrilamida pH 8,80 aparece un frente proteico impor­tante tanto en la proteina de soja comoen las proteinas muscu­lares; a pH 9,20 hay resolución del mismo.- a 12,6 Z de acrilamida, no se obtiene ningun desdoblamientoadicional trabajando a pH8,60 respecto de 1a resolución obtenidaa pH 8,80 (figura 17); a pH 9,20 disminuye mucho el largo totalde corrida.

En los densitogramas de ambos tipos de proteinas, en los queno aparecia {rente proteico, se pudo observar (figura 18)):

- las proteinas de carne presentan un perfil electroforeticocomplejo, siendo los picos principales los correspondientes a :actina, P.M. estimado 45.000 D; miosina P.M. estimado 220.000 D y1a mioglobina/miosina cadena liviana 2, P.M. estimado 17.500 D.

- la proteina de soja en cambio presentan cinco picos prin­cipales con los siguientes P.M. estimados: 68.500, 67.000,52.000, 39.500 y 19.500 D.

- de la superposición de ambosperfiles, surge: a) el picode PM19.500 de 1a proteina de soja es fundamental para su de­tección y cuantificación, por constituir uno de los picos mayori­tarios y aparecer en un valle del densitograma de proteina muscu­lares; b) el pico de soja P.M. estimado 67.000, tampoco se super­

67

p1 p1 p2 S1 S1 S’2 8'2 S3 83

pH 6.88585 638585358563

Eig. 16: Influencia del pH de extracción en muestras de proteinade soja y musculares: PM y PM2proteina musculares;S concentra­do de soja; S : harina d¿ soja PDI 15; 82’: 82 calentada a lOOoC,15 min.; sa: Éarina de soja PDI 85.

_ _ 4 _ -, . xa

l E . . I. a \un.- a - -..4c “ ‘. .. a. ¿ . - .— — _—- , . i _

N

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EF! T“. "' ‘t! 9-9 EEB‘F-B‘EE! ‘JO.ln. ¡a t""‘|

31:“, “"1.P'fi“. t”:'C ¡aA!!!

pH 8,8 3 pH 8,6

P s P S l4,9 9,8 18,2 29.5 96 PROT. SOJA 1

29 4.2 9.1 145 96 HARINA SOJAC

J

7: Resolución electroforética de proteinas musculares y desoja y dist1ntas mezclas de ambas, a 12,6 Z de acrilamida y pHdel gel de separación 8,60 y 8,80.

a“)

4 419500 39500 52000 67.000 SOJA

A 4x 417.500 45000 220000 P. MUSC­

Eig, 15: Densitogramas de proteinas musculares y proteina de sojasuperpuestos, a fin de caracterizar bandas de soja y carne condiferentes Rf utilizables para la identificación respectiva (12,6%de acrilamida. pH 8,80).

pone contribuyendo en la detección; c) el pico de P.M. estimado52.000 se superpone con una banda minoritaria de 1a carne, aumen­tando por ende su concentración relativa respecto de las bandasde carne adyacentes; d) el pico de soja de PMestimado 39.500, apesar de ser un pico mayoritario de soja, se superpone confracciones proteicas tambien mayoritarias de las proteinas muscu­lares, siendo por lo tanto de poca utilidad en este tipo demezclas; el pico de F.M. 68.500 es poco intenso y se superponecon proteinas de la carne.

4.5.3 CUANTIFICACION DE PRDTEINA DE SOJA

Se trabajo con sistemas modelo de mezclas carne fresca-sojadonde la soja aportaba 4,9 Z, 9,8 Z, 18,2 Z y 29,5 Z de proteinatotal presente, lo que implicaba porcentajes de harina de soja enla mezcla original del 2,0 Z, 4,2 Z, 9,1 Z y 14,6 Z . Dichasmezclas agf como1a carne sola y harina de soja sola, se calenta­ron a 100 C durante 15 minutos con calor húmedo.

Los porcentajes de extractabilidad que se obtuvieron paraestas muestras fueron:

Z de soja en las mezclas 2.0 4,2 9,1 14,6

Z de extractabilidadde total de proteinas 94.6 93,7 5,8 100,3

Las resoluciones electroforeticas de las meaclas a 12,6 Z deacrilamida, pH 8,80 y 8,60, se observan en figura 17.

En los densitogramas respectivos (figura 19), se indican conflechas los picos que corresponderían a soja. A1 comparar estosdensitogramas con el perfil de proteinas musculares sin soja, seobserva la aparicion de nuevos picos (P.M. 19.500 y 67.000 D), oel aumento relativo de picos ya existentes (P.M.39.500 y52.000D).

Puede observarse que la proteina de soja es detectable aúnen la menor concentracion utilizada 2 Z de agregado a la mezclainicial).

Se calculó el area para el pico de P.M. estimado 19.500 y52.000 D; se grafico para estos picos area vs cantidad de protei­na sembrada (figura 20). Los coeficientes de correlación paradichas rectas fueron r = 0.989 y r = 0.992 , respectivamente.También se grafico la relacion de areas de los picos de P.M.19.500 y 52.000 D de la soja respecto del área del pico de laactina, vs porcentaje de proteína de soja respecto del total deproteínas. (figura 21). Se obtuvo relación lineal para ambasrelaciones con coefientes de correlacion r = 0.995 y r = 0.994respectivamente.

68

1 PROÏ. SOJA

18.2

9.8

m9

PM.

1 HAR. SOJA

lkó

il

[‘12

2.0

' Densitogramas de proteinas musculares (PM)y de distintasmezclasindican

con proteina de soja (12,6 %de acrilamida y pH 8,80). Secon flechas los picos atribuibles a proteina de soja.

(3mm)sea]?oh {Ü S ZL zdFT

PM19.500

r=.989nnmszooo//

r:992,///,

14.16

' ms87 .ze soja

“9

EigizgzAreasdelospicosdeP.M.19.500y52.000Ddeproteinade soja,vscantidaddeproteinade sojapresenteensistemamodelosoja­ carne.

ln lO

-N

¿960’s B 3'1 "B ep ¡19 !'O'B['9'1

9Ll' ÜLLO'

1"H’oo/actitia

r:.993

./

suWWGcfina/

7:.994/

162%sojgas

Fig,21:Gráficodelarelaciónde áreasdelospicosdesojadeP.M.19.500y52.000Drespectode1a actina,vsporcentajedeproteinadesojarespectodeltotaldepro­teinas.

DISCUSION

De acuerdo a los valores obtenidos, no eH'ste diferencias enla extractabilidad a pH6,8 y 6,6, ni para distintas muestras desoja. ni para proteinas musculares. lamnocoexisten diferenciasnotorias en 1a resolucion obtenida ambospHs de extraccion.

Por otro lado, el tiempo de incubacion en la extracciOnempleadopor algunos investigadores es excesivo, siendo suficien­te tiempos de calentamientos de 5 min.

De las cinco bandas principales de soja, no se superponencon bandas de las proteinas musculares, unicamente las de P.M.estimado 67.000 y 19.500 D. Las proteínas musculares presentan unperfil complejo con d'an cantidad de pic s, siendo el pico deP.M. 19.500 1a unica banda mayoritaria de la soja que aparece enun valle de proteinas musculares. Debido a esto, este pico esfundamental para la identificacion y cuantificacion de soja eneste tipo de mezclas.

En la medida que resulta fundamental la resolucion de lasona de bajo PH, se eligieron comolas mejores condiciones paraanalizar estas mezclas, 12,b Z de acrilamida y pH del gel deseparacion 8,80, ya que se obtienen los menores anchos de bandade los picos P.H. 1W.500y 60.000 utilisados comoconfirmatoriosde la presencia de soja. Por otro lado no existen picos de altoP.M. que interesen en este tipo de mesclas.

Las bandas de P.M. estimado 67.500 y 59.500 D ae auperponencon bandas mayoritarias de la carne, siendo de utilidad unicamen­te cuando 1a proteina de soja se encuentra en alta proporcion. Labanda de P.N. 52.000 D si bien se superpone con un pico minDFiLd“rio de la carne, su aumento relativo es de gran ayuda en ladetección aun cuando la proteina de soja se encuentra en bajaproporcion.

Otros investigadores (45) (161) han obtenido, trabajandotambién con SDSy ME,perfiles electroforeticos similares para lasoja. Asignan los picos de P.M. 19.500 y 39.500 D a la fraccion11 S de 1a soja y los picos de P.H. 52.000, 67,000 y 68.500 D ala fraccion 7 S de la soja.

El porcentaje de soja en las mezclas del sistema modelocarne-soja, se estableció de manera de cubrir el nivel de aditimvo y el de extensor, tanto en los valores establecidos por elCAA, como por el Codex Alimentarios.

Asi, el 2 Z de harina de soja es un valor sensiblementeinferior al 3,5 Z permitido por el CHA como aditivo, maHimecuando el CAAautoriaa este porcentaje de harina sola o en me2_clas con aislados (art. 323 bis). Se debe tener en cuenta que losproductos comerciales contienen un porcentaje de proteinas dealrededor del 12 1 contra EOZ que contiene lu carne- halo siqnifica que el agregado de 2 Z de harina de soja, que en el sistemamodelo correspondía a 5 Z de proteina de soja respecto del totalde proteínas, en un producto comercial representara un porcentajemayorde proteina de soja respecto del total de proteinas. Esto

69

implica un mayornivel de sustitución de proteinas carnicas porproteína de soja, que se reflejará en la resolución electrofore­tica en la modificación de la relación de picos de soja respectoa los picos de las proteínas musculares. El tema se analizarámas profundamente en el punto 4.10.5.

Por otro lado, el porcentaje maximode soja estudiado fue de29,5 Z respecto al total de proteinas, ya que el maximorecomendado por el Codex Alimentarius es del 30 Z .

De acuerdo a los resultados obtenidos en sistema modelo, esposible detectar la presencia de soja en mezclas soja-carne, enconcentración de 2 Z de harina de soja, equivalente a 5 Z respec­to del total de proteinas. Por tanto la metodologia seria adecua­da para la detección de soja a nivel de aditivo en productoscárnicos.

Para encarar el estudio de cuantificación de soja en estetipo de mezclas era necesario comprobar la relación lineal delarea del/los picos en estudio con la cantidad de soja sembrada.Se realizo para los picos de P.M. estimado 19.500 y 52.000 Dsiendo dicho aumento lineal.

Tambien se obtuvo relación lineal para 1a relación de picosde soja/actina.

Por tanto en principio, podria utilizarse cualquiera de losdos metodos en la cuantificación de soja en mezclas soja-carne.W4.6.1 EXTRACTABILIDAD PRÜTEICA: INFLUENCIA DE LA VARIEDAD DE

HARINA Y DEL TIPO DE PROCESADO

El estudio de la influencia de la variedad de soja y tipo deproCesado, en la extractabilidad de las.proteínas, es un pasoprevio imprescindible para la detección o cuantificación de sojaen mezclas proteícas.

Las variedades estudiadas y muestras procesadas, se detalla­ron en Mat. y Métodos (3.2.2).

Cada muestra se extrajo por lo menos dos veces, se determinóproteina en el extracto por metodo de Lowry (3.3.3. y 4.4) refi­riéndose al valor de proteinas en la muestra original determinadapor metodo de Kjeldahl.

Los valores de extractabilidad obtenidos para las distintasvariedades de harina figuran en tabla 2. Para estudiar siexistían di+erencias entre los distintos grupos, se aplicóanalisis de varianza (Anova) de un factor. No se obtuvodiferencia significativa entre las variedades connPí 0,05.Para eltotal de extracciones se calculó el valor medio X = 93,38, condesviación estandar S = 4,36.

Se realizó un estudio similar para las muestras sometidas adistintos procesos y distintos grados de calentamiento. Los re­sultados figuran en tabla 3. El analisis de varianza de un fac­

70

IflBLQWZI INFLUENCIA DE LA VARIEDAD DE HARINA EN LA EXTRACTABILI­DAD DE PROTEINADE SOJA. De izq. 8 der.: harinas industriales(HI1 y HI2), variedad Halesoy, Hardome y Coker Hampton.ii***************************************************************

H 11 H 19 HALESÜY HARDÜNE Ü.HAMPÏÜN

89,40 97,50 88,74 93,50 96,5691,88 91,25 92,56 88,08 90,2198,80 96,35 102,93 - —94,31 94,99 99,87 - —94,90 89,91 — n —90,95 85,41 — _ _

1

¡:8 93,37:3,36 92,57i4,ó7 95.88ib,41 90,7913,83 93,39i4,49n. = número de extracciones

ANOVA UN FACTOR: CDN P { 0,05 NÜ HUBO D.S.

PARA EL TOTAL DE MUESTRAS: n = 20 x t s = 93,38 Ï_4,36*****************************************************************

IQELQ_;I INFLUENCIA DEL TIPO DE PRDCESADO EN LA EXTRACTABILIDADDE PROTEINADE SOJA. De izq. a der.: harina tostada PDI 15, idemcon calentamiento posterior (10000 30 min. y 12100 15 min.),aislado, texturizado y concentrado de soja.**************************************************I***************

H.PDI 15 H.P81 15 H.PDI 15 AISLADÜS TEXÏUHIZADÜS CÜNC.100 C 30' 121 C 15'

88,58 99,60 96,70 99,00 86,85 93,9393,10 99,66 87,07 99,41 81,46 95,2594,15 88,66 96,34 95,06 94,4088,56 96,78 99,04 98,59 96,1093,1893,73

n 6 2 4 4 4 2i¡18 92,05:2,36 99,6310,02 92,29t5,15 98,4611,42 88,8416,16 94,92i0,96

ANDVA UN FACTOR: CON P < 0,05 NU HUBÜ D.S.

PARA EL TOTAL DE MUESTRAS: n = 24 í ¿.8 = 93,73 t_4,74******************************************************************

tor, no arrojo diferencia significativa con Fui 0,05. Para el'J’total de extracciones se obtuvo un valor medio X = 93.7o con des­

viación estandar S = 4,74.

Se realizo test de Student para diferencia de medias entreambosgrupos: no hubo diferencia significativa con P i 0,05.

Se calculo el valor medio y el intervalo de confianea conP < 0,05 de la extractabilidad de proteinas independientemente dela variedad de harina y tipo de procesado, obteniendose lossiguientes valores:

n = 44 í = 93,59 S = 4,52 Intervalo de confianza = 92,45-94,74

El valor de extractabilidad hallado, coincide con el deter­minado en el estudio de la influencia del pHen la extractabili­dad (punto 4.5.1).

Se calculo el error relativo para una determinacion indivi­dual por medio del coeficiente de variación :

C. V. = 8 X 100 = 4,83 z

4.6.2 PERFIL ELECTRÜFÜREILQQ

Se estudio la influencia de la variedad de harina, tipo deprocesado y distintos grados de calentamiento en la resolucionelectroforetica.

Las resoluciones obtenidas se observan enla fig.22 junto a1a del patron de P.M. .For observacion directa, no existe practi­camentediferencias entre las distintas muestras, siendo la únicadiferencia apreciable una pequeña cantidad de proteína que nopenetra en el gel de separacion en algunos casos.

En las fig. 23 y 24, pueden observarse los densitogramas.Las 5 bandas proteiúas principales se mantienen constantes paratodas las variedades y tipo de procesado.

En la variedad Halesoy se compararon los densitogramas obte­nidos para una harina sin tostar (PDI '5 y otra tostada (PDI15). En el caso de harina tostada unicamente la banda de P.M.69.000 D, disminuye ligeramente.

En la misma muestra luego de un calentamiento severo (1210€15 min.), aparecen unicamente las bandas de P.M.19.500 y 39.500 Dmuy disminuidas, con importante fondo a lo largo de toda lacorrida.

4 . ó . 3 CUANT I F I CAC I ON DE__QÜJA A PART I F\' DEJÏQQU__.__Qg1\!tj_;IQQÏESAMAQ

lflfLUENCIA DE LA VARIEDAD DE HARINA Y DEL TIPU DE PHÜCESADÜ EN“¿fis AREAS ESPECIFICAS

Se estudio el error global del metodo. Para ello, una mismamuestra de harina de soja se extrajo con 3 soluciones extractivas

72

l-‘50‘ ‘D—“­eegeeüüñ¡up-wm!!!iI‘Il sl:tt:

.-,4.pg.pq-pCIDC-D1ÍÍ‘I’Ú'....‘.’l ,, .fi , t ev vá fi?

A1 A2 T1 T2 “¡1

4EigL__agg:Resoluciones electroforeticas de muestras de soja some­tidas a distintos procesados. De izq. a der.:v aislado 1 (A1);aislado 2 (A2), texturizado 1 (T1), texturizado 2 (T2), harinaindustrial 1 (HIl, control de soja sin proceso). Las muestras sesembraron por duplicado, excepto HIl por triplicado.

m“-_-.—__

n-talla-D1-D1!DCID1ID1’H.I.CIMCI«¿mi :

c H H HÍ1 HI2 PPM Ha

: Resoluciones electroforéticas de harinas de distintasvariedades de soja y patrón de P.M. De izq. a der.: Coker Hampton(CH); Hardome (H); H. industrial 1 (HII); H. industrial 2 (HIZ);patrón de P.M.; Halesoy PDI 85 (Ha). Todas las muestras de harinase sembraron por duplicado.

COKERHAMPTON' J

Eig*23 Densitogramas obtenidos para harinas de distintas varie­dades de soja.

T. f1' -

Eig¿212 Densitogramas obtenidos para muestras de soja sometidas adistintos procesados.

cuadruplicadodensitometró

se sembró cada extracto por( n 12) se

de igual composición,en un misma placa y cada resoluciónpor duplicado.

Se calculó el area especifica dividiendo el area del pico enestudio en cm‘ por la cantidad de proteina sembrada en ug.

Al sembrar la mismaextracción por cuadruplicado, el areaespecífica del pico de P.M. 19.500 D arrojo diferencias de hastael 5,6 Z . Se calculó el area especifica dgl mismopico paraqlas12 siembras obteniendo un valor medio de X = 57,73 X 10 “cmh/ugcon una desviación estandar S = 4,57; el coeficiente de variaciónen este último caso fue de 7,92 Z .

Si bien cada resolución electroforetica se densitoMetró porduplicado, para los calculos se utilizó el promedio de areas, nojustificandose realizar este paso por duplicado por la altareproducibilidad obtenida con el equipo utilizado.

influencia de 1a variedad de soja y tipo de procesado enelectroforetico y areas especificas de los picos, espaso previo imprescindible para establecer la constan­picos elegidos.

Lael perfiltambién uncia de los

Para estudiar la influencia del tipo de procesado, seestudiaron 2 aislados, 2 texturizados y una harina PDI 85.

En una misma placa se sembró cada muestra como minimo porduplicado y se estudiaron las areas especificas para los picosP.M. 19.500 y 39.500 D. Los resultados obtenidos figuran en tabla4 y 5. Los duplicados de los densitogramas se presentan agrupa­dos. Se realizó analisis de varianza de un factor con los prome­

No sedios de areas de los duplicados de los densitogramas.encontró D.S. con P < 0,05 para ninguno de los picos.

Para estudiar la influencia de la variedad de soja, seHardome y HIl y HIE,de distintas varie­

iñ­analizó la variedad Coker Hampton, Halesoy,siendo las dos últimas, mezclas industriales

en el estudio de ladades. Se procedió de igual manera quefluencia del procesado. Los valores figuran en tablas ó y 7.Aplicando Anova un factor, no hubo 0.5. con P < 0,05.

4.6.4 ERROR GLOBAL DEL METÜDQ

Se realizó- test de Student para la diferencia de mediasentre variedades y tipo de procesados. No se encontró D.S. conP < 0,05.

Los valores obtenidos para las areas especificas indepen­dientemente de la variedad de harina y tipo de procesado fueron:

Pico P.M. 3.9.500 D n = 24 í 1 s = 59,11 t 5,99. v. = 10,12 7.

Pico F'.M. 19.500 D n = 24 í i s = 62,56 _t 7,21c. v. = 11,53. '/.

-73

9

HDMTD m. HZWFEmZÜHm cmr quïo Um vxünmmbco Gm mom) m2 mr Dmmbmwvmnuflmnb AXHO na xcov cmr anO cm 1.3. u0.moo U.

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3. H 325m10 am mwmauwmm

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IfifiLfi_g| INFLUENCIA DE LAS_RIST¿NTAS VARIEDADES DE HARINA DE SOJAEN EL AREA ESPECIFICA (X10 cm /ug), DEL PICO DE P.M.39.500 D.

**************************************-I-**********-I--M--I-***-I-*********

C.Hampton Hardome Halesoy HI1 HI9

48,54 60,93 60,86 63,67 63,3748,54 59,96 62,21 60,64 63,37

49,26 43,84 67,69 52,68 60,2449,26 49,32 68,47 55,85 65,03

n. 2 2 2 2 21

í 49,9 575,51 64,8 58,21 63,0

ní = número de siembras

ANDVA UN FACTÜR CON P < 0,05: NU HUBO 0.8.

*****************************************************************

IABLA,ZI INFLUENCIA DE LAS_QIST¿NTAS VARIEDADES DE HARINA DE SOJAEN EL AREA ESPECIFICA (X10 cm lug), DEL PICO DE P.M.19.500 D.

*****************************************************************C.Hampton Hardome Halesoy HI1 HI2

48,79 63,24 70,86 62,24 66,5051,6 63,83 66,52 62,24 65,72

56,1 48,36 77,53 59,49 77,8956,1 48,36 77,53 59,49 77,45

n. 2 2 2 21

í 53,145 55,95 73,11 60,86 71,89

n = número de siembras

ANDVA UN FACTOR CDN P i 0,05 : ND HUBU D.S.

**********¡"I-*****'I'***********************************************

- 75

DISCUSION

Dado que en cualquier producto comercial que contengaproteínas de soja se desconoce el origen de la misma, era nece­sario el estudio de la influencia de la variedad de soja y tipode procesado en cada paso de la metodologia. De encontrarse modi­ficaciones importantes en la extractabilidad, perfil electrofore­tico o áreas específicas, se limitaría las posibilidades de dete­cción o cuantificación de proteina de soja en meaclas proteicas.

Por otro lado, si la extractabilidad de proteinas de sojafuera constante, independientemente de la variedad o del procesoque haya sufrido, permitiría independizarse de la determinacionde proteina por metodo de Lowryen los extractos, aplicando unfactor al valor de proteina determinada por metodo de Hjeldahl.

De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que lavariedad de harina, el tipo de procesado y el tiempo de calenta­miento, no afectan la extractabilidad de la proteina de soja,con el buffer de extraccion utilizado. Es de destacar que aun laharina de soja tostada con PDI 15 y la misma luego de calenta­miento severo, presentan alto grado de extractabilidad.

El error en 1a extractabilidad seria del 4,83 Z . Este valores relativamente bajo si consideramos los pasos previosnecesarios para la determinación de Lowryy la comparacion deresultados hallados por métodos diferentes (Hjeldahl y Lowry).

Seria factible utilizar un factor de corrección para elvalor de proteína determinada por Hjeldahl, independizandose dela determinacion por Lowry. Dicho factor es de 0,936 calculadocomoel valor medio con P i 0,05 para 44 extracciones.

De las resoluciones electroforeticas y densitogramas obteni­dos, se concluye que las distintas variedades y tipo deprocesado, no modifican el perfil electroforetico de lasproteínas de soja.

Solo la banda de P.M. 69.000 D disminuye en una harinatostada de PDI 15. En la medida que esta banda no es utilizadapara la detección de soja en mezclas con proteinas carnicas o concereales (comose vera mas adelante, punto 4.1.4), seria perfec­tamente posible la detección de soja, aún proveniente de harinatostada, en mezclas donde se desconoce el origen de la fuenteproteica.

Por otro lado, que en un proceso de calentamiento se afectela proteína de mayor P.M., coincide con los resultados obtenidospara proteinas de pescado.

Al trabajar con distintas extracciones de una mismamuestra,el error global hallado para el pico de P.M. 19.500 D, medidopor el C.V. fue de 7,92 Z .Este porcentaje es levemente superioral obtenido al trabajar con una mismaextracción, por lo que sededuce que la siembra es una fuente de error importante.

Dado que en la determinacion de proteinas por Lowry elporcentaje de error hallado tambien fue del orden del 5 Z, se

76

concluye que en esta metodologia, trabajando de la manera des­cripta con los equipos utilizados, los pasos de mayor incidenciaen el error de la cuantificación son la determinacion deproteínas y la siembra.

Por lo tanto, para cuantificar seria recomendable realizaruna sola extracción de la muestra, trabajar en placa y sembrarcomo mínimo por duplicado.

La distintas variedades y tipo de procesado de la proteínade soja, no afectan la resolucion electroforetica obtenida por elpresente metodo.

La influencia en la cuantificación se estudio mediante lasvariaciones del area específica de la banda de P.M. 19.500 D porser fundamental en la detección en las mezclas con proteinascarnicas. Esta banda tambien es importante en otras mezclasproteícas, ya que comose vera mas adelante, de todos los casosestudiados (4.1.2 y 4.1.4), solo en mezclas con proteinas dearroz se superpone con una banda de igual P.M.

También se estudio el area especifica del pico de P.M.39.500 D en las distintas harinas y muestras procesadas, paradescartar posibles modificaciones en otros picos de soja quepudieran ser de utilidad en otras mezclas proteicas.

De los resultados de areas específicas para los picos deP.N. 19.500 y 39.500 D , se concluye que no existen diferenciasni por variedad de harina, ni por tipo de procesado, siendoposible cuantificar proteína de soja sola por el presente metodocon un error del 10 -12 Z .

En caso de mezclas, es necesario en cada caso estudiar lainfluencia de picos adyacentes en las areas específicas de la/lasbandas proteícas elegidas para la cuantificación, así como 1ainfluencia de sustancia que puedan afectar la extraccion proteicao las areas específicas.

5.7 ¿PROTEINAS CQRNICAS

4.7.1 Extractabilidad de proteinas

Se utilizaron tres muestras de carne vacuna; la muestra 1correspondía a carne magra extraída de un solo corte; las mues­tras 2 y 3 correspondieron a carne picada meaclas de distintoscortes.

Las 3 muestras se extrajeron directamente y las muestras 2 y3 también se extrajeron luego de calentamiento a lÜOUCuna hora y12108 15 minutos.

Los resultados de extractabilidad obtenidos fueron:

Muestra 1 2 2 2

Calentamiento — 10000 12100 100°c 1210€Extractabi­lidad en z 91,3 87,0 89,6 93,1 88,04 99,5 92,44

_ Para las 7 extracciones, se obtuvo una extractabilidad mediade X = 90,14 Z con s =2,25, lo que implica un coeficiente de va—riacion de 2,50 Z .El valor hallado difiere ligeramente delobtenido en el estudio de la influencia del pH en la extraccion(4.5.1).

Para proteinas de origen porcino la extractabilidad obtenidafue de 88,6 Z .

4.7.2 PRDTEINAS DE QELQEN VACUNO Y PORCINO

La determinacion del porcentaje de carne de cerdo utilizadoen la fabricacion de chacinados, es un problema de gran interes,ya que que debido al costo superior de la carne porcina, es comúnque la cantidad real utilizada sea inferior a la declarada odirectamente no se agregue. En muchos casos, la proteina deorigén' porcino es unicamente la aportada por la gordura de cerdoo tocino agregado, comopor ejemplo en los productos cárnicos decomposición conocida de los que se dispuso (punto 3.2.7).

Por otro lado, se tuvo conocimiento de que en nuestro medio,en epocas de elevado costo de la carne porcina, 'se ha intentadola adulteracion de carne porcina por carne vacuna mediante trata­miento de esta con hipoclorito o peróxido de hidrógeno.

De esta manera, existen varios aspectos de interes conrespecto a las proteínas musculares en los productos cárnicos:

1) IDENTIFICACION DEL ORIGEN

El perfil electroforetico obtenido para las muestras deproteinas de carne vacuna y porcina a 12,6 Z de acrilamida y pH8,8, se observa en figura 25a.

Existe gran diferencia en la banda de P.M. 17.500 D, identimficada tentativamente comomioglobinammiosina cadena liviana E.Esta banda en la carne vacuna constituye ¿n pico importante,

78

E1g¿25g: Densitogramas de proteinas musculares de origen porcino(P) y bovino (B). Se indican con flechas los picos de P.M. 17.500y 36.000 D. La letra S indica el comienzo del gel de separación.

mientras que en carne porcina aparecen 2 picos débiles. En cam­bio, la banda de P.M. 36.000 D, aparece mas intensa en carneporc1na.

En ambas muestras 1a actina es la banda principal y lamiosina cadena pesada, la segunda banda en intensidad.

Para la detección de la posible adulteración de carne porciwna por carne vacuna, se realizó la electroforesis de carne vacunatratada con hipoclorito, peróxido de hidrógeno y agua (punto3.2.3), en pa’alelo con la mismamuestra sin tratamiento. Losdensitogramas se observan en figura 25 b.

Es apreciable la disminución del pico de la mioglobina enlas 3 muestras tratadas, siendo mas intensa la disminución en elcaso de la muestra tratada con hipoclorito. En esta muestratambien se observa disminución del pico P.M. 39.000 D.

Por otro lado no euisten diferencias entre los perfiles decarne porcina y bovina en la :ona donde aparece la banda de sojade P.M. 19.500 D, utilizada para su detección. Este resultado esimportante, ya que de haber existido diferencias, hubiera sidonecesario utilizar comoreferencia de productos embutidos unamezcla carne porcina! carne vacuna. Esto implicaría 1a imposibi“lidad de detección de soja, debido a que la composición de lasmezclas utilizadas para chacinados varia enormemente, por lo queseria imposible disponer de una mezcla de composición similar ala utilizada comoreferencia.

Tampoco hay modificaciones en la zona de detección de-.:''1globina, como se vera mas adelante (figura uL .

2) DETECCION Y CUANTIFICACION EN MEZCLAS

A1 no presentar el perfil electroforetico de proteinas decarne porcina, alguna banda caracteristica de intensidad conside­rable, ausente en carne vacuna, seria dificil por este metodoladetección de carne porcina en mexclas de carne vacunawcarneporcina.

Sin embargo, en mezclas carne vacunawcarne porcina hay modi“ficación del area del pico de 1a mioglobina, así comode la relamción actina/mioglobina, pudiendo utilizarse estos valores comoreflejo de 1a proporción de carne vacuna y porcina utilizada.

Para estudiar la variación de las areas mencionadas, sesembraron proteinas de origen vacuno y de origen porcino, ymezclas donde la proteina de origen vacuno representaba 88,5,77,0, 3,2 y 44,8 Z de la proteina total; cada muestra se sembrópor duplicado (figura Eb).

La variación del pico de la mioglobina con el porcentaje decarne vacuna, se estudió graficando area especifica de dicho pico(calculado comoarea del pico sobre total de proteina sembrada),vs porcentaje de carne vacuna. Se obtuvo relación lineal con uncoeficiente de correlación r = 0,988 (figura 27).

Tambien se grafico la relación de areas actina/mioglobina,vs porcentaje de carne vacuna (figura 28). Se obtuvo relaciónlineal con r = _ 0.970.

79

ClC)‘

‘lfl mp

L . R CONTROL

(0-)

: Densitogramas de proteinas musculares de origen bovinotratadas con hipoclorito, peróxido de hidrógeno. agua y controlsin tratamiento. Se indican con flechas los picos de P.M. 17.500D (mioglobina) y 39.000 D. La letra S indica el comienzo del gelde separación.

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a. m -. . «4.,.__. .__. fi. ____M w

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%c.vacuna 100 sas 77,0 63,2 44,8 o

' . 6: Resoluciones electroforeticas de proteinas musculares deorigen bovino y porcino y diferentes mezclas. Cada muestra sesembró por duplicado.

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a ,/’Ra3 ‘//E 4/o _ ./

(o r - .983 ¡1/I /'O Ï/:2 / . E13.Z7:Areaespecifica dela .y/// pico de carne vacuna de P.M52 1 ;/'- 17.500 D. vs porcentaje de«g 'f/ carne vacuna en distintasa / mezclascarnevacuna-carneo Í porcina.-- /E //

% c.vacuna

E1g.38:Relación de áreasactina/miosina cadena 11­viana 2-mioglobina, vsporcentaje de carne vacunaen distintas mezclas carnevacuna-carne porcina.

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Ï O//9L9 ///

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oé /'/’É /// Fig.29:Variacibn del áreaa /// de actina vs cantidad deE t/’ r=.986 proteinas musculares sem­:69 /// ' brada de_origén vacuno.

“eLas°/,/ _

47A 74%? STug p.musc ares

3) DETERMINACION DE PRDTEINAS CARNICAS TOTALES

En la medida que en ambos tipos de proteinas musculares, laactina es el pico principal, se penso que podria utilizarse elvalor de actina para determinar el porcentaje total de proteinade origen muscular. Para este era necesario estudiar:

a) si el area de actina era proporcional a la cantidad deproteina muscular sembrada. Para esto se sembraron cantidadescrecientes de proteina de carne vacuna y se grafico area deactina vs cantidad de proteina sembrada; se obtuvo relacionlineal con coeficiente de correlación r = 0,986 (figura 29)"

b) posibles diferencias en las areas especificas para laactina según el origen de 1a proteina carnica_E1 cálculo de areasespecificas para la actina de origen vacuno, porcino y meeclaspara las 12 muestras dio X = 61,06 con s = 2,158, lo que repre"senta un coeficiente de variación de 3,50 Z .

DISCUSION

De acuerdo a los valores de extractabilidad-obtenidos, no seencontraron diferencias en la extractabilidad de proteinas muscu_lares de diferentes muestras ni de las mismasluego de calenta­mientos a 10000 1 hora o 121 C 15 min.

La falta de influencia del calentamiento en la extractahilimdad con el buffer utilizado, coincide con los resultados halladospara proteina de soja (punto 4.a.1).

Estos resultados difieren con los valores obtenidos porHofmann (88), quien encontro disminuciones del 10 Z en la extracwtabilidad de proteinas musculares calentadas por arriba de 1000€.

De acuerdo a los perfiles electroforeticos obtenidos,1aactina y la miosina presentan movilidades relativas similares enambas muestras, por lo que no tienen valor identificatorio.Similares resultados se encontraron para la actina en la identi­ficación de especies de pescado enlatados (punto 4.3).

Sin embargo, es posible diferenciar proteinas de origenvacuno de proteinas de origen porcino, debido a la presencia deun importante pico de P.M. 17.500 D en el caso de proteinas deorigen vacuno, en lugar de dos picos débiles en las proteínas deorigen porcino. Hofmanntambién encontro esta diferencia funda"mental entre ambostipos de proteinas, atribuyendo este picoexclusivamente a la mioglobina (BB)

Si bien el pico de P.M. 17.500 D de elevada concentracion enproteinas de carne vacuna, disminuye en muestras tra.adas conhipoclorito o peróxido de hidrógeno, aparece comoun solo pico,mientras que en proteinas de origen porc1no aparecen 2 picosdébiles. Estos dos picos débiles aparecen claramente aún enproductos cárnicos a base de cerdo, comose Vera mas adelante(punto 4.10.2 y 4.10.3 .

Por otro lado, si bien en las muestras tratadas, la diminumcion del pico 17.500 D es considerable, es necesario tener en

80

cuenta que el tratamiento realizado en laboratorio fue mas severoque el industrial, a efectos de considerar casos -Htremos.

De acuerdo a estos resultados, 1a posible adulteración decarne porcina (fundamentalmente en la elaboracion de productos depieza entera: jamón cocido y paleta) por carne vacuna, seríadetectable.

La proporcion de carne porcina y carne vacuna, podria calcu­larse por la relacion de areas actina/mioglobina y por la varia­ción del area de este último pico.

Si bien en ambos casos se obtuvo elevada correlación, lautilizacion de la relacion de areas actina/mioglobina, facilita"ría la determinación y seria ademas mas exacta que 1a determinamción de areas específicas, por independizarse del error de siem"bra y de la cuantificación proteica.

Se obtuvo elevada correlación entre el area de 1a actina yla cantidad de proteína muscular sembrada. Tambien se encontroque las areas especificas son equivalentes independientemente delorigen vacuno o porcino. Estos resultados indican que este metodopodria ser utilizado en productos cárnicos comoindicativo de laproteina muscular o carne magra total utiliaada.

81

5.._Q__I_NEL.LJE_NQ_I_B__.DEL_-_IBBIQHIEMIQ.__IERMICD Y SALES DE, CURADD EN"EMLBIQNEQQARMQBLQQNÚSQJA

Los productos cárnicos comerciales, son sometidos durante suelaboración a un proceso de calentamiento suave (70-7500). Porotro lado, durante su elaboracion se incorporan sales de curado(nitritos, cloruro de sodio, fosfatos), que contribuyen en suscaracteres organolépticos, estabilidad y mayorretención de agua.

Se estudio la influencia del proceso de calentamiento y dela presencia de sales de curado, en la extractabilidad,resolucion electroforética o areas especificas de picos deproteinas carnicas y de soja.

Para ello se prepararon emulsiones de pasta fina, con y sinsales de curado y se sometieron a distintos grados de calenta­miento. La elaboracion de las muestras se realizo respetandotodas las etapas del proceso en planta piloto, según se detalloen el punto 3.2.6.

4.8.1 EXTRACTABILIDAD

La extractabilidad obtenida para las muestras' sin y consales de curado y distintos grados de calentamiento, figuran entabla B.

JÏÍfiE‘LILÉ}.EXTRACTABILIDAD PRÜ1EICA DE MUESTRAS ELABÜRHDAS EN PLANTA PILOTO,CÜN Y SIN SALES DE CURADO Y CON DISTINTOS GRADOS DE CALENTAMIENTO.*****************************************************************

Sin sales Con sales

Kjeldahl Lowry Z Ext. Hjeldahl Lowry Z Ext.

Crudo 5,44 3,9 71,69 5,40 4,70 87,04

65°C 5,59 4,9 87,66 5,42 4,50 83,03

75°C 5,51 4,85 88,02 5,46 4,45 81,50

12100 5,41 5,55 102,59 5,55 4,35 78,38

í + 8 = B7,49:12,6 c.v. = 14,43 ï 1 8 = 82,4913,60 C.V.= ,36*************************INI-N"!-***-I-***************i-*-I'**-I--I'**'I"*******

Se aplico test de Student para diferencias de medias conP < 0,05. No hubo D.S.

Para las 8 muestras la extractabilidad media +ue de X84,99 con S = 9,00 y coeficiente de variacion 10,59 Z .

4.8.2 PERFILES OBTENIDOS Y CUANTIFICACIÜN DE PHÜTEINHS

Se corrieron simultaneamente las muestras con y sin sales,

82

sin calentamiento y calentadas a 65°C y 75°C, cada una en dosconcentraciones diferentes. Se utilizó comoreferencia proteinasde carne vacuna y proteína de soja.

La resolución obtenida se observa en figura 30.Por observacion directa no se aprecian diferencias entre

muestras con y sin sales y con sin calentamiento.Para confirmar estos resultados se calcularon las areas

específicas para la actina y mioglobina; los resultados se en­cuentran en tabla 9.

En las muestras sin sales, se_obtuxo un area especificamedia para la actina de 66,80 X 10 w cmL/ug, con S = 6,06(C.V. = QLQBZX. Para la mioglobina se obtuvo area especifica de14,17 x 1o “ cmL/ug, con s = 1,16 ( C.V. = 7,73 x >.

Para las muestras cgn sales de curado, los valores halladosfueron, para la actina X = 61,42 con S = 4,01 ( Ü.V. = 6,53 Z) ypara la mioglobina X = 16,75 con s = 1,64 ( C.V. = 9,37 Z ).

Se realizo test de Student para diferencias de medias entreambos grupos no encontrándose D.S. con P i 0,05.

Se calculo entonces para todas las muestras el area especí­fica para la actinai X = 64,11 con s = 5,65 y 'C.V. 8,81 Z ypara la mioglobina X = 15,87, con s = 1,66, C.V. = 10,30 Z .

QETECCIÜN Y CUANTIFICACIÜN De_ggge

E1 pico de soja de P.M. 19.500 D puede observarse nitidamen"te en todas las muestras, no detectandose diferencias en lasmuestras con y sin calentamientos y con o sin sales (119.30).

Para confirmar estos resultados, se calculo la cantidad desoja presente. Para esto, el area del pico de P.M. 19.500 D desoja en cada muestra, se dividió por el area específica de 1aproteínas de soja sembrada en paralelo. Se calculó el porCentajede proteína de soja, dividiendo la cantidad de soja hallada porel total de proteinas sembrada. Para las 12 muestras se obtuvo unvalor medio X = 6,29 con S = 0,936 y C.V. = 14,89 Z .

En la medida que el agregado de proteina de soja fue del 10%respecto del total de proteinas y el mismopara todas las mues"tras, se detectó el 63 Z de proteina de soja presente con unadispersión del 15 1 .

4.8.3 PRODUCTÜS________5gmgliggg A ESIERILIZAEIUN INDUSTRIAL.UTILIZACION 0g ÜTHÜSMQJQRLPIQEÉQL

Las muestras con y sin sales calentadas a 1210C 15 min., seextrajeron con el bufíer utilizado normalmente (ME)y también conbuffer conteniendo DTTy DTEen lugar del ME.

Los densitogramas de las muestras se presentan en la {19.31.La resolucion obtenida respecto de las muestras sin calenta­

miento drástico varia, siendo sensiblemente menor la resolucion ynitidez de bandas.

En los densitogramas de las muestras con DTTy DTE, no se

83

.- M_ _. _. __ .. -- -- .. e. __fl n .u w w “ W- .’ _. u. n

So PM

Tem p.°C '— 75 75 65 55 .. .. _

Sales — sl - s¡ — si _ _

Fig.30: Perfiles obtenidos de las muestras elaboradas en plantapiloto siguiendo las etapas de elaboración industrial. De izq. adeg.: harina de soja (So); muestra con sales 75°C; sin sales75 C; con sales 65 C; sin sales 65 C, con sales sin calentar; sinsales sin calentar, proteinas musculares(PM). Excepto harina desoja y proteinas musculares, todas las muestras se sembraron 2veces en 2 volúmenes diferentes (30 y 25 ul).

CÓN SALES 65°C;ME

121°C: DTT

ME

DTE

)n n DTE

E13¿11: Densitogramas de muestras calentadas a 121°C 15 min; laextracción se realizó variando el disruptor: ME, DTTy DTE. Secomparan los densitogramas de las muestras con sales. con unmuestra sin sales calentada igual Siempo y temperatura, y con unamuestra con sales calentadas a 65 C. Se indica con una flecha elpico de soja de P.M. 19.500 D. La letra S indica el comienzo delgel de separación.

observan mejoras en la resolución de bandas o aumento de sunitidez, con respecto a las muestras extraídas con ME.

Por otro lado, tanto en las muestras con o sin sales aun encalentamientos drásticos, es posible la detección de proteínas deSOJa.

DISCUSION

De acuerdo a los resultados obtenidos, puede considerarseque la extractabilidad de los productos cárnicos formados por unaemulsión +ina, no varia en presencia o ausencia de sales decurado, o con o sin calentamientos, aun drásticos.

Sin embargo, el valor de extractabilidad hallado de 85 Z, esinferior respecto a la proteina de carne sola ( 90,14 Z ) oproteina de soja sola (93,6 Z). Existe gran dispersión de losdatos, reflejada en el coeficiente de variación hallado de 10,62,superior al hallado para proteina de soja o de carne sola.

Las resoluciones obtenidas no varian con los calentamientosusuales en la industria, ni por la presencia de sales de curado.Los datos de areas especificas indican que tampoco hay variaciónen forma cuantitativa._ El valor de area especifica hallado para la actina fue deX = 64,115este valor no difiere del hallado para actina en carnevacuna, _carne porcina y mesclas ,sin calentamiento y sales decurado (X = 61,06).

Estos resultados difieren de los hallados por Hoffmann (BB),quien encontró gran disminución de la intensidad de las bandas enlas muestras que contenían sales de curado.

La proteina de soja seria detectable y cuantificable enmuestras procesadas industrialmente. En este caso, en que la sojase agregó al nivel de 10 Z de proteinas respecto del total deproteínas, (nivel inferior a1 maximopermitido comoaditivo porCAA, punto 4.10.5), se detectó como valor medio el 63 Z de laproteína presente, con una dispersión del 15 Z .

En el caso de los calentamientos drásticos, la resolucióndisminuyó en forma acentuada, pero aun asi la soja es detectablepor ser el pico utilizado de bajo P.M. y de acuerdo a lo visto enla influencia del tratamiento termico en proteinas de pescado,las proteinas de menor P.M. son las menos afectadas por el calor.

La utilización en estos casos de otros disruptores comoDTTo DTEno trae aparejado mejoras en la resolución.

4.9 PROTEINAS DIFERENTES DE_50JA UTILIZADAS EN PRDDUCTÜE CBRNICOQ

Dadoque el perfil electroforetico de las proteinas carnicases muy complejo con presencia continua de bandas en todos losrangos de P.M., se estudió la posibilidad de detectar proteínasdiferentes de soja de uso corriente en chacinados.

Se estudiaron las siguiente proteinas: plasma vacuno congela­

-84

do, suero vacuno en polvo, hemoglobina vacuna en polvo, caseinatode sodio, leche descremada en polvo, suero de leche en polvo,gluten y huevo entero en polvo. La muestra de plasma congelado,se separaba al descongelarlo en una fraccion solida con aspectode músculo liso, que se analizó por separado del liquido sobrena­dante.

Se realizo la electroforesis a 12,5 Z de acrilamida y pH8,80, por ser las condiciones elegidas para detectar proteinas desoja en mezclas carne-soja. Se corrieron todas las muestras, yuna muestra de proteina carnica, una muestra de soja y una mezclapatrón de P.M.

La proteina de soja se introdujo, ya que era necesario elestudio de posibles superposición de picos de la proteina de sojacon el resto de las proteinas.

La proteina de huevo se estudio por ser un posible constitu­yente de embutidos, rellenos, milanesas preparadas, rebozadorindustrial u otros productos cárnicos.

Las resoluciones electroforeticas obtenidas se observan enfig.32. La densitometria se realizó por duplicado, calculando elP.M. para cada banda (figuras 33 y 54).

De los per+iles electroforeticos y densitogramascorrespondientes, se observa:

- ninguna de las proteinas estudiadas interfiere con soja,ya que no presentan ningun pico importante que se superponga conel pico de P.M. 19.500 elegido para detectar soja en productosCárnicos. De los picos de proteina de soja utilizados como con­firmatorios, el de 52.000 D tampoco sufre superposición; encambio el de 67.000 D aparentemente podría superponerse con unode los picos importantes del plasma (albúmina bovina de P.M.66.000 D), y con un pico de F.M. levemente superior de proteínade huevo.

- el suero, asi comolas 2 fracciones del plasma, presentan2 bandas principales de P.M. estimado 66.000 (albúmina bovina) y55.000, que se superponen con bandas de la carne por ser consti­tuyentes normales de las proteinas carnicas. En plasma aparece,una banda de intensidad menor, de P.M.32.0DD, que coincide con labanda de menor intensidad de la globina. El agregado podriaevidenciarse por el aumento de dichas bandas con respecto a lasadyacentes (por ej. actina), pero solo serian detectables agrega­dos importantes.

- la proteina de la hemoglobina, globina, presenta una bandamuy intensa de P.M. estimado 14.000 y otra menos importante deP.M. estimado 32.000. Esta proteina es por ello perfectamentedetectable, ya que las proteinas musculares son todas de PMsuperiores a 14.500 D.

- las proteinas de huevopodrian ser detectables utilizandolos picos de alto P.M. estimados 100.000 y 67.000 D, ya que labanda de P.M. 45.000 (ovoalbúmina) se superpone con bandas de lacarne.

- la caseina presenta 3 bandas principales de P.M. 37.000,28.000 y 34.000 D, en orden decreciente de intensidad; el suero

«85

111

2 C- "k­- un

- miȟ;:; _, nal...

PM P p Su Go H So C L SL G PPM

Fig. 32: Resoluciones electroforéticas de extractos de proteinasmusculares y posibles agregados proteicos, a 12,6 %de acrilamidapH 8,80. De izq. a der.: proteinas musculares (PM), plasma(fracción coagulable) (P), plasma (sobrenadante) (P), suero vacu­no (Su), globina (Go), huevo entero (H), soja (So), caseinato(C),leche (L), suero de leche (SL), gluten (G) y patrón de P.M.(P ).P.M.

Densitogramas de: globina, plasma, proteinas musculares.Las flechas indican los picos principales en cada caso, a los quese les calculó el P.M. El comienzo del gel de separación seindica con la letra S.

Eig, 35: Densitogramas de las siguientes proteinas: huevo entero,gluten, leche y soja. Las flechas indican los picos principalesde cada proteina a los que se les calculó el P.M. El comienzo delgel se separación se indica con la letra S.

lacteo presenta 2 bandas de P.N. 17.500 (¡Z-lactoglobulina) y14.000 D ( O4-1actoalbúmina); en leche entera logicamente estanpresentes todas las bandas. Ningunade las proteinas lacteasserían detectables, ya que todas las bandas importantes se super­ponen con las proteinas carnicas.

—el gluten presenta bandas muy nitidas de alto PM y 2bandas anchas de PM43.000 y 35.000 D. Todas las bandas se super­ponen con proteinas carnicas.

La falta de interferencia de las demasproteinas con soja,confirma los resultados hallados por distintos investiga­dores:Benincasa en un sistema similar estudio la posible interfe­rencia de proteinas lacteas, de huevo, pan y habas (111); Guy ycol. descartaron la posible interferencia de colageno, sangre,plasma y huevos (114).

De acuerdo a lo visto en el punto 1.2.3, la detección deglobina agregada en productos cárnicos, es de gran interés desdeel punto de vista nutricional porque implica sustitución deproteínas de buen V.B. por otras de pesimo VUB. En cambio 1adetección de proteinas de soja en productos cárnicos, tiene mayor.importancia desde el punto de vista legal, ya que los precios delos productos elaborados con soja texturizadadeberian ser muyinferiores a los elaborados unicamente con carne vacuna/porcina.

Asi, las proteínas diferentes a las musculares que masinteresaria detectar serian la globina y la soja, siendo ambasdetectables por este metodode electroforesis.

Por otro lado, de acuerdo a los perfiles electroforeticosobtenidos con el presente sistema, es posible identificarproteinas de sangre bovina (plasma o suero y hemoglobina), huevo,soja, proteina de leche de origen vacuno (incluyendo caseina osuero lácteo) y gluten.

'86

9-_19__EBQ_Q|¿QT_Q_&_QBBNJQQS__QQUE_EQ__L_E.S_

4.10.1 MUESTRAS INDQSTRIALES DE CÜMPÜSICIDN CDNDCIDA

A efectos de confirmar algunos de los resultados obtenidos,se dispuso de 4 muestras donde se conocia exactamente la propor­cion de las distintas materias primas y tipo y porcentaje deproteinas agregadas (segun se detallo en Mat. y Het. 3.2.7):hamburguesas con agregado de 2 Z de aislado de soja y 9 Z deplasma congelado (H1); 2 muestras de salchichas de Viena, una con25 Z de plasma (Sl) y otra con 2,1 Z de gluten (82); mortadelacon 2,2 Z de gluten (M). I

Estas muestras se sembraron sin y con agregado de la pro­teína extrínseca con que se elaboró, para intensificar los picosatribuibles a las mismas.

Se utilizaron comoreferencia carne vacuna, proteina desoja, plasma, gluten y caseina.

Las resoluciones obtenidas se observan en {igura 35; losdensitogramas representativos se observan en figura 36.

Comparandolos perfiles de la carne con respecto a las mues­tras, se observa:

- la soja es perfectamente detectable en estas muestras. Lospicos identificatorios se confirman por agregado de proteina desoja en siembra paralela. Se observan claramente los picos deP.M. 19.500 y 67.000 D. El pico de P.M. 52.000 D, si bien sesuperpone con un pico de las proteinas carnicas, confirmando losresultados hallados en sistema modelo, aumenta su intensidadrelativa en forma significativa a1 compararlo con el densitogramade proteinas cárnicas, siendo claramente atribuible a soja.

- el plasma no es detectable en la muestra con 9 Z, peropuede observarse el aumentorelativo de los picos respecto a laactina en la muestra con 25 Z de plasma. En 1a muestra quecontiene soja y plasma, puede observarse que el pico de soja deP.M. 67.000 D aparece independientemente del pico de plasma deP.M. 66.000 D, descartando la posible superposición que surgia delas siembras de cada proteina por separado y confirmando losresultados obtenidos en el sistema modelocarne-soja.

—si bien todos los picos del gluten se superponen conproteinas carnicas, el pico de P.M. 35.000 D modifica la rela­cion de los picos de menor P.M. adyacentes a la actina, ya queestos decrecen en intensidad con el P.M. y en presencia de glutenla relación se invierte apareciendo mas intensos los picos demenor P.N. Sin embargo, el pico de P.M. 35.000 D del gluten, sesuperpone con otra pico de P.M. similar de la caseina (+ig.34),por lo que en un producto terminado es dificultoso asegurar lapresencia de una u otra proteina.

Los resultados confirman la posibilidad de detectar sindificultad de la proteina de soja, siendo las proteinas de gluteny de plasma de difícil detección.

.37

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PSo PMM M S282 H1H1S1.S1 c GCP+G +G +P +P

+So

Fig. 35: Resoluciones electroforeticas de muestras comerciales decomposición conocida y de proteinas utilizadas como referencia.De izq. a der.: plasma (P); soja (So); proteinas musculares (PM);mortadela elaborada con 2,25 % de gluten (M); idem con agregadode gluten en la siembra (M +G); salchicha de Viena con 2,1 % degluten (82); idem con agregado de gluten en la siembra (82+G);hamburguesa con 9 % de plasma y 2 % de aislado de soja (H1); idemcon agregado de plasma y soja en la siembra (Hl+P+So); salchichade Viena con 25 % de plasma (Sl); idem con agregado de plasma enla siembra (81+P); caseina (C); gluten (G); mezcla de caseina yplasma (CP).

AMB_U'4-SC J

1-PI.A

¡Lunas 'n'=s

a),

E1g¿afig: Densitogramas de: proteinas musculares; hamburguesa ela­borada con 2 % de aislado de soja y 9 % de plasma(H1); idem conagregado en la siembra de soja y plasma. Se indican con flechasen distintos niveles los picos correspondientes a soja (So) yplasma (P).

Fig.36b: Densitogramas de: salchicha de Viena elaborada con 2,1 %de gluten (82); idem con agregado de gluten en la siembra; sal­chicha de Viena elaborada con 25 % de plasma (Sl); idem conagregado de plasma en la siembra. Se indican con flechas lospicos correspondientes a gluten (G) y plasma (P).

.. Ali/MANLJ”

x/_\M1\M” s W tw1 . wi ,

6 : Densitograma de mortadela elaborada con 2,25 % degluten (M); idem con agregado de gluten en la siembra (M+G).

4.10.2 PRODUCTOS COMERCIALES DE COMPOSICION DESCONOCIDA

PRODUCTOS SIN CALENTAMIENTO

Se analizaron 4 muestras de-hamburgues¿s de distintas marcascomerciales.

A) Extractabilidad

Los porcentajes de proteinas de las muestras desgrasadas ysecas y los porcentajes de extractabilidad se observan en latabla 10.

TABLA 10: PORCENTAJE DE EXTRACTABILIDAD PROTEICA DE PRODUCTOSCOMERCIALES SIN CALENTAMIENTOS Y PRESENCIA DE SOJA/HEMOGLOEINA.*******i**********ü*********************i*ü%********Ifi*fi**%******

Proteina* Extractabilidad Presencia de Presencia desoja Hb

H2 77,9 100 No NoH3 70,8 82,6 No NoH4 60,61 67,7 Si NoH5 78,22 74,8 No No

* Muestra desgrasada y seca.***************************%******%*******1*****N*I%*ü***fl****üü*

EL valor medio de la extractabilidad para las 4 muestrasfue de X = 81,28 con s = 13,89 y C.V. = 17,09 Z .

Se observa que los porcentajes obtenidos fueron muy variambles y en algunos casos muyinferiores a los obtenidos para carnesola.

B) PERFILES OBTENIDOS

Las muestras se sembraron en placas de é y 12 lugares,comparandose con proteinas de carne vacuna y proteína de soja.8eobservan los densitogramas correspondiente en la figura 37.

Se puede observar la ausencia del pico de soja de P.M.19.500 D en las muestras H2, H3 y H5, destacándose en dicha Kunade P.M. el valle característico de las proteínas musculares. Encambio, la muestra H4presenta todos los picos atribuibles a sojaen concentración apreciable. En esta muestra, aún el pico de P.M.39.500 D que se habia descartado para detección de soja en siste­ma modelo por superpone con bandas mayoritarias de las proteinasmusculares (punto 4.5.2), tambien aparece muy intensificado.En ninguna de las 4 muestras se observa el pico atribuible aglobina.

PRODUCTOS CON CALENTAMIENTO

De acuerdo a lo detallado en Mat.y Met. punto 3.2.7 seutilizaron salchichas de Viena y frankfurt, chorizo tipo aleman y

BG

Eig, Q7: Densitogramas de hamburguesas de distintas marcas comer­ciales. Las cantidades sembradas fueron: H2: 46,4ug; H3:38.4 ug;H4:27,3 ug; H5: 38,4 ug. Se indican con flechas los picos atri­buibles a soja en H4.

lomo de cerdo.

A) ExtractapiliqÉg

Los porcentajes de proteinas de la muestra desgrasada y seca,junto con el porcentaje de extractabilidad, se encuentran en latabla 11.

TABLA 11: PORCENTAJE DE EXTRACTABILIDAD FRÜTEICH DE PHUDUCTÜSCOMERCIALES CALENTADÜS Y PRESENCIA DE SOJA/HEMUGLÜBINH.*****************************************************************Tipo de Proteina Extractabilidad Soja ' Hbchacinado

Chorizotipo aleman Chi 81,32 80,15 no si

ChE 67,86 84,00 si no

Salchicha 83 58,72 68,8 dudoso* side Viena

" S4 55,32 74,3 siSalchichade Viena(c.vacuna) 85 54,28 82,65 si

Salchichade Viena 86 53,06 80,5 si si

S7 46,69 84,05 si si

88 58,66 76,55 dudoso* si

S9 45,01 76,20 no no

810 35,51 75,00 dudoso** no

Salchichafrankfurt 811 71,79 88,5 no si

812 57,78 81,14 no no

Lomo de cerdo L 71,11 98,77 dudoso* no

* se confirma presencia por agregado de pequeña cantidad de soja** Il II ll Il II ll ll ll ll*************************i***************************************

Para las 12 muestras (excluyendo el ¿omo de cerdo) seobtiene un valor medio de extractabilidad de X = 79,32 con s =5,37 y C.V. = 6,77 Z .

69

B) PERFILES QBTENIDÜQ

Las muestras se sembraron por duplicado en placas de 12,52de acrilamida, con capacidad para ó y 12 muestras en cantidadesentre 30 y 50 ug.

Las resoluciones obtenidas se observan en las figuras EBy 39y los densitogramas se observan en las figuras 40, 41 y 42.

Tanto en la observacion directa de las placas, comoen losdensitogramas se observa 1a excelente resolucion obtenida en todoel rango de P.M. y en particular en la zona donde aparece el picode soja de P.M.19.500 D. l

En algunas muestras, por observación directa de la placaSe deduce claramente ausencia (ej. 811, Chi ) o presencia (Ühï55, Só, S7) de soja. Ütras muestras en placa parecerian nocontener soja, pero en el densitograma no aparece claramente elvalle correspondiente (SE, SB, S9, ChE).

Al repetir las siembras de algunas de estas muestras dudosasaumentando la cantidad sembrada (40 ug.), se observan claramentelos picos-atribuibles a soja (ej. 83), los cuales se confirmanpor agregado de proteina de soja (figura 43).

En cambio en 1a muestra 810, se puede observar mas claramen­te la ausencia de proteina de soja, lo cual se confirma poraparicion de nuevos picos con el agregado de soja (figura 44).

De las 5 muestras dudosas, en 4 se confirmo 1a presencia desoja en cantidades no cuantificables, ya que no es posible calcu­lar el área del pico P.M. 19.500 D, por lo que se presume suagregado al nivel de aditivo.

Una de las muestras dudosas fue el lomo de cerdo (figuras 42y 45). En este caso se comparó con proteína de carne porcina,(aunque estas proteinas no presentan diferencias de resolucioncon proteinas de carne vacuna en esta :ona de F.M.segun se vio en4.7.2). Se sembró también la muestra y la proteina de cerdo conbaja proporcion de agregado de proteina de soja (l ug). En lamuestra de lomo de cerdo se observa un leve aumento del pico deP.M. 19.500 D y aumento del pico de 67,000 D. En la muestra decarne porcina se observa unicamente la aparición del pico de P.M.67.000 D. Se detectó asi la presencia de soja en un producto depiexa entera.

En la mayoria de las muestras sometidas a tratamiento térmi"co, aparecio un pico de P.M.in+erior a la mioglobina, atribuiblea globina de acuerdo a lo visto en proteínas diferentes de soja(punto 4.9).

En ninguno de los densitogramas correspondiente a muestrasde hamburguesas se observa dicho pico (figura 37).

4.10.3 CUANTIFICACIDN DE SOJA PREsENIE

Dado que en los productos cárnicos 1a proteína de soja seencuentra en mezclas complejas comolas musculares, se estudio elerror del metodo de cuantificación de soja. Para ello dos Emuestras que no contenían proteína de soja, con y sin calenta"miento (811 y H3 respectivamente), se sembraron sin y con el

90

So Ch1 S4 PM

Fig. 38: Resoluciones obtenidas de distintas muestras comercialesde productos cárnicos y proteinas musculares y de soja comoreferencia. De izq. a der.: proteina de soja, (So); salchicha deViena (SB); chorizo tipo aleman (Chi); salchicha de Viena (S4);hamburguesa (H4); proteinas musculares (PM). Cada muestrasembró por duplicado.

1.: . - .,._ .ping": mua'“““

-_Ú-’-——- -_—­

PM S5 s7 S11 L So

Egg, 39: Resoluciones obtenidas de distintas muestras comercialesde productos cárnicos y proteinas musculares y de soja comoreferenc1a. De izq. a der.: proteinas musculares; salchichas deViena: 85, S7, 811; lomo de cerdo (L); proteina de soja.

Eig. ¿0: Densitogramas obtenidos de distintas muestras comermciales de productos cárnicos : chorizo tipo aleman Chl, 41,7 ug;salchicha de Viena Sll, 41,2 ug.; salchicha de Viena S3, 31,3 ug;salchicha de Viena S4, 27,2 ug. Se indican con flechas los picosatribuibles a globina (Go) y/o soja (So).

Go So So

. Densitogramas obtenidos de distintas muestras de salchi­chas de Viena: 85, 38,1 ug; SS, 29,2 ug; S7, 27,4 ug; 88, 28,4ug. Se indican con flechas los picos atribuibles a globina (Go)y/o soja (So).

Eig, 42: Densitogramas obtenidos de distintas muestras comer­ciales de productos cárnicos: lomo de cerdo L, 48 ug; chorizotipo aleman Ch2, 37,1 ug; salchichas de Viena: 89, 30,7 ug y 81015 ug.

83+So

S3

Fig. 53: Densitogramas obtenidos de salchicha de Viena 83 (40 ug)y d la misma con el agregado de 6,9 ug de soja (SS + So). Seaumentó la amplitud del registrador a efectos de facilitar elcálculo de áreas.

810+So

. 44: Densitogramas obtenidos de salchicha de Viena 810 (40ug) y de la misma con el agregado de 6,9 ug de soja (810 + So).

Phfl

L

Í

L+So

Fig, 45: Densitogramas obtenidos de lomo de cerdo (L); idem conel agregado de 1 ug de proteina de soja (L +80); proteinas muscu­lares de origen porcino (PM). Se indican con flechas los picosatribuibles a soja.

agregado de dos cantidades diferentes de proteina de soja.La cantidad sembrada de las muestras fue en todos los casos

30 ug. Los agregados fueron de 3,45 y 6,9 ug de soja representan­do el 10,3 y 18,7 Z respectivamente, del total de proteinassembradas. Comose vera en el punto 4.10.4, el porcentaje de 10,3Z de proteina de soja respecto del total de proteina, es inferioral maximopermitido por el CAAal nivel de aditivo (14,6 Z); elporcentaje de 18,7 Z se encuentra en el limite admitido por CAAcomo extensor (17,9 Z).

La densitometria se realizo con el doble de amplitud, aefectos de aumentar la altura del pico y facilitar el cálculo delas areas. '

Los densitogramas correspondientes se observan en lasfiguras 46 y 47.

Se calculo el area del pico de soja P.M. 19.500 D. Dichaarea se dividió por el area especifica calculada a partir deproteína de soja corrida simultaneamente. Para 3 siembras dife"rentes de soja, los valores obtenidos de areas especificasfueron :0,152, 0,148 y 0,132; se tomó el promedio 0,144.

Las cantidades de proteina de soja calculadas a partir delos densitogramas y porcentajes de soja determinados respecto delagregado, figuran en la tabla 12.

TABLA 12: ERROR EN LA CUANTIFICACION DE SOJA: PORCENTAJE DEDETECCION DE SOJA AGREGADA*****************************************************************muestra soja agregada soja detectada Z de detección

ug ZC511 - m n —811 3,45 10,3 2,67 77,39811 6,9 18,7 6,67 96,7H3 - - n ­H3 3.45 10,3 3,75 108,7H3 6,9 18,7 6,41 93,9

a: porcentaje de proteina de soja respecto del total de proteina-I-*-I--l-**-I-********-I-*-I-*****'I'*****-I-************-l***¡"ati-iii- k-IíI-i-I‘E-l-át-H-i-i-i­

Se observa en funcion de los resultados, que el error esmuy alto en los 2 porcentajes menores debido a la dificultad dedeterminar la linea de base. En los 2 agregados mayores, sedetecta mas del 90 Z de 1a soja agregada.

Se trato de mejorar la exactitud de la determinacion conbajas concentraciones de soja, realiaando la determinacion delpico de soja por pesada tomando como linea de base el perfil deproteina muscular corrida en la mismaplaca. Sin embargo, sedescarto este procedimiento por no coincidir en general en lasmuestras comerciales la linea de base con la de las proteinasmusculares.

En las muestras comerciales donde el pico de soja apareciaclaramente, se probaron dos metodos de cuantificación, calculando

¡91

(It-uln

Eig, 46: Estudio del método de cuantificación de soja en produc­tos cárnicos:(30 ug).

densitogramas obtenidos para salchicha de Viena 811sin y con agregado de 3,45 y 6,9 ug de proteina de soja.

Se indican con flechas los picos atribuibles a soja.

Fig, 47: Estudio del método de cuantificación de soja en produc­tos cárnicos: densitogramas obtenidos para hamburguesa H3 (30 ug)sin y con agregado de 3,45 y 6,9 ug de proteina de soja. Seindican con flechas los picos atribuibles a soja.

de 2 maneras diferentes el area especifica del pico de 19.500 Dde la soja:

a) agregando una cantidad conocida de soja a la muestra, elarea específica de soja se calcula dividiendo el aumentodel areapor 1a cantidad de soja agregada.

b) en siembra independiente.y simultanea, corriendo proteinade soja simultaneamente en la mismaplaca y dividiendo el areaespecifica por la cantidad de soja sembrada.

Se sembraron 30 ug de proteina de cada muestra 2 veces, enuna siembra con agregado de 6,9 ug de soja. En 1a misma placa sesembraron 30 ug de soja en forma independiente. Los densitogramascorrespondientes se observan en las figuras 4B, 49, 50 y 51. Losresultados figuran en tabla 13.

TABLA 13: CUANTIFICACIDN DE SOJA PRESENTE EN PRDDUCTÜS COMERCIALES*****************************************************************

H4 53 55 81 S7Z de soja arespecto 17,7 3,2 3,58 6,57 11,5total de bproteina 18,55 2,63 3,34 4,72 13,07

a: area especifica de 1a soja calculada por agregado de proteinade soja en 1a muestra en siembra paralela.b:area especifica de la soja calculada por siembra independientede soja en la misma placa.****-fi******************i"!í-I-ü‘i'i'i-í'i-**i"!-i-***************************

De acuerdo a estos resultados, los dos metodos de cuantifi"cación serían similares, pudiendoaplicarse cualquiera de ellos.

La cuantificación de proteina de soja seria posible enniveles superiores al 3 Z respecto del total de proteinas.

De acuerdo a nuestros resultados, 2 de las muestras comermciales analizadas superaban una sustitución de proteina de carnepor proteina de soja del 10 Z (H4 y S7).

4.10.4. DETERMINACION DE CARNE MAQRA Y RELACION PRÜTELLQQMQQHN,VACUNA/CARNE PDRCINA

De acuerdo a los resultados obtenidos, no seria posibledetectar y cuantificar, por este metodo, el total de proteínas nocarnicas.

Por ello, se comenzoel estudio de la posible determinaciónde las proteinas musculares presentes por cuantificación de laactina en muestras comerciales.

Dado que los resultados obtenidos en sistemas modelos fueronmuy promisorios, tanto para la relación de area actina vs ug deproteína carnica sembrada, comopara la relacion actina/mioglobi"na vs proporción de carne porcina, era necesario estudiar posi­bles interferencias y/o modificaciones en las areas especificasen productos industriales.

Al analizar la relación area actina vs proteina carnica o

92

|14+5i3

H4

8: Cuantificación de soja presente en muestra comercial:densitogramas de hamburguesa (H4) sin y con agregado de 6,9 ug desoja (H4 + So) . Se indican con flechas los picos atribuibles asoja.

35+SO

S5

Eig, 49: Cuantificacibn de soja presente en muestra comercial:densitogramas de salchicha de Viena (85) sin y con agregado de6,9 ug de soja (85 + So) Se indican con flechas los picosatribuibles a soja.

.864' SO

Se

F15, 50: Cuantificación de soja presente en muestra comercial:densitogramas de salchicha de Viena (86) sin y con agregado de6,9 ug de soja (SB + So) Se indican con flechas los picosatribuibles a soja.

*S7+So

S7

Eig, 51: Cuantificación de soja presente en muestra comercial:densitogramas de salchicha de Viena (S7) sin y con agregado de6,9 ug de soja (S7 + So) Se indican con flechas los picosatribuibles a soja.

relacion actina/mioglobina vs proporcion carne porcina, en lasmuestras comerciales de composicion conocida, se encontraron lossiguientes problemas:

a) la mioglobina se superpone con el pico de P.M. 14.500 Ddel gluten, produciendo un aumento del area, y disminuyendoconsecuentemente la relacion actina/mioglobina.

De las proteinas estudiadas (punto 4.9), el huevo tambienpresenta una banda que interferiria con mioglobina,

Por tanto en chacinados que contengan gluten y/o huevo, nopodrían calcularse los porcentajes relativos de carne porcina ovacuna, ni por relacion de areas actina/mioglobina, ñl por varia"cion del area especifica de la mioglobina. '

b) la actina se superpone unicamente en forma leve con unpico del gluten de P.M. 43.500 , por lo que en muestras quecontengan gluten existiría un error por enceso. Sin embargo, aúnen las muestras con gluten, al calcular a partir de los densito"gramas el porcentaje de carne magra, teniendo como referenciacarne vacuna sembrada en la mismaplaca, los resultados fuerondel 50 Z de proteina muscular respecto de la proteína totaldeterminada por Hjeldanll

El bajo porcentaje de proteina muscular respecto deproteinas totales, podria atribuirse a que en el metodode Kiel"dahl se determina también el colágeno, proteina de otros orígenesy el nitrógeno no proteico.

A efectos de conocer el porcentaje de proteina aportado porotras materias primas proteicas, en las muestras de composicionconocida, se calculo el porcentaje de proteicas entrinsecas res­pecto del total de proteinas. Los valores calculados {iguran entabla 14.

TABLA 14: PORCENTAJE DE PROTEINAS TOTALES Y PORCENTAJE DE PHOTEI“NAS EXTRINSECAS RESPECTO DEL TOTAL DE PROTEINAS, EN PRODUCTOSCARNICOS, DE COMPOSICION OONUCIDA**************%%%*****%***********************H%**%***i***ü**üü%*Producto Materia Prima Proteina del Prot. extrinseca en

agregada* producto ** Z respecto total de_ proteina

Mortadela Glutend 2,23 Z 11,94 12,8

Salchicha Glutena 2,1 Z 15,45 9,3

Hamburguesa Sojab Aislado 2 % 16,72 10,7aPlasma congelado total:149 Z F 3,23

Salchicha Plasma congelado“25 Z 12,07 12,4

* sobre 100 g de producto fresco** proteina determinada por el método de Hjeldahl sobre productofrescoa: 68,5 Z de proteina; b: 9B Z de proteina; c: ó Z de proteina******************w***fi***********%************%*MKi#*****üfifii***

93

De acuerdo a estos porcentajes, existe desde un 9 Z a 14 Zde proteina de origen diferente al de tejido muscular en estosproductos. En el caso que se utilizo gluten, los porcentajesfueron de 9,3 Z y 12,8 Z, a pesar de que la cantidad de glutenagregado (2,1 y 2,23 Z) fue considerablemenLe inferior al maximopermitido por CAA(3,5 Z) en el art. 323 bis.

fl¿¿QLg_fl¿ygg_Qg_gg5TITUCIÜN DE PRÜTEINAS CAHNICAS PUR PRÜTEINA Dg_SÜJF

Si consideramos que el CAApermite el agregado como aditi­vo de 3,5 Z de harina de soja en el producto terminado. y laharina de soja tiene 50 Z de proteina, ello representa 1,7 Z deproteína de soja en el producto. En el caso de utilizarse mezclasde harina y de aislado de soja, el porcentaje de soja en elproducto puede aumentar, ya que no se establece la proporcionmaxima de aislado en la mezcla.

En el caso de los productos extendidos, el criterio seguidopor el CAAde establecer un maximode sustitucion en base seca esambiguo, por no poder establecerse claramente que proporcion deproteínas carnicas se sustituyen por el extensor.

Esto se debe a que el CAAestablece para chacinados cocidos,unicamente maximode agua permitido (78 Z para salchichas, art.322 , y maximo de grasa (50 Z, art. 319) ambos valores muysuperiores al que presentan los productos de pasta fina, siendoel resto proteínas, almidón y sales.

Calcular a partir de estos máximos, que porcentajes de carnemagra se utilizan y que proporcion se sustituye en un productoextendido con 10 Z de texturizado de soja en base seca, sumado ala gran variabilidad que estos productos presentan (en partedebido a las materias primas empleadas), se transforma en merocalculo sin ninguna base real.

Lo mismo sucede cuando se desea calcular en un productocon soja comoaditivo, que porcentajes respecto de total deproteínas representa 1,7 Z de proteina de soja en el producto.

Debido a esto, se analizó la composicion centesimal de lasmuestras pasteurizadas, a efectos de calcular el procentaje deproteina de soja respecto del total de proteina.

Los valores hallados para 16 muestras analizadas (incluyenlas 12 muestras analizadas electroforeticamente), son lossiguientes:*******************w****************************u**n************Agua Proteína Grasa Cenizas H. de Carbono*

57,6 11.92 23,7 2,30 3,9

*determinado por diferencia*************************-I-*****'I-**i-*****-ï-********** I-í-í-i-l-i-IF-l-I-{i-ü-fl-I­

De acuerdo a estos valores de proteína y agua, se calculo:a) el porcentaje de proteina de soja respecto del total de pro­

94

teina y b): el porcentaje de proteina de soja en base seca en enel producto. Estos calculos se hicieron a efectos de compararcon los criterios del CAAy del Codex Alimentarius.

NIVEL DE ADITIVO

CAA. Si consideramos que en un producto pasteurizado quecontiene 2 Z de proteina (de acuerdo a los valores promedioobtenidos de composicion centesimal), se permite el agregado de3,5 Z de harina de soja (1,7 Z de proteina), esto representa unmaximo de 14,6 Z de proteína de soja respecto del total de pro"teína. En base seca significaría 8,1 Z de harina de soja.

En caso del agregado de aislado como aditivo, eignificaria15 Z de proteina de soja respecto del total de proteína o 4, 65 Zen base seca.

CDDEX.El Codex Alimentarius establece un agregado de 2-3 Zen base seca. Considerando 2,5 Z de aislado y de acuerdo a losvalores promedio obtenidos de composicion centesimal, implicaría1 Z de aislado en producto final (maximopermitido tambien por lalegislación francesa), y 8,3 Z de proteina de SOJarespecto deltotal de proteína.

Los niveles de aditivo exigidos o recomendados por CAA yCodex respectivamente y los porcentajes de sustitución en BaseSeca y/o total de proteina serian:*****************************************************************

Aditivo (Max. Z de Prot. respecto Z en Base Seca**total de prot.*

CAA 3.5 Z H. Soja o 14,6 8,1mezcla con aislado

2 Z aislado 15,0 4,65

Codex 2-3 Z H. Seca 8,3

* Z de proteina de soja respecto del total de proteina de acuerdoa los valores promedios de proteína obtenido del analisis decomposicion centesimal de 16 muestras.** idem en base seca.*****************************************************************

NIVEL DE EXTENSÜR

CAA.Considerando el maximo permitido de 10 Z de texturizadoen Base Seca, y de acuerdo a los valores promedio obtenidos decomposición centesimal, implicaría 17,9 Z de proteina de sojarespecto del total de proteina.

CDDEX. Establece un maximo de 30 Z de proteina de soja

respecto al total de proteina, lo que equivale a 16 Z en baseseca.Los niveles de extensor exigidos o recomendados por CAA y

Codex respectivamente y los porcentajes de sustitución en BaseSeca y/o total de proteína son:**************ini-¡"X"!-**********************-I-****i-**** **-h"*********ir“­

Extensor (Max.) Z de Prot. respecto Z en Base Seca**total de prot.*

CAA 10 Z Texturizado de 17,9 "­Soja en Base Seca

Codex 30 Z del total de -- ióproteinas

* Z de proteina de soja respecto del total de proteina de acuerdoa los valores promedios obtenidos del analisis de composicioncentesimal de 16 muestras.** idem en base seca*****************************************************************

De acuerdo a los cuadros anteriores, el maximopermitido porCAA a nivel de aditivo implicaría 4,6 Z de aislado u 8,1 Z deharina en base seca. Ambosporcentajes son muyelevados respectoa los recomendados por Codex 2*3 Z).

El maximo permitido como extensor en CAAesta xpresado enbase seca. Asi, dos muestras con igual cantidad de soja agregaday similar base seca, pueden cumplir ambas con lo establecido porCAA, pero el grado de sustitución de proteinas carnicas por sojapuede ser muydiferente, si sus contenidos de grasa y proteina sonmuydiferentes.

De acuerdo a los valores promedios hallados a partir de lacomposicion centesimal, el maximoporcentaje de proteinas permi"tido por CAAa nivel de extensor, esta muy cercano al nivel deaditivo admitido por dicho CAAy es sensiblemente inferior almaximo recomendado por Codex a nivel de extensor.

Por otro lado se permite el agregado de 3,5 Z de meaclas deharina con aislado sin especificar la proporcion, por lo cual losporcentajes de sustitución podrían elevarse mas, probablementepor encima del nivel de extensor.

De acuerdo al analisis anterior, en el caso de los productosextendidos, el criterio del Codex de exigir un maximo deproteinas sustituida seria el mas correcto. En el caso delagregado a nivel de aditivo, el maximo permitido por CAAes muyelevado y en caso de utilizarse mesclas harina- aislado, deberiaespecificarss la proporción.

DLSQLJQIM.

EXTRACTABILIDAD

De acuerdo a los datos de extractabilidad de proteinas enproductos comerciales, el rango obtenido es muyamplio, a dife_rencia de los valores obtenidos para muestras de proteinas carni­cas y soja por separado y en mezclas.

Esta variabilidad en 1a determinacion de proteinas, no puedeser atribuible a problemas en 1a solubilidad, sino al alto por­centaje de colágeno que contendrian algunas de las muestrascomerciales, ya que el metodo de Lowry se basa fundamentalemtneen 1a presencia de triptofano y tirosina. El colágeno, altamentedeficiente en triptofano y utilizado comomaterial de relleno,sobretodo en productos de baja calidad, originaria los bajosporcentajes de extractabilidad obtenidos en algunas muestras.PRODUCTOS DE COMPOSICION DESCONOCIDA

Dado que se encontro que las sales de curado no afectaban laresolucion, ni el area del pico de soja de P.M. 19.500 D y deque no existían interferencias de otras proteinas, se procedió acalcular a1 porcentaje de proteina de soja en las muestras comer­ciales.

En total se analizaron 17 muestras, encontrándose presenciade soja en 9 casos, lo que representa el 52,9 Z del total demuestras analizadas. De estas muestras, en 5 1a soja se encontra­ba en niveles cuantificables (55,5 Z de las muestras con soja).

En 1a muestra H4 la proteina de soja fue 18 Z del total delas proteinas extraídas. En esta muestra 1a extractabilidadproteica fue solo del 67,7 Z, (probablemente debido a1 elevadoporcentaje de colágeno). Considerando la extraccion de la protei­na de soja como 100 Z, el porcentaje de proteina de soja respectodel total de proteinas en el producto fue de 12,18 Z .

En la medida que el producto fresco contenía 18,3 Z deproteina, arrojaria 2,23 Z de proteina de soja en el producto.Esto equivaldria a 4,46 Z de harina de soja o 2,5 Z de aislado,valores ambos que superan el nivel de aditivo permitido por CAA.

Dado que el producto contenía 54,4 Z de agua, el porcentajeen base seca seria de 9,78 Z de harina de soja, probablementetexturizado. Este valor es cercano al maximopermitido por CAAcomoextensor. Por tanto este producto deberia haberse rotulado"hamburguesa con soja".

En la muestra S7 los valores que se determinaron fueron:-12,5 Z del total de proteinas extraídas correspondían a soja-1a extractabilidad proteica total fue del 84 ZEsto significa que del total de proteinas en el producto,

10,5 Z corresponden a soja.Dado que el producto contenía 11,95 Z de proteinas, el

porcentaje de proteina de soja en producto fresco, seria de 1,25g. Esto corresponde a 2,5 Z g harina de soja o 1,4 Z de aislado.

De acuerdo a1 CAAdicho agregado corresponde a1 nivel de

aditivo.Dado que el producto contenía 57,3 Z de agua, este porcen­

taje de soja hallado expresado en base seca corresponde a 3,28 Z,por lo cual superaria, aunque levemente, el maximodel Codex paraaditivo.

En el resto de las muestras, en que la soja fue cuantiïica­ble, se encontraba en menorporcentaje, por lo que estaria entodos los casos a nivel de aditivo.

Del total de muestras analizadas en 4 muestras no fueposible medir el area del pico de P.M. 19.500 D. En estasmuestras la soja tambien se encontraría a nivel de aditivo.

De estas muestras es necesario remarcar el caso del lomo decerdo por hallarse expresamente prohibido en el CAAla utiliea“cion de proteina de soja en lomo de cerdo, jamon cocido, paleta(art.323 bis) en productos de pieea entera. Sin embargo se encon"tro en la unica muestra analizada.

De acuerdo a los calculos anteriores, para la cuantificaciónen un producto comercial es necesario:

- determinar en el producto porcentaje de proteina y deagua. A partir de estos datos calcular el porcentaje de proteinasen producto seco y desgrasado.

—determinar proteina en el extracto para calcularporcentaje de extractabilidad respecto del producto seco ydesgrasado.

- a partir del densitograma, calcular porcentaje de sojarespecto de la cantidad de proteina sembrada.

E1 porcentaje de proteina de soja se corrige por 1aextractabilidad obtenida y se relaciona con el porcentaje deproteina en el producto fresco.

En caso de que en un laboratorio no se disponga de densitc"metro, la determinacion se podria realiear en forma semicuantiti"va sembrando distintas mezclas carnemsoja y realizando luegoobservacion directa. En estas mezclas carne-soja, el contenido deproteinas carnicas deberia ser similar al del producto en estu"dio, de manera que los picos de sojamcarne se encuentren enrelación adecuada de acuerdo a lo visto en sistemas modelo carne"soja (punto 4.5.3).

En estos casos en que se desea cuantificar, es convenienteque los volúmenes de siembra de 1a muestra problema y las mues"tras de referencia sean similares, a e{ectos de que no varie el

-r"largo" de la banda, de acuerdo a lo visto en 4.1.a.

Si en una muestra que contiene soja se desea conocer si elagregado es a nivel de aditivo o extensor, seria recomendablesembrar simultaneamente una mezcla carne-soja donde la soja seencuentre en 1a maxima concentración permitida por el CAA comoaditivo y las proteinas cárnicas en la concentracion usual en eltipo de producto en estudio, Por comparacion de areas del picoP.M. 19.500 D de soja, se puede deducir si el nivel de agregadoen la muestra problema, es superior o inferior al permitido comoaditivo.

Si en una muestra sólo se desea detectar 1a posiblepresencia de soja, seria posible obviar 1a cuantificación proteicaen el extracto, sembrandodos volumenes diferentes de la proteinaextraída. .De esta manera, a pesar de 1a gran variación en elporcentaje de extractabilidad proteica, se aseguraria 1a siembrade la cantidad de proteina adecuada para realizar la detecciónpor observacion directa.

4.11 DETECCIDN DE PROTEINAS DE TBIQÜ EN MEZQLfigL

4.11.1 ESTUDIO DE LA DETECCIÜN DE PRDTEINAS DE YEMA. HUEVOEfilfiRÜ, PLASMQ BOVIND, SOJA Y PROTEINAS QfiENICAS. ELECCION DE_BANDAS CARACTERISTICAS

De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio deproteínas extrínsecas en productos cárnicos (punto 4.9), el glu­ten ofrece un perfil electroforetico complejo donde no existepredominio de alguna banda que pueda ser utilizada preferentemen­te para la identificacion.

Debido a la extensa difusion y variedad de alimentos en quese utilizan proteinas de trigo, se estudiaron las condiciones decorrida en que se optimizaba la diferenciación de las proteinasde trigo en mezclas con otras proteínas.

Se sembró harina de trigo sola y con agregado de yema, huevoentero industrial, plasma, soja y proteina de carne. La muestrade yema se preparó en laboratorio, por calentamiento a 1000€ dehuevo entero y posterior separacion de la yema; se tomo muestrade la zona central de 1a yema. La muestra de huevo entero enpolvo fue de origen comercial, asi como la del plasma bovino y desoja.

Se varió la concentración de acrilamida (7,5 10,0 y 12,6 Z)y el pH del gel de separacion fue de 8,80 para 7,5 y 12,6 Z deacrilamida y de 8,80 y 9,00 para 10 Z de acrilamida. Se sembraronen placas con ó lugares de siembra, corriendo las 4 placas simul­taneamente.

Los perfiles electroforeticos y densitogramas de las protei­nas de huevo entero, plasma, soja y proteinas de carne por sepa­rado, se presentaron en las figuras 32, 33 y 34. El perfil elec­troforético de la proteina de yemasola se observa en la fig. 52.

Los perfiles electroforeticos obtenidos y densitogramasrepresentativos de harina de trigo y con agregado de proteina dehuevo entero, yema, plasma bovino o soja, en cada una de lascondiciones de corrida estudiadas, se observan en las {iguras 53­58. En todos los casos se indican con flechas los picos atribui­bles a la proteina agregada; cuando existe superposición depicos, se observa el aumento relativo del mismorespecto de lospicos adyacentes.

Las cantidades de proteina sembrada en las distintas mezclasvarió, a efectos de semejar las proporciones probables de distin­tos alimentos. Asi, la cantidad de proteina de trigo sembrada conagregado de proteina de yema, huevo y plasma, fue de 195 ug. Lascantidades agregadas de las distintas proteinas fueron:

—plasma bovino: 8,53 ug (4,2 Z respecto del total deproteinas);

- huevo entero: 10,03 ug (4,9 Z respecto del total deproteínas);

- yema: 16,24 ug (7,7 Z respecto del total de proteinas).En el caso de la mezcla con soja, las cantidades sembradas

fueron de 170 ug de gluten y 97 ug de soja. En el caso de

loq

d, N. PNIx105

Eig, 52 Densitograma de proteina de yema de huevo a 12,6 X deacrilamida pH 8,80.

7,5%ac¿ H __ 12,6%ac.

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¿Iiun»;a:¡millí¡“"1¿ lt

Üm.¿EL

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+Y +H T +P +so PM +Y +H T +P +So PM

10,0 % ac. 10,0%ac. pH 9,0

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Ï:____ ¿Ïïjámm:;_.aun» _num-pr 2' ¡iiii‘iiguuu-IF uu. lun,“ A. w

+y +H T +P +So-PM +\!+H T "P +50'PM

Fig. 53: Resoluciones electroforeticas de proteinas de trigo yposibles mezclas a: 7,5 % pH 8,80; 10 % pH 8,80 y 9,0; 12,6 % pH8,80. En cada placa de izq. a der.: harina de trigo + proteina deyema (+Y); harina de trigo + proteina de huevo entero (+H);harina de trigo (T); harina de trigo + plasma bovino (+P); harinade trigo + soja (+80); proteinas musculares + harina de trigo(PM).

proteinas musculares, las cantidades de proteinas sembradas fut"ron 88,9 ug de estas y 9,8 ug de gluten, por encontrarse normal­mente el gluten en bajas concentraciones an productos carnicos.

La proteína de trigo (figura 54"57) otrece un perfil elec"troforetico con abundantes picos de alto P.M., obteniéndose lamejor separacion de todas las bandas a 10,0 Z de acrilamida y pH9,00. Aparecen 5 bandas sucesivas muynltidas y de baja concen­tracion (P.M. 90.000, 84.000, 80.000, 74.000 y 67.000 D), unvalle y otra serie de picos débiles; luego presenta 2 picos deelevada concentracion e importante ancho de banda, de P.M. 43.500y 35.000 D; el único pico de bajo P.M. (14.800 D), es tambien deelevado ancho de banda.

Si se compara el proteinograma obtenido para harina de trigoa 7,5 , 10,0 y 12, Z de acrilamida, se observa la gran disminu«cion de nitidez de las bandas a 7.5 Z de acrilamida, sobretodo delos picos de P.M. 43.500 y 35.000 D, a pesar de que la cantidadde proteina de trigo sembrada Fue igual en todos los casos. ñ 7,5Z de acrilamida, se observa la menor altura de pico y mayor anchode banda del proteinograma siendo este el unico registro sinfotoreducción.

La proteina de plasma presenta solo 2 picos (P.M. aparente55.000 y 65.000 D); al agregar proteina de plasma a proteina detrigo, el pico de P.M" 65.000 D aparece en un valle de lasproteinas de trigo, siendo facilmente detectable en todas lascondiciones de corrida.

Si bien la cantidad de plasma agregado fue de solo 8,53 ug,en la medida que esta proteína presenta unicamente 2 picos prin"cipales, el pico de P.H. 65.000 D aparece con gran intensidad,siendo períectamente cuantificable en estas cantidades.

Las proteinas de huevo presentan un pico muy predominantecorrespondiente a la ovoalbúmina (P.M, 45.000 D) que se super“pone con una banda importante de las proteinas de trigo de igualP.M. La banda de P.M. 67.000 D también se superpone con una bandade proteínas de trigo en todas las condiciones estudiadas. Por lotanto, ninguna de ellas aisladamente puede utilizarse para ladetección de huevo, pero contribuyen a la detección, ya que estospicos en presencia de huevo aparecen muyaumentados respecto delresto de las proteinas del trigo. En cambio es de gran utilidadpara la identificacion de proteinas de huevo una banda importan"te y de P.M. aparente 100.000 D que aparece inmediatamente antesde las proteinas de trigo a 7,5 y 10,0 Z de acrilamida; la mismabanda a 12,5 Z se superpone con la primera banda de las proteinnas de trigo. La banda de FHM.200.000 D es de poca intensidad yaparece muyalejada de todas las proteinas del trigo en todaslas condiciones de corrida.

Se utilizo tambien proteina de yemacomoreferencia, ya queel CAA establece normas de control sobre el minimo de huevosagregados a las pastas, en funcion de un contenido mínimo de

101

H.TRIGO+PLASMA

H.TRIGO

+ YlEhfiA

H.TR|G()+HUEVO

PL'TRICiO

F¿g. 54: Densitogramas obtenidos a 7,5 % de acrilamida y pH 8,80de: harina de trigo sola y con agregado de proteina de huevoentero, proteina de yemay proteina de plasma bovino. Se indicancon flechas los picos que aparecen o se intensifican con laproteina agregada. El comienzo del gel de separación se indicacon la letra S.

H.TRI(30+PLASMA

HKTRIG()

+YEMA

H.TR|C¡0

+HUEVO

HfTRICSO

Eig,55: Densitogramas obtenidos a 10 % de acrilamida y pH 8,80de: harina de trigo sola y con agregado de proteina de huevoentero, proteina de yema y proteina de plasma bovino. Se indicancon flechas los picos que aparecen o se intensifican con laproteina agregada. El comienzo del gel de separación se indicacon la letra S.

RTRIGO+PLASMA

¡”moho+YEMA

H.ÏR|GO+HUEVO

HJRIGO

Eig. 56: Densitogramas obtenidos a 10 % de acrilamida y pH 9.0de: harina de trigo sola y con agregado de proteina de huevoentero, proteina de yema y proteina de plasma bovino. Se indicancon flechas los picos que aparecen o se intensifican con laproteina agregada. El comienzo del gel de separación se indicacon la letra S.

HTRKH)

+PLASMA

HÜTRIGC)

4-YIEhlA

H,TRIGC)

+HUEVO

HÍTRICBO

Eig¿fiZ: Densitogramas obtenidos a 12,6 % de acrilamida y pH 8,80de: harina de trigo sola y con agregado de proteina de huevoentero, proteina de yema y proteina de plasma bovino. Se indicancon flechas los picos que aparecen o se intensifican con laproteina agregada. El comienzo del gel de separación se indica conla letra S.

colesterol aportado por la yema.Por esta razon industrialmentepodria agregarse en algunos casos solo yema. fil agregar proteínade yema, aparecen con mayor intensidad las bandas de P.N. aparen­te 100.000 y 200.000 D, sin aparición de la ovoalbúmina.

La banda de P.M. estimado 200.000 D, aparece como un picoimportante en yema de huevo, pero no aparece en la muestra dehuevo entero. Esto podria atribuirse a que siendo la muestra dehuevo entero de origen comercial, esta banda de elevado P.H.podría haber sufrido disminución en el proceso de secado o duran­te almacenaje no adecuado.

En la mezcla de harina de trigo y soja son perfectamentediferenciables ambasproteinas en cualquiera de las condicionesde corrida (figura 58).

En cambio la detección de harina de trigo en mezcla conproteinas carnicas, no se ve favorecida por las variaciones de pHy acrilamida estudiadas, ya que el perfil de proteinas de carnees también muycompleja, -Histiende gran superposición de bandas.La imposibilidad de detectar trigo en mezclas con proteinascarnicas en el presente sistema, coincide con los resultados deotros investigadores (117).

4.11.2 DEIECCIÜN DE F-RUTEIan DE: HUEVO Y PLASMA EN muss1írgnqg?¿__COMERCIALES DE PASTAS m- Hui-¿MQ

Se estudió la aplicabilidad del metodopara detección deproteinas de huevo y plasma en muestras comerciales de {ideos alhuevo de muestro medio, ya que existían referencias de la sustfmtución de huevo por plasma nd sold en milanesas sino también apastas al huevo.

De acuerdo a los resultados obtenidos, las bandas atribuimbles a plasma, proteína de huevo y proteina de trigo, se distri"buyen a 7,5 y 10,0 Z de acrilamida de acuerdo al siguiente esque«ma:

HUEVO (P.M.) GLUTEN (F.M.) PLASMA (P.M.)200.0001 DC)_000

90.000-—-‘ 84_000'—— BC). 000-—I 74_000' —" - - --- 67.000

65. (DOC)—-— 55 . OCIO

- — - - - —— 44-.CHIN)

Se trabajó con 7 muestras de fideos al huevo de diferentesmarcas comerciales. Comoreferencia se utilizaron fideos de gluwten, huevo entero, yema y plasma.

Se trabajo en placas de 14 lugares de siembra, realizando la

813

9L)

i

813

813

Eig, 58: Densitogramas de mezcla de proteina de trigo y soja adistintas concentraciones de acrilamida y pHdel gel de separa­ción. Se indican con flechas los picos atribuibles a soja.

electroforesis a 12,5 Z de acrilamida y pH del gel de separacion8,80. De cada muestra comercial se sembró alrededor de 130 ug demuestra, sin y con agregado de pequeña cantidad de plasma (11,60ug) y de huevo (12,60 ug), en siembras independientes.

De acuerdo a los perfiles electroforeticos obtenidos a12,6 Z de acrilamida (figuras 58 y 59). se olserva:

—la resolucion es excelente en todas las muestras;—se aprecia claramente el aumento de los picos de P.M.

100.000, 67.000 y 45.000 D superpuestas con picos de lasproteinas de trigo; en algunas muestras aparece tambien el picode F.M. 200.000 D.

- la proteina de plasma aparece claramente pudiendose idenwtificar sin dificultad;

Densitogramas representativos de muestras de {ideos comer­ciales que contienen proteina de huevo entero (F3) y proteína dehuevo entero y plasma (F2), se observan en figuras 60 y 61.

Dado que-a 7,5 Z de acrilamida se obtiene mejor resolucionde las proteinas de alto P.M., a pesar de la gran disminución denitidea de las bandas, se realizo 1a electroforesis de lasmismas muestras a esta concentración de acrilamida. Se sembró 180ug de muestra sin y con agregado de plasma (9,12 ug) y proteínade yema (9,12 ug). Las resoluciones obtenidas se observan enfiguras 62 y 63.

En los densitogramas correspondiente (figuras 64 y 65) seobserva:

- el pico de P.M. 100.000 D atribuible a proteina de huevoaparece claramente en todas las muestras (excepto en fideos degluten). Por tanto, todas las muestras contendrian proteina dehuevo, aunque en proporciones variables ya que la altura de dichopico presenta grandes diferencias entre las distintas muestras(por ejemplo F3 y F5). En concordancia con esto y de acuerdo alpunto 4.11.1, las muestras que presentan mayor proporcion deproteina de huevo (F3, F2 y F1) presentan un aumento relativo muyimportante del pico de P.M. 67.000 D.

- en los fideos de gluten (figura 64), así comoen harina detrigo (figuras 66-67), el pico de 44.000 D del trigo aparece engeneral de altura equivalente o inferior a la altura del pico35.000 D; sin embargo al agregar proteína de huevo la superposi­cion con la ovoalhúmina provoca importante aumento relativo delmismo respecto del pico 35.000 D (punto 4.11.1). Si se comparanlos perfiles de las distintas muestras comerciales entre sí y conlos fideos de gluten, se observa que en las muestras F1, 2, F3 yF4 se habria utilizado proteina de huevo entero, mientras que enF5, F6 y F7, se habria utilizado proteinas de yema.

—el pico de 200.000 D aparece en la mayoria de las muesmtras, aunque en algunos casos muy debil (F4, F5 y F6).

- en algunas muestras (F2, F5 y F6), el valle donde apareceel pico de 65.000 D atribuible a plasma bovino no aparece clarammente, por lo que podria encontrarse en bajos niveles;

- el perfil electroforetico de las proteinas de trigo obte­nidos para las distintas muestras es similar, excepto para la

,103

P FG F1 ¡:2 F3 'H

Eig. 59a: Identificacion de proteinas de plasma bovino y huevo enIideos comerciales. Las resoluciones electroforéticas a 12,6 %deacrilamida y pH 8,80 corresponden a 4 muestras de fideos comer­c1ales. De izq. a der.: fideos de gluten (FG) y fideos al huevoF1, F2 y F3; cada muestra se sembró 3 veces, a la izq. conagregado de plasma bovino y a la derecha con agregado de protei­nas de huevo entero. Comoreferencia se sembró proteinas deplasma bovino (P) y proteinas de huevo entero (H).

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Ik.i¡4l IiiH ¡Ill lll ‘¿l,¡II

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P ' F4 F5 F6 ¡:7 y

Fig, 59h: Identificación de proteinas de plasma bovino y huevo enfideos coemrciales. Las resoluciones electroforéticas a 12,6 %deacrilamida y pH 8,80 de 4 muestras de fideos comerciales. De izq.a der.: fideos al huevo F4, F5, F6 y F7; cada muestra se siembrapor triplicado, a la izq. con agregado de plasma bovino y a laderecha con agregado de proteinas de huevo entero o yema. Comoreferencia se sembró proteinas de plasma bovino (P) y proteinasde yema (Y).

F3+HUEVO

F3+PLASMA1

F3

Fig. 60: Densitogramas obtenidos a 12,6 % de acrilamida y pH 8.80de fideos al huevo comerciales (F3) y con agregado de proteina dehuevo y de plasma. Se indican con flechas los picos atribuibles aproteina de huevo en la muestra sin agregado. Con agregado deproteina de huevo o plasma se indican los picos que seintensifican o aparecen. El comienzo del gel de separación seindica con la letra S.

F2+ PLASMA

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Eig, 61: Densitogramas obtenidos a 12,6 % de acrilamida y pH 8,80de fideos al huevo comerciales (F2) y con agregado de proteina dehuevo y de plasma. Se indican con flechas en distintos niveleslos picos atribuibles a proteina de huevo (H) y plasma (P) en lamuestra sin agregado. Con agregado de proteina de huevo o plasmase indican los picos que se intensifican. El comienzo del gel deseparación se indica con la letra S.

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FG F1 Fz' F3.

Fig. 62: Identificación de proteinas de plasma bovino y huevo enfideos comerciales. Las resoluciones electroforéticas a 7,5 %deacrilamida y pH 8,80 corresponden a 4 muestras de fideos comer­ciales. De izq. a der.: fideos de gluten (FG) y fideos al huevoFl, F2 y F3; cada muestra se sembró 3 veces, a la izq. conagregado de plasma bovino y a la derecha con agregado de protei­nas de yema. Se indican con flechas los picos que aparecen o seintensifican con el agregado de plasma (P) o yema (Y) y el picoque se intensifica por superposición con la ovoalbúmina (O).

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F4 F5 F6 F7

Eig. 63: Identificación de proteinas de plasma bovino y huevo enfideos comerciales. Las resoluciones electroforéticas a 7,5 %deacrilamida y pH 8,80 corresponden a 4 muestras de fideos comer- =ciales. De izq. a der.: fideos al huevo F4, F5, F6 y F7; cada fmuestra se siembra por triplicado, a la izq. con agregado de ,plasma bovino y a la derecha con agregado de proteinas de yema. íSe indican con flechas los picos que aparecen o se intensifican fcon el agregado de plasma (P) o yema (Y) y el pico que se inten- 'sifica (en algunos casos) por superposición de la ovoalbúmina (O).>

__.-_.¡¿__Li

Eig. 54 Densitogramas de muestras comerciales de fideos a 7,5 %de acrilamida y pH 8,80: fideos de gluten (FG), y fideos al huevode distintas marcas: F1, F2, F3. Se indican con flechas los picosque aparecen o se intensifican con el agregado de proteina dehuevo entero (H) y plasma (P).

F6

F5

F4

Densitogramas a 7.5 % de acrilamida y pH 8.80 de mues­tras comerciales de fideos al huevos de distintas marcas: F4,F5, F6 y F7. Se indican con flechas los picos atribuibles aproteina de yema (Y).

muestras F2 que presenta intensidad relativa de los picos muydiferente al resto: picos de PuM. 90.000 a 74.000 D de muy bajaintensidad.

DISCQQIÜN. CUMPLIMIENTO CDN CAA

El métodoes aplicable para la diferenciación de proteina deplasma bovino, de proteina de huevo entero y/o yema.

Este metodo también seria aplicable para la detección deproteinas de plasma y de huevo en fideos. Si bien a 10,0 Z deacrilamida pH 9,00 las proteinas de huevo son perfectamentedetectables, a 7,5 Z de acrilamida, a pesar de la gran disminu­cion de nitidez de las bandas, se facilita la detección de pro“tefna de huevo por la mayor resolucion de la zona de elevadoF.M., donde se encuentran las bandas proteicas utiles para suidentificacion.

La sustitución de huevo por plasma no presenta interesnutricional, ya que ambas proteinas son de buen V.B. Sin embargola detección es de gran importancia, ya que deben existir normasque reglamenten su utilizacion y establezcan las exigencias hi­gienico-sanitarias necesarias para dichos productos.

Actualmente el CAA exige para las pastas secas al huevo(art. 713) un minimo de 2 yemas/kg de semola. Dichos productosdeberan contener un minimo de colesterol de 0.04 Z en base seca.

La sangre vacuna contiene alrededor de 190 mg Z de coleste­rol; aunque en plasma quedaria todo el colesterol, es probableque durante el proceso de secado el porcentaje disminuya. Si biendesconocemos el contenido de colesterol que aportaria el plasmabovino seco, se ofrece en nuestro medio un producto comercial conagregado de colesterol a efectos de poder sustituir el huevo porplasma, cumpliendo con el minimoestablecido de colesterol delCAA.

Todo esto indica que el valor de colesterol en que se basael CAApara asegurar un mínimo de huevos presente en las pastasal huevo, no solo no es efectivo (requiriendose otras determina­ciones), sino que para cumplirlo se recurre al agregado externo.Asi se da la paradoja del agregado de colesterol, cuyo elevadocontenido en huevos es indeseable, para cumplir con las exigen"cias del CAA.

En caso de que las autoridades permitan la utilización deproteinas de plasma en pastas (en sustitución parcial o total delas proteinas de huevo), estas deberan presentar diferente rotumlado.

La diferenciación entre gluten y soja tiene importancia enel control de materias primas para la industria carnica, ya queambos se utilizan comoaditivos; resulta por tanto un metodoeficaa para detectar adulteracion por sustitución parcial o to"tal, ya que los precios pueden ser sensiblemente diferentes.

La detección de gluten en productos carnicos no es posiblecomoya habiamos visto, ya que es necesario considerar el comple"

¿7104

jo perfil electroforetico de ambasproteinas y el pequeño porcen­taje en que se suele utiliaar el gluten en productos cárnicos.

9.-_1_-Z__I_DENT IF I C AC I ÜN DE HAR I NAS..-D.E_..QE_ B.E;ÏB.L._._S_.-..

De acuerdo a resultados anteriores, las proteinas de trigo,si bien presentan un perfil electroforetico complejo, son dife­renciables en todas las mezclas analizadas, excepto en mezclascon proteinas carnicas.

La posibilidad de la diferenciación de las distintas hari"nas, seria de interes en el control de materias primas.en gene­ral, y en particular el control de matrias primas para la elabo­ración de alimentos pa'a enfermos celíacos, asi comodel productoterminado.

Se estudió la posibilidad de diferenciar de acuerdo a lasresoluciones electroforeticas, los distintos cereales entre sl, eincluso de algunas otras harinas de oleaginosas de uso corriente.

Se comparóel perfil electroforético de : a) las proteinasde los cereales prohibidos para enfermos celíacos (harina detrigo integral, harina de trigo blanca, harina de avena, harinade cebada, harina de centeno); b) de los permitidos en dichosenfermos (harina de maiz, harina de mijo,I harina de arroz, harinade mandioca) y c) de algunas leguminosas tambien permitidas(harina de soja, harina de garbanzo). Todas estas muestras secompararon ademas con proteinas de leche, huevo y levadura, yaque estas proteinas podrian ser constituyentes normales de algu"nos alimentos comogalletitas, tortas, fideos, etc.

Se realizó la electroforesis a 10,0 Z y 12,5 Z de acrilamidaen placas para 14 muestras. El pH del gel de separación fue 8,89.

Se obtuvieron muybuenas resoluciones proteicas, siendo enprimera instancia diferenciahles entre si todas las muestras, enambas concentraciones de acrilamida (figuras óó y 67).

En el caso de mezclas, es necesario tener en cuenta:1) pueden existir mezclas en las que sean facilmente identi"

ficables los constituyentes.2) cuando los resultados no son claros, es necesario sembrar

por lo menos 2 cantidades diferentes de la muestra problema. Estofacilita la apreciación de los distintos picos: cuandola canti"dad sembrada es elevada, aunque los picos de mayor intensidadgeneralmente enmascaran los picos vecinos, es posible la mejorapreciación de los picos débiles; por el contrario, cantidades desiembra menores permiten la mejor apreciación de las zonas depicos mas intensos.

3) es necesario agregar cada una de las proteinas que sesospeche contiene la mezcla, para confirmar presencia por aumentode intensidad de picos ya existentes, o ausencia por aparición denuevos picos.

4) el nivel de detección de una proteina en una mezcla,depende de cada proteina y de la mezcla, ya que existen proteinascomo la soja, arroz, huevo, plasma, etc, que presentan bandas muy

4105

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pLL'VHMTnAcceMMisgA'GaH

Fig. 66: Identificación de cereales a 12,6 % de acrilamida y pHV8,80. De izq. a der.: proteina de levadura (PL); leche vacuna(LV), harina de mandioca (HM, no aparecen proteinas); harina detrigo blanca (T); harina de trigo integral (Ti); Harina de avena(A); harina de cebada (C); harina de centeno(Ce); harina de maiz(M); harina de mijo (Mi); Harina de soja (So); harina de arroz(AU; harina de garbanzos (Ga); huevo entero (H).

PL'LVT T¡ ACCeM MiSoA'GaH

Fig. 67: Identificacion de cereales a 10,0 %de acrilamida y pH8,80. De izq. a der.: proteina de levadura (PL); leche vacuna(LV), harina de trigo blanca (T); harina de trigo integral (Ti);Harina de avena (A); harina de cebada (C); harina de centeno(Ce);harina de maiz (M); harina de mijo (Mi); Harina de soja (So);harina de arroz (A5; harina de garbanzos (Ga); huevo entero (H).

intensas. En la medida que algunas de estas bandas se presenteaislada en una mezcla, el nivel de detección sera alto.

En particular, la proteina de gluten no presenta picosintensos característicos; esto hace que en una mezcla sea dificilestablecer de antemano cual sera su nivel de detección, asi porejemplo en mezcla con una proteina compleja como las de carne ogarbanzo, en caso de poder identificarse, el nivel de detecciónserá bajo.

Por tanto para el control de alimentos para enfermos ce­líacos, este metodo no puede utilixa'se en todos los casos,siendo de utilidad en los casos en que se comprueba presencia deproteínas de los cereales TACCpara descartar dichos alimentos.

Tambien sera de utilidad en mezclas donde pueda observarseclaramente ausencia de gluten por ofrecer un perfil con pocasbandas. Sin embargo, debe ser utilizado con precaución, ya queen algunos productos con perfiles muycomplejos como los cárniwcos, no es posible asegurar ausencia.

1L1i_LDENILELQflQLQNÑQE PROTEINAS EN PRODUCTOS TEXTURIZADQQ

Se estudió la posibilidad de identi+icar el origen de laproteina utilizada en la elaboracion de texturizados, ya queestas proteinas han sufrido un proceso de alta presion y calenta"miento variable.

Se sembraron las siguientes muestras no comerciales: "extru­dido de mais, de maienmijo (50-50), mais-avena (60"40), sojanmaiz(40-60), arroz, trigo integral, 2 muestras comerciales: un textu­rizado de trigo integral y un thrudido de maiz con queso.

Se realizó 1a electroforesis a 10 Z de acrilamida comparandocon las respectivas harinas sin tratamiento (figura 68).

Los resultados que se obtuvieron fueron desparejos: en losproductos comerciales las proteinas fueron perfectamente identi­ficables. En el caso del extrudido maizwqueso, se realizó elec­troforesis en forma simultanea con caseína y queso. Los densito"gramas correspondiente, junto a harina de maiz se observan en{igura 69. Se puede observar claramente la identificación dequeso y harina de maiz en dicho producto.

En las muestras no comerciales aparecia mucho fondo, apesar de lo cual eran identificables los constituyentes de losextrudidos de maiz, maizuavena y maisrmijo.

En la muestra de arroz extrudido solo era visible la bandade P.M. 19.500 D, por lo que no es posible frente a una muestraproblema asegurar que se trata de arroz.

En el producto de sojawmafz era posible identificar el maizy asegurar que no contenía soja (a pesar de que la proteina desoja estaria al nivel del 40 Z), ya que no aparecía la banda deP.M. 19.500 D que aun en los tratamientos mas drásticos es pos'_ble detectar.

106

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de la proteina de origen en productosextrudidos. De izq. a der.: harina de trigo integral (Ti); pro­ducto comercial de harina de trigo extrudido (ET); extrudido detrigo integral (ETi); harina de arroz (A’); extrudido de arroz(EA); harina de soja (So); extrudido de soja-maiz (ESo-M);harinade avena (A); extrudido maiz-avena (EM-A); harina de mijo (Mi);extrudido maiz-mijo (EM-Mi); harina de maiz (M); extrudido demaiz (EM); extrudido comercial de maiz con queso (EM-Q).

Fig. 68: Identificación

Big, 69: Densitogramas a 12.6 %de acrilamida de caseina (C),queso (Q), extrudido comercial de maiz-queso (EM-Q)y harina demaiz (M).

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Fig. 70: Identificación de soja en productos comerciales nocárnicos. De izq. a der.: harina de mijo (Mi); fideos de trigo—soja-mijo (FT-So-Mi); harina de trigo blanca (T); fideos degluten conteniendo soja (T-So); harina de arroz (A); mezcla decereales arroz-soja (A-So); leches de soja L81,L82, LSBy LS4;harina de soja (So); milanesas de soja (MSC);extrudido sojammaiz(ESQ-M).

C Q1 0102 02 Q3 oa Q4 Q4 Q5 05 So+ + + + +So SO So So So

Fig.' 71: Resoluciones electroforétícas a 15 %de acrilamida dedistintos tipos de quesos y proteina de soja y caseina. De izq. ader.: caseina (U), queso de pasta dura (Q1), queso blanco (Q2)queso de pasta dura (Q3), dos muestras de queso de pasta blanda(Q4 y Q5) y soja (So). Las muestras de queso se sembraron 2 veces:Sln y con agregado de 6,3 ug de soja.

LJiBBQDUQEÉLQMEBQIflLE S....D.E__._S.Q.lfi__(_NQ._QBE(N_I.(¿QSL

Se estudio la posibilidad de identificar soja en productoscomerciales de distinta naturaleza: milanesas de soja comerciali"zadas secas, mezclas con cereales, fideos, leche en polvo yproductos texturizados.

Las muestras extraídas se sembraron en placas con 10,0 Z deacrilamida. En el caso de mesclas, se sembró como referenciatambién la proteína a identificar distinta de la soja.

En las resoluciones electroforeticas obtenidas (figura 7D),se observa:

—fideos: se analiuaron 2 muestras de fideos, uno de altocontenido en gluten con soja, y otro en mezcla de soja con mijoy trigo. La soja se puede detectar perfectamente en las 2 mues­tras, confirmando los resultados obtenidos en 4.11.1. La proteínade trigo también fue identificable sin dificultad en ambas mues_tras. En cambio, la proteina de mijo, a pesar de presentar unabanda muy intensa de P.M. 22.000 D, no aparece, por lo que sesospecha ausencia de dicho cereal.

—mezcla con cereales: en la mezcla de harina de soja conharina de arroz, son perfectamente identificables ambasproteinas, obteniéndose Hcelente resolucion. A pesar de queambas muestras presentan en común una banda muy importante deP.M. 19.500 D, el resto del proteinograma permite la diferencia"ción sin di{icultad, siendo caracteristica de arroz la banda deP.M. 15.000 D.

- leche de soja en polvo: de las 4 muestras, solo en una esperfectamente identificable la soja (LSI); el resto ofrece unperfil similar entre si: desaparecen las bandas de alto P.H.,apareciendo una banda muy difusa en la zona del pico de P.H.39.500 D; en la zona de bajo P.M., aparece fondo continuo, desta_candose levemente la banda de P.M. 19.500 D.

- productos texturilados:a) en la milanesa de soja se obtuvoexcelente resolucion siendo identificable la soja, pero apareceuna banda de P.M.22.000 D no atribuible a soja; este pico podriaatribuirse a mijo, pero se descarta presencia de este por noaparecer el pico característico de P.M. 15.000 D; b) un thrudidomezcla de soja con mai: suministrada por molino procesador ,muestra una resolucion similar a la do leche de soja en polvo, nosiendo identificables ni la soja, ni el mais.

DISCUSION

Para la identificación en mezclas hay que tomar en cuenta enlo posible varias bandas y analizar cada meacla en particular.Así por ejemplo en la mezcla soja- arroz si se tratara de unamezcla incógnita y de acuerdo a los patrones sembrados en estaplaca, se observarla:- la banda de P.M. 15.000 D podria corresponder a arroz y/o mijo;- la banda de P.M. 19.500 D podria corresponder a arroa y/o soja;- la banda de P.M. 22.000 D podría corresponder a mijo;- la banda de P.M.37.ÜOOD podria corresponder a arroz y/o trigo;

107

- la banda de P.M.41.ÜÜOD podría corresponder a soja;- la banda de P.M.44.000 D podría corresponder a soja; aunque sesuperpone con una banda de la proteína de trigo, es atribuible asoja por su nitidez y no a trigo, donde dicha banda aparece muydifusa;- las bandas de P.M.52.00D y óóEODOD,podrian corresponder a soja;—1a banda de P.M.ó9.000 D, podria corresponder a soja y/o arroz.

De acuerdo a esto, la mezcla contieïe soja y arroa. Paradescartar mijo y gluten, si bien no aparece la banda de P.M.57.000 D, atribuible a gluten, ni la de P.M.55.ÜÜOD atribuible amijo, se aconsejaria sembrar la muestra con agregado de pequeñacantidad de ambos tipos de proteinas. '

De las leches de soja en polvo, sólo en una era posibleidentificar soja; si bien de acuerdo a los rótulos, eran aisladosde soja, es probable que las muestras hayan sufrido un tratamien­to termico muyintenso o bien se trate de hidrolizados de soja.

Las muestras texturizadas dieron los mismosresultados queel resto de texturizados:las muestras provenientes del molinoprocesador deben haber sufrido un tratamiento térmico muy inten­so, quedando practicamente solo proteínas de bajo P.M., en cambioen el texturizado comercial que se ofrece comomilanesa de soja,se obtiene excelente resolución electroforetica.

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QUESOS_:__DETECCIDN DE F'RDTEINAS DE_¿{}1

Dado que 1a proteína de soja puede ser utilieada en laelaboración de quesos (41)(42)(162), se estudió si por electrofo­resis era posible su identificación en dichos productos.

Deacuerdo a los perfiles electroforeticos obtenidos previa­mente (figura 32), la proteina de soja es perFectamente diFeren­ciable en un meecla soja/caseina o soja/proteina de leche. Enambos casos los niveles de detección serian óptimos ya que noexiste superposición de picos.

Se extrajeron 5 muestras de quesos comerciales de distintostipos (punto 3.2.8). Se realizó la electroforesis a 12,6 y 15,0 Zde acrilamida a pH 8,80.

En la resolución obtenida a 15,0 Z de acrilamida (figura71), se observa que los distintos tipos de quesos presentanbasicamente el mismoperfil electroforetico con diferente intenmsidad relativa de las mismasbandas preteícas.

Comparando estos perfiles con el perfil obtenido para lacaseina a 12,6 Z de acrilamida (tigura 72), se observa una grandisminución de la banda de 37.000 D en todos los casos; la bandade P.M. 28.Ü00 D no sufre disminución apreciable. Aparecen nuevasbandas proteicas de menor P.M. resultado de la hidrólisisproteica.

En algunas muestras (GFI, QFE, figura 72), aparece una banda

108

0 F2

SOJA

E13, ZZ. Densitogramas obtenidos a 12,6 % de acrilamida paracaseina (C), quesos frescos (QFI y QFZ)y proteina de soja.

que se superpone exactamente con la banda de P.M. 19.500 D deproteina de soja, y otra pequeña banda que tambien podría seratribuible a la banda de soja de P.M. 52.000 D. Sin embargo lasdemasbandas proteicas caracteristicas de proteina de soja, estanausentes.De acuerdo a esto, no es posible asegurar que en dichasmuestras se encuentre proteina de soja presente.

¿ECHE EN POLVO A BASÉ_QE HIDRÜLIZADÜ PRÜTELEÜ: IDENTIFICACION DELA PROTEINA UTILIZHDM

Se dispuso de una muestra comercial de leche en polvo a basede hidroliaado proteico en la cual se desconocía la 'proteinaempleada.

Se realizó la electroforesis a 12,6 Z y 15 Z de acrilamida,utiliaando comoreferencia proteína de soja y caseina. Los densi­togramas obtenidos a 12,6 Z de acrilamida se muestran en fig. 73.

Aparece un importante frente proteico y 5 bandas proteícasdiferenciables. Dos de estas bandas coinciden con los picos de37.000 y 28.000 D de la caseina. Se comparó con el perfil obteni­do para proteina de quesos, observándose coincidencia de 2 bandasproteicas de menor P.M.

Con proteina de soja no existen coincidencias en ningunabanda proteica.

Para confirmar los resultados anteriores y resolver el fren­te proteíco, se repitió 1a electroforesis a 15 Z de acrilamida,sembrando la muestra sin y con agregado de caseina y de proteinade soja. Los densitogramas obtenidos se observan en figura 74. Enla muestra con agregado de caselna Se intensifican los picos deP.M. 37.000 y 28.000 D, mientras que con agregado de soja apare­cen nuevos picos.

DISCUSION

De acuerdo a los perfiles electroforeticos obtenidos paralos distintos quesos, se observa constancia en el perfil electro_foretico, con diferencia en la intensidad relativa de las bandas.

Las 3 bandas principales de la caseina, son perfectamenteidentificables en proteína de quesos, siendo la de P.M. 38.000 D1a que sufre mayor disminución.

Para asegurar presencia de proteina de soja, seria necesariorealizar una elaboración de queso en planta piloto con incorpora­ción de proteina de soja, a efectos de estudiar las modifica­ciones hidroliticas que sufren estas proteinas durante el procesode elaboración y maduración. De esta manera, a1 igual que con lacaseina, seria posible identificar las bandas proteicas remanen­tes o aparicion de nuevas bandas proteicas caracteristicas.

En el caso de la leche en polvo a base de hidrolizado, esposible asegurar que 1a proteína de origen es caseina y no soja.

Es posible agregar que 1a hidrólisis fue en parte enzimáti­ca, ya que debió existir una hidrólisis selectiva en determinadas

109

Figl 73:Densitogramas obtenidos a 12, 6 %de acrilamida de hidro­lizado proteico (HP), caseina (C), soja (So) y queso (Q).Seindican con flechas en el hidrolizado proteico, los picos atri­buibles a caseina ( ) y queso ( ). El frente proteico se indicacomoFP y el comienzo del gel de separación con la letra S.

Fig. 74: Densitogramas obtenidos a lb %de acrilamida de hidroli­zado proteico (HP), con agregado de caseina (HP+C)y proteina desoja (HP+So). Se indican en cada caso la intensificación de picosexistentes o 1a aparición de los mismos.

uniones de las cadenas proteicas que permitieran una rupturasistemática, originando cadenas de menor F.M. Esto coincide conque algunas de las bandas proteicas se superponen con las obteni­das para proteina de queso, donde la hidrólisis también es enzi­mática. Sin embargoel perfil de la proteina hidrolizada tambiénpresenta importante fondo en la zona de bajo P.N., por lo que sededuce existencia de polipeptidos no diferenciables por su P.M.,o sea hidrólisis al azar (a diferencia del perfil de lasproteinas de queso donde no existe fondo , siendo la resoluciónobtenida excelente).

Allá IQENIIFICACIDN DE MATEBIQS_EBIÜAS

A nivel industrial la electroforesis en gel de poliacrilamidase puede utilizar para la identificación de materias primas oadulteración de materias primas de elevado costo con otras decosto inferior. A modode ejemplo se analizaron durante el desa­rrollo del presente trabajo:

—identificación de ligantes para industria carnica rotuladocomosoja, siendo en realidad harina de trigo.

- identificación de yemade huevo en polvo utilizado para 1afabricación de helados.

- identificación de huevo entero en polvo utilizado para lafabricación de rellenos en pastas secas.

- identificación de caseina y gelatina utilizado para laelaboración de postres.

4.17 NIVEL DE DETECCIÓN DEL_ME!QQQ

El nivel de detección varía según el colorante utilizado. ElCoomassie Erilliant Blue R-QSO, tiene un nivel de detección 10veces superior al AmidoBlack (55), por lo cual este se ha dejadopracticamente de utilizar (54). Se ha comenzadoa utilizar colo­rantes de plata 100 veces mas sensible que el Coomassie (capacesde detectar nanogramos)(163), pero se encuentran aún en la etapade prueba (54).

Según la fuente bilbiografica, el nivel de detección deproteinas utilizando CoomassieErilliant Blue R-ESOvaria de 0,5­1 ug (163) a Ü,2—Ü,5ug por banda (54). Algunos investigadoreshan trabajado con colorante de distintos origenes y partidas,estableciendo que la capacidad de tinción varia enormemente(55).

De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente traba_jo, debe tenerse en cuenta:

- en el analisis de alimentos, no es posible establecer unnivel de detección único de proteinas, ya que si bien el metododetecta menosde un ug de proteina por banda, es dificil estable­cer a cuanta proteina corresponde en cada caso particular. Estose debe a que existen proteinas donde aparece una banda predomi­

110'

nante (ejemplo proteina de mijo, maiz, huevo entero), o consti"tuidas por pocas bandas proteícas muyintensas (proteína de soja,plasma, caseina, centeno), mientras otras proteínas son muycom­plejas (proteínas musculares, trigo, garbanzo).

—la detección varia según las condiciones utilizadas: cuan­to menor sea el grosor de la placa de acrilamida, la proteina sedistribuirá en menorsuperficie aumentandoel nivel de detección;por otro lado cuanto mayor es la concentración de acrilamida,mayor es la nitide: por ser menor el ancho de banda, asi porejemplo bandas poco intensas a 7,5 Z de acrilamida, aparecen muydefinidas a 12,6 Z (figura 53). _

- en el caso que se analicen proteinas aisladas, el nivel dedetección sera el del método. En las condiciones utiliaadas, sepudo detectar 1 ug de proteina de soja; si consideramos quepresenta S picos principales, el nivel de detección seria de 0,20ug por banda, limite maximode detección de acuerdo a la biblio­grafía. Por otro lado, también se pudo apreciar el aumento de lospicos atribuibles a proteina de soja en mezcla con lomo de cerdoy cuanti+icar el agregado de 3,45 ug de proteina de soja aproteínas musculares (punto 4.10.3).

—en mezclas el nivel de detección dependerá de la compleji­dad de la meacla en cada caso particular (punto 4.12), aumentandoel nivel de detección en la medida que bandas importantes de losconstituyentes de la mezcla, se presenten aisladas.

111

QQNQLLLSJQNEQ

Del estudio de 1a aplicabilidad en el laboratorio bromatolomgico de 1a electroforesis en gel de poliacrilamida con S h, surge1a importancia de la optimizacion de las condiciones de separa"cion en cada caso en particular._ Ademases importante destacar1a influencia sobre 1a resolución electroforetica, de algunostratamientos térmicos que sufren ciertos alimentos, asi comoeltipo de mezcla proteica de que se trate, para asegurar la aplica"bilidad de esta tecnica analítica.

1) INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE ACRILAMIDA Y DEL PH

La obtención de un frente proteico que migra junto al frentede colorante indica la presencia de proteinas de bajo P.M. noresueltas.

. La influencia del pH en el gel de separacion en presencia deSDS, depende de 1a concentracion de acrilamida: pequeños aumen"tos del pH en el gel de separacion puede modificar la resolucionde las proteínas de bajo P.H. que se mueven junto al límitemóvil, mientras que disminuciones de pH pueden mejorar la resolu“cion de bandas de F.M. intermedio.

Trabajando en presencia de SDS, el aumento del pH del gel deconcentración hasta igualar el pH del gel de separacion, noafecta la resolucion obtenida. Puede obviarse la inclusión delmismocuando se trabaja en tubo; al trabajar en placa es necesamrio la inclusión de un gel de menor concent'acion para evitarpequeños defectos en la gelificación del gel de separación, aligual que en sistema continuo.

Es necesario estudiar para cada caso particular las condi­ciones optimas de separación. Asi por ejemplo para la detecciónde proteina de soja en productos cárnicos, el sistema originariode Laemmli no ofrece buena resolucion de la zona de bajo P.M.,siendo necesario aumentar la concentracion de acrilamida o el pH"

En cambio para la detección de proteínas de huevo en pastasal huevo, no se obtienen ventajas por cambios de pH, ni poraumentos de concentracion de acrilamida, siendo las mejores con"diciones obtenidas 7,5 Z o 10,0 Z de acrilamida, aún cuando seobtenga un importante Frente proteico o gran disminución de 1anitidez de las bandas en el caso de 7,o Z de acrilamida.

2) INFLUENCIA DEL CALENTAMIENTO Y DEL PROCESO

Calentamientos tanto húmedo como seco de hasza [00°C duranteuna hora, no modifican los per{iles electro+oreticos obtenidosmediante esta tecnica, ya que las uniones hidrógeno, unioneshidrofobicas y disulfuru que st producen durante la desnaturali"zación a esta temperatura, son reversibles en presencia de CDSyME. - - -J-w -“.hCalentamientos a temperaturas super1eres a 100 L proVJ-sncambios drásticos por formacion de uniones amida no revorsibioo

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por los reactivos utilizados, apareciendo Fondocontinuo a lolargo de toda la corrida. En este caso la resolucion de lasproteinas de bajo P.M. es fundamental en la identificacion. Asifue posible identificar especies de pescados en productos enlata­dos.

Las modificaciones en la resolucion electroforetica no sedeben a variaciones en la extractabilidad, ya que de acuerdo alos porcentajes obtenidos tanto para proteina de soja, comoparaproteinas carnicas, la extractabilidad no disminuye aún en mueswtras con calentamientsos de 121'C 15 min.

En productos texturizados, la identificacion no siempre esposible. En muestras comerciales y muestras obtenidas en plantapiloto la identificacion fue posible; en cambio en algunas mues"tras extrudidas de elaboracion indtisïi'rial.i la identificación nofue posible.

3) DETECCION Y CUANTIFICAOION DE PROTEINA DE SOJA EN PRODUCTOSALIMENTICIOS

Del estudio de la variación del perfil electroforetico deproteinas de soja segun variedad y procesado se concluye:

u la entractabilidad de 1a proteina de soja en el bu{fer deextracción fue de 93,6 Z con un C.V. de 4,8 Z , para n = 44.

—no -HÍStE variación del perfil obtenido para las varia“dades Halesoy, Hardome, Eoker Hamptony E harinas industriales dela zona de Santa Fe mezcla de variedades.

m el area aspecifica para las variedades mencionadas, mas 2aislados de produccion Extranjera y dos texturizados fue de62,56 i 7,2 x 1o “ amé/ug, para el pico de 17.500 D.

La constancia obtenida en la extractahilidad, perfil elec_troforetico y areas especificas, indican la posibilidad de utiliwzar el presente metodoen la detección y cuantificación de sojaen productos alimenticios.

4) IDENTIFICACION DE PROTEINAS EN PRODUCTOS OARNIOOS

Proteínas extrfnsecas- las proteinas axtrinsecas posibles de identificar en pro“

ductos cárnicos son proteina de soja y globina; la proteina deplasma es posible detectarla sólo cuando es agregada en altasproporciones.

- ninguna de estas proteinas sufre interferencia con otrosposibles agregados.

—estas proteinas son detectablos tanto en chacinadus elabomrados unicamente con carne bovina, carne porcina o con meuclas,por no presentar diferencias de resolucion estas proteinas muscumlares en las zonas de detection de la proteina de soja, qlohina oplasma.

Productos Comercialesn la tecnica se aplico a muestras comerciales sometidas a

proceso de pasteuriaacion y muestras comerciales sin calentamien"

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to. En ambos casos se obtuvo excelente resolucion.- en ambos tipos de muestras comerciales sc detecto agregado

de proteina de soja; globina se detecto en productos pasteurizamdos.

n de las muestras en que se detecto soja, una debia serrotulada "hamburguesacon soja"; en el resto, la soja estaba anivel de aditivo según CAA.

—ningunade las muestras analizadas cumplla con el requisitoexigido por CAAde declararlo en la lista de ingredientes o en elrótulo en el caso de 1a muestra H4.

De acuerdo a las proporciones permitidas por CAA y lascantidades recomendadas por Codex Alimentarius Internacional,seria aconsejable una revision de los limites permitidos por CAGa efectos de disminuir el máximopermitido comoaditivo y elevarel maximopermitido como extensor.

E1 criterio posible a adoptar por CAApodria ser las reco—mendaciones del Codex Alimentarios Internacional, lo cual implimcaria una reduccion del SO Z del maximopermitido como aditivo yun aumento de alrededor del 60 Z del máximo permitido como axtenmsor.

Por otro lado tambien seria necesario analizar el criterioseguido por Francia de permitir un solo tipo de agregado.

Proteínas CárnicasEs posible 1a identificacion del origen vacuno o porcino de

las proteinas carnicas aisladas.Para calcular el porcentaje relativo utilixndo en mezclas,

Si bien en sistema modelo se obtuvo excelente correlación entrela relacion de áreas actina/mioglobina o area especifica de lamioglobina vs porcentaje de carne vacuna, en los productos comer­ciales xiste superposición del pico de 1a mioglobina con lasproteinas del gluten y/o huevo, por lo que dicho calculo se vedificultado.

Si bien no es posible calcular el porcentaje de carne porcina en mezclas, si seria posible detectar proteina carnica deorigen vacuno en productos que debieran ser exclusivamente deorigen porcino. Aún en el caso de que dicha utilizaCLÓn se tratode enmascarar por decoloracion de la carne vacuna con hipocloritoo peróxido de hidrógeno, las proteinas de carne porcina presentandos picos débiles en la sona de F.M. 17.500 D en lugar de un solopico de intensidad apreciable de las proteinas de origen vacuno.Por otro lado, este tipo de adulteracion interesa fundamentalmenmte en los productos de pieea entera que deben ser elaborados conproteinas de carne porcina unicamente (paleta, jamon cocido), yaque en los embutidos de pasta {ina 1a proporcion de carne porcinautilizada es muybaja o nula.

Por otro lado, en la medida que no existen diferencias enlas areas especificas para 1a actina para proteina de origenvacuno y porcino, se calculo el porcentaje de proteina muscularpresente, aún cuando este valor tendria error por exceso porsuperponerse con picos del gluten, proteina extrfnseca de uso

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frecuente. Sin embargo los porcentajes de proteina muscular ha”llados oscilaron en el 50 Z .

La determinación de la cantidad de proteina muscular presen­te por medicion del area de actina, estaria invalidada en losproductos que contengan huevo entero, por la superposición de laactina con la ovoalbúmina, importante pico de las proteinas dehuevo.

Si bien no esta dentro de los objetivos que se plantearon enesta tesis, de acuerdo a los porcentajes de proteina muscularhallados y de acuerdo a los valores obtenidos de composicioncentesimal de los producto pasteur'zados, se puede inferir lanecesidad de reconsiderar estos productos comosustitutos carni­cos, ya que del analisis surge:

- su porcentaje de proteinas totales es considerablementeinferior al de la carne, 12 Z en lugar de EOZ.

men este porcentaje de proteinas debe considerarse la prewsencia de colageno y gluten y eventualmente Hh (todos de muy bajoV.B.), por lo que surge la necesidad de evaluar la calidad nutri"cional de estos productos.

A efectos de tratar de asegurar un minimode proteinas enestos productos, la legislacion de otros paises exige un minimode proteinas presentes (FFF: protein fat free en EEUU). Otrospaises tratan de asegurar que de esas proteinas, un minimosea deorigen muscular, para lo cual exigen minimode proteinas libresde colágeno (Alemania), maximopara la relacion colageno/proteina(Francia), según se detallo en el punto 1.223.

Actualmente el CAAno exige ninguno de estos parametros porlo que sería conveniente la revision por parte de las autoridadesdel CAAa efectos de establecer la legislacion mas adecuada.

5) IDENTIFICACION DE CEREALES Y DLEABINDSAS/LEGUMINÜSAS

Es posible la aplicacion de esta tecnica para la identifica­ción de cereales y oleaginosas/leguminosas.

La identificacion en mezclas es posible en la gran mayoriade los casos, pero es necesario estudiar cada caso particularpara asegurar la existencia de bandas no superpuestas que permi"tan 1a identificacion.

Alimentos para Enfermos CeliacosEn el caso particular de la identificacion de gluten en

alimentos para enfermos celíacos, la tecnica soria útil por lapositiva, es decir descartar todas aquellos alimentos en los quese puede asegurar la existencia de gluten. Esto dependerá de lamezcla, ya que en muchosproductos para preparar sopas, tortas,helados, etc. la presencia de gluten es facilmente dotectable. Encambio, en mezclas por ejemplo con proteínas musculares cuyoperfil es igualmante complejo al de las proteinas de trigo, noes posible asegurar la presencia de gluten, mas aun cuando losagregados de gluten se realizan en pequeña cantidad.

Es necesario tener en cuenta que la presencia de gluten

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los alimentos aun en pequena :antidad, puede provocar la apari­cion de los sintomas clinicos de la enfermedad.

6) IDENTIFICACION DE PLASMA BOVINO Y HUEVO EN PASTAS AL HUEVO

La identificacion de ambostipos de proteinas es perfecta­mente posible por la presente tecnica.

Las muestras de pastas al huevo que se analizaron, todascontenían proteínas de huevo, pero en proporciones muyvariables.

El minimode colesterol en las pastas al huevo exigido porCAAcarece de valor, no solo por la posible utilización_de plasmaque contienen colesterol, sino por el posible agregado del mismoal plasma utilizado, a efectos de cumplir con lo establecido porCAA. Es por tanto necesario controlar el agregado de huevos pormedio de otras determinaciones.

7) IDENTIFICACION DE DISTINTAS PROTEINAS

De acuerdo a los perfiles electroforeticos hallados, seriaposible identificar las siguientes proteinas:

" proteínas de sangre bovina y subproductos (plasma, suero,hemoglobina);

- proteinas de huevo entero y yema de huevo;n proteinas lácteas (leche entera, suero lacteo, ceseina,

hidrolizados de caseina);—proteinas de cereales (trigo, avena, cebada, centeno,

mijo, maiz, arroz);- proteinas de leguminosas (garbanzo, soja);- identificacion de especies en pescados enlatados y

proteinas de origen bovino y/o porcino.

B) INCORPORACION DE LA ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA(PAGE) CON SDS AL CAA

La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia deSDS y ME, es una tecnica de facil implementacion en cualquierlaboratorio bromatologico, de bajo costo , sin requerir personalaltamente especialieado.

De acuerdo a los resultados obtenidos, se propone la incorporacion de dicha tecnica analítica al CAA en los siguientecasos:

- detección y cuantificación de soja en productos cárnicos;- detección de proteinas de origen vacuno en productos que

debieran ser elaborados exclusivamente con proteinas de origenporcino

n detección y posible cuantificación te plasma bovino yhuevo en pastas al huevo.

- identificación de cereales y /o oleaginosas o posiblesmezclas.

—identiíicacion de especies de pescados enlatados.- se contemple su posible utilixacion en identificacion de

materias primas utiliïadas en productos extrudidos y leches en¿a.. DRA. MIRTA E. ‘-' - ­

PRoFESORAA.).;.-JJW DEPARTAMENTODEBROMATOLOGIApanEN {AL

Y NUTR|CION ¡ax _ IFALGUTAD DE FARHAGM Y ¡(OQUMH‘A

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