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MEMORIA DE PRÁCTICAS. INTRODUCCIÓN. La siguiente memoria trata sobre las prácticas realizadas en la empresa Biorama (Guijuelo) desde el 1 de Julio de 2008 al 29 de Agosto de 2008 (ambos inclusive). En dicha empresa se realiza servicio integrado de calidad y consta de laboratorio microbiológico y físico-químico donde se realizan diferentes tipos de análisis que detallaré más adelante. MATERIALES. Ambos laboratorios constan de todos los materiales y maquinaria necesarios para la realización de los análisis. MATERIAL DE VIDRIO:

- Balones de rotavapor. - Embudos de diferentes tamaños. - Isograduados. - Probetas. - Matraces aforados. - Matraces erlenmeyer. - Vasos de precipitado. - Tubos de ensayo. - Buretas. - Cápsulas. - Varillas de vidrio. - Vidrios de reloj. - Matraces Kjeldhal.

En el laboratorio existe material de diferentes volúmenes y material esterilizado por el autoclave que es necesario para algunos procedimientos. APARATOS:

- Cromatógrafo. - Campana de desecación.

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- Centrífuga. - Conductivímetro. - Phmetro. - Estufas eléctricas reguladas a diferentes temperaturas. - Cuerpo extractor soxhlet. - Rotavapor. - Campana de extracción. - Placa calefactora. - Balanza analítica. - Baño maría. - Campana de flujo laminar. - Digestor. - Batería calefactora. - Baño de arena. - Destilador. - Espectofotómetro.

Cromatógrafo Centrífuga Conductivímetro

Phmetro Rotavapor Destilador

Espectofotómetro. Destilador de Nitrógeno.

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RUTINA DIARIA. Mi horario de prácticas era de 8 de la mañana a las 3 de la tarde. Lo primero que debía hacer era anotar las temperaturas de ambos laboratorios y de todos los frigoríficos y congeladores que hay en el laboratorio. Tras esto debía comprobar la conductividad del agua destilada, el valor no debería sobrepasar los 3 micro siemens. Lo anotaba en sus cuadernos correspondientes para llevar un control diario de las temperaturas y de la calidad del agua destilada. De las muestra que llegaban al laboratorio se realizaban diferentes procedimientos, paso a detallar cada uno de ellos. PROCEDIMIENTOS. NITRITOS. MATERIAL Y APARATOS.

- Baño maría. - Papel de filtro. - Espectofotómetro. - Tubos de ensayo.

REACTIVOS.

- Ácido acético glacial. - Ácido sulfanílico. - Agua destilada. - Carbón activo en polvo. - 1- naftilamina cloruro. - Sodio cloruro. - Sodio nitrito.

REACTIVO COLORIMÉTRICO:

- Solución I: Disolver calentando al baño maría 1,5 gramos de ácido sulfanílico en 50 ml de ácido acético glacial y 100 ml de agua destilada. Añadir 50 ml de una solución de sodio cloruro que contenga 100 g/l de sodio cloruro (5 g de sodio cloruro en 50 ml de agua destilada). Enrasar con agua destilada hasta 250 ml.

- Solución II: Disolver 0,4 g de 1- naftilamina en 100 ml de agua destilada, esta es la solución madre. Se toman 25 ml de la solución

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madre, se añaden 50 ml de ácido acético glacial y se enrasa con agua destilada hasta 250 ml.

El reactivo colorimétrico se obtiene mezclando volúmenes iguales de ambas soluciones. - Solución patrón sodio-nitrito: Pesar, con aproximación de 1 mg, 0,25

g de sodio nitrito, disolver en agua destilada y completar hasta 250 ml. Tomar 1 ml de esta solución e introducirla en un matraz aforado de 200 ml y enrasar con agua destilada.

PROCEDIMIENTO. Preparamos el extracto igual que en la analítica de cloruros. Del extracto obtenido, tomamos 25 ml y añadimos 1 g de carbón activo en polvo si es necesario decolorar. Filtramos hasta que el filtrado sea transparente y de éste tomamos una alícuota de 10 ml en un tubo de ensayo. Añadimos 10 ml del reactivo colorimétrico, mezclamos y dejamos la solución en reposo durante 15 minutos al abrigo de la luz. A partir de 20 minutos y antes de 4 horas, medir la densidad óptica de la solución a λ=520 nm. Tomar de la solución patrón alícuotas de 5, 10 y 20 ml y llevar a 100 ml de agua destilada. El contenido de estas disoluciones es de 0.25, 0.5 y 1 p.p.m de nitrito sodio. Transferir 10 ml del raeactivo colorimétrico y proceder a su valoración colorimétrica a 520 nm. Con la absorbancia obtenida en la medición y la curva patrón obtenemos las p.p.m de sodio nitrito que tiene la solución, a partir de aquí, calculamos: p.p.m NaNO² = C. 2 x 500 m.v C: Concentración en sodio nitrito expresado en p.p.m determinada en la curva patrón. m: peso de la muestra. V: volumen en ml tomado del extracto decolorado.

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NITRATOS. MATERIAL Y APARATOS.

- Matraces aforados de 50 ml. - Espectofotómetro.

REACTIVOS.

- Ácido clorhídrico 37.5%. - Ácido sulfanílico. - Agua destilada. - Ácido sulfúrico 96%. - Brucina. - Potasio nitrato.

Reactivo brucina- ácido sulfanílico: Disolver 1 g de brucina y 0.1 g de ácido sulfanílico en unos 70 ml de agua destilada caliente. Añadir 3 ml de ácido clorhídrico 37.5% dejar enfriar y enrasar a 100 ml de agua destilada. Solución de ácido sulfúrico: Añadir 500ml de ácido sulfúrico al 96% a 75 ml de agua destilada y conservar herméticamente cerrado. Solución patrón nitratos: Disolver 0.04 g de potasio nitrato en agua destilada y enrasar a 250 ml. PROCEDIMIENTO. Preparamos el extracto igual que en la analítica de cloruros. En un matraz aforado de 50 ml introducimos 10 ml del extracto y 1 ml del reactivo brucian- ácido sulfanílico, mezclamos y dejamos en reposo 10 minutos al abrigo de la luz. Pasado este tiempo, añadimos agitando agua destilada hasta completar unos 40 ml y dejamos en reposo 15 minutos en oscuridad. Enfriamos el matraz en un baño de agua fría hasta que alcance temperatura ambiente, preferiblemente en oscuridad. Alcanzada la temperatura enrasar hasta 50 ml de agua destilada, homogeneizar y leer absorbancia a 410 nm. El cero se ajusta con agua destilada sometida al procedimiento anteriormente descrito.

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CÁLCULOS. Llevar la absorbancia obtenida a la curva patrón y expresar el correspondiente contenido en mg/Kg. CLORUROS. MATERIAL Y APARATOS.

- Balanza analítica. - Embudos. - Placa calefactora. - Agitador metálico con calefacción. - Centrífuga y tubos de base redonda de 100 ml.

REACTIVOS.

- Ácido nítrico 60%. - Agua destilada. - Alcohol etílico 60%. - Hierro III y amonio sulfato 12-hidrato. - Nitrobenceno. - Plata nitrato 0.1 N. - Potasio ferrocianuro 0.1 N. - Zinc acetato 2- hidrato.

Solución acuosa de hierro III y amonio sulfato 4%: Poner 4 g de hierro III y 2 g de amonio sulfato 12 hidrato en 100 ml de agua destilada. Reactivo de Carrez:

- I solución acuosa de potasio ferrocianuro 15%: 15 g de potasio ferrocianuro 3-hidrato en 100 ml de agua destilada.

- II solución acuosa de zinc acetato 30%: 30 g de zinc acetato 2-hidrato en 100 ml de agua destilada.

PROCEDIMIENTO. Preparar, con precisión de 1 g, 10 g de la muestra e introducirla en un erlenmeyer de 250 ml. Añadir 150 ml de alcohol etílico 40%. Poner en el agitador y calentar suavemente durante 1 hora. Trasvasar a un matraz aforado de 250 ml y añadir 5 ml de cada reactivo de carrez y enrasar con agua destilada. Agitar y dejar reposar 10 minutos. Centrifugar 5 minutos a

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2000 r.p.m. Separar la grasa sobrenadante, filtrar en el matraz de 200 ml hasta enrase. Verter el contenido en un vaso de 500 ml y colocarlo en la placa calefactora y evaporar el líquido hasta aproximadamente 100 ml para eliminar el alcohol. Dejar enfriar y llevar el líquido al matraz de 200 ml y enrasar con agua destilada. Valorar introduciendo el líquido en un erlenmeyer de 250 ml agitando suavemente entre adicción y adicción:

- 10 ml de nitrato de plata 0.1 N. - 10 ml de ácido nítrico 60%. - 1 ml de la solución hierro III y amonio sulfato 4%. - 10 ml del extracto problema. - 50 ml de agua destilada.

Dejar reposar durante 10 minutos en oscuridad. Añadir 1 ml de nitrobenceno para aglomerar el precipitado y obtener una solución limpia. Valorar el exceso de nitrato de plata con potasio tiosulfato hasta viraje. CÁLCULOS. % Cloruros = 14.625 (10-n) P P: Peso, en gramos, de la muestra. n: Volumen, en ml, de potasio tiosulfato 0.1 N gastados. HUMEDAD EN CARNES. MATERIAL Y APARATOS.

- Balanza analítica. - Cápsulas. - Varillas finas de vidrio. - Desecador. - Baño maría. - Estufa eléctrica regulada a 102 ºC.

REACTIVOS.

- Etanol 96%.

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- Arena de mar lavada. - Gel de sílice como indicador.

PROCEDIMIENTO. Secar la cápsula conteniendo una cantidad de arena de mar lavada igual a 3 o 4 veces el peso de la muestra durante 30 minutos en la estufa regulada a 102 ºC. Sacarla de la estufa e introducirla en el desecador hasta que alcance la temperatura ambiente. Pesar 5 g de la muestra con precisión 0.1 g. Añadir a la cápsula 5 ml de etanol al 96 % y remover la mezcla con la varilla de vidrio. Colocar la cápsula en el baño a 60-80 ºC hasta que se evapore el etanol. Secar la muestra durante 4 horas en la estufa y colocarla en el desecador hasta que alcance la temperatura ambiente. Pesar la cápsula con precisión de 0.1 mg. CÁLCULOS. % humedad: (M1 – M2). 100 M1-M0 M0: Masa, en gramos, de la cápsula, la varilla y la arena. M1: Masa, en gramos, de la cápsula, varilla y la muestra antes del desecado. M2: Masa, en gramos, de la cápsula, la varilla, la arena y la muestra después del desecado. GRASA EN CARNES. MATERIAL Y APARATOS.

- Cuerpo extractor Soxhlet. - Placa calefactora. - Estufa eléctrica. - Embudos. - Matraces erlenmeyer. - Vidrios de reloj. - Papel de filtro. - Balanza analítica. - Desecador.

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REACTIVOS.

- Éter dietílico. - Ácido clorhídrico 3N.

PROCEDIMIENTOS. Pesar 2.5 g de muestra en un matraz, añadir 100 ml de HCl 3N y unas perlas de vidrio. Cubrir con un vidrio de reloj y poner en ebullición 1 hora. Enfriar y filtrar sobre doble filtro, lavar el residuo con agua fría hasta la desaparición de la reacción ácida verificándolo con medición de pH. Colocar los papeles de filtro con el residuo sobre un reloj de vidrio y desecarlos durante hora y media a 95-98ºC. Introducir los filtros desecados en un cartucho soxhlet. Tarar el matraz del soxhlet y echarle 220 ml de éter, colocar el matraz en el cuerpo extractor ajustando los niveles del mismo para conseguir 15 sifonadas por hora, el tiempo de extracción es hora y media. Eliminar el disolvente en la estufa a 75ºC durante hora y media, colocar el matraz en el desecador hasta alcanzar la temperatura ambiente y pesar. CÁLCULOS. % grasa: P´ - p x 100 P´´ P: Peso en gramos del matraz. P´: Peso en gramos del matraz con la muestra. P´´: peso en gramos de la muestra. NITRÓGENO/PROTEÍNAS EN CARNE MATERIAL Y APARATOS.

- Balanza analítica. - Batería calefactora. - Probetas. - Matraces Kjeldhal. - Erlenmeyer de 200 ml. - Bureta.

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REACTIVOS.

- Ácido bórico. - Ácido clorhídrico 0.1N. - Ácido sulfúrico 96%. - Etanol 96%. - Azul de metileno. - Cobre II sulfato 5 hidrato. - Indicador mixto. - Potasio sulfato. - Rojo de metilo. - Selenio metal polvo. - Sodio hidróxido 40%. - Papel de análisis.

CATALIZADOR. Para hacer 500 g mezclar:

- 482.5 g de potasio sulfato. - 7.5 g de cobre II sulfato 5 hidrato. - 10.0 g de selenito.

PROCEDIMIENTO. Combustión: Pesar aproximadamente 1.5 g de muestra y envolverla en papel de análisis exento de nitrógeno. Llevar la muestra pesada al matraz Kjeldhal e introducir: 15 g de catalizador y 25 ml de ácido sulfúrico 96%. Mezclar suavemente por rotación y colocar el matraz en la batería calefactora a 220 ºC durante 30 minutos. Pasado ese tiempo agitar los matraces, subir la temperatura a 330 ºC y mantenerla durante 1 hora. Cuando ya se ha llevado a cabo la combustión de la muestra, el contenido de los tubos presenta una coloración amarilla verdosa, se sube la temperatura a 440 ºC y se mantiene 2 horas. Al final de la combustión el contenido de los tubos debe presentar una coloración verde fluorescente. Dejar enfriar sin que cristalice la muestra y añadir 100 ml de agua destilada, dejar reposar hasta el enfriamiento de los tubos. Añadir 100 ml de hidróxido sódico al 40%.

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Destilación. Introducir la alargadera del aparato de destilación en un erlenmeyer de 200 ml que contenga agua destilada, colocar el tubo digestor con 50 ml de agua destilada en el aparato de destilación y programar la destilación automática para 4 minutos. Introducir la alargadera del aparato de destilación en un erlenmeyer de 200 ml que contenga 25 ml de ácido bórico al 4% y unas gotas del indicador, colocar el tubo digestor con la muestra y programar para destilación automática 6 minutos. Valorar el destilado recogido con HCl 0.1N. CÁLCULOS. % N TOTAL: 0.14 f (v1 – v2) P f: factor de ácido clorhídrico. V1: Volumen en ml de ácido gastado en la valoración de la muestra. V2: Volumen en ml de ácido gastado en la valoración del blanco. P: Peso en gramos de la muestra. % PROTEÍNA TOTAL: 6.25 x % nitrógeno total. HIDROXIPROLINA. MATERIAL Y APARATOS.

- Baño de arena. - Balanza electrónica. - Espectofotómetro.

REACTIVOS.

- Ácido cítrico anhidro. - Ácido clorhídrico 37%. - Ácido perclórico 60%. - 2 propanol. - Cloramina T3 hidrato. - 4- dimetilamino benzaldehido DC L- hidroxiprolina. - Sodio acetato anhidro. - Trisodio citrato 2 hidrato.

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- Sodio hidróxido. - L- hidroxiprolina.

SOLUCIONES.

- Solución de ácido clorhídrico 50%: Añadir en un matraz de 100 ml, 50 ml de HCl 37% y enrasar con agua destilada.

- Solución concentrada de hidróxido de sodio: Añadir en un matraz de 100 ml, 40 g de sodio hidróxido en lentejas y enrasar con agua destilada.

- Solución 10% hidróxido de sodio: Añadir en un matraz de 100 ml, 10 g de sodio hidróxido en lentejas y enrasar con agua destilada.

- Solución oxidante: Un volumen de solución Cloramina T y cuatro volúmenes de solución tampón.

• Solución Cloramina T 3 hidrato 10.5%: Añadir en un matraz de 100 ml, 10.5 g de Cloramina T y enrasar con agua destilada.

• Solución tampón: Añadir 1.02 g de sodio acetato anhidro, 1.16 g de Trisodio citrato 2 hidrato, 0.165 g de ácido cítrico y 11.55 ml de 2- propanol. Enrasar a 30 ml.

- Solución ácido perclórico 17.5%: Añadir en un matraz de 100 ml, 29.16 ml de ácido perclórico 60% y enrasar con agua destilada.

- Solución BMBA: Añadir en un matraz de 100 ml, 5 g de dimetilamino benzaldehido y enrasar con 2 propanol.

PROCEDIMIENTO. Pesar 3 g de la muestra e introducirla en un matraz de 250 ml, añadir perlas de vidrio y 50 ml de ácido clorhídrico al 50%. Colocar en el baño de arena durante 7 horas en ebullición suave, transcurrido ese tiempo refrigerarlos bajo chorro de agua. Añadir 28 ml de solución concentrada de hidróxido potasio y ajustar el pH a 6 o 7 añadiendo gota a gota solución de hidróxido sódico al 10%. Transferir el contenido del erlenmeyer a un matraz aforado de 200 ml, enrasar y reposar 1 hora. Filtrar el contenido del matraz. Tomar una alícuota de 5 ml del filtrado y diluirla 10 o 20 veces con agua destilada y hacer la curva patrón. CURVA PATRÓN.

- Solución madre (400µg/ml): 2 mg de hidroxiprolina L en 5 ml de agua destilada.

- Soluciones de concentración conocida:

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• (5 µg/ml): 0.25 ml de solución madre en 20 ml de agua destilada.

• (10µg/ml): 0.50 ml de solución madre en 20 ml de agua destilada.

• (20µg/ml): 1.0 ml de solución madre en 20 ml de agua destilada.

- En una batería de tubos aforados a 12 ml añadir: • Blanco: 1 ml de agua destilada + 2 ml de 2-propanol + 0.2 ml

de Cloramina T + 0.8 ml de solución tampón. • (5µg/ml): 1 ml (5µg/ml) + 2 ml 2-propanol + 0.2 ml de

Cloramina T + 0.8 ml de solución tampón. • (10µg/ml): 1 ml (10µg/ml) + 2 ml 2-propanol + 0.2 ml de

Cloramina T + 0.8 ml de solución tampón. • (20µg/ml): 1 ml (20µg/ml) + 2 ml de 2-propanol + 0.2 ml de

Cloramina T + 0.8 ml de solución tampón. • Muestra: 1ml muestra diluida + 2 ml 2-propanol + 0.2 ml de

Cloramina T + 0.8 ml de solución tampón. Agitar y dejar reposar durante 10 minutos, añadir a cada tubo 3 ml de ácido perclórico 17.5% y 2 ml de DMBA. Colocar al baño maría a 60ºC durante 20 minutos, enfriar bajo chorro de agua fría. Leer en el Espectofotómetro a 560 nm. CÁLCULOS. L-H % = Xd 50p X: Cantidad de hidroxiprolina leída en la curva patrón. P: peso inicial de la muestra. D: dilución del filtrado realizado. OXIDABILIDAD. MATERIAL Y APARATOS. Se preparan matraces previamente, se añaden 100 ml de agua destilada y perlas de vidrio a los matraces volumétricos necesarios para el ensayo y se procede exactamente como en el ensayo. Terminado este ensayo se vierte el contenido y ya están preparados para la analítica completa.

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REACTIVOS.

- Ácido oxálico 0.1N. - Ácido sulfúrico 96%. - Potasio permanganato 0.1N.

SOLUCIONES.

- Solución de ácido sulfúrico al 25%: 25 ml de ácido en 100 ml de agua destilada.

- Solución ácido oxálico 0.01N: Preparar en el momento de su uso a partir de 0.1N (10 ml de solución: 1 ml 0.1N en 10 ml de agua).

- Solución permanganato potásico 0.01N: Preparar a partir de permanganato potásico 0.1N.

- Solución ácido sulfúrico al 50%: 25 ml de ácido en 50 ml de agua destilada.

PROCEDIMIENTO. Comprobar si la muestra tiene nitritos, en caso positivo hervir la muestra durante 10 minutos antes de la adición de permanganato. Colocar 100 ml de la muestra problema en al matraz y añadirle 10 ml de la solución ácido sulfúrico 25% y perlas de vidrio. Calentar hasta ebullición (si la muestra tiene nitritos mantener en ebullición 15 minutos, el agua evaporada se sustituye por agua destilada y se prosigue con el ensayo). A la solución hirviente se le añaden 25 ml de solución permanganato 0.01N y se mantiene en ebullición 10 minutos, pasados los 10 minutos se añade 30 ml de solución oxálico 0.01N y se continúa la ebullición hasta transparencia. Se valora con el permanganato titulado hasta coloración rosada persistente. DETECCIÓN DE RESIDUOS DE INHIBIDORES. La leche, la carne, los productos de la acuicultura y otros productos procedentes de animales enfermos y tratados con antibióticos, sulfamidas u otras biocidas quedan contaminados por los mismos. El RD 1749/98 regula la detección de residuos de sustancias antibacterianas en tejidos animales ya que los alimentos con inhibidores presentan un importante riesgo para las personas alérgicas a los mismos, además de crear resistencias microbianas de difícil solución en la lucha contra patógenos.

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ANTIBIOTIC MICROKIT TEST. Se trata de un test de screning primario sensible a la mayoría de los antibióticos (excepto a la polimixina) presentes en el mercado y a otros muchos inhibidores de crecimiento microbiano. Se trata de un medio especial preparado para tests cualitativos que contienen altas concentraciones de esporas de Bacillus stearothermofilus variedad calidolactis y un indicador de pH. Este medio es de color lila. Al germinar las esporas, la acidificación consecuente al metabolismo produce un viraje del lila al amarillo. En presencia de inhibidores, las esporas no germinan y el medio continúa de color lila. EXTRACCIÓN E INOCULACIÓN. En leche y otros líquidos se añaden tres gotas de la muestra en un tubo de kit. Hay que evitar contaminaciones cruzadas usando una pipeta distinta para cada muestra ajustando el pH del líquido entre 6 y 7. En alimentos y otros sólidos se mezclan 10 g de la muestra triturada con 40 ml de tampón fosfato al 1% y a pH 6. Macerar agitando con perlas de vidrio durante 20- 45 minutos, el material debe estar libre de residuos inhibidores (detergente o alcohol). Decantar, filtrar y utilizar directamente el extracto claro añadiendo tres gotas del kit. INCUBACIÓN. Conviene atemperar los tubos desde la nevera a 64ºC durante una hora, para acortar el tiempo de incubación (1-4 horas en lugar de 2-5 horas), siendo fundamental evitar variaciones de temperatura. Dejar en el baño a 64ºC durante 3 horas. LECTURA DE LOS RESULTADOS. Analizar bajo luz intensa el color final del tubo. Los que permanezcan de color lila son positivos, ya que al haber inhibidores en la muestra las esporas no han germinado, no han acidificado el medio y no se ha producido viraje de color. Los tubos que aparecen de color crema o con zonas claramente amarillas son negativos, ya que al no haber inhibidores en la muestra las esporas han germinado, al crecer han acidificado el medio y ha virado a amarillo. Los cambios de color posteriores a las 5 horas y media no son indicativos de prueba negativa ya que a largas incubaciones acaba virando por inactivación del inhibidor.

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ANÁLISIS PARA POTABILIDAD DEL AGUA. MATERIAL Y APARATOS.

- Vasos de precipitado. - Phmetro - Conductivímetro. - Turbidimetro.

REACTIVOS.

- Kit de amonio. - Kit de cloro.

PROCEDIMIENTO. Lo primero es determinar el olor, sabor y olor del agua, se le asigna números poniendo el 0 si es totalmente transparente y 1, 2…según el color va siendo mayor. Después se determina el pH cuyos valores deben ser superiores a 6.5, la conductividad que se expresa en microsiemens y la turbidez. Se determina cantidad de amonio y cloro mediante los kits correspondientes. Tras el análisis físico químico se realiza el análisis microbiológico. A los botes del agua se le añade tiosulfato sódico para neutralizar los agentes antimicrobianos, tras eso se filtran 100 ml de la muestra a través de un filtro estéril de 0.45 µn de diámetro de poro. El filtro se deposita en placas, usando pinzas estériles, donde hay medios para determinar la existencia de diferentes microorganismos:

- Aerobios en medio TSA agar, se usa la siembra en masa y se cuentan todas las colonias expresando el resultado en número de colonias por ml.

- Coliformes en medio agar Chapman TTC. Las colonias que crezcan con color rojo serán consideradas sospechosas. Las colonias sospechosas deben ser confirmadas por la oxidasa negativa, se coloca la colonia sospechosa en un soporte de vidrio o papel secante y le añadimos unas gotas del reactivo (p etilendiamina). Si se produce un viraje azul la colonia es oxidasa positiva si no aparece viraje azul se considera oxidasa negativa.

- E.Coli en medio agar Chapman TTC y 2,2,5 trifenil dihidrato tetrazolio cloruro. Las colonias que crezcan con coloración amarilla serán consideradas sospechosas, se confirman mediante 2 pruebas: prueba de la oxidasa (descrita anteriormente) y prueba del indol en la

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que las colonias sospechosas se inoculan en agua de peptona y se incuba a 37 ºC durante 24 horas, posteriormente se añade al tubo unas gotas del reactivo de Kovacs, si aparece un anillo color rosa/ rojo se considera indol positivo, si el anillo es de color amarillento es indol negativo. El resultado se expresa en u.f.c./100 ml.

- Clostridium perfringes en medio TSC, en esta placa tras depositar el filtro hay que poner otra capa del medio ya que el microorganismo se desarrolla en anaerobiosis. Las colonias que aparezcan con coloración negra serán consideradas sospechosas. El resultado se expresa en u.f.c./100 ml.

Las placas deben incubarse para que se desarrollen los microorganismos, la placa de aerobeos se incuba a 22 ºC durante 48 horas y las tres restantes a 37 ºC durante 24 horas. Un análisis especial que se hace en algunas aguas es la detección de Legionella. Se deben neutralizar los agentes antimicrobianos con tiosulfato sódico igual que en los casos anteriores, se realiza la filtración de 100 ml de agua a través de un filtro estéril, se añaden 35 ml de solución ácida y se deja reposar 5 minutos. Tras esto se lava el filtro con agua destilada estéril ayudándonos de pinzas estériles. Ponemos el filtro en la placa con el medio BCYE y se incuba a 37ºC durante 10 días. Las colonias típicas de Legionella crecidas sobre la membrana blanca aparecen blancas con matices azulados, aunque también pueden aparecer otras coloraciones como marrón, rosa, verde lima o rojo profundo. Las colonias sospechosas se resiembran de nuevo en medios secundarios de BCYE y agar sangre y se incuban a 37ºC durante dos días. Todas las colonias que crecen sobre BCYE y no crecen sobre agar sangre se consideran Legionella sp, el resultado se expresa en u.f.c. /100 ml o en caso de ausencia como “no detectado”. ANÁLISIS DE COMIDA. El análisis se realiza en condiciones de esterilidad usando un mechero que crea condiciones de esterilidad en la zona circundante y bajo la campana de flujo laminar. MATERIAL Y APARATOS.

- Vidrios de reloj estériles. - Cucharillas estériles. - Probetas estériles. - Pinzas estériles.

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- Bolsas estériles. - Balanza analítica.

REACTIVOS.

- Fraser para Lysteria. - Peptona.

PROCEDIMIENTO. Se pesan 10 g de la muestra y se ponen dentro de la bolsa estéril a la que se añade 100 ml de peptona. Se pesan otros 10 g y se depositan en otra bolsa estéril a la cual, se le añade 100 ml de Fraser. Se llevan al triturador y posteriormente se vierte el contenido (procurando que únicamente caiga líquido) en tubos estériles que están rotulados con el número de la muestra. A partir de los tubos se hacen los diferentes análisis para la detección de los diferentes microorganismos. Lysteria monocitogenes. Se usa como medio de preenriquecimiento caldo Fraser y como medio de cultivo Agar Palcam. El enriquecimiento consiste en depositar 10 g de la muestra en una bolsa y añadirle 100 ml de caldo Fraser, se vierte el líquido en tubos estériles y se incuba a 37ºC durante 24 horas. El aislamiento es por siembra en estría, se añade 0.1 ml de caldo sobre Agar Palcam y se incuba 24 horas a 37ºC. Serán colonias sospechosas las que presentan coloración verdosa con ennegrecimiento en el centro. La confirmación de las colonias sospechosas es por la prueba de la oxidasa y siembra en estría en agar sangre.

- Prueba de la oxidasa: Se usa como reactivo p-etilendiamina (10mg/1ml), colocamos la colonia sospechosa sobre un soporte de vidrio o papel secante y se le añaden unas gotas del reactivo. Si se produce un viraje azul, la colonia es oxidasa positiva, sino aparece viraje azul se considera oxidasa negativa.

- Agar sangre (siembre en estría): Se inocula la colonia con un asa de siembra y se incuba a 30ºC durante 24 horas.

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Lysteria monocitogenes es β-hemolítica y por tanto, hidroliza los glóbulos rojos, si la colonia sospechosa se trata de Lysteria aparece un halo más claro alrededor debido a que ha hidrolizado los glóbulos rojos.

Escherichia coli. Se usa como caldo de preenriquecimiento bilis verde brillante 2% y como medio de cultivo Eosine Azul de Metileno según Levine (EMB Levine). Se toma una alícuota de 1 ml de cada dilución y se añaden en 10 ml de bilis verde brillante con campana de durham. Se incuban a 44 ºC durante 24 horas, se contabilizan los tubos que contengan gas en la campana tras la incubación.

El recuento se lleva a la tabla del Número Mas Probable (NMP), que nos dará un número aproximado de número de colonias que tiene la muestra. La confirmación se hace en EMB Levine por siembra en estría, se inoculan 0.1 ml de los tubos positivos sobre el agar EMB Levine y se incuba 24 horas a 44 ºC, si la colonia sospechosa es E.Coli aparecerá rodeada de un color verde metálico fluorescente. El resultado se expresa en NMP.

Staphylococcus aureus. Se usa como medio de cultivo Baird Parker Agar con emulsión de yema de huevo telurito. Se toma una alícuota de 0.1 ml de cada dilución y se siembra en estría sobre Agar Baird Parker. Se incuba a 37 ºC durante 24 horas.

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Serán colonias sospechosas aquellas que presenten coloración negra con un halo blanquecino.

La confirmación es por la prueba DNAasa, las colonias sospechosas se confirman con DNAasa agar mediante siembra en estría, se inocula con el asa de siembra la colonia sospechosa y se incuba a 37 ºC durante 24 horas, sobre el crecimiento se vierte HCl 1N, pasados unos minutos, si se observa la aparición de una zona transparente alrededor de las colonias es porque S.Aureus ha liberado desoxirribonucleasas y el crecimiento se considera positivo.

El resultado se expresa en u.f.c/g. Shigella. Se usa como caldo de preenriquecimiento Rappaport Vassiliadis Soja (RVS) y como caldo de cultivo Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD). Se añade 1 ml de solución a 9 ml de caldo de enriquecimiento, se incuba a 37ºC durante 24 horas, el aislamiento es por siembra en estría poniendo 0.1 ml de caldo sobre XLD agar, se incuba a 37 ºC durante 24 horas.

Son colonias sospechosas las que presentan la misma coloración que el medio, se puede confundir con E.Coli, para descartar el error se hace la prueba del indol que debe ser negativo. La confirmación es por la prueba de la catalasa y por TSI:

- Prueba de la catalasa: Se usa como reactivo peróxido de hidrógeno, colocamos la colonia sospechosa en un soporte de vidrio y se le

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añaden unas gotas del reactivo, si se producen burbujas es catalasa positivo, si no se producen es catalasa negativo.

- TSI (siembra en picadura y estría): Se usa el media Hierro Triple

Azúcar Agar. Se inocula en picadura y en estría la colonia sospechosa y se incuba 24 horas a 37 ºC, si aparece coloración roja en la lengüeta, fondo amarillo y ausencia de ennegrecimiento se considera TSI positivo.

El resultado se expresa en u.f.c. /g. Salmonella. Se usa como caldo de preenriquecimiento Rappaport Vassiliadis Soja (RVS) y como medio de cultivo Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD). Se adiciona 1 ml de solución a 9 ml de caldo de enriquecimiento y se incuba 24 horas a 37 ºC. El aislamiento es por siembra en estría, se pone 0.1 ml de caldo sobre XLD y se incuba 24 horas a 37 ºC.

Serán colonias sospechosas las que presentan la misma coloración que el medio y tienen el centro negro. La confirmación es por la prueba de la oxidasa que debe ser negativa y el TSI que debe se positivo.

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- Prueba de la oxidasa: Se usa como reactivo p-etilendiamina, se coloca la colonia sospechosa sobre un soporte de vidrio y se le añaden unas gotas del reactivo. Si se produce viraje azul, la colonia es oxidasa positiva, si no aparece viraje azul se considera oxidasa negativa.

- TSI (siembra en picadura y estría): Se usa como medio Hierro Triple Azúcar Agar. Se inocula en picadura y en estría la colonia sospechosa y se incuba a 37 ºC durante 24 horas. Si aparece coloración roja en la lengüeta y ennegrecimiento se considera TSI positivo.

El resultado se expresa en u.f.c. /g. Enterobacterias totales. Se usa como medio de cultivo Agar Rojo Violeta Glucosa (VRBG), se toma una alícuota de 1 ml de cada dilución y se deposita en una placa de Petri, se añaden 15 ml del medio previamente atemperado y se incuba 24 horas a 37 ºC. Las colonias de color morado serán consideradas sospechosas. La confirmación es por la prueba de la oxidasa que debe se negativa. El resultado se expresa en u.f.c. /g. Enterobacterias lactosa positiva-coliformes. Se usa como medio el Agar Rojo Bilis Violeta Lactosa (VRBL), se hace siembra en masa, se toma una alícuota de 1 ml de cada dilución y depositarla en una placa de Petri, se añaden unos 15 ml del medio atemperado y se incuba 24 horas a 37 ºC. Las colonias que crezcan de color morado se consideran sospechosas. El resultado se expresa en u.f.c. /g. Aerobeos mesófilos totales. El medio de cultivo usado es TSA Agar. Se toma una alícuota de 1 ml de cada dilución y se deposita en una placa de Petri, se añaden unos 15 ml del medio y se incuba a 37 ºC durante 24 horas. Se cuentan todas las colonias expresando el resultado en número de colonias por gramo. Clostridium perfringes. Se usa como medio de cultivo TSC y siembra en masa. Se toma una alícuota de 1 ml de cada disolución y se añade a 10 ml del medio TSC, una

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vez solidificado el medio se añade otra capa de agar para conseguir condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 24 horas a 37 ºC.

Las colonias que aparezcan de color negro se consideran sospechosas, la confirmación es por la prueba nitrato movilidad que debe ser positivo, se usa el medio nitrato movilidad, se inocula la colonia sospechosa por picadura y se sella con parafina estéril, se incuba a 37 ºC durante 24 horas. Si aparece coloración roja en la superficie del tubo significa que ha habido crecimiento y se considera como nitrato movilidad positivo, si no aparece color rojo se considera movilidad negativa El resultado se expresa en u.f.c. /g. Clostridium sulfito reductor. Se usa el medio SPS según Angelotti, se toma una alícuota de 1 ml de cada dilución y se añade a 10 ml de medio SPS diluido previamente en tubos. Se agita el tubo y se sella con parafina estéril. Se incuba a 37 ºC durante 24 horas.

Las colonias que crezcan de color negro a lo largo del tubo se consideran sospechosas, el resultado se expresa en u.f.c. /g.

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ÍNDICE. - Introducción. Pag. 1. - Materiales. Pag. 1. - Rutina diaria. Pag. 3. - Procedimientos. Pag. 3.

• Nitritos. Pag. 3. • Nitratos. Pag. 5.

• Cloruros. Pag. 6.

• Humedad en carnes. Pag. 7.

• Grasa en carnes. Pag. 8.

• Nitrógeno/ proteínas en carne. Pag. 9.

• Hidroxiprolina. Pag.11.

• Oxidabilidad. Pag. 13.

• Detección de residuos inhibidores. Pag. 14.

• Análisis para potabilidad de agua. Pag. 16.

• Análisis de comida. Pag. 17.

Lysteria monocitogenes. Pag. 18.

Escherichia coli. Pag. 19.

Staphylococcus aureus. Pag. 19.

Shigella. Pag. 20.

Salmonella. Pag. 21.

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Enterobacterias totales. Pag. 22.

Enterobacterias lactosa positiva coliformes. Pag.22.

Aerobeos mesófilos totales. Pag. 22.

Clostridium perfringes. Pag. 22.

Clostridium sulfito reductor. Pag. 23.

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