Mejoramiento genetico

97Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

III.-Capítulo 2

Hibridación somática

Polci, Pablo; Friedrich, Pablo

1 Introducción

La mejora genética de las plantas cultiva-das en procura de incrementar la producciónviene siendo practicada por el ser humanodesde hace miles de años, seguramente des-de el inicio mismo de la agricultura. Para ello,el hombre ha empleado los cruzamientos conel fin de incrementar la variabilidad genética,paso inicial en el proceso de mejoramiento.De esta manera la hibridación entre especiesdiferentes permitió aumentar de modo sig-nificativo la productividad de diversos culti-vos, como por ejemplo los cereales. Sin em-bargo, en otros cultivos esta estrategia noresultó exitosa a causa de esterilidad sexualo incompatibilidad genética.

La hibridación somática, es decir, la ob-tención de plantas híbridas a partir de la fu-sión de células o de protoplastos derivadosde células somáticas, surgió hace unos 30 añoscomo una herramienta muy promisoria parasortear problemas de incompatibilidadprecigótica.

Esta técnica, si bien presenta algunas li-mitaciones, como una elevada esterilidad oimposibilidad de regenerar plantas en algu-nos casos, demostró ser útil en la mejoragenética de plantas, principalmente por per-mitir la introgresión limitada de genes de es-pecies silvestres en los cultivos. Se utiliza, porejemplo, cuando se quiere transferir resisten-cia a enfermedades o tolerancia a estreses.También permite la obtención de citoplasmashíbridos (cíbridos). La hibridación asimétricay cibridización sirve como puente para latransferencia de genes individuales

La técnica de fusión de protoplastos sedesarrolló en la década de 1950-60, a partirde la observación de que ciertos virus pue-den inducir la fusión de células animales. Sinembargo, recién en la década de 1980-90 tuvoun mayor auge debido a la aparición de mé-todos químicos y eléctricos más apropiadospara la fusión de células vegetales. La paredpresente en estas células representa una

barrera que normalmente impide la fusiónentre ellas. Por ello, la obtención de plantashíbridas somáticas requiere del previo aisla-miento de protoplastos mediante la diges-tión enzimática de las paredes celulares, paraluego proceder a la fusión de protoplastosde distintos tipos parentales (distintosgenotipos) y posterior regeneración de plan-tas a partir de los productos de fusión. Lahibridación somática en plantas comenzó adesarrollarse a principios de 1970 con la apli-cación de métodos químicos de fusión, y seextendió en los ´80 con el empleo de méto-dos de electrofusión.

Es relevante destacar que, a los fines delmejoramiento genético, el sistema deprotoplastos no sólo se emplea para la ob-tención de híbridos somáticos, sino que tam-bién constituye un material apropiado parala incorporación de ADN exógeno. Asimismo,la fusión de protoplastos tiene un uso mu-cho más amplio que el estrictamente de in-terés agronómico; en tal sentido, es de granutilidad en estudios de biología celular asícomo para otras aplicaciones biotecnológicas,por ejemplo, la producción de anticuerposmonoclonales.

2 Hibridación somática vs. hibridaciónsexual

Con relación a su potencialidad para pro-ducir híbridos, existen diferencias importan-tes entre la fusión de protoplastos somáticosy el cruzamiento sexual:

• La hibridación sexual entre organismosde diferentes especies está limitada por ba-rreras de incompatibilidad. En algunos casosestas barreras son precigóticas, es decir, nopermiten que se produzca la fecundación. Tallimitación no existe en la fusión deprotoplastos, dado que este proceso es no-específico, permitiendo la fusión de células deorígenes muy diversos, incluso de organismosmuy distanciados filogenéticamente (porejemplo, células animales y vegetales). Ello nosignifica que pueda regenerarse un organis-mo viable y fértil a partir de cualquier tipo decombinación entre células. De hecho, la bús-queda de híbridos de interés agronómico hademostrado que el principal aporte de estametodología es la introgresión, en los culti-vos, de genes provenientes de plantas silves-tres emparentadas.

98 POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo

• ·La hibridación sexual ocurre normal-mente por fusión de células haploides (n +n), mientras que en la hibridación somáticase fusionan dos protoplastos con susgenomas completos (2n + 2n) o con uno deellos conteniendo sólo parte de su genoma.

• ·Otra diferencia está dada por la heren-cia de los genes extranucleares, esto es,plastídicos y mitocondriales. Mientras que enla reproducción sexual el genomacitoplasmático es aportado casi exclusiva-mente por la gameta femenina, en la hibri-dación somática se combinan organelas deambos progenitores, produciendo nuevascombinaciones de genes citoplasmáticos.

3 Hibridación somática vs.transformación genética

La preponderancia que han tomado lastécnicas de transformación genética ha rele-gado a la hibridación somática a un papel demenor significación como herramientabiotecnológica aplicada al mejoramiento delos cultivos. Comparando ambas metodolo-gías, podemos destacar las siguientes diferen-cias:

• En la transformación genética se incor-poran uno o pocos genes exógenos en unaplanta, mientras que en la hibridaciónsomática el número de genes introducidoses mayor dado que se transfierencromosomas de una especie aotra o se combinan dosgenomas completos.

• La hibridación somáticapermite transferir caracteres sinnecesidad de contar con un co-nocimiento detallado de los me-canismos moleculares que deter-minan la expresión de dichos ca-racteres. Por el contrario, la trans-formación genética requiere laprevia identificación y aislamien-to de los genes que determinanla expresión del carácter de inte-rés.

• Caracteres tales como pro-ductividad, tolerancia a ciertos ti-pos de estrés, resistencia hori-zontal a enfermedades y otrosson poligénicos, por lo que sutransferencia es factible por hi-

bridación somática pero no por transforma-ción genética. Sin embargo, en la actualidad,con las nuevas herramientas aportadas porla genómica se está avanzando en el conoci-miento de todos los genes involucrados endiversas vías metabólicas. Estos podrían sertransferidos en conjunto vía transgénesis.

4 Tipos de híbridos somáticos

Cuando se realiza la fusión de protoplas-tos se obtienen células con el aporte decromosomas de dos o más núcleos (Fig.1.) Silos protoplastos involucrados en la fusiónproceden de distintos tipos parentales seoriginan «heterocariones», y si proceden delmismo tipo parental se originan «homoca-riones». Cuando en el heterocarión ocurrela fusión de los núcleos (cariogamia), se for-ma una «célula híbrida».

A partir de una célula híbrida, que contie-ne dos genomas completos, se puede rege-nerar una planta que, según cual haya sidoel destino del material genético nuclear du-rante las divisiones celulares que siguen a lafusión, puede ser de tres tipos:

1. Híbrido simétrico, que tiene elgenoma nuclear completo de cada tipoparental.

2. Híbrido asimétrico , que tiene elgenoma nuclear completo de uno de losparentales y sólo una parte del genoma nu-clear del otro parental.

Fig. 1. Destino del material genético nuclear y extranuclear en la fusiónde protoplastos.


3. Cíbrido, que contiene el genoma nu-clear completo de uno de los parentales, re-teniendo sólo material genético extranucleardel otro parental.

Es usual que en el proceso de regenera-ción de plantas híbridas ocurra una elimina-ción gradual de cromosomas de uno de lostipos parentales, produciéndose de estemodo híbridos asimétricos o cíbridos. La prác-tica de la hibridación somática en plantasdemostró que, en general, los híbridosasimétricos y cíbridos son más valiosos quelos simétricos producidos entre plantas ale-jadas filogenéticamente. Por esta razón sehan desarrollado métodos para inducir la hi-bridación asimétrica o cibridación, alterandoel genoma de uno de los protoplastosparentales. En este caso se dice que se trans-fiere parte del genoma de un protoplastodonante a uno receptor. Por lo tanto, tenien-do en cuenta el material de partida emplea-do para la fusión, pueden producirse tres ti-pos de células híbridas:

1. Células híbridas simétricas, por fusiónde dos protoplastos con sus genomas com-pletos.

2. Célula híbrida asimétrica, por fusiónde un protoplasto conteniendo su genomacompleto con otro conteniendo su núcleoinviable o sólo una parte de su genoma nu-clear. Los protoplastos donantes son irradia-dos con rayos X o Gamma, lo que provoca lafragmentación de los cromosomas. Una vezproducida la fusión, dichos fragmentos tien-den a eliminarse en las sucesivas mitosis, peroalgunos de ellos pueden integrarse con elgenoma del receptor produciendo un híbri-do asimétrico. El tratamiento de irradiaciónparece no tener efectos deletéreos omutagénicos sobre los genomas deorganelas, probablemente debido a quecada célula posee varias copias de ellas. Tam-bién puede producirse una célula híbridaasimétrica fusionando protoplastos recepto-res con microprotoplastos, conteniendo unoo pocos cromosomas. Los microprotoplastosse obtienen induciendo la formación demicronúcleos por tratamientos con agentesantimicrotúbulos.

3. Cíbridos, por fusión de un protoplastoconteniendo su genoma nuclear completo

con un protoplasto enucleado o con su nú-cleo inviable. Los protoplastos enucleados ocitoplastos pueden obtenerse centrifugandolos mismos a alta velocidad en un gradientede densidad isosmótico. Asimismo, el méto-do de irradiación con rayos X o Gamma pue-de generar cíbridos en casos en que se pro-duzca la eliminación total de los fragmentoscromosómicos. Los protoplastos que poseensu genoma nuclear completo (receptores),pueden ser tratados previamente coninhibidores metabólicos. En este caso sólopueden sobrevivir, por complementaciónmetabólica, los heterocariones conteniendoel núcleo del receptor y el citoplasma del do-nante enucleado.

La segregación de los plástidos ymitocondrias de los dos tipos parentales tam-bién constituye una fuente importante devariabilidad en la regeneración de plantashíbridas. Es frecuente que ocurranrecombinaciones de los genomas mitocon-driales de ambos tipos parentales, pero elloes poco común entre plástidos. Dado que lasorganelas segregan independientementeunas de otras, la regla es que al cabo de po-cas divisiones mitóticas las células formadascontengan plástidos provenientes de uno uotro tipo parental. Así, una célula híbrida ori-gina una colonia de células que exhiben dife-rentes combinaciones de genes citoplasmá-ticos, pero con una mayor frecuencia de célu-las que poseen mitocondrias recombinantesy plástidos de uno u otro tipo parental. Eldestino que sufre el material genético nucleary extranuclear durante las divisiones celula-res determina que, a partir de una poblaciónde células híbridas similares, se puedan rege-nerar plantas con diferentes combinacionesde genes nucleares, plastídicos y mitocon-driales.

La Figura 2 muestra un esquema de lasetapas involucradas en la hibridaciónsomática, las cuales son tratadas a continua-ción.

5 Aislamiento de protoplastos

El desarrollo de métodos enzimáticos deaislamiento a partir de 1960 brindó la posibi-lidad de obtener grandes cantidades deprotoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-


cia en diferentes áreas de la biología y labiotecnología de plantas, dada la utilidad delos protoplastos como sistema experimentalpara estudios fisiológicos, bioquímicos ymoleculares, así como para su aplicación almejoramiento genético.

Los protocolos de aislamiento empleanenzimas fúngicas con actividad celulasa ypectinasa, siendo necesario en algunos casosel agregado de hemicelulasas. Las celulasas yhemicelulasas degradan la pared celular, entanto que las pectinasas digieren la matrizde pectina que mantiene adheridas a las cé-lulas. El uso de enzimas disponibles comer-cialmente posibilitó el aislamiento deprotoplastos de prácticamente cualquier te-jido vegetal, siempre que el mismo no estélignificado. Se ha podido aislar protoplastosde una gran cantidad de especies vegetalesy regenerar plantas a partir de los mismos,permitiendo el uso de este sistema para lapropagación clonal y la modificación genéticade plantas.

El número de protoplastos aislados, suviabilidad y la pureza de la suspensión obte-nida dependen de varios factores, debiendo

establecerse en forma empírica lascondiciones óptimas para un sistemadeterminado. Las etapas del aisla-miento y los factores a considerar encada una de ellas se describen a con-tinuación:

1. Selección del material departida. Influye en el resultado delaislamiento así como en el procesode regeneración posterior. General-mente se emplean hojas y células encultivo líquido o sólido. Cuando seemplean hojas, la edad y las condi-ciones de cultivo de la planta afectanel rendimiento. Se obtienen mejoresresultados con hojas jóvenes total-mente expandidas que con hojas vie-jas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contac-to de las enzimas con las células, lashojas suelen cortarse en trozos pe-queños, muy finos en el caso de lasmonocotiledóneas. Algunas veces seextrae la epidermis inferior antes decolocar la hoja en la soluciónenzimática, como sucede con lasdicotiledoneas. Cuando se emplean

células en suspensión, se obtienen mejoresresultados si se encuentran en la faseexponencial de crecimiento.

2. Tratamiento enzimático. La concentra-ción de la enzima y el tiempo de incubaciónrequeridos para lograr la liberación de losprotoplastos dependen del producto comer-cial utilizado. El pH generalmente se ajustaen un rango de 4,7 a 6, y la temperatura en-tre 25 y 30º C. La duración del tratamientoenzimático y la relación volumen de solución/cantidad de tejido influyen en el rendimien-to. Durante el aislamiento se produce la lisisde algunas células, que liberan enzimashidrolíticas y compuestos oxidantes que pue-den dañar los protoplastos, por lo que sesuelen agregar inhibidores de proteasas yantioxidantes tales como el Polivinilpirroli-dona-10. El agregado de un estabilizadorosmótico a la solución enzimática es esencialpara evitar la ruptura de los protoplastos amedida que son liberados, siendo más esta-bles si la solución es ligeramente hipertónica.Para ello se utilizan solutos osmóticamenteactivos, comúnmente manitol o sorbitol, enconcentraciones que varían entre 0,3 a 0,8

Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridaciónsomática.


M según el tipo de protoplasto. La soluciónenzimática es por lo general suplementadacon sales, comúnmente CaCl2, que incremen-tan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B).

3. Limpieza y purificación de losprotoplastos. Una vez lograda la liberaciónde los protoplastos, se procede a la remo-ción de las enzimas y de los restos de tejidoy de células rotas. La suspensión se pasa porun filtro de nylon o metálico con un diáme-tro de poro (30-100 mm) que permita el pasode los protoplastos y retenga los restos detejido y grupos de células no digeridas. Pos-teriormente, se efectúan 3 ó 4 lavadoscentrifugando la suspensión por 5 minutos abaja velocidad (50-100 g). Finalmente, losprotoplastos sedimentados se resuspendenen una solución salina que contenga un es-tabilizador osmótico. De este modo se elimi-nan las enzimas y restos celulares. Para lo-grar una mayor pureza de la suspensión esconveniente centrifugarla en un gradiente dedensidad (Fig. 3C). Para el recuento deprotoplastos se emplea un hemocitómetro.La viabilidad se determina generalmenteempleando colorantes que son incorporados(rojo neutro, diacetato de fluoresceína) oexcluidos (azul de Vean) por las células via-bles; también pueden evaluarse la actividadfotosintética (emisión de fluorescencia) y larespiratoria (consumo de O2).

6 Métodos de fusión

6.1 Métodos químicos

Los primeros casos informados de fusióncontrolada y reproducible de protoplastosvegetales y de regeneración de híbridossomáticos se produjeron a principios de ladécada de 1970, empleando nitrato de sodiocomo agente fusógeno. La frecuencia de for-mación de heterocariones en tales casos eramuy baja. Posteriormente, se lograron me-jores resultados fusionando protoplastos decélulas del mesófilo de Nicotiana en un me-dio conteniendo alta concentración de Ca++

(50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo,el fusógeno que alcanzó mayor aceptaciónes el polietilenglicol (PEG) debido a que, encomparación con los otros agentes químicos,produce mayor proporción de heteroca-riones y, para muchos tipos celulares, resultamenos tóxico. Además, el tratamiento conPEG genera una mayor proporción deheterocariones binucleados, con menor ocu-rrencia de fusiones entre más de dosprotoplastos.

El procedimiento de fusión con PEG másampliamente utilizada es, en lo esencial, unacombinación del método original del PEG yel de CA++ y pH elevados. Los protoplastosde dos tipos parentales se mezclan en unasolución conteniendo 15 a 45 % de PEG (pesomolecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30minutos. La temperatura de incubación óp-tima para inducir la fusión es de 35 a 37º Cpero, en la práctica, suele ajustarse a 24º C.La densidad de protoplastos adecuada parala formación de heterocariones es de 4 a 5 %(volumen de protoplastos/volumen de sus-pensión). La remoción del PEG se lleva a caboen forma gradual, siendo esto fundamentalpara asegurar una elevada frecuencia deheterocariones. Para ello, la suspensión sesomete a sucesivos lavados con una soluciónalcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, dismi-nuyendo progresivamente la concentraciónde PEG con cada lavado.

En la fusión de los protoplastos ocurren,en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1)las membranas plasmáticas de protoplastosadyacentes entran en íntimo contacto, (2)se producen alteraciones en sitios localizados

Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A.Eliminación de las nervaduras centrales y seccionado dela hoja en trozos pequeños. B. Digestión enzimática delas paredes celulares. C. Centrifugación y obtención deprotoplastos libres de restos de tejidos vegetales.


de las mismas, formándose puentescitoplasmáticos entre protoplastos vecinos,y (3) las interconexiones citoplasmáticas seexpanden, provocando la fusión. La carganegativa neta de la superficie de las mem-branas produce la repulsión entre ellas; el tra-tamiento con Ca++ y pH elevados neutralizalas cargas superficiales, favoreciendo el con-tacto entre protoplastos. El PEG actuaríacomo un puente molecular causando altera-ciones en las membranas plasmáticas quepromueven la adhesión y formación de puen-tes citoplasmáticos entre protoplastos veci-nos, produciéndose finalmente la fusión.

6.2 Electrofusión

En 1973 se descubrió que pulsos de ele-vado potencial eléctrico en un rango muyestrecho de intensidad y duración conducena un incremento reversible, experimental-mente controlable, de la permeabilidad dela membrana celular. Este efecto se denomi-nó ruptura eléctrica reversible para enfatizarla habilidad de la membrana para reparartales perturbaciones. El voltaje mínimo paraun protoplasto (umbral) con el cual se pro-duce la formación de poros disminuye a ma-yor duración del pulso eléctrico. Este fenó-meno de ruptura reversible también es apli-cado en la técnica de electroporación, con laque se pueden introducir en las células cons-trucciones de ADN y otras moléculas de altopeso molecular.

El método de electrofusión en esenciainvolucra dos pasos:

1. Los protoplastos, colocados en un me-dio de baja conductividad entre dos electro-dos, se ponen en contacto al aplicar corrien-te alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz)en un campo eléctrico no uniforme. Las car-gas se separan dentro de las células forman-do un dipolo y generando, por lo tanto, unpotencial de membrana. La fuerza del cam-po a ambos lados de una célula es diferente(campo no uniforme), dando origen a unafuerza neta que la empuja a una región demayor intensidad de campo (hacia uno delos electrodos). Este proceso se denominadielectroforesis. La polaridad de la célulaincrementa el campo local no uniforme, atra-

yendo a las células vecinas. Luego, losprotoplastos se aproximan unos a otros yforman cadenas paralelas a las líneas de cam-po aplicadas (Fig. 4A).

La fuerza ejercida sobre la célula bajo con-diciones dielectroforéticas depende (1) de laintensidad de campo eléctrico, (2) delgradiente del campo, (3) del volumen delprotoplasto y (4) de la diferencia entre lasconstantes dieléctricas de la célula y su am-biente (así como la correspondiente diferen-cia entre sus conductividades).

2. El segundo paso consiste en la aplica-ción de uno o más pulsos cortos de corrientedirecta de 15 a 100 µseg., con una intensi-dad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), sufi-ciente para causar la ruptura reversible de lamembrana. Para que esto ocurra es necesa-rio que el voltaje crítico de membrana seaalcanzado en cuestión de nanosegundos amicrosegundos. Ocurre entonces la fusión delas dos células cuyas membranas están enestrecho contacto (1 a 2 nanómetros de dis-tancia). El proceso de resellado es principal-mente atribuido a las moléculas lipídicas de-bido a que su coeficiente de difusión es dosórdenes de magnitud mayor que el de lasproteínas. Durante este proceso pueden for-marse puentes lipídicos entre las membranasde las dos células. En otras palabras, las mem-branas no se vuelven a sellar separadamen-te en la zona de contacto. Los puentes for-mados de esta manera, con continuidadcitoplasmática entre las dos células, condu-cen a un radio de curvatura muy pequeño ya altas tensiones superficiales. Como conse-cuencia se forma una nueva célula esférica,ya que el proceso es favorecido energéti-camente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversi-ble si el número y el tamaño de los porosson pequeños en relación con el total de lasuperficie de la membrana. Fuerzas de cam-po supra críticas, así como también largosperíodos de exposición, rompen áreas ma-yores de membrana y pueden producir ladestrucción total de la célula

La frecuencia de fusión depende de va-rios factores:

• ·El genotipo.• ·La procedencia de los protoplastos

dentro del mismo genotipo. Diferentes po-blaciones de protoplastos exhiben frecuen-


cias de fusión diferentes, aun cuando proven-gan del mismo genotipo. En general, losprotoplastos obtenidos a partir de hojas sefusionan más fácilmente que los provenien-tes de raíz o de cultivos celulares.

• ·El tamaño de los protoplastos. Losmás grandes se fusionan más fácilmente.

• ·La densidad de los protoplastos.• ·El número, la duración y la fuerza de

los pulsos de corriente directa. La duracióndel pulso eléctrico es de 15 a 50 µseg. El tiem-po requerido para la fusión que sigue a laaplicación de un pulso varía desde pocos se-gundos a varios minutos. Esto probablemen-te esté relacionado a la diferencia de fluidezde la membrana en los distintos tipos celula-res y a las propiedades del citoesqueleto den-tro de la célula.

• ·El medio de fusión. Un factor de limi-tación en la agregación dielectroforética delas células es la conductividad eléctrica del me-dio; si ésta es muy alta, hay mucho flujo decorriente en la solución y se producencalentamientos y turbulencias que impidenla formación de cadenas.

• ·El potencial osmótico del medio de fu-

sión. La inclusión de iones en el medio pue-de incrementar el porcentaje de fusión. Sinembargo, existe la limitación de que ladielectroforesis debe realizarse en un mediode baja conductividad; el medio de fusiónusualmente consiste en manitol (cuya con-centración se ajusta según los protoplastosempleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos depresión osmótica en el medio de suspensiónde los protoplastos pueden favorecer el pro-ceso de fusión.

• ·La longitud de las cadenas deprotoplastos formadas durante la dielec-troforesis, que además depende de factorescomo la densidad de protoplastos, fuerza delcampo eléctrico y tiempo durante el cual esaplicado. Cadenas más largas darán mayorfrecuencia de fusión que las cadenas cortas.Pulsos de corriente más largos y de mayorvoltaje producen un aumento de los even-tos de fusión múltiple; obviamente, pulsosmuy largos y voltajes muy elevados puedenmatar a los protoplastos.

• ·La composición y propiedades de lamembrana plasmática pueden ser afectadaspor la actividad metabólica de losprotoplastos y por el tipo de enzimas em-pleadas en el proceso de aislamiento, influ-yendo en consecuencia en el proceso de fu-sión.

Las condiciones experimentales debenajustarse de modo de obtener la mayor fre-cuencia de fusión posible (número deprotoplastos fusionados sobre el total deprotoplastos), intentando maximizar la pro-porción de heterocariones (productos de lafusión de protoplastos diferentes) formadospor sobre la de homocariones (productos dela fusión de protoplastos del mismo tipoparental), y minimizando la ocurrencia deeventos de fusión múltiple (fusión de más dedos protoplastos). La proporción de cada unode los dos tipos de protoplastos en la sus-pensión puede fijarse a fin de incrementar laformación de heterocariones por sobre la dehomocariones. El tipo de protoplasto conmayor tendencia a fusionar se mezcla con elde menor tendencia a fusionar en una rela-ción de 1:5 a 1:10. Así, durante la formaciónde cadenas, los protoplastos más fusionablesestarán mayoritariamente en contacto conlos menos fusionables, y éstos a su vez esta-

Figura 4: Electrofusión de protoplastos de mesófilo depasto llorón. A. Dielectroforesis de células. Las diferenciasen intensidad de campo eléctrico hacen que las célulasse muevan hacia la zona cercana al electrodo. B.Aplicación de pulsos cortos de corriente directa, queinducen la formación de poros en la membrana,generando puentes entre las membranas de las célulasadyacentes. C. Los puentes con continuidadcitoplasmática poseen un radio de curvatura muypequeño. Las altas tensiones superficiales generadas enese sector conducen a la formación de una nueva célulaesférica.


rán ligados entre ellos mismos. Seleccionan-do las condiciones –duración y voltaje de lospulsos– que promuevan sólo la fusión de losprotoplastos más fusionables, los productosserán mayormente heterocariones.

Sin embargo, aun cuando las condicionesde fusión puedan fijarse de modo de incre-mentar la frecuencia de fusión y la propor-ción de heterocariones formados, la fusiónde protoplastos a gran escala (macrofusión),tanto por métodos químicos como eléctricos,resultará en una mezcla de protoplastosparentales, homocariones y heterocariones.Esto conlleva la necesidad de emplear méto-dos de selección de los híbridos somáticosobtenidos. Una técnica alternativa que ofre-ce la ventaja de no requerir una posteriorselección de heterocariones, aunque deman-da mayor manipulación, es la microfusión oelectrofusión de pares de protoplastos. Estatécnica se basa en los mismos principios quela electrofusión a gran escala pero está dise-ñada para inducir la fusión en pares seleccio-nados de protoplastos. Este sistema empleamicroelectrodos de platino fijados a un so-porte montado debajo del condensador deun microscopio invertido. Los pares deprotoplastos seleccionados se colocan enmicrogotas de medio de fusión sobre un so-porte, recubiertas por aceite mineral. En cadaevento de fusión, los microelectrodos seposicionan a cada lado de una microgotaconteniendo un par de protoplastos, y seaplican los pulsos eléctricos. Después de lafusión, los heterocariones resultantes sontransferidos a gotas con medio de cultivopara la posterior regeneración de plantashíbridas. La tasa de fusión es de aproxima-damente 30 pares de protoplastos fusiona-dos y transferidos a medio de cultivo porhora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fu-sión cercanas al 50 %.

Ventajas de la electrofusión:

1. El proceso entero puede ser seguidobajo microscopio por lo que los híbridos pue-den ser fácilmente identificados y transferi-dos a un medio nutritivo o selectivo.

2. Puede preseleccionarse el número decélulas a ser fusionadas. Las formaciones dedos células son favorecidas por bajas densi-dades en la acanaladura entre los electrodos.

Para obtener productos de multifusión de-ben emplearse elevadas densidades.

3. El proceso de fusión es sincrónico, yaque el pulso provoca la fusión de todas lascélulas expuestas al campo.

4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80- 100 %) y cariogamia.

5. La viabilidad de las células fusionadases muy buena.

6. Este método ofrece ventajas sobre otroscomo el del PEG, que: -requiere condicionesno fisiológicas -las frecuencias de formación deheterocariones binucleados son bajas y varia-bles -resultan tóxicos para diversos tipos celu-lares- el fusógeno debe ser removido antesdel cultivo de los protoplastos y tiene bajorendimiento de células fusionadas.

7 Selección de heterocariones

La fusión de protoplastos a gran escalaproduce una mezcla de tipos parentales yproductos de fusión. Si no se efectúa unaprevia selección de las células híbridas, la re-generación de plantas y la posterior identifi-cación de los híbridos demandará mucho tra-bajo y recursos. Dicha selección es particular-mente necesaria cuando se emplean méto-dos químicos, que producen una baja pro-porción (<10%) de células híbridas. Por el con-trario, los métodos eléctricos no requierennecesariamente del posterior proceso de se-lección dado que normalmente producen fre-cuencias de fusión muy elevadas o porque,en el caso de la microfusión, no se generanmezclas heterogéneas de protoplastos de-bido a que se fusionan dos células por vez.Cualquiera que sea el caso, la condición dehíbrido debe verificarse en la planta regene-rada mediante diferentes análisis que se ex-plican más adelante.

La selección de células híbridas puede lle-varse a cabo empleando los siguientes mé-todos:

• Selección sobre la base de caracteresmorfofisiológicos. En ciertos casos es posi-ble diferenciar los callos híbridos de losparentales. Por ejemplo, en algunos cruza-mientos, los callos híbridos poseen un colorintermedio al de los parentales.

Cuando se produce un cruzamiento en-tre un parental con capacidad para regene-


rar planta con uno recalcitrante, los híbridossomáticos normalmente regeneran plantas,ya que este carácter se comporta como do-minante. Si los protoplastos del genotiporespondedor son tratados con inhibidoresmetabólicos irreversibles (iodoacetamida,dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirán, ysolamente podrán regenerarse los híbridos.

• Selección por complementación. La se-lección se produce porque el medio de culti-vo resulta restrictivo para el crecimiento delos parentales, pero no para el de los híbridos.La complementación puede lograrse por lassiguientes vías:

a) Empleando dos parentales con defec-tos metabólicos o genéticos no alélicos. Sidichos caracteres son recesivos, la fusión pro-duce una célula híbrida en la que los defec-tos se anulan por complementación. Porejemplo, la fusión de dos variedades albinasno alélicas (nucleares) de tabaco, permitióobtener plantas verdes.

AAbb (albina) x aaBB (albina) ↓

AAaaBBbb (verde)

Asimismo, a partir de dos líneas mutantesno alélicas de tabaco deficientes en nitratoreductasa, se obtuvieron colonias capaces decrecer en un medio conteniendo nitratocomo única fuente de nitrógeno.

b) Fusionando parentales que expresancaracteres dominantes tales como resisten-cia a antibióticos o herbicidas. Para ello seemplea una línea resistente a cierta droga, yotra resistente a una segunda droga, efec-tuándose la selección de las células híbridasen un medio conteniendo ambas drogas aconcentraciones que resultan letales para laslíneas parentales.

c) Una línea que presente una mutaciónautotrófica (por ejemplo: albinismo, deficien-cia a nitrato reductasa) y un carácter domi-nante (por ejemplo, resistencia a antibióticoso herbicidas) es de gran utilidad para la se-lección. Los híbridos producidos por el cruza-miento de estos parentales con cualquiergenotipo silvestre pueden ser seleccionadosen medio mínimo suplementado con el anti-biótico o herbicida, que no permite el creci-miento de los parentales.

• Selección por aislamiento de los

heterocariones o células híbridas. Es el sis-tema más confiable y de más amplio espec-tro de aplicación. El aislamiento puede reali-zarse de dos maneras:

a) Selección mecánica directa utilizandotécnicas de micromanipulación con micro-pipeta. Puede realizarse cuando los proto-plastos parentales presentan rasgos que losdistinguen al microscopio, permitiendo reco-nocer las células híbridas. Por ejemplo, al fu-sionar protoplastos del mesófilo (verdes) conprotoplastos de suspensiones celulares (inco-loros). También pueden colorearse las célu-las de ambos progenitores con diferentescolorantes vitales, como el rojo neutro y azulbrillante de cresilo.

b) Citometría de flujo. Los protoplastosparentales se marcan con diferentes coloran-tes fluorescentes; por ejemplo, rodamina(rojo) y fluoresceína (verde amarillento). Elaislamiento de los heterocariones marcadoscon ambos colorantes se realiza utilizando uncitómetro de flujo (FACS, fluorescence-activated cell sorter), que es preciso y muyrápido. El equipo posee fotocélulas que de-tectan fluorescencia, pudiendo separar losprotoplastos marcados con un solo fluoro-cromo (parentales) de aquéllos doblementemarcados (híbridos).

8 Cultivo de protoplastos

La habilidad para regenerar plantas apartir de células y tejidos en cultivo es un com-ponente esencial en la biotecnología para lamanipulación genética y el mejoramientovegetal. Esto resulta relativamente fácil paralas dicotiledóneas herbáceas, pero ha sidobastante difícil para las monocotiledóneas,particularmente las gramíneas.

Los protoplastos se cultivan en cajas dePetri en medio líquido o semisólido, rico encompuestos orgánicos e inorgánicos, suple-mentado con reguladores del crecimiento, yen presencia de un estabilizador osmótico.Suelen ser cultivados en cajas de Petri con me-dio agarificado, donde se mezcla la soluciónde protoplastos con un medio de cultivo lí-quido a 40º°C conteniendo 1,2% de agar,perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Losprotoplastos quedan, así, atrapados en elmedio semisólido y, luego de varios días, seven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-


bargo, el medio líquido da mejores resulta-dos por varias razones: (a) los protoplastosde varias especies sólo pueden dividirse enmedio líquido, (b) la presión osmótica delmedio puede ser fácilmente reducida a lospocos días en cultivo, (c) la densidad celularpuede ser modificada agregando medio decultivo o las células con especial interés pue-den ser aisladas y cultivadas a alta densidad,(d) la degradación de algunos componentesdel medio por la población de protoplastospuede producir algunas sustancias citotóxicas,cuya concentración alrededor de las célulasserá menor en el medio líquido. Una técnicamuy eficiente que combina medio sólido ylíquido es la de cultivo en perlas de agarosa,donde los bloquecitos con los protoplastosinmovi-lizados en agarosa son cortados encuatro mitades y colocados en medio líqui-do, donde se cultivan en continua agitación.

Los protoplastos regeneran la pared ce-lular luego de uno a cuatro días en cultivo. Lapresencia de pared es esencial para lograr unadivisión regular. Luego de dos a tres sema-nas, producto de mitosis sucesivas, se formanmicrocolonias derivadas cada una de una cé-lula, que dos semanas después se pueden vera simple vista. Estos callos son transferidos aun medio de cultivo y a condiciones apropia-das para regenerar plantas (Fig. 5).

Los principales factores a tener en cuen-ta para el cultivo de protoplastos son:

· Los requerimientos nutricionales: se hanutilizado en muchos casos los mismos mediosde cultivo que se utilizan en el cultivo de célu-las y tejidos, pero en general son enriqueci-

dos con vitaminas, azúcares, aminoácidos,reguladores de crecimiento y también conaditivos inespecíficos como leche de coco,hidrolizado de caseína, extracto de levadu-ra, etcétera.

· El potencial osmótico del medio de cul-tivo: los protoplastos requieren de protec-ción osmótica antes de regenerar la paredcelular. Normalmente se ajusta con el agre-gado al medio de cultivo de manitol osorbitol.

· La densidad celular: la densidad inicialde protoplastos varía de 104 – 105 proto-plastos/ml de medio de cultivo. Los cultivoscon altas densidades producirán, a partir decada protoplasto, colonias que deberán se-pararse tempranamente para evitar quime-ras. Si deseamos colonias bien separadas paraasegurar que provengan de un soloprotoplasto, la densidad inicial debe ser baja,de 100 – 500 protoplastos/ml. Hay proto-plastos de varias especies y tipos que no lo-gran dividirse a bajas densidades de cultivo.Para estos casos se desarrolló la técnica decultivo con células nodrizas o alimentadoras.Esta técnica consiste en exponer una suspen-sión de 106 protoplastos/ml a rayos X a do-sis que inhiben la división celular, pero quequedan metabólicamente activas. Estas cé-lulas se plaquean en un medio agarificado, yluego se colocan por sobre éstas losprotoplastos sin irradiar, de los cuales se for-marán las colonias. También suele utilizarsepapel de filtro para separarlas de las célulasnodrizas. Otra técnica utilizada es el cultivoen microgota, donde se puede cultivar hasta

un solo protoplasto. Cada microgotacontiene entre 0,25 - 25 µl de mediode cultivo, logrando densidades de 2 –4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda deun micromani-pulador se coloca la célu-la y se la cubre con aceite mineral paraevitar la deshidratación del medio.

· Los tratamientos físicos: trata-mientos de choque eléctrico y térmicoestimulan la división de los protoplas-tos.

· Las condiciones de cultivo: en ge-neral los protoplastos son sensibles ala luz, por lo cual durante el cultivo selos mantiene en oscuridad o bajo luzmuy tenue.

· El origen de los protoplastos: el

Figura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos demesófilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosasuspendidas en medio líquido. C. Detalle de la formación decallo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneración.F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G.Planta regenerada.


estado fisiológico del tejido del cual provie-nen y la calidad de los protoplastos son muyimportantes para obtener una elevada efi-ciencia en la respuesta al cultivo.

9 Identificación de las plantas híbridas

La condición de híbrido debe verificarseen la planta regenerada aun cuando se hayaefectuado algún tipo de selección para el cul-tivo de las células híbridas. A tal fin es conve-niente efectuar diferentes evaluaciones, loque permite una mejor caracterización delhíbrido. Comúnmente se llevan a cabo lossiguientes estudios:

1. Morfológicos. Los híbridos somáticospueden presentar rasgos morfológicos carac-terísticos. Los mismos pueden ser interme-dios a los de los parentales, la suma de ellos,u otros completamente nuevos.

2. Citológicos. El análisis del complemen-to cromosómico permite revelar si el híbridoposee el total de cromosomas de cadaparental, si se han fusionado más de dosprotoplastos, el grado de aneuploidía y posi-bles translocaciones intergenómicas. Median-te hibridación in situ empleando sondas deADN repetitivo específico de especie puedeevaluarse con más profundidad la contribu-ción de los genomas parentales y reestructu-raciones cromosómicas en el híbrido.

3. Isoenzimáticos. El patrón de bandasisoenzimáticas del híbrido debe mostrar ban-das de ambos parentales, pudiendo haberotras bandas que resultan de nuevas combi-naciones de las subunidades enzimáticas.Habitualmente se analizan los patrones deglucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglu-coisomerasas, glutamato oxalacetatotransaminasas, esterasas, peroxidasas yfosfatasas ácidas. Las isoenzimas son extre-madamente variables entre tejidos vegeta-les, por lo que para el análisis se deben em-plear los mismos tejidos u órganos, y en elmismo estadío fenológico.

4. En el ámbito del ADN. La demostra-ción de la presencia de ADN de ambosparentales es la prueba más directa de la hi-bridación. El análisis de ADN es independien-te del tejido empleado y de la edad de laplanta. Puede llevarse a cabo por RFLP(polimorfismos en la longitud de los fragmen-tos de restricción), RAPD (polimorfismos en

el ADN amplificado al azar) o Southern blot,empleando sondas de ADN repetitivo espe-cífico de especie o de genes de ARNribosomal.

10 Logros y tendencias de la hibridaciónsomática

La hibridación somática ha permitido pro-ducir híbridos que no se habían podido ob-tener por cruzamientos sexuales, incremen-tando así el flujo de genes en los cultivos. Latabla 1 muestra algunos ejemplos de híbridossomáticos que presentan algunas ventajasagronómicas.

En sus inicios, algunos esperaban que lahibridación somática permitiera producir nue-vas especies que expresaran las característi-cas deseadas de ambos progenitores. Porejemplo, por hibridación entre tomate ypapa, se buscó producir plantas que desarro-llaran tomates en la parte aérea y tubérculosen la raíz (pomato). La experiencia mostróque difícilmente puedan lograrse estoshíbridos espectaculares, debiéndose más biendirigir la técnica hacia la introgresión de po-cos genes silvestres en las especies cultivadasmediante hibridación asimétrica o cibridación,manteniendo las características generales delcultivo.

Uno de los factores que dificulta la ob-tención de híbridos simétricos es la progresi-va pérdida de cromosomas de uno de losparentales, que normalmente ocurre duran-te la regeneración. Si bien la fusión deprotoplastos permite sortear las barrerasprecigóticas, siguen existiendo barrerasgenómicas que resultan en la eliminación es-pontánea de cromosomas durante las divi-siones celulares. El mecanismo que determi-na la eliminación de cromosomas no estábien comprendido, pero generalmente seretienen los cromosomas del parental quetiene el ciclo celular más corto. Uno de losfactores que puede producir incompatibilidadgenómica es el estado de diferenciación delos tipos celulares involucrados en la fusión.Por ejemplo, cuando se fusionan células enfase de crecimiento activo con células delmesófilo, que no se dividen, generalmentese pierden los cromosomas de estas últimas.

Los híbridos somáticos o sexuales entreespecies silvestres y cultivadas contienen


muchas características no deseadas de la pri-mera, además de aquéllas deseadas. Elretrocruzamiento con la especie cultivada esrequerido para remover los genes no desea-dos del parental silvestre, pero ello no siem-pre es posible debido a que los híbridos sue-len ser estériles. La hibridación asimétrica y lacibridación tienen la ventaja de incorporarsólo uno o pocos caracteres provenientes delparental silvestre en la especie cultivada, y pro-ducir plantas con mayor fertilidad.

Algunos caracteres deseables están codi-ficados por el genoma extranuclear, talescomo la androesterilidad citoplasmática yciertos tipos de resistencia a enfermedadesy a herbicidas. Para estos casos es de particu-lar utilidad la cibridación, dado que es unmétodo simple para transferir estos genes.

11 Algunos ejemplos

Se han obtenido híbridos intergenéricosde Panicum maximum (+) Pennisetumamericanum (Ozias-Atkins et al., 1986),Saccharum officinalis (+) Pennisteumamericanum, Oriza sativa (+) Echinochloa

oryzicola, Triticummonococcum (+)Pennisetum ameri-canum, Festucaarundinacea (+)Lolium multiflo-rum. El primer casode regeneración deplantas maduras dehíbridos interge-néricos (simétricos yasimétricos) en gra-míneas fue el Festu-lolium.

A pesar de losesfuerzos realizados,la aplicación de estaestrategia no haconducido a la ob-tención de nuevoshíbridos de especiesimportantes, funda-mentalmente debi-do a problemas debaja o nula fertili-dad. Los métodosactuales de transfe-rencia de genes ais-

lados han desplazado el interés en la hibri-dación somática. Sin embargo son una exce-lente herramienta para estudiar las interac-ciones núcleo-citoplasmáticas entre genomas.

12 Lecturas recomendadas

BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolationand culture. Somatic hybridization and cybridization. En:Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier,Amsterdam. pp. 337-406.

LINDSEY Y JONES, 1992. Biología celular de la ingenieríagenética. En: Biotecnología vegetal agrícola, Capítulo 6.Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142.

MATSUMOTO, K. 2001. Híbridos somáticos. Biotecno-logía Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp.26-28.

ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principlesand industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:pp. 149-156.

Tabla 1: Ejemplos de híbridos somáticos que exhibenalgún carácter de interés agronómico

Mejoramiento genetico

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