MATERIALES Y MÉTODOS Reactivostesis.uson.mx/digital/tesis/docs/22233/Metodología.pdf ·...
Transcript of MATERIALES Y MÉTODOS Reactivostesis.uson.mx/digital/tesis/docs/22233/Metodología.pdf ·...
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
Todos los reactivos y disolventes que se utilizaron se adquirieron de las compañías
Sigma-Aldrich-Fluka y J.T. Baker
Para la síntesis de los precursores tipo diamina previamente obtenidos (2-(3-
((2-aminophenoxy)methyl)benzyloxy)benzenamine y la 2-(4-((2-
aminophenoxy)methyl)benzyloxy)benzenamine), se utilizó: 2-aminofenol-N-
protegido y α-α’dibromo-p-xileno. La amina utilizada para la formación del receptor
monocromofórico fue la 2-benciloxianilina. Para la síntesis de todos los receptores se
emplearon 1 y 2-naftilisocianato y diclorometano anhidro. También se emplearon
K2CO3 y NaOH (98%) como bases.
Por otro lado, se emplearon los siguientes disolventes: dimetilsulfóxido,
DMSO, (99.8%), acetonitrilo, CH3CN, (98%), alcohol etílico absoluto anhidro
(99.6%), diclorometano, CH2Cl2 (99.5%), dimetilformamida (DMF) (99.8%), acetona
(99%), así como los disolventes deuterados acetonitrilo (CD3CN) y dimetilsulfóxido
(DMSO-d6).
Los huéspedes que se utilizaron para reconocimiento molecular fueron los
siguientes aniones: F-, Cl-, Br-, AcO-, C6H5COO-, NO3-, HSO4
-, H2PO4- en su forma
de sales de tetrabutilamonio. De igual forma se prepararon los aniones de los
dicarboxilatos: oxalato, glutarato y suberato, utilizando para ellos los ácidos
correspondientes y el hidróxido de tetrametilamonio.
Equipos
Durante el desarrollo de la parte experimental se emplearon diversos equipos, los
cuales fueron de gran utilidad tanto en la purificación como en la caracterización de
los compuestos obtenidos.
Lámpara UV
Para monitorear las reacciones y confirmar la obtención de los productos se ut Esta
lámpara corresponde al lizo Cromatografía de Capa Fina utilizando una cámara
Spectroline modelo CM-10, que contiene una lámpara UV marca Spectroline modelo
ENF-260C de 115.
Punto de Fusión
Para la determinación del punto de fusión se utilizó el equipo Electrothermal con un
termómetro de mercurio con un rango de 0 a 400°C
Espectrofotómetro UV-Vis
Equipo de Ultravioleta-Visible marca, Agilent 8435 (Agilent Technologies) de
arreglo de diodos, equipado con lámpara de deuterio y de halógeno, con un intervalo
espectral de 187-1100 nm y celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico.
Espectrofotómetro de Emisión Electrónica Fluorescencia.
Equipo de fluorescencia marca Perkin Elmer L3 50B equipado con lámpara de xenón
para un intervalo de 187-900 nm y celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico. También
fue utilizado un equipo de fluorescencia Cary Eclipse Varian, en el Departamento
Química Inorgánica de la Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma
de México.
Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y 13C
Espectrómetro de RMN marcar Bruker modelo Avance 400 que opera a 400 MHz.
Espectrometría de Masas
Se empleó un equipo de espectrometría de masas de alta resolución JEOL JMS-700
con un modo de ionización positiva de bombardeo atómico acelerado (FAB+).
Programas
Para los ajustes por regresión lineal y no lineal por el método de mínimos cuadrados
se utilizó el programa Microcal Origin versión 8.0 de Microcal Software. Para
obtener los espectros correspondientes a RMN 1H y 13C fueron usados los equipos
MestReNova 6 y MestReC Lite 4. Además, para la representación de las nuevas
moléculas se utilizó el paquete Chem Bio Office Ultra 2010.
Técnicas Empleadas
Métodos Ópticos
La espectroscopia óptica ha sido la técnica más utilizada en los métodos
experimentales para las mediciones de constantes de asociación, particularmente la
técnica de absorción electrónica (UV-Vis) y emisión electrónica (fluorescencia), en
donde características de los espectros como la intensidad y posición espectrales son
sensibles al microambiente de los cromóforos o fluoróforos y es debido a esto que
pueden ser utilizadas para seguir el proceso de complejación
Todos los receptores poseen cromóforos que absorben a conocidas longitudes
de onda, lo cual los hace posible para utilizar algunas de estas dos técnicas.
Espectroscopia de absorción electrónica. La región ultravioleta visible es el
intervalo espectral donde operan las transiciones electrónicas que muestran gran
cantidad de moléculas orgánicas y también la de los compuestos inorgánicos. Esta
técnica se ha utilizado ampliamente en el análisis cuantitativo desde hace mucho
tiempo principalmente en la región del visible para compuestos coloridos. Las
mediciones mediante esta técnica se basan en la ley de Lambert-Beer que relaciona la
absorción de la radiación contra la concentración de un compuesto en disolución.
Estas relaciones vienen dadas para la absorbancia de A de una sustancia dada, por la
siguiente ecuación:
sclA ⋅⋅= λε (16)
Donde A representa la absorbancia, parámetro óptico adimensional que registra el
espectrofotómetro, l es el espesor de la celda (cm), c, es la concentración molar de la
sustancia y ελ el coeficiente de absorptividad molar (M-1·cm-1) a la longitud de onda a
la cual es realizada la medición (Skoog y Holler, 2001).
Los estudios de complejación mediante esta técnica consisten en obtener los
espectros del anfitrión y del huésped de forma independiente y del complejo en cada
punto de la titulación, tras la adición de microlitros de una solución concentrada del
huésped a una concentración fija del anfitrión, lo que da como resultado la
disminución o el incremento de la absorción de los máximos de absorción en el
anfitrión tras la adición del huésped y calcular la constante de asociación del
complejo, así como parámetros termodinámicos del proceso de reconocimiento
molecular (Turgut et al., 2004; Connors, 1987).
En los estudios de complejacion mediante esta técnica se puede obtener
información acerca de la composición de la solución y en consecuencia de la relación
estequiométrica. La información acerca del número de especies presente puede ser
obtenida del análisis de los espectros de las soluciones en donde en algunos casos
sucede la aparición de un punto isosbéstico, lo cual es indicativo de la presencia de
dos especies en equilibro y por lo tanto los espectros obtenidos a diferentes grados de
complejación deben pasar a través de ese punto. Aunque cabe mencionar que la
formación de más de dos especies con absortividades molares idénticas con la
observación de un punto isosbéstico no excluye la presencia de más de un equilibrio
1:1. Es por ello que en algunos casos las razones estequiométricas pueden ser
obtenidas mediante el método de Job (variaciones continuas), con lo que se determina
la estequiometria del complejo (Schneider y Yatsimirsky, 2000; Connors, 1987).
Una de las desventajas en la espectroscopia de UV-Vis para el estudio de
complejos supramoleculares se debe a que algunas veces los cambios inducidos por
complejación son pequeños. Sin embargo en algunos casos los cambios son grandes y
las moléculas empleadas pueden ser utilizadas como indicadores o sensores.
La ecuación utilizada para el cálculo de la constante de asociación para los
complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica UV-
Vis, es la siguiente:
[ ][ ]T
T
GK
GKAbsAbs
+⋅Δ=Δ
1 (17)
donde:
ΔAbs = Cambio de Absorbancia (Absorbancia substrato complejado– Absorbancia
del substrato libre)
ΔAbs∞ = Cambio de absorbancia máximo del receptor a saturación
X = Concentración del ligante
Estudios en solución mediante fluorescencia. Cuando compuestos
fluoróforos en disolución son excitados mediante radiaciones luminosas en la región
espectral del visible o del ultravioleta próximo, reemiten la energía recibida total o
parcialmente a modo de radiación fluorescente o fosforecente. De acuerdo a la ley de
Stokes, el máximo de emisión de un compuesto fluorescente se sitúa a una longitud
de onda mayor que la que corresponde al máximo de su banda de absorción. Cuando
la excitación cesa, la intensidad de la radiación emitida decrece exponencialmente.
Una relación consistente entre la intensidad de fluorescencia y la concentración del
fluoróforo es la siguiente (Lakowicz, 1999; Rouessac y Rouessac, 2003; Valeur,
2002; Skoog y Holler, 2001):
Absf II ⋅= ϕ (18)
Donde If es la intensidad de fluorescencia, φ es la eficiencia cuántica, la cual se define
como la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al
número total de moléculas excitadas e Iabs es la intensidad de la luz absorbida por el
fluorofóro. La ecuación anterior se puede expresar como un exponencial en función
de la absorbancia donde I0 es la intensidad de la luz proveniente de la fuente:
)/log( 00 AbsIIIA −= (19)
)101(0A
Abs II −−= (20)
Por lo que:
)101(0A
f II −−⋅= ϕ (21)
El término exponencial de la ecuación 20 requiere un desarrollo matemático
(serie de Mc Laurin) en donde se obtiene un término 10-A = 1-2.3 y junto con la ley
de Lambert-Beer se puede mostrar la siguiente ecuación:
bCII f εϕ 03.2 ⋅= (22)
La ecuación anterior demuestra que la concentración es directamente
proporcional a la fluorescencia, siendo posible lograr un intervalo de linealidad en
soluciones muy diluidas pero a altas concentraciones la fluorescencia tiene a saturar
debido a que la luz incidente no llega completamente al centro de la celda y no todas
las moléculas llegan a ser excitadas.
Por otro lado, la fluorescencia es mucho más sensible al microambiente del
soluto comparada con las mediciones realizadas mediante absorbancia. Aunque la
precisión de las mediciones fluorométricas son usualmente más bajas que las
mediciones de absorbancia debido a interferencias como impurezas o dispersión de la
luz por partículas de polvo que puedan encontrarse en la solución (Connors, 1987;
Schneider y Yatsimirsky, 2000; Skoog y Holler, 2001; Valeur, 2002).
La ecuación empleada para el cálculo de la constante de asociación para los
complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica de
fluorescencia es la siguiente:
XK
XKIII S
⋅+⋅⋅+
= ∞
1
(23)
donde:
Is = Intensidad del substrato libre
I∞ = Intensidad del substrato enlazado a saturación
X = Concentración del ligante
RMN de 1H
La RMN es una de las técnicas es una de las más importantes para los estudios de
complejación, ya que presenta las siguientes ventajas: En contraste con los métodos
de absorción y emisión electrónica, UV/VIS y fluorescencia, la RMN no está sujeta a
malas interpretaciones a causa de la presencia de impurezas. Por otro lado,
proporciona un gran número de señales independientes para la evaluación de los
equilibrios supramoleculares con valores de constantes que difieren por menos de
10% y precisiones de ±1%. Finalmente, proporciona información de la estructura del
complejo, es decir, permite determinar si la interacción del huésped con el anfitrión es
de asociación o bien de inclusión en una cavidad (Schneider y Yatsimirsky, 2000).
En cuanto a los estudios de complejación, el método cualitativo de estudio
consiste en obtener los espectros del anfitrión y del huésped en forma independiente,
y después del complejo formado a una concentración fija del anfitrión y del huésped.
Se obtienen los desplazamientos químicos de los protones del receptor en su forma
libre y los desplazamientos químicos de los protones del receptor como complejo (en
presencia de huésped). Finalmente estos últimos valores se emplean para calcular el
cambio de desplazamiento químico (Δδ = δsubstrato-complejado - δsubstrato-libre). Aquellos
protones que presentan el cambio más grande de desplazamiento químico
proporcionan información acerca de la estructura del complejo. Por otro lado,
también se espera que el receptor presente en general cambios más significativos de
los desplazamientos químicos de sus protones cuando esté en presencia de huéspedes
con los que tenga una mayor afinidad (Ochoa Lara, 2003).
La ecuación utilizada para el cálculo de la constante de asociación para los
complejos H-G, (de estequiometría 1:1) estudiados en esta tesis, por la técnica de
RMN de 1H, la cual considera el balance de masas, es la siguiente:
[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]
[ ]
⋅−
++−++
Δ+= ∞T
TTTTTT
Hobs H
GHK
GHK
GH 411
5.0
2
δδδ (24)
donde: δH= desplazamiento químico del protón
∞Δδ = cambio máximo de desplazamiento químico inducido por complejación
[ ]TG =Concentración total del huésped
[ ]TH =Concentración total del receptor
K=Constante de asociación
Síntesis de los Receptores Mono- y Bi-cromofóricos
Para la síntesis de los receptores bicromofóricos se hizo reaccionar las dos diaminas
previamente sintetizadas, con el 1 y el 2-naftilisocianato. Para el receptor
monocromofórico se utilizó la 2-benciloxilianilina y el 1 naftilisocianato. Las cinco
reacciones se utilizaron las mismas condiciones: como disolvente CH2Cl2 anhidro,
temperatura de reacción de 30 °C, atmósfera de nitrógeno y agitación constante por
aproximadamente 12 horas; en todos los casos, la obtención de producto se manifestó
por la formación de un precipitado. El avance de la reacción, así como la obtención
de los productos se monitoreo mediante cromatografía en capa fina (CCF), en la que
se observó la desaparición de la señal correspondiente a la materia prima y la
aparición de una nueva señal, propia de los productos. Posteriormente se procedió a
realizar la purificación.
Síntesis de los Receptores con Fluoroforo 1-naftil
Para la formación de la urea monocromofórica (1-B) el procedimiento fue el
siguiente: se colocó en un matraz de tres bocas de 100 mL a la 2-bencioloxianiliana
en CH2Cl2 anhidro, que se hizo reaccionar con 1-naftilisocianato disuelto de igual
forma en CH2Cl2 anhidro utilizando una estequiometria 1:1 y añadiendo un pequeño
exceso de este último (Esquema 1a).
Para la formación del receptor bis-urea bicromofórico (1-M, 1-P) se siguió el
procedimiento antes mencionado, siguiendo una estequiometría 1:2 con un pequeño
exceso del isocianato (Esquema 1b).
O
NH2
+
NCOCH2Cl2Ref lujo
ReceptorMonocromof órico
a)
O
NH2
+
CH2Cl2Reflujo
ReceptoresBicromofóricosO
H2N
=
m-xililen p-xililen
NCO
b)
Esquema 1. a) Síntesis de la urea monocromofórica 1-B; b) Síntesis de los receptores
bisurea bicromofóricos 1-M y 1-P.
Sintesis de los Receptores con Fluoroforo 2-naftil
Para la síntesis de estos dos receptores bicromofóricos (2-M y 2-P) se emplearon el 2-
naftilisocianato y las diaminas correspondientes. Siguiendo el procedimiento antes
mencionado, con una estequiometría 1:2 y con un pequeño exceso del isocianato
(Esquema 1b).
Espectroscopia de Absorción Electrónica (UV/Vis)
Cálculo de Coeficiente de Extinción Molar
Se prepararon soluciones madre de todos los receptores, a partir de la cual se
prepararon soluciones con una concentración de 1.063 mM en una mezcla de CH3CN:
DMSO (90:10) y se procedió a registrar los espectros a diferentes concentraciones de
todos los receptores. En una celda de cuarzo se agregaron 2.5 mL de la mezcla de
disolventes, tomándose una primera lectura. Posteriormente, se añadieron alícuotas de
10µL y se mantuvo en agitación por 5 minutos a 25 °C y pasados estos, se realizó la
primera lectura. La concentración final leída fue de 5.65 x10-5 M
Estudios de Complejación
Uv-Vis
Soluciones 1-B, 1-M y 1-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la
sección anterior, se consideró que la concentración adecuada del receptor 1-B para los
estudios en solución es 3.5x10-5 M; en el caso de los receptores 1-M y 1-P la
concentración a utilizar es 3.0x10-5 M. Se utilizó una mezcla de CH3CN:DMSO
(90:10).
Soluciones 2-M y 2-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la sección
anterior, se consideró que la concentración adecuada para ambos receptores fue de
1.0x10-5 M en una mezcla de CH3CN:DMSO (90:10).
Soluciones de aniones. Se prepararon soluciones madre 0.4 M en DMSO para
los aniones F-, HSO4-y H2PO4
- en formas de sales de tetrabutilamonio (TBA); a partir
de dichas disoluciones, se llevó a cabo una dilución con concentración final de 0.02
M en un sistema de disolventes CH3CN:DMSO (90:10). Para el anión acetato, se
preparó una solución 0.1 M en CH3CN:DMSO (90:10). Dichas disoluciones fueron
utilizadas para llevar a cabo las titulaciones frente a los receptores, como parte de los
estudios de reconocimiento molecular.
Las sales de los aniones dicarboxilatos fueron preparados in-situ, utilizando
los ácidos dicarboxílicos e hidróxido de tetrametilamonio (Me4NOH), la reacción se
realizó de la siguiente forma:
HOOC-R-COOH + Me4NOH = TMA-OOC-R-COO-TMA + H2O
Se prepararon disoluciones madres 0.2 M en DMSO para los aniones oxalato,
succinato, glutarato y suberato. A partir de dichas disoluciones, se llevó a cabo una
dilución con concentración final de 0.02 M en un sistema de disolventes
CH3CN:DMSO (90:10).
Titulación Espectrofotométricas
Cada una de las titulaciones fueron realizadas de la siguiente manera. En una celda de
cuarzo de 3 ml de volumen y 1 cm de paso óptico, se agregaron 2500 µL de los
receptores a una concentración definida. Se tomó un primer espectro, en ausencia del
huésped. Posteriormente, se adicionó una alícuota de una solución madre de un
huésped en específico. Para alcanzar el equilibrio, la solución en la celda se mantuvo
a agitación y temperatura constante por 5 minutos. En seguida se procedió a registrar
el espectro de absorción para este primer punto de la titulación. La variación del
volumen en la celda no fue mayor del 6% y la concentración máxima obtenida de los
huéspedes fue de 1.163 mM.
Fluorescencia
Con el fin de conocer la concentración adecuada de cada receptor para realizar
titulaciones, se prepararon soluciones madre 5.0 x10-5 M en CH3CN:DMSO (90:10)
de todos los receptores y se procedió a tomar los espectros a diferentes
concentraciones de todos los receptores. En una celda de cuarzo se agregaron 3 mL
de la mezcla de disolventes, tomándose una primera lectura. Posteriormente, se
añadieron diferentes alícuotas de 5µL de soluciones madre de cada receptor de
0.01063 M en una mezcla de disolventes CH3CN:DMSO (90;10), se mantuvo en
agitación por 5 minutos a 25 °C y pasados estos, se realizó la primera lectura.
Soluciones 1-B, 1-M y 1-P. De acuerdo a los espectros obtenidos de la
sección anterior, se consideró que tanto para el receptor monocromofórico, como para
los receptores 1-M y 1-P la concentración adecuada es 5.0 x10-7 M.
Soluciones 2-M y 2-P. De acuerdo a los espectros obtenidos en la sección
anterior, se consideró que la concentración adecuada para ambos receptores fue de
2.0 x10-7 M.
Soluciones de aniones. Se prepararon soluciones madre 0.02 M en
CH3CN:DMSO para los aniones Cl-, NO3-, HSO4
-, H2PO4- y AcO- en formas de sales
de tetrabutilamonio (TBA). Para el anión acetato, se preparó un disolución de 0.1 M.
Dichas disoluciones fueron utilizadas para llevar a cabo titulaciones, como parte de
los estudios de reconocimiento molecular.
Las soluciones de los aniones dicarboxilatos fueron preparados in-situ, como
se mencionó antes. Se prepararon disoluciones madres 0.5 M en DMSO para los
aniones glutarato y suberato. A partir de dichas disoluciones, se llevó a cabo una
dilución con concentración final de 0.02 M en un sistema de disolventes
CH3CN:DMSO (90:10). Para el anión oxalato se preparó una solución 0.5 M en un
mezcla de disolventes DMSO:H2O (50:50); a partir de esta, se hizo una dilución de
0.02 M en un sistema de mezclas de CH3CN:DMSO:H2O (96:2:2).
Titulaciones por Fluorescencia
Cada una de las titulaciones fueron realizadas de la siguiente forma: en una celda de
cuarzo de 3.0 ml de volumen y 1 cm paso óptico, se agregaron 2500 µL de los
receptores a una concentración definida. Se tomó un primer espectro, en ausencia del
huésped. Posteriormente, se adicionó una alícuota de una solución madre de un
huésped en específico. Para alcanzar el equilibrio, la solución en la celda se mantuvo
a agitación y temperatura constante por 5 minutos. En seguida se registró el espectro
de emisión para este primer punto de la titulación. La variación del volumen en la
celda no fue mayor del 6% y la concentración máxima obtenida de los huéspedes fue
de 1.084 mM.
RMN 1H
Los estudios realizados mediante esta técnica, no fueron realizados para todos los
receptores, ni se usaron todos los aniones. Solo se analizaron los receptores y aniones
que arrojaron resultados y cambios más notables, originados de los estudios mediante
fluorescencia y UV-Vis.
Para realizar los estudios de complejación mediante está técnica,
primeramente se preparó una solución madre de 24.3 mM en DMSO-d6 a partir de la
cual, se realizó una dilución con una concentración de 2.43 mM en CD3CN, de tal
manera que se obtuvó una mezcla final de CD3CN:DMSO-d6 en proporción 90:10. La
solución final, fue depositada en una celda para RMN, para llevar a cabo titulaciones.
Solución de aniones. Se prepararon disoluciones madre 0.4 M en
CD3CN:DMSO-d6 (90:10) para los aniones Cl-, Br-, NO3-, HSO4
-, H2PO4-, AcO- y
benzoato en formas de sales de tetrabutilamonio (TBA). A partir de estas soluciones
madres, se preparó una dilución 0.2 M en la misma mezcla de disolventes. Ambas
soluciones fueron utilizadas para llevar acabo titulaciones por RMN 1H.
Titulaciones por RMN 1H
Cada una de las titulaciones fue realizadas de la siguiente manera: en una celda para
RMN, se agregaron 500 µL de los receptores. Se tomó un primer espectro, en
ausencia del huésped. Las primeras dos adiciones del huésped específico se toaron de
la solución madre y las alícuotas posteriores, de la dilución. Para alcanzar el
equilibrio, la solución en la celda se mantuvo a agitación y temperatura constante por
5 minutos. En seguida se registró el espectro correspondiente tras esta adición. El
volumen en la celda varió un 10% y la concentración máxima presente de los
huéspedes fue de 35.4 mM.
Método de Job Este estudio, es utilizado para determinar la relación estequiométrica en la formación
del complejo. El estudio fue realizado por la técnica de RMN 1H utilizando el
receptor 2-M y el huésped acetato. Para lo anterior, se preparó una solución de 2-M
0.152 M en DMSO-d6 y una solución del huésped 0.083 M en DMSO-d6. Se
prepararon 8 muestras, donde la fracción molar de ambas especies fue variando y
siempre procurando que el volumen total final fuese de 500 µL y la mezcla de
disolvente final resultase ser CD3CN:DMSO-d6 (90:10). Las adiciones fueron
realizadas como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Experimento Job: 2-M y acetato.
2-M, mM
Acetato, mM
Adición 2-M (μL)
Adición Acetato
(μL)
DMSO-d6 (μL)
Adición DMSO-d6
(μL)
Adición CD3CN
(μL)
X anfitrión
7 0 23.02 0 23.02 26.98 450 1 6 1 19.73 6.03 25.76 24.25 450 0.86 5 2 16.45 12.06 28.5 21.5 450 0.715 4 3 13.15 18.09 31.24 18.76 450 0.571 3 4 09.87 24.12 33.99 16.00 450 0.423 2 5 06.59 30.15 36.74 13.26 450 0.285 1 6 03.29 36.18 39.47 10.53 450 0.143 0 7 0 42.21 42.21 7.80 450 0