Memoria del proyecto UE07/02

“Estudio de la conectividad ecológica en la CAPV.

Genética del Paisaje aplicada sobre una especie-

objetivo de la Red de Corredores Ecológicos: la

marta europea (Martes martes)”

Julio de 2010

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Memoria del proyecto UE07/02

”Estudio de la conectividad ecológica en la CAPV.

Genética del Paisaje aplicada sobre una especie-objetivo

de la Red de Corredores Ecológicos: la marta europea

(Martes martes)”

Ruiz-González, A.1, Gurrutxaga, M.2, Madeira, M.J.1, Lozano, P.J.2, Fernández,

J.M.3 y Gómez-Moliner, B.J.1

1Departmento de Zoología y Biología Celular Animal, Laboratorio de Zoología, Facultad de

Farmacia, Universidad del País Vasco (UPV-EHU), C/ Paseo de la Universidad 7, 01006. Vitoria-

Gasteiz 2Departamento de Geografía, Universidad del País Vasco (UPV-EHU), Tomás y Valiente s/n,

01006. Vitoria-Gasteiz, 3 Departamento de Territorio y Biodiversidad, IKT, SA, Granja Modelo, s/n, 01192 Arkaute.

E-mail de contacto: benjamin.gomez@ehu.es

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................... 6

1.1. Motivación ........................................................................................................................... 6 1.2. Objetivos.............................................................................................................................. 9

2. MATERIAL Y MÉTODOS ........................................................................................................ 11

2.1. Área de estudio y recolección de muestras ...................................................................... 11 2.1.1 Área de estudio .......................................................................................................................... 11 2.1.2 Recolección de muestras ........................................................................................................... 11

2.2. Extracción de ADN ............................................................................................................ 12 2.3. Diferenciación genética del género Martes mediante el análisis genético de excrementos (PCR-RFLP) ....................................................................................................... 12 2.4. Análisis mediante marcadores microsatélites ................................................................... 13

2.4.1. Diseño y optimización de un protocolo multiplex para el genotipado de muestras no-invasivas13 2.4.2 Probabilidad de identidad de los individuos ............................................................................... 14 2.4.3 Amplificado de microsatélites y genotipado de los individuos .................................................... 15 Genotipos consenso y errores de genotipado..................................................................................... 16

2.5. Diversidad genética y estructuración poblacional ............................................................. 16 2.5.1 Diversidad genética/ estadísticos descriptivos de diversidad genética ...................................... 16 2.5.2. Análisis de estructuración poblacional: Identificación de poblaciones mediante análisis de agrupación bayesiana ......................................................................................................................... 16

2.5.2.1 Análisis mediante GENELAND................................................................................................................. 17 2.5.2.2 Análisis mediante STRUCTURE .............................................................................................................. 17

2.6. Análisis de correlación entre distancias genéticas y modelado SIG de la conectividad del paisaje ................................................................................................................................ 18

2.6.1. Cálculo de distancias genéticas ................................................................................................ 18 2.6.2. Análisis de conectividad del paisaje mediante modelado SIG .................................................. 18

2.6.2.1. Modelos de conectividad ......................................................................................................................... 18 Modelo de conectividad de la red de corredores ecológicos de la CAPV ...................................................... 19 Modelos de conectividad binarios: gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales .......... 20

2.6.2.2. Cálculo de distancias de mínimo coste y distancias euclidianas ............................................................ 23 2.6.3. Análisis de correlación entre distancias genéticas, euclidianas y de mínimo coste .................. 24

3.RESULTADOS.......................................................................................................................... 25

3.1. Recolección de muestras .................................................................................................. 25 3.2. Diferenciación genética del género Martes mediante el análisis genético de excrementos (PCR-RFLP) ....................................................................................................... 25 3.3. Análisis mediante marcadores microsatélite..................................................................... 28

3.3.1. Diseño y optimización de un protocolo multiplex para el genotipado de muestras no-invasivas28 3.3.2 Probabilidad de identidad de los individuos ............................................................................... 29 3.3.3 Amplificado de microsatélites y genotipado de los individuos .................................................... 30

3.4. Diversidad genética y estructuración poblacional ............................................................. 31 3.4. Análisis de correlación entre distancias genéticas y modelado SIG de la conectividad del paisaje ................................................................................................................................ 35

4. DISCUSIÓN.............................................................................................................................. 37

4.1. Distribución y relaciones de simpatría de las especies del género Martes ...................... 37 4.2. Análisis mediante marcadores microsatélite: éxito y errores de genotipado.................... 38 4.3. Estructuración espacial y conectividad funcional de la marta........................................... 39

4.3.1. Estructuración espacial de las poblaciones............................................................................... 39

4. RESUMEN Y CONCLUSIONES .............................................................................................. 44

5. PERSPECTIVAS FUTURAS.................................................................................................... 46

6. AGRADECIMIENTOS .............................................................................................................. 47

7. BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................ 48

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Delimitación del área de estudio. ....................................................................................... 11 Figura 2 Esquema representativo de la metodología de identificación de especies mediante el

método de PCR-RFLP. ............................................................................................................ 13 Figura 3. Superficie de resistencia del modelo de conectividad de la RCE de la CAPV. ................ 20 Figura 4. Mapas de resistencias binarios, en gradiente de mayor a menor querencia por ambientes

forestales (A-G). En color verde se representa la resistencia de valor 1 y en naranja la resistencia de valor 50. ............................................................................................................ 22

Figura 5. Rutas de mínimo coste (least cost paths, LCP) obtenidas según el modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV. Las LCP discurren por aquellos píxeles que oponen menor resistencia acumulada al desplazamiento de la especie entre cada par de puntos. ................................................................................................................. 23

Figura 6. Ejemplo del cálculo de la distancia euclidiana y la distancia de mínimo coste (least cost distance, LCD) entre dos individuos. La distancia euclidiana corresponde a la longitud de la línea recta. La LCD corresponde al coste acumulado a lo largo de la ruta de mínimo coste (LCP) entre dos puntos. La LCD se calcula sumando la resistencia que posee cada píxel que atraviesa multiplicada por la longitud de píxel atravesada. En este caso, la presencia del pantano de Legutiano entre los dos puntos hace que la ruta de mínimo coste lo bordee por el norte. ........................................................................................................................................ 24

Figura 7. Representación geográfica de la totalidad de muestras recolectadas (n=798) en el presente estudio. ..................................................................................................................... 25

Figura 8. Localización geográfica de las muestras del género Martes identificadas mediante PCR-RFLP en el ámbito de la CAPV y zonas limítrofes. ................................................................. 26

Figura 9. Distribución de la marta (Martes martes) en cuadrículas UTM 10x10km......................... 27 Figura 10. Distribución de la garduña (Martes foina) en cuadrículas UTM 10x10km. ..................... 27 Figura 11. Localización de muestras de marta respecto a la Red de Corredores Ecológicos (RCE)

de la CAPV. ............................................................................................................................. 28 Figura 12. Ejemplo de electroferograma obtenido en este estudio a partir de la PCR multiplex M1,

donde se observan los diferentes tamaños de alelos obtenidos para cada marcador microsatélite con un color de fluorocromo diferente................................................................ 29

Figura 13. Probabilidad de identidad (PID-unbias) y Probabilidades de identidad de hermanos (PID-sib) calculadas a partir del genotipo de 35 muestras de marta obtenido mediante 15 marcadores microsatélites. El valor de 0,01 representa el valor a partir del cuál existe un número suficiente de loci para distinguir entre diferentes individuos con una fiabilidad mayor del 99%. ................................................................................................................................... 30

Figura 14. Mapa de asignación de los individuos a cada uno de los grupos poblacionales inferidos mediante Structure (K=3) y para cada píxel del territorio mediante Geneland (K=4). En el caso del Structure cada individuo está representado por un círculo con 3 colores que representan la proporción de pertenencia (q) a cada uno de los 3 grupos poblacionales (Grupos Navarro, Oriental y Central). En el caso del Geneland se representan el valor de asignación a cada uno de los 4 grupos inferidos para cada uno de los pixeles del área de estudio (Grupos Navarro, Oriental, Central y Oriental) ........................................................... 32

Figura 15. Mapas de probabilidad de pertenencia a cada grupo poblacional (de arriba abajo: grupo Navarro, Oriental, Central y Occidental) obtenidos mediante GENELAND. ........................... 33

Figura 16. Localización y número de muestras identificadas como marta (Martes martes) en la franja norte de la Península Ibérica (714 muestras en total)................................................... 46

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Valores de fricción del modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV.19 Tabla 2. Valores de fricción de la variante del modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE

de la CAPV que suprime el efecto barrera de las carreteras y el suelo urbano...................... 20 Tabla 3. Valores de fricción correspondientes a los modelos de conectividad binarios, en gradiente

de mayor a menor querencia por ambiente forestales. ........................................................... 22 Tabla 4 Marcadores microsatélite empleados en este estudio y su correspondiente agrupación en

multiplex. Rango de cada marcador microsatélite (Rango); Numero de alelos por locus (A), Riqueza alélica (AR), heterocigosidad esperada (Hexp) y observada (Hobs), tasa de PCR positivas (PCR+), droupout (ADO) y falsos alelos (FA) para cada uno de los locus. ............. 31

Tabla 5 Diversidad genética obtenida para los cuatro grupos de marta identificados mediante GENELAND. Número de individuos (n), número medio de alelos por cada locus (A), Heterocigosidad observada (Ho), y heterocigosidad esperada (He), valores de significancia para el equilibrio de Hardy-Weinberg HW (significancia p<0,05) y valores de Fis (Intervalo de confianza al 95%). Los valores significativos se marcan mediante un asterisco *.................. 34

Tabla 6 Valores de Fst entre pares de grupos identificados mediante GENELAND. Los valores de Fst significativos (P < 0.05) se indican mediante un asterisco................................................ 34

Tabla 7 Estimas de flujo génico (Nm) bi-direccional entre los grupos de marta inferidos mediante GENELAND y calculados mediante MIGRATE....................................................................... 35

Tabla 8 y Figura 16. Coeficientes de correlación de Pearson (Mantel r) entre distancias de coste y distancias genéticas para los diferentes modelos de conectividad considerados: 1) Red de corredores ecológicos de la CAPV (RCE) y su correspondiente variante (RCEv) 2) modelos binarios en gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales (modelos A-G). Se incluyen así mismo variantes de dichos modelos mediante la inclusión de ríos (Br, Dr y Er) y zonas humanizadas (Dc y Ec). El valor de correlación con la distancia euclidiana (IBD) se utiliza como valor de partida. En todos los casos la correlación resultó significativa (p<0,0001)................................................................................................................................ 36

Tabla 9. Comparación de los resultados del test de Mantel obtenidos en diferentes estudios de genética del paisaje inferidos a nivel de individuos. Coeficientes de correlación de Pearson (Mantel r) obtenidos entre distancias genéticas inter-individuales y distancias euclidianas, y entre distancias genéticas y distancias funcionales. ............................................................... 43

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. Motivación

Los procesos de reducción y fragmentación de hábitats están considerados la principal causa de

la crisis global de biodiversidad (Fraknhan et al. 2000). Estos procesos pueden repercutir

notablemente en los procesos dispersivos de la biota, reduciendo el flujo génico entre

poblaciones, con los consiguientes efectos negativos sobre la viabilidad de las poblaciones

(Santos y Tellería, 2006; Fischer & Lindermayer 2007).

La conectividad ecológica del territorio puede definirse como la capacidad de éste para dar

soporte a los desplazamientos de las especies silvestres entre las teselas con recursos (Taylor et

al. 1993). La conectividad ecológica que presenta un territorio es regulada por diferentes factores

(bióticos y abióticos) así como por las políticas sectoriales, especialmente la urbanística, la de

infraestructuras de transporte y la agraria.

La conectividad ecológica que presenta el territorio es específica para cada especie, dado que

varía en función de la escala a la que la especie percibe la heterogeneidad del paisaje, de la

movilidad de la especie y del perfil ecológico de ésta (Tischendorf & Fahrig 2000). Trasladado

sobre la casuística de especies concretas, el término conectividad puede referirse al grado de

comunicación y de intercambio de individuos y genes entre poblaciones.

Los métodos moleculares ofrecen en la actualidad una interesante aproximación para cuantificar

el flujo génico a través del territorio. En este sentido, existe un creciente número de herramientas

que permiten diagnosticar la estructura y variación genética de las poblaciones de una especie en

el tiempo y el espacio, así como establecer su relación con las variables ambientales y/o

territoriales. Esto ha permitido el desarrollo de la disciplina denominada genética del paisaje

(Landscape genetics), que integra la genética de poblaciones, la ecología del paisaje y la

estadística espacial (Manel et al. 2003; Storfer et al. 2007; Holderegger & Wagner 2008).

La genética del paisaje es una disciplina emergente que nos permite determinar el efecto de la

heterogeneidad territorial sobre la conectividad ecológica o funcional (i.e. flujo génico) (Manel et al.

2003; Storfer et al. 2007; Holderegger & Wagner 2008). Específicamente, la genética del paisaje

nos permite cuantificar la relación entre la conectividad genética obtenida empíricamente (e.g

distancia genética) y las estimas de conectividad ecológica obtenidas mediante modelado SIG (e.g

distancias efectivas; (Coulon et al. 2004; Broquet et al. 2006; Cushman et al. 2006).

La investigación en genética del paisaje conlleva dos pasos analíticos (Manel et al. 2003) que

pueden ser combinados en un único análisis. En el primer paso, se describen los patrones de

variación genética poblacional y en el segundo paso, estos patrones se correlacionan

estadísticamente con variables ambientales. Por consiguiente, el objetivo final de la genética del

paisaje es cuantificar el efecto de la configuración del paisaje en la variación genética (Storfer et

al. 2007).

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En los últimos años, se han desarrollado numerosas herramientas estadísticas para la

consecución del segundo paso analítico, con un creciente número de estudios basados en el

análisis a nivel individual en lugar de poblacional (Manel et al. 2003).

En este sentido, en los últimos años, los métodos bayesianos se han consolidado como una

alternativa a los métodos tradicionales, que requieren de una definición a priori de las poblaciones

bajo estudio (Guillot et al. 2009). Estos métodos permiten inferir la estructuración genética sin la

necesidad de tomar asunciones acerca de la pertenencia de cada individuo a una determinada

población. Los métodos de agrupación Bayesiana permiten delimitar poblaciones de un modo más

adecuado y son particularmente útiles para describir la estructuración poblacional en especies con

una elevada movilidad y/o en especies con una distribución continua, caso de la mayoría de los

mesocarnívoros y grandes carnívoros (e.g., Cegelski et al. 2003; McRae et al. 2005; Sacks et al.

2008). La Evaluación de la estructuración genética poblacional de una especie resulta crucial para

definir de un modo apropiado las unidades de gestión y conservación (Frankham et al. 2002;

Palsboll et al. 2007) y para el mantenimiento del flujo génico y la diversidad genética (Moritz

2002).

Paralelamente, uno de los métodos utilizados en genética del paisaje, que nos permite inferir la

conectividad funcional, es comparar las distancias genéticas inter-individuales con distancias

funcionales o efectivas obtenidas a partir de modelos de conectividad en soporte SIG (Sistemas

de Información Geográfica) basados en mapas o en superficies de resistencia del territorio al

desplamientos de la especie (Coulon et al. 2004; Broquet et al. 2006). Las distancias efectivas

reflejan, por tanto, cómo la configuración del territorio influye en los procesos dispersivos, el flujo

génico y la conectividad genética (Beier et al. 2008). En poblaciones con una dispersión limitada

espacialmente, el flujo génico está influenciado frecuentemente por la distancia geográfica y

disminuye a medida que aumenta la distancia. Este patrón se conoce como “aislamiento por

distancia” (isolation by distance; IBD) (Wright 1943) y puede ser cuantificado mediante la

comparación entre las distancias geográficas y genéticas inter-individuales.

El efecto específico de la configuración territorial sobre la estructuración genética puede ser

estudiado mediante el análisis de la desviación de las distancia genéticas de un patrón simple de

IBD. De forma resumida, es esperable que en ambientes heterogéneos y en el caso de especies

especialistas del hábitat, las distancias efectivas expliquen mejor las distancias genéticas inter-

individuales que la mera distancia geográfica que no tiene en cuenta la estructura territorial.

Estudios recientes en genética del paisaje basados en modelos de conectividad y aplicados sobre

especies forestales como la marta americana (Martes americana) (Broquet et al. 2006) y el corzo

(Capreolus capreolus) (Coulon et al. 2004) respaldan la hipótesis de que el flujo génico se ve

afectado por las características del paisaje y que dicha interacción puede ser detectada mediante

el análisis de la estructura genética espacial.

En lo que a los espacios naturales protegidos (ENP) respecta, el fomento de la conectividad

ecológica entre ellos es objeto de una creciente atención dentro de las políticas de conservación

de la naturaleza a nivel internacional (Bennett & Mulongoy, 2006; Jongman & Pungetti, 2004;). Su

importancia estriba en evitar el aislamiento de los ENP, frenar la pérdida de biodiversidad y mitigar

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los efectos del cambio climático sobre la biota (Opdam & Wascher, 2004). En este sentido, la

integración de criterios de conectividad ecológica en la planificación del conjunto territorial es

fundamental para evitar que los ENP funcionen como lugares inconexos, incapaces de actuar

como nodos de redes ecológicas coherentes y de ejercer el papel de conservación para el que

son designados (Carroll et al. 2004).

En el artículo 10 de la Directiva 92/43/CEE, o Directiva Hábitats, la cual regula el establecimiento

de la red europea de espacios Natura 2000, se insta a gestionar aquellos elementos del paisaje

esenciales para la migración, la distribución geográfica y el intercambio genético de las especies

silvestres, con el objeto de fomentar la coherencia funcional de dicha red (Kettunen et al. 2007).

En el año 2005, la Dirección de Biodiversidad del Gobierno Vasco encargó a IKT, S.A. la

delimitación de una Red de Corredores Ecológicos (en adelante RCE), compromiso recogido en el

Programa Marco Ambiental autonómico. Este estudio (Gurrutxaga, 2005) consistió en delimitar, a

escala regional, aquellos sectores de la matriz territorial de especial interés para garantizar la

conectividad ecológica entre diferentes espacios Natura 2000 de la CAPV. Se seleccionó un grupo

funcional de especies-objetivo, sensibles a la fragmentación del hábitat a escala regional, formado

por mesomamíferos de vocación forestal. Los corredores se delimitaron sobre suelo rústico,

abarcando tanto sectores de vegetación espontánea como agrosistemas con diferentes prácticas

de aprovechamiento. Su delimitación se apoyó en un modelo SIG, que permitió la identificación de

rutas de mínimo coste (least cost paths) (Adriaensen et al. 2003) entre espacios Natura 2000. En

torno a las rutas de mínimo coste se delimitaron los corredores, con una anchura variable en torno

a los 2 km.

De entre el conjunto de especies-objetivo de la RCE de la CAPV, la marta europea (Martes

martes) es la que presenta requerimientos forestales más estrictos y está más vinculada a

bosques maduros de cierta extensión (Zalewski & Jedrzejewski 2006). Por ello, potencialmente

presenta un notable carácter indicador respecto a los procesos de fragmentación forestal y

pérdida de conectividad funcional ( Mergey, 2007; Pereboom et al. 2008).

Sin embargo, la obtención de muestras biológicas de marta para estudios moleculares resulta

compleja y costosa. Una alternativa es centrarse principalmente en material obtenido de forma no-

invasiva (muestras fecales). La utilización de este tipo de muestras ofrece la posibilidad de realizar

un seguimiento de carácter no invasivo, analizar un elevado tamaño muestral, evaluar áreas de

mayor extensión y estudiar un amplio número de individuos. No obstante, ello conlleva una serie

de limitaciones. En este sentido, además de las complicaciones metodológicas asociadas al uso

de muestras no invasivas (baja tasa de éxito amplificado y elevadas tasas de error en el proceso

de genotipado), la obtención de muestras fecales de marta para su posterior aplicación en

estudios moleculares requiere, como paso previo, una identificación fiable de la especie también

mediante técnicas moleculares. La marta (Martes martes) y la garduña (Martes foina) son dos

especies de mustélidos que ocupan de forma simpátrica la mayor parte de Europa (Proulx et al.

2004). Debido al limitado conocimiento de sus relaciones bioecológicas, su marcado

comportamiento elusivo y a que sus excrementos no pueden ser distinguidos exclusivamente por

su morfología, resulta muy complejo monitorizar sus poblaciones. Por ello, el análisis de muestras

no invasivas mediante herramientas moleculares, se está convirtiendo en una valiosa herramienta

9

para la identificación de especies, evitándose los errores asociados a la incorrecta identificación

de excrementos, que pueden comprometer de forma notable la calidad y fiabilidad de los

resultados en los estudios de distribución. Bajo este marco, la técnica de PCR-RFLP (Polymerase

Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) desarrollada por nuestro grupo de

investigación (Ruiz-González et al. 2008) permite identificar mediante el análisis del ADN extraído

a partir de excrementos, la naturaleza específica de cada muestra fecal (M. martes o M. foina). La

aplicación de esta técnica sobre muestras fecales recolectadas en el ámbito de estudio, nos

permite 1) llevar a cabo un seguimiento exhaustivo y fiable de su distribución de forma no–

invasiva y 2) aislar de forma exclusiva las muestras de marta para su posterior análisis con

marcadores microsatélite.

1.2. Objetivos

El objetivo principal de este trabajo es determinar el grado de estructuración de las poblaciones

de marta e inferir la conectividad funcional en el ámbito de la CAPV mediante la combinación de

información territorial y genética. Para su consecución, pretendemos dar respuesta a dos

cuestiones principales mediante el uso de diferentes metodologías:

1) ¿Se encuentran las poblaciones de marta de la CAPV estructuradas espacialmente desde el

punto de vista genético o se trata de un único conjunto poblacional? Daremos respuesta a esta

pregunta mediante el uso de dos algoritmos de agrupación Bayesiana.

2) ¿Cual es el impacto de los usos del suelo en la conectividad funcional? Mediante el uso del

Test de Mantel y un patrón de IBD como hipótesis nula, estudiaremos la correlación entre las

distancias genéticas inter-individuales y diferentes distancias efectivas obtenidas a partir de

diferentes modelos de conectividad: i) el utilizado para el diseño de la RCE de la CAPV y ii) 6

modelos binarios que representan diferentes gradientes, desde lo más estrictamente forestal hasta

la inclusión de espacios abiertos como zonas favorables a la dispersión.

La evaluación de los diferentes modelos permitirá:

2.1.) Testar empíricamente el modelado SIG que se utilizó en el diseño de la RCE de la CAPV

(Gurrutxaga, 2005), en términos de adecuación de la parametrización realizada acerca de la

influencia de los usos del suelo sobre la movilidad de la especie, inferida mediante el intercambio

genético detectado.

2.2.) Determinar cuáles son los usos del suelo favorables a la dispersión de la marta en la CAPV.

Como objetivos parciales de la investigación, se persigue:

- Obtener una aproximación sobre la distribución de las especies del género Martes en zonas de

simpatría, mediante técnicas moleculares no invasivas, como alternativa a métodos de

inventariación tradicionales.

- Aislar de forma exclusiva las muestras de marta para su posterior análisis con marcadores

microsatélite.

10

- Profundizar en el conocimiento del uso del hábitat, y relaciones bioecológicas de las especies del

género Martes presentes en la CAPV: la marta (Martes martes) y la garduña (Martes foina) en

zonas de simpatría, mediante el análisis genético de excrementos del género Martes y su

posterior tratamiento mediante SIG.

- Ampliar el conocimiento sobre el estado de conservación de la marta en la CAPV, actualmente

catalogada como “Rara” en el Catálogo Vasco de Especies Amenazadas.

- Desarrollar un panel de marcadores microsatélite 1) efectivo y fiable para su utilización en

muestras fecales y 2) suficientemente polimórfico para identificar las muestras a nivel individual,

con el que proceder a·3) caracterizar genéticamente las poblaciones de marta en el área de

estudio

- Evaluar las potencialidades y limitaciones de combinar las superficies de resistencia utilizadas

para delimitar corredores ecológicos mediante la identificación de rutas de mínimo coste (least

cost paths), y los análisis genéticos en estudios de conectividad.

11

2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. Área de estudio y recolección de muestras

2.1.1 Área de estudio

El área de estudio considerada para los análisis de estructuración espacial de la marta (ver

apartado 2.6) engloba de forma genérica la Comunidad Autónoma del País Vasco y zonas

limítrofes (CAPV+ZL) y la Comunidad Foral de Navarra (NA) (Figura 1).

Debido a que el presente trabajo se focaliza de forma especial en la evaluación de la conectividad

ecológica en el ámbito de la CAPV, los análisis de correlación entre distancias genéticas inter-

individuales y distancias funcionales (ver apartado 2.5) se realizan de forma exclusiva en el área

correspondiente a la CAPV y zonas limítrofes (Figura 1).

Figura 1 Delimitación del área de estudio.

2.1.2 Recolección de muestras

La recolección de muestras se llevó a cabo en el período comprendido entre 2004 y 2010. Sin

embargo, las muestras de excrementos recolectadas durante el periodo 2004-2005, si bien han

sido utilizadas para determinar la distribución de las especies simpátricas del género Martes

(M.martes y M.foina), no han sido empleadas para el genotipado con microsatélites debido a la

baja calidad del ADN extraído tras su almacenamiento prolongado.

La marta y la garduña, al igual que la gran mayoría de los carnívoros, utilizan las pistas forestales

o los senderos como zonas de marcaje (Barja 2005). Por tanto, para localizar los excrementos

atribuibles al género Martes se realizaron recorridos a pie, por pistas forestales y senderos dentro

del área de estudio, dirigidos de forma preferencial hacia zonas forestales con presencia potencial

de marta, ya que se trata de la especie objetivo del presente estudio. Los muestreos a partir de

excrementos se han completado con muestras de tejido obtenidas de manera oportunista a partir

de individuos atropellados y/o trampeados en otros estudios de seguimiento de mesocarnívoros

promovidos por diferentes administraciones públicas.

Las muestras de excrementos y tejido fueron recolectadas en Tubos eppendorf con etanol de 96º

y fueron almacenadas a -20ºC hasta su posterior análisis genético. Las muestras recolectadas

12

fueron georrefenciadas mediante GPS (Garmin eTrex) para su posterior análisis mediante SIG

(ArcGIS 9.2.).

Debido a la amplia extensión del área de estudio, ha sido necesaria la colaboración de diferentes

personas y entes en el proceso de recolección de muestras:

Servicio de Guardería de las secciones de Parques Naturales y Caza y Pesca de la Diputación

Foral de Álava (DFA); Museo de Ciencias Naturales de Álava; G. Belamendia (CEA); P. Lizarraga

y L. Lorza, (CRF Martioda-DFA); F. Canales y M.A. Campos (CRN); J.Pinedo; E. Arberas; Oskar

Berdión, M. Corral; N. Ruiz de Azua; J. López de Luzuriaga; I. Aginako; H. Aguirre; P. Pérez; J.

Ruiz Guijarro; I. Martínez; E. Díaz; J.M. Pérez de Ana; D. Vado; A. Eguia; Iñigo Zuberogoitia;

Fermin Urra; Marta Barral (NEIKER); A. García de Albéniz.

2.2. Extracción de ADN

La extracción de ADN a partir de muestras fecales se realizó mediante un kit de extracción basado

en membranas de sílice y adaptado a muestras no invasivas (DNA Stool Mini Kit, QIAGEN). La

extracción de muestras de tejido se ha realizado mediante un kit específico para material de tejido

(DNA Tissue Kit, QIAGEN). En ambos casos se ha utilizado el protocolo especificado por la casa

comercial suministradora.

2.3. Diferenciación genética del género Martes mediante el análisis genético de excrementos (PCR-RFLP)

La especie del género Martes a la que pertenece cada muestra de excrementos, se identificó

mediante la técnica de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length

Polymorphism) (Ruiz-Gonzalez et al. 2008). Esta técnica se basa en el amplificado de un

fragmento corto de 276 pares de bases de ADN mitocondrial y su posterior digestión con enzimas

de restricción. Los patrones de digestión obtenidos para cada especie son claramente

diferenciables lo que permitió identificar de forma inequívoca a qué especie del género Martes (M.

Martes o M. foina) pertenece cada muestra (Figura 2).

13

Figura 2 Esquema representativo de la metodología de identificación de especies mediante el método de PCR-RFLP.

2.4. Análisis mediante marcadores microsatélites

2.4.1. Diseño y optimización de un protocolo multiplex para el genotipado de muestras no-invasivas

Debido a la ausencia de marcadores microsatélites específicos de la especie Martes martes, la

fase inicial del trabajo de laboratorio se dirigió a la búsqueda y optimización de marcadores

microsatélites que: 1) pudiesen amplificar y resultaran polimórficos en las poblaciones de marta

del ámbito de estudio y 2) fuesen fácilmente amplificables en muestras fecales.

14

Para ello y en primer lugar, se seleccionaron un total de 42 marcadores microsatélites diseñados

para otras especies de mustélidos y se determinó su poder de amplificación y polimorfismo en la

marta. Los 42 microsatélites fueron originalmente diseñados para la marta americana (Martes

americana): Ma1, Ma2, Ma3, Ma4, Ma5, Ma8, Ma9, Ma10, Ma11, Ma15,Ma18 y Ma19 (Davis &

Strobeck 1998); el glotón (Gulo gulo): Gg7,Gg14 (Davis & Strobeck 1998) y Gg454;(Walker et al.

2001); el tejón (Meles meles): Mel1, Mel6 (Bijlsma et al. 2000) y Mel10, (Domingo-Roura 2002), el

visón Europeo (Mustela lutreola): MLUT27 y MLUT04 (Cabria et al. 2007); el visón americano

(Mustela vison): Mvis020, Mvis022, Mvis072, Mvis075 (Fleming et al. 1999), Mvi39 y Mvi57

(O´Connell et al. 1996); el armiño (Mustela erminea): Mer 22, Mer 41 y Mer 95 (Fleming et al.

1999); la nutria (Lutra lutra): Lut 604, Lut 615 (Dallas & Piertney 1998) y la marta pescadora

(Martes pennanti): MP0059, MP0084, MP0100, MP0144, MP0175, MP0188, MP0200, MP0234,

MP0247, y MP0288 (Jordan et al. 2007).

Inicialmente, los 42 marcadores se ensayaron sobre un total de 15 muestras de tejido

pertenecientes a ejemplares distribuidos por todo el ámbito de estudio, con el fin de detectar la

presencia de polimorfismo para los diferentes marcadores. Tras este primer ensayo, se

seleccionaron 20 marcadores microsatélites polimórficos que se testaron sobre muestras fecales,

debido a que muchos marcadores óptimos para trabajar sobre muestras de tejido o pelo, no

ofrecen buen resultado en la amplificación cuando se trabaja con muestras de ADN obtenidas a

partir de heces. Tras esta última prueba, se seleccionaron un total de 15 microsatélites, con los

que se ha diseñado un protocolo de PCRs-Multiplex que permite la amplificación simultánea de

varios loci en una misma reacción de amplificación (PCR) (ver apartado 3.3.1). Ello nos permite

analizar un elevado número de marcadores en el menor número de reacciones posibles.

Las pruebas para la optimización de esta batería de marcadores se han realizado inicialmente

sobre un total de 30 muestras procedentes de diferentes regiones (10 Península Ibérica, 15 País

Vasco y Navarra y 5 del resto de Europa), con el fin de abarcar el máximo polimorfismo posible y

evitar de esta manera el solapamiento de los alelos de microsatélites en una misma PCR.

2.4.2 Probabilidad de identidad de los individuos

Para identificar de forma fiable diferentes individuos, es preciso analizar con marcadores

microsatélite un número suficiente de loci polimórficos para que la probabilidad de de identidad

(PID), que se refiere a la probabilidad de que dos individuos compartan el mismo perfil genético,

sea muy baja [p.e. PID < 0.01; (Taberlet & Luikart 1999; Mills et al. 2000)]. Así mismo, el empleo

de un número elevado de marcadores permite realizar análisis más robustos de la estructura

genética de las poblaciones y valorar la evolución de la diversidad genética en el seno de las

mismas.

Por tanto, como paso previo al desarrollo de cualquier estudio que tenga como objetivo la

identificación de individuos, a partir de muestras no invasivas, es necesario calcular la

probabilidad de identidad de la batería de marcadores microsatélites seleccionada. Esta validación

se ha realizado sobre un total de 36 muestras de tejido del área de estudio, y por tanto de

identidad individual conocida. La PID ha sido calculada mediante el software GIMLET v1.3.

(Valiere 2002).

15

2.4.3 Amplificado de microsatélites y genotipado de los individuos

Una vez diseñada una batería de 15 microsatélites eficiente para la identificación individual a partir

de muestras de excrementos, se llevó a cabo el genotipado de la totalidad de muestras

identificadas como marta (muestras fecales y de tejido).

Las amplificaciones por PCR fueron realizadas en un volumen total de 10 µl conteniendo 2µl del

extracto de ADN, 1x Multiplex Kit MasterMix (Qiagen), y 160 nM de cada primer. La activación

inicial de la polimerasa (HotStart PCR) fue realizada a 95°C durante 15 min, seguido por 42 ciclos

(35 en el caso de las muestras de tejido) de desnaturalización a 94º durante 30s, una fase de

anillamiento a 56ºC durante 120s y de elongación a 72°C durante 30s, y una extensión final a

72°C durante 45 min. Además de los controles negati vos de la extracción, se incluyeron controles

negativos de la PCR para monitorizar posibles contaminaciones en ambos procesos (Pompanon

et al. 2005). Adicionalmente se amplificó una muestra de referencia a modo de control positivo que

permite verificar la consistencia de la movilidad electroforética de los fragmentos entre los

diferentes “runs” (Davison & Chiba 2003).

Debido a la baja cantidad y calidad de los extractos de ADN obtenidos a partir de muestras no

invasivas, a menudo aparecen errores de genotipado. Los dos errores más frecuentes son la no-

amplificación de uno de los dos alelos (Allelic Dropout, ADO) y la generación de falsos alelos

(False Alleles, FA) debido a errores de la enzima ADN-polimerasa durante la replicación

(Pompanon et al. 2005).

Los errores de genotipado pueden ser detectados y corregidos adoptando un protocolo de

repeticiones de las amplificaciones de cada marcador para todas las muestras (‘multiple-tube

approach’: (Navidi et al. 1992; Taberlet et al. 1996). Sin embargo, el seguir un protocolo de

repeticiones incrementa sensiblemente el coste en tiempo y dinero para obtener el genotipo de

cada muestra (Goossens et al. 1998). De este modo, para cada una de las muestras de origen

fecal, se realizaron 4 réplicas de análisis para cada una de las multiplex, de manera que el número

de genotipos obtenidos para cada una de las muestras de excrementos fue de 60 en lugar de 15,

lo que disminuye la posibilidad de error en el genotipado cuando se trabaja con este tipo de

muestras. En el caso de las muestras de tejido se realizó una única réplica por muestra para cada

una de las multiplex, a excepción de aquellas que presentaban alguna duda en el genotipado.

La calidad de de cada una de las muestras fue evaluada en primer lugar mediante la amplificación

por PCR de cuatro réplicas de cuatro loci agrupados en la mutliplex 1 (MP0188, MP0059, Gg-7 y

Ma1). Únicamente aquellas muestras que mostraban un número de PCRs positivas >50% fueron

amplificadas para el resto de los 11 loci mediante 4 réplicas. Aquellas muestras para las que no se

obtuvo un genotipo fiable tras las 4 réplicas para el total de marcadores fueron descartadas de los

análisis. Los productos de las PCRs en mutliplex fueron analizados en un secuenciador capilar

automático ABI 3130XL (Applied Biosystems), con el estándar de tamaños GS500 LIZ™ (Applied

Biosystems). Los resultados fueron analizados con el programa ABI software Genemapper 4.0.

16

Genotipos consenso y errores de genotipado

El genotipo consenso a partir de las 4 réplicas fue determinado mediante el software Gimlet 1.3.4

(Valière 2002), aceptando los heterocigotos siempre que los dos alelos hayan sido observados al

menos en dos réplicas y los homocigotos si un alelo único ha sido observado al menos en tres

réplicas. El mismo software ha sido utilizado para estimar las tasas de éxito de PCR así como los

errores de genotipado: la no-amplificación de uno de los dos alelos (Allelic Dropout, ADO Taberlet

et al. 1996) y la generación de falsos alelos (False Alleles, FA (Gagneux et al. 1997).

2.5. Diversidad genética y estructuración poblacional

2.5.1 Diversidad genética/ estadísticos descriptivos de diversidad genética

La variabilidad genética se estimó mediante diferentes estadísticos descriptivos: número medio de

alelos por locus (A), heterocigosis media observada (Ho) y heterocigosis media esperada (He). Así

mismo mediante el software GENEPOP 3.4 (Rousset 2008) se llevó a cabo el análisis de equilibrio

de Hardy-Weinberg. Todos estos análisis se realizaron para el conjunto de muestras analizadas

así como para cada uno de los grupos infeidos mediante los métodos bayesianos (ver abajo).

De forma complementaria, se calculó el grado de diferenciación genética entre las

poblaciones/grupos inferidos a parir de los dos modelos bayesianos (ver apartado 2.5.2). Para ello

se calcularon los valores de Fst (o índice de fijación), que determina la diferenciación genética

entre pares de poblaciones. Valores significativamente diferentes de 0 indican escaso flujo génico

que disminuye conforme se acerca a 1. Por otro lado, se ha calculado el parámetro Fis, que

determina el grado de endogamia de la población. Valores positivos indican déficit de

heterocigotos y valores negativos un exceso.

El flujo génico (Nm) bi-direcional entre los pares de grupos identificados, se calculó mediante el

software MIGRATE 3 (Beerli & Felsenstein 2001; Beerli 2006). Este software estima el número de

migrantes intercambiados entre pares de poblaciones por generación basándose en la teoría de

coalescencia. Siguiendo las recomendaciones de Beerli & Felsenstein (2001), se realizó un

análisis inicial, empleando los valores de Fst, para determinar los parámetros más adecuados

para realizar el análisis final.

2.5.2. Análisis de estructuración poblacional: Identificación de poblaciones mediante análisis de agrupación bayesiana

Se utilizaron dos métodos de agrupación Bayesiana para inferir la estructuración poblacional de la

marta a nivel de la CAPV y la CF de Navarra de forma conjunta. Mediante estos métodos

podemos asignar los individuos (probabilísticamente) a diferentes grupos sin necesidad de

conocer a priori las unidades y/o límites poblacionales. Los dos modelos utilizados han sido

implementados en los softwares STRUCTURE 2.1(Pritchard et al. 2000; Falush et al. 2003) y

GENELAND 3.2.2 (Guillot et al. 2005a; Guillot et al. 2005b; Guillot 2008; Guillot et al. 2008)

GENELAND es similar a STRUCTURE, pero incorpora la información espacial de los individuos en

los análisis. STRUCTURE es actualmente el modelo más ampliamente utilizado para determinar la

estructuración poblacional a partir del genotipo de individuos para los que se desconocen sus

17

afinidades poblacionales, y por tanto es un modelo estándar con el que poder comparar los

resultados obtenidos mediante GENELAND.

2.5.2.1 Análisis mediante GENELAND

En primer lugar, analizamos la estructuración genética mediante el uso del software GENELAND

versión 3.2.2 (Guillot et al. 2005a; Guillot et al. 2005b; Guillot 2008; Guillot et al. 2008) extensión

de programa R 2.11.1 (Ihaka& Gentleman 1996). GENELAND implementa un algoritmo de

agrupación bayesiana similar a STRUCTURE y utiliza un método de re-muestreo mediante

simulación de cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC) para estimar parámetros desconocidos

incluyendo el número de grupos poblacionales. GENELAND incorpora además los datos

espaciales (coordenadas geo-referenciadas) para cada individuo (Guillot et al. 2005a; Guillot et al.

2005b). Este modelo asume que las poblaciones se encuentran espacialmente organizadas como

un conjunto de polígonos que no se superponen.

El número de poblaciones (K) fue determinado mediante la implementación de 50 procesos de

iteraciones de MCMC, permitiendo que el valor de K varíe en cada uno de ellos, con los siguientes

parámetros :500.000 iteraciones MCMC, la tasa máxima del proceso de Poisson fijado a 100, la

incertidumbre asociada a las coordenadas espaciales fijas en 2 kilómetros, la K mínima = 1, la K

máxima = 10, el número máximo de núcleos en el teselado de Poisson-Voronoi fijado a 300, y un

“bur-in” de 100.000 en el post-procesamiento. La incertidumbre asociada con las coordenadas

espaciales fue asignada a 2 km debido a que el área de campeo mínima descrita en la literatura

para machos de marta es de 200ha (Zalewski & Jedrzejewski 2006)..

Se utilizó el modelo de frecuencias correlacionadas (Guillot 2008), ya que este modelo resulta ser

más efectivo en la detección de diferencias poblaciones más sutiles. Cada análisis proporciona

(en un paso solo) una estimación de K y un mapa de las poblaciones estimadas. Calculamos la

media logarítmica de la probabilidad posterior para cada uno de los 50 análisis y seleccionamos

los 3 con los valores más altos. Estos 3 análisis fueron posteriormente sometidos a un post-

procesamiento (con un burn-in, o supresión, de las primeras 100.000 iteraciones) para obtener las

probabilidades posteriores de pertenencia a cada grupo para cada uno de los individuos y para

cada píxel del dominio espacial. Finalmente comprobamos visualmente la consistencia de los

resultados a través de los 3 análisis seleccionados.

2.5.2.2 Análisis mediante STRUCTURE

El programa STRUCTURE versión 2.2 (Pritchard et al. 2000) fue utilizado así mismo para analizar

la estructura genética de la marta. Utilizamos un modelo de mezcla (admixture), que permite que

los individuos tengan múltiples orígenes poblacionales (calculando su proporción de pertenencia a

cada grupo), con un modelo de frecuencias correlacionadas (Falush et al. 2003). El rango de

posibles grupos (K) analizados fue de entre 1 a 8, llevando a cabo análisis independientes para

verificar la consistencia de los resultados entre los diferentes análisis para cada estimación de K.

La longitud de las iteraciones de MCMCs y el proceso de “bur-in” se fijó en 1.000.000 y 100.000

respectivamente. El valor óptimo de K se seleccionó a partir del valor máximo del logaritmo de la

18

probabilidad posterior de los datos [Ln Pr(X/K)] para un valor de K determinado. El valor más bajo

de K que mejor explica la estructura poblacional se tomó como la solución más idónea (Pritchard

et al. 2000). Después de asignar las muestras al grupo para el que representaban un mayor

porcentaje de pertenencia (q), realizando la media de q para los diez análisis, la asignación de

individuos mediante STRUCTURE fue representada en el conjunto del área de estudio para

verificar la congruencia de los grupos poblacionales inferidos y para realizar una comparativa con

los resultados obtenidos mediante GENELAND.

2.6. Análisis de correlación entre distancias genéticas y modelado SIG de la conectividad del paisaje

En este apartado, investigamos el efecto de la configuración del territorio sobre la dispersión de la

marta, utilizando como referencia un modelo simple de aislamiento por distancia (IBD) (Wright

1943).

En primer lugar, se calcularon las distancias genéticas inter-individuales, como indicador del flujo

génico existente entre las diferentes zonas del territorio. En segundo lugar, se calcularon las

distancias funcionales entre individuos mediante modelos de conectividad del paisaje basados en

superficies de resistencia, que simulan la fricción que opone cada zona del territorio al

desplazamiento de la especie. El valor de cada celda representa la resistencia que opone el

territorio para atravesarla. Por último, se calcularon las distancias euclidianas o geográficas entre

los individuos. El impacto de la configuración del territorio sobre las distancias genéticas fue

entonces analizado comparando las matrices de distancias genéticas, geográficas y funcionales

entre pares de individuos.

2.6.1. Cálculo de distancias genéticas

De acuerdo a las frecuencias alélicas obtenidas para los marcadores microsatélites, se determinó

la distancia genética entre los distintos pares de individuos de marta. La distancia genética ar

(Rousset 2000) entre pares de individuos (un mayor valor de ar significa una mayor diferenciación

entre individuos) es un parámetro útil para inferir el efecto del paisaje en la estructuración genética

y ha sido previamente utilizado con éxito en otros mamíferos(Coulon et al. 2004; Broquet et al.

2006). La distancia genética ar fue calculada mediante el programa SPAGEDi (Hardy & Vekemans

2002).

2.6.2. Análisis de conectividad del paisaje mediante modelado SIG

2.6.2.1. Modelos de conectividad

Para el análisis de la conectividad del territorio entre individuos de marta, se utilizaron diferentes

modelos de conectividad territorial. Cada modelo de conectividad parte de dos capas de

información:

- un mapa de puntos de origen, en este caso correspondiente a la localización geográfica

de los diferentes individuos de marta identificados.

19

- un mapa o superficie de resistencia de los usos del suelo al desplazamiento de la especie,

que define cada uno de los modelos de conectividad utilizados.

Modelo de conectividad de la red de corredores ecológicos de la CAPV

Los valores de resistencia correspondieron a los que se utilizaron para el diseño de la RCE de la

CAPV, los cuales se asignaron en 2005 mediante revisión bibliográfica y consulta a expertos,

dentro de rango de valores de 1 a 1000 (Tabla 1 y Figura 3) (Gurrutxaga et al. 2010)). El diseño de

este modelo de conectividad se basó únicamente en la fricción estimada para los usos del suelo

(sin considerar otras variables, como las topográficas y/o climáticas), debido a que se concibió en

el marco de un trabajo dirigido a la planificación de los usos del suelo en términos de conectividad

ecológica.

Se actualizó la cartografía temática de base empleada para la elaboración del mapa de

resistencias de 2005, de forma que se utilizó el tercer inventario forestal nacional (Ministerio de

Medio Ambiente, 1997-2006) y la red de carreteras de la base cartográfica numérica BCN200

(IGN, 2008).

A aquellos sectores de autopistas y autovías que discurren en túnel o en viaducto, se les asignó la

resistencia correspondiente al uso del suelo presente en los mismos.

Complementariamente, como superficie de resistencia testigo se utilizó la siguiente variante

respecto del anterior, con objeto de comprobar el efecto de la eliminación del efecto barrera

producido por las carreteras, el suelo urbano, canteras y embalses (Tabla 2). Se seleccionó el

valor de 50 para la resistencia de estos elementos porque está dentro de los valores de fricción

que presenta la matriz territorial dominante (por ejemplo los cultivos agrícolas presentan una

resistencia de 60).

Tabla 1. Valores de fricción del modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV.

Uso del suelo Resistencia Bosques 1 Matorral 5 Plantaciones forestales 10 Mosaicos agroforestales 20 Prados y pastizales 30 Roquedos 40 Cultivos 60 Humedales y balsas 100 Carreteras nacionales 200 Autopistas/autovías, urbano, embalses y canteras

1000

20

Figura 3. Superficie de resistencia del modelo de conectividad de la RCE de la CAPV.

Tabla 2. Valores de fricción de la variante del modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV que suprime el efecto barrera de las carreteras y el suelo urbano.

Uso del suelo Resistencia

Bosques 1 Plantaciones 5 Matorrales 10

Mosaicos agroforestales 20 Prados y pastizales 30

Roquedos 40 Cultivos 60

Humedales y balsas 100 Carreteras nacionales 50

Autopistas/autovías, urbano, embalses y canteras

50

Modelos de conectividad binarios: gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales

Por otro lado, con objeto de determinar los usos del suelo que pueden dar soporte a los

movimientos dispersivos de la marta, se utilizaron diferentes modelos de conectividad basados en

mapas de resistencia binarios. Éstos se calculan a partir de dos valores de fricción, uno para los

sectores favorables a la dispersión y otro para los sectores hostiles (superficies de resistencia

binarias). La asignación de los valores de fricción en cada modelo se basó en la consideración de

los siguientes usos del suelo como medios dispersivos favorables para la especie, de forma que

se abarcó un gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales (desde lo

estrictamente forestal hasta la inclusión de espacios abiertos) (Tabla 3):

A. Bosques autóctonos

B. Zonas forestales (bosques y plantaciones)

21

o B incluyendo ríos (Br)

C. Zonas forestales y matorrales

D. Zonas forestales, matorrales y mosaicos agroforestales

o D incluyendo ríos (Dr)

o D considerando el efecto barrera de las carreteras, el suelo urbano, las canteras y

los embalses (Dc)

E. Zonas forestales, matorrales, mosaicos agroforestales y prados y pastizales

o E incluyendo ríos (Er)

o E considerando el efecto barrera de las carreteras, el suelo urbano, las canteras y

los embalses (Ec)

F. Zonas forestales, matorrales, mosaicos agroforestales, prados y pastizales y roquedos

G. Zonas forestales, matorrales, mosaicos agroforestales, prados y pastizales, roquedos y

cultivos

Debido al desconocimiento sobre la resistencia efectiva de los diferentes uso del suelo asociadas

a los movimientos dispersivos de la marta, se adoptó la metodología de Broquet et al. (2006) para

la asignacion de valores de fricción. Así, a los hábitats de dispersión preferencial se les asignó un

valor de 1, mientras que a las celdas de hábitat no favorable para la dispersión se les asignó un

valor de 50 (Tabla 3, Figura 4).

22

Tabla 3. Valores de fricción correspondientes a los modelos de conectividad binarios, en gradiente de mayor a menor querencia por ambiente forestales.

Usos del suelo A B Br C D Dr Dc E Er Ec F G

Bosques 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Plantaciones forestales 50 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Matorrales 50 50 50 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Mosaicos agroforestales 50 50 50 50 1 1 1 1 1 1 1 1

Prados y pastizales 50 50 50 50 50 50 50 1 1 1 1 1 Roquedos 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1 1 Cultivos 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1

Resto del territorio 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Ríos - - 1 - - 1 - - 1 - - -

Carreteras nacionales - - - - - - 200 - - 200 - Autopistas, urbano,

canteras y embalses - - - - - - 1000 - - 1000 - -

Los valores de resistencias de los modelos de conectividad A, B, C, D, E, Ec, F y G se

representan en la Figura 4.

Figura 4. Mapas de resistencias binarios, en gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales (A-G). En color verde se representa la resistencia de valor 1 y en naranja la resistencia de valor 50.

23

2.6.2.2. Cálculo de distancias de mínimo coste y distancias euclidianas

Para cada uno de los diferentes modelos de conectividad considerados, se calcularon las

distancias de mínimo coste (least-cost distance, LCD), o distancias funcionales, entre todos los

pares de individuos mediante PATHMATRIX (Ray 2005). Las distancias euclidianas, o

geográficas, se calcularon también con PATHMATRIX. La distancia de mínimo coste se refiere al

valor de coste-distancia, o resistencia acumulada, que abarca la ruta de mínimo coste (least cost

path, LCP) entre cada par de individuos. La LCP discurre por aquellas partes de la matriz del

paisaje por donde la resistencia acumulada resulta ser mínima entre dos puntos. Por tanto, el

valor de LCD es un indicador del grado de permeabilidad que presenta el territorio al

desplazamiento de la especie entre dos localizaciones. En cambio, la distancia euclidiana o

geográfica se refiere a la distancia en línea recta entre cada par de individuos (Veáse en las

Figuras 5 y 6 un ejemplo explicativo de las diferencias entre distancia de mínimo coste y distancia

euclidiana).

Figura 5 . Rutas de mínimo coste (least cost paths, LCP) obtenidas según el modelo de

conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV. Las LCP discurren por aquellos píxeles que

oponen menor resistencia acumulada al desplazamiento de la especie entre cada par de puntos.

24

Figura 6. Ejemplo del cálculo de la distancia euclidiana y la distancia de mínimo coste (least cost distance, LCD) entre dos individuos. La distancia euclidiana corresponde a la longitud de la línea recta. La LCD corresponde al coste acumulado a lo largo de la ruta de mínimo coste (LCP) entre dos puntos. La LCD se calcula sumando la resistencia que posee cada píxel que atraviesa multiplicada por la longitud de píxel atravesada. En este caso, la presencia del pantano de Legutiano entre los dos puntos hace que la ruta de mínimo coste lo bordee por el norte.

2.6.3. Análisis de correlación entre distancias genéticas, euclidianas y de mínimo coste

El efecto de la estructura paisajística sobre el flujo génico de la marta fue evaluado calculando la

correlación entre las matrices de distancias genéticas inter-individuales y de distancias euclidianas

entre pares de individuos, por un lado, y entre las matrices de distancias genéticas inter-

individuales y de distancias de mínimo coste (LCD) entre pares de individuos, por otro.

Una mejor correlación utilizando la distancia de mínimo coste, indicaría que los procesos

dispersivos están asociados a la configuración del territorio (y no exclusivamente a la distancia

geográfica). Ello probaría que el flujo génico dentro de las poblaciones de marta está influenciado

por la conectividad que presenta el territorio en ambientes fragmentados.

La correlación entre las matrices de distancias fue calculada mediante el test de Mantel.

implementado en el software Xlstat (Addinsoft, New York, USA) utilizando las distancias genéticas

(ar) y el logaritmo de las distancias euclidiana y LCD, tal y como viene recomendado por Rousset

(1997) para tests desarrollados en especies que utilizan un paisaje de dos dimensiones. Los

valores de significancia (P) fueron calculados utilizando un proceso de permutación (10 000

permutaciones).

25

3.RESULTADOS

3.1. Recolección de muestras

Se tomaron muestras de un total de 977 excrementos para el conjunto del área de estudio, de los

cuales se descartaron un total de 179. Las muestras se descartaron por 1) tratarse de muestras

presumiblemente del mismo ejemplar (separadas por una distancia <1km), 2) por su pertenencia

dudosa al género Martes sp., o 3) por tratarse de excrementos no suficientemente frescos, y por

tanto no aptos para los posteriores análisis genéticos. Así, se obtuvieron un total de 798 muestras

(592 CAPV+ZL y 206 =NA de la CF de Navarra).

Además de las muestras de excrementos se obtuvieron un total de 74 muestras de tejido y/o pelo

(59=CAPV+ZL y 15=NA de la CF de Navarra) pertenecientes a diferentes ejemplares de marta.

Figura 7. Representación geográfica de la totalidad de muestras recolectadas (n=798) en el

presente estudio.

3.2. Diferenciación genética del género Martes mediante el análisis genético de excrementos (PCR-RFLP)

De las 798 (592=CAPV+ZL y 206=NA) muestras analizadas, 670 muestras (494=CAPV+ZL y

176=NA) aportaron amplificado positivo para el género Martes, lo que supone un éxito de

identificación del 84%. El 16% restante, no ha ofrecido un amplificado positivo, lo que puede

deberse a que los excrementos presentaban ADN muy degradado, no útil para su amplificado por

PCR, o a que se trataba de excrementos de otras especies de carnívoros, que en ocasiones

pueden ser fácilmente confundidos con los excrementos del género Martes (Davison et al. 2002).

Como resultado de la aplicación de la técnica de PCR-RFLP sobre los excrementos, se han

identificado 347 (262=CAPV+ZL y 85=NA) muestras de marta y 323 (232=CAPV+ZL y 91=NA) de

garduña. Se han identificado, así mismo, 74 (57=CAPV+ZL y 15=NA) muestras de tejido de M.

martes y 109 (99=CAPV+ZL y10=NA) de M. foina, sumando un total de 421 registros de marta y

432 registros de garduña. La localización geográfica de las muestras de la CAPV y zonas

limítrofes queda recogida en la Figura 8.

26

Figura 8. Localización geográfica de las muestras del género Martes identificadas mediante PCR-RFLP en el ámbito de la CAPV y zonas limítrofes.

Estos resultados han dado lugar a la identificación en el ámbito de la CAPV y zonas limítrofes de

13 nuevas cuadrículas UTM 10x10km donde previamente no se encontraba citada la marta, y de

11 cuadrículas en el caso de la garduña. Por otro lado, se ha confirmado la presencia de las

especies en 33 y 70 cuadrículas UTM 10x10 km, respectivamente, donde ya habían sido citadas

con anterioridad en el Atlas de la SECEM (López-Martín 2007), tal y como queda representado en

las Figuras 9 y 10.

27

Figura 9. Distribución de la marta (Martes martes) en cuadrículas UTM 10x10km.

Figura 10. Distribución de la garduña (Martes foina) en cuadrículas UTM 10x10km.

28

Es preciso destacar que dentro de la CAPV la mayor parte de las muestras de marta se

encontraron dentro del marco geográfico de la RCE de la CAPV (Figura 11). Concretamente, de

las 306 muestras de marta recolectadas en la CAPV, 125 (41%) se encontraron en espacios-

núcleo, 83 (27%) en enlaces y 81 (26,5%) en zonas de amortiguación. Las 17 muestras restantes

(5,5%) se encontraron en el resto de territorio de la CAPV.

Figura 11. Localización de muestras de marta respecto a la Red de Corredores Ecológicos (RCE) de la CAPV.

3.3. Análisis mediante marcadores microsatélite

3.3.1. Diseño y optimización de un protocolo multiplex para el genotipado de muestras no-invasivas

Se han diseñado y puesto a punto 4 PCRs multiplex para un total de 15 microsatélites con las que

posteriormente se han analizado el total de las muestras de marta identificadas en este estudio.

La batería de marcadores seleccionados, a partir de la totalidad de 42 microsatélites analizados,

se recoge en la Tabla 4. La utilización de diferentes fluorocromos (6-FAM, NED, PET, VIC) han

permitido la electroforesis en multiplex del amplificado de los diferentes microsatélites (ver Figura

12 donde se recoge un ejemplo de genotipado mediante la mutliplex 1).

29

Figura 12. Ejemplo de electroferograma obtenido en este estudio a partir de la PCR multiplex M1, donde se observan los diferentes tamaños de alelos obtenidos para cada marcador microsatélite con un color de fluorocromo diferente.

3.3.2 Probabilidad de identidad de los individuos

La probabilidad de identidad fue calculada en función de las frecuencias alélicas estimadas a partir

de 36 muestras de tejido de marta pertenecientes a individuos diferentes. La probabilidad de

identidad total fue de 5,42x10-11 y la probabilidad de identificación para hermanos de 4,47x10-5.

Esto significa que tan solo 4,47 martas de cada 100.000 hermanos se espera que por azar tengan

un mismo genotipo. Por tanto, la PID-sibs se encuentra muy por debajo del umbral de 0.01

necesario para prevenir el efecto sombra (la presencia de dos o más individuos con el mismo

genotipo multilocus (Mills et al. 2000), y que por tanto los genotipos idénticos identificados en el

presente estudio corresponden a recapturas del mismo ejemplar. De hecho, mediante la utilización

de los 6 microsatélites más polimórficos sería suficiente para alcanzar dicho umbral.

30

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,10

Mer

41

Mvi7

2Gg7 M

a2M

el1

Mlut

27

Mp0

059

Mel1

0M

a19

Lut43

5M

a1

Mp0

188

Mvi5

7

Lut45

3

Lut61

5

PID-unbias

PID-sibs

Figura 13. Probabilidad de identidad (PID-unbias) y Probabilidades de identidad de hermanos (PID-sib) calculadas a partir del genotipo de 35 muestras de marta obtenido mediante 15 marcadores microsatélites. El valor de 0,01 representa el valor a partir del cuál existe un número suficiente de loci para distinguir entre diferentes individuos con una fiabilidad mayor del 99%.

3.3.3 Amplificado de microsatélites y genotipado de los individuos

De las 347 muestras de excrementos identificadas como marta, 120 (correspondientes a los

muestreos durante el período comprendido entre 2004 y 2005) no han sido incluidas para la

caracterización genética mediante microsatélites debido a que no ofrecían suficiente ADN para

asegurar un correcto genotipado. Por tanto en esta fase se han analizado 227 muestras de

excrementos (154=CAPV+ZL y 73=NA) y 74 muestras de tejido (59=CAPv+ZL y 15=NA) (pelos y

músculo) completando un total de 301 muestras.

El primer control de calidad no fue superado por 103 muestras de excrementos (45,4%) que

fueron descartadas de los subsiguientes análisis. Las restantes, 124 muestras (54,6%) fueron

amplificadas mediante 4 réplicas para los 11 loci restantes. Tras el genotipado multi-tubo 41 de

estas muestras (33,06%) fueron finalmente descartadas debido a que mostraban una baja tasa de

amplificado o una elevada tasa de error. Por tanto, se obtuvo un genotipo multilocus para un total

de 83 muestras (66,93% de las muestras que pasaban el screening y el 33,56%del total de

muestras analizadas). Para estas muestras el porcentaje de PCRs positivas fue del 90% (Tabla 4)

variando para cada loci entre el 77 y el 98% y entre muestras entre el 63%y el 100%. El valor

medio de ADO fue 0,202 con valores entre 0,092 y 0,375 siendo variables entre las diferentes

multiplex. La tasa de FA media fue de 0,014 con valores entre 0 y 0,072.

Tras el proceso de reagrupamiento identificamos un total de 68 genotipos individuales. Las 74

muestras de tejido fueron correctamente genotipadas para los 15 loci y resultaron ser individuos

únicos. En total se han identificado 157 genotipos que corresponden a 142 individuos diferentes

(98=CAPV+ZL y 45=NA). El número de veces que cada individuo ha sido detectado durante el

estudio varió entre 1 y 3 veces con un total de 15 ejemplares remuestreados.

31

Del total de muestras de excrementos analizadas, el 10,95% no pudieron ser identificadas

mediante el método de PCR-RFLP, el 48,99% fueron identificadas como garduñas; el 20,17% no

pasaron el primer control de calidad; 6,05% fueron descartadas debido a su baja tasa de

amplificado y/o a su elevada tasa de error tras su completo genotipado mediante los 15 loci; y por

tanto tan solo el 13,84% de las muestras fueron martas genotipados de forma correcta y completa.

Tabla 4 Marcadores microsatélite empleados en este estudio y su correspondiente agrupación en multiplex. Rango de cada marcador microsatélite (Rango); Numero de alelos por locus (A), Riqueza alélica (AR), heterocigosidad esperada (Hexp) y observada (Hobs), tasa de PCR positivas (PCR+), droupout (ADO) y falsos alelos (FA) para cada uno de los locus. MULTIPLEX ASIGNADA

MARCADOR FLUOROCROMO SELECCIONADO

Rango A AR Hexp Hobs PCR+ ADO FA

MULT_1 Gg-7 PET 164-172 5 4,259 0,6635 0,6071 0,96 0,143 0,000

Ma-1 NED 204-212 5 3,582 0,5349 0,4286 0,91 0,167 0,000

MP0059 VIC 140-150 6 3,513 0,6573 0,4714 0,98 0,092 0,072

MP0188 6-FAM 113-121 3 2,945 0,4236 0,3429 0,97 0,139 0,000

MULT_2 Lut-453 6-FAM 108-112 3 2,071 0,5034 0,5500 0,96 0,093 0,033

Mel-1 PET 265-275 5 4,533 0,6992 0,6643 0,87 0,174 0,009

Mel-10 NED 154-166 7 5,924 0,7831 0,6500 0,88 0,375 0,014

MULT_3 Lut-435 VIC 127-159 12 5,074 0,6508 0,3869 0,86 0,114 0,027

Ma-19 PET 200-212 5 3,441 0,5156 0,4714 0,85 0,192 0,000

Mvi-57 6-FAM 100-116 7 3,718 0,4995 0,4786 0,94 0,167 0,014

Mvi072 NED 260-276 8 4,918 0,7213 0,6403 0,77 0,183 0,023

MULT_4 Lut-615 6-FAM 111-115 3 2,201 0,5101 0,4964 0,89 0,269 0,014

Ma-2 NED 167-179 5 3,755 0,6532 0,6000 0,93 0,274 0,008

Mer41 VIC 148-160 7 5,479 0,8026 0,6857 0,87 0,316 0,000

Mlut-27 PET 198-204 4 3,139 0,6688 0,6449 0,91 0,333 0,000

Mean - - - 5,7333 3,903 0,6191 0,5412 0,90 0,202 0,014

3.4. Diversidad genética y estructuración poblacional

Para el conjunto de los 15 microsatélites analizados se ha obtenido una riqueza alélica (AR) de

3,903 y un número medio de alelos por locus (A) de 5,7333 variando en un rango de entre 3-12

alelos para cada locus. Los marcadores Lut-435, Mvi072, Mel-10, Mvi-57, Mer41 resultaron ser los

más polimórficos (Tabla 4). Los valores de heterocigosidad observada y esperada fueron de

0,5412 y 0,6191, respectivamente (Tabla 4).

Los dos métodos de agrupación Bayesiana sugieren la existencia de estructuración poblacional en

el conjunto del área de estudio. A pesar de que ambos métodos infieren un número diferente de

poblaciones (GENELAND, k=4 y STRUCTURE k=3), cada una de las dos soluciones por separado

y en conjunto demuestran un claro patrón espacial entre los diferentes grupos, no observándose

un solapamiento en la distribución para cada uno de ellos. Por tanto, las poblaciones de marta no

forman una única unidad reproductiva, demostrando una clara subdivisión espacial dentro del área

de estudio.

Mediante GENELAND se han obtenido 4 grupos poblacionales (Figuras 14 y 15):

32

• Grupo Navarro: abarca el norte de Navarra, la parte oriental de Guipuzcoa y el extremo

nororiental de Álava.

• Grupo Oriental : comprende las montañas de Elgea-Urkilla-Aizkorri, el Duranguesado y

las zonas intermedias entre ambas.

• Grupo Central : abarca el macizo de Gorbea y las sierras cercanas situadas al sur y al

oeste del mismo.

• Grupo Occidental : situado en las Encartaciones de Bizkaia y el extremo occidental de

Álava.

A pesar de que GENELAND infiere la existencia de 4 grupos poblacionales, existe una elevada

convergencia entre la asignación de individuos a cada uno de los grupos poblaciones mediante

ambas metodologías. STRUCTURE infiere prácticamente los mismos grupos (Navarro, Oriental y

Central) a excepción del grupo Occidental. De este modo, en el 86,42% de los casos (n=120)

ambas metodologías identifican los individuos pertenecientes al mismo grupo. En el caso de los

12 ejemplares (8,57%) identificados como un grupo distinto por el GENELAND (grupo Occidental),

estos se corresponden con ejemplares que en la asignación mediante STRUCTURE poseían un

elevado porcentaje de mezcla (q<0,7). Los 7 ejemplares restantes para los que ambos modelos

ofrecían una asignación poblacional diferente, correspondían a ejemplares que se encontraban en

la zona de contacto entre los diferentes grupos.

Figura 14. Mapa de asignación de los individuos a cada uno de los grupos poblacionales inferidos mediante Structure (K=3) y para cada píxel del territorio mediante Geneland (K=4). En el caso del Structure cada individuo está representado por un círculo con 3 colores que representan la proporción de pertenencia (q) a cada uno de los 3 grupos poblacionales (Grupos Navarro, Oriental y Central). En el caso del Geneland se representan el valor de asignación a cada uno de los 4 grupos inferidos para cada uno de los pixeles del área de estudio (Grupos Navarro, Oriental, Central y Oriental)

33

Figura 15. Mapas de probabilidad de pertenencia a cada grupo poblacional (de arriba abajo: grupo Navarro, Oriental, Central y Occidental) obtenidos mediante GENELAND.

El conjunto de la población no se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg (p<0,05) (Tabla 5).

Estos resultados corroboran la existencia de estructuración poblacional en el conjunto del área de

estudio, tal y como se ha identificado mediante los análisis bayesianos. Sin embargo, los

diferentes grupos poblacionales identificados se encuentran en equilibrio de HW, lo que justifica la

validez de los grupos inferidos. El número de ejemplares detectados para cada grupo oscila entre

12 y 47 con un número medio de 35 ejemplares por población. El número medio de alelos por

locus fue similar entre las diferentes poblaciones con una media para el conjunto de ellas de

5,733, siendo la población Navarra la que cuenta con un mayor número de alelos por locus

34

(5,1333) y la Central la que cuenta con un valor más bajo (3,7333). La heterocigosidad observada

(0,5412) fue menor que la heterocigosidad esperada (0,6191), para el conjunto de poblaciones,

así como para cada una de ellas por separado (Tabla 5). Los valores de Fis (que determina el

grado de endogamia de la población) resultaron ser positivos (lo que indicaría un indican déficit de

heterocigotos) pero estadísticamente no significativos.

Tabla 5 Diversidad genética obtenida para los cuatro grupos de marta identificados mediante GENELAND. Número de individuos (n), número medio de alelos por cada locus (A), Heterocigosidad observada (Ho), y heterocigosidad esperada (He), valores de significancia para el equilibrio de Hardy-Weinberg HW (significancia p<0,05) y valores de Fis (Intervalo de confianza al 95%). Los valores significativos se marcan mediante un asterisco *.

Grupo n A Ho He HW P (SE) FIS

Oriental 47 4.200 0.5292 0.5621 0.0891 (0.0056)

0.0692

Occidental 12 3.8677 0.5878 0.5699 0.3991 (0.0192)

0.01298

Central 38 3.7333 0.5191 0.5338 0.3976 (0.0098)

0.04092

Navarro 43 5.1333 0.5608 0.5845 0.0459 (0.0047)

0.05245

Total 140 5.7333 0.5412 0.6191 0.0003 * (0.0002)

0.05130

Los valores de Fst (Tabla 5), que determinan la diferenciación genética entre pares de

Poblaciones, oscilan entre 0,056 y 0,17. Todos resultaron ser positivos y estadísticamente

significativos lo que corrobora los resultados obtenidos mediante métodos bayesianos, y denota la

existencia de un escaso flujo génico entre ellas. La población Navarra resultó ser la más

diferenciada con los valores de Fst más elevados (Tabla 6).

Tabla 6 Valores de Fst entre pares de grupos identificados mediante GENELAND. Los valores de

Fst significativos (P < 0.05) se indican mediante un asterisco

Grupo Oriental Occidental Central Navarro Oriental - 0.05684* 0.07981* 0.11379* Occidental - - 0.07480* 0.07753* Central - - 0.17262*

Los resultados obtenidos mediante el programa MIGRATE corroboran así mismo, los resultados

obtenidos mediante los valores de Fst, detectando escaso flujo génico entre los grupos, con

valores entre 2,5-3,6 ejemplares por generación (Tabla 7). Existe escasa variación en las tasas de

flujo génico entre pares de poblaciones. Sin embargo, existe una mayor emigración desde el

grupo Oriental hacia los dos grupos adyacentes (Navarra y Central) que desde las zonas

adyacentes hacia el grupo Oriental. Esto parece indicar que esta población puede estar actuando

como población fuente (Tabla 7).

35

Tabla 7 Estimas de flujo génico (Nm) bi-direccional entre los grupos de marta inferidos mediante GENELAND y calculados mediante MIGRATE.

Migración desde Oriental1 Occidental2 Central3 Navarro4

Oriental - 2.51806 2.5973 2.86636 Occidental 2.84265 - 3.62889 2.85025 Central3 3.09339 2.52047 - 2.65878

Migración hacia

Navarro4 3.17622 2.51639 2.6798 -

3.4. Análisis de correlación entre distancias genéticas y modelado SIG de la conectividad del paisaje

Se obtuvo un coeficiente de correlación de Pearson (r) de 0.214 (p<0,0001) entre las distancias

genéticas y las distancias euclidianas entre pares de individuos de marta, dejando patente la

existencia de un patrón de aislamiento por distancia (Tabla 8).

Al utilizar el modelo de conectividad con el que se diseñó la RCE de la CAPV (Tabla 8 y Figura

16), se obtuvo una mejor correlación (r=0.256, p<0,0001) entre las distancias genéticas inter-

individuales y distancias de mínimo de coste, por lo que la parametrización de los costes utilizados

para el diseño de la RCE explica mejor la estructuración genética que el patrón simple de IBD.

Al emplear la variante del mapa de resistencias anterior, que suprime el efecto barrera de las

carreteras y el suelo urbano, la correlación entre distancias genéticas y funcionales disminuyó

(r=0.236) (p<0,0001) (Tabla 8 y Figura 16), si bien fue mayor a la existente entre distancias

genéticas y geográficas (IBD). Por tanto, el efecto barrera de las carreteras y el suelo urbano, tal y

como se parametrizó en el mapa de resistencias con que se diseñó la RCE de la CAPV, explica

mejor el flujo génico de la especie concernida.

Al utilizar los modelos de conectividad binarios, se observa que la correlación entre distancias

genéticas y funcionales aumentaba al incorporar determinados hábitats abiertos como medios

favorables a la dispersión (Tabla 8 y Figura 16). En cambio, la incorporación de los medios

fluviales como medios favorables a la dispersión empeora dicha correlación, tal y como se ha

obtenido en los modelos Br y Dr (Tabla 8). Al igual que ocurrió con el modelo de conectividad con

el que se diseñó la RCE de la CAPV, la consideración del efecto barrera de las carreteras y el

suelo urbano mejoró la correlación resultante, tal y como se ha obtenido en los modelos Dc y Ec

(Tabla 8 y Figura 16). La correlación más alta de los modelos binarios utilizados (r = 0.257) se

obtuvo al considerar como medios favorables a la dispersión las masas forestales y arbustivas, los

mosaicos agroforestales y los prados y pastizales, e integrando el efecto barrera de las carreteras

y el suelo urbano (Tabla 8 y Figura 16). La correlación no varió al incluir los roquedos, y empeoró

al incluir los espacios cultivados (Tabla 8 y Figura 16).

36

Tabla 8 y Figura 16. Coeficientes de correlación de Pearson (Mantel r) entre distancias de coste y distancias genéticas para los diferentes modelos de conectividad considerados: 1) Red de corredores ecológicos de la CAPV (RCE) y su correspondiente variante (RCEv) 2) modelos binarios en gradiente de mayor a menor querencia por ambientes forestales (modelos A-G). Se incluyen así mismo variantes de dichos modelos mediante la inclusión de ríos (Br, Dr y Er) y zonas humanizadas (Dc y Ec). El valor de correlación con la distancia euclidiana (IBD) se utiliza como valor de partida. En todos los casos la correlación resultó significativa (p<0,0001).

Modelo Asunción del modelo r Submodelos Asunción del modelo

r

IBD Aislamiento por distancia 0.214

A Preferencia por Bosques 0.216

B Preferencia por Bosques y plantaciones forestales

0.226 Br Con ríos 0.202

C Preferencia por Bosques, plantaciones forestales y matorrales

0.231

Dr Con ríos 0.213 D Preferencia por Bosques, plantaciones forestales, matorrales y mosaicos

agroforestales

0.234

Dc Con carreteras y espacios urbanos

0.252

Er Con ríos 0.225 E Preferencia por Bosques, plantaciones forestales, matorrales, mosaicos

agroforestales y prados-pastizales

0.242

Ec Con carreteras y espacios urbanos

0.257

F Preferencia por Bosques, plantaciones forestales, matorrales, mosaicos

agroforestales, prados-pastizales y roquedos

0.242

G Preferencia por Bosques, plantaciones forestales, matorrales, mosaicos

agroforestales, prados-pastizales, roquedos y cultivos

0.227

RCE Resistencias en gradiente de la RCE 0.256 RCEv Resistencias en gradiente de la RCE sin el efecto barrera de las carreteras y espacios urbanos

0.236

37

4. DISCUSIÓN

4.1. Distribución y relaciones de simpatría de las especies del género Martes

Los resultados de distribución de marta y garduña obtenidos han aportado valiosa información de

cara al análisis de las relaciones de simpatría y de los diferentes factores ambientales explicativos

del uso diferencial del hábitat en las especies del género Martes a diferentes escalas. Además,

tiene un valor añadido por tratarse de un borde meridional del área de distribución de la marta,

donde los factores climáticos podrían jugar un papel relevante en la regulación de las relaciones

de simpatría (Proulx et al. 2004).

La información obtenida permite delimitar de una forma más precisa y a una escala detallada la

distribución actual de ambas especies en la CAPV, en relación al último atlas de distribución

disponible donde se recogen las citas, de procedencia diversa, obtenidas a lo largo de las últimas

cuatro décadas (López-Martín 2007). Esta nueva información es de utilidad de cara a afrontar la

revisión del actual estatus de protección de la especie en el Catálogo Vasco de Especies

Amenazadas, actualmente catalogada como “Rara”. La presencia de marta se rarifica hasta

desaparecer en la zona septentrional y costera del área de estudio, donde la garduña muestra una

clara predominancia, tal y como queda reflejado en los diferentes mapas de distribución

presentados en este trabajo.

La ausencia de la marta de la franja sur de la CAPV limita la valoración de la RCE para este

ámbito. La rarefacción de la especie coincide con la zona de transición entre el clima atlántico y

mediterráneo, lo que podría indicar que los factores climáticos puedan estar influyendo en la

distribución, ya que este área supone el límite de distribución meridional de una especie

eurosiberiana (Proulx et al. 2004). Las cuadrículas localizadas en el sur de distribución (cuyo

origen son citas de los años 80 (López-Martín 2007), podrían no reflejar la distribución actual de la

especie, ya que en este estudio sólo se ha confirmado la presencia de la garduña. Una posible

interpretación de los datos aquí presentados se relacionaría con una rarefacción de la marta en

este sector meridional de su distribución en un pasado reciente, lo que habría permitido el

subsiguiente reemplazo por la garduña como consecuencia de su mayor plasticidad ecológica.

Este mismo proceso ha podido dar lugar a la presunta ausencia de la marta en el límite territorial

entre la CAPV y la CF de Navarra, donde la garduña ocupa actualmente hábitats potencialmente

óptimos para la marta.

Estos resultados van en consonancia con la hipótesis de Delibes (1983) que, si bien sugiere que

en ambientes fragmentados la garduña es desplazada hacia zonas más humanizadas, esta puede

ser menos sinantrópica cuando las densidades de la marta decrecen. Estudios recientes han

mostrado diferentes resultados acerca de las relaciones de simpatría a escala local (Pilot et al.

2007; Rosellini et al. 2008). Si bien la marta resulta la única especie presente en una zona forestal

bien conservada en los montes de Invernadeiro (Ourense, Galicia)(Rosellini et al. 2008), ambas

especies parecen explotar los mismos micro-hábitats en mosaicos agroforestales en la zona

38

central de Polonia (Pilot et al. 2007; Posluszny et al. 2007). La coexistencia de ambas especies

parece depender de una combinación de diferentes factores, tales como la abundancia relativa de

cada una de las especies dentro de la comunidad de carnívoros, las condiciones climáticas, la

disponibilidad de recursos tróficos, los procesos históricos de persecución, así como del grado de

fragmentación del hábitat (Ruiz-Gonzalez et al. 2008). Nuestros resultados parecen respaldar esta

hipótesis donde las relaciones bio-ecológicas son complejas y dependientes de diferentes factores

ambientales e históricos. Si bien la marta parece mostrar una relativa predominancia en ambientes

forestales sobre la garduña a nivel de la CAPV, ambas especies pueden ser sintópicas en zonas

más heterogéneas o bien la garduña predominar en ambientes forestales potencialmente óptimos

para la marta.

En los últimos 20 años, la combinación de diferentes factores, tales como la protección legal, la

regeneración de hábitats naturales y un aumento en la disponibilidad de presas, ha hecho que

numerosas especies hayan invertido sus tendencias demográficas, permitiendo la recolonización

de áreas de las que previamente habían desaparecido (p. ej. el caso de la nutria en España;

López-Martín & Jiménez-Pérez 2008), o bien la ocupación de nuevos hábitats. En este sentido, no

es totalmente descartable que la marta haya expandido su área de distribución hacia la zona nor-

occidental de la CAPV en los últimos años, ya que se ha detectado la presencia de la especie en

zonas donde no había información previa de su existencia. En Irlanda, por ejemplo, el aumento del

rango de distribución de la marta se ha asociado a una disminución de la persecución directa y a

un aumento de las tasas de cobertura forestal, que favorecen la conectividad (O’ Mahony et al.

2006). En el norte de Italia, la expansión de la marta hacia zonas donde predominan los mosaicos

agroforestales parece depender de una presión demográfica, induciendo que la especie se

disperse en dirección sur desde los pre-Alpes Italianos, así como de una mayor disponibilidad de

recursos tróficos en este tipo de hábitats (Ballestrieri et al. 2009). Una tendencia demográfica

positiva podría favorecer el aumento del rango de distribución (p. ej. en mustélidos: Blandford,

1987; López-Martín & Jiménez, 2009). Sin embargo, la información existente acerca del número y

la tendencia poblacional de la marta en la CAPV es insuficiente para validar esta hipótesis. Por

tanto, resulta necesario llevar a cabo estudios más exhaustivos que permitan conocer la densidad

poblacional y la tendencia poblacional a largo plazo.

4.2. Análisis mediante marcadores microsatélite: éxito y errores de genotipado

A partir de los 42 microsatélites analizados se ha desarrollado un protocolo multiplex compuesto

por 15 microsatélites que permite determinar la identidad individual (Pid-sibs=4,47x10-5) así como

la estructura poblacional de la marta, con la ventaja de su efectividad en material obtenido de

forma no invasiva.

Las tasas de éxito de genotipado en muestras fecales obtenidas mediante este panel (porcentaje

de muestras fecales que muestran un genotipo consenso para la totalidad de loci) fue del 35%.

Este resultado se encuentra dentro de la media, en comparación con otros trabajos abordados en

carnívoros, que varían entre el 14 y 66% (Nutria (Lutra lutra):14% Lanszki et al. 2008; 20% Dallas

et al. 2003; 21% Ferrando et al. 2008; 24% Kalz et al. 2006; 41% Prigioni et al. 2006; 44%

Arrendal et al. 2007; 48% Hung et al. 2004; 73% Janssens et al. 2008; 55-63% Hajkova et al.

39

2009). Tejón (Meles meles): 62% Frantz et al. 2003. Glotón (Gulo gulo): 54% Hedmark & Ellegren,

2007; 70% Flagstad et al. 2004. Coyote (Canis latrans): 28% Adams & Waits 2007. Lobo (Canis

lupus): 59% Lucchini et al. 2002; 79% Creel et al. 2003; 52,8% Marucco et al. 2009).

Otra de las cuestiones relevantes en los estudios moleculares no invasivos es la detección y

eliminación de los errores de genotipado, ya que su presencia puede influir en los resultados

obtenidos (Waits & Leberg 2000; Creel et al. 2003; Pompanon et al. 2005). La tasa de errores de

genotipado detectada en nuestro estudio (ADO = 17.8%, FA = 2.9%) fue similar a las tasas de

error detectadas en otros estudios no invasivos abordados en mamíferos (Broquet et al. 2004;

Hajkova et al. 2006; Valière et al. 2006).

4.3. Estructuración espacial y conectividad funcional de la marta

En este estudio hemos combinado técnicas moleculares no invasivas con análisis de agrupación

Bayesiana y modelos de coste-distancia, para elucidar la estructuración espacial y la conectividad

funcional en una especie rara y elusiva y para la que la obtención de muestras resulta un factor

limitante. Cabe destacar que este es el primer estudio que se lleva a cabo a nivel continental

utilizando como especie a la marta europea y mediante muestras fecales para la consecución de

estos objetivos.

4.3.1. Estructuración espacial de las poblaciones

Los resultados de estructuración poblacional mediante análisis bayesianos, respaldados a su vez

por los valores significativos de Fst, los análisis de equilibrio de H-W así como por las bajas tasas

de migración entre grupos, validan la existencia de una estructuración espacial, con la presencia

de al menos 3 grupos poblacionales distintos en el conjunto del área de estudio. Sin embargo, la

existencia del grupo Oriental, debe ser tomada con precaución debido al bajo número de muestras

identificadas para este grupo (n=12). Por ello, resulta necesario corroborar con un mayor tamaño

muestral la validez de dicho grupo.

La existencia de una marcada estructuración espacial en la actualidad, puede ser debida a

procesos históricos de fragmentación forestal, así como a la marcada persecución a la que se han

visto sometidas las poblaciones de marta en la CAPV hasta tiempos recientes (Castién &

Mendiola, 1985; Álvarez et al. 1998). Ambos factores, han podido dar lugar a procesos de cuello

de botella poblacionales, que podrían ser los responsables de la diferenciación que presentan las

poblaciones Central y Oriental, muy cercanas entre sí. Así mismo, es destacable que la principal

desconexión detectable en el ámbito de la RCE de la CAPV, la existente en la zona de los

embalses del Zadorra y que concuerda así mismo con una elevada presencia de infraestructuras

viarias (N-240, A-2623), coincide con el límite espacial entre ambas poblaciones. Esto parece

indicar que estas infraestructuras han podido actuar como barreras a la dispersión entre ambos

núcleos poblacionales, habiendo actuado de forma sinérgica con otros factores tales como la

fragmentación forestal y la persecución histórica. Los procesos de fragmentación forestal así como

la presencia de infraestructuras viarias contemporáneas se han identificado como factores

influyentes en la estructuración espacial de otros mamíferos forestales (p. ej. Coulon et al. 2004,

Coulon et al 2006).

40

Con respecto a la diferenciación de la población Navarra, si bien existe cierta continuidad forestal

entre ambos territorios, también se detecta una marcada fragmentación en la distribución de la

especie en la frontera entre ellos. Esta zona, si bien posee hábitat potencialmente adecuado para

la marta, está ampliamente ocupada por la garduña. La existencia de procesos históricos de

extirpación de la marta ha podido suponer el establecimiento de la garduña de estos hábitats. Los

procesos de competencia ecológica que actúan entre ambas especies han podido conducir a una

fragmentación del área de distribución de la marta en el conjunto del umbral Vasco y la región

pirenaica adyacente, pudiendo ser estos procesos parcialmente responsables de la actual

diferenciación poblacional.

La localización espacial de los limites poblacionales, respaldada a su vez por los análisis de los

modelos de coste-distancia, sugieren la no existencia de barreras absolutas al flujo génico en el

área de estudio, si bien la combinación de diferentes usos del suelo con baja permeabilidad (p. ej.

cultivos, asentamientos humanos, infraestructuras, etc.) han contribuido a la actual diferenciación

poblacional.

Por tanto, nuestros resultados sugieren que la matriz territorial posee una influencia significativa

en la estructuración poblacional de la marta en el ámbito de estudio, donde los procesos de

fragmentación forestal parecen ser los principales responsables de la diferenciación poblacional

observada. Sin embargo, dicha diferenciación ha podido verse incrementada por el efecto

sinérgico de los procesos históricos de persecución así como de los procesos de competencia

ecológica con su congénere M. foina. No obstante, a estas causas hay que añadir la propia

historia evolutiva de las poblaciones de marta desde el último máximo glacial.

4.3.2. Efecto de la configuración territorial sobre la conectividad funcional

Las especies especialistas de hábitat son generalmente reconocidas como especies

particularmente vulnerables a los procesos de fragmentación (Bright 1993). Sin embargo, son

escasos los estudios que se han desarrollado a nivel de individuos con el objetivo de determinar

su comportamiento espacial y dispersivo en este tipo de ambientes (Pereboom et al. 2008). El

impacto de la fragmentación de hábitats sobre los patrones espaciales a nivel de individuos es

menor que el que cabe esperar entre poblaciones (Rousset 2000, Coulon et al. 2004). Por tanto,

es esperable que las características paisajísticas estén menos correlacionadas con las distancias

genéticas inter-individudales que los valores de diferenciación poblacional (p. ej. valores de Fst

entre poblaciones). Por el contrario, un enfoque a nivel de individuos tiene la ventaja de tener una

mayor efectividad a la hora de detectar los efectos de la composición del territorio en el flujo

génico cuando el tamaño muestral a nivel poblacional y/o individual es bajo (Coulon et al. 2004).

Ambas restricciones permiten aplicar un enfoque desde la genética del paisaje en especies raras y

elusivas con un muestreo limitado.

Los resultados de correlación de distancias genéticas y geográficas obtenidos muestran la

existencia de un patrón de aislamiento por distancia para la marta en el País Vasco, al existir una

correlación significativa entre distancias genéticas inter-individuales y distancia euclidiana. Bajo un

patrón de aislamiento por distancia (IBD), los individuos separados por una mayor distancia

geográfica (línea recta o euclidiana) muestran mayores niveles de diferenciación genética (Wright

1943). Este patrón se hace pausible cuando el flujo génico (p. ej. el intercambio de migrantes)

41

ocurre principalmente entre los individuos más cercanos. Bajo este modelo, la estructura territorial

no influye en el patrón genético observado. Sin embargo, en numerosas ocasiones, la distancia y

la resistencia del paisaje pueden influir simultáneamente sobre el flujo génico (Trizio et al. 2005).

De hecho, en este estudio las distancias funcionales se han calculado como una función de

distancia y resistencia entre pares de individuos (LCD). Así, los individuos que se encuentran más

distanciados en el espacio tienden a estar así mismo separados por una mayor distancia de coste,

haciendo que la distinción entre un patrón netamente espacial y los efectos del paisaje resulte

particularmente complejo (Cushman et al. 2006).

Mediante la utilización de muestreos no invasivos y métodos de genética del paisaje basados en

individuos, hemos valorado el impacto de los diferentes usos del suelo en el flujo génico de la

marta en un ambiente fragmentado. Los resultados obtenidos respaldan la hipótesis de que la

conectividad en una especie eminentemente forestal está influenciada por los diferentes usos del

suelo y la distancia espacial. El flujo génico contemporáneo sigue un patrón de aislamiento por

distancia (IBD), pero los modelos complejos que tienen en cuenta la matriz territorial explican

mejor el patrón genético observado.

Al introducir la fricción que opone el territorio al desplazamiento de la especie mediante

modelización SIG, utilizando distancias de mínimo coste obtenidas en base al mapa de

resistencias con el que se diseñó la RCE de la CAPV, la correlación con las distancias genéticas

aumenta apreciablemente. Esto nos permite validar empíricamente, en relación a la marta, que el

modelo SIG que se utilizó en el diseño de la RCE es adecuado. Esto se debe a que las distancias

funcionales obtenidas entre individuos se ajustan mejor que la distancia euclidiana a los datos

empíricos de la especie (distancias genéticas). La comparación con los coeficientes de correlación

obtenidos en otros estudios similares, muestra que la mejora obtenida en relación a la distancia

euclidiana es relativamente alta y del orden del obtenido en trabajos similares (Tabla 9), lo que

permite validar la hipótesis de partida.

Cabe destacar así mismo que los modelos que parametrizan la totalidad de los usos del suelo

(modelo RCE) resultan ser más realistas que los modelos binarios que simplemente consideran el

territorio como zonas de hábitat favorable y no favorable, tendencia que predomina en la mayoría

de los estudios previos (Broquet et al. 2006, Coulon et al. 2004). Los modelos binarios consideran

exclusivamente el hábitat objetivo, por lo que la conectividad depende exclusivamente de la

distancia entre celdas del hábitat objetivo. En estos modelos se asume que la matriz circundante

es igualmente inhóspita, lo que supone una importante simplificación de la realidad (Holderegger

& Wagner 2008). Los modelos en mosaico (como el de la RCE), en cambio, consideran la

totalidad de hábitats existentes. En estos modelos, la conectividad no depende de forma exclusiva

de la distancia entre hábitats favorables sino de la naturaleza de los hábitats existentes en el

conjunto de la matriz.

Para paliar la limitación asociada a modelos binarios, en este trabajo hemos considerado

diferentes modelos binarios en gradiente para determinar qué usos del suelo sirven como soporte

a la dispersión de la especie. Los resultados de correlación obtenidos con los modelos binarios

sugieren que no sólo las masas forestales sirven como medios de dispersión favorable para la

especie. Las masas arbustivas, mosaicos agroforestales y hábitats herbáceos también

42

funcionarían como tales. En cambio, la inclusión de las zonas de cultivo en el modelo empeora la

correlación. Esto sugiere que los cultivos actúan como medio no favorable para la dispersión de la

especie. Estos resultados van en consonancia con estudios recientes llevados a cabo mediante

radioseguimiento, que aportan nuevos datos que difieren sustancialmente sobre lo descrito

tradicionalmente en la literatura científica (Pereeboom et al. 2008). Estos estudios demuestran que

la marta no se encuentra confinada de forma exclusiva a grandes manchas forestales, sino que

hace un uso adicional de fragmentos forestales y de zonas arbustivas (Pereeboom et al. 2008;

Balestrieri et al. 2009). Las martas tienden a situarse en la vecindad de la cobertura forestal

cuando se aventuran a cruzar espacios abiertos. En este sentido, las zonas de cultivo y los

espacios abiertos parecen ser evitados por la especie, si bien no actúan como barreras reales al

desplazamiento. La especie, en lugar de cruzar de un modo directo las zonas abiertas, hace uso

de las zonas arbustivas a modo de corredor, que reconectan eventualmente con las zonas

predominantemente forestales (Caryl 2008). Si bien la marta es una especie eminentemente

forestal, el resto de la matriz no resulta igualmente inhóspita a los movimientos de la especie,

donde las zonas arbustivas y los mosaicos agroforestales podrían jugar un importante papel

conector (Mergey 2007). Así mismo, la mejora del modelo al incluir zonas de pastizales parece

indicar que la especie no renuncia a cruzar estos espacios siempre y cuando existan medios

forestales en las inmediaciones (Pereeboom et al. 2008), tal y como sucede en el ámbito de la

CAPV.

En este trabajo se ha obtenido una correlación significativa entre las distancias efectivas y las

distancias genéticas con valores de correlación más elevados que los detectados en trabajos

similares (Tabla 9). Si bien algunos autores han utilizado la longitud de las rutas de mínimo coste

(least cost paths, LCP) como indicador de la conectividad del paisaje entre pares de individuos

(Broquet et al. 2006; Coulon et al. 2004), en el presente estudio se han empleado la distancias de

mínimo coste (least cost distances, LCD) al constituir un indicador más preciso del efecto de la

estructura del paisaje sobre la movilidad y el flujo génico de la especie. Así, las martas que se

desplazan por distintos LCP de igual longitud se ven afectadas por diferentes esfuerzos debido al

diferente coste asociado a los usos del suelo presentes en el territorio (Stevens et al. 2006). Por

ello, el coste de los LCP (o LCD) en lugar de la longitud de los LCP, resulta ser una medida más

eficiente para valorar la conectividad funcional entre pares de individuos.

43

Tabla 9. Comparación de los resultados del test de Mantel obtenidos en diferentes estudios de

genética del paisaje inferidos a nivel de individuos. Coeficientes de correlación de Pearson (Mantel

r) obtenidos entre distancias genéticas inter-individuales y distancias euclidianas, y entre

distancias genéticas y distancias funcionales.

Especie

Mantel r con

Distancias

euclidianas:

(valor de p)

Mantel r

Distancias

funcionales:

(valor de p)

Variable de

distancia

funcional

Variables

utilizadas en

resistencias

Referencia

Corzo (Capreolus

capreolus), hembras

No

significativa

0,031

(0,005)

Longitud de LCP

(m)

Distancia a

bosque

Coulon et al.

2004

Marta americana

(Martes americana)

No

significativa

0,043

(0,026)

Longitud de LCP

(m)

Presencia de

bosque

Broquet et al.

2006

Coxing's white-bellied

rat (Niviventer

coninga)

0,123

(<0,001)

0,161

(<0,001)

LCD (unitless)

Distancia a

usos del suelo,

pendiente,

NDVI

Wang et al.

2008

Glotón (Gulo gulo)

0.215

(<0,001)

0,260

(<0,001)

LCD (unitless)

Presencia de

nieve en

primavera

Scharchtz et

al. 2009

Marta europea

(Martes martes)

0,214

(<0,001)

0,256

(<0,001)

LCD (unitless)

Usos del suelo Presente

estudio

44

4. RESUMEN Y CONCLUSIONES

En este estudio hemos combinado técnicas moleculares no invasivas con análisis de agrupación

bayesiana y modelos de coste-distancia, para elucidar la estructuración espacial y la conectividad

funcional en una especie rara y elusiva y para la que la obtención de muestras de sangre y/o

tejidos resulta un factor limitante. Cabe destacar que este es el primer estudio que se ha realizado

a nivel continental utilizando como especie a la marta europea y mediante muestras fecales para

la consecución de estos objetivos.

Como paso previo ha sido necesario utilizar una técnica de identificación de especies a partir de

muestras fecales para determinar la distribución de las especies simpátricas del género Martes.

Tras ello, se ha procedido a aislar las muestras de la especie objetivo (Martes martes) con el fin

de efectuar análisis de genética del paisaje mediante un nuevo panel de marcadores

microsatélites desarrollado expresamente.

Los resultados obtenidos demuestran la potencialidad de los métodos moleculares como

herramienta útil para dar respuesta a cuestiones ecológicas, como el efecto de la fragmentación

del hábitat, la conectividad funcional y el estudio de la distribución de especies simpátricas

mediante estudios no invasivos. Las principales conclusiones son:

-La técnica de PCR-RFLP aplicada sobre muestras obtenidas de forma no-invasiva (excrementos)

se presenta como una técnica efectiva (éxito de identificación del 84%) y alternativa a métodos de

seguimiento tradicionales para delimitar la distribución de la marta y la garduña en áreas de

simpatría.

-Los resultados de presencia obtenidos permiten delimitar de una forma más precisa y a una

escala detallada la distribución actual de ambas especies en la CAPV, en relación a la información

previa disponible. Esta nueva información es de utilidad de cara a afrontar la revisión del actual

estatus de protección de la marta en el Catálogo Vasco de Especies Amenazadas, donde

actualmente se encuentra catalogada como “Rara”.

- Los resultados de distribución de marta y garduña han aportado valiosa información de cara al

análisis de las relaciones de simpatría y de los diferentes factores ambientales explicativos del uso

diferencial del hábitat en las especies del género Martes. Si bien la marta parece mostrar una

relativa predominancia en ambientes forestales sobre la garduña, ambas especies son sintópicas

en ambientes más heterogéneos. Por el contrario, en algunas zonas la garduña predomina en

hábitats forestales potencialmente óptimos para la marta. Por otro lado, la presencia de marta se

rarifica y desaparece en la zona septentrional del área de estudio, donde la garduña parece

mostrar una clara predominancia.

- El protocolo multiplex diseñado, compuesto por 15 microsatélites, permite determinar la identidad

individual (Pid-sibs=4,47x10-5) así como la estructura poblacional y variabilidad genética de la

marta, con la ventaja de su efectividad en material obtenido de forma no invasiva, donde el ADN

se encuentra parcialmente degradado.

45

- Las tasas de éxito de genotipado (35%) así como los errores de genotipado (ADO = 17.8%, FA =

2.9%) han sido similares a las tasas detectadas en otros estudios no invasivos abordados en

mamíferos.

-Los resultados obtenidos mediante análisis bayesianos (GENELAND y STRUCTURE),

respaldados a su vez por los valores significativos de Fst, los análisis de equilibrio de H-W así

como por las bajas tasas de migración entre grupos, muestran que la marta presenta una marcada

estructuración poblacional. Así, se ha detectado la presencia de al menos 3 núcleos poblacionales

claramente diferenciados en el área de estudio: Central, Meridional y Navarro. La existencia de un

cuarto grupo (Oriental) debe ser corroborada con un mayor tamaño muestral.

-La localización espacial de los límites poblacionales identificados, junto con los resultados

derivados de los modelos de coste-distancia, sugieren la no existencia de barreras absolutas al

flujo génico en el área de estudio, si bien la combinación de diferentes usos del suelo con baja

permeabilidad (p. ej. cultivos, asentamientos humanos, infraestructuras, etc.) han contribuido a la

actual diferenciación poblacional.

-Nuestros resultados sugieren que la matriz territorial posee una influencia significativa en la

estructuración poblacional de la marta en el ámbito de estudio. Sin embargo, la actual

diferenciación ha podido verse afectada por el efecto sinérgico de los procesos históricos de

fragmentación forestal, por la persecución, así como por procesos de competencia ecológica con

su congénere M. foina.

-Los resultados obtenidos respaldan la hipótesis de que la conectividad en una especie

eminentemente forestal está influenciada por los diferentes usos del suelo y la distancia espacial.

El flujo génico contemporáneo sigue un patrón de aislamiento por distancia (IBD), pero los

modelos complejos que tienen en cuenta la matriz territorial explican mejor el patrón genético

observado.

-Si bien la marta es una especie eminentemente forestal, el resto de la matriz no resulta igual de

inhóspita a los movimientos dispersivos de la especie, donde las zonas arbustivas y los mosaicos

agroforestales parecen jugar también un importante papel conector. Así mismo, la mejora del

modelo al incluir zonas de pastizales parece indicar que la especie no renuncia a cruzar estos

espacios siempre y cuando existan medios forestales en las inmediaciones.

- Los resultados de este estudio permiten validar empíricamente, en relación a la marta, que el

modelo SIG que se utilizó en el diseño de la RCE es adecuado. Esto se debe a que las distancias

funcionales obtenidas entre individuos se ajustan mejor que la distancia euclidiana a los datos

empíricos de la especie (distancias genéticas).

46

5. PERSPECTIVAS FUTURAS

Si bien el presente trabajo se ha centrado en la evaluación de la conectividad ecológica a una

escala regional, en un área de estudio que abarca el País Vasco y zonas limítrofes, esta área

posee un interés añadido a nivel supraregional por constituir un espacio de transición y conexión

entre las cordilleras Pirenaica y Cantábrica, conocido como umbral vasco (de Terán & Solé, 1987).

En la medida en que dichas cordilleras constituyen dos de los principales reservorios de

biodiversidad del suroeste de Europa, el umbral vasco juega un papel de vital importancia en la

regulación de flujos bióticos y constituye un ámbito de marcado carácter estratégico para el

análisis y el mantenimiento de la conectividad ecológica territorial (Worboys et al. 2010). En este

sentido, nuestro equipo de investigación viene trabajando durante los últimos años en la recogida

y análisis de muestras por todo el tercio norte de la Península Ibérica, habiéndose provisto ya de

un elevado tamaño muestral del conjunto del área de distribución potencial de la marta (véase

figura 17).

Los resultados obtenidos en el presente estudio, complementados con el análisis de poblaciones

de referencia de ambas Cordilleras, permitirán evaluar el papel conector del umbral vasco en

relación a la marta en el marco del norte peninsular. Por tanto, la metodología puesta en práctica

en el presente estudio puede extenderse al conjunto del norte de la Península Ibérica,

incrementando la significación de las conclusiones.

Figura 16. Localización y número de muestras identificadas como marta (Martes martes) en la franja norte de la Península Ibérica (714 muestras en total).

47

6. AGRADECIMIENTOS

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación de la Universidad del País Vasco y del Dpto.

de Medio Ambiente, Planificación Territorial, Agricultura y Pesca del Gobierno Vasco a través de la

empresa IKT SA, en el marco de la convocatoria de proyectos Universidad-Empresa 2007 (Ref.

UE0702). Así mismo, este estudio ha sido parcialmente financiado por el Dpto. de Educación,

Universidades e Investigación del Gobierno Vasco mediante la ayuda al grupo de investigación

“Sistemática, Biogeografía y Dinámica de Poblaciones” (Ref. IT317-10; GIC10/76) y el programa

de becas predoctorales de las que A. Ruiz-González es beneficiario (Ref. BFI09.396).

Queremos agradecer encarecidamente la colaboración desinteresada de las diferentes personas y

entes que han participado en el proceso de recolección de muestras (citadas en el apartado 1.2.1)

ya que sin su ayuda este trabajo no hubiera sido posible. Así mismo, agradecer al Dr. Ettore

Randi, director del Conservation Genetics Laboratory del Instituto Superiore per la Protezione e la

Ricerca Ambientale (ISPRA) por su apoyo y colaboración en la ejecución de este trabajo, así

como por facilitar la realización de una estancia para abordar parte de este estudio.

Queremos agradecer también a Peter Cairns por la cesión de la imagen que aparece en la

portada (© Peter Cairns).

48

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