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Mara Elisa Daltabuit Test

TESIS DOCTORALESN.o 57

DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS

DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR

PARA EL ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN CALOSTRAL

Y HORIZONTAL DEL VIRUS MAEDI-VISNA (VMV)EN OVINO

Memoria presentada por la Licenciada en VeterinariaDoña Mara Elisa Daltabuit Test

para obtar al grado de Doctor en Veterinaria

NEKAZARITZA, ARRANTZAETA ELIKADURA SAILA

DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA,PESCA Y ALIMENTACIÓN

Vitoria-Gasteiz, 2006

Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia

Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco

UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA

FACULTAD DE VETERINARIA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL

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DALTABUIT TEST, Mara ElisaDesarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y molecular para el estudio de la

transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino / memoria presentada por MaraElisa Daltabuit Test para optar al grado de Doctor en Veterinaria. – 1a ed. – Vitoria-Gasteiz : EuskoJaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu Nagusia = Servicio Central de Publicaciones del Gobierno Vasco, 2006

p. ; cm. – (Tesis doctorales ; 57)Tesis-Universidad de ZaragozaISBN 84-457-2399-5

1. Maedi-Visna, Enfermedad del-Tesis doctorales. I. Euskadi. Departamento de Agricultura, Pesca yAlimentación. II. Título III. Serie619:616.98:578.82/.83(043)

Edición: 1.a Febrero 2006

© Administración de la Comunidad Autónoma del País VascoDepartamento de Agricultura, Pesca y Alimentación

Internet: www.euskadi.net

Edita: Eusko Jaurlaritzaren Argitalpen Zerbitzu NagusiaServicio Central de Publicaciones del Gobierno VascoDonostia-San Sebastián, 1 - 01010 Vitoria-Gasteiz

Fotocomposición: Composiciones RALI, S. A.Particular de Costa, 8-10, 7.a - 48010 Bilbao

Impresión: Lankopi, S. A.Colón de Larreategui, 16 - 48001 Bilbao

ISBN: 84-457-2399-5

D.L.: BI-471-06

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El Dr. Eduardo Berriatua Fernández de Larrea, investigador del Instituto Vasco de Investiga-ción y Desarrollo Agrario (NEIKER).

Hace Constar:

Que el trabajo titulado: “Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y mo-lecular para el estudio de la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV)en ovino” presentado por Dña. Mara Elisa Daltabuit Test, ha sido realizado bajo su direccióny cumple con los requisitos exigidos para optar al título de Doctor en Veterinaria.

Derio a 22 de Febrero de 2005

Fdo. Dr. Eduardo Berriatua Fernández de Larrea

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La realización de este trabajo, ha sido posible gracias a la fi-nanciación recibida de los proyectos “MAEDI CONTROL”SED2003011 del Departamento de Agricultura y Pesca del Go-bierno Vasco, RTA01-107-C3-3 del Instituto Nacional de In-vestigaciones Agrarias (INIA) de España y al CRAFT PRO-JECT “SRLV-C” QLK2 – CT – 2001 – 70356 del V ProgramaMarco de la UE. Así mismo la autora de esta memoria ha dis-frutado de una ayuda para gastos de estancia del Instituto Vas-co de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER).

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A mis Papás

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AGRADECIMIENTOS

Quiero dar las gracias a mi director de tesis Eduardo Berriatua Fernández de Larrea porla organización y dirección de este trabajo.

A Ramón Juste por haberme brindado la oportunidad de desarrollar este trabajo enNEIKER y por estar dispuesto a ayudarme en todo momento.

Quiero agradecer especialmente a Vega y Josune por compartir conmigo “el camino dela tesis” y por darme su apoyo, comprensión y ayuda, no les podré agradecer lo suficiente.

A Sorkunde, Ana H., Xeider, Esmeralda, Itziar, Julio y David por el enorme apoyo enla recta final de la tesis. De todos ustedes he aprendido algo, muchas gracias.

A toda bajo cubierta, Bea, Idoia, Natalia y Mónica por hacer que mis días terminaransiempre con una sonrisa.

Al resto de los compañeros NEIKER, por hacer que me sintiera en todo momento comoen casa.

A Imanol y a Juan Carlos por haber ayudado en la obtención de muestras en las fríasmañanas de Enero.

Quiero dar las gracias a todos los que se volvieron mis “cuates-NEIKER” han hechoque mi estancia en Bilbao sea inolvidable.

A Alfredo por aguantar mis etapas “de buenas” y “de malas” y ser mi apoyo en todomomento.

Y finalmente a los cuates-México con quienes pasar tan solo un minuto merece la pena.

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ESKER ONAK

Eskerrak eman nahi nizkioke nire tesi zuzendari izan den Eduardo Berriatua FernándezDe Larreari, lan hau zuzentzeagatik eta gidatzeagatik.

Ramon Justeri, NEIKER-en lan hau egiteko aukera eman zidalako eta momentu orotanni laguntzeko prest egon delako.

Eskerrak eman nahi dizkiet, bereziki, Vegari eta Josuneri, tesiaren bide luze honetaneman didaten laguntasunarengatik eta babesarengatik. Ezingo dizuet nahikoa eskertu.

Sorkunderi, Ana H.-ri, Xeiderri, Esmeraldari, Itziarri, Juliori eta Davidi ere eskerrik be-roenak, tesiaren azkeneko momentuetan eman dizkidaten animoengatik. Zuengandik guz-tiongandik zerbait ikasi dut, eskerrik asko.

Teilatupekoei; Beari, Idoiari, Nataliari eta Monicari. Gainera, egunak irribarre batekinbukatzen lagundu didazue.

NEIKER-eko gainontzeko lagunei, bertan egon naizen denbora luze honetan etxean ba-nengo bezala sentiarazteagatik.

Imanoili eta Juan Karloseri, Urtarrileko goiz hotzetan laginak jasotzen laguntzeagatik.

Eskerrak eman nahi dizkiet, orobat, nire “cuates-Neiker” bihurtu diren guztiei, beraiekbihurtu baitituzte ahaztezin Bilbon pasa ditudan urteak.

Alfredori, nire une “onak” eta “txarrak” jasateagatik, eta nire sostengua izan delakomomentu guztietan.

Eta azkenik, eskerrak nire lagun mexikar guztiei; benetan merezi du zuekin une bakarbat bera ere igarotzeak.

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ABREVIATURAS

ABC: Advidina estreptoavidina biotina.Ac: Anticuerpo.Acp: Anticuerpos precipitantes.Acpc: Anticuerpos policlonales.Acm: Anticuerpos monoclonales.Acn: Anticuerpos neutralizantes.ADN: Ácido desoxirribonucleico.ADNc: Ácido desoxirribonucleico comple-

mentario.AEC: Artritis encefalitis caprina.APO: Adenomatosis pulmonar ovina.ARN: Acido ribonucleico.ARNm: ARN mensajero.ARNt: ARN transferencia.C: Citocina.CA: Cápside.CAPV: Comunidad Autónoma del País

Vasco.CE: Células epiteliales.CEM: Células epiteliales mamarias.CFS: Células de fluido sinovial.CSIC-UPNA: Instituto de Agro-biotecno-

logía y Recursos Naturales.CL: Células de leche.CMSC: Células de membrana sinovial de

cabra.CS: Células somáticas.DAB: Diaminobenzidina.DO: Densidad óptica.EC: Efecto citopático.ELISA: Ensayo de inmunoabsorción enzi-

mática.ELISA-d: Ensayo de inmunoabsorción en-

zimática directo.

ELISA-i: Ensayo de inmunoabsorción en-zimática indirecto.

FL: Finish Landrace.G: Guanina.HIS: Hibridación in situ.IDGA: Inmunodifusión en gel de agar.IF: lle de FranceIg: Inmunoglobulina.IHQ: Inmunohistoquámica.IL: Interleucuina.IL-1: Interleucina 1.IL-2: Interleucina 2.IL-6: Interleucina 6.IL-8: Interleucina 8.IL-16: Interleucina 16.IN: Integrasa.INRA: Institute Nationale de la Reserche

Agricole.LTR: Long Terminal Repeat.LVPR: Lentivirus de los pequeños rumian-

tes.MA: Matriz.MCP-1: Sustancias quimiotácticas para

monocitos.MHC: Complejo mayor de histocompati-

blidad.MV: Maedi-Visna.NC: Nucleo cápside.NEIKER: Instituto Vasco de Investigación

y Desarrollo Agrario.nm: Nanómetros.NPO: Neumonía progresiva ovina.NSVM: Norwegian School of Veterinary

Science.

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OIE: Organización Internacional de Epizo-otias.

ORF: Open Reading Frames. pb: Pares de bases.PBS: Solución de fosfato salino.PBMC: Células mononucleares de sangre

periférica.PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.PCR-n: Reacción en cadena de la polimera-

sa nested.PCR-sn: Reacción en cadena de la polime-

rasa semi-nested.PCO: Plexo coroideo ovino.PRu: Pequeños rumiantes.PP: Polipurinas.PR: Proteasa.PRPsc: PRP-Scrapie.Q-PCR: Reacción en cadena de la polime-

rasa cuantitativa.RTM: Proteína transmembranal recombi-

nante.SDS: Dodecil sulfato sódico.SEM: Scanning electron microscope.SFB: Suero fetal bovino.SFO: Suero fetal ovino.

SNC: Sistema nervioso central.SU: Envoltura externa.TEM: Transmision electron microscope.TM : Glicoproteína de la transmembrana.TNF-?: Factor de necrosis tumoral alpha.TR: Transcriptasa reversa.UniEdi: Universidad de Edimburgo.UniMil: Università Degli Studi di Milano.UniUtr: Universidad de Utrecht. UV: Ultravioleta.VAEC: Virus de la Artritis Encefalitis Ca-

prina.VAIE: Virus de la Anemia Infecciosa Equi-

na.VIB: Virus de la Inmunodeficiencia Bovi-

na.VIF: Virus de la Inmunodeficiencia Felina.VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Huma-

na.VMV: Virus Maedi-Visna.VNPO: Virus de la Neumonía Progresiva

Ovina.VIS: Virus de la Inmunodeficiencia de los

Simios.WB: Western Blot.

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ÍNDICE

1. RESUMEN / LABURPENA / SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.1. Agente etiológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.1.1. Morfología de la partícula viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342.1.2. Ciclo de replicación viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.1.2.1. Entrada del virus en la célula hospedadora . . . . . . . . . . . . . . . . 352.1.2.2. Transcripción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.1.2.3. Integración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.1.2.4. Expresión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.1.2.5. Síntesis, Ensamblaje y Maduración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.1.3. Implicaciones de la replicación viral en la variabilidad de los LVPR . . . 382.1.4. Tropismo viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

2.2. Respuesta inmune . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.2.1. Respuesta inmune humoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.2.2. Respuesta inmune celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.2.3. Inmunidad pasiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.3.1. Inmunidad en el neonato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.2.3.1.1. Sistema inmune neonatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.3. Cuadro clínico y lesiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.3.1. Forma pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.3.2. Forma nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.3.3. Forma mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442.3.4. Forma articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.4. Diagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4.1. Diagnóstico de la enfermedad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.4.1.1. Diagnóstico Clínico- Lesional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4.1.1.1. Forma Pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4.1.1.2. Forma Mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4.1.1.3. Forma Nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 452.4.1.1.4. Forma Articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.4.1.2. Diagnóstico Diferencial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.4.1.2.1. Forma Pulmonar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.4.1.2.2. Forma Mamaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472.4.1.2.3. Forma Nerviosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472.4.1.2.4. Forma Articular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

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2.4.2. Diagnóstico de la infección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.4.2.1. Diagnóstico Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.4.2.1.1. Aislamiento Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.4.2.1.2. Microscopía Electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502.4.2.1.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) . . . . . . 512.4.2.1.4. Reacción en cadena de la Polimerasa- Cuantitativa

(Q-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542.4.2.2. Diagnóstico Inmunológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.4.2.2.1. Inmunodifusión en gel de agar (IDGA) . . . . . . . . . . 552.4.2.2.2. Ensayo de Inmunoabsorbancia Enzimática (ELISA) 552.4.2.2.3. Inmunohistoquímica (IHQ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.4.2.2.4. Hibridación in Situ (HIS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582.4.2.2.5. Inmunoelectrotransferencia (WESTERN BLOT) . . 58

2.5. Epidemiología y control del VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592.5.1. Aspectos históricos y distribución geográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592.5.2. Modos de transmisión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

2.5.2.1. Transmisión Aerógena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 602.5.2.2. Transmisión Lactógena . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 602.5.2.3. Transmisión Intrauterina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

2.5.3. Otras vías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622.5.3.1. Iatrogénica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

2.5.4. Factores de riesgo de la infección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622.5.5. Prevención y control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA Y ANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS PCRS DE LVPR MÁS EMPLEADAS EN EUROPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 673.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 693.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

3.2.1. Abordaje experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 703.2.2. Obtención del banco de muestras de sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.2.3. Obtención de suero y realización del ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.2.4. Obtención de células blancas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.2.5. Obtención de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 733.2.6. Concentración y pureza de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.2.7. Secuenciación de aislados de LVPR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.2.8. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 743.2.9. Ensayos PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.2.9.1. Estrategias de comparación de ensayos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 753.2.9.2. Tipos de ensayo de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 753.2.9.3. Condiciones y formato de reacción de PCR . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 773.3.1. Banco de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

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3.3.2. Secuenciación de ADN y diseño de cebadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 783.3.3. Ensayos de LTR-PCR en las muestras europeas intercambiadas . . . . . . 793.3.4. Ensayos de PCR con el “kit-1” en las muestras locales . . . . . . . . . . . . . 793.3.5. Ensayos de PCR con el “kit-2” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 803.3.6. Comparación de LTR-PCR (Derio) y POL-PCR (Pamplona) . . . . . . . . . 81

3.3.6.1. Porcentaje de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA positivos . . . . . . 813.3.7. Grado de concordancia entre las técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 823.3.8. Variabilidad genética en los cebadores del proyecto Craft . . . . . . . . . . . 83

3.3.8.1. Cebadores Gin5-F y Gin3-R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 833.3.8.2. Cebadores Craft F y Craft R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 843.3.8.3. Cebadores OsloF y OsloR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 853.3.8.4. Cebadores POL F y POL R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 863.3.8.5. Cebadores LTR F y LTR R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

3.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS ENCALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS SEROPOSITIVAS Y LA RELACIÓNCON LA INFECCIÓN POR VMV EN CORDEROS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 914.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 934.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

4.2.1. Abordaje experimental y población de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 934.2.2. Obtención de muestras, análisis de AC por ELISA y detección de

provirus MV mediante LTR-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 944.2.3. Obtención de CS y componentes no celulares de calostro . . . . . . . . . . . 944.2.4. Obtención de ARN del sobrenadante de calostro . . . . . . . . . . . . . . . . . . 954.2.5. Tratamiento con DNAsas en las muestras de ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . 954.2.6. Concentración y pureza del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 954.2.7. Diseño de la GAG-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 964.2.8. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

4.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 974.3.1. Cebadores y condiciones de reacción de la GAG-PCR . . . . . . . . . . . . . . 974.3.2. Porcentaje de ensayos de PCR y ELISA positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . 984.3.3. Comparación de técnicas de diagnóstico en calostro y sangre . . . . . . . . 994.3.4. Seroprevalencia en corderos criados con calostro VMV-Seropositivo

según el estado de VMV-PCR del calostro y el modo de ingestión delcalostro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

4.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTALPOR VMV EN OVINO LATXO ADULTO CRIADO BAJO DISTINTASPRESIONES DE INFECCIÓN A VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1035.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

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5.2. Materiales y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1065.2.1. Diseño experimental y población de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1065.2.2. Obtención de muestras y ensayos de PCR y ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . 1065.2.3. Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

5.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1075.3.1. Porcentaje de ovejas ELISA y PCR positivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1075.3.2. Incidencia acumulada de seroconversión según la edad y el estado de

PCR durante el primer año de vida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1085.3.3. Relación entre resultados de ELISA y PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

5.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

6. CONCLUSIONES FINALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

7. APÉNDICE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

8. ANEXOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

DESARROLLO Y APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR PARA EL ESTUDIO...

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Familia Retroviridae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34Figura 2.2. Ubicación de los genes de los Retrovirus de los pequeños rumiantes . . . . 35Figura 2.3. Estructura de la LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Figura 2.4. Replicación Retroviral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37Figura 2.5. Patogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Figura 3.1. Ubicación geográfica de los rebaños seleccionados (1,3 y 11 Arkaute,

2 y15 Markina-Xemein, 4 Antzuola, 5 Zestoa, 6 Legazpia, 7 Oñati, 8 y 9 Beizama, 10 Muskiz, 12 Derio, 13 Tolosa, 14 Gaintza) . . . . . . . . . . . . . . 71

Figura 3.2. Esquema de los pasos a seguir en el ELISA Indirecto ELITEST . . . . . . . 73Figura 3.3. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin5-F en el gen gag 84Figura 3.4. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin3-R en el gen gag 84Figura 3.5. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft F en el gen gag 84Figura 3.6. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft R en el gen gag 85Figura 3.7. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo F en el gen gag 85Figura 3.8. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo R en el gen gag 85Figura 3.9. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL F en el gen pol 86Figura 3.10. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL R en el gen pol 86Figura 3.11. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR F en la región

LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86Figura 3.12. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR R en la región

LTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87Figura 4.1. Zona amplificada por los cebadores gag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96Figura 4.2. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag F en el gen gag 97Figura 4.3. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag R en el gen gag 97Figura 5.1. Porcentaje de ovinos ELISA y LTR-PCR positivos según la edad en

grupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta(grupo H) presión de infección a VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

Figura 5.2. Incidencia acumulativa de ovinos ELISA-seropositivos según la edad engrupos de animales criados en condiciones de baja (grupo L) y alta(grupo H) presión de infección a VMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

Figura 5.3. Porcentaje y coeficiente de concordancia, kappa, de las técnicas dediagnóstico de anticuerpos frente a VMV ELISA y de provirus VMVLTR-PCR según la edad de los ovinos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 2.1. Clasificación Viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33Tabla 3.1. Pruebas de PCR desarrolladas para el diagnóstico de SRLV entre 1992 y

2001 disponibles en la literatura científica internacional . . . . . . . . . . . . . . 70Tabla 3.2. Rebaños ovinos y caprinos seleccionados para crear un banco de muestras 72Tabla 3.3. Cebadores empleados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76Tabla 3.4. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y

temperaturas de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77Tabla 3.5. Resultados de ELISA y PCR para la selección de muestras a enviar a la

Universidad de Utrecht e INRA de Lyon para secuenciación yestudio devariabilidad genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Tabla 3.6. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios delproyecto empleando las PCRs en el “Kit-1” con muestras locales . . . . . . . 79

Tabla 3.7. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios delproyecto empleando las PCRs en el “Kit-2” con muestras locales . . . . . . . 81

Tabla 3.8. Proporción de positivos a las técnicas LTR-PCR, POL-PCR y ELISA enmuestras de corderos del rebaño experimental Arkaute tomadas entre elnacimiento y los 300 días de edad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

Tabla 3.9. Resultados discordantes y kappa entre los ensayos de LTR-PCR,POL-PCR y ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

Tabla 3.10. Resultados entre los ensayos LTR y ELISA a los 300 días . . . . . . . . . . . . . 83Tabla 4.1. Cebadores empleados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97Tabla 4.2. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y

temperaturas de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98Tabla 4.3. Porcentaje de PCR-positivos en muestras de calostro y sangre de ovejas

tomadas el día del parto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99Tabla 4.4. Porcentaje de ELISA-positivos en muestras de calostro y sangre de oveja

tomadas el día del parto y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

Tabla 4.5. Resultados discordantes, concordantes y coeficiente kappa entre parejas de técnicas de diagnóstico PCR y ELISA de VMV en muestras de calostro y sangre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Tabla 4.6. Porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad en función del estado de PCR del calostro, el modo de ingestión del calostro y el volumen de calostro ingerido mediante biberón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

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1. RESUMENLABURPENA

SUMMARY

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1. RESUMEN

En esta tesis se investigan aspectos del diagnóstico, epidemiología y control de la in-fección por el VMV en ovino. Se realizaron estudios para (i) comparar la validez diagnósti-ca de hasta siete ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección deVMV integrado en células (provirus) y libre, (ii) investigar la presencia de VMV en calostrode ovejas seropositivas y su relación con la infección en corderos y (iii) estudiar la transmi-sión horizontal del VMV en ovino adulto sometido a distintos grados de presión de infecciónde VMV.

Parte del estudio comparativo de las PCRs se llevó a cabo en el seno de un proyecto delV Programa Marco de la Dirección General de Investigación de la Comisión Europea dirigi-do a la elaboración de un ensayo de PCR para la detección de LVPR de espectro paneuropeo.Se realizó un análisis de sensibilidad y especificidad diagnóstica con cinco ensayos de los la-boratorios de lentivirus ovinos de las Universidades de Lyon (Francia), Utrecht (Holanda),Oslo (Noruega), en el Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales, CSIC-UPNA dePamplona y en el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER) de Derio.Con todos los ensayos fue posible detectar LVPR de origen ovino y caprino y en general laespecificidad de las técnicas fue buena. Sin embargo, la sensibilidad de los ensayos varió con-siderablemente dependiendo del ensayo, el origen de las muestras y el laboratorio donde serealizó el ensayo. Globalmente, la PCR desarrollada en Derio para amplificar secuencias dela región “long terminal repeats” (LTR) mostró una sensibilidad comparativamente más altaque el resto de PCRs en ADN de muestras de sangre de ovinos de Europa.

Para investigar la infección por VMV asociada al consumo de calostro se analizó la pre-sencia de anticuerpos frente a VMV y de VMV integrado y libre en calostro de ovejas sero-positivas y la seropositividad a los 300 días de edad en corderos que consumieron este calos-tro durante las primeras 24 horas de vida. Se identificó VMV en calostro empleando laLTR-PCR y se diseñó una nueva PCR para detectar secuencias del gen gag (Gag-PCR) delVMV. La Gag-PCR permitió detectar provirus y VMV libre no asociado a células somáticas(CS) mediante un protocolo de purificación de ARN viral, retrotrasncripción y amplificaciónde ADNc viral. Se observó una buena correlación entre las PCRs indicando que en calostrola presencia de provirus va asociada a la presencia de virus libre y el porcentaje de calostrosseropositivos fue superior al de calostros PCR-positivos. La probabilidad de ser seropositivoa los 300 días de edad se asoció independientemente a la presencia de virus en calostro, almodo en que se tomó el calostro, con biberón o mamado de la oveja y al volumen de calos-tro ingerido. Los corderos que tomaron con biberón el calostro ovino tuvieron más riesgo deinfección que los que lo tomaron de la madre y las posibles causas de esto se discuten en de-talle. El riesgo de infección fue también mayor al aumentar la cantidad de calostro PCR-po-sitivo ingerido excepto en los que tomaron un volumen de calostro superior a la mediana, enlos que el riesgo fue independiente del estado de PCR del calostro. Estos resultados indicanque la cantidad de virus en calostro de oveja seropositiva varía substancialmente según los in-dividuos y que probablemente la mayoría de los calostros seropositivos tienen VMV. Sin em-bargo cuando la cantidad de VMV presente es baja, sólo se infectan los corderos que consu-

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men un volumen alto de calostro. A efectos prácticos de control de VMV estaría justificadoel empleo de la PCR para identificar calostros de riesgo de infección cuando no fuese posibleconseguir alternativas de calostro ovino no infectado o destruir el VMV calentando el calos-tro a 56°C antes de administrarlo.

Al final del estudio anterior, las corderas pasaron a formar parte del rebaño experimen-tal infectado de VMV de ovejas de raza Latxa en ordeño de NEIKER y se mantuvo un grupode machos castrados en un edificio separado para estudiar la transmisión horizontal en cadagrupo mediante ELISA y LTR-PCR. En dos años la prevalencia de infección ascendió del16% al 60% en el grupo de hembras de reposición y del 14% al 18% en el grupo de machos.Además la mayoría de las hembras se infectaron en los primeros 6 meses después de entraren el rebaño de ordeño. Por un lado, los hallazgos realizados en las hembras refuerzan el co-nocido riesgo de transmisión horizontal de VMV en rebaños lecheros latxos y demuestran quela probabilidad de infección con VMV no aumenta con la edad como se observa cuando seemplea la técnica serológica IDGA, menos sensible que el ELISA. Por otro lado, la casi nulaincidencia de VMV entre los machos demuestra que en determinadas condiciones, la estabu-lación de ovinos infectados y libres de VMV no implica necesariamente un contagio hori-zontal significativo. Nuevos estudios para identificar los factores de riesgo de la excreción ytransmisión de VMV en el rebaño serán de gran utilidad para entender mejor la epidemiolo-gía del VMV y diseñar estrategias más precisas de control de la infección por VMV.


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LABURPENA

Tesi honetan Maedi-Visna birusak (MVB) ardietan eragindako infekzioaren diagnosti-koa eta esparru epidemiologikoa ikertu da. Horretarako, zeluletan barneratutako (probirusa)eta libre dagoen MVB detektatzeko asmotan, Polimerasaren erreakzio kateatu (PCR) teknikadesberdinak parekatu dira; ardi seropositiboen oritzetako birusaren presentzia aztertu eta ho-nen erlazioa arkumeen infekzioan ikuskatu da eta gradu desberdineko infekziodun ardi hel-duen transmisio horizontala ikertu da.

Espektro europearra duen hausnarkari txikien lentibirus detekziorako PCR baten disei-nuaren helburuarekin zuzenduriko “V Programa Marco de la Dirección General de Investi-gación de la comisión Europea” delako proiektuan barneratua izan da PCR desberdinen pa-rekapen azterketa. PCR desberdinen espezifikotasuna eta sentsibilitatea zehazteko Lyon-go(Frantzia), Ultrecht-eko (Herbeherak) eta Oslo-ko (Norvegia) Unibertsitateetako ardi lentibi-rusak ikertzen dituzten laborategiek, Iruñeako Agrobioteknologia eta baliagai naturalen ins-titutuak (CSIC-UPNA) eta Derioko Nekazal ikerketa eta garapenerako euskal erakundeak(Neiker) parte hartu dute. Laborategi desberdinetan, ardi eta ahuntz jatorrietako lentibirusakdetektatzea ahalbideratu da eta orokorrean tekniken espezifikotasuna ona izan da. Bestalde,sentsibilitateari dagokionez, entsaiu, laginen jatorria eta entsaiua burututako laborategi alda-gaiak kontutan hartuta, hau ainitz aldatzen dela ikusi da. Orokorrean Derion garatutako“Long terminal repeats” (LTR) eskualdea anplifikatzeko PCR-ak inork baino sentsibilitatehandiagoa erakutsi du Europako ardi odol laginetan.

Oritz kontsumoarekin erlazionaturiko infekzioa aztertzeko; a)MVB-ren aurkako anti-gorputzen presentzia, b)probirus gisa edo birus librearen agerpena ardi seropositiboen oritze-tan eta d)bizitzako lehen 24 ordutan oritz hau dastatutako arkumeen seropositibitatea 300egunetara ikuskatu da. PCR-LTR teknika erabiliz, MVB-ren presentzia oritzean detektatuaizan da eta bide batez, Gag-PCR genearen sekuentzia detektatzeko PCR berri bat diseinatuaizan da. Azken PCR honen bidez eta birusaren RNA-ren purifikazio, retrotranskripzio etaDNA osagarriaren anplifikazioaren bitartez, MVB librea detektatzea ahalbideratu da. PCRdesberdinen arteko korrelazio egokia ikusi da, oritzean ageri den probirusa, birus librearenagerpenarekin erlazionatuta dagoela gaineratuz eta oritz seropositiboen portzentaia, PCR po-sitiboak diren oritzen portzentaia baino handiagoa izan delarik. 300 eguneko adinarekin se-ropositiboa izateko probabilitatea oritzeko birusaren agerpenarekin, oritza hartutako modua-rekin (biberoiarekin edo zuzenean ardi-dititik hartuta) eta edandako oritz bolumenarekinindependienteki erlazionatua izan da estatistikoki. Honela, infekzio arriskua latzagoa izandela biberoia hartu duten animalietan eta oritz kantitate gehiago hartu dutenetan ikusi da. Me-dianari dagokion bolumena baino gehiago hartutako animalietan berriz, infezio-arriskua ori-tzaren PCR emaitzarekiko independientea izan da. Emaitza hauekin, ardiaren arabera birusa-ren presentzia oritzean asko aldatzen dela, oritz seropositibo gehienak birusa dutela bainabirusaren agerpena eskasa denean oritz bolumen handia dastatzen duten arkumeak soilik in-fektatzen direla ondorioztatzen da. MVB-ren kontrola bideratuz, PCR-aren erabilera infekzioarriskua duten oritzen detekziorako egokia litzateke oritz ez infektatua erabili edo MVB ori-tza 56°C-tara berotuz hil ezin izanez gero.

1. RESUMEN, LABURPENA, SUMMARY

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ELISA eta LTR-PCR-az transmisio horizontala ikertzeko, aipaturiko entsaiua amaituz,arkume emeak Neikerrek MVB-az infektaturik duen latxa-ardien artalde esperimentalerapasa eta zikiratutako ar talde bat beste gune batetan mantendu dira. Bi urteren buruan infek-zioaren prebalentzia %16-tik %60-ra igo da emeen kasuan eta %14-tik %18-ra arren kasuan,eme gehienak lehen sei hilabeteko epean infektatuak izan direla gaineratuz. Alde batetik,emeetan ikerturikoak, birusaren transmisio horizontalak latxa-esne artaldeetan duen garran-tzia aldarrikatu du eta adinarekin infekzioaren probabilitatea ez dela handitzen agarrezko ge-letan egindako inmunodifusio teknika diagnostikoak (ELISA baino sentsibilitate gutxiagokoteknika) babesten duen bezela ondorioztatzen da. Bestalde, arretan birusaren agerpen ia ezak,infektaturiko eta animalia osasuntsuak batera ikuiluratzeak transmisio horizontalaren kutsa-pena ondorioztatzen ez duela kasu guztietan sustatzen du. MVB-ren epidemiologia eta honenkontrola hobe bideratzeko, birusaren iraizketa eta transmisioan eragiten duten faktoreen iker-keta ezinbestekotzat ikusten da.


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SUMMARY

This thesis investigates diagnostic and epidemiologic aspects of maedi visna virus(MVV) infection in sheep. Studies were carried out to (i) compare diagnostic validity of sev-en different polymerase chain reaction (PCR) tests for the detection of proviral and free MVV,(ii) study the presence of MVV in calostrum of seropositive ewes and its relationship with in-fection in lambs and (iii) study horizontal transmission of MVV in adult sheep subjected tovarying MVV-infection pressure.

The comparative PCR studies were part of a European project (CRAFT) whos main ob-jective was to design a PCR assay to detect small ruminant lentiviruses (SRLV) across Eu-rope. A sensibility and specificity study was performed in five PCR assays developed andused by the Universities of Lyon (France), Utrecht (Holland), and Oslo (Norway), the Agro-biotecnology and Natural Resources Institute (CISIC-UPNA) (Pamplona-Spain) and theBasque Institute for Agricultural Research and Development NEIKER-Derio (Vizcaya-Spain). It was possible to detect ovine and caprine SRLVs with all the assays and overall thespecificity of the tests was very good. Yet, the sensibility varied considerably between assays,according to the origin of the samples, the animal species and the laboratory that carried outthe test. The most sensitive test in ovine samples was the one developed in NEIKER that am-plifies a DNA fragment in the long terminal repeats (LTR) region of proviral SRLV.

To study the MVV-infection in lambs associated to the consumption of colostrum, thepresence of anti-MVV antibodies and cell-integrated and cell-free MVV was investigated incolostrum of seropositive sheep and an analysis was carried out to investigate the relationshipbetween consumption of MVV-containing colostrum in the first 24 hours of life and seropos-itivity at 300 days-old.

Proviral MVV was identified in colostrum somatic cells (SC) using the LTR-PCR as-say and a new PCR targeting sequences in the gag gene of MVV. This Gag-PCR also alloweddetecting cell-free MVV in colostrum following a protocol of viral RNA purification, retro-transcription and amplification of complementary DNA. There was a good positive correla-tion between PCRs indicating that in colostrum the presence of provirus is associated to thepresence of cell-free virus and the number of antibody-positive (seropositive) colostrum sam-ples was higher than the number of PCR-positive colostrum samples. The risk of beingseropositive at 300 days of age was independently associated with the quantity of virus pre-sent in the colostrum, the mode of feeding the colostrum (naturally suckled or bottle-feed)and the volume of colostrum ingested. Lambs that consumed colostrum by bottle had a high-er risk of infection than those that naturally suckled colostrum form their dams and the pos-sible reasons for this are discussed. The risk of infection increased with increasing PCR-pos-itive colostrum volume except in lambs that consumed more colostrum than the median, inwhich case the risk was independent of the PCR result of the colostrum. These results indi-cate that the quantity of virus in colostrum of seropositive ewes varies substantially betweenindividuals and that probably the majority of seropositive colostrums contain MVV. Howev-er, when the viral concentration in colostrum is low and not detectable by PCR, only lambs

1. RESUMEN, LABURPENA, SUMMARY

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that consume a high volume become infected. From a practical MVV-control point of view,it would be justified to use the PCR to identify MVV-containg colostrum when not possibleto obtain alternative MVV-free colostrum or inactivate MVV by heating the colostrum to56°C before feeding it.

When the previous experiment ended, horizontal MVV-infection was investigated insome of these lambs including a group of ewe-lambs that joined NEIKER’s experimentalMVV-infected, housed, Latxa dairy-flock as replacemente ewes and a group of castrated ramsmaintained in a separate building with no other sheep, using ELISA and LTR-PCR. In a two-year period the prevalence of infection raised from 16% to 60% in the group of the replace-ment ewes while in the group of the castrated rams the prevalence went from 14% to 18%.Moreover, the majority of ewes became infected in the first 6 months after entering the dairyflock. The findings in the ewes reinforce the well-known risk of horizontal MVV-transmis-sion in housed latxa sheep and demonstrates that the risk of MVV-infection does not increasewith age as shown when MVV-infection was investigated using the AGID serological tech-nique that is less sensitive than ELISA. On the other hand the almost null incidence of MVV-infection among the rams demonstrates that in certain conditions, housing infected and non-infected ovines does not necessarily result in significant horizontal infection. New studies toidentify risk factors for MVV-excretion and -transmission in infected flocks will allow a bet-ter understanding of the epidemiology of MVV and the design of more precise MVV-controlstrategies.


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2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

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2.1. AGENTE ETIOLÓGICO

El virus Maedi-Visna (VMV) forma parte de la familia Retroviridae, género lentivirusy subgénero lentivirus de los pequeños rumiantes (LVPR) [155] (Tabla 2.1).

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Tabla 2.1. Clasificación Viral

Familia Género Subgénero Especies

Retroviridae AlpharetrovirusBetaretrovirusGammaretrovirusDeltaretrovirusEpsilonretrovirus

Lentivirus Lentivirus Bovino Virus de lainmunodeficiencia BovinaVirus de la enfermedad de Jembrana

Lentivirus Equino Anemia infecciosa Equina

Lentivirus Felino Virus de la inmunodeficiencia FelinaLentivirus del Puma 14Lentivirus de Pantera

LentivirusOvino/Caprino Virus de la ArtritisEncefalitis Caprina (VAEC)Lentivurs caprino BrasileñoLentivirus caprinoVirus VisnaVirus Maedi-Visna (VMV)Virus Maedi-Visna EV-1Virus Maedi-Visna SA-OMVVLentivirus OvinoLentivirus de los pequeños rumiantes (SRLV)

Lentivirus de Primates Virus de la inmunodeficienciahumanaRetrovirus del Simio SRV-2Virus de la inmunodeficienciadel Simio-Humano

SpumavirusRetrovirus Tipo D

PUBMED. Taxonomía

Los virus ARN en general y en particular los lentivirus son virus muy variables ya quesu ARN Polimerasa tiene un alto porcentaje de error y no presentan un corrector de error[165]. Las distintas cepas de Maedi-Visna (MV) y Artritis Encefalitis Caprina (AEC), se hanenglobado y denominado “lentivirus de los pequeños rumiantes” (LVPR) (Figura 2.1)

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Querat y col. (1984) clasificaron a los LVPR en base a sus propiedades estructurales,genéticas y de replicación en dos tipos. El tipo I o virus con composición de proteínas simi-lares al VMV, tienden a ser altamente citopáticos, causando lisis en cultivos celulares, alta-mente patogénicos in vivo y además inducen la producción de anticuerpos neutralizantes. Eltipo II o virus con composición de proteínas similares al VAEC no producen citolisis, oca-sionan infecciones persistentes en cultivos celulares, exhiben baja patogenicidad en animalesinfectados y no inducen la formación de anticuerpos neutralizantes [178].

2.1.1. Morfología de la partícula viral

Los lentivirus se componen aproximadamente de 60% de proteína, 35% de lípidos,3% de carbohidratos y 1% de ARN [173]. Los viriones son envueltos, con un diámetro de80-130 nm. El genoma se encuentra en el interior de la nucleocápside (NC) y presenta trans-criptasa inversa (TR). La cápside (CA) se encuentra rodeada por una capa de proteína de ma-triz (MA). Además, el virión presenta una envoltura externa (SU) compuesta por una bicapade lípidos que contiene la proteína transmembranal (TM) [43, 155, 173].

El genoma de doble cadena de ARN, contiene tres genes estructurales y cada uno co-difica para dos o más proteínas:

1. El gen gag (Antígeno Específico de Grupo) codifica 3 proteínas: La CA (p25), la NC(p14) y la MA (p17) que estimula una fuerte respuesta de anticuerpos durante la in-fección [173, 192].

2. El gen pol (Polimerasa ) codifica la TR, la enzima dUTPasa, necesaria para la in-fección en macrófagos [169], la Integrasa (IN) que facilita la integración del provi-rus en el genoma de la célula [155, 169] y la Proteasa (PR) que es esencial para lainfectividad y maduración del VMV [169].


34

VIH-2

VIS smm

VIS syk

VIH-1

VIS cpz

VIS agm

VIS mnd

VMV

VAEC

VIF

I

II

III

IV

V

VAIE

VIB

Retroviridae

Fields Virology 1996

Figura 2.1. Familia retroviridae

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 34

3. El gen env (Envoltura), codifica las glicoproteínas, la TM, la SU que contiene losepítopos reconocidos por los anticuerpos neutralizantes y que sirven para la inte-racción del virus con el receptor de la célula hospedadora [43, 155, 173].

Los LVPR presentan tres genes accesorios:

1. vif (Factor de Infectividad Viral), es el único gen accesorio conservado en el geno-ma de los LVPR que induce una débil respuesta inmune in vivo. El gen vif se re-quiere para una eficiente replicación y patogenicidad del virus in vivo [100, 101,155, 173, 192].

2. tat, previene la terminación prematura de la transcripción incrementando la expre-sión génica viral in vivo [112, 155, 173, 192].

3. rev (Regulador de la expresión de proteínas del Virión) [101]. Codifica una proteí-na que está involucrada en los empalmes (“splicing”) de los transcriptos de ARN vi-ral. El gen rev es bipartito y se localiza en una pequeña región de la extremidad 5’del gen env y una región más grande en la región 3’ del mismo gen [46, 155, 173,192] (Figura 2.2)


35

Figura 2.2. Ubicación de los genes de los Lentivirus de los Pequeños Rumiantes

2.1.2. Ciclo de replicación viral

2.1.2.1. Entrada del virus en la célula hospedadora

El virus entra en la célula hospedadora (monocitos/macrófagos y células tipo fibro-blásticas) por los mecanismos de fusión o endocitosis mediados por los receptores glicopro-teicos de la envoltura viral (gp135, SU) [173], que se unen a los receptores específicos pre-sentes en la superficie de la célula hospedadora.

Actualmente se conoce poco acerca del origen de los receptores celulares a los que seunen los LVPR (VMV y VAEC). En 1991 Dalziel y col. propusieron que el receptor prove-

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 35

nía del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II [63]. Crane y col. (1991) pre-sentaron dos proteínas de 15 y 45 kDa, que se identificaron como proteínas asociadas a mem-brana pero que no pertenecían al CMH [49]. Lyall y col. (2000) describen el receptor comoun componente proteínico presente en la superficie celular [149]. Sin embargo, varios auto-res defienden que el VAEC y el VMV utilizan receptores celulares diferentes [31, 105, 111](Figura 2.4).

2.1.2.2. Transcripción

En el momento en que el virus penetra en el citoplasma de la célula hospedadora y selibera de su envoltura, comienza la retrotranscripción del ARN viral a una doble cadena deADN que permanece dentro de la nucleocápside.

La transcripción es modulada por la unión de ciertas proteínas reguladoras como tat yrev. En la región U5 hay un sitio de unión inicial con una secuencia complementaria a la se-cuencia 3’ del ARNt. Estos sitios marcan el comienzo de la síntesis de la cadena negativa deADN viral, que servirá de molde para la síntesis posterior de la cadena complementariade ADN. La síntesis de la cadena negativa de ADN viral se inicia en dos secuencias ricas enpurinas, también llamadas Polipurinas (PP) [173, 192] (Figura 2.4).

2.1.2.3. Integración

Al finalizar la síntesis de la doble cadena de ADN, éste es transportado por las proteí-nas de la nucleocápside al núcleo de la célula. Este ADN lineal es integrado en el ADN delhospedador con ayuda de la integrasa viral. Una vez integrado en monocitos la replicacióndel virus no comenzará hasta que los monocitos maduren a macrófagos [157] (Figura 2.4).

2.1.2.4. Expresión

La expresión del ADN viral se produce en dos pasos (i) la transcripción de ADN enARN y (ii) la traducción y síntesis proteínica.

La transcripción del ADN a ARN se produce cuando la caja TATA es reconocida por laPolimerasa II del ARN celular [173]. La extremidad 5’ del ARN viral comienza con una re-gión llamada R seguida por una secuencia única llamada U5, mientras que en la extremidad3’ hay una única secuencia U3 seguida por una región R. Esta región contiene la señal y el si-tio de unión de una Poli-A final, característica del ARNm de las células eucariotas. De estamanera la organización general de la molécula de ARN viral es R-U5-gag-pol-env-U3-RA-AAA.... [119, 192]. Al finalizar este proceso se habrá generado el ARN genómico y el ARNmnecesarios para la síntesis del ARN viral y de las proteínas virales [34, 46, 173] (Figura 2.3).


36

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 36

2.1.2.5. Síntesis, Ensamblaje y Maduración

La síntesis de las proteínas virales se produce una vez sintetizado el ARN viral y a par-tir de 2 ARNm distintos: (i) Un ARNm de 35s que codifica para los precursores de las proteí-nas gag y pol, (ii) Un ARNm de 25s que codifica para el precursor de la proteína env. Cadaprecursor se sintetiza en dos lugares distintos de la célula huésped. El precursor de la proteínaenv entra a la cisterna del retículo endoplásmico durante la síntesis y es llevada al complejo deGolgi donde es glicosilada tras lo cual es transportada a la membrana plasmática. El precursorde las proteínas gag y pol se sintetiza en los polirribosomas libres del citoplasma celular, siguela misma ruta glicosilándose y alcanzando la membrana plasmática. Junto con el ARN viral,los precursores de gag, pol y env comienzan el ensamblaje de la nucleocápside en la parte in-terna de la membrana plasmática. Posteriormente se da la gemación con la unión de la nucle-ocápside a proteínas env ya fijadas como peplómeros en la membrana plasmática [155, 173].


37

U3 R U5

Región Moduladora

Región aumentadora

Promotor

Transcripción

Genes Virales

DNA Cromosomal

Sitio

SP-1Caja

TATA

Figura 2.3. Estructura de la LTR.

Figura 2.4. Replicación Retroviral

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 37

Los precursores proteínicos son lisados post-transcripcionalmente por una proteasa vi-ral obteniendo así proteínas virales maduras [155] (Figura 2.4).

2.1.3. Implicaciones de la replicación viral en la variabilidad de los LVPR

Como ya se ha mencionado la replicación de los retrovirus se acompaña por una alta fre-cuencia de mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. Se estima que en cada ciclo de re-plicación ocurren alrededor de 3x10-5 mutaciones lo cual sugiere que la enzima TR sufre erro-res frecuentes [155]. Los sitios de mutación no se distribuyen de modo totalmente aleatorio,son menos frecuentes en los genes gag, pol y partes del gen env, mientras que las zonas del genenv que codifican los lugares de unión de los anticuerpos, son altamente variables [155, 173].

Hay también una alta frecuencia de recombinaciones entre genomas de retrovirus en cé-lulas doblemente infectadas. La recombinación es un evento temprano que ocurre antes de laintegración, durante la TR para formar ADN viral. Juntas la frecuencias de mutaciones y re-combinaciones en VMV exceden por mucho cualquier otro virus animal [155].

El concepto de “quasi” especies viral fue propuesto por Manfred Eigen y se define como“una población compleja que se perpetúa por sí misma formada por diversas entidades que ac-túan como un todo”. El factor por lo que los virus ARN en general y los lentivirus en particularexisten como quasi-especies es atribuido al hecho de que poseen polimerasas de ARN que tie-nen intrínsicamente altos porcentajes de errores y un deficiente mecanismo de corrección. Elporcentaje de error de la polimerasa del ARN viral es directamente responsable del tamaño e in-tegridad de la quasi especie; un porcentaje de error bajo está asociado con una “quasi” especieque ocupa volúmenes pequeños de espacio secuencial. Por otro lado un porcentaje de error altoresulta en una “quasi” especie que ocupa grandes volúmenes de espacio secuencial [155].

Se sabe que el tipo de virus que infecta originalmente persiste en el animal coexistien-do con las nuevas variantes y que la progresión de la enfermedad no está ligada con la apari-ción de nuevas variantes. El virus de VAEC presenta considerable variación de cepas [77,155, 165].

Esta variabilidad no es sólo un instrumento del lentivirus para evadir la respuesta inmu-ne del hospedador y facilitar la persistencia de la infección sino que también podría estar invo-lucrado en la habilidad de estos virus de cruzar la barrera de especie y de mostrar capacidadespatogénicas distintas. Este fenómeno tiene obvias implicaciones para el diseño de las pruebasde diagnóstico, desarrollo de vacunas y drogas para el control de la enfermedad [155, 165].

2.1.4. Tropismo viral

Las células blanco del VMV son preferentemente de la línea celular monocito/macró-fago [35, 86, 87, 189] y el virus también es capaz de infectar otras células incluidas las célu-las dendríticas y epiteliales. Tanto las células dendríticas como los monocitos son las células


38

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encargadas de transportar a los lentivirus por sangre y linfa a los tejidos diana. [93]. Sin em-bargo, el virus no comienza su replicación hasta el momento en que los monocitos madurana macrófagos en los tejidos, aprovechando para su replicación los mecanismos de replicaciónpropios de estas células [156]. La ausencia de replicación en sangre y linfa se supone rela-cionada con la capacidad del virus de eludir en muchos casos una respuesta inmune celular yhumoral temprana [35, 87, 168].

Los órganos blancos afectados por los LVPR son los pulmones, glándulas mamarias,articulaciones y sistema nervioso central (SNC) [24, 29, 146, 159]. Por otro lado aunque lainfección productiva es en células de la línea monocito/macrófago in vitro los LVPR son ca-paces de infectar gran variedad de células como se explica en el apartado de diagnóstico porcultivo celular.

2.2. RESPUESTA INMUNE

La infección por los LVPR, estimula en el hospedador una respuesta inmune mediadapor anticuerpos y células que no es capaz de acabar con la infección y que mantiene a los ani-males persistentemente infectados. La duración de la infección es larga, de varios años en lamayoría de los casos y se distinguen varias fases cronológicas. Tras la infección existe un pe-riodo largo asintomático en el que la carga viral es baja, seguido de un periodo sintomáticorelativamente corto antes de producirse la muerte [6, 169]. (Figura 2.5).


39

Infección

Seroconversión

Latencia

Inicio de Lesiones

Síntomas clínicos

Génesis Lesional

Muerte

Figura 2.5. Patogenia

2.2.1. Respuesta inmune humoral

Los anticuerpos (Ac) presentes en la infección por LVPR son de tipo precipitantes(Acp) y neutralizantes (Acn) [97]. Los primeros Anticuerpos en aparecer ya sea por una in-fección natural o experimental son los Acp.

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 39

En estudios experimentales, la detección de estos anticuerpos fue entre las semanas 1 y8,5 post infección. Los anticuerpos neutralizantes se detectaron más tarde, entre 1 y 5 mesespost-infección y son específicos de cepa. [25, 67, 207]. Klein y col. (1985) demuestran quelos aislados altamente citolíticos producen una mayor respuesta inmunológica a Acn que lascepas poco citolíticas. [126].

Las razones por las que los Acn son inefectivos para eliminar la enfermedad pueden servarias. Por un lado la capacidad de mutación del virus que implica la aparición de variantesantigénicas que no reconocen los Acn [169], además la afinidad del virus por los macrófagoses mayor que la afinidad entre el virus y los anticuerpos [122] y algunos epítopos de neutra-lización podrían ser “secuestrados” por moléculas de carbohidratos y pasar desapercibidos alsistema inmune del hospedador [16, 17].

La respuesta inmune se desarrolla principalmente frente a las proteínas virales p25,gp105, p16 y p14 [118] y la infección por VMV produce Acn restringidos a la subclase IgG

1.

De este modo Bird y col. (1995) demostraron mediante Western Blot una nula presencia deanticuerpos de la subclase IgG

2tras la infección [21]. Esta deficiencia en IgG

2limitaría la ca-

pacidad de opsonización y fagocitosis de las partículas virales [24].

2.2.2. Respuesta inmune celular

La respuesta inmune celular se presenta entre 1 y 4 semanas post infección y vuelve alos niveles basales de 4 a 12 semanas después [95, 133, 207].

En infecciones por VMV, se invierte la relación de linfocitos CD4+/CD8+ aumentandoel porcentaje de linfocitos T CD8+, que facilitan el control de la carga viral eliminando célu-las infectadas y produciendo citoquinas inhibidoras [16, 22, 33]. La producción de factoresquimiotácticos estimula la migración de linfocitos y neutrófilos a los órganos diana provo-cando las lesiones características del VMV [6]. La infección por LVPR causa una alteraciónen la producción de interleucinas y sustancias quimiotácticas para monocitos (MCP-1) [135,241]. Así, aumenta sobre todo la producción de interleucina 8 (IL-8), que se produce en ma-yor grado por los macrófagos alveolares de animales infectados, y que es responsable de atra-er linfocitos y neutrófilos al tejido infectado provocando por ejemplo la alveolitis caracterís-tica del MV [32, 138, 169]. Por otro lado, en animales sintomáticos los niveles deinterleucina-2 (IL-2) disminuyen y también la expresión de receptores de la IL-2 en linfoci-tos T CD8+ [20, 35, 74, 139]. Además se ha observado que en infecciones por VAEC se in-crementa la expresión de interleucina 16 (IL-16) en los PBMC y en células de membrana si-novial, fluido sinovial, suero y sobrenadante de cultivos de células mononucleares de sangreperiférica [200]. Además Craig y col. (1997) observaron un aumento del factor de necrosistumoral alpha (TNF-α) en infecciones de LVPR cuya función es regular la expresión de otrascitoquinas como la interleucina-1 (IL-1) y la interleucina-6 (IL-6), la actividad de los macró-fagos y la expresión de moléculas de adhesión de las células endoteliales [48]. En ese mismoaño Woodall y col. (1997) utilizando una cepa con tropismo respiratorio, no detectaron alte-raciones en los niveles de TNF-α por lo que no toda la red de citocinas es afectada [235].


40

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 40

2.2.3. Inmunidad pasiva

No hay una transferencia prenatal eficiente de inmunoglobulinas entre la oveja y el cor-dero ya que la placenta es de tipo sindesmocorial. Por ello la glándula mamaria de los pe-queños rumiantes ha asumido el papel de transferir la inmunidad pasiva de la madre a la cría[166].

Durante las últimas dos a tres semanas de gestación la glándula mamaria acumula unagran cantidad de calostro rico en inmunoglobulinas disponible para la cría inmediatamentedespués del nacimiento. El mecanismo del transporte de inmunoglobulinas de la sangre ma-terna a la glándula mamaria es selectivo específicamente para las inmunoglobulinas IgG

1. Es-

tas moléculas, se unen por medio de su fracción FC a la membrana intracelular de las célulasepiteliales de los acinis, por pinocitosis pasan al interior del citoplasma donde por pinocito-sis inversa salen al lúmen de los alvéolos [166].

Después de la ingestión del calostro, y tras haber pasado por la gotera esofágica, la ca-seína es almacenada en el abomaso y el suero rico en IgG

1 pasa al intestino delgado. Los an-

ticuerpos son absorbidos y pasan a la circulación fetal por células epiteliales inmaduras quepermiten la transferencia de éstas. Este proceso continúa durante las primeras 32 horas devida hasta que las células inmaduras se reemplazan por células maduras incapaces de seguirpermitiendo el paso de las macromoléculas [166].

La glándula mamaria se encuentra fuertemente infiltrada por linfocitos y macrófagosdurante el proceso de calostrogénesis, la mayoría de los linfocitos presentes son CD8+ yCD5- [166].

El periodo de protección inmunitaria conferida depende directamente de la concentra-ción de anticuerpos específicos en el calostro, el volumen de calostro ingerido por la cría y lavida media de la inmunoglobulina circulante. La duración de la inmunidad pasiva, general-mente se encuentra entre 6 semanas y 6 meses [166].

2.2.3.1. Inmunidad en el neonato

Después de que los corderos hayan ingerido calostro, la concentración de anticuerposIgG

1, IgG

2, IgM e IgA en suero aumenta considerablemente y es la IgG

1 la que se encuentra en

mayor cantidad. A partir del día 16 después del nacimiento hasta el día 32 las concentracionesde anticuerpos se mantienen estables o aumentan, indicando un balance entre el catabolismo yla producción endógena de inmunoglobulinas por parte de los pequeños rumiantes [166].

2.2.3.1.1. Sistema inmune neonatal

Los órganos linfoides secundarios y el timo se desarrollan fundamentalmente antes delnacimiento pero la placenta evita que el sistema inmune neonatal tenga relación con antíge-


41

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 41

nos exógenos e inmunoglobulinas. Los linfocitos predominantes en el feto son las células Tque empiezan a circular a partir del día 72 de gestación, los CD8, CD4 y células T γ δ de lamadre también se encuentran circulando en el feto [166].

La placa de Peyer ileocecal es el lugar donde se produce la linfopoyesis y es la fuenteprincipal de las células B en la oveja. Aparecen a partir del día 75 de gestación y al día 120se encuentran completamente maduras. Durante los 10 primeros días después del nacimien-to, el 90% de los linfocitos son reemplazados [166].

2.3. CUADRO CLÍNICO Y LESIONES

Los ovinos pueden estar infectados con el VMV durante toda su vida sin presentar sin-tomatología y la aparición de síntomas coincide a menudo con infecciones secundarias bac-terianas, cambios en la alimentación y situaciones de estrés incluidas las fisiológicas como lagestación, el parto y la lactación [57, 202].

Lo más común es que los signos clínicos se presenten en animales mayores de dos años[65]. El VMV puede provocar lesiones multisistémicas y las cuatro formas clínicas puedenaparecer de forma individual o mixta [57]. La forma pulmonar (Maedi) es la más común conpresencia de neumonía intersticial crónica; La forma nerviosa (Visna) cursa con meningoen-cefalomielitis y coroiditis no purulenta [56,156,203], la forma mamaria se presenta como unamamitis intersticial; la última manifestación clínica y menos frecuente es la forma articularque cursa con artritis de carácter crónico no supurativo [148].

2.3.1. Forma pulmonar

La forma respiratoria (Maedi) tiene un periodo de incubación prolongado que puededurar de meses a varios años, siendo los tres a cuatro años de vida la edad en la que más fre-cuentemente aparece [57, 65]. El primer signo que se puede apreciar es una pérdida progre-siva de peso que puede conducir finalmente a la caquexia sin que se observe anorexia. El sig-no más característico es la disnea, con aumento en la frecuencia respiratoria, respiraciónabdominal, extensión del cuello, dilatación de ollares y jadeo. A consecuencia de la insufi-ciencia respiratoria, se desarrolla intolerancia al ejercicio que provoca el retraso en la marcha[148]. En ocasiones, probablemente a causa de infecciones secundarias, se ha descrito la exis-tencia de tos seca con poca o nula descarga nasal [65, 146, 233]. El animal permanece alertay sólo presenta fiebre si hay infecciones secundarias [156]. A medida que evoluciona la en-fermedad, las ovejas permanecen cada vez más tiempo postradas hasta morir a causa de in-suficiencia respiratoria [65, 146]. La muerte es inevitable, sin producirse la recuperación clí-nica una vez que aparecen los síntomas [65].

Las lesiones macroscópicas consisten en un aumento del peso y del volumen de lospulmones que no se colapsan al abrir la cavidad torácica y en los que a veces se detectan


42

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impresiones costales. Es característica la aparición de un fino punteado grisáceo subpleu-ral de hasta 1,5 mm de diámetro que afecta de forma difusa a todo el órgano [12]. Los bor-des pulmonares, en especial los dorsales, se redondean, la consistencia es gomosa, homo-géneamente firme y poco elástica [12, 146, 161]. El parénquima adopta una coloraciónaclarada, y la superficie de sección es seca, sin producción de exudado salvo en los casosen que haya infecciones bacterianas asociadas. Los nódulos linfáticos mediastínicos y tra-queobronquiales aparecen aumentados de tamaño y presentan coloración blanquecina [73,90, 180].

Microscópicamente las lesiones pulmonares típicas son una neumonía intersticial e hi-perplasia linfoide difusa. Se observa engrosamiento de los septos interalveolares con infiltra-ción de células mononucleares, hiperplasia de las células de músculo liso y fibrosis [158]. Sedesarrollan folículos linfoides perivasculares, en torno a vías respiratorias, o dispersos en elparénquima, en ocasiones con centros germinales [12, 218]. En los nódulos linfáticos me-diastínicos y traqueobronquiales se observa una hiperplasia de las áreas corticales y paracor-ticales [53, 73, 90, 173, 180, 218].

2.3.2. Forma nerviosa

La forma nerviosa (Visna) se presenta generalmente en animales mayores de dos años[53, 65, 156, 160, 174] aunque el periodo de incubación tiende a ser menor que en Maedi [65]y el curso clínico se prolonga desde unas semanas hasta un año. Las ovejas presentan retrasoen la marcha e incapacidad para seguir al rebaño a causa de incoordinación en el movimien-to. Esta inestabilidad provoca caídas múltiples y se agrava hasta llegar a producir parálisis delas extremidades posteriores y, con el tiempo, incluso las anteriores, hasta culminar con lapostración del animal. Al igual que ocurre en la presentación respiratoria de la enfermedad elanimal se encuentra alerta, responde ante estímulos externos, no presenta fiebre ni disminu-ye su consumo de alimento [65, 156]

Las lesiones macroscópicas en encéfalo y en médula espinal no son frecuentes [199],sin embargo, de estar presentes, aparecen como áreas grisáceas de malacia en la sustanciablanca periventricular principalmente en cuerpo calloso, fornix, corteza frontotemporal y enel hipocampo. En ocasiones puede llegar a apreciarse un engrosamiento granular de los ple-xos coroideos y opacidad de las meninges. En la médula espinal las lesiones pueden adoptarforma de cuña con su base en las meninges o localizarse alrededor del conducto ependima-rio. A nivel microscópico se aprecia una encefalomielitis no purulenta desmielinizante cróni-ca. Las lesiones se distribuyen fundamentalmente en torno al sistema ventricular del encéfa-lo. Las características más sobresalientes son la aparición de manguitos perivasculares,desmielinización (secundaria) y malacia. La respuesta inflamatoria consiste en una gliosis einfiltración de células plasmáticas, linfocitos y macrófagos [12, 65, 146, 148, 156]. En losplexos coroideos, además de una coroiditis no purulenta, puede llegar a observarse la apari-ción de folículos linfoides con centros germinativos [221].


43

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2.3.3. Forma mamaria

Por lo general la forma mamaria de la enfermedad se observa en animales de entretres y cinco años aunque en algunos casos puede reconocerse desde el año de vida [109,227]. Si el proceso es únicamente mamario el curso clínico es prolongado ya que no sue-le causar la muerte del animal [148]. Algunos autores señalan que la glándula mamaria esmás susceptible al virus que otros órganos [216] y que dependiendo de la raza puede serel órgano más afectado [146]. El signo clínico más evidente es la presencia de una masti-tis indurativa difusa, bilateral, crónica, no dolorosa que se acompaña de un aumento de ta-maño de los nódulos linfáticos retromamarios [146]. Las lesiones provocan una disminu-ción en la producción de leche [227] que puede evolucionar hasta agalaxia [146].Macroscópicamente en la glándula mamaria se observa aumento de tamaño y consisten-cia. La superficie de corte presenta un aspecto húmedo, liso y con pérdida del aspectoglandular [227]. La lesión microscópica característica es la presencia de una mastitis in-tersticial crónica con hiperplasia de folículos linfoides (con centros germinales activos).La inflamación afecta al parénquima glandular y a los conductos galactóforos. En el pri-mero se produce una infiltración difusa por linfocitos, macrófagos y plasmocitos que pue-den llegar a reemplazar los acini. En torno a los conductos galactóforos se desarrolla unahiperplasia de folículos linfoides que protruyen hacia la luz provocando la obstrucción to-tal o parcial de los conductos dando lugar a atrofia y desaparición del tejido alveolar [88].Este proceso se acompaña de fibrosis que contribuye a la estenosis ductal [12]. En los nó-dulos linfáticos retromamarios, al igual que en los mediastínicos, se observa una hiper-plasia linfoide [173].

2.3.4. Forma articular

Esta forma de presentación es infrecuente y se describe sobre todo en ovejas mayoresde dos años y la manifestación clínica más evidente es la cojera y marcha envarada [58, 148,156, 161]. A nivel macroscópico las articulaciones más afectadas son carpo, tarso y bolsaatlantal. En estas localizaciones puede apreciarse engrosamiento y congestión de las mem-branas sinoviales y de la cápsula articular. El cartílago articular puede presentar erosionesen los casos avanzados. La cantidad de líquido sinovial está aumentada, en ocasiones con fi-brina. Los tejidos periarticulares pueden verse afectados con fibrosis, hemorragias pete-quiales especialmente en tendones, destrucción del hueso articular y mineralización [58,88].

Microscópicamente la lesión consiste en una sinovitis proliferativa crónica. Se puedeapreciar una hiperplasia de la membrana sinovial con infiltración perivascular de macrófagos,linfocitos, células plasmáticas, y en ocasiones formación de folículos linfoides. En casosavanzados las lesiones son más degenerativas que inflamatorias. Las lesiones se extienden alas estructuras periarticulares en las que se puede observar fibrosis, focos de necrosis y calci-ficación [58].


44

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 44

2.4. DIAGNÓSTICO

2.4.1. Diagnóstico de la enfermedad

2.4.1.1. Diagnóstico Clínico- Lesional

El diagnóstico mediante examen clínico de animales afectados de VMV puede ser útilen animales en fase sintomática. A continuación se describen los síntomas clínicos más des-tacables en las distintas formas clínicas de infección por VMV.

2.4.1.1.1. Forma Pulmonar

El diagnóstico clínico, se realiza comúnmente en animales mayores de tres o más añosde edad [146]. Los síntomas son intolerancia al ejercicio, fatiga respiratoria y retraso en lamarcha. Aumenta la frecuencia respiratoria, hay presencia de respiración abdominal con ex-tensión del cuello, dilatación de ollares y jadeo, poca presencia de tos y de flujo nasal [65,146, 233]. El animal permanece alerta sin fiebre al menos que existan infecciones bacteria-nas secundarias [156]. La muerte es inevitable y no se produce la recuperación después de laaparición de los signos [65].

2.4.1.1.2. Forma Mamaria

Los signos clínicos pueden aparecer a partir del año y medio de edad con mamitis indu-rativa no dolorosa y con aumento de tamaño de los nódulos linfáticos retromamarios [146]. Sepuede presentar disminución de la producción de leche hasta llegar a una agalaxia [146, 227].

2.4.1.1.3. Forma Nerviosa

Aparece en animales mayores a dos años [53, 66, 156]. Las ovejas muestran retraso enla marcha a causa de incoordinación en el movimiento e inestabilidad que provocan caídasmúltiples, llegando incluso a producirse la parálisis de las extremidades posteriores y ante-riores. El animal se encuentra siempre alerta y responde a estímulos externos, no se observancambios en el consumo del alimento [66, 156].

2.4.1.1.4. Forma Articular

Se presenta en ovejas mayores de dos años y clínicamente se caracteriza por la apari-ción de cojera, engrosamiento de las articulaciones, sobre todo las del carpo y tarso y adel-gazamiento crónico [53, 156, 161].


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2.4.1.2. Diagnóstico Diferencial

2.4.1.2.1. Forma Pulmonar

1) Adenocarcinoma Pulmonar Ovino (APO)

El Adenocarcinoma Pulmonar Ovino está asociado etiológicamente con un Betaretro-virus [155]. El proceso se presenta en animales adultos a partir de los dos años de vida y lapresentación clásica de la APO se caracteriza por presencia de fluido en el tracto respiratorio,tos, disnea progresiva y pérdida de condición corporal [146]. En el examen post mortem seobserva que la lesión es focal y consiste en áreas tumorales de color blanquecino-grisáceo dediferente extensión y en donde la estructura normal del tejido pulmonar se pierde por la trans-formación tumoral. El desenlace de esta enfermedad, como en el Maedi, es fatal [146]. A me-nudo coexisten ambas enfermedades en el mismo animal [92].

2) Neumonía Atípica

Hay numerosos agentes implicados en el desarrollo de esta enfermedad. Principalmen-te intervienen Mycoplasma ovipneumoniae y Mannheimia haemolytica y menos constante-mente pueden estar implicados otros agentes. Se afectan generalmente animales jóvenes quesufren de forma frecuentemente subclínica una neumonía broncointersticial en las áreas cra-neoventrales pulmonares quedando el resto del parénquima sin afectar. Macroscópicamentelas zonas consolidadas presentan una tonalidad entre grisácea y rojiza. Las vías respiratoriascontienen una secreción de mucosa a purulenta [92].

3) Neumonía Enzoótica

Causada por Mannheimia haemolytica, a diferencia del Maedi suele afectar a ovejas detodas las edades con curso agudo o sobreagudo. Los animales presentan fiebre, tos y descar-ga nasal. La lesión pulmonar consiste en una neumonía aguda fibrinosa con focos de necro-sis que afecta a las áreas craneoventrales aunque, cuando el curso de la enfermedad se alar-ga, puede dar lugar también a una pleuritis fibrosa [92, 146]. A nivel microscópico escaracterística la presencia de leucocitos con morfología ahusada en los alvéolos y que son co-múnmente denominados células en grano de avena o “oat shaped” [114].

4) Neumonías Parasitarias

Principalmente se encuentran implicadas tres especies de nematodos, Dictyocaulus fi-laria, Protostrongylus rufescens y Muellerius capillaris. Los animales pueden encontrarseafectados a partir de los dos meses de edad [146]. La aparición de signos clínicos depende dela edad y del grado de parasitación, pudiendo dar lugar a tos, secreción nasal mucosa o mu-


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copurulenta y pérdida de peso corporal. En la necropsia se aprecia una lesión focal que con-siste en la presencia de placas grisáceo-verdosas o de atelectasia en las zonas dorsocaudalesdel pulmón. A nivel microscópico hay neumonía granulomatosa asociada a diferentes faseslarvarias y organismos adultos del parásito e hiperplasia de musculatura lisa. [12, 146, 233].

5) Pseudotuberculosis Pulmonar

Es una infección producida por Corynebacterium pseudotuberculosis que puede cursarcomo una enfermedad respiratoria crónica cuyo signo clínico más evidente es la presencia dedisnea intensa y adelgazamiento crónico del animal. La principal lesión asociada a esta en-fermedad es una linfadenitis caseosa que, cuando afecta a los nódulos linfáticos mediastíni-cos y bronquiales, puede diseminarse al pulmón, originando así focos de necrosis caseosa enel parénquima pulmonar [27].

2.4.1.2.2. Forma Mamaria

1) Agalaxia Contagiosa

Afección producida por Mycoplasma agalactiae puede cursar de forma aguda o cróni-ca. La enfermedad se asocia a tres presentaciones clínicas que incluyen mamitis bilateral,queratoconjuntivitis y artritis, que no siempre se presentan de forma conjunta en un mismoanimal. Las características de la leche aparecen alteradas pudiendo evolucionar hacia unaagalaxia con desaparición de acinis y fibrosis. En ocasiones puede ser imprescindible recu-rrir al diagnóstico inmunológico o etiológico debido a la similitud que pueden presentar en elcuadro clínico y lesional con la forma mamaria del MV [12, 92].

2) Mastitis Bacterianas

Las mamitis bacterianas pueden ser originadas por diferentes agentes etiológicos comoStaphylococus aureus, Mannheimia haemolítica, o Escherichia colli entre otros. Los anima-les afectados pueden presentar fiebre y depresión. La glándula mamaria puede estar afectadaunilateralmente, presentando tumefacción y secreción láctea frecuentemente alterada y pue-de observarse presencia de pus y/o sangre [24, 78].

2.4.1.2.3. Forma Nerviosa

1) Scrapie

El Scrapie, enfermedad producida por un prion (PrPsc), afecta a animales de entre dos ycinco años, aunque se ha descrito el proceso en animales menores del año de vida [83]. El cur-


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so de esta afección es lento y se caracteriza por la existencia de hiperexcitabilidad, temblo-res, ataxia, prurito y pérdida de la condición corporal. La lesión sólo es apreciable microscó-picamente, se localiza principalmente en el tronco del encéfalo y consiste en una degenera-ción vacuolar de las neuronas y del neuropilo característica [78, 146].

2) Aujeszky

Esta enfermedad de etiología herpesviral tiene un curso agudo con una clínica caracteri-zada por un intenso prurito, incoordinación, ataxia, postración y muerte. Macroscópicamente sepuede apreciar congestión en el encéfalo, pulmón y nódulos linfáticos preescapulares. Histoló-gicamente se aprecia congestión, hemorragias y desmielinización. En algunos de los casos seobservan diferentes grados de meningoencefalomielitis no supurativa que puede variar de difu-sa a focal con presencia de manguitos perivasculares, gliosis y necrosis neuronal [221].

3) Cenurosis

El agente etiológico es una larva parasitaria, Coenurus cerebralis, que provoca lesionestraumáticas en su migración a través del encéfalo y compresión del parénquima nervioso aldesarrollarse la vesícula. Microscópicamente en el infiltrado inflamatorio pueden observarseeosinófilos.

Afecta principalmente a uno de los hemisferios cerebrales, provocando ceguera. Losanimales caminan en círculos en el mismo sentido que las lesiones cerebrales [78, 146].

4) Listeriosis

Causada por una bacteria, Listeria monocytogenes, que se encuentra en ensilados pre-parados en condiciones inadecuadas o contaminados con tierra. El curso de la enfermedad esagudo y se afectan animales de cualquier edad. Los síntomas son parálisis facial, apatía, pér-dida del equilibrio, movimientos en círculos, movimiento de lado a lado de la cabeza, nistag-mo, movimiento anormal de ambos ojos, temblor labial y sialorrea. A nivel microscópico lalesión se localiza en el tronco del encéfalo y consiste en una meningoencefalitis purulenta conmicroabscesos y manguitos [13, 78, 146].

5) Louping-ill

Es una infección causada por un virus del género Flavivirus que se transmite por me-dio de garrapatas. La enfermedad afecta al sistema nervioso central de entre otras especies laovina. Cursa de forma aguda, afectando principalmente a animales jóvenes (corderas y pri-malas) como un proceso febril y con síntomas nerviosos como ataxia, parálisis del tercio pos-terior, estado comatoso y muerte. Las lesiones sólo son detectables a nivel microscópico y


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consisten en una meningoencefalomielitis no purulenta con necrosis neuronal especialmentea nivel de tronco del encéfalo y médula espinal [92].

6) Intoxicación por falaris

Es una patología de origen tóxico provocada por el consumo de plantas del género Pha-laris. La enfermedad frecuentemente se presenta de forma aguda o crónica siendo menos co-mún la presentación sobreaguda. El cuadro clínico se caracteriza por problemas de incoordi-nación, debilidad, temblores musculares, hiperexcitabilidad y movimientos verticales de lacabeza de forma continua. Posteriormente se produce postración con rigidez espástica de lasextremidades. Macroscópicamente, al realizar secciones transversales del encéfalo, se llega aapreciar una coloración grisácea-verdosa principalmente en los cuerpos geniculados latera-les. A nivel microscópico se aprecia acúmulo de pigmento granular en el citoplasma de lasneuronas. Además hay gliosis, desmielinización y manguitos perivasculares [80].

2.4.1.2.4. Forma Articular

1) Agalaxia Contagiosa

La Agalaxia contagiosa provoca artritis no purulenta, especialmente en animales jóve-nes. Los síntomas pueden llegar a desaparecer con la administración de antibióticos. Al igualque ocurre en la forma mamaria de la enfermedad puede ser imprescindible recurrir al diag-nóstico inmunológico o etiológico debido a la similitud en el cuadro clínico y lesional con laforma artrítica del MV [13, 78, 146].

2) Otras Artritis Bacterianas

Bacterias como Brucella spp., Erisipelothrix rhusopatiae y Fusobacterium necropho-rum producen inflamaciones articulares frecuentemente de carácter purulento, que resulta encojera [13, 78, 146].

2.4.2. Diagnóstico de la infección

2.4.2.1. Diagnóstico Viral

2.4.2.1.1. Aislamiento Viral

El cultivo celular, es la técnica más utilizada para el aislamiento viral. Se basa en culti-var células provenientes de tejidos o fluidos, y presentarlos en forma de monocapa o suspen-sión, como células individuales, para su futura infección. Estas células están adaptadas a un


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medio artificial, se mantienen a 37°C, con medio de cultivo, suero fetal bovino (SFB) u ovi-no (SFO) y antibióticos [34]. Sigurdsson y col. (1960) describieron por primera vez el aisla-miento del VMV y el comportamiento viral in situ empleando cultivos celulares primarios deplexo coroideo ovino (PCO) [205].

El aislamiento viral de MV y AEC se ha llevado a cabo empleando una variedad de cul-tivos primarios y cultivos en línea. Cultivo primario de plexo coroideo ovino (PCO) [41, 47,99, 145, 185, 201, 205, 208, 236], explantes de pulmón [76, 201], células fetales de testículode macho cabrío [60], cultivos en línea de fibroblastos epidermales [136, 181, 191], cultivosprimarios de células de la microglía caprina [15], en células de la línea monocito-macrófago[136, 214], células de membrana sinovial de cabra (CMSC) [62, 102, 117, 131, 153, 179, 190,214], cultivos primarios de células de riñón ovino [47, 201], células de glándula mamaria ovi-no y caprino [141, 236], cultivos primarios de células epiteliales provenientes de leche de ca-bra [153], cultivos de células del endotelio aórtico de ovino [140], cultivos primarios de cé-lulas de la granulosa [131] cultivos primarios de células epiteliales del oviducto caprino[131], cultivos de células corneales [27, 29, 58, 123]. Da Silva y col. inmortalizaron una lí-nea de fibroblastos caprinos con el fin de utilizarlos para el diagnóstico de los LVPR [59].

El tiempo de infección celular varía de semanas a meses, dependiendo de la adaptacióndel virus a condiciones de laboratorio, dosis infectiva, diversidad de la cepa y la virulencia[205], la presencia de efectos citopáticos (EC) requiere de más de 2 a 3 pases para que se pue-dan apreciar debido a su replicación lenta [170]. Los EC que se pueden percibir tanto en cul-tivos primarios como en cultivos en línea son: la morfología celular se vuelve de forma cir-cular y filiforme, cambios de color a grisáceo en el protoplasma, sin la presencia degranulocitos [173, 205]. El EC más característico en los LVPR es la formación de sincitios,generalmente de 5 a 30 núcleos por célula, al paso del tiempo, estas células gigantes mueren,se separan de la botella de cultivo y se liberan al medio [205]. Lamara y col. (2001) demos-traron un efecto citopático a partir de los 6 días post infección, mientras que Sihvonen y col.(1980) y Simard y col. (2001) manifestaron la presencia de EC a los 14 días, Sigurdardóttir(1964), Baszler (1994), Celer (1997) y Lerondelle (1999) han observado un EC a partir de los21 días post infección, Daltabuit y col. (1999) reporta un efecto citopático a partir de los6 meses post infección [15, 41, 62, 131, 141, 201, 208, 210].

Por otro lado, Mselli-lakhal y col. (1999) y Singh y col. (1999) confirman la presenciade infección y de producción viral, sin la presencia de sincitios [154, 214].

El uso frecuente del cultivo celular es la obtención de grandes cantidades de virus comoantígeno para las diferentes técnicas de diagnóstico como Western Blot, ELISA, Inmunodi-fusión y PCR, entre otras.

2.4.2.1.2. Microscopía Electrónica

Existen fundamentalmente 2 tipos de microscopios electrónicos, el microscopio detransmisión de electrones (“transmision electron microscope” TEM) y el microscopio


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de electrones por escáner (Scanning electron microscope SEM). En la investigación de es-tructura viral, la microscopía de transmisión de electrones es la técnica de elección, se llegaa obtener dos tipos de información: (i) el número absoluto de partículas virales presentes enuna preparación y (ii) presencia de la estructura viral [34]. Hoy en día la microscopía inmu-noelectrónica “immunoelectron microscopy” está ganando terreno como un método rápidopara el diagnóstico en muestras de tejido infectado [155].

Thormar (1961), describió las diferencias más aparentes entre cultivos celulares infecta-dos y no infectados de plexo coroideo de ovino: la presencia de pequeñas partículas circularesque tienden a agruparse [222]. Coward y col. (1970) presentaron información sobre la infec-ción de MV tanto en células de riñón de ovino y PCO, las células presentaron una forma alar-gada y presentación de viriones en gemación [47]. Mornex y col. (1994) encontraron presen-cia de partículas virales típicas a LVPR en cocultivos de lavados broncoalveolares [152]. Leey col. (1996) con la técnica TEM y la SEM, compararon la replicación viral del MV, cepa EV-1en macrófagos y en células epiteliales, encontrando presencia de viriones en vacuolas de ma-crófagos y partículas tipo A retrovirales intracitoplasmáticos en macrófagos [137].

2.4.2.1.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

El diagnóstico basado en la reacción en cadena de la polimerasa, se define por la espe-cificidad que se llegue a obtener entre la unión de los oligonucleótidos sintéticos y la se-cuencia diana. Utilizando una mezcla compleja de ácidos nucleicos y ADN Polimerasa ter-moestable, se produce una síntesis de ADN. Se lleva a cabo mediante un procesoautomatizado de múltiples ciclos de alineamiento, extensión y desnaturalización resultandoen una amplificación masiva de 2n órdenes de magnitud a partir de n ciclos de amplificaciónde la secuencia diana localizada entre los dos cebadores [34]. Existen variantes de la técnicatradicional de PCR para la detección de LVPR, la PCR anidada (PCR-n), consiste en la am-plificación de un producto obtenido a partir de un amplificado de una PCR anterior y la PCRsemianidada (PCR-sn) que emplea en la segunda PCR un cebador de los utilizados en la pri-mera PCR. Cuando el objetivo es detectar virus libre es necesario realizar una RT-PCR puri-ficando primero ARN y transcribiendo el ARN a ADN complementario (ADNc) utilizandouna enzima TR.

El éxito de la técnica de PCR, depende en gran medida de la elección del gen vírico y deldiseño correcto de los cebadores que deben de ser específicos del virus [165, 169, 185, 236].

La gran sensibilidad potencial de la PCR permite identificar animales infectados conpoca carga vírica. Además presenta la ventaja sobre los métodos serológicos de permitir ladetección de infección en animales con anticuerpos calostrales y en animales infectados queno hayan desarrollado anticuerpos frente a la infección. Esto último es un hecho relativa-mente frecuente en las infecciones por lentivirus y se denomina “latencia serológica” o“gap” serológico [43, 44, 182] y es responsable de falsos negativos en pruebas serológicas[113, 143].


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Durante los últimos años se han diseñado cebadores dirigidos a distintas regiones delgenoma viral del MV y de la AEC, incluidas las regiones LTR, gag, pol y env [2, 8, 14, 27,37, 39, 61, 79, 99, 113, 145, 165, 185, 230, 232, 236, 237].

En su trabajo Zanoni y col. (1992), diseñaron 3 parejas de cebadores dirigidos a distin-tos genes, los cebadores Gag y LTR se diseñaron en base al VMV Islándico y los cebadoresPol diseñados a partir del VAEC aislado por Crawford y col. (1980). Sólo la pareja de ceba-dores LTR amplificaron 6/6 muestras (100%), mientras que los cebadores Gag amplificaron5/6 (83%) y los cebadores Pol (VAEC) detectaron el 4/6 (67%). Los autores concluyeron quelas cepas de LVPR presentan gran variabilidad genética [236].

Por otra parte Rosati y col. (1995), analizaron cepas de VMV y VAEC de diferentes zo-nas geográficas con 4 pares de cebadores de las regiones LTR, env (proteína TM) y gag (pro-teínas p25 y p16) a partir de la cepa Islandesa K1514 de VMV. Los cebadores dirigidos a laregión LTR amplificaron 100% (9/9) de las muestras, los cebadores Gag (p25) amplificaron62,5% (5/8), los cebadores Env amplificaron 22.2% (2/9) y los cebadores Gag (p16) 11,1%(1/9). Los cebadores Env (TM) amplificaron una muestra más, al modificar la temperatura dehibridación. Rosati y col. también argumentaron que las diferencias de sensibilidad según loscebadores se deberían a la variabilidad genética entre las cepas de LVPR [185].

La posibilidad de detección precoz de la infección por VMV fue demostrada por Za-noni y col. (1990), empleando cebadores dirigidos al gen gag detectaron virus en célulasde plexo coroideo ovino a partir del día 1 post infección y efecto citopático 7 días después[237].

Daltabuit y col. (1999) desarrollaron una Gag-PCR con el fin de amplificar el VAECen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cabras seropositivas. Las PBMC,fueron cocultivados con células de membrana sinovial de cabra (CMSC), 6 meses despuésse visualizó efecto citopático al mismo tiempo que se detectó provirus por PCR [62]. Reddyy col. (1993) empleando cebadores dirigidos a las regiones gag y pol del CAEV-co, lleva-ron a cabo reacciones de PCR en muestras positivas y negativas de PBMC, células del flui-do sinovial de cabra (CFS) y células de leche (CL). Las PCR dirigidas a cabras seropositi-vas con cebadores Gag detectaron 18/20 PBMC-positivo, 8/8 CL-positivo y 5/5CFS-positivo. En cabras seronegativas la Gag-PCR detectó 3/33 PBMC-positivos, 0/8 CL-positivos y 0/5 CFS-positivos, dos de las cabras seronegativas y Gag-PCR positivos, sero-convirtieron 2 meses después [179].

Wagter y col. (1998) desarrollaron una Gag-PCR con seis cebadores de cepas MV ho-landesas, francesas, islandesas y suizas. Tras probar los cebadores en muestras de campo deanimales VMV-seropositivos y no infectados con el VMV, 1/9 animales del rebaño acredita-do como libre de VMV fue Gag-positivo y 53/60 (88%) de animales seropositivos fueronGag-positivos. Este último resultado podría indicar una baja sensibilidad de la PCR frente alensayo serológico. Por otro lado estos autores demostraron que la sensibilidad de la GAG-PCR incrementaba al aumentar el volumen de muestra de sangre de 10 ml frente a los 3 mlempleados por Walter y col. [232].


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Brodie y col. (1993), emplearon una Gag-PCR y una LTR-PCR de lentivirus ovinos ydetectaron provirus en leucocitos de lavado broncoalveolar, sangre, nódulo linfoide medias-tínico y médula ósea. La sensibilidad de la técnica aumentó tras cultivar células infectadas au-mentando así, la carga viral [28].

Johnson y col. (1992) estudiaron a 20 ovinos menores de 1 año, con presencia de ARNviral detectado por Hibridación in situ y sólo el 10% (2/20) eran seropositivos a VMV. Trasla obtención se cultivaron los PBMC y 14 días después el 70% (14/20) fueron LTR, Hibrida-ción in situ positivos y en cocultivo presentaron efecto citopático [113].

Amorena y col. (1992) diseñaron 3 parejas de cebadores para una POL-PCR y 3 pare-jas para una Env-PCR, a partir de secuencias Islándicas de MV. Se analizaron 5 cepas inclui-das, 3 Islándicas, 1 sudafricana (SA-OMVV) y 1 británica (EV-1). Tanto la Env-PCR comola POL-PCR detectaron las 3 cepas Islandesas mientras que una sola pareja de cebadores Envdetectaron la SA-OMVV y ninguna de las 2 PCR detectaron la cepa británica EV-1 [8].

Zanoni y col. (1996), desarrollaron PCRs para la región LTR, y para los genes gag, envy pol del VMV y fueron capaces de detectar hasta 10 copias del ADN molde. La sensibilidadde las PCRs en muestras de sangre y leche fue menor que la del ELISA, sin embargo en mues-tras de animales seronegativos, el 50% fueron PCR positivos. Los autores sugieren una sero-conversión tardía como razón de los resultados [239].

Extramiana y col. (2002) evaluaron una LTR-PCR con respecto a un ELISA y unaIDGA en muestras de sangre, leche y tejido. Los resultados obtenidos de sensibilidad y espe-cificidad con respecto al conjunto de muestras fue de 98% y 100% respectivamente, mientrasque los resultados de sensibilidad obtenidos por tipo de muestra fue del 84% (sangre), 67%(leche) y 88% (tejido) y una especificidad del 100% [79].

Narayan y col. (1983) demostraron que para visualizar un amplicón en un gel de aga-rosa se necesita partir de aproximadamente 3000 monocitos con 30 a 240 células infectadas[157]. Barlough y col. (1994) diseñaron una PCR doble anidada con el propósito de mejorarla sensibilidad de la PCR tradicional. Los cebadores fueron elaborados a partir de la secuen-cia de CAEV-co [192] y dirigidos al gen gag y pol. Se aplicó la PCR a muestras de PBMC deanimales seropositivos por ELISA. El 69,4% de las muestras amplificaron utilizando laGAG-PCR y el 16,3% fueron positivos a la POL-PCR. Al momento de emplear el protocoloanidado Gag-POL-PCR el porcentaje de positivos se redujo al 14,3%. Sin embargo, la con-cordancia fue alta (κ= 0,912) entre la PCR doble anidada y el ELISA. Los autores proponen,eliminar el Southern Blot y utilizar la PCR doble anidada para detectar a los falsos positivosde pruebas serológicas [14].

Celer Jr y col. (2000) desarrollaron una PCR-sn, los cebadores fueron diseñados a par-tir del genoma del VMV para detectar el gen gag. La Gag-PCRsn detectó un 70% (21/30) delos seropositivos y un 8,8% (6/68) de los seronegativos [39].

Leroux y col. (1997), diseñaron una RT-PCR para detectar LVPR en muestras de lechey secreciones mamarias, de ovinos y caprinos infectados de forma experimental y de forma


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natural [144]. Se diseñaron cebadores degenerados para la región pol de virus locales. LaPOL-RT-PCR detectó 8/8 ovinos, 9/9 caprinos infectados de forma natural y todas las mues-tras provenientes de animales seropositivos, también detectó un animal seronegativo que pro-venía de un grupo seropositivo y este resultado sugiere que la expresión viral en células deleche puede presentarse con anterioridad a la seroconversión y que la POL-RT-PCR podríaser una técnica tan confiable como el cultivo celular, más sencillo y rápido. Los autores des-tacan el uso de cebadores diseñados directamente en cepas locales evitando de esta forma lavariabilidad genética y por tanto los falsos negativos [144].

Vitu y col. (1997) desarrollaron una RT-PCR para detectar VAEC en leucocitos de le-che. Se observó viremia intermitente con la RT-PCR al igual que en cocultivo, sin embargolos animales se mantuvieron seropositivos durante el transcurso del ensayo. La concordanciaentre IDGA y RT-PCR fue del 67% [230].

Schoborg y col. (2002) desarrollaron una RT-PCR para detectar la región gag de la cepaCAEV-co [197].

Zhang y col. (2000) desarrollaron una PCR cuantitativa de competición (QC-PCR) paradetectar una región conservada del gen pol del VMV. Observaron ADN viral en macrófagosalveolares y en monocitos de sangre periférica, también observaron mayor carga viral en ma-crófagos alveolares detectaron una mayor carga viral en animales que presentaron lesioneshistopatológicas [240].

2.4.2.1.4. Reacción en cadena de la Polimerasa-Cuantitativa (Q-PCR)

Esta técnica permite la detección y cuantificación de ácidos nucleicos. A diferencia dela PCR convencional, esta técnica se basa en la detección fluorescente la cual aumenta pro-porcionalmente al tiempo en que el producto de PCR es amplificado. Las estrategias de mar-caje del amplicón se basan en sondas (Taqman, “Molecular beacons” y “Scorpions”) o SYBRgreen que aumentan la especificidad del amplicón cuantificado y permite el desarrollo de re-acciones multiplex [124]. La detección de la fluorescencia se realiza mediante filtros de emi-sión optimizados para el uso de los fluoróforos. Permite obtener y registrar la cantidad defluorescencia emitida durante cada ciclo, y es posible monitorear la reacción de PCR duran-te la fase exponencial, donde el aumento significativo del producto de PCR se correlacionacon la cantidad de ácido nucleico diana.

Existen dos métodos para cuantificar el ADN o ARN, cuantificación relativa y absolu-ta. La cuantificación relativa determina la cantidad de moléculas, relativizadas frente a uno ovarios genes endógenos o “housekeeping genes”, ideal para análisis de expresión génica. Lacuantificación absoluta permite obtener el número exacto de moléculas referido a una rectaestándar, ideal para detección de partículas virales siendo posible la cuantificación de menosde 5 copias del molde de ADN o ARN y con una desviación estándar menor al 2% [124].Klein y col. (1999) desarrollaron un protocolo de PCR cuantitativa para detectar distintos ais-lados del lentivirus de la inmunodeficiencia felina [125]. Gudmundsson y col. (2003) utiliza-


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ron esta técnica para estudiar la infección y patogenia del VMV, los ensayos fueron dirigidosa los genes, gag, pol, env, tat, rev y vif [96].

2.4.2.2. Diagnóstico Inmunológico

Los anticuerpos frente a las infecciones por lentivirus aparecen poco después de producir-se la infección en la mayoría de los animales y aunque no protegen contra la enfermedad, son in-dicadores de la infección. Entre las principales técnicas serológicas que se han empleado para eldiagnóstico de anticuerpos en los LVPR se incluyen la Inmunodifusión en gel de agar (IDGA),el ensayo de inmunoabsorbancia enzimática (ELISA), Inmunohistoquímica y el Western Blot.

2.4.2.2.1. Inmunodifusión en gel de agar (IDGA)

La IDGA es todavía la prueba más extendida en la mayoría de los laboratorios del mun-do [40] y es la prueba de referencia por la Organización Internacional de Epizootias (OIE).Consiste en detectar anticuerpos precipitantes en un medio de agar empleando antígeno viralsoluble. La reacción Ag-Ac genera bandas en el gel visibles a simple vista. La IDGA utilizacomo antígeno, el VMV o el VAEC, que se produce a partir de cultivo celular de plexo co-roideo o pulmón fetal ovino [3, 52]. Los antígenos más usados en la IDGA es el del VMV[164, 185]. Los anticuerpos que se detectan van dirigidos a la proteína de superficie gp135,la proteína de cápside p25 en el caso de VMV y la p28 en caso de VAEC y la proteína de ma-triz p16 [41]. Se ha demostrado que el VMV es de limitado valor diagnóstico para el VAEC[52] y su baja sensibilidad se atribuye a una divergencia entre las proteínas de gag (25%) yenv (40%) de VAEC y VMV, y a las diferentes cepas víricas. Otro aspecto relacionado con labaja sensibilidad es que la IDGA requiere la participación de múltiples interacciones epíto-pos-anticuerpos para obtener un resultado positivo [52, 128, 129, 164, 179].

En la década de los noventa, Knowles y col. (1994) reportaron una sensibilidad del91% y una especificidad del 100% para la prueba IDGA-LVPR con respecto a inmunopreci-pitación [128]. En estudios más recientes Varea y col. (2001) observaron una sensibilidad del76.3% y una especificidad de un 98.3% para la IDGA-LVPR frente a Western Blot [229].

2.4.2.2.2. Ensayo de Inmunoabsorbancia Enzimática (ELISA)

Las pruebas de ELISA se dividen en 5 categorías, (1) ELISA indirecto (ELISA-i) con-siste en la fijación del antígeno en la placa al cual se unen los anticuerpos presentes en lamuestra, la calidad de la purificación puede ser un factor limitante de la prueba, mientras ma-yor sea la pureza del antígeno mas alta será la sensibilidad y especificidad [27, 38, 71, 107,121, 130, 175, 186, 193, 211, 228, 229, 231, 238] , (2) ELISA directo (ELISA-d), detecta an-tígeno o anticuerpo (3) ELISA sándwich directo detecta antígeno, (4) ELISA de competición,en donde compiten dos anticuerpos para la unión antígeno anticuerpo y (5) ELISA de bloqueo


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donde compiten dos anticuerpos para la unión antígeno anticuerpo, sin embargo una incuba-ción previa bloquea la unión entre uno de los dos anticuerpos [51].

En 1990, Simard y col. elaboraron un ELISA-i con antígeno de VMV que estimaroncon una especificidad del 98,8% y con un 15,5% de sensibilidad más que la IDGA [212]. Delmismo modo Brodie y col. (1993) desarrollaron un ELISA-i con una sensibilidad del 92,3%y una especificidad del 94% [28]. Celer V. y col. (1993) con un ELISA-i de antígeno VAECreportan una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100% en caprino y una sensibili-dad del 81% y una especificidad del 87% en ovino con respecto al Inmuno Blot [38].

En este mismo año Vander y col. (1994) desarrollaron una ELISA-i con antígeno deVAEC, reportan una sensibilidad y especificidad del 94,4% y 100% con respecto a la inmu-noprecipitación [228].

La técnica de ELISA-i utilizando proteínas recombinantes como p55 (gag), p25 (gag),p16 (gag), p14 (gag), p44 (TM), gp 135 (env) y la gp46 (TM) a diferencia de virus comple-to, tienen como ventaja, el ser de una mayor pureza.

Kwang y col. (1993), presentaron una ELISA-i con una glicoproteína recombinante dela región transmembranal (TM) procedente del lentivirus ovino, los autores demostraron unamayor sensibilidad y especificidad que la IDGA [130]. El año siguiente, Kwang y col. (1994)describieron una ELISA-i de 3 péptidos distintos de la región TM, de esta manera aumentanla sensibilidad de la técnica, los autores argumentan que las ELISAs de segunda generaciónofrecen un mejor equilibrio entre coste y capacidad diagnóstica. Clavijo y col. (1995), presen-taron resultados de una ELISA-i de proteína transmembranal (TM), la sensibilidad fue del98,8% y la especificidad fue del 97,2%, sin embargo, los autores manifiestan que al utilizar enparalelo un ELISA-i (TM) y un ELISA-i de proteína recombinante (p28) aumentaría la sensi-bilidad, así detectando un mayor número de falsos negativos. [45]. En 1997 Boshof y col. fu-sionan la proteína p25 y la TM obteniendo un ELISA con una sensibilidad del 100% y una es-pecificidad del 100%. De Martini y col. (1999) repitieron la prueba con animales infectadosexperimentalmente y obtuvieron una sensibilidad de tan solo el 64% y una especificidad del100%, aunque en animales infectados naturalmente la sensibilidad aumentó a un 84%, sospe-chando de la existencia de gran variabilidad entre cepas víricas [71]. Saman y col. (1999) uti-lizaron como antígeno una proteína recombinante p25 y un péptido derivado de la región in-munodominante de la proteína transmembranal, gp 46. La sensibilidad de la ELISA-i obtenidofue 99,5% y la especificidad 99,3% [193]. Varea y col. (2001) utilizando la misma ELISA-1p25+gp46 obtuvieron una sensibilidad del 97,8% y una especificidad del 98,2% [229].

Se han comparado resultados de sensibilidad y especificidad entre ELISAs indirectosde proteínas recombinantes y ELISAs indirectos de virus completo, Celer y col. (1993) en-contraron una sensibilidad del 50% y una especificidad del 100% para el ELISA-i P25 conrespecto a Inmuno Blot [38].

Zanoni y col. (1994) compararon un ELISA-i con antígeno VMV completo, con unELISA-i recombinante Gag-GST, la sensibilidad de la ELISA-i Gag GST fue del 86% y la es-pecificidad del 99,3% [238].


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La sensibilidad y especificidad de un ELISA-i de proteína transmembranal recombi-nante (RTM) descrito por Rosati y col. (1994), presentó una sensibilidad del 60% y una es-pecificidad del 95% frente a una ELISA-i de virus completo [186].

Power y col. (1995) compararon dos ELISAs-i recombinantes, Gag p25 + p16 y la ELI-SA-i TM. Concluyeron que al combinar las dos pruebas, la sensibilidad y la especificidad au-mentaron a 97,4% y 99,4%, respectivamente mientras que la de las técnicas individuales pre-sentan una sensibilidad menor del 76,6% para la ELISA-i Gag y del 94,8% para la ELISATM[175].

Pasick y col. (1998) compararon una ELISA-i combinando proteínas recombinantes degag y de TM, la sensibilidad fue del 98% y la especificidad del 98,8%, mientras que la sen-sibilidad y especificidad de la ELISA-i de virus completo de AEC fue de 97,9% y 88,2% res-pectivamente [164].

En los ELISAS de competición se enfrentan el antígeno viral, anticuerpos monoclona-les o policlonales y el suero problema. Fevereiro y col. (1999) enfrentan el suero problemacon anticuerpos monoclonales a un antígeno del VMV, la sensibilidad de este ELISA de com-petición fue del 96% y una especificidad del 78% [82], Herrmann y col. (2003) describen unasensibilidad del 100% y una especificidad del 96% utilizando antígeno del VAEC [103, 104].

2.4.2.2.3. Inmunohistoquímica (IHQ)

Las técnicas de IHQ se basan en la detección de un antígeno mediante anticuerpos po-liclonales (Acpc) o monoclonales (Acm) específicos. Para facilitar la visualización de la re-acción se emplea un sistema de amplificación de señal, habitualmente el complejo avidina es-treptoavidina-biotina (ABC) y un sistema revelador, generalmente diaminobenzidina (DAB).Finalmente se visualizan los complejos antígeno–anticuerpo bajo el microscopio óptico[134].

Con esta técnica, se ha llegado a reportar la presencia de LVPR en distintos tejidos. Ge-orgsson y col. (1989), en un ensayo experimental tras la inoculación intracerebral de VMVen ovinos utilizaron Amc dirigidos a epítopos de la p25, y p15, detectando y relacionando lapresencia de antígeno viral con las lesiones nerviosas y los tipos celulares implicados [89].Gelmetti y col. (2000) empleando una mezcla de Amc a las proteínas p27, p15 y gp105 delVMV, aumentaron la sensibilidad de la técnica, en este caso sobre muestras de pulmón [84].

Todos los autores mencionados han detectado la presencia de antígenos virales en cé-lulas de la línea monocito-macrófago, pero también ha sido posible mostrar la presencia vi-ral en células de otras líneas, como Bolea y col. (1998) que observaron la presencia de prote-ínas virales en células epiteliales y macrófagos de la glándula mamaria [24], Lerondelle y col.(1999) que con el fin de demostrar la expresión antigénica del VAEC en células de la glán-dula mamaria, infectaron cultivos celulares primarios y procesados por IHQ utilizando Acpcanti-queratina. Los autores proponen que las células epiteliales de glándula mamaria podrían


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ser reservorios del virus y jugar un papel importante en la diseminación y patogénesis de lainfección mamaria [141].

Lamara y col. 2001 señalaron la presencia del VAEC en células de la granulosa derivadosdel oviducto caprino, en presencia de Amc contra la p25 (VAEC) [131]. Preziuso y col. (2003)utilizando Amc frente a la proteína p28 del VMV, detectaron proteínas en las células intersti-ciales y en células epiteliales del epidídimo [177]. Estos dos últimos autores sugieren que estostipos celulares podrían servir como reservorios del virus en la fase subclínica de la infección yser potencialmente capaces de transmitir la infección a embriones [131] o al semen [177].

2.4.2.2.4. Hibridación in situ (HIS)

La Hibridación in situ es una técnica ampliamente utilizada para la detección de ARNviral en células infectadas utilizando sondas de ADN marcadas generalmente con ADN 35Ssobre muestras de tejido o de cultivos celulares previamente fijados, tratados con proteinasa K,deshidratadas y secadas al aire, observando los resultados al microscopio óptico [7].

En las últimas décadas se ha utilizado esta técnica para el diagnóstico de los LVPR. Sannay col, (1999) amplificaron secuencias de ADN de la región pol observando la presencia delVAEC en macrófagos, microglía, astrocitos, oligodendrocitos y plexo coroideo entre otros [195]

Stowring y col. (1985), emplearon ambas técnicas para detectar ARN del VMV (HIS)en oligodendrocitos y astrocitos de zonas de desmielinización identificados por IHQ [220].Gendelman y col. (1985) detectaron ARN del VMV en distintos tejidos, especialmente en losmacrófagos alveolares, donde se observa una mayor presencia de ARN que de células en pro-ducción viral. Estos mismos autores, combinaron las técnicas de IHQ e HIS para visualizarel Ag viral y el ARN. Detectaron una mayor presencia de ARN en macrófagos en la mem-brana sinovial que de proteína viral [85, 87]. Anderson y col. (1994) detectaron proteína vi-ral (p15) en macrófagos de membrana sinovial [9].

Roy y col. (1992) utilizaron sondas ADN para detectar ARN de VMV en cultivos celu-lares y utilizaron una combinación de HIQ y HIS para detectar tanto Ag viral como ARN den-tro de la misma célula [188]. Carrozza y col. (2003) combinando HIS y HIQ lograron identi-ficar diferentes tipos celulares portadores del genoma del VMV tanto en pulmón (neumocitosI y II, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos) como en la glándula mamaria (célulasepiteliales, endoteliales, macrófagos y fibroblastos) [37].

2.4.2.2.5. Inmunoelectrotransferencia (WESTERN BLOT)

La prueba de Western Blot (WB) consiste en someter el antígeno a una interacción es-pecífica con anticuerpos marcados directa o indirectamente. Tras separar proteínas de antí-geno mediante electroforesis en gradientes de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), las proteínas se transfieren a una hoja de nitrocelulosa y los lugares de unión no


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específicos se bloquean y las tiras se incuban con antisuero y se añaden anticuerpos anti-in-munoglobulina con peroxidasa. Las reacciones se visualizan directamente tras la adición delsustrato enzimático [7]. Una muestra se considera positiva si se detectan al menos dos dife-rentes genes virales [30, 113, 155].

La prueba de WB detecta de forma precoz los anticuerpos frente a LVPR de infeccio-nes naturales y experimentales [42, 91, 127].

De Martín y col. (1999) detectaron un 94% (31/33) de positivos a WB y el 0% (0/5) encontroles negativos, siendo las pruebas de referencia ELISA e IDGA [71].

Diversos autores consideran el WB la “prueba de oro o referencia” para los ensayos deanticuerpos frente a LVPR [91, 225]. Sin embargo es una técnica laboriosa y poco prácticapara estudios serológicos a gran escala y se utiliza principalmente en aquellos casos de con-firmación, ayuda a verificar resultados dudosos [155].

2.5. EPIDEMIOLOGÍA Y CONTROL DEL VMV

2.5.1. Aspectos históricos y distribución geográfica

El VMV tiene una distribución mundial resultado de la exportación de distintas razaseuropeas ovinas y caprinas entre diferentes regiones del planeta y así estudios filogenéticoshan revelado una similitud entre los lentivirus ovinos sudafricanos y cepas inglesas comoEV-1 [172].

Un clásico ejemplo de transmisión y epidemia de VMV en una población como resul-tado de la importación de animales vivos infectados de VMV ocurrió en Islandia en la déca-da de 1930. Este país que hasta entonces estaba libre de la enfermedad importó 20 carnerosde raza Karakul de Alemania y tras mantenerlos en cuarentena durante 2 meses sin presentarsíntomas de enfermedad fueron enviados a 14 granjas alrededor del territorio islandés. Apro-ximadamente 6 años después se presentaron brotes en dos de los rebaños donde se había in-troducido un carnero infectado por rebaño y en poco tiempo quedó patente que el Maedi erauna enfermedad contagiosa con un periodo de incubación largo. Esta epidemia creció rápi-damente favorecida por el tipo de manejo que se practicaba en Islandia. El manejo durante elperiodo invernal se caracteriza por confinar a las ovejas en espacios pequeños y cerrados ydurante los meses de verano, los diferentes rebaños se encuentran en pastoreo libre hasta elmes de octubre en que las ovejas se recogen del monte y se mantienen en rediles durante3 días. Este segundo confinamiento favoreció la segunda fase de transmisión que sufrieronlos rebaños islandeses [68, 106, 204].

Los animales importados estaban también afectados de APO y al principio se asociaronlas muertes a esta enfermedad exclusivamente y no fue hasta 1939 en que el Maedi se reco-noció como enfermedad independiente [209]


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La etiología del Maedi se describió por Sigurdsson y col. en 1960 [205] y la etiologíade Visna fue descrito por Sigurdardóttir y col en 1964 [201], pero no fue hasta 1965 que Thor-mar y col. clasificaron al virus, como virus Maedi Visna, un sólo agente que causa los distin-tas signologias [223].

Otros ejemplos de transmisión del VMV por importación de animales es el de Noruegapor compra de ovinos daneses, Canadá por ovinos escoceses, Hungría por ovinos de rebañosingleses, Francia por ovinos de razas holandesas y Finlandia por importaciones suecas [172].

2.5.2. Modos de transmisión

Los ovinos y caprinos se infectan con LVPR fundamentalmente después del nacimien-to por consumo de calostro y leche de ovejas infectadas y por contacto horizontal con ani-males infectados que excretan virus en sus secreciones pulmonares. No se sabe exactamentecual de las dos vías de transmisión es más importante aunque recientemente se ha observadoque cuando la transmisión horizontal es eficiente, el riesgo de seroconversión a VMV es in-dependiente del modo de cría natural durante la lactancia, con madre seropositiva o serone-gativa a VMV [18].

2.5.2.1. Transmisión Aerógena

Puesto que los LVPR infectan principalmente monocitos y se replican en macrófagos yestos abundan en el pulmón, Houwers y col. (1990) sugieren que este órgano es una fuentede gran cantidad de virus libre e integrado [106]. La posibilidad de transmisión aerógena deVMV quedó patente en la epidemia de Islandia anteriormente descrita. Más tarde, en 1979,De Boer y col. corroboraron la posibilidad de transmisión aerógena y observaron que a ma-yor tiempo de exposición mayor es la severidad de las lesiones [68]. La transmisión horizon-tal se relaciona fuertemente con el sistema de producción ovino, el clima y la mala ventila-ción y en zonas donde el clima es más benévolo y el confinamiento es menor, la transmisiónhorizontal es menos eficiente y el VMV se transmite de manera más lenta [106]. En condi-ciones similares la incidencia de nuevas infecciones en un rebaño depende la proporción deanimales infectados [219] y en sistemas con estabulación de la proporción de infectados y eltiempo en el que los animales permanecen estabulados [18].

2.5.2.2. Transmisión Lactógena

De Boer y col. (1979) aislaron lentivirus ovinos a partir de leche de hembras seroposi-tivas, dos a tres meses después de la lactancia y detectaron anticuerpos específicos en los cor-deros que fueron amamantados con leche infectada [68]. Otros autores han demostrado tam-bién la presencia de VMV en calostro y leche [142, 208] y la posibilidad de infectar corderosy cabritos tras la ingestión de calostro con LVPR [1, 75, 196].


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Aunque se desconoce la fracción de infección que es atribuible al calostro y la lechey este aspecto es parte de los estudios realizados para esta tesis, en un estudio reciente seha observado que aproximadamente el 16% de los corderos que tomaron calostro de ove-jas seropositivas, durante las primeras 24h de vida, seroconvierte como resultado deello [4].

Generalmente la infección se atribuye a macrófagos infectados presentes en calostro yleche [154, 209]. Sin embargo, en cultivos de células epiteliales mamarias (CEM) de cabrasinfectadas, se ha detectado la presencia de proteínas gag y env en los sobrenadantes lo quesugiere que las células producen de forma activa partículas virales. Además de en CEM y ma-crófagos, se han detectado proteínas y genoma viral, en células del intestino delgado de ca-bras infectadas con VAEC [154].

No se sabe bien el mecanismo de infección por vía intestinal. Houwers y col. (1990)describen que el intestino del cordero se encuentra permeable durante un periodo de tiempodejando paso a los macrófagos infectados presentes en calostro [106]. Sin embargo, los re-sultados de los estudios hechos por Mselli-Lakhal y col. (1999), sugieren que los CEM y laspartículas virales libres, pueden llegar a contribuir a la transmisión del VAEC, ya que estascélulas pueden transportar el virus en CEM a células epiteliales intestinales ya que se ha ob-servado ARN en criptas de células intestinales caprinas. Los autores sugieren que la transmi-sión del VAEC podría ser más efectiva cuando ocurre a través de células homólogas [154].Así mismo Preziuso y col. (2004) observaron que el VMV en células epiteliales (CE) pre-sentes en calostro se mantienen en corderos durante dos días y por tanto esto podría facilitarla infección. El VMV presente en CE infectan a los macrófagos presentes en la lámina pro-pia del intestino del cordero y posteriormente infectan a las placas de Peyer hasta llegar a in-fectar los nódulos linfáticos mesentéricos vía linfática [176].

2.5.2.3. Transmisión Intrauterina

La opinión generalizada es que la transmisión congénita del VMV es muy poco fre-cuente [23, 172]. Sin embargo, se han descrito lesiones típicas de neumonía progresiva ovi-na (NPO) en corderos nacidos por cesárea de madres infectadas [50] y se ha aislado virus defetos de madres seropositivas [56, 206] e incluso de una oveja seronegativa que había estadoen contacto con ovejas seropositivas [56]. Por otro lado De Boer y col. (1979) analizaron 30fetos de hembras seropositivas y no detectaron virus en ninguno de ellos [69].

Más recientemente, Brodie y col. (1994) amplificaron VMV mediante PCR en 10% defetos de madres de un rebaño infectado y estos autores sugieren que un título viral alto en lamadre puede llegar a ser un factor importante en la transmisión uterina [26]. Puesto que enocasiones podría ser difícil establecer con total seguridad el origen de la infección en corde-ros neonatos, Peterhans y col.(2004) sugieren comparar las secuencias obtenidas por la téc-nica de PCR de fetos obtenidos por cesárea, con las secuencias virales obtenidas de virus dela madre [172].


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Lamara y col. (2002) describen la replicación in vitro del VAEC en células de la gra-nulosa y del oviducto de cabra. Sin embargo, también demostraron que la zona pelúcida delembrión actúa como protección contra el VAEC [131, 132].

2.5.3. Otras vías

2.5.3.1. Iatrogénica

No se han descrito casos de transmisión iatrogénica en la literatura científica interna-cional. Más aún, Dawson y col. (1987) investigaron la transmisión de VMV en rebaños in-fectados donde se emplearon las mismas jeringas y agujas en varios animales pero ningunode los animales seronegativos seroconvirtió a consecuencia de ello [64]. Sin embargo la po-sibilidad de transmisión iatrogénica no debe descartarse aunque se considera de poca impor-tancia epidemiológica [106].

2.5.4. Factores de riesgo de la infección

En general, el riesgo de infección a los agentes patógenos depende de factores propiosdel agente patógeno, del hospedador y del medio ambiente que les rodea [224].

En infecciones experimentales con LVPR la ruta de infección y la dosis de virus admi-nistrada determina el riesgo de infección [142]. La estrecha relación entre la seroconversióna VMV y el grado de contacto con animales infectados y el tiempo de estabulación en los es-tudios observacionales antes mencionados [18, 69] sugiere que también en condiciones decampo la probabilidad de infección es proporcional al nivel de exposición a VMV.

Existe sin embargo evidencia de diferencias en susceptibilidad a la infección por lenti-virus según la edad, la raza y las características genéticas de los hospedadores.

En varios estudios se ha observado que la incidencia de seroconversión a VMV segúnla técnica de IDGA aumenta con la edad hasta aproximadamente los 3 o 4 años de edad [18,120, 226]. Sin embargo, como ya se ha explicado anteriormente esta técnica es relativamen-te poco sensible y la relación entre la edad y la infección a VMV se investiga en esta tesis em-pleando una técnica ELISA mucho más sensible.

Existe evidencia de resistencia genética a las infecciones por el VAEC [189] y el virusde la leucosis enzoótica bovina [151] asociada a determinados alelos de genes del complejomayor de histocompatibilidad (MHC). Berriatua y cols. (2003), observaron que la probabili-dad de seroconversión a VMV era menor para la progenie de ovejas seronegativas de cuatroo más años de edad que para las hijas de otras ovejas [18]. Es posible que el genotipo searesponsable de las diferencias en la susceptibilidad a las infecciones por VMV observadasentre razas.


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El efecto raza ha sido ampliamente estudiado. De Boer y col.(1979), encontraron quela raza ovina Texel, era muy susceptible a la infección por MV y de 10 a 20% de los anima-les infectados, pertenecientes a rebaños seropositivos llegaban a presentar signología clínica[69]. En 1986, Cutlip y col. observaron que la raza Border Leicester presentaba significati-vamente más lesiones y signología clínica, que la raza Columbia [54]. Perk y col. (1995) in-dicaron que la raza Awassi es muy susceptible a contraer la infección aunque aparentementepoco propensa a desarrollar la enfermedad [171]. En Islandia, Palsson y col. (1976) observa-ron que ovinos F1 (ovinos islandeses X Border Leiceter) parecen comportarse como resis-tentes a la infección [162]. Houwers y col. (1989) estudiaron un rebaño durante 10 años, in-tegrado por Finnish Landrace (FL), Ile de France (IF) y la generación F1 del cruce de ambas.En este rebaño, la raza FL fue más susceptible al VMV que la raza IF, de modo que el por-centaje de animales seropositivos al final del estudio fue 46% (35/76) para la FL y 5,6%(1/18) para la IF [110]. Snowder y col. (1990) al final de un estudio de 10 años, no observa-ron una diferencia en la seroprevalencia, entre 4 razas ovinas que integraban un solo rebaño,incluidas la Polypay, Rambouillet, Columbia y Targhee, a pesar de que al inicio de la expe-riencia, la seroprevalencia en los ovinos de raza Rambouilet era menor [217]. En Australia,Grewal y col. (1986) observaron una menor susceptibilidad al VAEC en cabras de la raza Sa-anen que en cabras de las razas Nubia, Alpina y Toggenburg [94]. Así mismo, Rowe y col.(1992) reportaron una menor susceptibilidad en cabras de la raza Saanen y Toggenburg queen la raza Alpina [187]. Finalmente en varios estudios se han observado diferencias de sus-ceptibilidad a la infección por VMV asociadas al sexo [11, 213] pero los autores coinciden endestacar que estas diferencias estarían asociadas a un desigual manejo de las ovejas y los car-neros del rebaño.

2.5.5. Prevención y control

Hasta la fecha, no hay tratamientos comerciales eficaces contra los retrovirus animales.En 1978, Carroll y col. (1978) observaron que el interferón in vitro, no mantenía una baja re-plicación viral [36], sin embargo, Juste y col. (1997), utilizando interferón-tau observaron re-ducción de la viremia y retraso en la aparición de síntomas en corderos infectados con VMV[115-117]. Por otro lado, se han descrito vacunas contra LVPR pero los resultados no han sidobuenos [55, 106, 150, 167] y los programas de control de los LVPR van dirigidos a la erradi-cación del agente infeccioso [106, 147].

Los Islandeses demostraron que es posible erradicar el virus de la cabaña de un país me-diante sacrificio de rebaños completos afectados por la enfermedad seguido de un periodo devaciado sanitario y reemplazo con animales de otros rebaños libres de infección [106, 147,163].

Además se han descrito otros dos abordajes eficaces para eliminar el VMV de rebañosinfectados, y la elección de uno u otro método depende de la prevalencia de la infección, delvalor genético de los animales del rebaño y de los costos que sea posible asumir. Uno de losmétodos consiste en realizar análisis serológicos periódicos cada seis meses, de todos los ani-


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males de un rebaño y sacrificar los positivos y su progenie menor de seis meses y el otro mé-todo consiste en crear un rebaño separado a partir de corderos del rebaño original separadosde las madres al nacimiento y criados artificialmente para evitar la transmisión lactógena[106, 172].

El abordaje de análisis serológico y sacrificio selectivo está particularmente indicadoen rebaños con prevalencia de infección baja y la razón por la que es necesario realizar aná-lisis periódicos es porque como se ha explicado anteriormente algunos animales pueden es-tar infectados y no presentar anticuerpos detectables [61, 147, 180, 234].

El método alternativo de crear un segundo rebaño completamente separado del infec-tado con corderos criados artificialmente desde el nacimiento es oportuno en rebaños con unatasa de infección alta donde no es económicamente factible eliminar a todos los animales se-ropositivos y en rebaños con animales de alto valor genético. Esta estrategia es cara ya quedepende de la disponibilidad de naves y terreno para mantener a dos rebaños distintos. Ade-más, la cría artificial de corderos es laboriosa y potencialmente peligrosa si no se realiza unencalostrado adecuado de los corderos y por ello algunos autores piensan que éste método noes muy útil a nivel de campo [106, 147]. El encalostrado de los corderos durante las primeras24 horas de vida puede hacerse con calostro bovino o con calostro ovino calentado previa-mente a 56°C para destruir el VMV y posteriormente se deben realizar estudios serológicosde los corderos a los 6 meses de edad y después cada 6 meses para cerciorarse de la negati-vidad de los animales [106, 108, 147]. Como ya se ha indicado anteriormente, la cría artifi-cial de los corderos durante la lactancia es sólo uno de los aspectos fundamentales de esteabordaje y es necesario que el nuevo rebaño no entre en contacto con el rebaño infectado paraevitar la transmisión horizontal [19].

Además de estas estrategias bien conocidas, Ferrer describió un abordaje para reducirgradualmente la seroprevalencia en rebaños extensivos de rasa aragonesa, consiste en ir eli-minando los animales positivos al hacer el desecho anual, o simplemente dejar recría sola-mente de animales negativos [81]. Más recientemente Berriatua y cols. observaron que el nú-mero de animales que seroconvirtieron en diez rebaños lecheros de raza Latxa del País Vascodurante 2-5 años fue similar o inferior al número de animales que se eliminaron del rebaño por“desvieje” durante este tiempo y la tasa de desvieje osciló entre 14-25%. Esto indica que enestos rebaños hubiese sido posible reducir la seroprevalencia gradualmente sin necesidad deaumentar la tasa de desvieje por encima de valores considerados como normales, centrando eldesvieje en animales seropositivos a VMV. Como se ha comentado anteriormente en este es-tudio se observó además que las hijas de madres seronegativas mayores de cuatro años tuvie-ron menor probabilidad de seroconvertir que las hijas de otras madres indicando que existe uncomponente genético heredable de resistencia y susceptibilidad a la infección. La selección dela reposición entre las hijas de madres mayores seronegativas facilitaría el control del VMV enel rebaño tanto por este aspecto como por el hecho de que se evita la transmisión lactógena demadre a hija y posiblemente se reduzca la circulación de virus en el rebaño [18].

Está claro que es esencial disponer de un conocimiento preciso de los modos de trans-misión de VMV, su importancia relativa y otros aspectos de la epidemiología del VMV para


64

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 64

poder diseñar y poner en marcha nuevas estrategias de control de VMV que estén al alcancede la mayoría de los productores de ovino de este país y otros lugares del mundo. Un aspec-to previo fundamental al control del VMV es disponer de las herramientas necesarias para laidentificación precisa de los animales infectados para lo que, como se ha explicado, la inhe-rente variabilidad del VMV podría ser un factor limitante importante en el diagnóstico y con-trol de VMV. En esta tesis se describen estudios experimentales cuyos objetivos fueron ahon-dar en el conocimiento de los métodos de detección y transmisión del VMV. En el primercapítulo experimental se lleva a cabo un estudio comparativo de los ensayos de PCR de LVPRmás empleados en Europa, el segundo capítulo aborda la detección y transmisión de VMV encalostro de ovejas infectadas y en el tercer y último capítulo se presenta un estudio de la im-portancia de la transmisión horizontal en ovejas en estabulación sometidas a una presión va-riable de infección de VMV.


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01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 65

3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE

LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA YANÁLISIS COMPARATIVO DE LAS PCRsDE LVPR MÁS EMPLEADAS EN EUROPA

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 67

3.1. INTRODUCCIÓN

Como ya se explicó anteriormente disponer de una herramienta de diagnóstico de la in-fección por LVPR fiable es indispensable para estudiar y poner en práctica métodos de preven-ción y control. Hasta hace una década, las técnicas de diagnóstico disponibles para MV y AECeran principalmente de tipo serológico basadas en la detección de anticuerpos. La técnica de re-ferencia para la Organización Internacional de Epizootias (OIE) es todavía la IDGA que si bientiene una especificidad del 98,3%, su sensibilidad con respecto al WB es tan sólo del 76,3%[229]. A la ausencia de anticuerpos en animales infectados se le denomina “latencia serológica”y es una característica de las infecciones LVPR que podría ser consecuencia de la patogenia dela infección y de la capacidad de los lentivirus de eludir al sistema inmune [57, 202]. Esta hi-pótesis es compatible con la observación de que tras la infección hay una fase de viremia cortay el VMV tiende a localizarse en células y tejidos diana minimizando su presencia como viruslibre en el torrente sanguíneo donde sería más vulnerable a la respuesta inmune del hospedador[232]. Cabe decir, sin embargo que la latencia serológica también podría estar relacionada conla sensibilidad limitada de la prueba serológica de IDGA empleada en la mayoría de los estu-dios de la infección por LVPR. Como ya se ha comentado actualmente existen pruebas seroló-gicas más sensibles como los ELISAs recombinantes de tercera generación [193].

En cualquier caso, expertos en la infección por LVPR opinan que es posible que nin-guna prueba serológica consiga cerrar totalmente el “gap serológico” [43, 44, 193] y por ellodesde su descubrimiento se ha perseguido la obtención de una PCR para el diagnóstico deVMV. Actualmente existen numerosos ensayos de PCR para el diagnóstico de VMV (Tabla3.1), sin embargo, el éxito de la aplicación de la PCR al diagnóstico de los LVPR ha sido li-mitado y la sensibilidad observada en estos trabajos osciló entre un 30-100%. Aunque no estádel todo claro por qué las PCRs frente a los LVPR tienen resultados tan variables podría es-tar relacionado con el número escaso de muestras empleadas para validar los ensayos, la pocaconcentración de virus en sangre, la presencia de una sola copia de los genes gag, pol, env,tat, vif y rev frente a las dos copias de LTR en fase proviral y sobre todo, por la gran diversi-dad genética de los LVPR [236].

Con el fin de paliar algunas de las limitaciones de los estudios de PCR realizados has-ta la fecha, la Unión Europea decidió financiar en 2001 un proyecto de investigación tipoCRAFT del V Programa Marco, con el objetivo de desarrollar una PCR válida para el diag-nóstico de LVPR en Europa. En este proyecto participaron 8 centros de investigación de 6 pa-íses, incluidos la Universidad de Utrecht en Holanda (UniUtr), Animal Health Services De-venter Holanda, coordinadora del proyecto el Institute Nationale de la Recherche Agricole(INRA) de Lyon, el Instituto de Agro-biotecnología y Recursos Naturales (CSIC-UPNA) dePamplona, el Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario (NEIKER) de Derio, laNorwegian School of Veterinary Science (NSVM) de Oslo, la Università Degli Studi di Mi-lano (UniMil) y la Universidad de Edimburgo (UniEdi). Cada uno de estos laboratorios tra-bajó en colaboración con al menos dos empresas locales del sector ganadero que facilitaronla obtención de muestras. Finalmente también participó en el proyecto el Instituto Pourquierde Lyon cuyo objetivo fue dar un formato comercial al ensayo/s desarrollado en el proyecto.

69

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Este capítulo describe el trabajo desarrollado para diseñar y validar PCRs de espectropaneuropeo con especial énfasis en el trabajo realizado en NEIKER.


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Tabla 3.1. Pruebas de PCR desarrolladas para el diagnóstico de SRLV entre 1992 y 2001 disponiblesen la literatura científica internacional

Año de Autores Región Fracción de resultados coincidentespublicación Génica con la técnica de referencia empleada

Positivos (Se*) Negativos (Sp*)

1992 Zanoni y Col. LTR 6/6 (100%)1

NRGag 5/6 (83%)

1NR

1992 Johnson y Col. LTR 14/20 (70%)2

NR1993 Reddy y Col. Gag 18/20 (90%)

33/33 (9%)

3

Gag 5/5 (100%)3

NRGag 5/5 (100%)

3NR

1993 Rimstad Gag 25/27 (93%)4

20/81 (25%)4

1994 Barlough y Col. dn-PCRgag /pol 13/94 (14%)

45/40 (13%)

4

Gag 61/94 (65%)4

NRPol 13/94 (14%)

4NR

1995 Rosati y Col. LTR 9/9 (100%)1

NRgag - p25 5/8 (100%)

1NR

Env 2/9 (22%)1

NRgag - p16 1/9 (11%)

1NR

1997 Leroux y Col. pol (RT-PCR) 17/17 (100%) 3 y 4

NR1998 Wagter y Col. Gag 53/60 (88%)

3 y 41/9 (11%)

3y4

1998 Travassos y Col. Env 5/64 (8%)4

NRPol 4/64 (6%)

4NR

2000 Celer y Col. gag (sn-PCR) 21/30 (70%)3

6/68(9%) 3

2002 Extramiana y Col. LTR 75/90 (83%)3 y 4

1/25 (4%) 3 y 4

1Cultivo celular

2Hibridación In situ

3IDGA

4ELISA

Se* y Sp*: sensibilidad y especificidad relativaNR: no realizadodn: Doble Anidadasn: Anidada

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1. Abordaje experimental

El abordaje inicial propuesto para seleccionar una PCR de espectro paneuropeo fue cre-ar un banco de muestras de ovinos infectados y no infectados de LVPR, estudiar la variabili-dad genética de virus de distintos orígenes geográficos y crear cebadores para regiones géni-cas conservadas en los aislados víricos de los distintos países. En caso de que no seobservasen secuencias suficientemente conservadas se planteó como segunda alternativacomparar ensayos de PCR disponibles en los laboratorios participantes en el proyecto em-pleando las muestras del banco de muestras creado en la fase inicial del proyecto.

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 70

3.2.2. Obtención del banco de muestras de sangre

El objetivo inicial fue que cada laboratorio reuniese entre 50-100 muestras de peque-ños rumiantes (PRu) no infectados y entre 100-250 muestras de PRu infectados. El criterioelegido para establecer el estado de infección de los animales fue el estado de seropositivi-dad según un ELISA-i recombinante de tercera generación. En NEIKER se evaluó ademásel estado de infección de algunos animales empleando la PCR que amplifica un fragmentode las secuencias LTR del provirus integrado siguiendo el protocolo de Extramiana y col.(2002) [79].

Con el fin de seleccionar muestras para el banco de muestras, NEIKER realizó unsondeo serológico en 10 rebaños de ovejas lecheras de raza Latxa y 5 rebaños de cabras deraza Saanen y Murciano-Granadina de las 3 provincias de la Comunidad Autónoma del PaísVasco (CAPV) (Figura 3.1). La selección de los rebaños se basó en el conocimiento previode la existencia/ausencia de infección de LVPR en los rebaños y en la predisposición delganadero a colaborar en el estudio. De este modo se clasificaron en 3 grupos denominadosA, B y C. En el Grupo A se incluyeron 7 rebaños ovinos supuestamente seropositivos, enel Grupo B se incluyeron 3 rebaños ovinos, presumiblemente seronegativos y en el GrupoC, se incluyeron 5 rebaños caprinos que se sospechaba que eran seropositivos al VAEC(Tabla 3.2).

3. ELABORACIÓN DE ENSAYOS DE PCR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR LVPR EN EUROPA...

71

Figura 3.1. Ubicación geográfica de los rebaños seleccionados (1,3 y 11 Arkaute, 2 y15 Markina-Xe-mein, 4 Antzuola, 5 Zestoa, 6 Legazpia, 7 Oñati, 8 y 9 Beizama, 10 Muskiz, 12 Derio, 13Tolosa, 14 Gaintza)

En los rebaños del grupo A se tomaron un gran número de muestras sobre todo de ani-males menores de un año del rebaño experimental de NEIKER en Arkaute (A

1), que partici-

paban en un experimento de transmisión de LVPR por calostro [4]. De los rebaños del grupoB supuestamente negativos se tomaron muestras de todos los animales con el fin de compa-rar la ausencia de animales infectados y de los rebaños restantes se tomaron de 6 a 32 mues-tras de animales elegidos al azar.

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 71

3.2.3. Obtención de suero y realización del ELISA

En NEIKER se empleó un ELISA-i comercial de tercera generación “ELITEST” [193] cu-yos componentes y fases de reacción se esquematizan en la Figura 3.2. Los sueros se homoge-neizaron en un agitador y se realizaron 3 diluciones consecutivas (1:10, 1:100 y 1:500) con dilu-yente de la muestra, añadiendo 100 µl de la última dilución a cada pocillo de la placa de ELISA.

A continuación se recubrió la placa con parafilm, se agitó suavemente hasta homogenei-zar y se incubó en una estufa a 37°C durante 1 hora. Tras la incubación se decantó el contenidode la placa con un volteado seco para impedir que se mezclaran los sueros. Seguidamente, sellevó a cabo el lavado de los pocillos cinco veces seguidas añadiendo 200 µl de solución de la-vado (SDL) a cada pocillo, vaciando la placa con un volteado seco en cada ocasión. Tras los la-vados, el exceso de líquido se eliminó mediante algunos golpes sobre papel secante.

A continuación se preparó una dilución 1:10 del conjugado con diluyente del conjuga-do y se añadieron 100 µl de dilución a cada pocillo. Tras una nueva incubación a 37°C duran-te otra hora, se lavó la placa 5 veces con SDL de la misma forma que se ha descrito en el pasoanterior. Seguidamente se preparó el sustrato tetrametil benzidina en sulfóxido de dimetilo, auna dilución 1:10 en tampón de sustrato y se añadieron 100 µl de esta dilución a cada pocillo,tapando la placa y dejándola incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una veztranscurridos, la reacción se paró añadiendo 100 µl de ácido sulfúrico 2M a cada pocillo.


72

Tabla 3.2. Rebaños ovinos y caprinos seleccionados para crear un banco de muestras

Grupo Especie Población Provincia Num. de Estado serológicomuestras sospechado

A1

Ovino Arkaute-G A 186 PositivoA

2Ovino Markina V 15 Positivo

A3

Ovino Arkaute-A A 10 PositivoA

4Ovino Antzuola G 21 Positivo

A5

Ovino Zestoa G 6 PositivoA

6Ovino Legazpia G 6 Positivo

A7

Ovino Oñati G 6 Positivo

Total 250

B8

Ovino Beizama-o G 306 NegativoB

9Ovino Beizama-l G 140 Negativo

B10

Ovino Muskiz V 255 Negativo

Total 701

C11

Caprino Arkaute A 30 PositivoC

12Caprino Derio V 8 Negativo

C13

Caprino Tolosa G 30 PositivoC

14Caprino Gaintza G 32 Positivo

C15

Caprino Markina V 30 Negativo

Total 130

A= Álava V= Vizcaya y G= Guipúzcoa

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 72

La lectura se efectuó en un lector ELISA (Labsystems Multiskan MS) a dos absorban-cias distintas: 450 nm y 570 nm. Para calcular el índice ELISA de cada suero, se determinópreviamente el punto de corte, cuyo valor fue la densidad óptica (DO) del control positivo (P)menos la DO del control negativo (N) dividido entre cuatro más la densidad óptica del con-trol negativo según la fórmula (P-N)/4+N. El suero se consideró como positivo si su densi-dad óptica era mayor o igual que el punto de corte y negativo si el valor de su DO era menorque el punto de corte1.


73

Figura 3.2. Esquema de los pasos a seguir en el ELISA Indirecto ELITEST

3.2.4. Obtención de células blancas

Se empleó el método de cloruro de amonio para obtener las células blancas de sangreperiférica según describe Extramiana y col. (2002) [78]. Se partió de 5 ml de sangre conEDTA que se traspasó a 2 tubos estériles de polipropileno de 15 ml. A continuación se aña-dió cloruro de amonio estéril al 0,83% a una proporción 1:1 para lisar los glóbulos rojos, seincubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de una centrifugación a tempe-ratura ambiente a 2.000 g (Megafuge 1,0 Haraeus) durante 10 minutos. Una vez obtenidas lascélulas mononucleares de sangre periférica (PBMC) se lavaron dos veces con PBS y se divi-dieron a partes iguales en dos tubos de 1,5 ml de polipropileno, con 2 ml de PBS. Tras cen-trifugar los viales a 14.000 g en microcentrífuga (Biofuge Heraeus) durante 1 minuto, se de-cantó el sobrenadante y se almacenaron los PBMC a -20°C.

3.2.5. Obtención de ADN

Se purificó el ADN siguiendo el método de fenol-cloroformo isoamílico [194]. Se re-suspendieron los PBMC en 400 µl de TE tras lo cual se procedió a realizar una digestión pro-téica con proteinasa K (200 µl/ml) y SDS 1%.

Incubando la muestra a 56°C durante 1 hora, y agitando cada 15 minutos. Al finalizar,se inactivó la proteinasa K a 96°C durante 10 minutos. A continuación se añadió, fenol-clo-roformo-alcohol isoamílico 1:1:1 para separar los ácidos nucleicos, agitando la mezcla hastahomogeneizarla. Seguidamente se centrifugó a 14.000 g durante 10 minutos. Al finalizar, seobtuvo la fase acuosa con los ácidos nucleicos (parte superior), y se le añadió cloroformo iso-

1 El control positivo se debe encontrar entre el rango de 0,5 y 1,0 y el control negativo entre 0,02 y 0,1

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 73

amílico a partes iguales, la muestra se agitó y se volvió a centrifugar siguiendo los mismospasos anteriores, obteniendo la fase acuosa (parte superior). A continuación se añadieron1,5 ml de etanol al 100% y acetato sódico y se incubó durante 24 horas a –20 °C con el fin deprecipitar el ADN. Al término de las 24 horas, la muestra se centrifugó durante 20 minutos a14.000 g decantando el sobrenadante y se realizaron 2 lavados con etanol al 75% centrifu-gando 14.000 g por 10 minutos. A continuación se decantó el etanol dejando los tubos bocaabajo con el fin de secar los ácidos nucleicos durante 1 hora. Una vez secada la muestra sediluyó en 20 µl de agua estéril y se mantuvo a 56°C durante 10 minutos. Se trabajó con con-troles de extracción, sustituyendo el ADN con TE, para detectar contaminación. Las muestrasse almacenaron a –20°C hasta el momento de necesitarlas.

3.2.6. Concentración y pureza de ADN

Se midió la pureza y la concentración del ADN extraído con un espectrofotómetro Na-nodrop ND-1000 (NanoDrop technologies). Se tomaron 2 µl de muestra, calculando la pure-za con el ratio de absorbancia 260/280nm, siendo que la longitud de onda 260 detecta ADNy la longitud de onda a 280 detecta proteínas. Un ratio de ~1.8 es aceptado como ADN puro,mientras que un ratio menor indica que el ADN presenta proteínas, fenol u otras contamina-ciones. La concentración de ADN, se calculó multiplicando la A260 por la constante de aná-lisis que en el caso de ADN es de 50 (Concentración = A260X50) [194].

3.2.7. Secuenciación de aislados de LVPR

Las tareas de secuenciación y estudio de la variabilidad genética de los aislados deLVPR las llevaron a cabo la UniUtr y el INRA empleando secuenciadores automáticos. Coneste fin se pidió que cada laboratorio participante en el proyecto enviase 25 muestras de ADNde células sanguíneas de 20 animales infectados y 5 no infectados. En NEIKER se llevó acabo un estudio de la variabilidad genética en las secuencia diana de los cebadores desarro-llados por los distintos grupos del proyecto CRAFT y las publicadas en Genbank(htt://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) incluidas la NC_001452 (Virus Visna),NC_001511 (SA-OMV), M31646 (SA-OMV), M60610 (Islándica), M10608 (Islándica),S51392 (EV-1) y NC_001463 (VAEC).

3.2.8. Análisis estadístico

Se empleó la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiInfo6.0 (CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordancia en-tre dos técnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del 5%(p<0,05).


74

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 74

3.2.9. Ensayos PCR

3.2.9.1. Estrategias de comparación de ensayos

En la comparación de los distintos ensayos de PCR participaron los centros de investi-gación de Pamplona, Derio, Oslo, Milán, Utrecht, Deventer y Edimburgo y se realizó en tresestadios cronológicos. Inicialmente cada laboratorio envió cinco muestras de ADN, cuatro deanimales infectados y una de un animal negativo, a los demás laboratorios con el fin de pro-bar la PCR propia en muestras de los demás laboratorios. Para la segunda y tercera fase, elInstituto Pourquier desarrolló y envió a cada centro un “kit” que incluía los reactivos de cadauna de las PCRs comparadas para probar con muestras de ADN propias.

En la segunda fase se compararon los cinco pares de cebadores (“Kit-1”) que se des-criben en el siguiente apartado y se solicitó que se probasen en 10 muestras positivas y 5 ne-gativas. En la tercera fase se seleccionaron los tres pares de cebadores que tuvieron el mayorporcentaje de amplificaciones correctas en la segunda fase (“Kit-2”) y se solicitó a cada la-boratorio que se ensayaran en 20 muestras positivas y 20 negativas.

Además de los ensayos descritos anteriormente, Derio y Pamplona compararon sus res-pectivas PCRs, la LTR y la POL, con otras 222 muestras tomadas de corderos al nacimientoy a los 15, 30, 90, 180 y 300 días de edad, pertenecientes al ensayo de transmisión de calos-tro antes mencionado [4] (Tabla 3.2 grupo A

1).

3.2.9.2. Tipos de ensayo de PCR

Se evaluaron cinco ensayos de PCR distintos incluídos tres descritos en publicacionesinternacionales y empleados rutinariamente por Lyon (Gag 1-PCR), Oslo (Gag 4- PCR), De-rio (LTR-PCR) y Pamplona (POL-PCR), y dos ensayos diseñados a partir de los trabajos desecuenciación de este proyecto (Gag 2-PCR y Gag 3-PCR). El nombre, origen, secuencia dia-na, posición y tamaño del amplificado se presentan en la (Tabla 3-3) Como puede apreciarselos ensayos diseñados en el proyecto, el Gag 1,2 y de Lyon y el Gag 4- PCR de Oslo ampli-fican fragmentos de la región gag mientras que los ensayos de Derio y Pamplona amplificansecuencias LTR y pol, respectivamente. El tamaño de los amplicones osciló entre las 113 pbdel Gag 4 y las 520 pb del Gag 1. Cabe señalar que los cebadores diseñados en Lyon inclu-yen posiciones degeneradas señaladas con las letras “D”, “M”, “N”, “R” e “Y” en las que seincluyen mezclas de nucleótidos en diferentes proporciones para facilitar la unión de los ce-badores a posiciones hipervariables (Tabla 3.3).

3.2.9.3. Condiciones y formato de reacción de PCR

La concentración de reactivos, el número de ciclos y temperatura de desnaturalización,hibridación y elongación de las PCRs empleadas se describen en la Tabla 3.4. En los dos


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01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 75

“Kits”, las condiciones de desnaturalización, hibridación y elongación se mantuvieron flexi-bles y nuestro protocolo utilizó 40 y 50 ciclos de desnaturalización, hibridación y elongaciónen las PCR del “Kit-1” y “Kit-2”, respectivamente y temperaturas y tiempo de hibridación de60°C y 30 segundos para el “Kit-1” y de 55°C y 30 segundos para e “Kit-2”.

El “Kit-1” incorporaba un “Primer Mix 5X” que contenía buffer con dNTPs pero noMgCl

2y 6 pares de cebadores (Gag 1,Gag 2,Gag 3, Gag 4,POL y LTR), mientras que en el

“Kit-2” el “Pimer Mix 2X” incluía también MgCl2

y 3 pares de cebadores (Gag 3, Gag 4 yLTR) (Tabla 3.4).


76

Tabl

a 3.

3.C

ebad

ores

em

plea

dos

Nom

bre

Ori

gen

Gen

Ta

mañ

o C

ebad

orSe

cuen

cia

Dia

nade

am

plic

ón

(5’-

3’)

Tm

Gag

1Ly

onga

g52

0pb

Gin

5-F

GM

TA

GA

GA

CA

TG

GY

GA

GG

CA

RG

61,0

°

Gin

3-R

DA

GN

CC

AT

GC

TG

CA

TD

GC

YA

CT

GT

58,0

°C

Gag

2Ly

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g40

5pb

Gin

5-F

GM

TA

GA

GA

CA

TG

GY

GA

GG

CA

RG

61,0

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Craf

t RC

CA

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CA

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CC

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58,0

°C

Gag

3Ly

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0pb

Craf

t FT

GA

CA

GA

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AA

TT

GT

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Gin

3-R

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CC

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TG

CA

TD

GC

YA

CT

GT

58,0

°C

Gag

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AA

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AG

TG

GC

AA

TG

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,7°C

Oslo

RG

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TA

AT

AC

TT

CT

AA

50,2

°C

LTR

Der

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1pb

LTR

FT

GA

CA

CA

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LTR

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CA

CG

TT

GG

GC

GC

CA

GC

TG

CG

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A75

,0°C

POL

Pam

plon

apo

l21

8pb

POL

FA

TA

GT

AA

AT

GG

CA

TC

AA

GA

TG

C57

,0°C

POL

RT

CC

CG

AA

TT

TG

TT

TC

TA

CC

C58

,0°C

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

N=

A+C

+T+G

R=

A+G

Y=

C+T

M=

A+C

D=

A+T

+G

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 76

3.3. RESULTADOS

3.3.1. Banco de muestras

De las 1.081 muestras de PRu analizadas mediante ELISA 237 muestras fueron positi-vas. Se realizó la LTR-PCR en 59 muestras ELISA positivas, incluidas 39 de ovejas y 20 de


77

Tabla 3.4. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas dereacción

Protocolo Reactivos Concentración Volumen Ciclos TemperaturaFinal

Buffer 1X 2,5 µl 1 96°C/3’

dNTPs 200µM 0,2 µl 50 94°C/30’’

Mg2Cl 2,5µM 1,25 µl 70°C/1’30’’

Cebador 1 0,4µM 0,5 µl 1 72°C/10’

LTR Cebador 2 0,4 µM 0,5 µl

Taq Polimerasa 2,5U 0,2 µl

ADN 500ng 5,0 µl

Agua 14,85 µl

Volumen total 50 µl

PCR Mix 5X (Buffer,dNTPs 1mM)

1X 10 µl 1 95°C / 5’

Mg2Cl (25mM) 2,5mM 5 µl 40-50 95°C / 30’’

Cebador 1 (100µM) 0,4µM 0,2 µl 60°C / 30’’

“Kit-1” Cebador 2 (100µM) 0,4µM 0,2 µl 72°C / 40’’

Polimerasa (5U/µl) 2,5 U 0,5 µl 1 72°C / 10’

ADN 500ng 5,0 µl

Agua 29,1 µl

Volumen total 50 µl

PCR Mix 2X ( Buffer,dNTPs 0,5mM,Mg

2Cl (4mM)*

1X 12,5 µl 1 95°C / 5’

Cebadores (0,8 µM)

“KIT-2” Polimerasa (2U/µl) 2,5U 0,5 µl 50 95°C / 30’’

ADN 500ng 5,0 µl 55°C / 30’’

Agua 7,0 µl 72°C / 40’’

Volumen total 25 µl 1 72°C / 10’

* La concentración de MgCl2se aumentó a 3,0mM en un segundo ensayo.

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 77

cabras. Se obtuvo producto de amplificación en 37/59 muestras y las restantes 22 fueron LTR-PCR negativas (Tabla 3.5). Finalmente se mandaron a la Universidad de Utrecht para su se-cuenciación, 25 muestras de ADN a una concentración final de 1,500ng 20 de ellas ELISA yLTR-PCR positivas y 5 ELISA y LTR-PCR negativos (Tabla 3.5).


78

Tabla 3.5. 1.5 Resultados de ELISA y PCR para la selección de muestras a enviar a la Universidadde Utrecht e INRA de Lyon para secuenciación y estudio de variabilidad genética

ResultadosNúmero Núm. muestras

ELISAmuestras LTR y enviadas

GrupoNúm. de

ELISA ELISA para secuenciaciónanimales

positivas positivas+ – seleccionadas LTR+ LTR–

A1 186 61 125 3 3/3 2 –A2 15 15 0 6 4/6 2 –A3 10 10 0 6 5/6 2 –A4 21 6 15 6 3/6 2 –A5 6 6 0 6 5/6 2 –A6 6 6 0 6 4/6 2 –A7 6 6 0 6 4/6 2 –

Tot.A 250 110 140 39 28/39 14 –

B8 306 41 265 – – – –B9 140 4 136 – – – –B10 255 0 255 – – – –

Tot.B 701 45 656 – – – –

C11 30 29 1 6 3/6 2 –C12 8 1 7 1 0/1 – –C13 30 26 4 6 4/6 2 2C14 32 25 7 6 2/6 2 2C15 30 1 29 1 0/1 – 1

Tot. C 130 82 48 20 9/20 6 5

Total 1.081 237 844 59 37/59 20 5

3.3.2. Secuenciación de ADN y diseño de cebadores

Los trabajos de secuenciación realizados por Utretch y Lyon permitieron diseñar un parde cebadores de la región gag de un tamaño de 23 bases para el cebador Craft F y de 23 ba-ses para el cebador Craft R. Estos cebadores no se diseñaron para trabajar juntos y el cebadorsuperior Craft F se empleó con el cebador Gin3-R y el cebador Craft-R se utilizó con el ce-bador Gin5-F. El tamaño de los amplicones fue de 150 pb y 405 pb para los cebadores Gag 3y Gag 2, respectivamente(Tabla 3-3).

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 78

3.3.3. Ensayos de LTR-PCR en las muestras europeas intercambiadas

En Derio se recibieron 15 muestras de ADN 4 positivas y 1 negativa de cada uno de loslaboratorios de Pamplona, Lyon y Utrecht. No fue posible realizar los ensayos con las mues-tras de Utrecht por presentar una baja concentración de ADN. La proporción de LTR-PCR po-sitivos en las muestras de Pamplona y Lyon fue 2/4 y 4/4, respectivamente. Por otro lado to-das las muestras negativas enviadas fueron LTR-PCR negativas.

3.3.4. Ensayos de PCR con el “Kit-1” en las muestras locales

Para evaluar la sensibilidad y especificidad del “Kit-1”, se emplearon un total de 779muestras de ADN de oveja, incluidas 597 ELISA y PCR positivas y 182 ELISA y PCR ne-gativas de los laboratorios de Derio, Oslo, Milán, Utrecht.


79

Tabla 3-6. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto emplean-do las PCRs en el “Kit-1” con muestras locales

Fracción de resultados coincidentesCentro Cebadores

Positivos (%) Negativos (%)

Derio Gag 2 0/10 (0) 5/5 (100)Gag 3 0/10 (0) 5/5 (100)Gag 4 1/10 (10) 5/5 (100)POL 5/10 (50) 5/5 (100)LTR 5/10 (50)* 5/5 (100)

Oslo Gag 1 0/50 (0) 15/15 (100)Gag 2 7/50 (14) 15/15 (100)Gag 3 1/50 (2) 15/15 (100)Gag 4 25/50 (50) 15/15 (100)POL 17/50 (34) 15/15 (100)LTR 2/50 (4) 15/15 (100)

Milán Gag 1 0/15 (0) 10/10 (100)Gag 2 0/15 (0) 10/10 (100)Gag 3 0/15 (0) 10/10 (100)Gag 4 8/86 (9) 10/10 (100)POL 0/15 (0) 10/10 (100)LTR 22/63 (35) 10/10 (100)

Utrecht Gag 1 4/7 (57) 2/2 (100)Gag 2 7/9 (78) 1/1 (100)Gag 3 3/10 (30) 1/1 (100)Gag 4 4/8 (50) 2/2 (100)POL 2/4 (50) 1/1 (100)LTR NI NI

Total Gag 1 7/72 (10) 27/27 (100)Gag 2 14/84 (17) 31/31 (100)Gag 3 4/85 (5) 31/31 (100)Gag 4 38/154 (25) 31/31 (100)POL 24/79 (30) 31/31 (100)LTR 29/123 (24) 30/30 (100)

Total 116/597 (19) 182/182 (100)

* La sensibilidad aumentó a 8/10 al incrementar el número de ciclos de PCR de 40 a 50.NI: no se dispone de información.

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 79

El número de muestras empleadas para validar las PCRs varió según el laboratorio y laPCR empleada (Tabla 3.6). Aunque estaba previsto emplear 10 muestras positivas y 5 nega-tivas por ensayo, el rango de muestras empleadas osciló entre las 86 muestras positivas deMilán para probar la Gag 4-PCR y la única muestra negativa que empleó Utrecht para probarla mayoría de las PCRs.

La proporción de resultados coincidentes varió según la PCR, el laboratorio y el estadode VMV de la muestra (Tabla 3.6). El porcentaje de resultados coincidentes fue 100% en lasmuestras negativas y mucho menor en el caso de las muestras positivas. Las proporcionesmás altas para cada PCR y laboratorio en muestras positivas fueron 50% en Derio y 35% enMilán para la LTR, 50% en Derio y Utrecht y 34% en Oslo para la POL, 50% en Oslo yUtrecht para la Gag 4-PCR, 78% en Utrecht para la Gag 2-PCR, 57% en Utrecht para la Gag1-PCR y 30% en Utrecht para la Gag 3-PCR. En conjunto la proporción de resultados positi-vos coincidentes fue numéricamente más alta para la POL-PCR, seguida de la Gag 4-PCR,LTR-PCR y la Gag 2-PCR (Tabla 3-6). Estadísticamente, sin embargo la proporción de re-sultados coincidentes fue similar para las PCRs Gag 1-PCR, Gag 2-PCR y Gag 3-PCR(p>0,05) pero mayor para la Gag 4-PCR que para la Gag 3-PCR (p<0,05).

3.3.5. Ensayos de PCR con el “KIT-2”

Para realizar este experimento se seleccionaron las PCRs de Derio (LTR-PCR), Oslo(Gag 4-PCR) y Craft (Gag 3-PCR). A pesar de que los resultados con la POL fueron compa-rativamente buenos, los investigadores de Pamplona decidieron desestimar su inclusión enel “Kit-2” por haber comprobado en su laboratorio que carecía de la aparente sensibilidad quehabía demostrado en el “Kit-1”. Estos resultados se confirmaron posteriormente en los ensa-yos de comparación de la LTR-PCR y POL-PCR realizados en Derio y Pamplona que se des-criben en el apartado 3.3.6.

En el ensayo “Kit-2”, se emplearon un total de 703 muestras, 583 muestras de ADN ovi-no y 120 muestras de ADN caprino. 339 muestras fueron ELISA y PCR positivas y 364 mues-tras ELISA y PCR negativas de los laboratorios de Derio, Oslo, Pamplona, Milán, Deventer-Utrecht y Edimburgo.

Al igual que en el ensayo “Kit-1”, el número de muestras empleadas para la validaciónvarió entre los distintos laboratorios. En este experimento, el número de muestras positivas ynegativas previstas eran 20 positivas y 10 negativas por ensayo, pero el rango de muestrasempleadas osciló entre las 96 muestras positivas de Deventer-Utrecht para probar la LTR y 6muestras negativas que empleó Edimburgo para probar la Gag 3-PCR (Tabla 3.7).

El porcentaje de resultados coincidentes en muestras negativas no alcanzó el 100% en to-dos los laboratorios como con el “Kit-1” y el porcentaje osciló entre el 80-100% en la mayoríade los laboratorios y ensayos pero fue 25% y 65% en Edimburgo con la Gag 4-PCR y en Oslocon la Gag 3-PCR, respectivamente. En conjunto la proporción de resultados negativos coinci-dentes fue 93% para la LTR-PCR, 86% para la Gag 3-PCR y 82% para la Gag 4-PCR.


80

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 80

El porcentaje de resultados coincidentes en muestras positivas varió también según loslaboratorios y ensayos. Así, el porcentaje osciló entre el 15% de la Gag 4-PCR en Derio y el100% de la Gag 4-PCR y LTR-PCR en Edimburgo. En conjunto el porcentaje de resultadoscoincidentes en muestras positivas fue 78% para la LTR-PCR, significativamente superiorque para la Gag 3-PCR y la Gag 4-PCR que fue 52% y 43%, respectivamente. Sin embargola LTR-PCR tuvo el menor porcentaje de resultados positivos coincidentes en las pocas mues-tras de caprino analizadas.


81

Tabla 3.7. Fracción de resultados coincidentes obtenidos por los laboratorios del proyecto emplean-do las PCRs en el “Kit-2” con muestras locales

Fracción de resultados coincidentes (%)Centro Cebadores Especie

Positivos Negativos

Derio Gag 3 O 8/20 (40) 10/10 (100)Gag 4 O 3/20 (15) 10/10 (100)LTR O 13/20* (65) 10/10 (100)

Oslo Gag 3 C 17/20 (85) 13/20 (65)Gag 4 C 11/20 (55) 16/20 (80)LTR C 8/20 (40) 18/20 (90)

Pamplona Gag 4 O 12/20 (60) 16/20 (80)LTR O 19/20 (95) 16/20 (80)

Milán Gag 3 O 7/20 (35) 20/20 (100)Gag 4 O 4/20 (20) 20/20 (100)LTR O 14/20 (70) 17/20 (85)

Deventer LTR O 81/96 (84) 144/152 (95)

Edinburgh Gag 3 O 3/7 (43) 5/6 (83)Gag 4 O 8/8 (100) 2/8 (25)LTR O 8/8 (100) 8/8 (100)

Total Gag3 O 35/67 (52) 48/56 (86)Gag4 O 38/88 (43) 64/78 (82)LTR O 143/184 (78) 213/230 (93)

* 14/20 con una concentración de MgCl2= 2,5mMO = Ovino y C = Caprino

3.3.6. Comparación de LTR-PCR (Derio) y POL-PCR (Pamplona)

3.3.6.1. Porcentaje de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA positivos

Para la comparación de los ensayos de PCR se utilizaron 222 muestras de 140 corderostomadas al nacimiento y a los 15, 30, 90, 180 y 300 días de edad. Entre ellas, 84 muestras co-rrespondían a corderos de 15 a 180 días de edad que habían tomado calostro de oveja sero-

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 81

positiva durante las primeras 24 horas de vida y no se emplearon para comparar las PCRs conel ELISA, quedando 138 muestras para analizar conjuntamente los tres ensayos.

Como puede observarse en la Tabla 3.8, la LTR-PCR detectó animales positivos desdeel nacimiento hasta los 300 días, mientras que las técnicas POL-PCR y ELISA detectaronanimales positivos a partir de los 15 días. En conjunto el porcentaje de positivos varió segúnlas técnicas y fue 22% (49/222) con la POL-PCR, 46% (102/222) con la LTR-PCR y 18%(25/138) con el ELISA (p<0,05) (Tabla 3.8). En la selección de 138 muestras el porcentaje demuestras positivas con POL-PCR y LTR-PCR fue 9% y 39%, respectivamente (p<0,05) (Ta-bla 3.8).

La proporción de LTR-positivos según la edad de los animales tiene un carácter bimo-dal con un pico entre los 0 y 30 días de edad y otro posterior a los 300 días. Por el contrariola POL-PCR y el ELISA apenas detectaron positivos antes de los 300 días y la proporción depositivos por POL-PCR y LTR-PCR a los 300 días fue 42% y 50%, respectivamente.


82

Tabla 3.8. Proporción de positivos a las técnicas LTR-PCR, POL-PCR y ELISA en muestras de cor-deros del rebaño experimental Arkaute tomadas entre el nacimiento y los 300 días de edad

Días Muestras analizadas por PCR Muestras analizadas por PCRy no por ELISA (n=222) y ELISA (n=138)

LTR POL ELISA LTR POL

0 5/9 (56) 0/9 (0) 0/9 (0) 5/9 (56) 0/9 (0)15 16/21 (76) 3/21 (14) 1/9 (11) 5/9 (56) 0/9 (0)30 18/27 (67) 6/27 (22) 0/15 (0) 12/15 (80) 0/15 (0)90 16/42 (38) 4/42 (10) 1/31(3) 11/31 (36) 1/31 (3)180 34/97 (35) 25/97 (25) 2/48 (4) 8/48 (17) 0/48 (0)300 13/26 (50) 11/26 (42) 21/26 (81) 13/26 (50) 11/26 (42)

Total 102/222 (46) 49/222 (22) 25/138 (18) 54/138 (39) 12/138 (9)

3.3.7. Grado de concordancia entre las técnicas

La comparación por parejas de las técnicas PCR y ELISA indicó la existencia de un ele-vado número de resultados discordantes. En consecuencia, el coeficiente de concordancia kap-pa (k) fue regular (k=0,25± 0,06) entre la LTR-PCR y la POL-PCR, moderada entre la POL-PCR y el ELISA (k=0,58±0,08) y baja entre la LTR-PCR y el ELISA (k=0,2) (Tabla 3.9).

El grado de concordancia entre la LTR-PCR y la POL-PCR fue particularmente pobreantes de los 180 días, bueno a los 180 días (k=0,59±0,10) y regular a los 300 días(k=0,40±0,19). El grado de concordancia entre la POL-PCR y el ELISA fue pobre antes delos 300 días y moderado a los 300 días (k=0,43±0,16). No se observaron diferencias en el gra-do de concordancia entre la LTR-PCR y el ELISA según la edad (Tabla 3.9).

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 82

Sin embargo, al comparar las técnicas teniendo en cuenta el resultado acumulado dePCR y el de ELISA a los 300 días en los 26 corderos analizados, el grado de concordanciaentre el ELISA y las PCRs mejoró y los valores de kappa fueron k= 0,35± 0,20 para ELISAy LTR-PCR, k= 0,44± 0,18 para ELISA y POL-PCR (Tabla 3.10).


83

Tabla 3.9. Resultados discordantes y kappa entre los ensayos de LTR-PCR, POL-PCR y ELISA

Edad LTR/Pol Pol/ELISA LTR/ELISA

DíasLTR+ LTR-

κPOL+ POL-

κLTR+ LTR-

κPOL - POL+ ELISA- ELISA+ ELISA- ELISA+

0 5 0 <0,2 0 0 <0,2 5 0 <0,215 13 0 0,09 0 1 <0,2 5 1 <0,230 16 4 <0,2 0 0 <0,2 12 0 <0,290 14 2 0,06 1 1 <0,2 11 1 <0,2180 13 4 0,59 0 2 <0,2 8 2 <0,2300 5 3 0,40 0 8 0,43 3 9 0,07

Total 66 13 0,25 1 12 0,58 44 13 0,03

κ = Kappa

3.3.8. Variabilidad genética en los cebadores del proyecto Craft

3.3.8.1. Cebadores Gin5-F y Gin3-R

El cebador Gin5-F presenta 3 posiciones degeneradas, una en el nucleótido 2 necesariapara cubrir la variabilidad descrita en esa posición, pero otras dos en el nucleótido 14 y 21 in-necesarias dado que se trata de posiciones conservadas en las siete secuencias analizadas. Porel contrario, el cebador no aparece degenerado en la posición 17 en la que se observa varia-bilidad con hasta 3 bases distintas en las 7 secuencias disponibles en GenBank (Figura 3.3).

Tabla 3-10. Resultados entre los ensayos LTR y ELISA a los 300 días

NúmeroLTR / ELISA

Díasde

MuestrasLTR+ LTR– LTR– LTR+

ELISA– ELISA+ ELISA– ELISA+Con Disc Kappa

300 26 3 4 4 15 73 27 0,35

POL / ELISA

POL+ POL– POL– POL+ELISA– ELISA+ ELISA– ELISA+

Con Disc Kappa

300 26 1 6 6 13 73 27 0,44

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 83

El cebador Gin3-R presenta 4 posiciones degeneradas para abarcar la gran variabilidaddescrita en la zona de hibridación. Sin embargo en la posición 22 aparece una variación en unade las secuencias que no se ha considerado a la hora de diseñar el cebador, su localización en elextremo 3’ del cebador sugiere que podría dar lugar a problemas de amplificación (Figura 3.4).


84

5’ 3’Gin5-F G M T A G A G A C A T G G Y G A G G C A R GNC_001452 - C - - - - - - - - - - - C - - A - - - A -NC_001511 - A - - - - - - - - - - - C - - C - - - A -M31646 - A - - - - - - - - - - - C - - C - - - A -M60610 - C - - - - - - - - - - - C - - A - - - A -M10608 - C - - - - - - - - - - - C - - A - - - A -S51392 - A - - - - - - - - - - - C - - A - - - A -NC_001463 - A - - - - - - - - - - - C - - G - - - A -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22R= A+G, Y= C+T, M= A+C

Figura 3.3. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin5-F en el gen gag

5’ 3’Gin3-R D A G N C C A T G C T G C A T D G C Y A C T G TNC_001452 A - - T - - - - - - - - - - - T - - C - - - - -NC_001511 A - - T - - - - - - - - - - - T - - T - - - - -M31646 A - - T - - - - - - - - - - - T - - T - - - - -M60610 A - - T - - - - - - - - - - - T - - C - - - - -M10608 A - - T - - - - - - - - - - - T - - C - - - - -S51392 A - - G - - - - - - - - - - - A - - C - - A - -NC_001463 G - - G - - - - - - - - - - - T - - T - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24N= A+C+T+G, Y= C+T, D= A+T+G

Figura 3.4. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Gin3-R en el gen gag

3.3.8.2. Cebadores Craft F y Craft R

El cebador Craft F presentó 3 posiciones degeneradas en los nucleótidos 11,18 y 20, sinembargo la variación sólo se presenta en estas posiciones en la secuencia caprina(NC_001463). Así mismo en el nucleótido 14 sólo sería complementaria a 3 de las 7 secuen-

5’ 3’Craft F T G A C A G A A G G R A A T T G T Y T R T G GNC_001452 - - - - - - - - - - G - - T - - - C - A - - -NC_001511 - - - - - - - - - - G - - C - - - C - A - - -M31646 - - - - - - - - - - G - - C - - - C - A - - -M60610 - - - - - - - - - - G - - C - - - C - A - - -M10608 - - - - - - - - - - G - - T - - - C - A - - -S51392 - - - - - - - - - - G - - C - - - C - A - - -NC_001463 - - - - - - - - - - A - - T - - - A - T - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23R= A+G, Y= C+T

Figura 3.5. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft F en el gen gag

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 84

cias (Figura 3.5). Algo similar sucede con el cebador Craft R, que contiene 3 posiciones de-generadas para incluir las variaciones debidas a la secuencia caprina. El nucleótido 10 no hi-bridaría con 3/6 secuencias ovinas. En cualquier caso al tratarse de una posición central delcebador su influencia en la amplificación sería mucho menor (Figura 3.6).


85

5’ 3’Craft R C C A Y A R A C A A T T Y C C T T C T G T C ANC_001452 - - - T - G - - - - - - C - - - - - - - - - -NC_001511 - - - T - G - - - G - - C - - - - - - - - - -M31646 - - - T - G - - - G - - C - - - - - - - - - -M60610 - - - T - G - - - - - - C - - - - - - - - - -M10608 - - - T - G - - - - - - C - - - - - - - - - -S51392 - - - T - G - - - G - - C - - - - - - - - - -NC_001463 - - - T - A - - - - - - T - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23R= A+G, Y= C+T

Figura 3.6. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Craft R en el gen gag

3.3.8.3. Cebadores OsloF y OsloR

El alineamiento de las 7 secuencias de LVPR con la secuencia de los cebadores de Oslo,mostró homología en todas las bases del cebador OsloF excepto una en la posición 10 donde seobserva variabilidad en 2/6 secuencias ovinas y en la secuencia caprina (Figura 3.7), mientrasque en el cebador Oslo R se observó falta de homología en hasta cuatro posiciones. (Figura 3.8)

5’ 3’OsloF C A A A C A G T G G C A A T G C A G C A T GNC_001452 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001463 - - - - - - - - - T - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Figura 3.7. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo F en el gen gag

5’ 3’OsloR G G C A T C A T G G C T A A T A C T T C T A ANC_001452 - - - - - - - - T - - G - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - - - - - C - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - T T - G - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - T - - G - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - -NC_001463 - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Figura 3.8. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador Oslo R en el gen gag

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 85

3.3.8.4. Cebadores POL F y POL R

El cebador POL F presentó una complementariedad en 19/22 bases entre el cebador ylas secuencias de LVPR y 3/22 uniones inespecíficas en las posiciones 2, 4 y 5 (Figura 3.9).Por otro lado, se observó variabilidad en 1/22 bases del cebador POL R (Figura 3.10).


86

5’ 3’POL F A T A G T A A A T G G C A T C A A G A T G CNC_001452 - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - G - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - T G - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001463 - G - G T - - - - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Figura 3.9. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL F en el gen pol

5’ 3’POL R T C C C G A A T T T G T T T C T A C C CNC_001452 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001463 - - - A - - - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 3.10. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador POL R en el gen pol

3.3.8.5. Cebadores LTR F y LTR R

En el alineamiento de las 7 secuencias de LVPR se observó completa complementarie-dad en 20/24 nucleótidos presentes en el cebador LTR F. La variabilidad observada fue en elnucleótido 6 (2/7 secuencias) y en el nucleótido 10 (1/7 secuencia). En ésta última se obser-vó además, una inserción de una timina en la secuencia caprina. (Figura 3.11). Por el contra-

5’ 3’LTR F T G A C A C A G C A A A T G T A A C C G C A A GNC_001452 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - A - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001463 - - - - - T - - - TT - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Figura 3.11. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR F en la región LTR

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 86

rio el cebador LTRR presenta el 100% de complementariedad con respecto a 7 secuencias deLVPR presentes en GenBank (Figura 3.12).


87

3.4. DISCUSIÓN

En este proyecto se consiguió reunir a expertos en LVPR de toda Europa, crear un ban-co de muestras de lentivirus ovinos y caprinos paneuropeo y llevar a cabo un estudio compa-rativo de las técnicas de PCR más utilizadas en Europa. Los ensayos realizados indican quees posible detectar aislados víricos ovinos y caprinos de distintos países con una sola PCR.Sin embargo, la sensibilidad y el grado de concordancia de los cinco ensayos analizados va-rió sustancialmente y la PCR diseñada para amplificar secuencias LTR fue la que detectó unmayor porcentaje de animales aparentemente infectados y la que tuvo numéricamente la me-nor proporción de resultados potencialmente falsos negativos. No fue posible realizar una es-timación de la sensibilidad y especificidad real de las PCRs porque como se explicó ante-riormente, no existe una técnica de referencia para el diagnóstico de la infección por SRLV.Se empleó la mejor alternativa de validación posible considerando muestras positivas las per-tenecientes a animales positivos a un ELISA recombinante y PCRs locales y muestras nega-tivas las de animales negativos a ambas técnicas.

El bajo grado de concordancia de las PCRs y la limitada sensibilidad de algunas de ellasse podría deber a una hibridación poco eficiente de los cebadores a las secuencias diana y/oa condiciones de reacción de PCR poco óptimas. Una hibridación deficiente asociada a va-riabilidad en las secuencias diana es probablemente la razón principal de la relativamente bajasensibilidad aparente puesto que el alineamiento y estudio comparativo de las secuencias enGenBank demostró alta variabilidad en las zonas de unión de ambos cebadores en todas lasPCRs salvo la LTR. Esto último podría justificar la mayor sensibilidad de la LTR-PCR res-pecto a las otras PCRs. Por otro lado, la aparentemente menor sensibilidad de la LTR-PCR enmuestras caprinas es compatible con la mayor variabilidad y la presencia de un nucleótido deinserción en la secuencia caprina.

La variabilidad genética es un fenómeno bien conocido en otros retrovirus [165] y paraintentar paliar la variabilidad en las secuencias diana los cebadores Gin5-F y Gin3-R [98], los

5’ 3’LTR R C C A C G T T G G G C G C C A G C T G C G A G ANC_001452 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001463 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Figura 3.12. Alineamientos de la zona de hibridación del cebador LTR R en la región LTR

01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 87

autores que diseñaron los cebadores Craft de este proyecto incluyeron posiciones degenera-das. Sin embargo, el estudio comparativo de los cebadores y las secuencias de GenBank de-mostraron que la posición de estos nucleótidos no se correspondió siempre con zonas varia-bles y al contrario, no se incluyeron bases degeneradas en algunas posiciones hipervariables.Es poco probable que se trate de errores en el diseño o síntesis de los cebadores y cabría es-perar que estos autores empleasen información propia no publicada sin considerar las sietesecuencias publicadas a la hora de diseñar sus cebadores. En cualquier caso no cabe duda quela alta variabilidad en las secuencias y la presencia de un excesivo número de posiciones de-generadas reducen la eficiencia de hibridación del cebador con las secuencias diana.

Las condiciones de reacción son otro factor crítico para obtener amplificación eficien-te y en particular la temperatura de hibridación, el número de ciclos de PCR y la concentra-ción de reactivos como el MgCl

2. Diferencias en alguno de estos parámetros explicaría la va-

riabilidad en los resultados obtenidos en un laboratorio con la misma PCR. Por ejemplo, enpruebas realizadas en Derio con la LTR-PCR la proporción de positivos con el “Kit-1”aumentó de 5/10 a 8/10 al aumentar el número de ciclos de PCR de 40 a 50 ciclos y con el“Kit-2” la proporción de positivos aumentó de 13/20 a 14/20 al incrementar la concentraciónde MgCl

2 de 2mM a 3mM, pero estas diferencias no son estadísticamente significativas.

Finalmente, cabe señalar que otro aspecto que explicaría la mayor sensibilidad de laLTR-PCR con respecto a otras PCRs es que en el provirus de los SRLV existen 2 secuenciasLTR y sólo una copia de los genes gag y pol. Los animales con infección por SRLV tienen ni-veles de viremia muy bajos y se ha estimado que sólo 1 monocito de cada millón contieneprovirus [106]. En estas circunstancias la presencia de dos copias de LTR en vez de una solade otros genes podría afectar de modo crítico a la sensibilidad de la técnica.

El estudio comparativo de las PCRs LTR-PCR y POL-PCR en 222 muestras pertene-cientes a corderos entre el nacimiento y los 300 días de edad confirmaron la mayor sensibili-dad de la LTR-PCR frente a la POL-PCR y un grado de concordancia regular entre las técni-cas. No es posible saber con total certeza si todos los resultados positivos a la LTR-PCR sonverdaderos positivos pero Extramiana y col. (2002) demostraron que su especificidad es del100% [79]. En el presente trabajo la LTR-PCR detectó 9 positivos en 222 muestras de ani-males supuestamente negativos en los laboratorios de Oslo, Pamplona, Milán y Deventer. Al-ternativamente, los resultados positivos a una PCR y no a las otras técnicas podrían ser ver-daderos positivos y constituir un ejemplo más de la conocida latencia serológica de los LVPR.Es posible que animales jóvenes infectados con dosis bajas de virus no seroconviertan pocotiempo después de producirse la infección. Más aún, el grado de concordancia entre las PCRsy el ELISA mejoró substancialmente al comparar el porcentaje acumulado de corderos PCR-positivos. Es bien conocido que la validez de las técnicas de diagnóstico varía en función dela población examinada como consecuencia de diferencias entre patógenos de distintas zonasgeográficas y otros factores como por ejemplo el grado de exposición al patógeno y la edadde los animales [198]. Como se describe en el capítulo cinco, la correlación entre la LTR-PCRy el ELISA aumentó de modo muy significativo con la edad de los animales, lo cual sugiereque es muy probable que los resultados positivos obtenidos en este trabajo fueron correcta-


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01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 88

mente interpretados y que la LTR-PCR es una técnica válida para detectar infección en ani-males jóvenes con infección reciente.

La existencia de animales infectados y serológicamente negativos indicaría la utilidadde la PCR para el diagnóstico de animales infectados en programas de control de la enferme-dad. Sin embargo el uso de esta técnica en estos programas podría verse limitado por su ele-vado coste comparado con los nuevos ELISAs recombinantes y por factores de tipo epide-miológico y de control del VMV. Por ejemplo, en un estudio reciente en rebaños lecheroslatxos en régimen semi-intensivo se observó que la incidencia de VMV fue baja [18]. En es-tas circunstancias quizás no es esencial detectar la infección inmediatamente después de pro-ducirse, antes de que los animales seroconviertan. Este aspecto vuelve a debatirse en los pró-ximos capítulos de esta tesis en los que se hacen nuevos estudios comparativos de laLTR-PCR y el ELISA recombinante para el diagnóstico de VMV en animales de distintasedades.


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01 TESIS 57 2/3/06 09:58 Página 89

4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBREY ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y

SANGRE DE OVEJAS SEROPOSITIVASY RELACIÓN CON LA INFECCIÓN

POR VMV EN CORDEROS

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 91

4.1. INTRODUCCIÓN

La vía lactógena es de gran importancia en la transmisión de los lentivirus de pequeñosrumiantes [1, 70, 209] y se piensa que el riesgo de transmisión es máximo en el cordero neona-to por el consumo de calostro de oveja infectada [110]. En un estudio reciente se observó que,efectivamente, el calostro de ovejas seropositivas es una buena fuente de infección pero no to-dos los corderos que tomaron calostro de madres seropositivas se infectaron [4]. Más aún la efi-ciencia de transmisión varió según la cantidad de calostro ingerida y según el modo de inges-tión del calostro, mediante biberón o mamado directamente de la madre. Entre los que tomaronel calostro con biberón el porcentaje de seroconversión se asoció positivamente al volumen in-gerido y osciló entre 29-61% mientras que en los que lo tomaron directamente de su madre sóloel 16% seroconvirtió. No se sabe por qué el riesgo de infección fue menor en los que mamarony podría deberse a que los corderos que maman toman menos calostro, a que el amamanta-miento se asocia con una producción mayor de saliva con propiedades anti-virales o que la tomamediante biberón favorece la aspiración de calostro y esto a su vez facilita la infección [4].

Independientemente de los factores descritos anteriormente, la ausencia de seroconver-sión en gran parte de los corderos que tomaron calostro de oveja seropositiva podría estar aso-ciada a que algunas de las madres seropositivas no estuviesen realmente infectadas, es decirque fuesen falsamente seropositivas y a que exista una pobre correlación entre el estado se-rológico materno y la presencia de virus en calostro. En el citado trabajo se empleó unELISA recombinante de tercera generación que se considera altamente específico (>98%)con lo que la probabilidad de obtener un falso positivo es muy baja. Por otro lado, como sedescribió en la revisión bibliográfica de la tesis aunque varios autores han demostrado la pre-sencia de virus en calostro de ovejas seropositivas, tanto integrado en células como libre [144,197, 230], no existen estudios cuantitativos de la relación entre el estado serológico materno,la presencia de virus en calostro y el riesgo de infección en los corderos ni trabajos compara-tivos entre distintas técnicas de diagnóstico de MVV en calostro.

Es posible investigar la presencia de virus integrado en células calostrales mediante laLTR-PCR descrita en los capítulos anteriores sin embargo no es posible emplear esta técnicapara detectar la presencia de virus libre ya que las secuencias LTR no se encuentran como talen el ARN del virus libre.

Este capítulo describe los resultados de un estudio cuyos objetivos fueron diseñar en-sayos de PCR para detectar la presencia de virus libre e integrado en muestras de calostro,comparar dichas técnicas e investigar la relación entre la presencia de virus en calostro y lainfección en los corderos.


4.2.1. Abordaje experimental y población de estudio

Se llevaron a cabo ensayos de diagnóstico de VMV en sangre y calostro de oveja conel fin de: (i) detectar la presencia de anticuerpos ELISA frente a VMV en plasma sanguíneo

93

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 93

en muestras tomadas un mes antes del parto y una semana después del parto y en el compo-nente no celular del calostro (ii) identificar provirus MV en células sanguíneas y en célulassomáticas (CS) calostrales mediante LTR-PCR y en CS mediante Gag-PCR y (iii) investigarla presencia de VMV libre en el componente no celular del calostro mediante una PCR trans-criptasa inversa (Gag-RT-PCR).

Una vez realizados estos ensayos se llevó a cabo un estudio comparativo de las técnicasde diagnóstico empleadas y finalmente se investigó la relación entre los resultados diagnósti-cos en calostro y el riesgo de infección en corderos que consumieron calostro con virus. Estoscorderos pertenecían a tres grupos experimentales, PFO, PSOL y PSOH de un experimento di-señado para investigar la importancia relativa del calostro en la infección por VMV descritosen detalle por [4]. Brevemente, los corderos nacieron durante 3 años de ovejas seropositivasdel rebaño experimental de NEIKER. Al nacimiento, los corderos del grupo PFO se mantu-vieron con la madre en el seno del rebaño adulto y se les permitió mamar de modo natural. Porel contrario, los corderos PSOL y PSOH se separaron de la madre al nacimiento y se llevarona una nave distinta sin ovinos adultos y se les proporcionó un volumen de calostro de oveja se-ropositiva según su peso al nacimiento. Los corderos PSOL tomaron entre 193-830 ml de ca-lostro y los corderos del grupo PSOH tomaron entre 850-1390 ml de calostro.

A partir de las primeras 24 horas de vida todos los corderos se criaron juntos en la naveseparada del rebaño principal hasta los 300 días de edad, momento en el que se analizó la pre-sencia de anticuerpos ELISA en los corderos.

4.2.2. Obtención de muestras, análisis de AC por ELISA y detección de provirus MVmediante LTR-PCR

Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 10 ml con anticoagulante EDTA y lasmuestras de calostro en envases de polipropileno de 50 ml. El procesado de las muestras de san-gre para obtener plasma, células blancas y la realización de ELISAy la LTR-PCR se llevó a cabosegún se describe en el capítulo ensayos de PCR para el diagnóstico de LVPR en Europa.

4.2.3. Obtención de CS y componentes no celulares de calostro

Se partió de un volumen inicial de 35 ml de muestra de calostro y tras añadir 15 ml dePBS estéril para reducir su viscosidad, se centrifugó la mezcla a 2.000 g en una centrífugaMegafuge 1,0 (Haraeus) durante 10 minutos a 4°C. A continuación se eliminó la capa supe-rior de grasa con una espátula de madera y se decantó el tubo para separar el sobrenadante delas CS. Se congeló el sobrenadante a –70°C para posteriormente realizar el ELISA y la Gag-RT-PCR. Se lavaron las CS tres veces resuspendiendo el sedimento en 30 ml de PBS y cen-trifugando a 2.000 g durante 10 minutos en cada ocasión. Finalmente se diluyeron las CS en4ml de PBS y tras dividir la muestra en cuatro volúmenes iguales en tubos de 1,5 ml de poli-propileno, se centrifugaron los tubos a 14.000 g en una microcentrífuga (Biofuge Heraeus)


94

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 94

durante 1 minuto, se decantó el sobrenadante y se almacenaron las CS a –20°C para poste-riormente realizar una LTR-PCR y una Gag-PCR.

4.2.4. Obtención de ARN del sobrenadante de calostro

Se utilizó el Kit Qiagen (RNeasy® Lipid Tissue Mini for total ARN isolation from adipo-se tissue, brain and other fatty animal tissues) para obtener ARN del sobrenadante de calostro si-guiendo el protocolo descrito en el kit. Tras descongelar las muestras de sobrenadante, se sepa-raron 100 µl y una vez a temperatura ambiente se añadieron 200 µl de cloroformo y trashomogenizar la muestra de manera vigorosa durante 15 segundos se centrifugó la mezcla a12,000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de recuperar la fase acusa supe-rior donde se encuentra el ARN. Acontinuación se añadieron 600 µl de etanol 70% a la fase acuo-sa y tras homogeneizar la mezcla con un vórtex durante varios segundos se pasó la mezcla a unacolumna (mini spin column) que se centrifugó a 8.000 g durante 15 segundos a temperatura am-biente con el fin de separar el componente líquido del ARN total que queda unido a la membra-na de la columna. Para completar los 900 µl de mezcla fue necesario repetir este paso dos veces.A continuación se lavó la membrana añadiendo 700 µl de buffer RWI* y centrifugando durante15 segundos a 8000g. Después se secó la columna en dos pasos, en el primero se añadieron 500 µlde Buffer RPE* y se centrifugó la columna durante 15 segundos a 8.000 g y en el segundo pasose añadieron 500 µl de Buffer RPE* y se centrifugó la columna durante 2 minutos a 8.000 g. Fi-nalmente se recuperó el ARN de la membrana añadiendo 50 µl de agua libre de ARNsas y cen-trifugando la columna a 8.000 g durante 1 minuto y se congeló a –70 °C para su uso posterior.

4.2.5. Tratamiento con DNAsas en las muestras de ARN

Se utilizó el Kit RQ1 ARNse free DNase,Promega® para tratar las muestras con DNAsas.En un vial de polipropileno de 1,5 ml se mezclaron 8 µl del ARN diluido en agua del paso an-terior con 1,5 µl de RQ1 Rnase Free DNase 10X Reacción Buffer+, 3 µl de RQ1 Rnase FreeDnase+ y 2,5 µl de agua libre de nucleasas. A continuación se incubó la mezcla a 37°C du-rante 30 minutos y al término de la incubación se adicionó 1,5 µl de RQ1 Dnase stop solu-tion+, aumentando la temperatura a 65°C durante 10 minutos con el fin de frenar la reacción.Finalmente se congeló la muestra –70°C hasta su posterior uso.

4.2.6. Concentración y pureza del ARN

Se midió la pureza y la concentración del ARN extraído con un espectrofotómetro Nano-drop ND-1000 (NanoDrop technologies). Se tomaron 2 µl de muestra, calculando la pureza conel ratio de absorbancia 260/280 nm. Un ratio de ~2,0 es aceptado como ARN puro, mientras que

4. DETECCIÓN POR PCR DE VMV LIBRE Y ASOCIADO A CÉLULAS EN CALOSTRO Y SANGRE DE OVEJAS...

95

* Reactivo proporcionado por el KIT (Qiagen)+ Reactivo proporcionado por el KIT (Promega)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 95

un ratio menor indica baja pureza. La concentración de ARN, se calculó multiplicando la A260por la constante de análisis que en el caso del ARN es de 40 (Concentración = A260X50) [194].

4.2.7. Diseño de la GAG-PCR

Se diseñaron una pareja de cebadores de la región gag del VMV, S51392 publicada enGenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) (Figura 4-1). Para ello se realizó unestudio de las secuencias disponibles y se seleccionó una región conservada del gen gag, loscebadores se diseñaron reuniendo las condiciones adecuadas para una correcta amplificaciónobteniendo un fragmento de menos de 25 bases, con un porcentaje de guaninas (G) y citosinas(C) entre el 40 y 60% evitando la formación de dímeros y una Tm similar entre los cebadores.


96

1 11110 20 30 40 50 60 70 80 90 100(1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAAGTAGGGAAATACCCTTCACAGGACGAAAAGGCGCTGCTGGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCAGCCCTGAGM31646MVV (1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAAGTAGGGAAATACCCTTCACAGGACGAAAAGGCGCTGCTGGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCAGCCCTGAGNC_001511MVV (1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGGAA-GTAGGGAATAGCCCTTCAGTGAAGGAGAAAGTGTTGCTTGGGCACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCCTTAM60610MVV (1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGGAA-GTAGGGAATAGCCCTTCAGTGAAAGAGAAAGTGTTGCTTGGGCACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCCTTANC_001452MVV (1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAA-GTAGGGAATAACCCTTCGACGAAAGAAAAGGCGCTGCTTGGCGACAGGAGGAGGGCTCGCGACCCTGTAS51392MVV (1)

GGGACGCCTGAAGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAA GTAGGGAATAACCCTTCA GAA GAAAAGGCGCTGCTTGGGGACAGGAGGAGGGTTCGCGACCCTGTAConsensus (1)

112 222120 130 140 150 160 170 180 190 200 210(112)

--ACTTAAAGAAGGGGACGAGCCC-TCCGCCTGAACCTGAGGAGTGCAAAGGCAGCGCTAGTAAGAAAACCGCCGTGGTGAATCTAGATAGAGACATGGCGACGCAAGGCTM31646MVV(112)

--ACTTAAAGAAGGGGACGAGCCC-TCCGCCTGAACCTGAGGAGTGCAAAGGCAGCGCTAGTAAGAAAACCGCCGTGGTGAATCTAGATAGAGACATGGCGACGCAAGGCTNC_001511MVV(112)

GAA--AGACGGAGGGG-CGCGGGCGTCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTGGTAAGGAAGCCGCCGTGGTGAGGCTAGCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTM60610MVV(111)

-AA--AGACGGAGGGG-CACGGGCGTCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTGGTAAGGAAGCCGCCGTGGTGAGGCTAGCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTNC_001452MVV(111)

ATAGGAGAAGCAGGGG-CGAGCTC-TGGTCCTGGACCTGAGGAGGGCAAGTGCAGCGCTGGTAAGGAAACCGCCGTGGTGAGTCTAGATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTS51392MVV(111)

A AGAAG AGGGG CGAGC C TCCTCCTGGACCTGAGGAG GCAAG GCAGCGCTGGTAAGGAAACCGCCGTGGTGAGTCTAGATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTConsensus(112)

223 333230 240 250 260 270 280 290 300 310 320(223)

CAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACATGTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGM31646MVV(220)

CAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACATGTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGNC_001511MVV(220)

CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTGTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGM60610MVV(219)

CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTGTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGNC_001452MVV(218)

CAAGAGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATAAGGAAAACATGTAGGATAAGAGTAGGCCCAAGGGAAGGAGAACCCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGS51392MVV(220)

CAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATTAAGACAACATGTAAAATAAGGGTAGGGCCC GGGAAGGAGA CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGConsensus(223)

334 444340 350 360 370 380 390 400 410 420 430(334)

CCTTAAAAACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAACTCCAGAAGAAACAAM31646MVV(328)

CCTTAAAAACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAACTCCAGAAGAAACAANC_001511MVV(328)

CATTAAAAACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAACTCCGGAGGAAACAAM60610MVV(327)

CATTAAAAACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAACTCCGGAGGAAACAANC_001452MVV(326)

CATTAAAAACTGTAGACTTTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAGTTAACTCCAGAAGAGACAAS51392MVV(331)

CATTAAAAACT TAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGAC ATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAG TAACTCCAGAAGAAACAAConsensus(334)

445 555450 460 470 480 490 500 510 520 530 540(445)

GTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGM31646MVV(439)

GTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGNC_001511MVV(439)

GCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAACCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGM60610MVV(438)

GCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGNC_001452MVV(437)

GTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACAATGGCTTGCCTTATGTGTAGTCAGCTGGGTATGAAACCCGAGACAGTGCAAGCAGCAAGGGGAATAATGCATATGAAAGS51392MVV(442)

GTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACATTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCATGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAGGGGAATAATAAGTATGAAAGConsensus(445)

556 666570 580 590 600 610 620 630 640 650(556)

AAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGAAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGAM31646MVV(550)

AAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGAAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGANC_001511MVV(550)

AAGGACTACAAGAAAATAAGGAGGCCAAGGGGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTACCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGAM60610MVV(549)

AAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGGGGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGANC_001452MVV(548)

AAGGACTACAGGAGAATAAGGAGGAAAAGGAGAAAAAGGTAGAACAACTCTACCCTAATTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTACCCTATTGTAAATCTGCAAGCAGGGGGGAS51392MVV(553)

AAGGACTACACGAAAATAAGGAGGA AAGGAGAAGAAGGTAGAACAACTCTACCC AACTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAAGCAGGAGGGAConsensus(556)

641 751650 660 670 680 690 700 710 720 730 740(641)

TATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGAM31646MVV(635)

TATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGANC_001511MVV(635)

TATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGAM60610MVV(634)

TATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGANC_001452MVV(633)

TATTGTAAATCTGCAAGCAGGGGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGATTCAGTAGTCTTCCAGCAATTGCAAACTGTGGCTATGCAGCATGGCCTTGTGTCCGAGGATTTTGAS51392MVV(638)

TATTGTAAATTTGCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGTGTCCGAGGATTTTGAConsensus(641)

Figura 4.1. Zona amplificada por los cebadores gag


Se empleo la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiInfo 6.0(CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordancia entre dostécnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del 5% (p<0,05).

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 96

4.3. RESULTADOS

4.3.1. Cebadores y condiciones de reacción de la GAG-PCR

En el alineamiento realizado a partir de las 6 secuencias del VMV obtenidas por Gen-Bank, se observa un 100% de complementariedad (20/20 nucleótidos) entre los cebadores yla zona de hibridación (Figura 4.2 y Figura 4.3). Los cebadores diseñados amplifican un frag-mento de 744 bases.

La secuencia de los cebadores y el amplicón puede observarse en la Figura 4.1. La con-centración de reactivos, el número de ciclos y las temperaturas de desnaturalización, hibrida-ción y elongación de las PCRs empleadas se describen en la Tabla 4.2.


97

5’ 3’Gag F G G G A C G C C T G A A G T A A G G T ANC_00145 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 4.2. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag F en el gen gag

5’ 3’Gag R T C A A A A T C C T C G G A C A C A A GNC_00145 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -NC_001511 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M31646 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M60610 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -M10608 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S51392 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figura 4.3. Alineamiento de la zona de hibridación del cebador gag R en el gen gag

Tabla 4.1. Cebadores empleados

Nombre DianaTamaño del

CebadorSecuencia

amplicón ( 5’- 3’ )Tm

gag F G G G A C G C C T G A A G T A A G G T A 55,6°CGag-PCR gag 744pb

gag R T C A A A A T C C T C G G A C A C A A G 54,8°C

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 97

4.3.2. Porcentaje de ensayos de PCR y ELISA positivos

Se realizaron 988 ensayos de PCR y ELISA en muestras de sangre y calostro de ovejas.La Tabla 4.3 presenta el porcentaje de positivos a ambas técnicas en muestras de calostro ysangre tomadas el día del parto y la Tabla 4.4 el porcentaje de resultados ELISA-positivos enlas mismas muestras y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto. El porcentajede resultados PCR-positivos osciló entre 49-54% y no se observaron diferencias según el tipode muestra (p>0,05) (Tabla 4.3). Por el contrario, el porcentaje de resultados ELISA-positi-vos fue 79-84% y tampoco hubo diferencias significativas según el tipo de muestra y el mo-


98

Tabla 4.2. Tipo y concentración de reactivos de PCR y volumen, número de ciclos y temperaturas dereacción

Protocolo Reactivos Concentración Volumen Ciclos TemperaturaFinal

Buffer 1x 2,50 µl 1 95°C/5’

DNTPs 200 µM 2,50 µl 50 94°C/45’’

Mg2Cl 2,5 mM 1,25 µl 60°C/30’’

Cebador 1 0,5 µM 1,25 µl 72°C/1’30’’

Gag-PCR Cebador 2 0,5 µM 1,25 µl 1 72°C/10’

Taq Polimerasa 3U 0,60µl

ADN 500 ng 5,0 µl

Agua 10,65 µl

Volume Total 25 µl

Buffer (Mg2Cl) 5X 10 µl 1 50°C/30’

DNTPs 400 µM 2 µl 1 95°C/15’

Cebador gag1 0,3 µM 1,5 µl 50 94°C/45’’

Cebador gag2 0,3 µM 1,5 µl 60°C/30’’Gag-RT-PCR

(Qiagen) RT-PCRenzyme mix (Qiagen) 2 µl 72°C/1’30’’

ARN 120 ng 7 µl 1 72°C/10’

Agua libre deARNse 26 µl

Volumen Total 50 µl

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 98

4.3.3. Comparación de técnicas de diagnóstico en calostro y sangre

El grado de resultados discordantes, concordantes, coeficiente kappa y grado de con-cordancia de las técnicas diagnósticas en calostro y sangre se describe en la (Tabla 4.5).

El grado de concordancia para los ELISAs realizados en sangre y calostro fue muy bue-no (Tabla 4.5). El grado de concordancia de las PCRs en las muestras de calostro fue buenoentre la LTR y las Gag (Gag y Gag-RT) y moderado entre la Gag-RT y la Gag. La concor-dancia entre la LTR en sangre y calostro también fue moderada. Finalmente la concordanciaentre los resultados ELISA y PCR en calostro y sangre sólo fue regular.


99

Tabla 4.3. Porcentaje de PCR-positivos en muestras de calostro y sangre de ovejas tomadas el día delparto

Tipo de PCR y muestra

Año LTR sangre Gag calostro LTR calostro Gag-RT-PCR calostro Total

Núm. %+ Núm. %+ Núm. %+ Núm. %+

A 59 73 62 58 64 61 54 52 239B 67 33 62 53 62 39 67 55 258C 6 20 19 42 19 42 19 32 63

Total 132 50 143 54 145 49 140 51 560

Tabla 4-4. Porcentaje de ELISA-positivos en muestras de calostro y sangre de oveja tomadas el díadel parto y en muestras de sangre tomadas un mes antes del parto

Tipo de muestra y momento de obtención

SangreAño Calostro Total

Al parto 1 mes antes del parto

Núm. % + Núm. % + Núm. % +

A 64 84 61 82 64 83 189B 67 78 67 78 67 81 201C 19 68 0 0 19 100 38

Total 150 79 128 81 150 84 428

mento en el que se tomaron las muestras (p>0,05) (Tabla 4.4). Entre las muestras de calostroELISA-positivas procesadas por PCR, el 78% (78/100) fue positiva a una o más PCRs y elporcentaje de positivas según la técnica de PCR fue 56% (66/114) para la LTR, 62% (67/109)para la Gag-RT-PCR y 65% (73/112) para la Gag (p>0,05).

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 99


100

Tabla 4.5. Resultados discordantes, concordantes y coeficiente kappa entre parejas de técnicas dediagnóstico PCR y ELISA de VMV en muestras de calostro y sangre

A) PCRs en muestras de calostro

Ensayo - tipo de muestras Con* Dis* kappa Grado de concordancia

Gag -RT-calostro Gag –calostro 79 21 0,58 moderado

Gag-RT-calostroLTR-calostro 81 19 0,63 bueno

Gag-calostro LTR-calostro 82 18 0,63 bueno

B) ELISA2 y PCRs en muestras de calostro


Gag-calostro ELISA2 calostro 70 30 0.40 regular

LTR-calostro ELISA2 calostro 63 37 0,28 regular

C) ELISA2 y LTR-PCR en muestras de sangre

Ensayo - tipo de muestras Con* Dis* Kappa Grado de concordancia

ELISA2 sangreLTR-sangre 63 37 0,25 regular

D) PCRs en muestras de calostro y sangre

Ensayo - tipo de muestras Con* Dis* Kappa Grado de concordancia

Gag-calostro LTR-sangre 67 33 0,34 regular

LTR-calostro LTR-sangre 71 29 0,42 moderado

Gag-RT calostroLTR-sangre 67 33 0,35 regular

E) ELISA2 en muestras de calostro y sangre


ELISA2 calostroLTR-sangre 61 39 0,22 regular

ELISA2 calostroELISA2 sangre 98 2 0,95 muy bueno

F) ELISAs en muestras de sangre 1 mes antes y poco después del parto


ELISA1 sangreELISA2 sangre 98 2 0,92 muy bueno

ELISA 1 y 2 = ELISA un mes antes del parto y poco después del parto, respectivamente.Con y Dis* = % Resultados concordantes y discordantes, respectivamente.

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 100

4.3.4. Seroprevalencia en corderos criados con calostro VMV-seropositivo según el es-tado de VMV-PCR del calostro y el modo de ingestión del calostro

El porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad varió según el esta-do VMV-PCR del calostro y el volumen de calostro ingerido mediante biberón (Tabla 4.6).De este modo, entre los corderos que mamaron de sus madres o tomaron cantidades mediasy bajas de calostro con biberón, la proporción de corderos ELISA positivos a los 300 días fuesignificativamente mayor en los que tomaron calostro LTR-positivo que en los que tomaroncalostro LTR-negativo. Sin embargo, para las PCRs Gag este efecto sólo se observó entre loscorderos que tomaron cantidades medias y bajas de calostro mediante biberón.

Finalmente, no se observó una relación entre el estado de LTR de la madre en sangre yla probabilidad de que los corderos fuesen seropositivos a los 300 días de edad.


101

Tabla 4.6. Porcentaje de corderos ELISA-positivos a los 300 días de edad en función del estado dePCR del calostro, el modo de ingestión del calostro y el volumen de calostro ingerido me-diante biberón

Grupo Tipo de Tipo de Estado Número de % ELISA + Valorexperimental ensayo muestra de PCR animales a los 300 días de Pde edad

PFO Negativo 25 16 0,95PFO Positivo 26 15

PSOH Gag-RT Calostro Negativo 9 67 0,60PSOH Positivo 13 77

PSOL Negativo 10 10 0,014PSOL Positivo 15 60


PSOH Gag Calostro Negativo 6 67 0,80PSOH Positivo 18 72



PSOH LTR Calostro Negativo 6 67 1PSOH Positivo 18 67



PSOH PCR (todas) Calostro Negativo 8 75 0,74PSOH Positivo 19 68



PSOH LTR (parto) Sangre Negativo 12 67 0,66PSOH Positivo 12 75


02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 101

4.4. DISCUSIÓN

Con el fin de estudiar la presencia de VMV asociado a células de calostro se empleó unensayo LTR-PCR publicado por Álvarez y col. (2004) [4] y para estudiar la existencia deVMV libre, no asociado a células, se diseñó una nueva PCR con cebadores para amplificarun segmento del gen gag de VMV a partir de las 6 secuencias completas de VMV disponi-bles en el GenBank. El ensayo Gag se empleó también para detectar virus integrado. La pro-porción de calostros PCR-positivos fue similar para los tres ensayos (LTR, Gag y Gag-RT) yel porcentaje de resultados concordantes entre dos técnicas fue próximo al 80%, indicandouna alta correlación entre la presencia de virus libre e integrado en el calostro.

El estudio demuestra que los corderos que tomaron calostro PCR-positivos y sobre todolos que tomaron calostro LTR-positivo, tuvieron una probabilidad significativamente mayorde seroconvertir a los 300 días que los que tomaron calostro PCR-negativo, excepto los cor-deros que tomaron >830 ml de calostro mediante biberón (grupo PSOH). Esto último sugie-re que la mayoría del calostro ingerido por los corderos del grupo PSOH contenía virus aun-que en algunos casos en cantidad inferior a la detectable por PCR pero suficiente paraproducir infección cuando se toma una cantidad elevada de calostro. Por extensión es muyprobable que los calostros PCR-negativos de los otros grupos (PFO y PSOL) también tuvie-sen virus aunque al consumirse en baja cantidad no se alcanzó el umbral de infección. De he-cho, los niveles de seropositividad en los corderos de los grupos PFO y PSOL que tomaroncalostro LTR-negativo oscilaron entre 4% y 10%, similares al de los corderos que tomaroncalostro bovino [4]. Como ya se explicó diversos autores han demostrado la presencia deVMV en calostro de ovejas infectadas pero se desconoce la dosis mínima de virus en calos-tro capaz de producir infección. Cabe esperar que esta dosis no sea fija y dependa de otrosfactores como la cepa de virus y características propias de los animales. El empleo de nuevosensayos capaces de cuantificar la cantidad de virus presente en calostro, como la PCR a tiem-po real, permitirán un análisis más preciso de la relación entre la ingestión de calostro de ma-dres infectadas y el riesgo de infección en los corderos.

Se confirma el hallazgo realizado por Álvarez y col. (2004) [4] de que tomar el calos-tro mediante biberón es un factor de riesgo significativo en la transmisión del VMV vía lac-tógena y que se reduce considerablemente cuando los corderos maman directamente de susmadres. No se conocen las razones de ello y los citados autores sugirieron la posibilidad deque la administración de calostro mediante biberón podría facilitar la aspiración del calostroy la infección, y que el amamantado vaya asociado a un incremento de la producción de sali-va. La cual contiene sustancias con propiedades antivirales.

Desde el punto de vista del control este trabajo demuestra la utilidad de realizar ensa-yos de PCR en calostro para reducir el riesgo de infección en corderos. Esto sería especial-mente útil de cara a seleccionar calostro para almacenar y usar con posterioridad. Es posiblesin embargo, que el realizar PCRs para seleccionar calostros libres de virus sea una opciónmenos económica que las alternativas de someter el calostro a un tratamiento térmico queinactive el VMV o emplear calostro de vaca.


102

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 102

5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCRDE LA INFECCIÓN HORIZONTAL

POR VMV EN OVINO LATXO ADULTO CRIADO BAJO DISTINTAS PRESIONES

DE INFECCIÓN A VMV

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5.1. INTRODUCCIÓN

Los ovinos se pueden infectar con VMV en edades tempranas por vía lactógena alconsumir calostro y leche con VMV y durante su vida productiva por vía horizontal al es-tar en contacto con ovejas infectadas [184]. La importancia relativa de estas formas detransmisión y el estudio de la transmisión calostral ha sido objeto de varios estudios re-cientes mencionados en la revisión bibliográfica y el presentado en el quinto capítulo deesta tesis. Sin embargo, no se conocen bien los mecanismos y factores de riesgo asocia-dos a la transmisión horizontal de VMV. En la epidemia registrada en Islandia se demos-tró que la transmisión horizontal es muy eficiente cuando se introducen animales con in-fecciones subclínicas en rebaños con condiciones de confinamiento elevado. Es muyposible que la eficacia de la transmisión horizontal varíe en rebaños donde el VMV es en-démico y según el sistema de manejo del ganado. De hecho, ya se ha explicado que en unestudio reciente en rebaños lecheros latxos semi-intensivos del País Vasco en estabulación2-6 meses/año, se observó que la incidencia de seroconversión a VMV no fue alta y quehubiese sido posible reducir gradual y progresivamente la seroprevalencia centrando eldesvieje en animales seropositivos sin aumentar la tasa normal de desvieje del reba-ño [18].

En el anterior trabajo, la seroconversión se incrementó al aumentar el grado de contac-to con animales seropositivos y hasta los 4 años de edad y se observó una interacción entreambas variables, de modo que para un grado de contacto con seropositivos similar, la proba-bilidad de seroconvertir aumentó con la edad hasta los 4 años de edad. Esto podría ser el re-sultado de una menor habilidad de las ovejas de mayor edad con respecto a las más jóvenes,de controlar la infección y esta mayor susceptibilidad de las ovejas mayores podría ser porejemplo por padecer mayor estrés productivo y exposición acumulada al VMV. Alternativa-mente, las ovejas mayores expuestas de forma repetida al VMV desarrollaron anticuerpos de-tectables por la técnica IGDA con más facilidad que las ovejas más jóvenes, expuestas en me-nor grado a VMV. La técnica IGDA es muy específica pero recientemente se ha comprobadoque su sensibilidad comparado con el ELISA recombinante empleado en los análisis de estatesis es sólo 78% [229].

Al término del experimento para evaluar la importancia del calostro en la transmisiónde VMV mencionado en los capítulos anteriores hubo la posibilidad de formar dos grupos ex-perimentales de corderos de 1 año de edad mayoritariamente seronegativos y de someterlosa distintos niveles de exposición a VMV y comprobar indirectamente la eficacia de la trans-misión horizontal en ganado estabulado mediante ELISA y PCR. Algunos de estos corderoshabían sido PCR-positivos en alguna de las seis ocasiones en que se habían analizado duran-te el primer año de vida a pesar de no haber seroconvertido al año de edad. La posibilidad deseguir manteniendo estos animales en experimentación ofreció pues la posibilidad añadida decomprobar la relación entre haber sido PCR-positivo durante el primer año de vida y sero-convertir posteriormente y en general de evaluar la relación entre las técnicas PCR y ELISAque durante el primer año de vida fue sólo moderada.

105

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 105


5.2.1. Diseño experimental y población de estudio

El estudio duró 3 años entre diciembre 2000 y noviembre 2003 y participaron 191 ani-males, de los cuales 176 habían participado previamente en el estudio de transmisión calostralde VMV antes mencionado [4, 5]. Al inicio del estudio los animales tenían 1 año de edad, 162eran seronegativos a ELISA y 29 eran seropositivos. Entre los seronegativos, 124 individuoshabían sido PCR-negativos en 6 muestreos desde el nacimiento hasta los 10 meses de edad ylos 38 restantes habían sido PCR-positivos en al menos y sobretodo (82%) en una ocasión.

Los animales se distribuyeron en dos grupos experimentales que se describen abajo, elgrupo H sometido a un grado de exposición del VMV alto y el grupo L sometido a una ex-posición del VMV baja. La seroprevalencia por ELISA al inicio del experimento fue alrede-dor del 15% (ver resultados) en ambos grupos y a partir de entonces se analizó la presenciade anticuerpos ELISA cada seis meses y de VMV en sangre cada 12 meses hasta los 4 añosde edad como máximo.

El grupo H constó de 147 ovejas nacidas en enero del 2000, 2001 y 2002 que fueron in-troducidas como animales de reposición al rebaño experimental en producción lechera deNEIKER. En este rebaño las ovejas se estabulan durante un periodo de aproximadamente 6meses en una nave de 35x13x4-m y pastan durante el resto del año. La seroprevalencia aVMV en este rebaño fue 66% (157/237) en diciembre de 2000, 42% (123/291) en diciembredel 2001 y 47% (128/271) en diciembre de 2002.

El grupo L incluyó 44 machos castrados nacidos en enero 2001 y que se mantuvieronen una nave separada de 20x9x4-m3 diseñada con buena ventilación. Durante la duración delexperimento no se introdujeron ovinos a esta nave excepto en enero 2002 en el que incorpo-raron 62 corderos recién nacidos que se mantuvieron en corrales separados durante los si-guientes 10 meses. La seroprevalencia en este grupo de corderos fue 8% (5/60) y dos corde-ros fueron PCR-positivos.

5.2.2. Obtención de muestras y ensayos de PCR y ELISA

Se tomaron muestras de sangre en tubos de vacío con EDTA cada seis meses excepto elprimer año en que se obtuvieron muestras al principio y a final de año. Las muestras de san-gre se procesaron para analizar anticuerpos en plasma con el ELISA y VMV integrado porLTR-PCR según se ha descrito en los capítulos anteriores.


Se empleo la técnica de chi-cuadrado de Yates para comparar proporciones en EpiIn-fo 6.0 (CDC, Atlanta) y se calculó el coeficiente kappa para medir el grado de concordan-


106

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 106

cia entre dos técnicas según Dohoo y col. (2003) [72]. Se tomó un nivel de significancia del5% (p<0,05).

5.3. RESULTADOS

5.3.1. Porcentaje de ovejas ELISA y PCR positivas

El porcentaje de animales ELISA-negativos y PCR-positivos en los grupos H y L sedescriben en la Figura 5.1. La prevalencia en el grupo H aumentó significativamente de un16% en ovejas de un año de edad al 57% en ovejas de 3 años de edad (p<0.05) y se mantuvoestable a partir de los 3 años (p<0.05). Por el contrario la seroprevalencia en el grupo L fue14% en carneros de 1 año de edad y no ascendió más allá del 18% en animales de 1,5 y 2 añosy fue significativamente menor que en el grupo-H y en todas las edades exceptuando al añode edad (p<0.05).

El porcentaje de PCR-positivos fue similar al porcentaje de ELISA-positivos entre gru-pos. En grupo H aumentó de 11% en ovejas de 1 año de edad a 49% en animales de 2 años yfue similar en edades posteriores, mientras que en el grupo L no varió significativamente se-gún la edad y osciló entre 18% al año de edad y 14% a los 2 años Figura 5.1. Exceptuando alaño de edad la proporción de PCR-positivos fue significativamente menor en el grupo L queen el H. (p<0.05).

5. ANÁLISIS MEDIANTE ELISA Y LTR-PCR DE LA INFECCIÓN HORIZONTAL POR VMV EN OVINO LATXO...

107

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Edad (años)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Se

rop

reva

len

cia

(%)

ELISA grupo H

ELISA grupo L

PCR grupo H

PCR grupo L

Figura 5.1. Porcentaje de ovinos ELISA y LTR-PCR positivos según la edad en grupos de animalescriados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV

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5.3.2. Incidencia acumulada de seroconversión según la edad y el estado de PCR du-rante el primer año de vida

La incidencia acumulada de ELISA-positivos según la edad se presenta en la Figu-ra 5.2. En el grupo H la incidencia aumentó a 27% 6 meses después de que los corderos se in-trodujeran al ensayo y disminuyó gradualmente a partir de entonces hasta 0% a los 4 años deedad. Estos resultados contrastan con los del grupo L dónde sólo un animal seroconvirtió en-tre 1 año y 1,5 años de edad (Figura 5.2). Dentro del grupo H, la proporción de corderos queseroconvirtieron durante el estudio fue 42% (11/26) para los corderos con algún resultado po-sitivo de PCR durante el primer año de vida y 41% (31/91) en los que nunca fueron PCR-po-sitivos durante el primer año de vida (p>0,05). La edad media de seroconversión fue de dosaños de edad en ambos grupos.


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1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Edad (años)

0

10

20

30

40

50

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70

80

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100

Inc

ide

nc

iaac

um

ula

da

(%)

grupo H

grupo L

Figura 5.2. Incidencia acumulativa de ovinos ELISA-seropositivos según la edad en grupos de ani-males criados en condiciones de baja (grupo L) y alta (grupo H) presión de infección a VMV

5.3.3. Relación entre resultados de ELISA y PCR

Al final del experimento 109 ovinos no fueron nunca ELISA o PCR positivas, 78 fue-ron ELISA-positivos y PCR positivos al menos una vez, 3 ovinos fueron ELISA-negativos yPCR-positivos en una ocasión y 1 ovino fue ELISA-positivo y nunca PCR-positivo. Por tan-to, el porcentaje de concordancia de los resultados acumulados de ELISA y PCR fue 98% yel grado de concordancia k=0,95, considerado como casi perfecto [72]. Sin embargo, el por-centaje y grado de concordancia entre el ELISA y la PCR varió conforme a la edad (Figu-ra 5.3). El porcentaje de concordancia fue >88% a lo largo del tiempo y aumentó con la edadde k =0,63 (substancial) al año de edad a k=0,94 (muy bueno) entre ovejas de 4 años.

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5.4. DISCUSIÓN

Se considera que la transmisión horizontal del VMV es importante en todos los siste-mas de producción ovina [184], particularmente en aquellos en los que las ovejas se estabu-lan durante largo tiempo [106]. Sin embargo, a pesar de que la prevalencia de VMV en el gru-po L formado por 44 machos fue 14-18% sólo un animal se infectó durante los dos años quepermanecieron estabulados. Por el contrario, el contagio vía horizontal fue relativamente efi-ciente en el grupo H y similar a lo observado en rebaños lecheros caprinos [1, 183] y en unestudio epidemiológico previo en ovejas latxas [18]. Sin embargo, en contraste con estudiosprevios, el riesgo de infección fue mayor inmediatamente después de que las ovejas del gru-po H se introdujesen al resto del rebaño lechero y no aumentó hasta los 4 años. Este hallazgoes plausible biológica y epidemiológicamente y la explicación más probable es que las técni-cas de ELISA y la PCR utilizadas en el presente ensayo permitieron detectar la infección an-tes que la técnica IDGA empleada en el estudio anterior.

Comparativamente en este estudio se trabajó con pocos animales y no fue posible rea-lizar una investigación precisa de la contribución independiente entre edad y grado de con-tacto horizontal entre ovejas infectadas. Sin embargo, el riesgo de seroconvertir en el grupoH fue marginalmente mayor en el primer año que en el año 2 cuando la seroprevalencia delrebaño al inicio del año fue de 65% y 41% respectivamente, pero similar al tercer año cuan-do la seroprevalencia fue 47%. La seroprevalencia en el rebaño al comienzo del periodo deexposición a VMV no es una variable con un valor pronóstico de la incidencia de serocon-versión como la seroprevalencia media durante el periodo de exposición a VMV que tiene en


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1 2 3 4

Edad (años)

0

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40

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100

%co

nc

ord

an

cia

0,0

0,2

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1,0

co

efi

cie

nte

Ka

pp

a

concordancia

kappa

Figura 5.3. Porcentaje y coeficiente de concordancia, kappa, de las técnicas de diagnóstico de anti-cuerpos frente a VMV ELISA y de provirus VMV LTR-PCR según la edad de los ovinos

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cuenta que el tamaño del rebaño no es fijo y hay ovejas que entran y salen en el intervalo en-tre los análisis [18]. Aún así el número de animales en el grupo L no varió y a pesar de unaseroprevalencia inicial del 14% sólo un animal seroconvirtió después de 2 años. Claramenteotras variables además de la seroprevalencia en el rebaño influyen en la incidencia de sero-conversión. Los grupos H y L fueron distintos respecto a la edad de las ovejas infectadas, elestrés de producción y otros factores relacionados al manejo del rebaño. Los animales infec-tados del grupo L eran más jóvenes que los del grupo H y se ha visto que los corderos naci-dos de ovejas que han estado infectados durante más tiempo tienen más riesgo de infectarseque corderos nacidos de ovejas con infecciones más recientes [184]. Es muy posible que lacarga viral y la excreción de virus sea mayor en ovejas que llevan más tiempo infectadas queen las que llevan menos tiempo infectadas. Es probable que la cantidad de virus excretada porlos machos infectados de este estudio estuviese por debajo del umbral de infección del VMV.

La relación entre el estrés productivo y la susceptibilidad a las infecciones no está biendocumentada, por ejemplo, las vacas lecheras de alta producción son más susceptibles a su-frir mamitis clínicas que las vacas de baja producción [215]. De modo similar las ovejas enproducción lechera podrían estar más comprometidas inmunológicamente y ser más sensiblesa la infección de VMV que machos castrados inactivos. Además, las ovejas del grupo H sealojaron en una nave con mayor densidad de animales, más vieja y con peor ventilación quela nave que albergó al grupo L y a los ovinos del grupo H se les ofreció la comida en una cin-ta que permitía el contacto nariz con nariz entre ovejas en vez de en pesebres unidirecciona-les empleados para el grupo L.

Varios estudios han descrito diferencias en la seroprevalencia de VMV entre machos yhembras, sin embargo no hay razones biológicas aparentes que las justifiquen y se conside-ran asociadas al distinto manejo de carneros y ovejas en la mayoría de los rebaños [10, 213].

La correlación entre los resultados de ELISA y LTR-PCR en este estudio fue muy bue-na y significativamente mejor que durante los primeros 6 meses de vida [5]. Las dos técnicasson altamente específicas [79, 193, 229] y la diferencia en la sensibilidad podría deberse aque las técnicas miden procesos biológicos distintos. La LTR-PCR identifica provirus y elELISA detecta anticuerpos y ambos no tienen necesariamente que estar presentes simultáne-amente. El aumento de la concordancia de los ensayos con la edad sugiere que la viremia aso-ciada a células se incrementa con el tiempo de infección.

El riesgo de seroconvertir después de un año de edad fue independiente de haber teni-do un resultado PCR-positivo en seis análisis realizados durante el primer año de edad. Estopuede indicar que algunos individuos y bajo circunstancias particulares podrían ser capacesde eliminar la infección. Sin embargo no hay evidencia de autocuración en infecciones porVMV y retrovirus en general. Alternativamente, es posible que estos animales se infectasenpero no produjesen anticuerpos tempranamente. Otra posibilidad es que algunos de los resul-tados PCR-positivos se hubiesen interpretado erróneamente. Como ya se describió en el pri-mer capítulo experimental de esta tesis algunos laboratorios europeos obtuvieron algunos re-sultados aparentemente falsos positivos, sin embargo la prueba fue desarrollada y validada ennuestro laboratorio con un 100% de especificidad [79].


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Los resultados de este estudio tienen implicaciones importantes desde el punto de vis-ta del diagnóstico y control del VMV. Los ELISA recombinantes como el empleado en esteestudio bastarían para el diagnóstico rutinario de la infección por VMV en ganado adultopuesto que su sensibilidad es similar a la de la LTR-PCR y este último ensayo es mucho máscaro. Apenas hay estudios comparativos de distintos ensayos de PCR en la literatura interna-cional de VMV aunque como se describió en el capítulo cuatro la LTR-PCR fue más sensibleque todas las otras PCR analizadas.

Entre las implicaciones de este trabajo en el control del VMV cabe destacar que en vis-tas de que las corderas de reposición se infectan con facilidad al poco de entrar en el rebañolechero principal, es quizás poco el beneficio que se puede obtener criándolas artificialmen-te para evitar la infección lactógena. Es posible sin embargo, que si se previene la transmi-sión lactógena y se retrasa la infección, las ovejas puedan alcanzar la etapa de máxima pro-ductividad antes de padecer efectos clínicos por VMV.

Otro aspecto de control importante es que en determinadas circunstancias, como en lasdel grupo L, la infección horizontal puede mantenerse muy baja. Por extensión cabría espe-rar escasa transmisión horizontal en rebaños donde los animales tienen poco contacto entresí. Esto, unido a una transmisión lactógena relativamente baja [5] podría explicar que la pre-valencia de VMV en rebaños extensivos del sur de España sea escasa o nula (informaciónpendiente de publicación) y que la enfermedad no se haya diagnosticado nunca en paísescomo Australia y Nueva Zelanda [184]


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6. CONCLUSIONES FINALES

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(a) Elaboración de ensayos de PCR para el diagnóstico de las infecciones por LVPR enEuropa y análisis comparativo de las PCRs de LVPR más empleadas en Europa:

Primera: Es posible detectar LVPR de origen ovino y caprino de diferentes países deEuropa con distintas PCRs pero la sensibilidad de la técnica varía substancialmente según eltipo de ensayo, el laboratorio que lo realiza y el origen geográfico y la especie de la que pro-viene la muestra.

Segunda: Entre las PCRs analizadas la LTR-PCR fue más sensible que las PCRs queamplificaron secuencias gag y pol y esto podría estar asociado por un lado a una mayor he-terogeneidad genética en las secuencias empleadas para diseñar los cebadores GAG y POLque en las secuencias de los cebadores LTR y por otro lado, a que en los provirus de los LVPRexisten dos secuencias LTR y una sola secuencia gag y pol y esto duplica teóricamente la pro-babilidad de obtener un producto amplificado.

Tercera: La LTR-PCR permitió detectar la infección en animales jóvenes con anticuer-pos calostrales y en animales sin anticuerpos de lo que se deduce que la PCR puede cubrir lasnecesidades de diagnóstico durante un periodo en el que el ELISA no puede utilizarse.

(b) Detección por PCR de VMV libre y asociado a células en calostro y sangre de ove-jas seropositivas y la relación con la infección en corderos:

Primera: Se observó una buena correlación entre los ensayos de PCR para secuenciasLTR y gag de VMV libre y asociado a células en calostro de ovejas seropositivas indicandoque cuando hay VMV en calostro coexisten ambas formas víricas.

Segunda: No todos los calostros con anticuerpos frente a VMV fueron PCR-positivos,esto es compatible con que las técnicas miden procesos biológicos distintos y con que la can-tidad de VMV existente en calostro varíe sustancialmente.

Tercera: El riesgo de infección en los corderos por consumo de calostro con anticuer-pos anti-VMV pero PCR-negativo a VMV es significativamente menor que el asociado alconsumo de calostro PCR-positivo a VMV excepto cuando los corderos consumen gran can-tidad de calostro. Esto refuerza la hipótesis de que la cantidad de VMV en calostro con anti-cuerpos frente a VMV varía pero que el virus está presente en la mayoría de los calostros conanticuerpos.

Cuarta: En cualquier caso, la relación entre la presencia de virus en el calostro y el ries-go de seropositividad al año de edad dependió del modo de ingestión del calostro.

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(c) Análisis mediante ELISA y LTR-PCR de la infección horizontal por VMV en ovinoadulto de raza latxa criado bajo distintas presiones de infección a VMV:

Primera: Se confirma experimentalmente la eficacia de la transmisión horizontal deVMV en rebaños de raza latxa en ordeño y se observa por primera vez que la transmisión esmáxima durante el primer año de vida y aumenta con la edad hasta los 3 años de vida.

Segunda: Se observó una buena correlación entre el estado de PCR y de ELISA a par-tir del año de edad compatible con una mayor probabilidad de viremia al aumentar el tiempode infección.

Tercera: Finalmente, este estudio demuestra que la infección horizontal entre animalesinfectados y sanos estabulados y en el mismo corral puede ser mínima y que sería de gran uti-lidad investigar más los aspectos que condicionan la transmisión del agente para facilitar eldiseño de estrategias más precisas de control de la infección por VMV.


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7. APÉNDICE

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a) Diluyente de la muestra (DDM) = Tampón fosfato con cloruro sódico, Tritón 1, es-tabilizadores de proteína y kathon CG al 0,05% (conservador).

b) Solución de lavado (SDL) = Tampón fosfato con 1,25% de Tween 20.

c) Diluyente del conjugado (DDC) = Tampón fosfato con estabilizadores de la pro-teína y del enzima y Kathon CG 0,05% (conservador).

d) Conjugado = Anticuerpos de conejo frente a IgG de oveja marcado con peroxidasa(HRP)

e) Tetrametil Benzidina disuelta en Dimetil Sulfóxido (TMB): Sustancia reveladora.

f) Tampón del substrato (TDS) = Tampón citrato fosfato con 0,006% de peróxido dehidrógeno.

g) Fosfato Salino Estéril (PBS ) = 100mM NaCl, 3mM Na2HPO

4y KH

2PO

4, pH 7,8

con HCl

h) TE estéril a pH 8.0 = 10mM Tris.Cl (pH 8,0), 1mM EDTA (pH 8,0)

i) Dodecil Sulfato Sódico 10% (SDS) = 100g SDS, 900ml H20 a 68°C hasta disolver,

corregir pH a 7,2 con HCL, ajustar el volumen a 1000ml con H20.

j) Proteinasa K = 160U/ml

k) Fenol:Cloroformo:Alcohol Isoamílico (25:24:1 )

l) Cloroformo: Alcohol Isoamílico (24:1) = 96ml de CHCL3, 4ml de C5H11OH

m) Acetato Sódico 3M = 408,1g Acetato Sódico 3H20 en 800ml de H

20, corregir pH a

7.0 con ácido acético, ajustar el volumen a 1000ml con H20.

n) Bromuro de Etidio = 1mg/ml.

o) Azul de Bromofoenol al 10% = 0,25% azul de bromofenol y sacarosa 40%

p) Gel de agarosa al 2% = marca y calidad molecular en tampón TBE 1x

q) TBE 1X = Tris Borato EDTA: Tris Base 1M, ácido bórico 1M y EDTA 20mM

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8. ANEXOS

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123

1 10910 20 30 40 50 60 70 80 90(1)-----------------------------------------CCCTTCM10608gag (1)-----------------------------------------------M31646gag (1)-----------------------------------------------NC_001511gag (1)AGTAAGGTAAGAGAGACACCTACTGGGAAAGTAGGGAATAACCCTTCS51392gag (1)

NC_001463gag (1)M60610gag (1)

M60610gag#2 (1)NC_001452gag (1)

Consensus (1)

110 218120 130 140 150 160 170 180 190 200(110)GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTM10608gag (69)-----------------------------------------------M31646gag (1)-----------------------------------------------NC_001511gag (1)CAGGGGCGAGCTCTGGTCCTGGACCTGAGGAGGGCAAGTGCAGCGCTS51392gag(110)-----------------------------------------------NC_001463gag (1)GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTM60610gag (69)GGGGCGCGGGCG-TCCTCCTGGGCCGAGGGGACACAAGAGCAACACTM60610gag#2 (69)-----------------------------------------------NC_001452gag (1)GG GCG GC T TCCTGG CC GG CAAG GCA C CTConsensus(110)

219 327230 240 250 260 270 280 290 300 310(219)M10608gag(177)M31646gag (27)

NC_001511gag (27)S51392gag(219)

NC_001463gag (48)M60610gag(177)

M60610gag#2(177)NC_001452gag (27)

Consensus(219)

328 436340 350 360 370 380 390 400 410 420(328)ACTATAGACTTTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATM10608gag(283)ACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTM31646gag(133)ACCCTAGACTTTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTNC_001511gag(133)ACTGTAGACTTTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCATS51392gag(328)ACATTAGATTACATGTTTGAGGACCATAAAGAGGAACCTTGGACAAANC_001463gag(154)

M60610gag(283)M60610gag#2(283)NC_001452gag(133)

Consensus(328)

437 545450 460 470 480 490 500 510 520 530(437)M10608gag(392)M31646gag(242)

NC_001511gag(242)S51392gag(437)

NC_001463gag(263)M60610gag(392)

M60610gag#2(392)NC_001452gag(242)

Consensus(437)

546 654560 570 580 590 600 610 620 630 640(546)M10608gag(501)M31646gag(351)

NC_001511gag(351)S51392gag(546)

NC_001463gag(372)M60610gag(501)

M60610gag#2(501)NC_001452gag(351)

Consensus(546)

655 763660 670 680 690 700 710 720 730 740 750(655)M10608gag(610)M31646gag(460)

NC_001511gag(460)S51392gag(655)

NC_001463gag(460)M60610gag(610)

M60610gag#2(610)NC_001452gag(460)

Consensus(655)

Anexo 1. Alineamiento del gen gag secuencias descritas en PubMed

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124

764 872770 780 790 800 810 820 830 840 850 860(764)CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGM10608gag (719)CATGGACAAGCAAAGATATATTAGAAGTACTAGCCATGATGCCTGGAAATAGGGCGCAAAAAGAGTTAATACAGGGGAAATTAAATGAGGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGM31646gag (569)CATGGACAAGCAAAGATATATTAGAAGTACTAGCCATGATGCCTGGAAATAGGGCGCAAAAAGAGTTAATACAGGGGAAATTAAATGAGGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGNC_001511gag (569)CATGGACAAGCAAGGATATATTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGGAACAGAGCACAGAAAGAGCTGATTCAGGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGATGGGTAAGS51392gag (764)CCTGGACAAGTAAAGACATACTAGAAGTATTGGCCATGATGCCTGGAAATAGAGCTCAAAAGGAGTTAATTCAAGGGAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGAGAAGNC_001463gag (569)CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGTTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGM60610gag (719)CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGTTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGM60610gag#2 (719)CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAATTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGNC_001452gag (569)CCTGGACTAGTAAAGATATATTAGAAGTATTGGCTATGATGCCTGGGAATAGAGCACAGAAGGAGTTAATACAAGGAAAATTAAATGAAGAAGCAGAAAGGTGGGTAAGConsensus (764)

873 981880 890 900 910 920 930 940 950 960 970(873)ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTGGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAGM10608gag (828)GCAGAATCCCCCAGGGCCAAATGTCC------TTACTGTGGATCAGATTATGGGAGTCGGACAAACAAATCAACAGGCATCGCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAGM31646gag (678)GCAGAATCCCCCAGGGCCAAATGTCC------TTACTGTGGATCAGATTATGGGAGTCGGACAAACAAATCAACAGGCATCGCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAGNC_001511gag (678)GCAGAATCCGCCAGGGCCAAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATCATGGGAGTAGGACAAACAAATCAACAGGCATCACAGGCTAATATGGATCAACGAAGGGAAS51392gag (873)GAATAATCCACCACCTCCAGCAGGAGGAGGATTAACAGTGGATCAAATTATGGGGGTAGGACAAACAAATCAAGCAGCAGCACAAGCTAACATGGATCAGGCAAGGCAANC_001463gag (678)ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAAGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAGM60610gag (828)ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAAGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAGM60610gag#2 (828)ACAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC------TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTGGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCCAATATGGATCAGGCAAGACAGNC_001452gag (678)GCAAAATCCACCCGGGCCGAATGTCC TCACGGTGGATCAAATAATGGGAGTAGGACAAACCAATCAGCAGGCATCTCAAGCTAATATGGATCAGGCAAGACAGConsensus (873)

982 1090990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080(982)ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACTM10608gag (931)CTTTGCTTGCAGTGGGTAATAACAGCCTTGAGATCAGTAAGACATATGTCACACAGACCAGGAAATCCTATGCTGATAAAACAAAAGAATAGTGAAAGTTATGAAGATTM31646gag (781)CTTTGCTTGCAGTGGGTAATAACAGCCTTGAGATCAGTAAGACATATGTCACACAGACCAGGAAATCCTATGCTGATAAAACAAAAGAATAGTGAAAGTTATGAAGATTNC_001511gag (781)CTGTGCTTGCAGTGGGTCATAACAGCCTTGAGAGCGGTAAGGCATATGTCGCATAGGCCAGGTAACCCAATGCTGGTAAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGATTS51392gag (976)ATATGCCTGCAATGGGTAATAAATGCATTAAGAGCAGTAAGACATATGGCGCACAGGCCAGGGAATCCAATGCTAGTAAAGCAAAAAACGAATGAGCCATATGAAGATTNC_001463gag (787)ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACTM60610gag (931)ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACTM60610gag#2 (931)ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGACTNC_001452gag (781)ATATGCCTGCAGTGGGTAATAACAGCGTTAAGATCAGTGAGGCATATGTCACATAGACCAGGAAACCCTATGTTAGTGAAGCAGAAGAATACTGAGAGTTATGAAGATTConsensus (982)

1091 11991100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180(1091)TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTGACGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACATTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAAM10608gag(1040)TTATAGCAAGATTGCTAGAAGCAATTGATACAGAACCCGTCACGGATCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACTCTGTCGTTCACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAAM31646gag (890)TTATAGCAAGATTGCTAGAAGCAATTGATACAGAACCCGTCACGGATCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACTCTGTCGTTCACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAANC_001511gag (890)TCATAGCGAGGTTGCTGGAAGCAATTGATGCAGAACCAGTCACCGACCCTATAAAGACATATTTCAAAAGTGACTCTG-CATACACGAATGCTAGTACAGATTGTCAAAS51392gag(1085)TTGCAGCAAGACTGCTAGAAGCAATAGATGCAGAGCCAGTTACACAGCCTATAAAAGATTATCT-AAAGCTAACACTATCTTATACAAATGCATCAGCAGATTGTCAGANC_001463gag (896)TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTAATGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACGTTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAAM60610gag(1040)TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTAATGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACGTTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAAM60610gag#2(1040)TCATAGCTCGCCTACTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGTGACGGACCCTATAAAAACATATTT-AAAAGTAACATTGTCATATACAAATGCTAGCACAGACTGTCAAANC_001452gag (890)TCATAGCTCGCCTGCTAGAGGCTATTGATGCGGAACCAGT ACGGACCCTATAAAAACATATTT AAAAGTAAC TTGTCATATACAAATGCTAGCACAGATTGTCAAAConsensus(1091)

1200 13081210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290(1200)AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGCM10608gag(1148)AACAAATGGACAGAGTGTTAGGGACAAGAGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGGGACGTAGGATCAGAAGGATTTAAAATGCAGCTGTTAGCM31646gag (998)AACAAATGGACAGAGTGTTAGGGACAAGAGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGGGACGTAGGATCAGAAGGATTTAAAATGCAGCTGTTAGCNC_001511gag (998)AGCAAATGGACAGAGTCTTGGGAAATAGGGTCCAACAGGCATCAGTAGAAGAGA-GATGCAAGCATGTAGAGATGTAGGATCAGAAGGGTTTAAAATGCAACTGTTAGCS51392gag(1193)AGCAAATGGATAGAACACTAGGACAAAGAGTACAACAAGCTAGTGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTAGAGATGTGGGATCAGAAGGGTTCAAAATGCAATTGTTAGCNC_001463gag(1004)AGCAGATGGATAGGACATTGGGAACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGCM60610gag(1148)AGCAGATGGATAGGACATTGGGAACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGCM60610gag#2(1148)AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAAATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTATTAGCNC_001452gag (998)AGCAGATGGATAGGACATTGGGGACGAGGGTTCAACAAGCAACGGTAGAAGAAAAGATGCAAGCATGTCGAGATGTGGGATCCGAAGGATTTAAGATGCAATTGTTAGCConsensus(1200)

1309 14171320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400(1309)ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAATM10608gag(1257)ACAGGCATTGAGACCGCCACGGAAGGAAGGAAAACAGGGAGTA---CAAAAATGCTATTACTGCGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGGCAATGCAGACAAGGAATAATM31646gag(1107)ACAGGCATTGAGACCGCCACGGAAGGAAGGAAAACAGGGAGTA---CAAAAATGCTATTACTGCGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGGCAATGCAGACAAGGAATAATNC_001511gag(1107)ACAGGCCTTGAGACCTCCACGAAAAGGAGGCAACGTAGGGTCAAGTCAAAAATGTTATAATTGTGGGAAAACAAGGACATCTTGCAAGACAATGCAGGCAAGGGATAATS51392gag(1301)ACAAGCATTAAG---GCCAGGAAAAGGAAAAGGGAATGGACAGCCACAAAGGTGTTACAACTGTGGAAAACCG-GGACATCAAGCAAGGCAATGTAGACAAGGAATCATNC_001463gag(1113)ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAATM60610gag(1257)ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGAAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAATM60610gag#2(1257)ACAAGCTTTGAGACCGCAAGGGAAGGCAGGACAAAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGGAAACCA-GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAATNC_001452gag(1107)ACAAGCTTTGAGACCGCCAGGGAAGGCAGGACACAAAGGGGTAAATCAAAAGTGTTATAATTGTGGGAAACCA GGACATCTCGCAAGACAGTGTAGACAAGGAATAATConsensus(1309)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 124

Anexo 2. Alineamiento parcial del gen gag secuencias descritas en PubMed, zona am-plificada por los cebadores Gag 1,2,3 y 4

8. ANEXOS

125

1 7610 20 30 40 50 60(1)GCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTM10608gag1 (1)

GCTAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAAGGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAGGAAGTAATTAAAGCAACTTM60610gag1 (1)

GATAGAGACATGGCGACGCAAGGCTCAAAGGAGAAGAAGGGATACCCTGAGCTCAAAGAGGTCATTAAGACAACATMVV31646gag1 (1)----------------------------------------------------------------------------NC_001511gag1 (1)

GATAGAGACATGGCGAGGCAAGTCTCCGGGGGGAAAAGAGATTATCCTGAGCTCGAAAAATGTATCAAGCATGCATNC_001463gag1 (1)

GATAGAGACATGGCGAAGCAAGGCTCAAGAGAGAAAAAGGGATACCCCGAGCTCAAAGAGGTAATAAGGAAAACATS51392gag1 (1)

----------------------------------------------------------------------------NC_001452gag1 (1)G TAGAGACATGGCGA GCAAGGCTCAA GGAGAAAAAGGGATACCC GAGCTCAA GA GT AT AA AAC TConsensus (1)

77 15490 100 110 120 130 140(77)GTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACTM10608gag1 (77)GTAAAATAAGGGTAGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACTM60610gag1 (77)GTAAAATAAAGGTGGGGCCC-GGGAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCCTTAAAAACCCTAGACTMVV31646gag1 (77)------------------------------------TGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCCTTAAAAACCCTAGACTNC_001511gag1 (1)GCAAGATAAAAGTTCGACTC---AGAGGGGAGCACTTGACAGAAGGAAATTGTTTATGGTGCCTTAAAACATTAGATTNC_001463gag1 (77)GTAGGATAAGAGTAGGCCCAAGGGAAGGAGAACCCTTGACAGAAGGGAACTGTCTATGGGCATTAAAAACTGTAGACTS51392gag1 (77)-----------------------GAAGGAGA--CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACTATAGACTNC_001452gag1 (1)GTAA ATAA GT GG CCC GGGAAGGAGA CCTTGACAGAAGGGAATTGTCTATGGGCATTAAAAACT TAGACTConsensus (77)

155 232160 170 180 190 200 210 220(155)

TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAAM10608gag1(152)

TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAAM60610gag1(152)

TTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAAMVV31646gag1(152)

TTATATTTGAGGATATAAAAACGGAGCCGTGGACTCTTACAAAAATGTATACAGTCTGGGAAAAATTAAAGCAAGTAANC_001511gag1 (43)

ACATGTTTGAGGACCATAAAGAGGAACCTTGGACAAAAGTAAAATTTAGGACAATATGGCAGAAGGTGAAGAATCTAANC_001463gag1(152)

TTATATTTGAAGATTTAAAAGGAGAGCCGTGGACCATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAACAGTTAAS51392gag1(155)

TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGACGATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAAGGGCTAANC_001452gag1 (54)

TTATATTTGAGGATTTAAAAACAGAGCCGTGGAC ATTACAAAAATGTATACAGTATGGGATAGATTAAAA AGCTAAConsensus(155)

233 310240 250 260 270 280 290 300(233)CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCAM10608gag1(230)CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCAM60610gag1(230)CTCCAGAAGAAACAAGTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCAMVV31646gag1(230)CTCCAGAAGAAACAAGTAAAAGAGAGTTTGCCTCCTTACAGGCCACATTGGCTTGTATAATGTGTAGTCAAATGGGCANC_001511gag1(121)CTCCTGAGGAGAGTAACAAAAAAGACTTTATGTCTTTGCAGGCCACATTAGCGGGTCTAATGTGTTGCCAAATGGGGANC_001463gag1(230)CTCCAGAAGAGACAAGTAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACAATGGCTTGCCTTATGTGTAGTCAGCTGGGTAS51392gag1(233)CTCCGGAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTCGCCTCCTTGCAAGCTACGTTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCANC_001452gag1(132)CTCC GAGGAAACAAGCAAAAGAGAATTTGCCTCCTTGCAGGCCACATTGGCTTGCATAATGTGTAGTCAAATGGGCAConsensus(233)

311 388320 330 340 350 360 370(311)TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGGM10608gag1(308)TGAAACCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACAAGAAAATAAGGAGGCCAAGGM60610gag1(308)TGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGMVV31646gag1(308)TGAGGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCCAGGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGGCTACACGAAAAACAGGAGGATAAAGNC_001511gag1(199)TGAGACCTGAGACATTGCAAGATGCAATGGCTACAGTAATCATGAAAGATGGGTTACTGGAACAAGAGGAAAAGAAGGNC_001463gag1(308)TGAAACCCGAGACAGTGCAAGCAGCAAGGGGAATAATGCATATGAAAGAAGGACTACAGGAGAATAAGGAGGAAAAGGS51392gag1(311)TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAAAGGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGCCAAGGNC_001452gag1(210)TGAAGCCCGAGACAGTGCAGGCAGCAA GGGAATAATAAGTATGAAAGAAGGACTACACGAAAATAAGGAGGA AAGGConsensus(311)

389 466400 410 420 430 440 450(389)

GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGM10608gag1(386)

GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTACCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGM60610gag1(386)

AAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGMVV31646gag1(386)

AAAAGAAGGTAGAACAACTCTACCCAAACTTGGAAAAACACAGAGAAGTGTATCCTATTGTAAATTTGCAGGCTGGAGNC_001511gag1(277)

AAGACAAA--AGAGAAA----------------AGGAAGAGAGTG---TCTTCCCAATAGTAGTGCAAGCAGCAGGAGNC_001463gag1(386)

AGAAAAAGGTAGAACAACTCTACCCTAATTTAGAGAAACATAGAGAAGTGTACCCTATTGTAAATCTGCAAGCAGGGGS51392gag1(389)

GGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCCCAACTTAGAGAAACATAGGGAAGTTTATCCTATTGTGAATTTGCAAGCAGGAGNC_001452gag1(288)

AGGAGAAGGTAGAGCAACTCTACCC AACTTAGAGAAACATAG GAAGT TATCCTATTGTAAATTTGCAAGCAGGAGConsensus(389)

456 538470 480 490 500 510 520(456)

GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTT-M10608gag1(453)

GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTT-M60610gag1(453)

GCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTTGMVV31646gag1(453)

GCAGGCTGGAGGGAGAAGTTGGAAAGCGGTAGAGTCAGTGACATTCCAGCAGCTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGACTT-NC_001511gag1(344)

AGCAGCAGGAGGGAGAAGCTGGAAAGCAGTAGATTCTGTAATGTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATGCAGCATGGCCTC-NC_001463gag1(432)

GCAAGCAGGGGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGATTCAGTAGTCTTCCAGCAATTGCAAACTGTGGCTATGCAGCATGGCCTT-S51392gag1(456)

GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTGNC_001452gag1(355)

GCAAGCAGGAGGGAGAAGTTGGAAGGCGGTAGAGTCAGTAGTCTTCCAGCAACTGCAAACAGTGGCAATGCAGCATGGACTTConsensus(456)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 125


126

1 10710 20 30 40 50 60 70 80 90(1)ACAAGGAATAATATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGCM10608pol (1)ACAAGGAATAATATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGCM60610pol (1)-----------------------------------------------------------------------------------------------------------M31646pol (1)---------------------------------------------------------TCCAAC---------------ATCACAGCAGGGAAACAGCAGGAGGGGGCNC_001511pol (1)------------------------------------------------------------CAT---------------ACAGCTGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGCS51392pol (1)------------ATGTCACAACTGTGGAAAGAGAGGACATATGCAAAAAGAATGCAGAGGAAAGAGAGACATAAGGGGAAAACAGCAGGGAAACGGGAGGAGGGGGANC_001463pol (1)------------ATGCCATCATTGTGGAAAAAGAGGACATATGCAAAAGGACTGCCGGCAGAA---------------GAAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGCNC_001452pol (1)

ATG CA A TGTGGAAA AGAGGACATATGCAAAA GA TGC G C AA AAACAGCAGGGAAACAACAGGAGGGGGCConsensus (1)

108 214120 130 140 150 160 170 180 190 200(108)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACGGGGGCAGM10608pol (93)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACGGGGGCAGM60610pol (93)-----------------------------------------------------------------------------------------------------------M31646pol (1)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCAAAGATAGATATAAAGGTAGGGACAAATTGGAAAAAGGTATTAGTAGATACTGGGGCAGNC_001511pol (36)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCTCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCAAAGGCAGAAATAAAGGTAGGGACAACATGGAGAATGTTATTAGTAGACACCGGAGCAGS51392pol (33)TACGTGTGGTGCCGTCCGCTCCTCCTATGGAATAACTTCAGCACCACCTATGGTTCAGGTCCGCATAGGTTCCCAGCAGAGGAACTTGTTATTTGATACCGGGGCGGNC_001463pol (96)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACCCAAAATAGAAATAAAAGTAGGAACAAGGTGGAAAAAATTATTAGTAGATACAGGGGCAGNC_001452pol (81)CACGTGTGGTGCCGTCCGCGCCCCCTATGTTGTAACAGAAGCACCACC AA ATAGAAATAAA GTAGG ACAA GTGGAAAAA TTATTAGTAGATAC GGGGCAGConsensus (108)

215 321220 230 240 250 260 270 280 290 300 310(215)ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACACM10608pol (200)ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACACM60610pol (200)-----------------------------------------------------------------------------------------------------------M31646pol (1)ATAGAACTATAGTAAGATATCATGACAATTCGGGAATACCCACAGGGAGAATAAAACTACAAGGGATAGGAGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGATAAAGTAGTANC_001511pol (143)ATAGGACAATAGTAAGATATCATGATAATTCGGGAATACCAAAAGGAAGAATAAAATTGCAGGGTATAGGGGGAATTATAGAAGGAGAAAAATGGGACAAAGTGGCGS51392pol (140)ACCGAACTATAGTTAGATGGCATGAGGGCTCGGGAAACCCAGCCGGAAGGATAAAACTGCAAGGAATAGGAGGAATAGTAGAAGGAGAAAAATGGAATAATGTAGAANC_001463pol (203)ATAAAACTATAGTAACATCCCATGATATGTCAGGGATACCAAAGGGAAGGATAATATTACAGGGCATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGAACAAGTACACNC_001452pol (188)ATA AACTATAGTAA AT CATGATA TC GG ATACCAAA GGAAGGATAA ATTACAGGG ATAGGGGGAATAATAGAAGGAGAAAAATGGGA AAGTA AConsensus (215)

322 428330 340 350 360 370 380 390 400 410(322)TTGCAATATAAAGATAAAATGATCAAAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTGGGAATAGGATTAATM10608pol (307)TTGCAATATAAAGATAAAATGATCAAAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTAGGAATAGGATTAATM60610pol (307)------------------------------------GTGGTACTGCCCAGTAGTCCAGTAGAGGTATTAGGAAGGGATAATATGGCAAAATTAGACATAGGAATAATM31646pol (1)ATACAATATAAAGAAAAAAGAATAGAAGGGACAATAGTGGTACTGCCCAGTAGTCCAGTAGAGGTATTAGGAAGGGATAATATGGCAAAATTAGACATAGGAATAATNC_001511pol (250)TTACAGTATAAAGAAAAAAGAATCTTGGGTACAATAGTAGTACTGCCTAGCAGTCCAGTGGAGGTATTAGGAAGGGATAATA-GGGAGAATTAGGAATAGGACTAATS51392pol (247)TTAGAATATAAAGGAGAAACAAGAAAGGGAACAATAGTAGTGTTACCACAAAGTCCAGTAGAAGTATTAGGACGAGATAACATGGCCCGATTTGGAATAAAGATAATNC_001463pol (310)TTGCAATATAAAGATAAAATAATCAGAGGTACCATAGTGGTGTTAGCTACGAGTCCGGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGAGAGAATTGGGAATAGGATTAATNC_001452pol (295)TT CAATATAAAGA AAAA AATCAAAGGTAC ATAGTGGTGTTACCTA AGTCCAGTAGAAGTATTAGGAAGAGATAATATGGGAGAATTAGGAATAGGA TAATConsensus (322)

429 535440 450 460 470 480 490 500 510 520(429)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA-TTCCCAGTACAAGAGTAAGATTAAAAGAGGGATGTAAGGGACCCCACATAGCGCAATGGCCTTTGACGCAAGAAAAATTAM10608pol (414)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA-TTCCCAGTACAAGAGTAAGATTAAAAGAGGGATGTAAGGGACCCCACATAGCGCAATGGCCTTTGACGCAAGAAAAATTAM60610pol (414)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA-TTCCCATTACACAGGTAAAATTAAAAGAAGGCTGTAAGGGTCCTCATATAGCACAATGGCCTTTAACTCAAGAAAAATTAM31646pol (72)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA-TTCCCATTACACAGGTAAAATTAAAAGAAGGCTGTAAGGGTCCTCATATAGCACAATGGCCTTTAACTCAAGAAAAATTANC_001511pol (357)TATGGCAAATCTGGAAGAAAAGAAAAATTCCTATTACCAAGGTAAGCCTAAAAGAAGGCTGCAAAGGACCTCATATAGCGCAGTGGCCTTTGACTCAAGAAAAATTAS51392pol (353)AATGGCAAATTTAGAGGAAAAAAGAA-TCCCAATTACAAAAGTAAAATTGAAAGAGGGATGTACGGGTCCACATGTCCCACAATGGCCATTAACAGAAGAGAAATTANC_001463pol (417)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA-TTCCCAGTACAAGAGTAAGATTAAAAGAGGGATGTAAGGGACCCCACATAGCGCAATGGCCTTTGACGCAAGAAAAATTANC_001452pol (402)TATGGCAAATTTAGAAGAAAAGAAAA TTCCCATTACAAAAGTAAGATTAAAAGAGGGATGTAAGGGACC CATATAGCGCAATGGCCTTTGAC CAAGAAAAATTAConsensus (429)

536 642550 560 570 580 590 600 610 620 630(536)GAGGGATTAAAAGAAATAGTAGACAGATTAGAGAAGGAAGGGAAAGTAGGAAGAGCGCCCCCACACTGGACTTGTAATACCCCTATATTTTGTATTAAGAAGAAATCM10608pol (520)GAGGGATTAAAAGAAATAGTAGACAGATTAGAGAAGGAAGGGAAAGTAGGAAGAGCGCCCCCACACTGGACTTGTAATACCCCTATATTTTGTATTAAGAAGAAATCM60610pol (520)GAAGGCTTAAAAGAAATAGTGGACAAGTTAGAAAAGGAAGGAAAGGTAGGTAGAGCGCCGCCACATTGGACATGTAATACTCCTATATTTTGCATCAAGAAAAAATCM31646pol (178)GAAGGCTTAAAAGAAATAGTGGACAAGTTAGAAAAGGAAGGAAAGGTAGGTAGAGCGCCGCCACATTGGACATGTAATACTCCTATATTTTGCATCAAGAAAAAATCNC_001511pol (463)GAAGGACTAAAAGAAATAGTGGAAAGATTAGAAAAAGAAGGGAAATTAGGTAGAGCACCTCCACATTGGACATGCAACACTCCTATATTTTGTATTAAAAAGAAATCS51392pol (460)AAAGGTCTAACAGAAATCATAGATAAATTAGTGGAAGAAGGAAAACTAGGAAAGGCACCCCCACATTGGACATGTAATACTCCAATCTTTTGCATAAAAAAGAAATCNC_001463pol (523)GAGGGATTAAAAGAAATAGTAGACAGATTAGAGAAGGAAGGGAAAGTAGGAAGAGCGCCCCCACACTGGACTTGTAATACCCCTATATTTTGTATTAAGAAGAAATCNC_001452pol (508)GAAGGATTAAAAGAAATAGTAGACAGATTAGAGAAGGAAGGGAAAGTAGGAAGAGCGCCCCCACATTGGACATGTAATACTCCTATATTTTGTATTAAGAAGAAATCConsensus (536)

643 749650 660 670 680 690 700 710 720 730(643)AGGAAAATGGAGGATGTTAATAGATTTTAGAGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTAGCAGAAGCACAGTTAGGGTTACCTCATCCAGGAGGATTACAGAGAAAGAM10608pol (627)AGGAAAATGGAGGATGTTAATAGATTTTAGAGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTAGCAGAAGCACAGTTAGGGTTACCGCATCCAGGAGGATTACAGAGAAAGAM60610pol (627)AGGGAAATGGAGAATGTTAATAGATTTTAGGGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTGGCGGAGGCACAATTAGGTTTGCCGCATCCAGGGGGATTACAGAAAAAGAM31646pol (285)AGGGAAATGGAGAATGTTAATAGATTTTAGGGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTGGCGGAGGCACAATTAGGTTTGCCGCATCCAGGGGGATTACAGAAAAAGANC_001511pol (570)AGGAAAATGGAGAATGTTAATAGACTTCAGGGAATTGAATAAACAAACAGAAGATCTGGCAGAGGCACAGTTGGGATTACCACATCCGGGAGGATTGCAGAAAAAGAS51392pol (567)AGGGAAGTGGAGAATGTTAATAGATTTCAGAGAATTGAACAAACAGACAGAAGATTTAACAGAAGCGCAGTTAGGACTCCCGCATCCGGGAGGACTACAAAAGAAAANC_001463pol (630)AGGAAAATGGAGGATGTTAATAGATTTTAGAGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTAGCAGAAGCACAGTTAGGGTTACCGCATCCAGGAGGATTACAGAGAAAGANC_001452pol (615)AGGAAAATGGAGAATGTTAATAGATTTTAGAGAATTAAATAAGCAAACAGAAGATTTAGCAGAAGCACAGTTAGG TTACCGCATCCAGGAGGATTACAGAAAAAGAConsensus (643)

750 856760 770 780 790 800 810 820 830 840(750)AACATGTAACAATATTAGATATAGGAGATGCATATTTTACAATACCATTATATGAGCCATATAGACAATATACATGCTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTAGGAM10608pol (734)AACATGTAACAATATTAGATATAGGAGATGCATATTTTACAATACCATTATATGAGCCATATAGACAATATACATGCTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTAGGAM60610pol (734)AGCATGTAACAATACTTGACATAGGGGATGCATATTTTACAATACCATTGTATGAGCCATATAGACCATATACATGTTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTGGGAM31646pol (392)AGCATGTAACAATACTTGACATAGGGGATGCATATTTTACAATACCATTGTATGAGCCATATAGACCATATACATGTTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTGGGANC_001511pol (677)AACATGTAACAGTATTGGATATAGGAGATGCATATTTTACAATACCATTATATGAACCTTATAGACCGTATACATGTTTTACCATGCTGAGTCCCAATAATTTGGGAS51392pol (674)AACATGTTACAATATTGGACATAGGAGATGCATATTTTACTATACCCCTATATGAACCATATCGAGAGTACACATGTTTTACTCTATTAAGTCCTAATAATCTAGGANC_001463pol (737)AACATGTAACAATATTAGATATAGGAGATGCATATTTTACAATACCATTATATGAGCCATATAGACAATATACATGCTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTAGGANC_001452pol (722)AACATGTAACAATATT GATATAGGAGATGCATATTTTACAATACCATTATATGAGCCATATAGACAATATACATGTTTTACCATGTTAAGTCCAAATAATTTAGGAConsensus (750)

857 963870 880 890 900 910 920 930 940 950(857)CCATGTGTAAGATATTATTGGAAAGTGTTACCACAAGGATGGAAATTAAGTCCTGCAGTGTATCAATTTACAATGCAAAAAATATTAAGAGGATGGATAGAAGAACAM10608pol (841)CCATGTGTAAGATATTATTGGAAAGTGTTACCACAAGGATGGAAATTAAGTCCTGCAGTGTATCAATTTACAATGCAAAAAATATTAAGAGGATGGATAGAAGAACAM60610pol (841)CCATGTACACGGTATTATTGGAAAGTACTACCACAAGGATGGAAGTTGAGTCCCTCAGTGTATCAATTTACAATGCAAGAAATATTAAGGGATTGGATAGCGAAACAM31646pol (499)CCATGTACACGGTATTATTGGAAAGTACTACCACAAGGATGGAAGTTGAGTCCCTCAGTGTATCAATTTACAATGCAAGAAATATTAAGGGATTGGATAGCGAAACANC_001511pol (784)CCTTGTGTAAGGTATTATTGGAAAGTGTTGCCACAAGGATGGAAATTGAGTCCCTCAGTGTATCAATTTACCATGCAGGAGATATTAAGAGATTGGATAAGGGAACAS51392pol (781)CCATGTAAAAGATACTATTGGAAAGTGCTGCCACAAGGTTGGAAATTGAGTCCATCTGTATATCAATTTACTATGCAGGAGATCTTAGAGGATTGGATACAGCAGCANC_001463pol (844)CCATGTGTAAGATATTATTGGAAAGTGTTACCACAAGGATGGAAATTAAGTCCTGCAGTGTATCAATTTACAATGCAAAAAATATTAAGAGGATGGATAGAAGAACANC_001452pol (829)CCATGTGTAAGATATTATTGGAAAGTGTTACCACAAGGATGGAAATTGAGTCC TCAGTGTATCAATTTACAATGCAAGAAATATTAAGAGATTGGATAGAGGAACAConsensus (857)

Anexo 3. Alineamiento del gen pol secuencias descritas en PubMed

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 126

8. ANEXOS

127

964 1070970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060(964)CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGCM10608pol (948)CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGCM60610pol (948)TCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATTTATATAGGGAGTGATTTGGATATAATGAAACACAGAGAGATAGTAGAAGAACTAGCTAGCTATATTGCCCM31646pol (606)TCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATTTATATAGGGAGTGATTTGGATATAATGAAACACAGAGAGATAGTAGAAGAACTAGCTAGCTATATTGCCCNC_001511pol (891)CCCTATGGTGCAATTTGGGATATATATGGATGATATCTATATAGGCAGTGATTTAGAAATGGGGGAACACAGAAGAATAGTAGAAGAACTTGCCAGTTATATTGCCCS51392pol (888)TCCAGAAATTCAATTTGGCATATATATGGATGATATTTACATAGGAAGTGATTTAGAAATTAAAAAGCATAGAGAAATAGTGAAAGATTTAGCCAATTATATTGCCCNC_001463pol (951)CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGGACTAGAAGAGCACAGGGGTATCGTGAACGAACTAGCATCATATATAGCGCNC_001452pol (936)CCCTATGATACAATTTGGAATATACATGGATGATATCTATATAGGGAGTGATTTAGAAATAGAAGAGCACAGAGG ATAGTGAAAGAACTAGC A TATATTGCCCConsensus (964)

1071 11771080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160(1071)AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGAGGCAAGAAGGATACCCGGCGAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTCM10608pol(1055)AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGCGGCAAGAAGGATACCCGGCTAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTCM60610pol(1055)AGTATGGATTTATGTTACCAGAAGAAAAGAGACAAGAAGGGTATCCAGCAAAGTGGCTTGGATTTGAATTGCACCCAGAGAAATGGAGATTTCAGAAACATACACTTM31646pol (713)AGTATGGATTTATGTTACCAGAAGAAAAGAGACAAGAAGGGTATCCAGCAAAGTGGCTTGGATTTGAATTGCACCCAGAGAAATGGAGATTTCAGAAACATACACTTNC_001511pol (998)AATATGGGTTTATGCTGCCGGAAGAAAAGAGGCAAGAAGGGTATCCAGCAAATTGGCTTGGATTTGAACTACATCCAGAGAGATGGAAGTTTCAAAAACATAAGCTTS51392pol (995)AATATGGATTCACTCTGCCAGAAGAGAAGAGACAAAAGGGATATCCAGCAAAATGGCTAGGATTTGAACTACACCCGCAGACCTGGAAATTTCAGAAGCATACATTANC_001463pol(1058)AATATGGATTCATGCTGCCTGAAGATAAGAGGCAAGAAGGATACCCGGCTAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTCNC_001452pol(1043)AATATGGATTCATGCTGCC GAAGA AAGAGGCAAGAAGGATATCCAGCAAAATGGCTTGGATTTGAATTGCATCCGGAGAAATGGAAATTTCAAAAACATACGCTConsensus(1071)

1178 12841190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270(1178)CCAGAGATTACAGAAGGACCCATAACCTTGAATAAACTACAGAAATTAGTAGGAGATTTAGTTTGGAGACAATCCCTAATAGGAAAAAGCATCCCAAATATCTTAAAM10608pol(1162)CCAGAGATTACAGAAGGACCCATAACCTTGAATAAACTACAGAAATTAGTAGGAGATCTAGTTTGGAGACAATCCCTAATAGGAAAAAGCATCCCAAATATCTTAAAM60610pol(1162)CCAGAAATAAAGGAAGGGACCATAACATTAAATAAATTACAAAAATTAGTAGGAGATTTAGTCTGGAGACAATCATTAATAGGAAAAAGCATACCTAATATACTAAAM31646pol (820)CCAGAAATAAAGGAAGGGACCATAACATTAAATAAATTACAAAAATTAGTAGGAGATTTAGTCTGGAGACAATCATTAATAGGAAAAAGCATACCTAATATACTAAANC_001511pol(1105)GCAAATATGGAAGAAGGACCAATAAGGTTAAATAAATTGCAGAAATTAGTAGGAGAATTAGTTTGGAGGCAATCATTGATAGGGAAAAGTATACCAAATATACTGAAS51392pol(1102)CCTGAATTAACAAAGGGAACAATAACATTAAATAAATTACAGAAATTAGTAGGAGAATTAGTATGGAGACAATCCATAATTGGGAAAAGCATTCCTAACATTCTGAANC_001463pol(1165)CCAGAGATTACAGAAGGACCCATAACCTTGAATAAACTACAGAAATTAGTAGGAGATTTAGTTTGGAGACAATCCCTAATAGGAAAAAGCATCCCAAATATCTTAAANC_001452pol(1150)CCAGA AT ACAGAAGGACCCATAAC TTAAATAAATTACAGAAATTAGTAGGAGATTTAGTTTGGAGACAATCC TAATAGGAAAAAGCAT CCAAATAT CTAAAConsensus(1178)

1285 13911290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380(1285)ATTAATGGAAGGAGATAGGGCTTTACAAAGTGAAAGATACATAGAGAGTATACATGTAAGAGAATGGGAAGCCTGTAGACAAAAGCTGAAGGAAATGGAAGGAAATTM10608pol(1269)ATTAATGGAAGGAGATAGGGCTTTACAAAGTGAAAGATACATAGAGAGTATACATGTAAGAGAATGGGAAGCCTGTAGACAAAAGCTGAAGGAAATGGAAGGAAATTM60610pol(1269)GTTAATGGAAGGGGATAGGGCGCTCCAAAGTGAAAGAAGGATAGAGCTCAGACATGTAAAGGAATGGGAGGAATGTAGAAGAAAATTAGCAGAAATGGAAGGAAATTM31646pol (927)GTTAATGGAAGGGGATAGGGCGCTCCAAAGTGAAAGAAGGATAGAGCTCAGACATGTAAAGGAATGGGAGGAATGTAGAAGAAAATTAGCAGAAATGGAAGGAAATTNC_001511pol(1212)ATTGATGGAAGGAGATAGAGCGTTACAAAGTGTAAGGAATGTAGAGACAATACATAAAGAAGAATGGGAAAGATGTAGAAGAAAACTAGAAGAAATGGAAGGGAATTS51392pol(1209)ATTAATGGAAGGAGATAGAGAATTACAAAGTGAAAGAAAAATTGAAGAAGTACATGTGAAAGAATGGGAAGCATGTAGGAAAAAATTAGAAGAAATGGAAGGAAATTNC_001463pol(1272)ATTAATGGAAGGAGATAGGGCTTTACAAAGTGAAAGATACATAGAGAGTATACATGTAAGAGAATGGGAAGCCTGTAGACAAAAGCTGAAGGAAATGGAAGGAAATTNC_001452pol(1257)ATTAATGGAAGGAGATAGGGC TTACAAAGTGAAAGAAA ATAGAGA ATACATGTAAAAGAATGGGAAGCATGTAGAAAAAAACTAGAAGAAATGGAAGGAAATTConsensus(1285)

1392 14981400 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480(1392)ATTATGATGAAGAGAAGGATATCTATGGGCAACTAGATTGGGGAAATAAAGCAATAGAATACATAGTATTTCAAGAAAAAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTAM10608pol(1376)ATTATGATGAAGAGAAGGATATCTATGGGCAACTAGATTGGGGAAATAAAGCAATAGAATACATAGTATTTCAAGAAAAAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTAM60610pol(1376)ACTATGATGAAGAGAAGGATGTATATGGACAAATAGATTGGGGAGATAAGGCAATAGAGTACATAGTGTTTCAAGAGAGAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTAM31646pol(1034)ACTATGATGAAGAGAAGGATGTATATGGACAAATAGATTGGGGAGATAAGGCAATAGAGTACATAGTGTTTCAAGAGAGAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTANC_001511pol(1319)ATTATAATGCAGAAAGGGACGTTTATGGACAAGTAGATTGGGGAAATAAAGCAATAGAATATATAGTGTTCCAAGAAAAAGGGAAACCATTATGGGTCAATGTGGTAS51392pol(1316)ATTATAATAAAGACAAAGATGTCTATGGACAATTGGCTTGGGGAGACAAAGCTATAGAATATATAGTGTATCAGGAGAAAGGGAAACCATTATGGGTAAATGTGGTTNC_001463pol(1379)ATTATGATGAAGAGAAGGATATCTATGGGCAACTAGATTGGGGAAATAAAGCAATAGAATACATAGTATTTCAAGAAAAAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTANC_001452pol(1364)ATTATGATGAAGAGAAGGATGTCTATGGACAA TAGATTGGGGAAATAAAGCAATAGAATACATAGTGTTTCAAGAAAAAGGAAAACCTTTATGGGTAAATGTAGTAConsensus(1392)

1499 16051510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590(1499)CATAGTATTAAGAATTTGAGTCAAGCCCAACAAATTATCAAAGCAGCACAAAAACTGACACAAGAAGTAATAATAAGAACAGGCAAGATACCCTGGATTTTGTTGCCM10608pol(1483)CATAGTATTAAGAATTTGAGTCAAGCCCAACAAATTATCAAAGCAGCACAAAAACTGACACAAGAAGTAATAATAAGAACAGGCAAGATACCCTGGATTTTGTTGCCM60610pol(1483)CATAATATTAAAAACCTCAGTCAATCACAGCAAATTATTAAAGCAGCACAAAAACTTACGCAAGAGGTAATAATAAGGATAGGAAAAATACCATGGATACTATTACCM31646pol(1141)CATAATATTAAAAACCTCAGTCAATCACAGCAAATTATTAAAGCAGCACAAAAACTTACGCAAGAGGTAATAATAAGGATAGGAAAAATACCATGGATACTATTACCNC_001511pol(1426)CATGCAATTAAAAATCTGAGTCAAGCACAGCAAATCATTAAAGCGGCACAAAAACTTACACAGGAAGTAATAATAAGAACTGGGAAAATACCATGGATACTATTGCCS51392pol(1423)CACAATATAAAGAACCTAAGCATCCCGCAACAGGTTATTAAAGCAGCGCAAAAATTAACCCAAGAAGTCATCATTAGGACAGGAAAAATACCATGGATATTGTTGCCNC_001463pol(1486)CATAGTATTAAGAATTTGAGTCAAGCCCAACAAATTATCAAAGCAGCACAAAAACTGACACAAGAAGTAATAATAAGAACAGGCAAGATACCCTGGATTTTGTTGCCNC_001452pol(1471)CATA TATTAAGAATCTGAGTCAAGC CAACAAATTATTAAAGCAGCACAAAAACT ACACAAGAAGTAATAATAAGAACAGG AAAATACCATGGATATTGTTGCCConsensus(1499)

1606 17121620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700(1606)GGGAAGGGAAGAAGATTGGATATTAGAGTTACAAATGGGAAACATAAATTGGATGCCATCATTTTGGTCATGTTATAAAGGCTCGGTGAGGTGGAAAAAGAGGAATGM10608pol(1590)GGGAAGGGAAGAAGATTGGATATTAGAGTTACAAATGGGAAACATAAATTGGATGCCATCATTTTGGTCATGTTATAAAGGCTCGGTGAGGTGGAAAAAGAGGAATGM60610pol(1590)AGGAAAGGAGGAAGATTGGATCTTAGAGTTGCAAATAGGAAATATAACATGGATGCCCTCATTTTGGTCGTGTTATAGGGGGTCAATAAGGTGGAAAAAGAGAAATGM31646pol(1248)AGGAAAGGAGGAAGATTGGATCTTAGAGTTGCAAATAGGAAATATAACATGGATGCCCTCATTTTGGTCGTGTTATAGGGGGTCAATAAGGTGGAAAAAGAGAAATGNC_001511pol(1533)AGTAAAAGAGGAGGATTGGATTTTAGAACTGCAGGTGGGAAATATCACGTGGATGCCATCATTTTGGTCATGTTATAGAGGGTCAGTACGATGGAAGAGAAGAAATGS51392pol(1530)AGGGAAAGAAGAAGATTGGAGACTAGAATTGCAATTAGGGAACATCACATGGATGCCAAAATTTTGGTCCTGTTATCGAGGACATACAAGATGGAGAAAAAGAAATANC_001463pol(1593)GGGAAGGGAAGAAGATTGGATATTAGAGTTACAAATGGGAAACATAAATTGGATGCCATCATTTTGGTCATGTTATAAAGGCTCGGTGAGGTGGAAAAAGAGGAATGNC_001452pol(1578)AGGAAAGGAAGAAGATTGGATATTAGAGTTGCAAATGGGAAACATAAC TGGATGCCATCATTTTGGTCATGTTATAGAGG TC GTAAGGTGGAAAAAGAGAAATGConsensus(1606)

1713 18191720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800(1713)TAATAGCGGAACTAGTCCCAGGACCAACATATTATACCGATGGAGGAAAGAAAAATGGGCGGGGAAGCCTGGGGTATATTGCCTCCACAGGTGAAAAGTTTAGAATAM10608pol(1697)TAATAGCGGAAGTAGTCCCAGGACCAACATATTATACCGATGGAGGAAAGAAAAATGGGCGGGGAAGCCTGGGGTATATTGCCTCCACAGGTGAAAAGTTTAGAATAM60610pol(1697)TAATAACAGAAGTAGTAGAAGGCCCGACATATTATACAGATGGAGGTAAGAAGAATGGAAAAGGAAGTCTAGGATTCATTGCCTCTACAGGCGTTAAATTTAGAAAAM31646pol(1355)TAATAACAGAAGTAGTAGAAGGCCCGACATATTATACAGATGGAGGTAAGAAGAATGGAAAAGGAAGTCTAGGATTCATTGCCTCTACAGGCGTTAAATTTAGAAAANC_001511pol(1640)TGGTCACAGAAGTAGTAGAAGGACCAACATATTATACTGATGGTGGCAAGAAGAATGGAATAGGGAGTTTAGGGTATATTGCTTCCACCGGAGAAAAATATAGAATAS51392pol(1637)TAATAGAAGAAGTAGTAGAAGGGCCTACATATTATACAGATGGAGGAAAAAAGAATAAAGTAGGAAGTCTAGGGTTCATAGTATCAACAGGGGAAAAATTTAGAAAGNC_001463pol(1700)TAATAGCGGAAGTAGTCCCAGGACCAACATATTATACCGATGGAGGAAAGAAAAATGGGCGGGGAAGCCTGGGGTATATTACCTCCACAGGTGAAAAGTTTAGAATANC_001452pol(1685)TAATAGCAGAAGTAGTAGAAGGACCAACATATTATAC GATGGAGGAAAGAAGAATGGA AGGAAGTCTAGGGTATATTGCCTCCACAGG GAAAAATTTAGAATAConsensus(1713)

1820 19261830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910(1820)CATGAAGAAGGGACAAATCAGCAGTTAGAATTGAGGGCCATAGAAGAGGCATGTAAACAGGGACCAGAAAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGGTATGCATATGAM10608pol(1804)CATGAAGAAGGGACAAATCAGCAGTTAGAATTGAGGGCCATAGAAGAGGCATGTAAACAGGGACCAGAAAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGGTATGCATATGAM60610pol(1804)CACGAAGAGGGAACAAATCAACAATTAGAATTAAGAGCAATAGAAGAGGCGTGCAAACAGGGACCAGAGAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGATATGCATATGAM31646pol(1462)CACGAAGAGGGAACAAATCAACAATTAGAATTAAGAGCAATAGAAGAGGCGTGCAAACAGGGACCAGAGAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGATATGCATATGANC_001511pol(1747)CATGAAAATGGGACAAATCAGCAATTAGAATTAAGGGCAATTGAGGAAGCATGTAAACAGGGACCAAGCAAAATGAATATAGTAACAGATAGTAGATATGCATTTGAS51392pol(1744)CATGAAGAGGGCACAAACCAGCAACTAGAATTAAGAGCCATAGAGGAAGCTCTAAAACAAGGGCCTCAAACAATGAATTTAGTAACAGATAGTAGATATGCATTTGANC_001463pol(1807)CATGAAGAAGGGACAAATCAGCAGTTAGAATTGAGGGCCATAGAAGAGGCATGTAAACAGGGACCAGAAAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGGTATGCATATGANC_001452pol(1792)CATGAAGA GGGACAAATCAGCAATTAGAATTAAGGGCCATAGAAGAGGCATGTAAACAGGGACCAGAAAAAATGAATATAGTAACAGATAGCAGATATGCATATGAConsensus(1820)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 127


128

1927 20331940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020(1927)ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATTATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTGM10608pol(1911)ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATTATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTGM60610pol(1911)ATTTATGAGAAGAAATTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAACCCAATACAGGCTAGAATTATGAAATTAGTGCATGATAAGGAACAGATAGGGGTACATTGGGTACCTGM31646pol(1569)ATTTATGAGAAGAAATTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAACCCAATACAGGCTAGAATTATGAAATTAGTGCATGATAAGGAACAGATAGGGGTACATTGGGTACCTGNC_001511pol(1854)GTTCATGATAAGGAACTGGGATGAAGAAGTTATAAAGAATCCAATACAGGCACGAATCATGAAGTTGATACATAGTAAGGAGAAGGTAGGGATACATTGGGTGCCAGS51392pol(1851)ATTTTTATTAAGAAATTGGGATGAAGAAGTAATAAAGAATCCAATTCAAGCAAGAATTATGGAAATTGCCCACAAGAAAGATAGGATAGGAGTGCATTGGGTGCCAGNC_001463pol(1914)ATTTATGTTGCGGAACTGGGACGAAGAAGTAATAAGAAACCCTATACAAGCGAGAATCATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAAATAGGGGTACATTGGGTGCCTGNC_001452pol(1899)ATTTATGTTAAGGAACTGGGATGAAGAAGTAATAAAGAACCCAATACAAGC AGAATTATGGAATTAGTGCATAATAAAGAAAAGATAGGGGTACATTGGGTGCCTGConsensus(1927)

2034 21402040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 2110 2120 2130(2034)GACACAAGGGGATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAGGTATATCTCAGAAATATTTTTAGCAAAAGAGGGAAGAGGGATTTTACAAAAAAGGGCAGAAGATGCTGGAM10608pol(2018)GACACAAGGGGATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAGGTATATCTCAGAAATATTTTTAGCAAAAGAGGGAAGAGGGATTTTACAAAAAAGGGCAGAAGATGCTGGAM60610pol(2018)GACACAAAGGAATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAAATATATTTCAGAAATATTTTTAGCAAGAGAAGGAAGCGGAATTCTTCCAAAAAGAGCGGAAGATGCAGGGM31646pol(1676)GACACAAAGGAATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAAATATATTTCAGAAATATTTTTAGCAAGAGAAGGAAGCGGAATTCTTCCAAAAAGAGCGGAAGATGCAGGGNC_001511pol(1961)GCCATAAAGGGATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAAATATATTTCAGAAGTATTTTTAGCAAAAGAAGGAAATGGGATAGTAAAGAAAAGAGCAGAGGATGCTGGGS51392pol(1958)GACATAAAGGGATTCCCCAAAATGAAGAAATAGACAAATATATTTCGGAAATATTTCTTGCAAAAGAAGGAGAAGGAATTCTCCCAAAAAGAGAAGAGGATGCAGGGNC_001463pol(2021)GACACAAGGGGATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAGGTATATCTCAGAAATATTTTTAGCAAAAGAGGGAAGAGGGATTTTACAAAAAAGGGCAGAAGATGCTGGANC_001452pol(2006)GACACAAAGGGATTCCTCAAAATGAAGAAATAGATAAATATATTTCAGAAATATTTTTAGCAAAAGAAGGAAGAGGGATT TACAAAAAAGAGCAGAAGATGCTGGGConsensus(2034)

2141 22472150 2160 2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230(2141)TATGACTTAATATGTCCACAGGAGATAAGCATTCCGGCGGGACAAGTGAAAAGGATAGCAATTGACTTGAAAATAAATTTGAAAAAGGACCAGTGGGCCATGATAGGM10608pol(2125)TATGACTTAATATGTCCACAGGAGATAAGCATTCCGGCGGGACAAGTGAAAAGGATAGCAATTGACTTGAAAATAAATTTGAAAAAGGACCAGTGGGCCATGATAGGM60610pol(2125)TATGATCTCATATGTCCGCAGGAAGTGTGTATTCCAGCGGGGCAAGTAAGAAAAATTCCAATTAATCTAAGAATAAACTTAAAGGAGGATCAGTGGGCCATGGTAGGM31646pol(1783)TATGATCTCATATGTCCGCAGGAAGTGTGTATTCCAGCGGGGCAAGTAAGAAAAATTCCAATTAATCTAAGAATAAACTTAAAGGAGGATCAGTGGGCCATGGTAGGNC_001511pol(2068)TATGATTTGATATGCCCACAAGAGGTAAGTATCCCAGCAGGACAAGTAAAGAAGATTCCAATTGATTTAAGAATAAATTTAAGAAAAAATCAATGGGCTATGATAGGS51392pol(2065)TATGATTTAATATGCCCAGAAGAGGTTACCATAGAGCCAGGACAAGTGAAATGCATCCCCATAGAGCTAAGATTAAATTTAAAGAAATCACAATGGGCTATGATTGCNC_001463pol(2128)TATGACTTAATATGTCCACAGGAGATAAGCATTCCGGCGGGGCAAGTGAAAAGGATAGCAATTGACTTGAAAATAAATTTGAAAAAGGACCAGTGGGCCATGATAGGNC_001452pol(2113)TATGATTTAATATGTCCACAGGAGGTAAGCATTCCGGCGGGACAAGTGAAAAGGAT CCAATTGA TTAAGAATAAATTTAAAAAAGGA CAGTGGGCCATGATAGGConsensus(2141)

2248 23542260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340(2248)GACCAAAAGCAGTTTTGCAAATAAGGGAGTATTCGTACAAGGAGGTATCATAGATTCGGGATATCAAGGAACAATACAAGTAGTAATATATAATAGTAATAATAAAGM10608pol(2232)GACCAAAAGCAGTTTTGCAAATAAGGGAGTATTCGTACAAGGAGGTATCATAGATTCGGGATATCAAGGAACAATACAAGTAGTAATATATAATAGTAATAATAAAGM60610pol(2232)GACGAAAAGTAGTTTTGCAAGCAAGGGAGTATTTGTACAAGGGGGAATAATAGATTCAGGATATCAAGGCATTATACAGGTAGTAGTATATAACAGCAATGACAAGGM31646pol(1890)GACGAAAAGTAGTTTTGCAAGCAAGGGAGTATTTGTACAAGGGGGAATAATAGATTCAGGATATCAAGGCATTATACAGGTAGTAGTATATAACAGCAATGACAAGGNC_001511pol(2175)GACAAAAAGCAGTTTTGCAAGTAAGGGAGTATTTGTACAAGGAGGAATAGTAGATTCAGGATATCAGGGAATCATACAAGTAGTAATTTATAACAGCAATGACGAAGS51392pol(2172)TACAAAAAGCAGCATGGCTGCCAAAGGAGTGTTCACACAAGGAGGAATCATAGACTCAGGATATCAGGGACAAATACAGGTAATAATGTATAATAGCAATAAAATAGNC_001463pol(2235)GACCAAAAGCAGTTTTGCAAATAAGGGAGTATTCGTACAAGGAGGTATCATAGATTCGGGATATCAAGGAACAATACAAGTAGTGATATATAATAGTAATAATAAAGNC_001452pol(2220)GAC AAAAGCAGTTTTGCAA TAAGGGAGTATTCGTACAAGGAGGAATCATAGATTCAGGATATCAAGGAA AATACAAGTAGTAATATATAATAGCAATAA AAAGConsensus(2248)

2355 24612360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430 2440 2450(2355)AAGTAGTAATACCACAGGGAAGAAAATTTGCACAGTTGATCCTCATGCCTCTAATACATGAAGAGTTGGAGCCATGGGGAGAAACAAGAAAAACAGAAAGAGGGGAAM10608pol(2339)AAGTAGTAATACCACAGGGAAGAAAATTTGCACAGTTGATCCTCATGCCTCTAATACATGAAGAGTTGAAGCCATGGGGAGAAACAAGAAAAACAGAAAGAGGGGAAM60610pol(2339)AAGTCATTATCCCACAAGGGAGAAAATTTGCACAATTAATTCTCATGCCTTTAATACATGAAGACCTAGAAGCTTGGGGGGAAACTAGAAGGACAGAAAGAGGAAACM31646pol(1997)AAGTCATTATCCCACAAGGGAGAAAATTTGCACAATTAATTCTCATGCCTTTAATACATGAAGACCTAGAAGCTTGGGGGGAAACTAGAAGGACAGAAAGAGGAAACNC_001511pol(2282)AGGTCATTATACCCCAGGGGAGGAAATTTGCACAGTTAATTCTCATGCCGCTGATACATGAGGAATTAGAGCCATGGGGGGAAACAAGAAAAACAGAAAGGGGAAATS51392pol(2279)CAGTAGTCATACCCCAAGGGAGAAAATTTGCACAATTAATATTAATGGATAAAAAGCATGGAAAATTGGAACCCTGGGGGGAAAGCAGAAAAACAGAAAGGGGAGAANC_001463pol(2342)AAGTAGTAATACCACAGGGAAGAAAATTTGCACAGTTGATCCTCATGCCTCTAATACATGAAGAGTTGGAGCCATGGGGAGAAACAAGAAAAACAGAAAGAGGGGAANC_001452pol(2327)AAGTAGT ATACCACAGGGGAGAAAATTTGCACAGTTAAT CTCATGCCTCTAATACATGAAGA TTGGAGCCATGGGGGGAAACAAGAAAAACAGAAAGAGGAGAAConsensus(2355)

2462 25682470 2480 2490 2500 2510 2520 2530 2540 2550(2462)CAAGGATTTGGATCAACAGGGATGTATTGGATAGAAAATATTCCCCTAGCAGAAGAAGAGCATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGM10608pol(2446)CAAGGATTTGGATCAACAGGGATGTATTGGATAGAAAATATTCCCCTAGCAGAAGAAGAGCATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGM60610pol(2446)CAAGGATTTGGATCAACGGGAGCATATTGGATTGAAAATATTCCCCTAGCAGAGGAAGATCACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGM31646pol(2104)CAAGGATTTGGATCAACGGGAGCATATTGGATTGAAAATATTCCCCTAGCAGAGGAAGATCACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGNC_001511pol(2389)CAGGGATTTGGATCAACAGGAGCATATTGGATTGAAAATATTCCCTTGGCGGAAGAAGATCATAGTAAATGGCATCAAGATGCTCAATCATTGCATCTAGAATTTGAS51392pol(2386)AAAGGATTTGGGTCTACAGGAATGTATTGGATAGAAAATATTCCTCTGGCAGAGGAAGACCACACAAAATGGCATCAAGATGCCCGATCATTGCATCTAGAATTTGANC_001463pol(2449)CAAGGATTTGGATCAACAGGGATGTATTGGATAGAAAATATTCCCCTAGCAGAAGAAGAGCATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGNC_001452pol(2434)CAAGGATTTGGATCAACAGGAATGTATTGGATAGAAAATATTCCCCTAGCAGAAGAAGA CATA AAATGGCATCAAGATGCTG GTCATTGCATTTAGAATTTGGConsensus(2462)

2569 26752580 2590 2600 2610 2620 2630 2640 2650 2660(2569)GATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATATAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCATAGACCATTM10608pol(2553)GATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATATAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCATAGACCATTM60610pol(2553)GATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATATTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAATAGATCATTM31646pol(2211)GATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATATTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAATAGATCATTNC_001511pol(2496)CATACCAAGAACAGCGGCTCAAGATATAGTGCAACAATGTGAAATATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAATACAATGAGAGGAAGTAACAAGAGGGGAATAGATCATTS51392pol(2493)AATTCCAAGAACAGCAGCAGAAGACATAGTAAATCAATGTGAAATATGCAAAGAAGCGAGGACACCTGCAGTAATTAGAGGCGGAAACAAAAGGGGGGTAAATCATTNC_001463pol(2556)GATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATATAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCATAGACCATTNC_001452pol(2541)GATTCCCAGAACAGC GCAGAAGATATAGT CAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACAATAAGAGGCAGTAATAAAAGGGG ATAGATCATTConsensus(2569)

2676 27822690 2700 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770(2676)GGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGACTAATCTATGCAGAGAGGGTAAAAGGAGAAACAGGACAAGAAM10608pol(2660)GGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGACTAATCTATGCAGAAAGGGTAAAAGGAGAAACAGGACAAGAAM60610pol(2660)GGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGATTAATATATGCAGAAAGAGTAAAAGGGGAAACAGGACAAGAAM31646pol(2318)GGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGATTAATATATGCAGAAAGAGTAAAAGGGGAAACAGGACAAGAANC_001511pol(2603)GGCAAGTGGATTACACTCATTTTGAAGATAAGATATTACTAGTATGGGTAGAAACAAATTCGGGATTAATTTATGCAGAAAGGGTGAAAGGGGAGACAGGACAAGAAS51392pol(2600)GGCAAGTGGATTATACCCATTATGAAAATATCATACTATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGACTAATATATGCAGAAAAAGTAAAAGGAGAATCAGGGCAAGAANC_001463pol(2663)GGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGACTAATCTATGCAGAGAGGGTAAAAGGAGAAACAGGACAAGAANC_001452pol(2648)GGCAAGTAGACTATACCCATTATGAAGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGACTAAT TATGCAGAAAGGGTAAAAGGAGAAACAGGACAAGAAConsensus(2676)

2783 28892790 2800 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870(2783)TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATAM10608pol(2767)TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATAM60610pol(2767)TTTAGAATCATGACTATAAGGTGGTATGGTCTGTTTGCCCCAAAGTCATTGCAGTCTGACAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAGCCAACACAGCTACTAATGAAATAM31646pol(2425)TTTAGAATCATGACTATAAGGTGGTATGGTCTGTTTGCCCCAAAGTCATTGCAGTCTGACAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAGCCAACACAGCTACTAATGAAATANC_001511pol(2710)TTTAGAGTAACAACTATGAGGTGGTATGCTCTGTTCGCCCCAAAATCATTGCAGTCAGATTATGGGCCAGCATTTATAGCAGAAGCAACACAATTGTTAATGACATAS51392pol(2707)TTCAGAATAAAAGTGATGCATTGGTATGCATTATTTGGTCCAGAGTCATTGCAGTCAGACAATGGACCTGCATTTGCAGCAGAGCCCACACAGCTGTTAATGCAATANC_001463pol(2770)TTTAGGGTGCAAACTATGAAATGGTATGCGATGTTTGCCCCGAAATCATTGCAGTCTGATAACGGACCAGCATTTGTAGCAGAATCTACTCAGCTCTTAATGAAATANC_001452pol(2755)TTTAGAGT AAAACTATGAA TGGTATGC TGTTTGCCCCAAAATCATTGCAGTCTGATAATGGACCAGCATTTGTAGCAGAA C ACACAGCT TTAATGAAATAConsensus(2783)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 128

8. ANEXOS

129

2890 29962900 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980(2890)TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTAM10608pol(2874)TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTAM60610pol(2874)TTTGGGGATAACACACACAACAGGGATACCATGGAATCCCCAATCGCAAGCACTAGTAGAAAGAACTCATCAAACTCTAAAAAATACAATAGAAAAATTTGTTTCTAM31646pol(2532)TTTGGGGATAACACACACAACAGGGATACCATGGAATCCCCAATCGCAAGCACTAGTAGAAAGAACTCATCAAACTCTAAAAAATACAATAGAAAAATTTGTTTCTANC_001511pol(2817)TCTAGGTGTAGAACACACAACCGGCATACCTTGGAATCCACAGTCTCAAGCTCTCGTAGAAAGAGCTCATCAGACTTTAAAGAAAACAATTGAAAAACTTGTTCCTAS51392pol(2814)CCTAGGAGTAAAACACACAACAGGCATACCTTGGAATCCACAGTCTCAGGCTATAGTAGAAAGGGCACATCAACTATTGAAAAGCACTTTAAAGAAGTTCCAGCCACNC_001463pol(2877)TTTGGGCATAGAACATACTACAGGGATCCCCTGGAACCCACAATCTCAAGCATTAGTAGAGAGAACACATCAGACGTTAAAGAATACATTAGAAAAACTTATACCTANC_001452pol(2862)TTTGGG ATAGAACACACAACAGGGATACC TGGAATCCACAATCTCAAGCA TAGTAGAAAGAACACATCAGAC TTAAAGAATACATTAGAAAAACTT T CCTAConsensus(2890)

2997 31033010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090(2997)TGTTTAATGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAGM10608pol(2981)TGTTTAACGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAGM60610pol(2981)TGTTTGCCTCATTTGATTCAGCAATAGCCGCAGCATTAATCACACTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAGM31646pol(2639)TGTTTGCCTCATTTGATTCAGCAATAGCCGCAGCATTAATCACACTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAGNC_001511pol(2924)TGTTCTCTGCATTTGAATCACGTGTCGCAGCTGCATTAATAGCTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCGAGGGACAAGCCCTATGGATATATTCATATTTAATAAGS51392pol(2921)AATTTGTCGCTGTAGAATCAGCCATAGCAGCAGCCCTAGTCGCCATAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTGGGGACAAGCCCTATGGATATTTTTATATATAATAAANC_001463pol(2984)TGTTTAACGCGTTTGAATCAGCCCTCGCAGGGACCCTCATTACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAGNC_001452pol(2969)TGTTT CGC TTTGAATCAGCC TCGCAGC GCCCTAAT ACTCTAAATATAAAAAGAAAGGGTGGGCTAGGGACAAGCCCTATGGATATATTTATATTTAATAAGConsensus(2997)

3101 32073110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190(3101)AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGACM10608pol(3085)AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGACM60610pol(3085)AAGGAACAGCAAAGAATACAACAGCAATCTACAAGAAATCAATCAAAATTTCGATTTTGTTATTACAGAG-TCAGGAAAAGAGGACACCCAGGCGAGTGGCTGGGACM31646pol(2743)AAGGAACAGCAAAGAATACAACAGCAATCTACAAGAAATCAATCAAAATTTCGATTTTGTTATTACAGAG-TCAGGAAAAGAGGACACCCAGGCGAGTGGCTGGGACNC_001511pol(3028)AAGGAACAGCAAAGAATACAACAACAGTATAAATTAAATCAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATT-CAGAGATCAGAAAAAGAGGACACCCGGGAGACTGGCTGGGACS51392pol(3025)AAAGAACAGAAAAGAATAAATAATAAATATAATAAAAATTCTCAAAAAATTCAATTCTGTTATTACAGAA-TAAGGAAAAGAGGACATC-AGGAGAGTGGAAAGGACNC_001463pol(3088)AAGGAACAACAAAGAATACAGCAACAAAGTAAATCAAAACAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA-CAAGAAAAAGAGGGCATCCAGGAGAGTGGCAAGGACNC_001452pol(3073)AAGGAACAGCAAAGAATACA CAACAAT TAAAT AAATCAAGAAAAAATTCGATTTTGTTATTACAGAA TAAGAAAAAGAGGACATCCAGGAGAGTGGCAAGGACConsensus(3101)

3208 33143220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 3300(3208)CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACCM10608pol(3191)CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACCM60610pol(3191)CAACACAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-AATCGTAATAAAAGATAAAAATCTAGAAAAGTATTTAGTCATAGCAAAAAAGGATGTTAAGTTCATACCGCAACCM31646pol(2849)CAACACAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-AATCGTAATAAAAGATAAAAATCTAGAAAAGTATTTAGTCATAGCAAAAAAGGATGTTAAGTTCATACCGCAACCNC_001511pol(3134)CGTCTCAGGTACTCTGGGAAGGGGAAGGAGC-TAAGATCGTAAAAGATAGAACTCTAGATAAGTATTTAGTAATAGCTAATAAAGATGTTAAATTCATACCGCAGCCS51392pol(3131)CAACCCAGGTACTGTGGAAAGGGGAAGGAGCCAATTGTGGTAAAGGATATAGAAAGTGAAAAGTATTTAGTAATACCTTACAAAGATGCAAAATTCATCCCGCCACCNC_001463pol(3193)CAACACAGGTACTTTGGGGCGGGGACGGTGC-GATTGTAGTGAAAGACAGAGGCACAGATAGATATCTGGTGATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACCNC_001452pol(3179)CAACACAGGTACT TGGGAAGGGGAAGGAGC ATTGTAGTAAAAGATAGAG A AGATAAGTATTTAGT ATAGCTAACAAAGATGTTAAGTTCATACCGCCACCConsensus(3208)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 129

Anexo 4. Alineamiento parcial del gen POL, secuencias descritas en PubMed, zona am-plificada por los cebadores POL


130

1 7210 20 30 40 50 60(1)ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATAM10608pol1 (1)ACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGGATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATAM31646pol1 (1)ACAGTAAATGGCATCAAGATGCTGGGTCATTACACTTAGACTTTGGGATACCCCGAACTGCAGCTGAGGATANC_001511pol1 (1)ACACAAAATGGCATCAAGATGCCCGATCATTGCATCTAGAATTTGAAATTCCAAGAACAGCAGCAGAAGACANC_001463pol1 (1)-TAGTAAATGGCATCAAGATGCTCAATCATTGCATCTAGAATTTGACATACCAAGAACAGCGGCTCAAGATAS51392pol1 (1)ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATAM60610pol1 (1)ATAACAAATGGCATCAAGATGCTGTGTCCTTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGGACAGCTGCAGAAGATANC_001452pol1 (1)ATA AAATGGCATCAAGATGCTG GTCATTGCATTTAGAATTTGGGATTCCCAGAACAGC GCAGAAGATAConsensus (1)

73 14480 90 100 110 120 130(73)TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCAM10608pol1 (73)TTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAAM31646pol1 (73)TTGTACAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCCAGCACAATAAGGGGAAGCAATAGGAGAGGAANC_001511pol1 (73)TAGTAAATCAATGTGAAATATGCAAAGAAGCGAGGACACCTGCAGTAATTAGAGGCGGAAACAAAAGGGGGGNC_001463pol1 (73)TAGTGCAACAATGTGAAATATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAATACAATGAGAGGAAGTAACAAGAGGGGAAS51392pol1 (72)TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCAM60610pol1 (73)TAGTTCAACAATGTGATGTGTGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACATTAAGAGGCAGTAATAAAAGGGGCANC_001452pol1 (73)TAGT CAACAATGTGAAGTATGTCAAGAAAATAAAATGCCTAGTACAATAAGAGGCAGTAATAAAAGGGG AConsensus (73)

144 218150 160 170 180 190 200(144)ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGAM10608pol1(144)

ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGAM31646pol1(144)ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACACATTATGAGGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGANC_001511pol1(144)

GTAAATCATTGGCAAGTGGATTATACCCATTATGAAAATATCATACTATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGANC_001463pol1(144)ATAGATCATTGGCAAGTGGATTACACTCATTTTGAAGATAAGATATTACTAGTATGGGTAGAAACAAATTCGGGAS51392pol1(143)

ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGAM60610pol1(144)ATAGACCATTGGCAAGTAGACTATACCCACTATGAAGACAAGATAATATTGGTCTGGGTAGAAACAAATTCAGGANC_001452pol1(144)

ATAGATCATTGGCAAGTAGACTATACCCATTATGAAGACAAGATAATATTAGTATGGGTAGAAACAAATTCAGGAConsensus(144)

02 TESIS 57 2/3/06 09:59 Página 130

Anexo 5. Alineamiento del la región LTR, secuencias descritas en PubMed y zona am-plificada por los cebadores LTR.

8. ANEXOS

131

1 8010 20 30 40 50 60 70(1)

TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGCGCTAAGTCATGTAGCAGCTGATGCTTGAGTCATAACCGCAGM10608ltr1 (1)

TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGC--TAAGTCATGTAGCAGCTGATGCTTGAGTCATAACCGCAGM60610ltr1 (1)

TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCCGCTTGTAAACGCTAAATCATGTATCAGCTGATGCTTAGGTCATAACCGCAAM31646ltr1 (1)

TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCCGCTTGTAAACGCTAAATCATGTATCAGCTGATGCTTAGGTCATAACCGCAANC_001511ltr1 (1)

-GACAAAGCAAAATGTAACCGCAAGTGCTGACAG-ATGTAACAGCTGACATATCAGCTGATGCTT-GCTCATG-CTGACANC_001463ltr1 (1)

TGACATAGCAAA-TGTAACCGCAAG------------GCGCAAAGTCATGTATCAGCTGATGCTTAAGTCATAACCACAAS51392ltr1 (1)

TGACACAGCAAA-TGTAACCGCAAGTTCTGCTTTTTTGCGCTGAGTCATGTAGCAGCTGATGGTTAAGTCATAACCGCAGNC_001452ltr1 (1)

TGACACAGCAAA TGTAACCGCAAGTTCTGCTT T TGCGCTAAGTCATGTATCAGCTGATGCTTAAGTCATAACCGCAAConsensus (1)

81 16090 100 110 120 130 140 150(81)

ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTCM10608ltr1 (80)

ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTCM60610ltr1 (78)

TTGTAAACAAGTTGCCTATAAAAGCTGCTTGCTAGCTGGGAGAGA-TCAGAGCACTCTTGGGAG-TGGAAG------CTCM31646ltr1 (80)

TTGTAAACAAGTTGCCTATAAAAGCTGCTTGCTAGCTGGGAGAGA-TCAGAGCACTCTTGGGAG-TGGAAG------CTCNC_001511ltr1 (80)

CTGTAGCTCTGAGCTGTATATAAGGAGAA-GCTTGCTGCTTGCACTTCAGAGTTCTA-GGAGAG------T------CCCNC_001463ltr1 (77)

TTGTAAACATGCTGCCTATAAAAGCTGCTTGCCTGTAGGTTGAG--GCAGAGTGCTTGGGAGAG----AACC-----CTCS51392ltr1 (68)

ATGTAAACAAGTTGCCTATATAAGCCGCTTGCTAGCTGGGGAAAA-GCAGAGTGCTTTGGAGAGCTCGAAGGAAAGAGTCNC_001452ltr1 (80)

TGTAAACAAGTTGCCTATATAAGC GCTTGCTAGCTGGG GAAA GCAGAGTGCTTTGGAGAG T GAAG CTCConsensus (81)

161 240170 180 190 200 210 220 230(161)

TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTTM10608ltr1(159)

TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTTM60610ltr1(157)

-CCGGGTCTCTCCTGCCTGA----CTGTGGAGA-C----AATAAAGGAGT---TACTTTACAACTGCGCT-AGCCTGGTTM31646ltr1(152)

-CCGGGTCTCTCCTGCCTGA----CTGTGGAGA-C----AATAAAGGAGT---TACTTTACAACTGCGCT-AGCCTGGTTNC_001511ltr1(152)

TCCTAGTCTCTCCTCTCCGAGGAGGTACCGAGACCTCAAAATAAAGGAGTGATTGCCTTACTGCCGAGTGGAGAGTGATTNC_001463ltr1(143)

-CCTGGCCTCTCCTGCTTGCA---CTGGAGAGT-T----AATAAAGGAGT---TGGCTGTTC-CTGAGCT-GGTCTGGTTS51392ltr1(137)

TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC----CTGAAAAGCTC----AATAAAGGAGT---TGGCTGATATCTGAGCT-TGCCTGGTTNC_001452ltr1(159)

TCCGGGCCTCTCCTGCCTGC CTG AGAG C AATAAAGGAGT TGGCTGATA CTGAGCT GCCTGGTTConsensus(161)

241 320250 260 270 280 290 300 310(241)

ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGM10608ltr1(227)

ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGM60610ltr1(225)

ATT-------------ATCGGGATTCGTCACTAATTCTGTGCAACACCAGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGM31646ltr1(218)

ATT-------------ATCGGGATTCGTCACTAATTCTGTGCAACACCAGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGNC_001511ltr1(218)

ACTGAGCGGCCGGTGTATCGGGAGTCGTCCCTTAATCTGTGCAATACCAGAGCGGCTCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGNC_001463ltr1(223)

TTT-------------TTCGGGATCCGTTACTAATTCCGTGCAATACCGGAGCGGGTCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGS51392ltr1(203)

ATT-------------ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGNC_001452ltr1(227)

ATT ATCGGGATTCGTTACTAATTCCGTGCAACACCGGAGCGGATCTCGCAGCTGGCGCCCAACGTGGConsensus(241)

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TESIS DOCTORALES PUBLICADAS

1. La raza Latxa: Sistemas de producción y características reproductivas. EDUARDO URIAR-TE EGURCEGUI

2. Estudio y puesta a punto de un método simplificado de control lechero cualitativo en la razaovina Latxa y su inclusión en el plan de selección. GUSTAVO ADOLFO MARÍIA LEVRINO

3. Implicaciones tecnológicas de la composición química del pescado con especial referen-cia a los lípidos. ROGELIO POZO CARRO

4. Estudio de suelos de Vizkaia. MARGARITA DOMINGO URARTE

5. El Maedi o neumonía progresiva en el conjunto de las enfermedades respiratorias cróni-cas del ganado ovino en la Comunidad Autónoma Vasca. LORENZO GONZÁLEZ ANGULO

6. Estudio experimental de las fases iniciales de la paratuberculosis ovina. RAMÓN A. JUS-TE JORDAN

7. Identificación, origen y factores fisicoquímicos que condicionan la contaminación porelementos metálicos de sedimentos de ríos. ESTILITA RUIZ ROMERA

8. Análisis financiero de proyectos de inversión en repoblaciones forestales. ÁLVARO AU-NOS GÓMEZ

9. Desarrollo y evaluación del sistema integrado de diagnóstico y recomendación (DRIS)para la fertilización de las praderas permanentes. MARTA RODRÍGUEZ JULIA

10. Estudio de las mieles producidas en la Comunidad Autónoma del País Vasco. MARÍA TE-RESA SANCHO ORTIZ

11. La biomasa microbiana como agente de las transformaciones de nitrógeno en el suelo trasel enterrado de la paja de cereal. JESÚS ÁNGEL OCIO ARMENTIA

12. Análisis jurídico y económico de la implementación de la política agraria comunitaria enla Comunidad Autónoma del País Vasco. BEATRIZ PÉREZ DE LAS HERAS

13. Nemátodos formadores de quistes (Globodera spp.) en patata (Solanum tuberosum L.):caracterización taxonómica, reproducción y actividad de las formas juveniles. AZUCENA

SALAZAR BAYONA

14. Ensayo comparativo de tres métodos de tratamiento antihelmítico estratégico en rebañosde ovejas latxas. ANA LUISA GRACIA PÉREZ

15. Estudio sobre una encefalitis vírica similar al Louping-ill en el ganado ovino de la Co-munidad Autónoma Vasca. DANIEL FERNÁNDEZ DE LUCO MARTÍNEZ

16. Análisis de caracteres involucrados en la selección y mejora de Lupinus hispanicusBoiss. et Reuter. VERÓNICA ARRIETA PICO

17. Contribución al estudio de fermentaciones artesanales e industriales de Rioja Alavesa.MILAGROS VIÑEGRA GARCÍA

18. Estudio del manejo de la alimentación en los rebaños ovinos de raza Latxa y su influen-cia sobre los resultados reproductivos y de producción de leche. LUIS Mª. OREGUI LIZA-RRALDE

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19. El sector pesquero vizcaíno, 1800-1960. Análisis de la interacción de los elementos am-biental, extractivo y comercial en la pesquería. JOSÉ AGUSTÍN MAIZ ALCORTA

20. Epidemiología, diagnóstico y control de la paratuberculosis ovina en la Comunidad Au-tónoma del País Vasco. J.J. ADURIZ RECALDE

21. Agrupación de poblaciones locales de maíz (Zea mays L.) mediante caracteres morfoló-gicos y parámetros ambientales. JOSÉ IGNACIO RUIZ DE GALARRETA GÓMEZ

22. Estudio del potencial melífero de Bizkaia. AMELIA CERVELLO MARTÍNEZ

23. Influencia de los procesos de salado y ahumado sobre las características fisicoquímicasdel queso Idiazabal (compuestos nitrogenados). FRANCISCO C. IBAÑEZ MOYA

24. El Euskal Artzain Txakurra (el perro pastor vasco) descripción y tipificación racial. Ma-riano GÓMEZ FERNÁNDEZ.

25. Evaluación de diferentes ciclos de selección recurrente en dos poblaciones sintéticas demaíz. GOTZONE GARAY SOLACHI

26. Valoración agronómica de la gallinaza: Compostaje. ADOLFO MENOYO PUELLES

27. Relación clima-vegetación en la Comunidad Autónoma del País Vasco. AMELIA ORTU-BAY FUENTES

28. Influencia de los procesos de salado y ahumado tradicional sobre las características mi-crobiológicas y organolépticas del queso Idiazabal. FRANCISO J. PÉREZ ELORTONDO

29. Mastitis en la oveja Latxa: epidemiología, diagnóstico y control. JUAN C. MARCO MELERO

30. Contribución al conocimiento anatomopatológico y diagnóstico de la tuberculosis capri-na y ovina por Mycobacterium bovis. Mª MONTSERRAT GUTIÉRREZ CANCELA

31. Estudio de factores que pueden influir en la calidad de la pluma de gallos Eusko-oiloa(Variedad Marradune) para la fabricación de moscas artificiales utilizadas en la pesca dela trucha. ROSA Mª ECHARRI TOMÉ

32. Estudio de la fracción lipídica durante la maduración del queso Idiazabal. Influencia delos procesos tecnológicos del tiempo de permanencia en salmuera y ahumado. ANA ISA-BEL NÁJERA ORTIGOSA

33. Influencia del tipo de cuajo y adición de cultivo iniciador sobre los compuestos nitroge-nados durante la maduración del queso Idiazabal. Mª SOLEDAD VICENTE MARTÍN

34. Estudio de la infección por Borrelia burgdorferi, grupo Ehrlichia phagocytophila y vi-rus de la encefalitis ovina en las poblaciones de ixódidos de la Comunidad AutónomaVasca. MARTA BARRAL LAHIDALGA

35. Lipolisis en el queso Idiazabal: efecto de la época de elaboración, del cultivo iniciador,de la pasteurización y del tipo de cuajo. FELISA CHAVARRI DÍAZ DE CERIO

36. Aspectos inmunopalógicos de la paratuberculosis de los pequeños rumiantes. Respuestainmune asociada a la vacunación. JUAN MANUEL CORPA ARENAS

37. Desarrollo y evaluación de nuevas técnicas de diagnóstico del Maedi-Visna. ANA BELÉN

EXTRAMIANA ALONSO

38. Estudios sobre Patogenia y Diagnóstico de la Adenomatosis Pulmonar Ovina. MARÍA

MERCEDES GARCÍA GOTI

39. Análisis de los factores de explotación que afectan a la producción lechera en los reba-ños de raza Latxa de la CAPV. ROBERTO J. RUIZ SANTOS

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40. Crecimiento y producción de repoblaciones de Pinus radiata D. Don en el Territorio His-tórico de Gipuzkoa (País Vasco). LUIS MARIO CHAUCHARD BADANO

41. Puesta a punto de técnicas PCR en heces y de Elisa para el diagnóstico de la Paratuber-culosis. Estudio de prevalencia en ganado bovino. JOSEBA M. GARRIDO URKULLU

42. Epidemiología y diagnóstico de la leptospirosis y la neosporosis en explotaciones de bo-vino lechero de la CAPV. RAQUEL ACHAERANDIO GALDOS

43. Relaciones aire-agua en sustratos de cultivo como base para el control del riego. Meto-dología de laboratorio y modelización. VALENTÍN TERÉS TERÉS

44. Zonas endémicas de enfermedad de Lyme en la CAPV: estudio del papel de los micro-mamíferos en el mantenimiento de Borrelia burgdorferi sensu lato en el medio natural.HORACIO GIL GIL

45. Optimización del esquema de mejora de la raza Latxa: análisis del modelo de valoracióne introducción de nuevos caractéres en el objetivo de selección. ANDRÉS LEGARZA ALBIZU

46. Influencia de las condiciones de almacenamiento, reimplantación y lluvia ácida en la via-bilidad de Pinus radiata D. Don. MIREN AMAIA MENA PETITE

47. Estudio sobre encefalopatías en peces: patogenicidad del nodavirus causante de la enfer-medad y retinopatía vírica (ERV) y transmisión experimental del prión scrapie a peces.RAQUEL ARANGUREN RUIZ

48. Enfermedades transmitidas por semilla en judía-grano (Phaseolus vulgaris L.): detec-ción, control sanitario y mejora genética. ANA MARÍA DÍEZ NAVAJAS

49. Pastoreo del ganado vacuno en zonas de montaña y su integración en los sistemas de pro-ducción de la CAPV. NEREA MANDALUNIZ ASTIGARRAGA

50. Aspectos básicos de la mejora genética de patata (Solanum tuberosum L.) a nivel diploi-de. LEIRE BARANDALLA URTIAGA

51. El cuajo de cordero en pasta: preparación y efecto en los procesos proteolíticos y lipolí-ticos de la maduración del queso de Idiazabal. Mª. ÁNGELES BUSTAMANTE GALLEGO

52. Dinámica de la población de atún blanco (Thunnus alalunga Bonnaterre 1788) del Atlán-tico Norte. Josu Santiago Burrutxaga

53. El pino radiata (Pinus radiata D.Don) en la historia forestal de la Comunidad Autónomade euskadi. Análisis de un proceso de forestalismo intensivo. MARIO MICHEL RODRIGUEZ

54. Balance hídrico y mineral del pimiento de Gernika (Capsicum annuum L., “cv Derio”)en cultivo hidropónico. Relaciones con la producción. HUGO MACÍA OLIVER

55. Desarrollo de Métodos Moleculares y su Aplicación al Estudio de la Resistencia Genéti-ca y Patogenia Molecular del Scrapie. DAVID GARCÍA CRESPO

56. Estudio epidemiológico y experimental de la transmisión y control del virus Maedi-Vis-na en ovino lechero de raza latxa del País Vasco. VEGA ALVAREZ MAIZTEGUI

57. Desarrollo y aplicación de técnicas de diagnóstico serológico y molecular para el estudiode la transmisión calostral y horizontal del virus Maedi-Visna (VMV) en ovino. MARA

ELISA DALTABUIT TEST

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Mara Elisa Daltabuit Test€¦ · DALTABUIT TEST, Mara Elisa Desarrollo y aplicación de técnicas...

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