Mapas, geneticos, fisicos, citologicos y de Secuencia;

Tipos de marcadores

Construcción de mapas genéticosTipos de marcadores genéticosGenotecas de DNA

Vectores de clonamientoMapas citológicos

FISH - fluorescence in situ hybridization

Construcción de mapas físicosSuperposición de mapas físicos y genéticos

Mapas de secuencia y anotación

Outline

• Mapa genético– Mapa basado en estimados de recombinación entre marcadores

(loci) en una población segregante derivada de parentales genéticamente diversos. Requiere polimorfismo genético en loci múltiples para determinar si ha ocurrido recombinación.

• Mapa físico– Basado en el alineamiento físico de fragmentos de ADN de un

único genotipo. El orden de los clones esta determinado vía hibridación con marcadores genéticamente cartografiados e identificando clones superpuestos a partir de una genoteca de insertos grandes.

• Mapa Citológico– Basado en la observación visual del largo del cromosoma,

posición del centrómero, proporción de los brazos, patrones de tinción para hetero- y eu-cromatina. Puede estar correlacionado con los mapas genéticos y físicos.

• Mapas de Secuencia– Secuencia de nucleótidos a lo largo del cromosoma

generalmente representan un único genotipo de una especie.

Construyendo mapas genéticos moleculares

• Escoger dos parentales genéticamente diversos

• Cruzarlos y desarrollar una población segregante– Familias F2, F3, BC1, Líneas endocriadas recombinantes (RILs)

desarrolladas por single seed descent (SSD), dobles haploides (DH), líneas de introgresión retrocruzadas (BILs)

• Extraer el DNA y evaluar la progenie con marcadores de DNA– Determinar la herencia del segmento de DNA en los locus de cada

marcador

• Determinar el orden de los marcadores a lo largo de los cromosomas basados en la frecuencia de recombinación entre pares de marcadores

– Marcadores que están localizados cerca mostraran menos recombinación que marcadores que están lejos o en cromosomas independientes.

• Nota: caracteres fenotípicos o bioquímicos pueden ser mapados basados en al co-segregación con marcadores de DNA.

Que es un marcador de DNA?

• Una manera de determinar la posición en un cromosoma.

• Los marcadores pueden identificar un nt especifico o pueden representar un segmento de DNA; pueden ser segmentos clonados o simplemente amplificados vía PCR

• Marcadores de copia simple ocurren en regiones se secuencia única

• Marcadores de copia múltiple contienen secuencias que están repetidas en el genoma y por lo tanto tienen posiciones múltiples (a pesar que siempre están flanqueadas por DNA de copia simple)

• Marcadores genéticos que detectan polimorfismos (diferencia) en el DNA entre dos individuos. Diferencias genéticas detectables son un pre-requisito para construir mapas genéticos

• Los marcadores polimórficos pueden ser evaluados para determinar el origen ancestral de una porción de DNA; pueden ser co-dominantes (distinguir entre heterocigotas y homocigotas ) o entre dominante/recesivo (+/-)

Que son los marcadores

• Los marcadores genéticos son loci polimórficos que nos informan:– Sobre el genotipo del individuo que lo porta– Sobre el genotipo de un locus vecino

• Los mas usuales son– los marcadores morfológicos– los marcadores moleculares– Marcadores bioquímicos (acepción genética)

Tipos de marcadores (lista no exahustiva)

• Marcadores codominantes revelados individualmente– RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)– CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence )– SSCP (single-stranded DNA conformation polymorphism )– Polimorfismos de numero de unidades de repeticion

• Microsatelites o SSR (simple sequence repeats)

• Marcadores dominantes revelados en masa (huellas dactilares genéticas)– Polimorfismos de secuencia

• AFLP (amplified fragment lenght polymorhism)

Diferencias a nivel de dianas de restricción

• Restriccion Fragment Length Polymorphism: RFLP

Las enzimas de restricción, son enzimas que cortan (digieren ) el ADN en sitios específicos llamados de restricción. Estos sitios comprenden un numero par de bases: 4,6,8 y a veces más en general en palíndromos

APA I GGG CCCCCC GGG

Bam HI GGATCCCCTAGG

• Una enzima que tenga un sitio de reconocimiento de 6 bases va a cortar el ADN cada 4096 bases en promedio (46). Un genoma de 109 bases va a producir unos 250 000 fragmentos de largos variables.

• La especificidad es tal que el cambio de una sola base es suficiente para evitar el corte. Es esta especificidad que es utilizada para poner en evidencia el polimorfismo:

Una presencia o ausencia de un sitio de restricción conlleva a un polimorfismos de largo del fragmento

Rebasehttp://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

Principio del RFLP

Enz restricciónI II

I II-

+

I II I II

ARNm

ADNc

marcardo

Clonaje

Enz restricción

RFLP y análisis de Southern

• cDNA o clones genómicos

• Puede determinar el numero de copias de una secuencia dada en el genoma.

• Técnica ampliamente usada para mapeo comparativo ya que requiere solo ~85% de similaridad entre seq para hibridizar con severidad media

• Usada para tamizar genotecas BAC/YAC

RFLP - garden blot

Tri

go

Arr

oz

Ave

na

Ceb

ada

Polimorfismos de secuencia –sitios de restriccion y diferencias en sitios de hibridacion de una

sonda arbitraria 2: AFLP

• AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. 1995 nucleiic acids Research. Vol 23, no 21

• P Vos, R Hogers, M Bleeker, M Reijans, T van de Lee, M Hornes, A Frijters, J Pot, J Peleman, and M Kuiper

• Keygene N.V., Wageningen, The Netherlands

• Métodos globales “Whole-genome” basados en la identificación de polimorfismos de largo de secuencia amplificados “amplified fragment-length polymorphisms” . Se usa amplificaciones de PCR selectivas de segmentos genómicos o de cDNA, digeridos /ligados

• TD usa un primer especifico de la secuencia consenso de un elemento transposable (TE). Ello resulta en amplicones que tienen un extremo anclado en una inserción TE y la otra en un región flanqueante con sitio de restricción definido a 400bp.

• El poder de la técnica es que genera muchos fragmentos en una sola reacción que puede ser ampliamente explorada para sus polimorfismos.

• La debilidad es que los marcadores son dom/rec y no están anclados a una posición especifica en el mapa

AFLP y Transposon Display (TD)

• Polimorfismos de Unidades de repeticion: SSR- simple sequence repeat

– Identify SSR’s computationally, using a BLAST query (see Simple Sequence Identification Tool available at www.gramene.org/) and available genomic or EST sequence

– If no sequence available, construct enriched or unenriched small-insert clone library; screen it by hybridizing labled oligo (with SSR motif of interest); send positive clones for sequencing

– design primers in single copy regions flanking SSR repeats such that the amplified fragments will be >50bp and <350 bp; look for size polymorphism on PAGE gels

– For multiplexing, design primers with similar Tm and a range of expected amplicon sizes so have non-overlapping groups of markers on gel

AGAGAGAGAGAGAGAG

•Polimorfismos de Unidades de repeticion: SSR- simple sequence repeat

SSRsmarcadores altamente polimórficos, multialelicos, copia única, co-

dominantes

SSR - segregación en RIL o población DH (tinción plata)

Segregación en población F2 Automated diversity fingerprinting

AGAGAGAGAGAGAGAG

• Son la forma de polimorfismo abundantes y mejor distribuida. Se detectan:

• Alineamiento de secuencias de genotipos múltiples

• usando dHPLC (denaturing, high-performance liquid chromatography) donde los amplicones de genotipos diferentes son disociados y re-apareados y luego pasados a través de una columna a una temperatura critica donde las moléculas homo y heteroduplex se disocian en tiempos diferentes

• usando la enzima CeL1 (que reconoce diferencias de una base en moléculas heteroduplex y corta en AND precisamente el lado 3’ del mismatch)

• Usando mass-spec que calcula diferencias en el peso molecular de los fragmentos amplificados (medidos en daltons)

SNP- single nucleotide polymorphisms

Ventajas de los diferentes marcadores

Alto polimorfismo

Bandas promedio

Análisis Automático

Co-dominante

Señalan genes activos

Mapeo Comparativo

+++

1-15

+

+

+/-

-

RFLP RAPD SSR AFLP TD SNP

+

1-2

-

+

+/-

+

+

5-15

-

-

-

-

+

30-70

+

-

-

-

+++

30-70

+

-

+

-

+1-

1500

+

-

+

+

Como se usan los marcadores?

M A B H H S S R H H R R R R H H H H S H H H S H R R R H H R S H S H M

The original band weights 365 aprox. In the resistant parent, the digestion with Afl III produces two bands: 191 bp and 174 bp aprox. The susceptible parent PS shows the original band because it doesn’t have any target restriction for Afl III. The polymorphism between parents is very clear. The heterozygote shows both bands.A: resistant Korean accession PI 161375B: “Piel de Sapo” (PS) or T111, susceptible parent H: heterozygoteM: pUC Mix, low weight molecular marker

M 29 MARKER (365 bp) (CAPS)365 bp

191+174 bp

• Usar los datos de segregación para establecer el ligamiento– Comparaciones de dos en dos entre todos las posibles combinaciones de

marcadores para cada individuo en la población • Los marcadores se registran como 1= alelo Maternal; (2= Heterocigoto); 3=

alelo Paternal– Determinar cuales son los pares mas frecuentemente heredados juntos ( mismo

score) usando individuos en la población como repeticiones para probar la asociación

– Establecer el orden de los marcadores a lo largo del cromosoma, confirmar usando la prueba de tres puntos o análisis de “intervalo”

Plant # -> #1 #2 # 3 # 4 #5 #6 #7 #8 #9 #10

RM152 2 2 1 2 1 3 2 1 3 2

RM89 2 2 1 2 1 3 2 1 3 3

RM23 1 2 2 2 1 2 3 1 3 3

RM520 2 3 1 2 1 3 2 2 3 2

red leaf gr gr red gr red gr gr gr gr gr

RM274 2 1 3 2 2 2 1 3 2 2

Car

acte

r/M

arca

dor

RM152 2 2 1 2 1 3 2 1 3 220 cM

10 cM

Cartografía básica

0 cM

RM23 1 2 2 2 1 2 3 1 3 340 cM

Cartografía física

• Cortar los cromosomas en fragmentos pequeños que puedan ser mantenidos, propagados y caracterizados.

• Ordenarlos en sus posiciones correspondientes en los cromosomas.

• Una vez que el mapeo se completa, el siguiente paso es determinar las bases de cada uno de los fragmentos que ha sido ordenado

Enzimas de restricción (Restricción incompleta)

Vectores

Vectores Características Talla inserto

Plásmido E.coli- Introducidos por transformación 1-5 kb (electroporación o heat shock)

Fago E.coli- Virus que infecta bacterias 10-15 kbIntroducido por transfección

Cósmido E.coli- Plásmido con “cos” sites para 30-45 kb el packaging en fagos lambda. Introducidos por infección en E. coli

Molécula de DNA que se origina de un virus, un plásmido o de la célula de un organismo superior en la que otro fragmento de DNA de un tamaño apropiado puede ser integrado sin que el vector pierda su capacidad de auto-replicación

Los vectores introducen DNA en células hospederas, donde el DNA puede ser reproducido en grandes cantidades.

Cromosomas Artificiales : para el map-based cloning

Vector Características Talla-inserto

BACs: E.coli- Basado en el F factor ocurre natural 100-300 kb mente. Estable, 1-2 copias por célula

TACs Contiene T-DNA (w vir genes) puede ser 100-300 kbBiBACs: transformado en plantas con Agrobacterium

PACs: E.coli- Basado en el genoma del fago-bacteria 100-300 kb P1 (un virus)

YACs: Cel. levadura (50-100 veces mas volumen < 1,000 kb que E. Coli). Usualmente inestablestienen re-arreglos (1

Mb)En experimentos de clonamiento posicional, Nunca crean en un solo clon grande ! YAC’s tienden a rearreglos y deleciones, etc.

Requisitos de un Vector

• Marcador de selección – Resistencia a ampicilina, kanamicina, hygromicina,

herbicidas, etc.– Permite que solo los clones recombinantes

sobrevivan

• Sitios de clonamiento múltiple (mcs)– muchos (únicos) sitios de restricción

• Los vectores que amplifican en E. coli:– Origen de replicación (Ori): requerido por el

plásmido para replicarse en la bacteria– Control del numero de copias (F factor

plasmid): reduce el numero de copias del plásmido en una célula dada para evitar problemas de re-arreglos (quimeras)

Construcción de mapas físicos

• Los mapas físicos de construyen con arreglos continuos de clones con insertos grandes (YAC, BAC, PAC, etc) y alineándolos a un mapa de ligamiento genético

• Se hace el fingerprint (i.e.digestion con HindIII) de las genotecas grandes (10-20X) y los extremos de cada BAC se secuencian

• El patrón de restricción de los clones se aparea usando un programa que se llama FPC (fingerprint contig) que permite que los clones sean ensamblados en contigs

• Los Contigs se alinean a los mapas genéticos hibridándolos a marcadores o alineando informaticamente la secuencia de los marcadores a la secuencia de los BAC-end o YAC, PACS ETC.

Fig. 2: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545

Esto es un contig

Fig. 1: Chen et al. (2002) The Plant Cell 14:537-545

Mapa fisico:genetico. BACs anclados en rojo, huecos en negro, centromero en verde.

Un pequeño numero de marcadores es suficiente para anclar los contigs al mapa genetico. Los gaps remanentes usualmente consisten en repeticiones que son dificiles de clonar o secuenciar.

Mapa fisico MNSV

A physical map covering the nsv locus that confers resistance to Melon necrotic spot virus in melon (Cucumis melo L.). Morales, Orjeda, Nieto. 2005 TAG

Mapas citologicosCitología y Cariotipos

• Los cromosomas son identificados visualmente e identificados por:– Largo físico– Posición del centrómero– Razón del largo de brazos (corto:largo)– Patrones de tinción que detectan áreas de

heterocromatina y eucromatina• Tinción al Acetocarmín• Tinción DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole se une

preferentemente a regiones ricas en AT)

– Hibridación de marcadores específicos mapados• FISH (Fluorescent in situ hybridization)

Ideogram of rice pachytene chromosomesCheng et al. (2001) Genome Research 11:2133-2141

• Las regiones DAPI-brillantes detectan heterocromatina. En Arabidopsis, casi toda la heterocromatina teñida con DAPI es centromerica, mientras que en arroz es pericentrica, asi como telomerica e intersticial.

• Fig. 3 (no legend) • Basada en observaciones de 50 células en paquiteno.

• Círculos = DAPI brillante

• Círculos abiertos = centrómeros

• Círculos sombreados = regiones DAPI-brillantes en indica pero no en japónica

• Línea punteada chr 9 = sección rDNA

• Largo relativo de cada K y brazo medido en um

FISH mapping en el K 10• Los cromosomas en paquiteno son 10X mas largos que cromosomas somáticos en

metafase por lo que proveen resolución mas alta para los mapas citológicos. Los clones BAC separados por ~100 kb pueden ser resueltos en k en paquiteno y dar un estimado de la distancia fisica:genetica y su relación con regiones heterocromaticas.

Cheng et al. (2001) Genetics 157:1749-1757

• Fig. 3

•Fig. 4•Fig. 4

High-Resolution Pachytene Chromosome Mapping of Bacterial Artificial Chromosomes Anchored by Genetic Markers Reveals the Centromere Location and the Distribution of

Genetic Recombination Along Chromosome 10 of Rice Zhukuan Cheng, et al 2001 Genetics

Zhukuan Cheng et al. Genome Res. 2001; 11: 2133-2141

Chromosomal arm-specific bacterial artificial chromosome (BAC) markers and rice chromosome identification

Mapas basados en secuencia

• Una vez que los genomas han sido secuenciados el trabajo es anotar las caracteristicas del genoma usando metodos computacionales y experimentales.

• Los mapas de secuencias contienen huecos (gaps) en los centromeros, rDNA y otras regiones repetidas.

• Arabidopsis: 25, 498 genes predecidos

http://atensembl.arabidopsis.info/index.html• 69% de los genes pudo ser clasificado de acuerdo a la similaridad

de la secuencias con proteinas de funcion conocida en otros organismos, mientras que 30% permanecen funcionalmente no clasificadas.

• 9% de los genes estan siendo caracterizados experimentalmente

• 14% de los genes asignados a los cloroplastos

• Se observa una redundancia pronunciada que incluye duplicaciones segmentales y arreglos en tandem

Organizacion del genoma

• 24 segmentos duplicados de 100kb o mas, que comprenden 58% del genoma de Arabidopsis apoyan la hipotesis de eventos multiples de duplicacion y origen poliploide ancestral

• Muchas inversiones locales, perdida/lganancia de genes en las regiones duplicadas

• 17% de los genes de Arabidopsis estan dispuestos en tandem

• Se sugiere redundancia funcional o una sutil diferenciacion de patrones de expresion entre genes duplicados

• 7% de los exones poseen polimorfismos (SNPs & indels) sitios de splicing alterados en 25% de los genes predichos.

• Los Transposones componen 10% del genoma (20% de zonas intergenicas del DNA). Retrotransposones ocurren primariamente en los centromeros y estan correlacionados con baja tasa de recombinacion.

http://www.ensembl.org/index.html