MANUAL_PRAC.MICOLOGIA_PAPIME F [1].pdf

7/24/2019 MANUAL_PRAC.MICOLOGIA_PAPIME F [1].pdf

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Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRICOLAS

MANUAL DE LABORATORIO DE MICOLOGIA

AGRCOLA

. MARCOS ESPADAS RESENDIZ

M.C. GLORIA DE LOS ANGELES ZITA PADILLA


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INDICE

PRACTICA 1. ................................................................................................................................................3

PRACTICA: 2 ................................................................................................................................................7

PRACTICA: 2 (CONTINUACIN).................................................................................................................9

PRACTICA 3 ...............................................................................................................................................12

PRACTICA.4 ...............................................................................................................................................14

PRACTICA: 5 ..............................................................................................................................................16

PRACTICA: 6 ..............................................................................................................................................18

PRACTICA 7 ...............................................................................................................................................22


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PRACTICA 1.

COLECTAIntroduccin

La colecta de muestras en campo de tejidos vegetales enfermos porhongos, son bastante tiles en el conocimiento y estudio de lasintomatologa de enfermedades, as como en la formacin depoblaciones representativas del patgeno. En laboratorio continuar conla revisin y caracterizacin de sntomas ayudar a iniciar a hacer uncorrecto diagnstico, el reconocimiento del signo en sus diferentes

manifestaciones estructurales como tipos de micelio, tipos de esporas,tipos de fructificaciones del hongo sexuales o sexuales nos ayudaran ahacer una correcta identificacin del patgeno en las malezasafectadas.

Objetivos:

Conocer y manejar las tcnicas ms comunes de colecta, preservaciny manejo de material de estudio fitopatolgico en cultivos deimportancia agrcola

Material y equipo utilizado en la colecta de plantas enfermas.

Pala recta, navaja de campo, tijeras de podar, lupa de campo,serrucho, machete, cmara fotogrfica, bolsas de polietileno, etiquetas,prensa, papel secante, peridico y cartn corrugado, libreta de campo,hielera porttil, ligas, engrapadora manual, frascos de boca ancha,soluciones fijadores.

Desarrollo:

Los problemas fitopatolgicos en los cultivos se pueden presentar enhojas, races, tallos, frutos, etc. Se pueden identificar cuando:

a)Crecen anormalmenteb) Se secan o se muerenc)Cuando disminuye la cosecha ao con ao y no se recupera an

con fertilizantes o combatiendo malezas.d)Alteraciones en el crecimiento (achaparramiento, gigantismos, etc.)e)Decoloraciones, sobre pigmentaciones, manchas, rayados, etc.


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Es conveniente disponer del mayor nmero de elementos vegetalescolectados que permitan lograr la identificacin del agente causal. Laspartes vegetales que deben colectarse, dependen de la formabiolgica del hospedante que se trate:

a)Hospedante anual. Se deber colectar varias plantas completas quepresenten sntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de laenfermedad, pero que no estn en su totalidad muertas o en estadode descomposicin, pues as no son tiles para el estudio en ellaboratorio. Si el cultivo ya esta muy desarrollado, colecte soloproporciones de los rganos afectados. Es conveniente colectartambin una planta sana para que sirva de comparacin.

b)Hospedante perenne. Se colectan partes representativas, como raz,tallo, hojas, flores, frutas, igualmente con sntomas iniciales y endiferentes etapas de desarrollo de la enfermedad; as mismo, sedebern colectar partes que estn completamente muertas o enestado de descomposicin.

En el caso de que la planta presente sntomas tipo marchitamiento, esmuy probable que se trate de infestaciones de hongos del suelo, por loque se deben tomar muestras del suelo que haya estado en contactocon la raz. En el caso de que las plantas sean pequeas, se debe sacarla planta entera, y sin sacudir el suelo de las races, se debe meter en

una bolsa de plstico junto con 250 gr. de suelo, (aproximadamente), ycerrarla con una liga. .

Al recolectar el material en el campo, deben tomarse en consideracinvarios aspectos importantes, como son el estado fenolgico de laplanta al momento de la recoleccin, la parte de la planta que se va atomar, el desarrollo de la lesin y las condiciones ambientales en esemomento. Para cada muestra deben anotarse los datos derecoleccin, como localidad, fecha, junto con una descripcin de los

sntomas.Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan

acompaados con una hoja con los siguientes datos de campo

a)Datos generales.

Localidad ________________ Fase fonolgica ________________

Fecha ________________


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Maleza(hospedero)

________________

b) Apariencia general de la poblacin de maleza enferma

Marchitez __________________ Tizones ________________

Amarillamiento ________________ Desarrolloanormal

________________

reas muertas ________________ Otros ________________

Manchas foliares ________________

c) Partes atacadas de las plantas.

Raz ________________ Brotes o Tallos ________________

Hojas ________________ Flores ________________

Frutos ________________

d) Distribucin de la enfermedad

Plantas aisladas ________________ Manchones ogrupos de

plantas

_______________

reas grandes ________________ reas pequeas ________________

Bandas o franjas ________________ Bordes de cultivo ________________

e) Condiciones prevalecientes durante la aparicin de los primerossntomas y el desarrollo de la enfermedad.


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Precipitacin ________________ Humedadrelativa

________________

Vientos ________________ Heladas ________________

Granizo ________________ Otros ________________

a)Qumicos aplicados al cultivo en donde se colecto la maleza(concentraciones y dosis).

Fertilizantes ________________ Fungicidas ________________

Herbicidas ________________ Insecticidas ________________

Defoliantes ________________ Otros ________________

a)Caractersticas del suelo.

Drenaje ________________ Textura ________________

pH ________________ Otros ________________

Datos del laboratorio que nos ayudarn al diagnstico de laenfermedad y a la identificacin del agente causal.

a)Caractersticas de las lesiones.b)Presencia de esporas, micelio, cuerpos fructferos o cualquier

estructura (hacer esquemas).c) Exudaciones (color, consistencia etc.)d)Presencia de insectos o caros.e) Evidencia de daos mecnicos

Bibliografa.

1. Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatologa General. HerreroHnos. Mxico.

2. Gavio, G.G. y H. Figueroa. 1975. Tcnicas Biolgicas Selectas deLaboratorio y Campo. Limusa. Mxico.

3. Gonzlez, L.C. 1977. Introduccin a la Fitopatologa. I.I.C.A. San Jose deCosta Rica.

4. Lpez A.G. 1978. Tcnicas de uso comn en el manejo de Hongosfitopatgenos. Tesis. E.N.A. Mx.

5. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis.Marcel Dekker Inc. 518 pp.


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6. Roberts, G. y C. Boothroyd. 1972. Fundamentos de Patologa Vegetal.Acribia. Zaragoza.

7. Tuite, J. 1964. Plant Pathological Methods, Fungi and Bacteria. Burges Pobl.Co. Minneapolis.

8. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,

Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,Washinton, D.C., 413 pp.

PRACTICA: 2

AISLAMIENTOIntroduccin

Para poder implantar mtodo de control de enfermedades en loscultivos, es necesario conocer los enemigos fngicos de los cultivos deimportancia agrcola. Esto implica el aislamiento e identificacin de loshongos que las enferman; para elaborar un inventario de los mismos, noslo en su centro de origen sino tambin en el rea de distribucin dadoque las condiciones ambientales que prevalecen en una u otra zona

determinan el grado de control logrado por un organismo vivo.Objetivos

Adiestrar a los alumnos en las tcnicas de aislamiento de hongosfitopatgenos .y con esto contribuir, al desarrollo de nuevas tecnologasde control.

Materiales y mtodos

2 Cajas de Petri con PDA para aislamiento, 1 caja de Petri con PDA yuna con jugo V8 agar para cepa pura, 2 cmaras humadas, Malezasenfermas, mechero, campana de flujo alminar, microscopioestereoscpico, microscopio compuesto, portaobjetos, azul delactofenol, azul de algodn, tijeras, pinzas de diseccin, cloro, envasesde plstico para desinfectar, pipeta, 250 ml de agua destilada estril,alcohol

Aislamientos a partir de vegetales enfermos.

Aislamiento directo. Observe al microscopio de diseccin el ejemplarenfermo; si encuentra fructificaciones, micelio, etc., tome una muestra


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de este material con una aguja de diseccin estril y colquelodirectamente sobre el medio de cultivo solidificado. Incube a 24C yobserve durante los siguientes 7 das.

Cmara hmeda. Cuando la planta presenta micelio y no hay

fructificaciones o cuando no se aprecia el crecimiento del patgeno,se recurre al uso de la cmara hmeda. Se toma porciones de tejidoenfermo se lava en agua corriente, se can los tejidos con papelabsorbente, y se desinfecta en una solucin 2:1de cloro, se lavan dosveces con agua destilada estril y se eliminan excesos de agua, en elinterior de una caja de Petri estril que contenga papel filtroesterilizado, finalmente en un dispositiva para cmara hmeda secolocan pequeos trozos del vegetal enfermo lavados desinfectados,secos y se cierra la caja, se humedece con agua destilada estril. Seincuba a 24C durante 2 o 3 das, caracterice al patgeno que se

desarrolla durante este tiempo de observacin y anote estos resultadosen su libreta se laboratorio

Partes vegetales en medio de cultivo. Se toma porciones de tejidoenfermo se lava en agua corriente, se secan los tejidos con papelabsorbente, y se desinfecta en una solucin 2:1de cloro, se lavan dosveces con agua destilada estril y se eliminan excesos de agua, encolocan el interior de una caja de Petri estril que contenga papel filtroesterilizado, este material lavado, desinfectado y seco se coloca encajas con PDA y/o Jugo v8 agar solidificado. Se incuba a 24C y se

observa se observa durante los siguientes 5 das, caracterice alpatgeno que se desarrolla durante este tiempo de observacin

Bibliografa

1. Agrios, G. N. 2005.Plant pathology. 5th ed. Elsevier academic Press.Amsterdam, Boston, Heidelberg, London, New York, Oxford, Paris, SanDiego, san Francisco, Singapore, Sydney, Tokyo. 992 pp. *

2. Charudattan, R.1991 The mycohebicides approach with plant pathogenspp24-57: In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman and Hall.

3. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRCPress. 355 pp

4. French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA.Costa Rica.

5. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.Marcel Dekker Inc., 518 pp.

6. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plantpothogenic fungi. C A B International, 267 pp.

7. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,Washinton, D.C., 413 pp.


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PRACTICA: 2 (CONTINUACIN)

AISLAMIENTO

AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATGENOS DETALLOS Y HOJAS(PLAQUEADO)

MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS.- Plantas infectadas- Tijeras- Sobres de papel- Lpiz de carbn

- Esquema de distribucin de las plantas para la toma de

muestras.- Bistur- Mechero de alcohol- Frascos de plstico para desinfectar tejidos- Cloro al 20%- Agua MQ- Cronometro con alarma- Aguar estril- Matraces para esterilizar agua

- Papel aluminio

- Rotulador- Pinzas de diseccin- Vaso de precipitado- Cajas de peri con PDA y antibitico- Campana de flujo laminar preparada- Papel parafim- Alcohol para quemar- Alcohol para desinfectar- Atomizador de alcohol

- Rollo de papel

PROCEDIMIENTO

a)Corte de material vegetal en invernadero.- Hacer los cortes en la parte basal de tallos.- Colocar las muestras de tejido en sobres de papel

previamente etiquetados y se anota en el mapa de

distribucin las plantas de donde se tomaron las muestras.b) Limpieza y corte de tallos y hojas.


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- Se eliminan las vainas foliares, para dejar el tallo limpio, seflamea un bistur en el mechero, para hacer cortes de talloy hoja de 5 mm de longitud.

- Se colocan los trozos de tallo y/o hojas en frascos deplstico previamente rotulados con cada una de las

muestras.c)Desinfeccin

- Rotular los frascos- Se le agrega del volumen del frasco de cloro al 20% y se

dejan las muestras en el desinfectante durante 20 minutos,agitar el frasco de vez en cuando. Despus de los 20minutos el desinfectante se decanta dejando solo lostejidos en el frasco.

d) Lavado de tejidos en agua estril (en campana de flujo laminar)- Se agrega de volumen del frasco de agua estril a los

tejidos desinfectados, agitar y decantar el agua a unvaso. Todo este ltimo paso se hace dentro de lacampana de flujo laminar, previamente preparada.

* Ver anexo de equipo en: preparar campana

e) Plaqueado- Rotular las cajas de petri con datos de la planta de donde

se aisl y fecha.- En cajas de petri con PDA y antibitico se van colocando

los trozos de tejido con pinzas de diseccin, flamendolas

cada vez que se vaya a colocar un trozo de tejido delrecipiente que los contiene desinfectados para llevarlos ala placa de medio de cultivo.

- Todo este plaqueado se hace dentro de la campana deflujo laminar preparada.

BIBLIOGRAFA

1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRCPress. 355 pp SB 732.5 D45

2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios y parsitos:Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603 M55.

3. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungi inventoryand monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B. QK600.3 M84

4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37


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5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plantpothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63

6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plant pathology,

Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis.Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.


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PRACTICA 3

LIMPIEZA Y REVISIN DE AISLAMIENTO DE HONGOSFITOPATGENOS

MATERIAL, EQUIPOS Y SUSTANCIAS

- Bistur- Mechero de alcohol- Pinzas de diseccin- Rotulador- Aislamientos a limpiar ya marcados

- Alcohol en atomizador

- Rollo de papel- Papel parafim- Campana de flujo laminar ya preparada- Caja de petri vaca- Microscopio estereoscpico y compuesto.

PROCEDIMIENTO

a) 72 horas despus de iniciado el aislamiento, se recomiendahacer la limpieza de posibles contaminaciones

b) Si las contaminaciones se presentan, delimitar el reacontaminada con un rotulador.

c) La eliminacin del rea contaminada, se hace en lacampana de flujo laminar con el mechero de alcohol enfuncionamiento.

d) Con el bistur previamente flameado se hacen los cortes enlas lneas marcadas que rodean al contaminante y se retira

la zona contaminada; se deposita lo extrado en una cajade petri vaca colocada en el interior de la campana deflujo laminar.

e) Este procedimiento se repite para cada una de las cajascontaminadas.

f) Una vez que estn limpios y puros, sellar las cajas con papelparafina.

Nota: este procedimiento se ha de repetir a las 96 horas, 120 horas,

etc. hasta que las contaminaciones dejen de aparecer.


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Bibliografa

1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods.CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45

2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios yparsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp. QK 603M55.

3. Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity of fungiinventory and monitoring methods, Elsevier Academic Press. 777pp. C.B.QK600.3 M84

4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and diseasediagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37

5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay for plant

pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733 M63

6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2004, Plantpathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London,New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseasesdiagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.


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PRACTICA.4

CARACTERIZACIN DE HONGOS FITOPATGENOSIntroduccin

Para continuar con el segundo postulado de Koch y llevar a cabo laidentificacin de los agentes causales, es necesario iniciar elreconocimiento del hongo que se aisl y se desarrollo en los medios decultivo por los diversos mtodos de aislamiento. Aqu es importante ydeterminante comparar estos hongos aislados, con los hongosreconocidos en los diversos signos que se colectaron, realizandopreparaciones temporales y usando o diferentes medios de montaje

facilitan la identificacin de los diferentes hongos fitopatgenos.

Objetivos. El alumno reconocer las diferentes estructuras somticas yreproductivas representativas para la caracterizacin e identificacinde las diferentes Clases hongos que atacan alas malezas

Actividades.

1. Elaboracin de preparaciones temporales y permanentes dehongos, utilizando diferentes tcnicas de tincin.

2.

Observacin de preparaciones permanentes de hongos.3. Esquematizacin de lo observado, indicando los nombres de lasestructuras.

4. Mida cada una de las estructuras observadas y documntelas confotografas a diferentes aumentos

Matriales y mtodos.

Porta y cubreobjetos, azul de metileno, Mechero o lmpara de alcohol,rojo congo, Caja de Petri, lugol Agujas de diseccin, preparaciones dehongos,Tejidos vegetales enfermos, cultivos de hongos, Azul delactofenol, Azul de algodn

PREPARACIONES TEMPORALES DE HONGOS

1. Con una asa estril (o una aguja de diseccin ), tome una pequeamuestra de hongos y colquela en un portaobjetos con una gota deagua destilada.

2. Extienda el micelio y agregue una gota de azul de metileno.

3. Coloque el cubreobjetos y observe al microscopio


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Haga preparaciones temporales con cinta adhesiva transparente.

TINCION CON ROJO CONGO.

1. Realice una preparacin temporal de hongos, usando lactofenol en

lugar de agua para colocar el micelio.2. Coloque el cubreobjetos y por un extremo agregue una gota derojo congo*, permita que se difunda y observe al microscopio.Esta tcnica se puede seguir, sustituyendo colorantes.

Bibliografa

1. Barne, H., and Hunter, B. B. 1987. Illustrated genera of imperfect fungi.MacMillan Publishing Company. 218 pp. QK 625 D1 B3

2. Cummins, G. B., and Hiratsuka, Y. 2003. Illustrated genera of rust fungi. APSPress. 225 pp. * OK 627. A1

3. Dhingra, O. D., and Sinclair, J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRCPress. 355 pp. * SB 732.5 D45

4. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of Ascomycetes. Volume 1. APS Press.263 pp. *QK 623.A1 H355. Hanlin, R. T. 1997. Illustrated genera of Ascomycetes. Volume 2. APS Press.

258 pp. *QK 623.A1 H356. Len Gallegos, H. M., y Cummins, G. B. 1981. Uredinales (royas) de Mxico.

SARH. Vol 1. 440 pp. y Vol 2 492 pp. C137. Klman, Vnky. 2002. Illustrated genera of smut fungi. APS Press. 238 pp. *QK

628 A1 V35.8. Muller, G. M., Bills, F. G., and Foster, S. M. 2004. Biodiversity of fungi inventory

and monitoring methods. Elsevier Academic Press. 777 pp. *QK600.3 M849. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and disease diagnosis.

Marcel Dekker Inc. 518 pp. *SB731 N3710.Trigiano, R. N., Windham, M. T., and Windham, A. S. 2008. Plant pathology,concepts and laboratory. CRC Press, Boca Raton, 413 pp. *SB732.56 P53

11.Watanabe, Tsuneo. 2002. Pictorial atlas of soil and fungi: morfologies ofcultured fungi and key to species. CRC Press.486. pp


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PRACTICA: 5

MICROCULTIVO

Introduccin.Una vez que se tiene el resultado de las diferentes tcnicas de

aislamiento como lo es la obtencin de la cepa pura, el siguiente pasopara cumplir a cabalidad con el segundo postulado de Koch, es laidentificacin del agente causal y una herramienta ms para cumplircon este objetivo, en caso que este agente causal sea un hongos comoen la mayora de las enfermedades que afectan a los cultivos: es latcnica de microcultivo; con esta tcnica se obtienen las distintas fasesdel ciclo de vida de los hongos, que va de germinacin de la espora,formacin del tubo germinativo, hifas, micelio, diferenciacin de lasestructuras reproductivas asexuales y sexuales. Se debe dar un manejode tiempos en el desarrollo de los hongos para poder observar lasestructuras desde el inicio de su formacin.

Por ejemplo esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongosen los que es difcil observar la formacin de los condios sobre losconidiforos y la forma y estructura de stos; porque, al efectuar elpreparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante

este mtodo se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento yesporulacin en todos sus detalles y as tener elementos morfolgicos deestructuras somticas y reproductivas completas para as poder hacerla identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los hongos comoagentes causales de enfermedades en las diferentes cultivos Dhingra,and Sinclair(1985) Trigiano, Windham,. and Windham,, (2008). En laactualidad hay herramientas bibliogrficas en la biblioteca de laFacultad de calidad y actualizadas: (Barne, H., and Hunter, B. B. 1987,Cummins, G. B., and Hiratsuka, Y. 2003,Hanlin, R. T. 1997.,Klman, Vnky.2002, Watanabe, Tsuneo. 2002.); que facilitan la identificacin de las

diferentes Clase de hongos que atacan a las plantas.

Objetivo.

Conocer la tcnica de microcultivo para la caracterizacin deestructuras somticas y reproductivas para identificarmorfolgicamente a los hongos fitopatgenos.

Materiales y mtodos

Recipiente con alcohol al 96%, pinzas de diseccin, aguja de diseccin,bistur, caja de Petri estril con PDA, cepa pura, dispositivo de


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microcultivo, pipetas, puntas agua estril, papel parafin, una caja conmedio de cultivo

Con un bistur estril se cuadricula el medio de cultivo de la caja de Petricon PDA en cuadros de aproximadamente 1 cm2. este paso se realizaen el interior de una campana de flujo laminar preparada para trabajarbajo condiciones aspticas

1. Dentro de la cmara de flujo laminar, con la ayuda de un bisturestril, uno de los cuadros de PDA se transfiere al portaobjetos queesta en la cmara de microcultivo ;este portaobjetos debe deestar sobre el triangulo de vidrio

2. Con la aguja de diseccin estril o con una asa bacteriolgicaestril se lleva el inculo a las orillas superiores e inferiores delcuadro de PDA

3. Se coloca el cubre objetos sobre el cuadro de PDA inoculado,procurando que quede bien centrado.

4. Se agregan 2ml de agua estril, en el fondo de la cmara demicrocultivo para mantener la humedad, sin mojar el rea decrecimiento del hongo. Los pasos 1-5 se llevan a cabo en elinterior de una campana de flujo laminar o en mesas de trabajoen condiciones aspticas

5. Se sella el dispositivo de microcultivo con papel parafilm y serotula.

6. El crecimiento del hongo se detiene cada 24,7. se repiten los pasos del 1 al 7 para mas microcultivos, y detener su

desarrollo a la 48, 72 y 96 hrs. Respectivamente

Bibliografa

1. Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant PathologyMethods. CRC Press. 355 pp SB 732.5 D45

2. Mier, T., Toriello, C. y Ulloa, M. Hongos microscpicos saprobios yparsitos: Mtodos de laboratorio. 2002. UAM IB UNAM. 90pp.QK 603 M55.

3.Muller, G. M., Bills, F. G. and Foster, S. M., 2004, Biodiversity offungi inventory and monitoring methods, Elsevier AcademicPress. 777pp. C.B. QK600.3 M84

4. Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and diseasediagnosis. Marcel Dekker Inc., 518 pp. C.B. SB731 N37

5. Schots, A., Dewey, F. M. and Oliver, R., 1994. Modern assay forplant pothogenic fungi. C A B International, 267 pp. C.B. SB733M63

6. Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plantpathology, Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton,London, New York, Washinton, D.C., 413 pp. C.B. SB732.56 P53

7. Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseasesdiagnosis. Marcel Dekker Inc. 518 pp. SB 731 N37.


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PRACTICA: 6

MEDIDA DE ESTRUCTURAS DE AGENTES FITOPATGENOS

CON MICROSCOPIO PTICO*

Introduccin.

Para identificar a un agente fitopatgeno y cumplir cabalmente con elsegundo postulado de Koch de adems de los datos correspondientesal aspecto de los sntomas que hayan causado en su hospedante, o delas colonias que hayan formado sobre las placas en medios de cultivo,de los datos morfolgicos que hayan resultado de la tcnica de

microcultivo es necesario saber las medidas de las estructuras somticasy reproductivas que se observan en el microscopio ptico para teneruna identificacin confiable del agente causal. Por ejemplo si se hablade hongos fitopatgenos las estructuras que se miden para identificarlosson: picnidios, acrvulos, esporodoquios, sinemas, peritecios, apotecios,clestotecios entre otras. La The American Phytopathological Society entodas sus obras de enfermedades de los cultivos agrcolas, las clavesque usa para la identificacin de los diferentes grupos de hongosfitopatgenos estn en funcin del tamao de las estructuras somticas

y de reproduccin de este grupo de fitopatgenos. La identificacin delagente causal es bsica para precisar el diagnstico y as poderestablecer el mejor mtodo de control para estas limitantes biolgicasen la produccin agrcola.

Objetivo....

Que el alumno aprenda a calibrar y medir clulas, estructurassomticas y reproductivas de importancia taxonmica deagentes fitopatgenos con el microscopio. ptico para su

identificacin morfolgicaMaterial.

Un microscopio ptico, Un micrmetro ocular, Un portaobjetosmicromtrico, Preparaciones permanentes y/o temporales deestructuras fitopatgenos.

Metodologa.

Calibracin de los lentes objetivos.


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1.- Se coloca en el ocular del microscopio ptico el micrmetro ocular aunque a menudo se trabaja con el ocular micromtrico permanentepuesto en el microscopio. Hay que evitar que quede invertida la escala(Ver Fig 1).

Fig 1.- A.- Colocacin de la reglilla ocular, y B.- Escala de la reglilla

ocular micromtrica

2.- Sobre la platina del microscopio se pone el micrmetro del objetosimilar portaobjeto como si fuese una preparacin.

Fig 2.- Escala de la reglilla portaobjeto

3.- Moviendo la platina se hace coincidir el margen de una raya delocular micromtrico con una del portaobjetos micromtrico. Puesto quelas rayas del portaobjetos aparecen tanto ms gruesas cuanto mayorson los aumentos, la superposicin de las lneas ha de ser siempre al

comienzo del margen exterior de stas.3.- Moviendo la platina se observa a travs de microscopio con ambasreglillas colocadas se les puede ver superpuestas en el campo visual, yse puede saber cuantas lneas del micrmetro ocular concuerdan concuantas lineas del micrmetro del objeto se hace coincidir el margen deuna raya del micrmetro ocular con una del micrmetro del objeto. Ver

figura 3


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Fig 3.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica

4.- Cuando se observa a travs del microscopio con ambas reglillasmicromtricas colocadas, se les puede ver superpuestas en el campovisual, y se puede saber cuntas lneas del micrmetro ocularconcuerdan con cuntas lneas del micrmetro del objeto. En el campovisual, la reglilla ocular se encuentra graduada del 0 al 10 a un lado la

reglilla del objeto con 100 divisiones; como cada lnea del micrmetrodel objeto corresponde a 10 micras, se hacen coincidir ambas reglillasen el cero, en el otro extremo de las reglillas se observa cual de las 100lneas de la reglilla ocular coinciden con otra de la reglilla delportaobjetos. Y se hacen los clculos correspondientes.

Ejemplos 1: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen1) y se observa que en el otro extremo de las reglillas el 100 de lareglilla ocular coincide con el 97 de los trazos de la reglilla del objeto,es decir 0.97 mm; por lo tanto, una lnea del micrmetro ocular es

equivalente a 0.009 mm = 9 m y este valor es el que utilizamos paradefinir el tamao de cada estructura que se mide, es obvio que estacalibracin es para este microscopio, con ese ocular y objetivosrespectivamente. Esta operacin se deber repetir cuando secambie de microscopio o de objetivos para evitar errores.

Ejemplo 2: Se hace coincidir los ceros de ambas reglillas (ver imagen2) y se observa que siete divisiones del ocular micromtrico coincidencon dos divisiones del portaobjetos micromtrico. Puesto que cada

divisin de ste equivale a 10 m, el valor de cada divisin del ocularse obtiene mediante una simple regla de tres: 7 divisiones del ocular= 20 m; una divisin del ocular = 20/7 = 2.8 m (Ver Fig 4).

Fig 4.- Vista simultnea del ocular y de la reglilla micromtrica, donde

coinciden la primera lnea de las dos reglillas y la lnea 2 de la reglillaportaobjetos con la siete de la ocular


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b).- Medicin de ejemplares y estructuras de micromicetes.

1.- Una vez que se ha cuantificado el valor de cada lnea en la reglilladel ocular ( 9 y 2.8 m en los ejemplos), se puede retirar el portaobjetosmicrmetro y en su lugar se puede colocar un portaobjetos normal conel espcimen a medir y se deja colocado el micrmetro ocular, demanera que se puede colocar una clula o estructura celularcualquiera, en este caso, se hace coincidir una raya de la escala conlos mrgenes de la estructura fngica elegida, y se cuenta el nmero dedivisiones de la escala comprendidas en la longitud y en el ancho dedicha estructura.

Ejemplo 3: Si la estructura del hongo se extiende a lo largo de 16lneas y cada una de ellas vale 9 micras, segn se explic antes, por

tanto el tamao total de esta clula es de 16 x 9, es decir 144 micras.

2.- Si se llega a cambiar el objetivo por otro menor aumento se deberepetir la operacin para encontrar nuevos valores en la reglilla, estamedicin se puede realizar en un microscopio mono o binocular, peroen este ltimo caso se tiene que mantener inalterada la distanciainterpupilar, puesto que el cambio altera la distancia mecnica y elvalor del micrmetro depende de ella.

Bibliografa

1. Barrera, E. H y R. Crdenas 1997 El microscopio ptico FES- Iztacala-UNAM P y V editores. Estado de Mxico. 86pp.

2. Barthelemy, E. R. Dawson, R. J., y A. E. Lee. 1984. Tcnicas para elLaboratorio de Biologa. 2. Edicin. CECSA editor. Mxico, D. F. Mxico.148 pp.

3. Mateu, B. 1972. Atlas de Microscopia. 4. Edicin. Jover Ediciones.

Barcelona, Espaa. 96 pp.4. Muntaola, M. 1999. Gua de los hongos microscpicos. 1. Edicin.

Omega editores. Barcelona, Espaa. 167 pp.

5. ____________. 1996. El Microscopio ptico. FES Zaragoza UNAM. Mxico,D. F. Mxico

6. *S elaboro esta practica en colaboracin Javier Hernndez y TaniaMuoz alumnos del curso de micologa


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PRACTICA 7

CUANTIFICACIN DE LA CONCENTRACIN DEINCULO

Introduccin

Cuando se trata inocular hospedadores para cumplir con los postuladosde Koch y as efectuar el diagnstico fitosanitario, evaluar la resistenciade las plantas a enfermedades, efectuar estudios especficos(epidemiolgicos) del patgeno, o para desarrollar un micoherbicida,es necesario recurrir a la inoculacin artificial, ya sea en invernadero o

en campo. Para esto se utiliza inculo a una concentracin especfica(es decir, un nmero determinado de esporas por mililitro), segn elpatgeno y hospedero en estudio, con la finalidad de obtener unabuena infeccin que permita observar las diferencias entre losmateriales evaluados. Conocer el nmero de esporas por mililitro, parael caso de micoherbicidas, adems de que se requiere en las pruebasde patogenecidad, en las pruebas seguridad y en estudiosepidemiolgicos; el conocimiento de la concentracin de esporas porml. es bsico para el manejo del producto comercial y la aplicacin delmicoherbicidas en campo.

Para determinar la concentracin se usa una cmara Neubauer ohemacitmetro, con el cual se hacen conteos de esporas en camposde dimensiones conocidas, que darn el nmero de esporas por ml dela suspensin inicial. De esta forma, por medio de diluciones se obtieneel inculo en la concentracin deseada.

Objetivo: Conocer y manejar la cmara Neubauer para realizar elcalculo de la concentracin de inculo, para entender lasconcentraciones comerciales y la aplicacin de micoherbicidas

Materiales y mtodos

Cultivos puros de hongos aislados de malezas enfermas, tubos falcnde 15 ml. 100 ml. de agua destilada estril, agitadores de vidrio estriles,Vortex, centrifuga, Tween 20,pipetas, colorantes, (solo en casonecesario), Cmara de Neubauer, microscopio compuesto, matrazerlenmeyer de 250ml.

1.-Prepare en agua destilada estril una suspensin de propgulos acontar de mayor concentracin que la deseada (solucin madre).

a)Colocar un volumen conocido de agua destilada estril o solucinfisiolgica en los cultivos de hongos en las cajas de Petri y rasparlos cultivos


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b)Decantar el raspado en tubos de centrifuga, someterlos 1 minutoen vortex y centrifugar de 3 a 5 minutos a una velocidad de 6000revoluciones, separar el sobrenadante del precipitado. Si lospropgulos tienden a permanecer unidos o aglomeradosagregue Tween 20a razn de 60 ppm mezclando sin agitar

2.- Si los propgulos son hialinos y pequeos, tome una alcuotapequea y agregue un tinte vital azul de algodn, fucsina acida queindique las clulas vivas, el tinte facilita la observacin de las clulaspoco refractivas. Use el tinte en forma concentrada, o si no tome encuenta el factor de dilucin que interviene.3.- Coloque el cubreobjetos especial sobre los rieles paralelos a amboslados de la cmara, frotando ligeramente para conseguir un buencontacto, con una pipeta delgada (que no gotee) tome una muestrade la suspensin y aplquela a la ranura al centro del margen de lacmara donde ser rpidamente absorbida por la fuerza capilar,

qutela a tiempo para que no entre un exceso que se rebose en losbordes, lo que introducira un factor de error.4.- Monte al microscopio y ubique el rallado de la cmara con elobjetivo de menor aumento, girando luego el revolver para mayoresaumentos (no se debe usar el de inmersin). Deje el tiempo necesariopara que los propgulos se asienten en el fondo de la cmara (dosminutos).

Fig. 1

5.- El fondo de la cmara tiene un rayado Nueubauer (Fig.I) de 9mm2

(3 mm por lado) dividido en 9 cuadrados principales (CP) de 1 mm porlado. El campo de conteo que se debe utilizar depende del tamao delos conidios del hongo con el que se est trabajando. Si stos son

grandes, lo ms conveniente es contar en los cuatro cuadros de lasesquinas (A, B, C, D) ms el cuadro del centro (E) (Fig.1). El conteo se


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repite por lo menos seis veces y se saca un promedio.(Tabla 1). ste semultiplica por una constante. De ese producto se obtendr laconcentracin en conidios/ml.

Tabla No. 1

Como el volumen sobre cada C.P. es 0.1mm3, para calcular laconcentracin por cc (10000 veces mayor), se procede en la formasiguiente:

SUMA de 5 C.P.x 2000= nmero/cc

Cuando los propagulos son pequeos se usa el C.P. central que estadividido en 25 cuadros secundarios (C.S.) de 0.2 mm por lado, cada unode los cuales est dividido en 16 cuadrados menores de 0.05mm porlado. Entonces la concentracin se calcula as:

NUMERO en el C.P. CENTRAL x 10000 = nmero/ cc.Esta concentracin corresponde a la de la suspensin inicial. Cuando sedesea calcular una dilucin determinada, se aplica la frmula siguiente:

C1 V1 = C2 V2

Donde:C1= Concentracin inicial (conocida en el conteo)V1= Volumen inicial (establecido arbitrariamente al preparar el inculo)

C2= Concentracin final deseada (segn el estudio a realizar)V2= Volumen final (desconocido)

3.- Limpie las superficies de la cmara entre cada observacinenjuague con agua destilada estril y seque por contacto con papelcon papel o tela absorbente y por ultimo con papel seda. Se puedeutilizar un jabn suave o alcohol

Bibliografa

1.-Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRCPress. 355 pp


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2.-French, E.R. y Her. 1980. Mtodos de Investigacin Fitopatolgica. IICA.Costa Rica.287pp3.-Douglas Bollete, C., Charles Quimby, P., Connick,Jr.,W., Daigle,D.,andFulgham,F.1991. Progress in the production, formulation, and application ofmycoherbicides.pp209-222. In TeBeest,D. Microbial control of weeds. Chapman

and Hall.4.- Gilchrist-Saavedra, L., G. Fuentes-Dvila, C. Martnez-Cano, R.M. Lpez-Atilano, E. Duveiller, R.P. Singh, M. Henry e I. Garca A. 2005. Gua prctica parala identificacin de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segundaedicin. Mxico, D.F.: CIMMYT 69pp5.-Narayanasamy, P., 2001, Plant pathogen detection and disease diagnosis.Marcel Dekker Inc., 518 pp.6.-Trigiano, R. N., Windham, M. T. and Windham, A. S., 2008, Plant pathology,Concepts and Laboratory. CRC Press, Boca Raton, London, New York,Washinton, D.C., 413 pp.

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