Manual Procedimientos de Bioseguridad en P3

Unidad de Investigación Médica

IMSS-Zacatecas

INDICE

JustificaciónMarco Legal Medidas de Bioseguridad en el Manejo de Muestras Mycobacterium tubercolosis

A. INTRODUCCIONB. PERSONALC. CONDICIONES GENERALES DEL LABORATORIO P3D. PROCEDIMIENTO PARA CONTENER UN DERRAME INFECTOCONTAGIOSOE. MEDIDAS DE CONTROL EN CASO DE ACCIDENTE

PROTOCOLOS DE LABORATORIO

A. ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE MTB.B. DESCONTAMINACIÓN DE MUESTRAS PARA CULTIVO DE Mycobacterium

tuberculosis.C. LAMINILLAS PARA BACILOSCOPIAD. INOCULACION DE MUESTRA DE SEDIMENTOE. TINCIÓN DE LAMINILLAS F. ALMACENAMIENTO DE SEDIMENTOS DE MX DE EXPECTORACIONG. IDENTIFICACIÓN DE Mycobacterium tuberculosis

I.CARACTERISTICAS TAXONOMICAS.

a. Morfología Colonial.

b. Morfología Celular.

II.- CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS.

a. Acumulación de niacina.

b. Reducción de nitratos a nitritos.

c. Actividad de Catalasa: Mtb presenta TERMOLABILIDAD POSITIVA.

H. ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE Mtb I. DESPARAFINIZACIÓN DE TEJIDOS INCLUIDOS J. EXTRACCIÓN DE DNA

a) Con Lisozima y CTAB.

b) Con perlas y fenol absoluto.

c) Con DNAzol.

K. INFECCIÓN DE LAS CÉLULAS A549.

L. DETERMINACIÓN DE CRECIMIENTO INTRACELULAR DE MTB EN CÉLULAS

EPITELIALES A549 (KILLING).

M. EXTRACCIÓN DE RNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, MEDIANTE TRIZOL.

N. OBTENCIÓN DE EXTRACTO PROTEÍCO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.a) Preparación del medio PBY. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.b) Obtención de Mtb stock de trabajo. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.

Obtención de Mtb stock de trabajo.c) Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.d) Diálisis de proteínas utilizando membranas de celulosa.e) Concentración de proteínas.f) Determinación de proteínas por el método de Lowry.

Justificación. En el trabajo de laboratorio dentro de nuestra institución se manejan diferentes tipos de agentes biológicos y materiales peligrosos, muchos de los cuales implican un riesgo para el personal, los estudiantes o el ambiente. Por esta razón el personal que hace trabajo en el Cuarto de Contención de la Unidad de Investigación Medica en Zacatecas del Instituto Mexicano del Seguro

Social debe conocer acerca de la peligrosidad y riesgo en esta área de trabajo, así como saber qué medidas de protección se deben emplear para prevenir y reducir dicho riesgo. Esta situación se encuentra regulada en las disposiciones sanitarias de nuestro país (leyes, reglamentos y normas), las cuales establecen evitar ciertas conductas y seguir otras para lograr un manejo seguro a fin de prevenir riesgos, lo cual permite a su vez fijar límites de exposición y brindar alternativas de tratamiento y disposición final para reducir su volumen y peligrosidad. Finalmente se complementan dichas disposiciones regulatorias, con los manuales, las guías, lineamientos, procedimientos y métodos de buenas prácticas de manejo de los residuos peligrosos, así como la divulgación de información, la educación y la capacitación de quienes los manejan.

Derivado de lo anterior y en apego a la normatividad sanitaria se implementa el presente MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD BIOLOGICA EN EL AREA DE P3 DE LAUNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA IMSS-ZACATECAS.

Marco Legal

El presente Manual se elabora de conformidad con el siguiente marco legal: 1. Ley General de Salud. 2. Ley General del Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente

3. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.

4. NORMA Oficial Mexicana NOM-197-SSA1-2000, Que establece los requisitos mínimos de infraestructura y equipamiento de hospitales y consultorios de atención médica especializada.

5. NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos. 6. NORMA Oficial Mexicana NOM-52-ECOL-1993, Que establece las características de los residuos peligrosos, el listado de los mismos y los límites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.7. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de investigación para la Salud.-Publicado en el Diario Oficial de la Federación de fecha 23 de diciembre de 1986.8. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en materia de Prestación de Servicios de Atención Médica. Publicado en el Diario Oficial de la Federación de fecha 29 de abril de 1986.9. REGLAMENTO de la Ley Federal de Seguridad, Higiene y Medio Ambiente de Trabajo.- Publicado en el Diario Oficial de la Federación de fecha 21 de enero de 1997.

Medidas de Bioseguridad en el Manejo de Muestras Mycobacterium tubercolosis.

INTRODUCCION:

Para realizar el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, el riesgo de infección para el personal de laboratorio es tres veces mayor que para aquellos que no trabajan con este agente infeccioso (Centres for Diseases Control and Prevenction and Nacional Institutes of Health U. S.A). La vía más importante para adquirir la infección es la respiratoria y se necesita una dosis muy baja de bacilos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) para infectar al humano (DL50%<10 bacilos). Además, los cuidados deben ser mayores considerando que los bacilos tuberculosos pueden sobrevivir en frotis fijados al calor y

pueden transportarse en los aerosoles producidos al preparar cortes congelados o durante la manipulación de los cultivos.

Las medidas de seguridad en el laboratorio son un conjunto de buenas prácticas que deben realizarse rutinariamente. Cada técnica debe ser realizada meticulosamente, usando apropiadamente cada área del laboratorio, eligiendo para ello los equipos específicos. Es muy importante que la respuesta del personal del laboratorio a situaciones accidentales, que ponen en riesgo la seguridad de todo el personal, inicie desde un uso apropiado de los materiales de protección como batas, mascarillas, guantes, etc. Así, es fundamental que al término de cualquier técnica o experimento, el personal involucrado realice todas las medidas de limpieza del área de trabajo en la que realizo dichas actividades, con el objeto de evitar la probable contaminación del ambiente de trabajo.

PERSONAL

a) Antes de incorporarse al laboratorio, todo el personal debe someterse a un examen medico así como a una prueba de la tuberculina con PPD. Para aquellas personas que han trabajado previamente con MTB, esta prueba normalmente es positiva. Si la reacción dérmica es negativa, estos individuos deben vacunarse con BCG, y comprobarse su reactividad antes de ser admitidos al laboratorio.

b) El personal debe recibir un adiestramiento técnico que incluya una meticulosa enseñanza sobre las medidas de seguridad personal, manejo de cultivos, técnicas rutinarias de laboratorio, desecho de material infectocontagioso, etc.

c) Una vez al año se realizará una radiografía de tórax conservando las placas en un archivo, para ir verificando la salud del personal.

d) Utilizar siempre overoles o bata larga, preferentemente que se cierre por la espalda. La bata debe ser esterilizada antes de lavarse y ser de uso exclusivo.

e) Utilizar cubre-bocas con filtros respiradores XN95

CONDICIONES GENERALES CON LAS QUE DEBE CONTAR EL LABORATORIO

1.- Área:

a) El laboratorio debe ser una área de circulación restringida y contar todos los avisos de advertencia y emergencia en las puertas de acceso.

b) El lugar de trabajo debe estar siempre limpio, con fácil acceso y contar con buena iluminación.

c) Las paredes y pisos deben ser lisos y de fácil lavado y deben limpiarse todos los días. Para evitar aerosoles y accidentes, no debe barrerse en seco ni encerarse.

d) Se recomienda la instalación de lámparas de luz ultravioleta en las áreas de cultivo de MTB, las cuales deben estar encendidas por un tiempo mínimo de 15 min al término del trabajo. Estas lámparas deben limpiarse semanalmente con alcohol al 70 %.

e) Las áreas de cultivo y manipulación de MTB deben contar con las siguientes condiciones:1.- Ubicarse en un sitio alejado de la puerta o en sitios donde no haya corrientes de aire.

2.- Contener solo los equipos y elementos necesarios. Antes de trasladar cualquier equipo a otra área o para su reparación deberá

descontaminarse adecuadamente, siguiendo las reglas descritas para un cuarto de bioseguridad biológica nivel 3 (BSL-3 anexo).

3.- Se debe descontaminar el gabinete de seguridad antes y después de cada sesión de trabajo con fenol al 5% o cresol al 3% y después con etanol al 70%. (Si hubo algún derrame durante el trabajo en el interior del gabinete de seguridad tapar con una gasa y verter fenol al 5% hasta empapar perfectamente, cerrar el gabinete, dejando actuar al desinfectante por lo menos 30 minutos).

a) Utilizar siempre trajes y/o bata larga, preferentemente que esta se cierre por la espalda. Si estos no son desechables deben ser esterilizados antes de lavarse y ser de uso exclusivo.

b) Utilizar cubre boca con filtros XN95.

PROCEDIMIENTO PARA CONTENER UN DERRAME INFECTOCONTAGIOSO

c) Elementos solidos d) Elementos punzocortantes e) Elementos líquidos. En caso de accidente por derrame vaciar en esta

zona en forma concéntrica fenol al 5%, cubrir con papel o paños absorbentes mojandolos perfectamente con la misma solución desinfectante y dejarlo actuar durante 30 minutos como mínimo antes de limpiar el área.

f) OPERACIONES DE MAYOR RIESGO:Siempre se realizan dentro del gabinete o cabina de bioseguridad.

1.- Destape de los envases que contienen la muestra.

2.- Transferencia de suspensiones de bacilos por medio de pipeta.

3.- Apertura de camisas de centrifugación

4.-Decantación de líquidos después de la centrifugación en contenedores

5.- Apertura de tubos después de centrifugación, agitación y/o bortexeo.

MEDIDAS DE CONTROL EN CASO DE ACCIDENTE

1.- En caso de accidente después de aplicar las medidas de contención indicadas avisar de inmediato al personal responsable del P3 (Biologa Leonor Enciso Moreno, Técnico Investigador A 80), registrar la fecha, e identificar al personal que participo y el material involucrado.

2.- Accidentes más comunes y que hacer cuando se presenten:

a) Rotura o volcadura de frascos con muestras de suspensiones bacilares o con cultivos inoculados.- Cubrir con fenol al 5% el material y el área contaminada, dejarlo actuar durante 30 minutos. Recoger los restos con pinzas, colocarlos en un recipiente adecuado, esterilizarlos en autoclave o incinerarlos.

b) Rotura o abertura accidental de tubos en la centrifuga, desconectar la centrifuga, mantenerla cerrada durante 10 minutos después de haber parado completamente, rociar la parte interior de la centrifuga con fenol al 5%, agregando mayor cantidad al tubo roto, tapar y dejar actuar la solución de fenol durante 30 minutos. Tomar con pinzas el tubo y las camisas y colocarlos en un recipiente, limpiar el interior de la centrifuga con gasas impregnadas con fenol al 5%, desechar los restos en el mismo recipiente y esterilizarlos en autoclave.

Proceder de la misma forma si el accidente ocurre durante la agitación mecánica, en el homogenizador de tejidos, agitador o vórtex.

c) Accidente por inoculación directa.- Lavar la zona inoculada con agua y jabón y enviar al accidentado al médico.

ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE MTB.

Tipos de muestras:

1) Muestras de esputo 2) Muestras de Esputo inducido.3) Aspiración gástrica (enfermos que no pueden expectorar).4) Lavado bronquial.5) Aspiración transtraqueal.6) Liquido cefalorraquídeo.7) Liquido peritoneal.Algunos tipos de muestras se obtienen de pacientes hospitalizados. Todos los tipos de materiales (expectoraciones y aspirados) se obtienen a primera hora de la mañana.

Se recomienda (OMS) báciloscopia en tres muestras de esputo para el diagnóstico de Tb pulmonar, la mejor muestra para el diagnóstico es el esputo y debe colectarse para facilitar su manejo bajo las siguientes condiciones:

Colectar en recipientes limpios y desechables de boca ancha y tapa de rosca, deben sellarse y empacarse para evitar derrames y roturas. De preferencia se deben obtener las tres muestras de días consecutivos, las muestras se deben de enviar cuanto antes al laboratorio o bien refrigerarse sin dejar pasar mucho tiempo.

El paciente se debe de enjuagar bien la boca antes de obtener el esputo, para que este libre de alimentos o drogas orales. Se debe recoger solo el material exudativo obtenido de los pulmones después de una tos profunda, no deberá dar descarga nasofaríngea ni saliva.

La posibilidad de aislar Mtb aumenta si la muestra se procesa el mismo día.

DESCONTAMINACIÓN DE MUESTRAS PARA CULTIVO DE Mycobacterium tuberculosis.

PROCESO DE DIGESTION, DESCONTAMINACION Y LAMINILLAS PARA BACILOSCOPIA DE LAS MUESTRAS DE EXPECTORACIÓN.

1.- Después de limpiar y desinfectar la campana de flujo laminar o gabinete de seguridad biológica introducir todo el material a utilizar limpiando con etanol al 70% y encender UV durante 5 minutos.

2.- Introducir las muestras, mezclar el contenido de cada una con un palillo y hacer un frotis o extendido delgado de 2 cm de largo X 1cm de ancho en el centro de un portaobjetos (previamente rotulado en la parte inferior con el numero de folio, numero de mx, fecha y persona que lo hace), pasar por la flama tres veces para secar y agregar unas gotas de metanol sobre la muestra para fijar y después teñir*.

3.- Trasvasar el resto de la mx a tubos Falcón de 50ml, previamente rotulados. Las muestras con volumen mayor a 5ml se centrifugan (3000 rpm/15min), y se decantan hasta un volumen aproximado de 5ml, si la consistencia de la mx no permite la decantación por el moco se separa en dos o mas tubos con 10ml máximo cada uno. (A partir de este momento el proceso debe de ser continuo, para no dañar las micobacterias).

4.- Para control de calidad de reactivos, dividir con un marcador en 8 espacios cajas petri con medio gelosa-sangre e identificar 2 espacios para cada reactivo uno de inicio y otro de final de uso. Al empezar a usar cada recipiente con reactivo tomar con ayuda de una pipeta de transferencia una gota y depositarla en el espacio correspondiente, cuando se termine de usar o bien antes de que se termine el contenido tomar otra gota y depositarla en el espacio correspondiente a final.

5.- Agregar con respecto a la cantidad de la muestra, un volumen igual de solución Citrato de Sodio-Hidróxido de sodio y N-cisteína (ver apéndice preparación de reactivos).

6.- Dentro de la campana y verificando que los tubos estén perfectamente cerrados agitar vigorosamente en vórtex durante 20 segundos, repetir agitación en forma similar después de 5 minutos y repetir cada 5 minutos dos veces más, todo a temperatura ambiente.

7.- Agregar Buffer de fosfatos hasta completar un volumen aproximado de 45 ml.

8.- Agitar hasta formar un remolino en toda la muestra.

9.- Centrifugar 3000 rpm/20minutos, (las camisas de la centrifuga solo se abren dentro de la campana de flujo).

10.- Decantar con cuidado hasta un volumen mínimo, evitando la perdida del botón de sedimento.

11.- Resuspender la pastilla bortexeando ligeramente, tomar una gota y depositarla en un portaobjetos (previamente identificado con los datos correspondientes) y dejar secar, una vez seco agregar 2 gotas de metanol para fijar dejar secar y después teñir*.

12.- Checar el pH de la muestra resuspendida con ayuda de papel tornasol.

13.- Ajustar pH a neutralidad, añadiendo Buffer Fosfatos hasta completar máximo 3 mL, si no se ajusta el pH con este volumen, realizar un lavado más, repetir el procedimiento hasta obtener pH neutro.

14.- Etiquetar (Folio, numero de muestra, fecha e iniciales de quien lo procesa) tubos con medio Löwestein Jensen (LJ) y/o 7H9.

15.- Añadir antibióticos (PANTA) 0.1 mL para LJ y 0.8 mL para medio liquido (MIGIT, 7H9, etc.)

16.- Inocular 0.5ml de muestra de sedimento a cada tubo LJ ó 7H9 y una gota en el espacio que corresponda a cada muestra en las cajas petri con gelosa sangre (GS).

18.- Las placas GS se incuban a 37° C/48hrs.

19.- Incubar LJ con la tapa semiabierta y 7H9 bien serrados en incubar a 37° C por ocho semanas, revisar cada semana para visualizar crecimiento y detectar positivos, de las muestras de expectoración cuyos cultivos presenten crecimiento antes de 7 días, se volverán a descontaminar y resembrar, de los sedimentos de cultivos de 10 días sin crecimiento, se harán alícuotas de 1.5 mL en criotubos que se pondrán a -20°C durante una noche y después se guardaran hasta su uso a -80°C.

*Preparar laminillas para Tinciones

Las laminillas secas previamente fijadas con metanol se colocan sobre una plancha a 80°C durante 1 min. Antes de teñir.

TINCIÓN DE LAMINILLAS

Auramina-Rodamina

a) Colocar las laminillas en un bastidor en la tarja y agregar colorante auramina-rodamina cubriendo la zona donde esta la muestra, dejar pasar 15 minutos.

b) Lavar con agua corriente y escurrir.c) Agregar alcohol ácido para rodaminas por 3 min. Lavar con agua

corriente y escurrir.d) Agregar Permanganato de Potasio durante 3 min. Lavar con agua

corriente.e) Observar al microscopio de fluorescencia.

Las laminillas pueden almacenarse por 30 días en oscuridad. Estas laminillas pueden teñirse también por Ziehl Neelsen (ZN) para confirmar.

Ziehl Neelsen (ZN).

a) Colocar las laminillas en un bastidor en la tarja y agregar colorante Fucsina cubriendo todo el portaobjetos

b) Calentar a emisión de vapores durante 5 minutos, lavar con agua corriente y escurrir

c) Decolorar con alcohol ácido durante 2 minutos, lavar y escurrird) Agregar azul de metileno cubriendo todo el portaobjetos por 1 minutos,

lavar y secar.

ALMACENAMIENTO DE SEDIMENTOS DE MX DE EXPECTORACION

A.- Se rotulan 2 tubos tapa de rosca 2 ml, para cada mx de sedimento (original y replica), los datos son: folio, fecha de proceso y nombre de quien realiza el procedimiento.

Nota: En la tapa para su almacenamiento se anotara el número consecutivo que corresponda, en el tubo replica se anotara una R antes de este número.

Se rotula un tubo falcón de 15 ml por cada mx en el cual se recupera el sobrenadante para su congelación.

B.- Procedimiento: Se realiza en P3 en campana de flujo laminar.

1.-Centrifugar los tubos falcón que contienen los sedimentos 3000 rpm durante 15 min.

2.- Se recuperan los sobrenadantes con pipeta de transferencia evitando formar aerosoles, en tubos falcón de 15 ml previamente rotulados, tomando cuidado de no perder la pastilla. Los tubos se guardan a -20°C durante 24 hrs, pasado este tiempo se guardan a -70 °C hasta su uso.

3.- Agregar 2 ml de TE 1X estéril, resuspender la pastilla hasta homogenizar.

4.- Tomar 1 ml de mx para cada tubo, original y replica previamente rotulado.

5.- Los tubos se guardan en la caja según corresponda (previamente rotulada como original y replica) a -20°C durante 24 hrs, pasado este tiempo se guardan a -70 °C hasta su uso.

IDENTIFICACIÓN DE Mycobacterium tuberculosis

I.- CARACTERISTICAS TAXONOMICAS.

1.- Morfología Colonial

Medio de Löwestein-Jensen: Colonias típicas blancas a color crema, de

aspecto rugoso a seco, con el tiempo toman forma de coliflor. Se desarrollan en

la superficie del medio y el sitio en que se implantan no cambia de color. El

crecimiento es eugénico.

2.- Morfología Celular

Bácilos de longitud mediana que miden 2 a 6 x 0.3 µm. Generalmente

sen de forma generalmente curva. En cultivo forman cordones serpentinos, que

tienden a ser extensos.

II.- CARACTERISTICAS FISIOLÓGICAS.

a.- Acumulación de niacina: Es POSITIVA para Mtb, pero también para M.

simiae y algunas cepas de M. marinum y M. chelonae, ya que todas comparten

la ausencia de la encima que convierte la niacina en niacinaribonucleótido.

Procedimiento:

1.- Se toma un tubo del problema con abundantes colonias de no menos

de cuatro semanas de desarrollo y se agrega 1mL de agua destilada estéril.

2.- Simultáneamente se disponen los testigos: Cultivo POSITIVO Mtb y

Tubo con medio solo.

3.- El medio se rompe con el asa a fin de facilitar la difusión de la niacina.

Se deja inclinado a temperatura ambiente durante 15 min.

4 .- El tubo se coloca en posición vertical y se extrae el líquido con una

pipeta de trasferencia se pasa a un tubo limpio y se agregan 0.5 mL de una

solución de bromuro de cianogeno y 0.5 mL de una solución de anilina.

5.- La presencia de una coloración amarilla significa presencia de niacina.

6.- Al final de la prueba debe agregarse a los tubos una solución de

hidróxido de sodio, ya que el bromuro de cianógeno en presencia de ácido, se

convierte en ácido cianhidrico que es muy tóxico.

b.- Reducción de nitratos a nitritos: Es POSITIVA para Mtb, pero también

para M. kansasii, M. zsulgai y M. fortuitum.

Prueba de Virtanen:

Algunas micobacterias utilizan nitratos como fuente de nitrógeno,

reemplazando a las sales de amonio.

Sustrato: Nitrato de sodio M/100 en amortiguador de fosfatos M/45, pH 7

NaNO3 0.085 g

KH2PO4 0.117 g

Na2HPO4 12 H2O 0.485 g

Água destilada 100 mL

Los reactivos deben estar recientemente preparados y conservados en

refrigeración en oscuridad.

Testigos:

POSITIVO: Mtb

NEGATIVO: Solo reactivos

1.- Colocar de 3 a 4 gotas de agua destilada en 3 tubos de 16 x 125 mm

con tapa de rosca.

2.- Introducir un asa bien cargada de bácilos en cada tubo y homogenizar

bien.

3.- Agregar dos mL del sustrato . Agitar e incubar a 37° C durante dos

horas.

4.- Agregar una gota de solución A (HCl 1:1 Agua destilada) y agitar con

la mano.

5.- Adicionar dos gotas de Sulfanilamida al 0.2 %.

6.- Añadir dos gotas de Clorhidrato de n-naftiletilendiamina al 0.1 %.

Si se desarrolla color rojo, la prueba es positiva. El color puede variar

desde rosa a rojo intenso (de 1+ a 5+). Se debe comparar el color

con el tubo testigo que es el negativo.

c.- Actividad de Catalasa: Mtb presenta TERMOLABILIDAD POSITIVA, pero

también ocurre en M. bovis y M. gastri.

Todas las micobacterias , excepto las mutantes isoniacida-resistentes de

Mtb M. gastri, sintetizan catalasa. En Mtb y M. bovis, la enzima es

termolabil.

Prueba de la actividad de la catalasa a temperatura ambiente y a 68 C

Reactivos:

i) Solución amortiguadora de fosfatos M/15 pH 7

solucion A: Fosfato disódico M/15. Disolver en un matraz volumétrico

9.47 g de Na2HPO4 12 H2O en agua destilada y aforar a 1000mL.

Solucion B: Fosfato monopotásico M/15. disolver en un matraz

volumétrico 9.07 g de KH2PO4 en agua destilada y aforar a 1000 mL.

Mezclar 61.1 mL de la solución A con 38.9 mL de B y ajustar el pH.

ii) Peróxido de hidrogeno al 30 %. Conservar en refrigeración en

oscuridad.

iii) Solución acuosa de Tween 80 al 10%. Calentar ligeramente el agua

para lograr mejor disolución. Conservar en refrigeración.

1.- En tubos de 12x100 mL, agregar 0.5 mL de la solución amortiguadora

(pH7). Emplear dos tubos por cada cepa.

2.- Agregar a cada uno una asada cargada de colonias. Dejar uno a

temperatura ambiente y el otro tubo en baño maría a 68° C por 20

minutos.

3.- Dejar enfriar a temperatura ambiente.

4.- Preparar (en el momento de ser usada) una mezcla 1:1 de la solución

acuosa de Tween y peróxido de hidrogeno, agregar 0.5 mL de esta

solución a cada tubo.

Testigos:

POSITIVO: Cultivo Mtb por duplicado uno a temperatura ambiente y el otro a

68° C.

Cultivo. M. fortuitum o M. phlei (son positivas a temperatura

ambiente y 68° C).

NEGATIVO: Solo reactivos.

La formación de burbujas en la superficie, se considera como resultado positivo.

Si no hay burbujas se deja en observación durante 20 min.

ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE Mtb

1.- Sembrar en medio 7H9 suplementado con OADC al 10% e incubar a 37 °C de 10 a 14 días.

2.- Tomar 1 ml y medir D.O. a 600 nm, tiene que ser de 0.14 a 0.2 (factor de conversión 1 D.O. = 1X10⁷ células), los cultivos que no alcancen este valor se regresan a incubar.

3.- Transferir a un tubo falcón 10 ml para centrifugar a 2700 rpm durante 15 min.

4.- Desechar sobrenadante, agregar 2 ml de medio, homogenizar y repartir el volumen en 2 tubos eppendorf de 2ml tapón de rosca que contengan 200 ul de glicerol estéril.

5.- Congelar a -20°C durante 24 hrs, pasado este tiempo se guardan a -70 °C hasta su uso.

DESPARAFINIZACIÓN DE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA

1.- Realizar un corte al bloque de parafina, para obtener solamente tejido, colocarlo en una caja de Petri e incubar en horno a 80°C durante 35 min.

2.-Separar el tejido de la base de parafina y colocarlo en un tubo eppendorf.

3.- Tomar 50 mg de tejido y colocarlo en un tubo limpio.

4.- Agregar 1 ml de Xileno, mezclar por inversión y vortexiar por 2 min.

5.- Centrifugar a 14000 rpm 5 min y repetir 2 veces más, removiendo el sobrenadante por pipeteo.

6.- Agregar 1 ml de etanol absoluto, agitar en Vortex durante 2 min.

7.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.

8.- Agregar 1 ml de etanol 96%, agitar en Vortex durante 2 min.

9.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.

10.- Agregar 1 ml de etanol 80%, agitar en Vortex durante 2 min.

11.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.

12.- Agregar 1 ml de etanol 70%, agitar en Vortex durante 2 min.

13.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.

14.- Pasar el tejido a un nuevo vial, secar en termomix por evaporación a 37°C durante 20 min.

Extracción de DNA

A partir de cultivos de Löwenstein-Jensen con Lisozima y CTAB .

1.- Tomar con la ayuda de un aplicador de madera de 1 a 2 colonias bien

crecidas de MTB.

2.- Depositarlas en un eppendorf de 2mL que contiene 500 uL de TE 1X (10 mM

Tris - 1mM EDTA, pH= 8.0).

3.- Resuspender e inactivar en baño María a 80º por 30 minutos.

4.- Adicionar 50 uL de Lisozima (10 mg/mL).

5.- Incubar a 37º C por 18-24 horas para lisar la pared celular.

6.- Agregar una mezcla de 70 µL de SDS (10%) y 5 µL de Proteinasa K (10

mg/mL).

7.- Dejar a 65º C por 15 minutos.

8.- Adicionar 100 µL de NaCl 5M y 100 µL de CTAB-NaCl (4.1% NaCl/ 10%

CTAB) para deshacer los complejos de lípidos y proteínas.

9.- Agregar 750 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1).

10.- Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos (para la separación de fases).

11.- Transferir la fase acuosa a un tubo limpio y estéril.

12.- Adicionar 10 µL de RNAsa e incubar por una hora a 37º C.

13.- Precipitar el DNA agregando 450 µL de isopropanol.

14.- Mezclar bien e incubar por un mínimo de 2 horas a -20º C.

15.- Centrifugar a 12 000 rpm por 30 minutos.

16.- Descartar el sobrenadante.

17.- Lavar el sedimento agregando 500 µL de etanol al 70 % frío.

18.- Dejar secar la pastilla a temperatura ambiente.

19.- Finalmente el DNA se resuspende en agua desionizada estéril (el volumen

corresponderá al tamaño de la pastilla de 30 a 50 µL), se deja solubilizar a 4°C

toda la noche.

20.-Para confirmar la integridad del DNA correr una alícuota en un gel de

agarosa al 0.8%, el resto se guarda a -20º C hasta su uso.

Extracción con perlas

I.-A partir de cultivos Löwenstein-Jensen con fenol absoluto.

1.- Tomar con la ayuda de un aplicador de madera algunas colonias de MTB.

2.- Depositarlas en un eppendorf de 2mL que contiene 500 µL de perlas de

vidrio siliconizadas y 600 µL de TE 1X (10 mM Tris - 1mM EDTA, pH= 8.0).

3.- Resuspender e inactivar en baño María a 80º por 30 minutos.

4.- Agregar 300 µL de Fenol absoluto

5.- Agitar vigorosamente en vortex durante 1 minuto

6.- Transferir la mezcla, sin perlas, a un tubo eppendorf de 1.5 mL

7.- Centrifugar a 13,000 rpm por 5 min.

8.- Recuperar la fase acuosa en otro tubo.

9.- Adicionar un volumen de fenol: cloroformo y mezclar vigorosamente, aproximadamente15 seg.

10.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.

11.- Recuperar el sobrenadante y adicionar un volumen de cloroformo.

12.- Mezclar vigorosamente, aproximadamente 15 seg.

13.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.

14.- Recuperar la fase acuosa.

15.- Adicionar 220µL de etanol 95 % mas 30uL acetato de sodio 3M.

16.- Mezclarlo muy bien manualmente.

17.- Precipitar a -40ºC durante 15 min.

18.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.

17.- Retirar el sobrenadante con pipeta y lavar con 100 µL de etanol al 70%.

18.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.

19.- Retirar el etanol con pipeta y dejar secar.

20.- Resuspender la pastilla en 50 µL de agua desionizada estéril.

II.-A partir de muestras sin digestión, cultivos y tejidos con DNAzol

para diagnostico presuntivo de Tuberculosis.

Tipo de muestra:Expectoración directa, sedimentos, LCR (Liquido cefaloraquideo), LP (Liquido Peritoneal), etc.

1. Preparar tubos tapón de rosca de 2mL con 300 uL de Perlas siliconizadas de 0.1mm (BSP Cat. 11079101), esterilizar y secar perfectamente.

2. Rotular 4 tubos tapón de rosca 2 mL para cada muestra, agregar 500uL de DNAzol a c/u.

a) Tubo 1 agregar 500uL de mx. b) Tubo2 agregar 500uL de mx y se agrega una concentración conocida de mycobacterias (H37Rv) previamente inactivadas a -80°C, para verificar que no hay factores de inhibición de reacción de PCR. * c) Tubo 3 agrear 500uL de TE (Control negativo). * d) Tubo 4 agrear 500uL de suspensión bacteriana de H37Rv previamente inactivada (Control positivo). Nota: El control positivo se procesa después de hacer la extracción de las muestras para evitar contaminación.

3. Rompimiento mecánico con vortex (velocidad máxima del vortex), 5 ciclos de 30 seg c/u con intervalos de enfriamiento de 1 min.

4. Dar un Spin con la Centrifuga a 14 000 rpm para recolectar todo el material.

5. Recuperar el sobrenadante y colocarlo en un microtubo previamente marcado. Realizarlo con puntas de 200 evitando acarrear perlas.

6. Agregar 500 µl de cloroformo-alcohol isoamílico (24-1) para generar fases.

7. Vortexiar 30 seg. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 min.8. Retirar fase acuosa y colocarla en un microtubo previamente marcado.9. Luego para precipitar el DNA agregar 1 vol. de Isopropanol a cada uno

de los microtubos con los sobrenadantes recuperados (mantener en hielo seco).

10.Dejar precipitando por 1 hr a -80°C.11.Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min a 4°C (si se realiza a 13 000 rpm

dejar 20 min).12.Descartar el sobrenadante sin tocar la pastilla de DNA (Con puntas de

200).13.Lavar la pastilla con 100μl de etanol al 70% frio. Dejando caer el etanol

alrededor del microtubo.14.Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min (si se realiza a 13 000 rpm dejar 15

min)15. Descartar sobrenadante con una micropipeta de 200μl.16.Dejar secar perfectamente.17.Resuspender en 35μl de agua estéril, mezclar suavemente y dejar en

hielo o a 4°C mínimo 1 hora.

* Por cada ciclo de extracción se llevara un control negativo y otro positivo en el que se colocara 500 μl de TE en lugar de muestra y 500 uL de suspensión bacteriana de 37Rv respectivamente.

MX DE TEJIDO:

1.- En un tubo de 2 ml con tapón de rosca colocar 300 ul de perlas de vidrio siliconizadas.

2.- Agregar 25 mg de tejido en pequeños cortes.

3.- Agregar 500 µl de DNAzol.

4.-Agitar con Mini Beed-beater durante 4 ciclos de 20 seg. Alternando cada ciclo con enfriamiento en hielo durante 1 min.

5.- Centrifugar por un min a 14000 rpm.

6.- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y estéril.

7.- Agregar 500µl de etanol absoluto y dejar precipitando durante 20 min en hielo.

8.- Centrifugar 15 min a 14000 rpm a 4°C y decantar el sobrenadante.

9.-Agregar 500 µl de etanol al 75%, centrifugar 10 min a 13000 rpm.

10.- Decantar y dejar secar durante 20 min a temperatura ambiente.

11.- Agregar 30 µl de TE 1X a cada mx, homogenizar suavemente y dar un spin.

12.- Cuantificar en nanodrop.

Infección de las células A549.

Material

Cajas de cultivo de 25 cm2.

Placas de 24 pozos.

Cámara de Neubauer.

Tubo eppendorf de 1.6 ml.

Pipeta de 1000 µl, 200 µl y 20 µl.

Perlas de cristal de 5 mm.

Medio DMEM al 5% SFB.

Medio DMEM al 1% SFB.

Medio DMEM.

Tripsina.

Azul de tripán.

Procedimiento

Crecimiento de líneas celulares.

Células epiteliales pertenecientes a la línea celular A549, se cultivaran en cajas

de 25 cm2 con medio DMEM 10% de SFB. Se incubarán a 37°C con 5% de CO2

hasta alcanzar 95% de confluencia, se tripsinizaran y se contara viabilidad.

Posteriormente se colocaran 500000 células en cada pozo en placas de 24

pozos para su posterior adhesión con medio DMEM al 5% SFB, se incubarán a

37ºC con 5% de CO2 durante 18 horas.

Infección de líneas celulares A549 con las diversas cepas Mycobacterium

tuberculosis.

Los viales con la concentración final de las diferentes cepas de Mtb (H37Rv,

H37Ra, Beijing, Beijing 4P, MDR y 5186) y la cepa de S. aureus; se

centrifugaran durante 5 minutos a 5000 rpm, se les eliminara el sobrenadante

y se les agregara 1mL DMEM al 1% de SFB. Se agregaran 3 perlas de cristal de

5mm, se mezclaran con vortex durante 5 min, se centrifugaran 2 min a 800

rpm. Se recolectara el sobrenadante y se pasara a otro vial (medio infectante).

Después, se procederá a realizar la infección en la línea celular A549 como se

indica en el cuadro:

MOI Cantidad RPMI 1%SFB

(*)

Cantidad Medio

infectante (*)

Total

S. aureus 150:1 1000 µl

H37Rv 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

H37Ra 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

Beijing 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

Beijing 4P 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

MDR 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

5186 5:1 1000 µl

10:1 1000 µl

(*) Estas columnas se completan al realizar los cálculos de MOI según la concentración

de S. aureus o de las cepas de MB, respectivamente.

Después de realizada la infección se incubaran a 37ºC con 5% de CO2 durante

2 horas, una vez transcurrido el tiempo se lava tres veces la placa con pipeta

agregando 500 µl de DMEM, sin tocar el fondo del pozo; esto se realizara para

remover las bacterias no fagocitadas.

Una vez realizados los lavados se incubaran nuevamente a 37ºC con 5% de

CO2 hasta dejar transcurrir los tiempos de infección; es decir se completen las

18 horas. Para cada condición se realizará lo siguientes:

Al pozo 1 y 2 se les agregara 1mL de trizol, se pasaran a tubos

eppendor y se guardaran a -20°C para su posterior extracción (continuar

con protocolo de extracción de RNA, mediante Trizol).

Mientras que al pozo 3 y 4 de la misma condición se procederá con la

determinación de crecimiento intracelular “KILLING”.

Determinación de crecimiento intracelular de

Mtb en células epiteliales A549 (Killing).

Material

Tubos de polipropileno de 14mL fondo U

Tubos de polipropileno de 50mL

Tubos de polipropileno de 5mL

Placas para cultivo de 96 pozos, fondo U.

Tubos eppendorf de 1600L

Pipetas serológicas de 5 y10mL

Puntas para micropipeta 200 L

Puntas para micropipeta 1000 L

Micropipetas de volumen variable

Pipeta multicanal 1000L

Reactivos

Suero humano descomplementado y filtrado.

RPMI 1640

7H9 (medio liquido)

7H10 agar

Mycobacterium tuberculosis

Mtb H37Ra

Mycobacterium tuberculosis

Mtb H37Rv

Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS)

Albúmina Sérica Bovina (BSA)

ADC

OADC

Glicerol

Asparagina

Agua desionizada

Gentamicina

Glutamina

Preparación de soluciones y reactivos.

1. RPMI 10% PHS.

Agregar 5mL de suero humano descomplementado a 45mL de medio RPMI-

1640 suplementado con 50 g/mL de sulfato de gentamicina y 200 mM L-

glutamina.

2. RPMI 30% PHS (Mezcla para infectar).

Agregar 15mL de suero humano descomplementado a 35mL de medio RPMI-

1640 suplementado con 50 g/mL de sulfato de gentamicina, 200 mM L-

glutamina.

3. 7H9 medio líquido.

Mezclar en una botella de 500 mL 1.88 g de agar 7H9 en polvo, 1.6 mL de

glicerol, y 400 mL de agua desionizada. Agitar.

Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C. Enfriar a 50°C aproximadamente.

Agregar 40 ml de ADC. Filtrar con membrana de 0.22 m, guardar a 4°C.

4. 7H10 agar (placas para cultivo de Mtb).

497 mL de agua desionizada

11.4 g de 7H10 agar

6 mL de glicerol

2.5g de asparagina

60 mL de OADC

1. Colocar un matraz de 1000 mL que contiene 497 mL de agua

desionizada en agitación con calor.

2. Agregar poco a poco el agar, glicerol y asparagina, disolver los reactivos

hasta que el agar tome un color verde claro opaco.

3. Poner el agar en el horno de microondas y calentar poco a poco, sin

dejar que hierva, se saca y se agita con la mano muy suavemente, este

procedimiento se repite hasta que cambie de color verde claro opaco a

verde botella translúcido. Tener cuidado al sacar, el agar puede estar

muy caliente y desbordarse de la botella.

4. Hacer tapones con algodón y gasa para tapar los matraces y poner una

bolsa para esterilizar sobre la boca de los matraces. Sellar la bolsa con

cinta testigo.

5. Llevar el agar al Laboratorio de Microbiología para esterilizar, en

autoclave durante 15 min a 121 °C.

6. Enfriar un poco a temperatura ambiente o con agua, aproximadamente

a 40 o 50 °C (no mucho porque puede empezar a gelificar).

7. Meter el matraz a la campana y destapar, agregar 60 mL de OADC

filtrándolo con jeringa y filtro de pirinola de 0.22 m. Agitar suavemente.

8. Colocar en la campana las placas petri abiertas con cuidado de

mantener la esterilidad de ellas (Guardar las bolsitas de las placas

dentro de la campana para su uso posterior).

9. Tomar el agar con pipeta de 50 mL y llenar las placas con 8 o 10 mL

cada una, dejar gelificar y enfriar en la campana aproximadamente 30

min. Tapar las placas y apilar de 8 en 8, sellar con cinta testigo.

10.Guardar de nuevo en sus bolsitas, poner la fecha en que se hicieron.

Colocar las placas en un contenedor.

11.Para el control de contaminación colocar todas las placas en la

incubadora (del pasillo) a 37°C durante 24 horas.

12.Al día siguiente sacar, dejar enfriar a temperatura ambiente y guardar

en refrigeración 37°C.

5. Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS) al 0.1%

Pesar 10 mg de SDS y disolver en 10 ml de agua desionizada. Hacer

alícuotas de 1ml y guardar en congelación.

6. 7H9 con Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 20%

Pesar 2g de BSA y disolver en 8 ml de medio líquido 7H9. Hacer alícuotas de

1ml y guardar en congelación.

Procedimiento

A) Infección y crecimiento intracelular de Mtb EpCs in vitro.

1. Después de lavar tres veces la placa después de dos horas de infección para remover las bacterias no internalizadas, dejar transcurrir los tiempos requeridos para cada experimento de acuerdo al diseño y objetivos planteados (como lo indica el protocolo de infección).

Nota: En los mismos tiempos se pueden recolectar los sobrenadantes de los cultivos para la determinación de citocinas u otras proteínas de interés.

B) Obtención de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

(Killing)

1. Cumplido el tiempo de incubación de acuerdo al diseño experimental, lisar las células adicionando 50 l de Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS) al 0.1% durante 10 min a temperatura ambiente.

2. Neutralizar la acción del SDS adicionando 50 l medio 7H9 con Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 20%.

3. De las bacterias obtenidas en la lisis celular, hacer 4 diluciones seriales (1:10) para cada condición de la siguiente manera:

a) Preparar 4 tubos de polipropileno o eppendorf de 1.5 mL con 900 l de medio 7H9 por cada pozo de la placa de cultivo. Marcar como tubo 1, 2, 3 y 4.

b) Tomar los 100 l de cada pozo y añadirlos al tubo 1.

c) Mezclar bien en vórtex, tomar 100 l y transferirlos al tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo 4.

4. Tomar 10 l de cada dilución y sembrar por triplicado en cajas Petri con agar 7H10 Middlebrook.

5. Incubar 21 días a 37°C en 5% CO2.

6. Sacar las placas de la incubadora y contar las colonias con lupa. Promediar el número de colonias contadas en los triplicados de la dilución que lo permita.

7. Multiplicar el promedio de colonias X la dilución X 100 (microlitros ajustados a ml). Los resultados se reportan en Unidades Formadoras de Colonias/ml.

Extracción de RNA de Mycobacterium tuberculosis, mediante Trizol.

Material:

Viales de Mtb. Tubo eppendorf de 1.6 ml y 0.6 ml. Pipeta 1000 µl, 200 µl. Puntas estériles. Gasas. Guantes. Vortex. Hielo seco.

Procedimiento.

1. Encender la campana de flujo laminar 15 min antes de comenzar a trabajar.

2. Colocar un campo en el área donde se trabajará.3. Colocar dentro de la campana el material apropiadamente limpio.4. A partir del vial de Mtb se colocaron 200 µl del cultivo en un tubo

eppendorf de 1.6 ml, 5. Posteriormente se centrifuga durante 5 min a 14000 rpm.6. Se pipetea el sobrenadante y se procesa inmediatamente para

RNA.7. Agregar 400 µl de Trizol por cada 200 µl de Mtb.

(Los pasos siguientes se pueden realizar fuera del cuarto de contención).

8. Homogenizar en vortex y mantener durante 5 min a temperatura ambiente.

9. Agregar 40 µl de mezclar cloroformo-alcohol isoamílico (49:1) y homogenizar en vortex.

10. Centrifugar 15 min a 14000rpm a 4ºC.11. Transferir la fase acuosa a otro tubo eppendorf de 0.6 ml, se

recupera aproximadamente 400ul.12. Agregar 100 µl de isopropanol frío, mezclar y dejar 30 min a

-70ºC (30 min en hielo seco).13. Centrifugar 10min a 14000 rpm a 4ºC.14. Eliminar el sobrenadante y lavar el RNA precipitado con 150

µl de etanol frío al 75%. Mezclar por inmersión.15. Centrifugar 10min a 14000 rpm a 4ºC.16. Dejar secar el RNA a -65ºC.

17. Resuspenderlo en agua de DEPC.

Obtención de extracto proteíco de Mycobacterium tuberculosis

1. Preparación del medio PBY.

Material

-Mycobacterium tuberculosis H37 Ra ATCC #25177 y/o Mycobacterium tuberculosis

H37 Rv ATCC # 25618

-Médio de Voges-Proskawer-Beck modificado por Youmans (PBY)

MEDIO PBY

Composición:

Asparagina 37.8 mM, (Difco cat.No 0144-17-8)............................... ................................. 5 g

Fosfato monobásico de potasio KH2PO4 22.04mM (Baker Mexico Cat. 3246).............. 5 g

Sulfato de potasio K3SO4 2.8mM (Baker Mex Cat. 3278) ........................................... 0.5 g

Citrato de sódio.2H2O 2.3mM (Baker Mex. Cat 3646-01) .......................................0.68 g

Cloruro de Magnésio 6H2O 1.5 mM (Baker Mex. Cat 5833)......................................... 0.302 g

Glycerol 684mM (Baker Mex. Cat. 2136-02) ...............................................................50 ml

Pesar las cantidades indicadas. Disolver en 750 ml de agua desionizada,

Ajustar el pH a 6.8. Aforar a 1 litro.

Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 10 Lb.

Poner en estufa a 37°C por 24 hr. Para control de esterilidad

Guardar en refrigerador a 4°C si no se utiliza inmediatamente.

*De 100 ml de PBY se obtienen aproximadamente 0.4 g de bacterias.

2. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.

Material:

-Viales de MTB H37 Ra Stock 1 se encuentra el ultracongelador # 2

-Matraces Erlenmeyer de 2 L Estériles y con tapón de gasa, cubiertas con papel aluminio.

Nota: Los matraces y frascos no se deben lavar con detergente, uso exclusivo para cultivo de MTB.

-Medio PBY Estéril

-Pipetas estriles, guantes, campo de trabajo

-Estufa a 37°C

-Campana de Flujo Laminar.

Nota: Se debe trabajar bajo condiciones de seguridad nivel 3.

Procedimiento

1.- Encender la campana de flujo laminar (motor y UV) 15 minutos antes de comenzar a trabajar

2.- Colocar un campo (azul, por el lado del material absorberte) en el área donde se trabajará

3.- Colocar el material, frascos, pipetas, y rotular apropiadamente.

4.- Vestir, bata azul, careta, (cepa H37RV), doble par de guantes, tener listo alcohol, cloro y gasas.

5.- En cada matraz se pondrán 700 ml de medio PBY

6.- Se utilizara un vial de MTB de aproximadamente 1x10 8/ml por frasco de medio.

7.- El vial de MTB se agita con vortex para disgregar las bacterias.

8.- Con una pipeta se toman las bacterias y se depositan “lentamente” en las paredes del matraz con PBY, de tal manera que queden la mayoría pegadas al vidrio. Se tapa el matraz y se lleva con mucho cuidado a la estufa de 37°C.

NOTA: Evitar que las bacterias se vayan al fondo del matraz.

9.- Al colocar el matraz en la estufa se inclina para permitir que las bacterias se incorporen a la superficie del medio.

10.- Incubar: 21 días. Checar cada tercer día el crecimiento micobacteriano, en caso de sospecha de contaminación realizar un frotis.

3. Obtención de Mtb stock de trabajo.

Material

- Equipo de filtración estéril (matraz para vacío y filtro de vidrio)

Guardadas en cajones laboratorio 2

- Filtros estériles de papel: pre-filtros y filtros de .45m y .22m

(Esterilizarlos individualmente previo a la cosecha, envueltos en papel aluminio)

Crecimiento de MTB sobre la superficie del medio

Masa bacteriana MTB

Extracto soluble de MTB

- PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) 20 mg/ml de etanol* (inhibidor enzimático)

Sigma Cat.P-7626, se localiza en cuarto de balanza

*preparar cuanto se requiera (5l/ml de filtrado)

- Sulfato de amonio (NH4)2SO4 JT Baker Cat. 0793 en cuarto de balanzas

- Medio PBY

- PBS Cambrex, Cat. 17-516Q

- Tubos de 50 ml Falcon 2070

*Llevar con mucho cuidado los matraces a la campana para no romper el crecimiento de la Mycobacteria de la superficie y se vaya al fondo.

Procedimiento

“Condiciones de Seguridad nivel 2 ó 3 para H37RV”

1.- Poner un campo azul sobre el área de trabajo.

2.- Meter el equipo de filtración y montarlo adecuadamente al vacío. (Colocar como primer filtro el “pre-filtro” al equipo.)

3.- Colocar los matraces de los cultivos con cuidado dentro de la campana de flujo laminar.

4.- Proceder a verter con mucho cuidado el contenido líquido del cultivo de MTB, haciendo a un lado la masa bacteriana formada en la superficie.

5.- Recuperar la masa bacteriana (MTb), agregando un poco de medio PBY y guardar en tubos de 50 ml. Rotularlos y sellar con papel parafilm. Guardar a -20°C

6.- El liquido filtrado (Extracto soluble de MTB) se pasa a través de una membrana de 0.22µm (equipo de filtración).

7.- Agregar PMSF [20 mg/ml], 5µl por de ml filtrado. (Para inhibición enzimática)

8.- Para precipitar las proteínas del extracto soluble de MTB se agrega sulfato de amonio 40 g/100 ml de extracto (Esto se puede hacer en un vaso de precipitado de 2 L y se coloca un agitador magnético (mosca). Colocar sobre una plancha de agitación y llevarlo al cuarto frío (4°C). Dejar hasta precipitación completa de proteínas**. (Overnight).

4. Diálisis de proteínas utilizando membranas de celulosa.

Material:

- Spectra/Por 2 Membrane, MWCO 12-14000 cat.132676 en cajón del cuarto de balanzas

*utilizar el tamaño que convenga

- Cordel o hilo

- PBS 10X y realizar dilución 1X

- Agua caliente

- Pipetas 10 y 50ml

- Vaso de precipitado de 2L

Procedimiento:

Preparación de las membranas de diálisis (TUBOS)

Nota: Usar guantes para manipular las membranas de celulosa.

1.- Cortar membranas de 30 cm de largo aproximadamente.

2.- Remojar las membranas en agua caliente por 5 min. Para que se suavicen y poder manipular.

3.- Sellar un extremo de la membrana con cordel o hilo.

4.- Verificar con agua estéril, que no haya fuga. Desechar el agua.

5.- Introducir con la ayuda de una pipeta el extracto soluble precipitado

6.- Sellar fuertemente el otro extremo de la membrana con cordel.

7.- Introducir las membranas (tubos) en una solución de PBS a 4oC y con agitación (realizar en el cuarto frio).

8.- Cambiar el PBS 1X por lo menos 3 veces durante el periodo de Dializado (24 h aproxr)

en este procedimiento las membranas “tubos” aumentaran su tamaño.

5. Concentración de proteínas.

1.- Detener la diálisis y concentrar por deshidratación en el cuarto frio.

2.- La concentración de proteínas en los tubos se vigilará las siguientes 72 hrs.

3.- Su volumen irá disminuyendo aproximadamente a la mitad de su tamaño inicial.

4.- Una vez terminada la concentración, se desmontan los tubos y se procede a realizar alícuotas del concentrado (500µl c/u) y se guardar en una caja debidamente rotulada, para almacenarse a -20°C.

Posteriormente se determinara la concentración de proteínas por el método de Lowry y se realizaran Electroforesis y transferencia en caso de así requerirse.

6. Determinación de proteínas por el método de Lowry.

Reactivos:

-Carbonato de sódio Na2CO3 ( JT Baker Cat. 3602 em cuarto de balanzas)

-Hidróxido de sodio NaOH ( Merck Cat. 50257 r en cuarto de balanzas )

-Tartrato de sódio Na2C4H4O6.2H2O ( JT Baker Cat. 3930 en cuarto de balanzas )

-Sulfato cúprico CuSO4 (JT Baker Cat. 1841 en cuarto de balanzas )

-Reactivo de Fenol Folin Ciocalteu (Sigma, en gaveta amarilla )

-BSA (Albúmina Sérica Bovina) ( Calbiochem, Cat.126593 en Refri 2)

-Solución de carbonato de sodio Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1N

-Solución A: 50 ml de la solución de Na 2CO3 al 2% en NaOH 0.1N ….……5ml

0.5ml de tartrato de sodio al 2%(solución acuosa)…………… 50 ul

0.5ml de sulfato cuprico CuSO4 al 1% (solución acuosa)…… 50 ul

-Solución B: Reactivo de Fenol Folin-Ciacolteu diluido 1:2 en agua destilada.

Nota: Solución A y Solución B se preparan en el momento,

-Solución estándar de proteínas 0.1 mg/ml (BSA)

Pesar 1 mg de BSA y disolver en 10 ml de agua destilada (dejar reposar hasta que se

disuelva sola para que no haga espuma ¡)

NaOH 0.1 N

PM de NaOH = 40 gr/mol

0.1N= 4 gr de NaOH en 1 L de agua desionizada

Na2CO3 al 2% en NaOH

Preparar 100 ml

Pesar 2 gr de Na2CO3 y disolver en 100 ml de NaOH 0.1N

*guardar en refrigerador 4°C

Tartrato de Sodio al 2%

Pesar 0.2 gr de tartrato de sodio y disolver en 10 ml de agua destilada.

*guardar en refrigerador 4°C cubiertos con papel aluminio y rotulados

Sulfato cúprico CuSO4 al 1%

Pesar 0.1 gr de sulfato cúprico y disolver en 10 ml de agua destilada

*guardar en refrigerador 4°C cubiertos con papel aluminio y rotulados

CURVA

Columna 1 y 2 ocuparan la curva (duplicado)

Conc. µg/ml

BSA 0.1mg/ml

µl

H2O

(µl)

Sol.A

(µl)

mezclar

y

reposar

10 min

Sol.B

(µl)

mezclar

y

reposar

30 min a 2 hr

0 0 25 75 7.5

20 5 20 75 7.5

40 10 15 75 7.5

60 15 10 75 7.5

80 20 5 75 7.5

100 25 0 75 7.5

muestra 25 0 75 75

Leer a 500nm (492 en el lector de ELISA)

Blanco A1

CURVA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 0 0

B 20 20

C 40 40

D 60 60 M U E S T R A S

E 80 80

F 100 100

G

H

TRATAMIENTO Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

1.-Obtener la curva de calibrado representando en ordenadas las absorbancias de los tubos frente a la concentración (o cantidad) de proteína en cada tubo, que previamente se calcula a partir de los datos de la tabla.

2.- Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema, expresando el resultado en mg/ml (tener en cuenta las dilucio

nes realizadas).