Manual micro avanzada 2012

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS Y ARTES DE CHIAPAS

ESCUELA DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA AVANZADA

NOVENO SEMESTRE

(BIOTECNOLOGÍA)

ii

INDICE DE PRÁCTICAS

NÚMERO TÍTULO PÁGINA

1 Comunidades microbianas 1

2 Caracterización bioquímica de microorganismos 3

3 Manejo y conservación de microorganismos 7

4 Adhesión bacteriana 9

5 Sinergismo bacteriano 12

6 Plásmidos 14

7 Detección de genes de virulencia bacteriana

mediante PCR

18

8 Células microbianas competentes 22

9 Transformación bacteriana 24

10 Cuantificación de proteínas 26

11 Análisis de proteínas bacterianas mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida

28

12 Bacterias lácticas 40

iii

INDICACIONES PARA EL REPORTE ESCRITO

GENERALES. Usar hojas blancas, tamaño carta. Escribir con letra arial número doce y margen izquierdo

de 3 cm, los otros de 2.5 cm, espacio entre líneas de 1.5 cm. Entregar en carpeta con broche baco. El

docente podrá señalar otra(s) forma(s) de elaborar el reporte. La entrega se realizará ocho días después de

haberla concluido.

PORTADA. Deberá anotar el nombre de la asignatura, el número de la práctica y nombre de la misma,

número de equipo e integrantes, lugar y fecha.

INTRODUCCIÓN. Deberá ser breve, no mayor de dos cuartillas y deberá anotar las citas bibliográficas

respectivas.

PROPÓSITO(S) [OBJETIVO(S)]

MÉTODO. Describa de forma detallada la forma en que se realizó la práctica.

RESULTADOS. Es la parte medular del reporte. Describa y analice sus resultados, aquí anote los cuadros

comparativos que realizó junto con su(s) compañero(s). Es conveniente anexar tablas, gráficas, dibujos,

fotografías o esquemas de lo que observó durante la práctica. Si existen dibujos, éstos deberán estar

entintados y coloreados cuando corresponda.

DISCUSIÓN. Esta es la parte más difícil de escribir, pero la más importante. Aquí se deben señalar las

diferencias y similitudes que se reportan en la literatura y comparar con los resultados de trabajos

similares o referencias documentales. Puedes utilizar cuadros comparativos u otra herramienta que te sea

útil para presentar la información.

CONCLUSIONES. Redactar con relación al o los propósito(s) [objetivo(s)] y a los resultados obtenidos.

CUESTIONARIO. Deberá contestar las preguntas que se encuentren al final de cada práctica, citará la

bibliografía empleada.

REFERENCIAS DOCUMENTALES. Debe citar SIEMPRE la fuente de donde obtuvo la información, ya

sea escrita o visual. Utilice revistas especializadas, libros y páginas de Internet especializadas.

1

PRACTICA No 1 “COMUNIDADES MICROBIANAS”

INTRODUCCION

Las comunidades microbianas se conforman por la asociación de microorganismos, por lo general mixtas y

que comprenden a las bacterias, hongos, algas y protozoos. Las comunidades pueden establecerse en una

amplia gama de hábitats naturales tales como el agua, el suelo, la superficie de plantas, el hombre y otros

animales. Las relaciones que establecen los miembros de una comunidad microbiana pueden ir desde

aquellas en las que los microorganismos se benefician, o bien, tener que rivalizar entre ellos.

OBJETIVO

Establecer una sucesión de comunidades microbianas mediante un sistema construido en el laboratorio,

denominado columna de Winogradsky.

MÉTODO

1. Construir una columna transparente de plástico usando una botella.

2. Añadir una fuente de celulosa (papel, hierba, lechuga, etc.). Permitir que la fuente de celulosa

permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no en la superficie de la columna.

3. Añadir a la columna un volumen de barro del fondo de un río, mezclado con una fuente de azufre (p.

ej. un huevo).

4. Presionar el material hasta obtener una capa de alrededor de 10 cm. Procurar que salga lo más que se

pueda de burbujas de aire.

5. Añadir agua de río hasta casi llenar la columna (dejar unos 5 cm) y cubrir con una película de papel

parafilm.

6. Dejar en reposo la columna en una zona fresca e iluminada.

7. Examinar la columna durante 4 semanas,m anotando cambios de color y grosor de las capas

diferentes.

8. Tomar muestras de las capas para observar las comunidades microbianas.

9. Registre sus observaciones y trate de identificar los microorganismos. Para apoyarse puede consultar

las ligas http://www.microscope-microscope.org/gallery/mark-simmons/index.htm,

http://www.microbelibrary.org/library/parasite/3196-conjugation-in-paramecium-spp y

http://www.microbelibrary.org/library/resources/3165-an-environmental-sample-which-shows-

ciliates-preying-on-diatoms.

CUESTIONARIO

1. ¿Dónde se localizan los metanógenos y porqué?

2. Desarrolle una secuencia de etapas que puedan sucederse en el microcosmos de la columna,

partiendo de la fermentación de los azúcares derivados de la degradación de celulosa.

3. Luego de ver la animación sobre la columna de Winogradsky en la liga

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html ¿Qué tipo de

bacterias es la que degrada la celulosa y en qué nivel de la columna se encuentran? Cómo

4. ¿Cuál es la importancia de las bacterias del género Beggiatoa?

5. Mencione un ejemplo de relaciones microbianas que se establecen en la columna de

Wynogradsky.

http://www.microscope-microscope.org/gallery/mark-simmons/index.htm

http://www.microbelibrary.org/library/parasite/3196-conjugation-in-paramecium-spp

http://www.microbelibrary.org/library/resources/3165-an-environmental-sample-which-shows-ciliates-preying-on-diatoms

http://www.microbelibrary.org/library/resources/3165-an-environmental-sample-which-shows-ciliates-preying-on-diatoms

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html

2

REFERENCIAS DOCUMENTALES

Gamazo C, López-Goñi I, R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología. 3ra. ed. Elsevier Masson.

231 pp.

Singleton P. 1999. Bacterias en biología, biotecnología y medicina. 5ta ed. John Wiley & Sons.

España. pp. 515

3

PRACTICA No 2 “CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE

MICROORGANISMOS”

INTRODUCCION

La clasificación e identificación de microorganismos se basa principalmente en la determinación de la presencia o

ausencia de enzimas codificadas en el cromosoma bacteriano. Dichas enzimas dirigen el metabolismo microbiano

a través de diversas vías que pueden detectarse mediante medios de cultivo especiales. Los sustratos sobre los

cuales tales enzimas actúan, son generalmente incorporados a los medios de cultivo, además de un indicador que

detecte directamente la degradación del sustrato o bien la presencia de un subproducto metabólico.

OBJETIVO

Caracterizar aspectos de algunos microorganismos como su morfología macroscópica, microscópica, así

como rasgos bioquímicos que coadyuvan en su identificación.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Dependiendo de las cepas proporcionadas o de los materiales para sembrar, preparar placas Petri con

medios de cultivo selectivos/diferenciales como: agar de sal y manitol, agar EMB, agar de MacConkey,

agar nutritivo, así como tubos de ensayo de 13 x 100 mm con agar de hierro y triple azúcar (TSI), agar de

hierro y lisina (LIA), medio de movilidad, indol y ornitina (MIO), agar Citrato de Simmons y agar OF de

Hugh y Leifson. Considerar un volumen de 4 ml para el agar TSI, LIA y Citrato de Simmons, y 3 ml para

el medio MIO y el medio OF. Para el caso de los medios en placa Petri, considerar un volumen aprox. de

20 ml por caja.

2. Preparar también placas Petri con agar almidón y agar gelatina (ver anexo) para identificar actividad

enzimática en cepas de Bacillus ambientales que puedan aislarse.

3. Luego de la esterilización y gelificación adecuados, conservar los medios de cultivo en refrigeración y

cubiertos con papel de estraza (en el caso de las placas Petri).

4. A partir de las cepas conservadas en caldo LB-glicerol y con técnica aséptica, reactivar tomando escarchas

congeladas con el asa y sembrar por estría cruzada en agar nutritivo. Incubar las placas a 37º C durante 24

h. Mantener los viales en hielo cuando estén fuera del congelador.

2DA. SESIÓN

1. Luego de la incubación, corroborar la viabilidad de las cepas sembradas en agar nutritivo, efectuar

descripciones de las colonias y seleccionar dos colonias aisladas para su resiembra.

2. De manera alternativa, pueden sembrarse materiales diversos en las placas de Petri con el propósito de

aislar cepas de enterobacterias, bacterias de la piel, ambientales, hongos fitopatógenos, etc. Incubar en

condiciones adecuadas.

3. De las colonias seleccionadas, clasificar el tipo de bacteria según la tinción de Gram (puede consultar la

liga sobre la técnica de esta tinción en http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2833-gram-

stain), resembrar en los medios selectivos y/o diferenciales, así como en los medios en tubo para estudiar

su comportamiento bioquímico (sembrar como se indica en el cuadro 1).

4. Incubar a 37oC durante 24 h.

3RA. SESIÓN

1. Efectuar la lectura e interpretación de las pruebas bioquímicas de las cepas estudiadas, con base en los

cuadros 2 al 7.

http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2833-gram-stain

http://www.microbelibrary.org/library/gram-stain/2833-gram-stain

4

Cuadro 1. Método de inoculación de los tubos con medios para estudiar reacciones bioquímicas.

TIPO DE

INOCULACIÓN

MEDIO DE CULTIVO

TSI LIA MIO Citrato de

Simmons

Medio OF

Estría X X

Picadura X X

Picadura + estría X

Cuadro 2. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y triple azúcar (TSI).

REACCIONES EN AGAR HIERRO DE KLIGER

Superficie Fondo

Fermentación de glucosa Alcalino –K- (rojo) Acido –A-(amarillo)

Fermentación de glucosa

y lactosa

Acido –A-(amarillo) Acido –A-(amarillo)

Producción de gas Con burbujas

Producción de H2S Precipitado negro

Para consultar el fundamento teórico del agar de hierro y triple azúcar, se recomienda consultar la liga

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2842-triple-sugar-iron-agar-protocols y para observar

reacciones típicas en este medio de cultivo, consulte la liga http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-

test/2982-reactions-in-tsi-agar-slants. Cuadro 3. Interpretación del comportamiento bioquímico en agar de hierro y lisina (LIA).

REACCIONES EN AGAR DE HIERRO LISINA

Superficie Fondo

Utilización de lisina Alcalino –K- (morado) Alcalino –K- (morado)

No utilización de lisina Alcalino –K- (morado) Acido –A- (amarillo)

Cuadro 4. Interpretación del comportamiento bioquímico en el medio de movilidad, indol y ornitina (MIO).

REACCIONES EN EL MEDIO MIO

PRUEBA NEGATIVA PRUEBA POSITIVA

Movilidad Sin turbidez alrededor del sitio de

la picadura

Con turbidez en todo el medio

Indol Anillo amarillo Anillo rojo

Descarboxilación de la ornitina Fondo amarillo (reacción ácida) Fondo morado o gris (reacción alcalina)

Cuadro 5. Patrones de reacción en la prueba de Oxidación-Fermentación (OF).

Resultado en:

Tubo abierto (sin aceite) Tubo cerrado (con aceite) Metabolismo

Ácido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo

Ácido (amarillo) Ácido (amarillo) Fermentativo

Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacarolítico

Para consultar el fundamento y reacciones típicas en el medio OF se recomienda la liga

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3151-oxidative-fermentative-test-protocol Cuadro 6. Pruebas para detectar producción de H2S, indol y utilización de citrato.

PRUEBA MEDIO DE

CULTIVO

REACTIVO EN

(ml) LUEGO DE

INCUBAR

PRUEBA

NEGATIVA

PRUEBA POSITIVA

Acido sulfhídrico TSI o Kliger

(picadura)

Sin cambio Precipitado negro

Indol MIO o SIM 0.5 ml de reactivo

de Kovacs o Erlich

Anillo amarillo Anillo rojo

Utilización de

citrato

Citrato de Simmons

(estría); Citrato de

Christensen

(picadura y estría)

Sin cambio Azul de Prusia

Puede consultar resultados de E. coli en cuanto a las pruebas de indol, consulte la liga

http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2573-escherichia-coli-and-klebsiella-pneumoniae-

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2842-triple-sugar-iron-agar-protocols

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2982-reactions-in-tsi-agar-slants

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2982-reactions-in-tsi-agar-slants

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3151-oxidative-fermentative-test-protocol

http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2573-escherichia-coli-and-klebsiella-pneumoniae-on-sim-medium

5

on-sim-medium y para las pruebas de rojo de metilo, voges-proskauer y citrato en la liga

http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2557-imvic-tests-of-e-coli

Cuadro 7. Pruebas para detectar actividad enzimática sobre almidón y gelatina.

MEDIO DE CULTIVO REVELADOR RESULTADO/INTERPRETACIÓN

Agar almidón Solución de yodo-lugol (Gram) Presencia de halo transparente alrededor

de la colonia; resto del medio se tiñe de

azul-morado: ACTIVIDAD

AMILOLÍTICA

Ausencia de halo transparente alrededor

de la colonia, resto del medio se tiñe de

azul-morado: NO ACTIVIDAD

AMILOLÍTICA

Agar gelatina Solución de HgCl2 al 12.5% Presencia de halo transparente alrededor

de la colonia; resto del medio aparece un

precipitado blanco: ACTIVIDAD

PROTEOLÍTICA

Ausencia de halo transparente alrededor

de la colonia, resto del medio aparece un

precipitado blanco: NO ACTIVIDAD

PROTEOLÍTICA

Para observar reacciones típicas de la degradación de estas biomoléculas, se recomienda la liga NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Tipo de desechos Como descartarlos Tipo de contenedor

Cultivos microbianos Esterilice en autoclave de

acuerdo a las instrucciones del

docente

El señalado por el técnico del

laboratorio

CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento de la técnica de Gram.

2. Según la información contenida en la liga http://www.microbelibrary.org/library/bacteria/3184-

degradation-of-biological-macromolecules-by-bacillus-species ¿Cuál es la utilidad de las pruebas

para detectar actividad amilolítica y proteolítica en Bacillus spp.?

3. ¿Cuál es el fundamento para la detección del metabolismo oxidativo y fermentativo en el medio OF?

4. Mencione como se clasifican los microorganismos con base en su requerimiento de oxígeno.

5. Investigue que métodos automatizados existen para identificar microorganismos con base en su

comportamiento bioquímico.


Brock, T.D., & M.T. Madigan. Microbiología. 1991. Prentice-Hall hispanoamericana. México. D.F.

Forbes, B.A., Sahm, D.F., and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott´s Diagnostic microbiology. 11th

ed. Mosby. U.S.A. 1069 pp.

Gutiérrez Jiménez, J., Luna Cazáres, L.M. 2009. Estampas del mundo microbiano. Colección Jaguar

UNICACH. 53 pp.

Koneman, E.W., Allen, S.D., Dowell, V.R., Janda, W.M., Sommers, H.M., and W.C. Winn. 1988.

Diagnóstico microbiológico. 3ra. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 909

pp.

Mac Faddin, JF. 1990. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.

Edit. Médica Panamericana. México, D.F.

http://www.microbelibrary.org/library/2-associated-figure-resource/2557-imvic-tests-of-e-coli

http://www.microbelibrary.org/library/bacteria/3184-degradation-of-biological-macromolecules-by-bacillus-species

http://www.microbelibrary.org/library/bacteria/3184-degradation-of-biological-macromolecules-by-bacillus-species

6

ANEXOS.

Agar almidón.

Caldo nutritivo deshidratado 8.0 g

Almidón soluble 5.0 g

Agar bacteriológico 15.0 g

Agua, aforar a 1000 ml pH final: 6.8-7.2

Disolver el agar y el caldo nutritivo en el agua, añadir el almidón y calentar a ebullición. Esterilizar en autoclave antes de envasar a cajas Petri.

Agar gelatina.

Caldo nutritivo deshidratado 8.0 g

Gelatina 30.0 g

Agar bacteriológico 7.5 g

Agua, aforar a 1000 ml pH final: 7.0

Hidratar la gelatina en el agua destilada de 10 a 15 min, calentar a 50º C y añadir el caldo nutritivo, ajustar el pH. Agregar el agar, calentar para disolver y esterilizar en autoclave. Envasar en cajas Petri.

HgCl2 al 12.5%

HgCl2 15.0 g

HCl concentrado 20.0 ml

Agua destilada 100.0 ml

7

PRACTICA No 3 “MANEJO Y CONSERVACIÓN DE

MICROORGANISMOS”

INTRODUCCIÓN

La conservación de los microorganismos es de capital importancia para estudios ulteriores como su caracterización

biológica. Los procedimientos que implican dicha conservación constituyen el punto de partida de todo estudio

biológico, dado que se preservan los elementos genotípicos y genotípicos. Asimismo, el uso apropiado de

criopreservadores protege la viabilidad microbiana, la cual se conserva a bajas temperaturas. Otro procedimiento

como la liofilización es también un método aceptable, sin embargo es más costoso y reduce el porcentaje de

viabilidad microbiana.

OBJETIVO

Que el alumno aprenda algunas técnicas básicas para la conservación de microorganismos, con la finalidad de

preservar rasgos fenotípicos y genotípicos.

NORMAS DE SEGURIDAD

Tipo de riesgo Como evitarlo Como proceder en caso de

accidente

Quemadura por vapor de agua Protegerse con la bata de manga

larga. No abrir la válvula de

escape de vapor abruptamente,

sobre todo si hay personas cerca

del autoclave

Sumergir de inmediato en agua

fría la parte afectada. Aplicar una

crema con algún antibiótico como

sulfadiacina de plata y luego cubrir

con una gasa para proteger del

polvo y otras lesiones.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Preparar la cantidad necesaria de caldo Luria-Bertani (LB) más glicerol al 20%. Distribuir en alícuotas de

1.5 ml en tubos de polipropileno (tipo eppendorf o bien viales con tapón de rosca).

2. Asimismo, preparar cajas Petri con agar LB (considerar aprox. 20 ml/caja).

3. Preparar caldo papa dextrosa para la conservación de hongos fitopatógenos. Cortar 200 g de papas en

trozos y colocar en 500 ml de agua destilada, dejarlos coser. Colectar el líquido hervido y filtrar a través

de algodón con gasa en un matraz Erlenmeyer; agregar 10 g de dextrosa. Esterilizar en autoclave a 121º C

por 15 min. Se recomienda que al enfriarse se añadan 0.5 g de estreptomicina para evitar la contaminación

bacteriana. Si se requiere preparar agar papa dextrosa, agregar agar bacteriológico al 1.5%.

4. Preparación de la arena. Tamizar arena común para quitar piedras u otro tipo de material. Agregar agua

corriente y quitar el exceso. Hacer este lavado por otra ocasión. Extender la arena húmeda sobre un

plástico negro, permitir que se seque a temperatura ambiente y de preferencia a la luz natural. Una vez

seca, colocar en bolsas de alta densidad y esterilizar en autoclave a 121º C por 20 min. Dejar 1 día y

transferir la arena a tubos de 15 x 150 mm con tapón de rosca; volver a esterilizar bajo las condiciones

mencionadas arriba. Guardar los tubos en refrigeración hasta su uso.

5. Preparar y esterilizar hisopos con algodón.

6. Considerar que si un microorganismo requiere de algún antibiótico para su crecimiento, añadir al medio

LB estéril y enfriado a 40-50º C a la concentración requerida. Algunos antibióticos (como la ampicilina)

necesitan de esterilización previa por filtración.

7. Luego de preparar los medios de cultivo (en viales, cajas) conservar a 4oC hasta su uso.

8

2DA. SESIÓN

1. A partir de un crecimiento axénico de un hongo (Fusarium, Penicillium), obtener 3 fragmentos con un

sacabocados y transferir con una pinza de disección a tubos con caldo papa dextrosa. Incubar hasta por 7

días según lo requiera el hongo. Si no se tiene un cultivo axénico de hongos, aislar uno a partir de alguna

fruta con indicios de contaminación por hongos; sembrar un fragmento afectado de la fruta en agar papa

dextrosa. Efectuar una tinción con azul de metileno y diurex del micelio fúngico, observar con el objetivo

seco débil y fuerte.

2. A partir de cultivos axénicos bacterianos proporcionados por el profesor o bien aislados de la práctica 2,

inocular los caldos LB con una colonia aislada. Incubar durante 2 h a 37oC.

3. Posteriormente, embeber un hisopo estéril con el cultivo líquido bacteriano recién sembrado y estriar de

forma masiva la superficie de un agar LB.

4. Incubar a 37oC durante 24 h.

3RA. SESIÓN

1. Si se observa crecimiento de los hongos en el caldo papa-dextrosa, tomar 1 ml y depositar en el tubo con

arena estéril. Dejar en posición vertical y verificar si se sedimentó el material. Si esto no ocurrió al día

siguiente, añadir otros 500 l. Incubar los tubos con el hongo a temperatura ambiente o refrigeración para

una mayor duración.

2. Etiquetar los tubos con caldo LB-glicerol con el nombre de las cepas bacterianas a conservar.

3. Sacar las placas de Petri y seleccionar aquellas con crecimiento confluente y cosechar bajo condiciones

asépticas y de forma exhaustiva con ayuda de un asa bacteriológica.

4. Colectar el material en los viales, depositando desde el fondo del vial. Homogenizar rotando el asa dentro

del caldo.

5. Conservar a -20oC (mantenimiento a corto plazo) aunque preferentemente a -70

oC para mantenimiento a

largo plazo.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD




docente


laboratorio

CUESTIONARIO

1. Defina los términos clona y cepa. ¿a qué se define como cepa silvestre?

2. ¿Qué sustancias se pueden emplear como preservadores durante la conservación de microorganismos?

3. ¿Qué otras técnicas hay para la conservación de microorganismos?

4. Investigue como se pueden conservar hongos microscópicos y protozoarios.

5. Qué estrategia utilizaría para recuperar por separado un conjunto de microorganismos que coexisten en

una muestra de agua encharcada, para luego conservarlos.




Suslov, T.V., and M.N. Schroth. 1981. Bacterial culture preservation in frozen and dry-film

methylcellulose. Appl. Environ. Microbiol. 42:872-77.

Vargas-Flores, ME. 2003. Caracterización de tres cepas de Beauveria brogniartii (Sacardo) Petch y su

virulencia en Phthorimaea operculella (Zeller) y Symmetrischema tangolias (Gyen). Tesis de

Licenciatura. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Perú.

http://biowww.net/forum/reagents.php


9

PRACTICA No 4 “ADHESIÓN BACTERIANA”

INTRODUCCION

La adherencia es una estrategia primordial que utilizan algunos microorganismos con el propósito de colonizar

tejidos de un huésped. Tal evento es facilitado por estructuras microbianas especializadas denominadas adhesinas,

las cuales pueden ser de naturaleza fimbrial o no. La adherencia facilita el establecimiento y persistencia de dichos

organismos en aquellos nichos ecológicos, dado que la unión sitio específica que median, les permite a los

microorganismos resistir mecanismos de defensa innatos que poseen los hospederos evitar la colonización por

gérmenes invasores. Además, la expresión de dichas estructuras no solo permite el establecimiento de

microorganismos en seres vivos, sino que también la colonización de la materia inanimada.

OBJETIVO

Analizar uno de los eventos que implican ventajas en algunos microorganismos como su capacidad de adhesión a

sustratos inanimados como el cristal.

10

NORMAS DE SEGURIDAD

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN.

1. Preparar tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca con 3 ml de caldo soya tripticaseína (TSB) que

contengan 0, 0.25, 1 y 2.5% de glucosa.

2. Preparar cajas Petri con agar soya tripticaseína (TSA) que contengan 0, 0.25, 1 y 2.5% de glucosa.

3. Dejar en prueba de esterilidad a 37º C por 24 h. Si los medios no están contaminados, conservar en

refrigeración con el medio hacia arriba.

2DA. SESIÓN.

1. Sembrar por estría cruzada las cepas de E. coli ATCC 25922, E. coli 042 y Staphylococcus aureus en

cada una de las concentraciones de TSA-glucosa. Incubar a 37º C por 24 h. A partir de estos cultivos,

resembrar una colonia axénica de cada cepa en caldos TSB – glucosa a la concentración de glucosa

que corresponda. Incubar. Incubar toda la noche a 37º C

3RA. SESIÓN.

1. Remover el contenido de cada tubo, desechar en un contenedor con cloro al 1%.

2. Añadir 2 ml de Safranina de Gram, dejar reposar durante 2 min.

3. Decantar el colorante en el contenedor de desechos y dejar secar los tubos toda la noche colocándolos

boca abajo sobre papel absorbente.

4. Efectuar la lectura de las pruebas, considerando una prueba positiva cuando se aprecie una capa

adherente de material teñido en la superficie interna del tubo. Estimar la adherencia como: ausente

(0), débil (+), moderada (++) o fuerte (+++). No considerar la prueba positiva si observa la presencia

de material teñido en la interfase líquido-aire. de la siguiente manera:

5. Construir una tabla conjuntando los resultados de todos los equipos.

6. Construir un gráfico para observar la capacidad de adherencia de cada cepa.





docente


laboratorio

CUESTIONARIO

1. ¿Qué estructuras bacterianas favorecen la adhesión?

2. ¿Cuál es la importancia de la adhesión bacteriana?

3. ¿Qué estrategias utilizaría para bloquear la adhesión bacteriana?

4. ¿Cuáles fueron las ventajas y desventajas al comparar las técnicas de adhesión en tubo y la del

ensayo en microplaca? Apoyarse en la referencia J. Microbiol. Meth. 40:175-179.

5. ¿Qué son las biopelículas y cómo se relacionan con la adherencia?

11


Cravioto A., Cross R.J., Scotland S.M., Rowe B. 1979. An adhesive factor found in strains of

Escherichia coli belonging to the traditional infantile enteropathogenic serotypes. Curr. Microbiol. 3:

95:99.

Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, and M. Svabic-Vlahovic. 2000. A modified microtiter-

plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Meth. 40:175-179.

Watnick, P., and R. Kolter. 2000. Biofilm, city of microbes. J. Bacteriol. 182:2675-9.

12

PRACTICA No 5 “SINERGISMO BACTERIANO”

INTRODUCCION

El fenómeno lítico entre Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae fue originalmente observado en

durante un brote de escarlatina en cultivos de leche para la búsqueda de Streptococcus hemolíticos. Las colonias

de Streptococcus estaban rodeadas de zonas de hemólisis completa cuando crecían en proximidad a colonias de

Staphylococcus beta-hemolítocos. Así, la beta-lisina de S. aureus actúa sinérgicamente con el factor CAMP

producido por Streptococcus agalactiae hemolíticos o no. Dicha reacción sinérgica resulta en una zona de

hemólisis grande y fácilmente visible en la región próxima a los dos cultivos.

OBJETIVO

Observar la acción sinérgica entre la lisina producida por ciertas cepas de Staphylococcus aureus con un factor

proteico (factor CAMP) secretado por cepas hemolíticas o no de Streptococcus agalactiae.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Sembrar por estría cruzada cepas de Staphylococcus aureus (secretora de beta-lisina), Streptococcus

agalactiae y Escherichia coli en agar nutritivo.

2DA. SESIÓN

1. En una placa de agar sangre de carnero, inocular la cepa de S. aureus mediante una estría central

recta.

2. Inocular las cepas prueba, es decir S. agalactiae y E. coli también mediante una estría simple recta,

aunque en ángulo de 90º con respecto a la estría del S. aureus (fig. 3ª). Las estrías de los organismos

prueba no debe tener contacto con la estría de S. aureus, procurar dejar un espacio de aprox. 2 mm.

3. Incubar las placas a 37º C durante 24 h.

3RA. SESIÓN

1. La presencia de una zona amplia de hemólisis en forma de “media luna” o “punta de flecha” en la

vecindad de estrías de S. aureus y S. agalactiae se considera como una prueba positiva. Si no aparece

tal zona de hemólisis la prueba se considera negativa.

13

Fig. 3ª. Patrón de inoculación para la prueba de CAMP.





docente


laboratorio

CUESTIONARIO

1. Explique los tipos de relaciones biológicas que existen y ejemplifique.

2. ¿Cuál es la utilidad de la prueba CAMP para Streptococcus agalactiae? Consulte la liga

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3086-camp-test-protocols

3. ¿Qué otros organismos pueden estudiarse aprovechando la acción sinérgica evaluada en la prueba de

CAMP?

4. ¿Cuál es la importancia de la competencia bacteriana cuando ciertos organismos se encuentran

colonizando tejidos de hospederos?

5. ¿Cuál es el papel de metabolitos bacterianos como las bacteriocinas en la competencia microbiana?





Gutiérrez Jiménez J & Luna Cazáres LM. 2009. Estampas del mundo microbiano. Colección Jaguar.

UNICACH. 53 pp.

Koneman, E.W., Allen, S.D., Dowell, V.R., Janda, W.M., Sommers, H.M., and W.C. Winn. 1988.

Diagnóstico microbiológico. 3ra. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 909

pp.

Organismo de prueba

(Streptococcus

agalactiae, E. coli)

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3086-camp-test-protocols

14

PRACTICA No 6 “PLÁSMIDOS”

INTRODUCCION

Los plásmidos bacterianos constituyen un tipo de elemento genético extracromosomal con replicación autónoma

que si bien no codifica funciones vitales para la célula bacteriana, provee ventajas ecológicas al microorganismo

como: codificación de resistencia a antibióticos, metales pesados, detergentes, adhesión, toxinas, etc. Dichos

elementos génicos son frecuentemente usados como “acarreadores de información génica” y pueden ser

construidos en el laboratorio para diversos fines.

OBJETIVO

Efectuar la extracción de plásmidos bacterianos mediante la técnica de lisis alcalina, y visualizar el material génico

obtenido mediante electroforesis en agarosa.

NORMAS DE SEGURIDAD


accidente

Efecto mutagénico por exposición

a la solución de bromuro de etidio

Usar guantes y careta durante el su

manejo. No añadir bromuro de

etidio a la cámara de electroforesis

o alguna de sus partes. Contener la

solución en un recipiente

exclusivo.

Ojos, piel: lavar con abundante

agua durante al menos 15 min. en

la ducha de seguridad. Desechar

ropa y zapatos contaminados. Para

derrames, use un absorbente para

secar el bromuro de etidio. Limpiar

también cualquier traza de esta

sustancia en estado sólido con

mucha precaución e intentando no

crear polvo. Elimínar la sustancia

en un contenedor hermético y

tírese dentro de un cubo etiquetado

Fenol: corrosivo a la piel, fatal si

se ingiere, inhala o absorbe a

través de la piel

Usar guantes apropiados, gafas y

careta, bata y mandil en campana

de extracción.

Si se ingiere y está consciente, dar

carbón activado en agua, aceite de

oliva o margarina. Provocar el

vómito. Si se inhala, sacar al aire

fresco. Si no respira, administre

respiración artificial. Si cuesta

trabajo respirar, administre

oxígeno. Si hay contacto con la

piel, lave inmediatamente con

abundante agua. Limpie la piel con

torundas embebidas en glicerol o

polietilénglicol por 10 min. Llevar

a un lugar con equipos de

resucitación.

15

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Siembre en agar LB las cepas: E. coli HB101, E. coli 042, E. coli HB101/pPic1 y E. coli

HB101/pCEFN1. Incube a 37º C durante 24 h. 2DA. SESIÓN

2. Transfiera una sola colonia del microorganismo en estudio en 2 ml de caldo LB con el antibiótico

apropiado (si es el caso). Incubar toda la noche a 37º C con agitación vigorosa.

3. Coloque 1.5 ml del cultivo en un tubo tipo eppendorf y centrifugue a 12,000 g durante 10 min a 8º

C.

4. Remover el medio por aspiración.

5. Resuspender el paquete bacteriano en 100 l de solución 1 fría y agite vigorosamente.

Solución 1 (GTE).

Glucosa 50 mM

Tris-Cl 25 mM (pH 8.0)

EDTA 10 mM (pH 8.0) La solución 1 puede prepararse en fracciones de 100 ml, autoclavear por 15 min. y almacenar a 4 oC. Hay que asegurarse de que el paquete bacteriano esté completamente disuelto en solución, lo cual puede lograrse agitando en vórtex.

6. Añadir 200 l de solución 2 recién preparada y mezcle por inversión rápidamente durante 5 veces. No

use el vórtex y almacene el tubo en hielo durante 5 min.

Solución 2.

NaOH 0.2 N, no refrigerar (diluido recientemente de un stock a 10 N)

SDS 1%

7. Añadir 350 l de solución 3 fría, agitar en vórtex y dejar 5 min en hielo

Solución 3.

Acetato de potasio 5 M 60 ml

Ácido acético glacial 11.5 ml

H2O 28.5 ml La solución resultante es 3 M con respecto al potasio y 5 M con respecto al acetato.

8. Cierre el tubo y agite en vórtex generosamente en posición invertida durante 10 s para dispensar la

solución a través del material viscoso bacteriano. Almacene el tubo en hielo durante 5 min.

9. Centrifugue a 12,000 g durante 10 min. a 8oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco.

10. Hacer extracción vol/vol con fenol: cloroformo (300 l de fenol + 300 l de cloroformo) y mezcle en

vórtex. Centrifugue a 12,000 g por 5 min a 8º C, y transfiera el sobrenadante a un tubo fresco.

11. Precipite el DNA con 2 volúmenes de etanol (500 l) o 1 volumen de isopropanol, mezcle por

inversión y deje toda la noche a –20º C.

12. Centrifugue a 12,000 g durante 10 min a 8º C.

16

13. Remueva el sobrenadante cuidadosamente por aspiración. Coloque el tubo en posición invertida sobre

papel secante y permita que el exceso de líquido drene.

14. Enjuague el paquete con 1 ml de etanol al 70% frío. Remueva el sobrenadante como se describió

anteriormente y permita que el paquete de ácido nucleico se seque a temperatura ambiente sobre

papel secante.

15. Resuspenda el paquete en 30-50 l de agua desionizada estéril. Se puede resuspender en 50 l de TE

(pH 8.0) que contenga RNasa pancreática (20 g/ml). Conservar a –20º C.

16. Agite en vórtex brevemente y almacene a –20º C.

17. Construya un gel de agarosa al 1% con regulador TBE (Tris-ácido bórico-EDTA) y cargue en los

carriles alícuotas del plásmido obtenido. Mezcle previamente con un regulador de corrimiento y

efectúe el corrimiento a 100 V en una cámara de electroforesis horizontal.

18. Tiña el gel en una solución de bromuro de etidio (10 g/mL) durante 15 min. y luego transfiera a un

recipiente con agua destilada.

19. Coloque el gel en un transiluminador y analice el gel en busca de bandas de ADN plasmídico luego

de su exposición a luz ultravioleta.

20. Documente la imagen con ayuda de una cámara digital en el modo de blanco y negro.



Solución de bromuro de etidio

(BrEt)

Descontaminar las soluciones

concentradas de BrEt mediante: i)

añadir suficiente agua para diluir

y reducir la concentración de

BrEt, ii) añadir un volumen de

KMNO4 0.5 M, mezclar y añadir

1 volumen de HCl 2.5 N, mezclar

y dejar en reposo durante 18 h,

iii) añadir 1 volumen de NaOH

2.5 N, mezclar y desechar la

solución.

De plástico con tapa hermética

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las conformaciones que pueden adoptar los plásmidos bacterianos? Consulte la

liga http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=2128 (debe registrarse para

tener acceso gratuito a la animación y otros recursos virtuales)

2. ¿Cuál es la utilidad de los plásmidos?

3. ¿Qué es el SDS (dodecil sulfato de sodio) y de qué manera participa en la técnica para la

extracción de un plásmido?

4. La solución III usada en el protocolo de lisis alcalina es

a. Solución de lisis

b. Solución de resuspensión

c. Solución neutralizante

d. Solución desnaturalizante

5. ¿Cómo se puede “curar” una bacteria de un plásmido?

http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=2128

17


Eslava, C., Navarro-García, F., Czeczulin, J.R., Henderson, I.A., Cravioto, A., and J.P. Nataro. 1998.

Pet, an autotransporter enterotoxin from enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun. 66:3155-

63.

Henderson, I.R., J. Czeczulin, C. Eslava, F. Noriega, and J.P. Nataro. 1999a. Characterization of pic,

a secreted protease of Shigella flexneri and enteroaggregative Escherichia coli. Infect. Immun.

67:5587-96.

Sambrook, J., MacCallum, P., and D. Russell. 2006. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd

. ed.

CSHL Press.



18

PRACTICA No 7 “DETECCIÓN DE GENES DE VIRULENCIA

BACTERIANA MEDIANTE PCR”

INTRODUCCION

En 1984, Kary B. Mullis y un grupo de científicos en la compañía biotecnológica Cetus Corporation, desarrollaron

la técnica conocida como reacción en cadena de la polimerasa o PCR. Esta técnica consiste en amplificar el ADN

mediante un proceso in vitro; de esta manera se pueden obtener grandes cantidades de un fragmento de ADN

específico a partir de un molde de ADN complejo en una reacción enzimática simple. Para la técnica se emplea una

ADN polimerasa termoestable y dos oligonucleótidos que sirven como iniciadores para sintetizar una fragmento de

ADN específico a partir de un ADN molde monocatenario. Esta prueba tiene diversas utilidades, tal como la

investigación de genes que codifican factores de virulencia en bacterias, que con la sensibilidad y rapidez se

pueden identificar el mismo día un patógeno bacteriano comparado con los días que toma la identificación con

métodos fenotípicos.

OBJETIVO

Que el alumno sea capaz de amplificar genes que codifican factores de virulencia bacteriano mediante la PCR.

NORMAS DE SEGURIDAD


accidente

Efecto mutagénico por exposición

a la solución de bromuro de etidio

Usar guantes y careta durante el su

manejo. No añadir bromuro de

etidio a la cámara de electroforesis

o alguna de sus partes. Contener la

solución en un recipiente

exclusivo.

Ojos, piel: lavar con abundante

agua durante al menos 15 min. en

la ducha de seguridad. Desechar

ropa y zapatos contaminados. Para

derrames, use un absorbente para

secar el bromuro de etidio. Limpiar

también cualquier traza de esta

sustancia en estado sólido con

mucha precaución e intentando no

crear polvo. Elimínar la sustancia

en un contenedor hermético y

tírese dentro de un cubo etiquetado

Quemadura por Luz ultravioleta

(U.V.)

No exponer el rostro o la piel

directamente, usar bata blanca de

manga larga. Protegerse mediante

caretas de plástico.

Aplicar compresas de agua fría o

ungüentos sin anestésicos sobre la

piel afectada. Los comprimidos

con corticosteroides pueden ayudar

a aliviar el dolor e inflamación

19

PROCEDIMIENTO

1RA SESIÓN

Reactivar las cepas de referencia en agar LB: a) E. coli ATCC 25922 (control negativo), b) E. coli 042 (prototipo

de E. coli enteroagregativa).

Reactivar las cepas de E. coli silvestres que se hayan aislado de alguna fuente y se hayan mantenido conservadas a

-20º C.

2DA. SESIÓN

Obtención del ADN bacteriano.

Tomar una colonia de cada cepa y diluirla en 1 ml de agua destilada estéril en un tubo de

polipropileno tipo eppendorf, someter a ebullición durante 1 minuto.

Preparación de la mezcla maestra (Master Mix) conforme a lo siguiente y según Cerna et al. (2003):

Para una sola muestra se debe realizar la mezcla a las concentraciones y en el orden siguiente:

Componente Volumen (µl)

Agua desmineralizada o MilliQ 13.8

Regulador 10X 2.5

Solución de MgCl2 50 mM 1

dNTP´s 2.5 mM 2

Mezcla de iniciadores 10 Ma 3.5

Taq polimerasa 5 U/l 0.2

Multiplicar cada uno de los volúmenes citados en la tabla por el número de muestras + 1/3 que se

analizarán por PCR.

Todos los reactivos deberán mantenerse en hielo y la Taq polimerasa deberá mantenerse a -20º C y

sacar únicamente al momento de usarse, procurando mantenerla el menor tiempo posible fuera del

congelador.

Homogeneizar el Master Mix en un agitador tipo vórtex y enseguida distribuir 23 µL a sendos tubos

para PCR, según el número de muestras.

Agregar 2 µL del ADN de la muestra (a partir del sobrenadante del tubo donde se hirvió la colonia

bacteriana) a cada tubo conteniendo la mezcla Master Mix. Luego de este paso, las concentraciones

finales en cada tubo de reacción quedan de la siguiente manera: Tris-HCl (pH 8.3), 10 mM; KCl, 50

mM; MgCl2, 2 mM; gelatina, 100 µg/mL; glicerol, 5% (vol/vol); dATP, dCTP, dGTP y dTTP 200

µM cada uno; Taq polimerasa 1 U/25 µL.

Centrifugar cada tubo durante unos segundos.

Agregar aproximadamente dos gotas de aceite mineral estéril a cada tubo.

Tapar los tubos y colocar en el termociclador (el usado en la Facultad de Ciencias Biológicas es un

termociclador eppendorf Mastercycler gradient) bajo las siguientes condiciones: 50°C (2 min, 1

ciclo); 95°C (5 min, 1 ciclo); 95,55 y 72 °C (45 segundos a cada temperatura, 40 ciclos) y un paso de

extensión final (10 min, 72 °C).

Dejar el producto de PCR a 4°C hasta su manipulación (el termociclador usualmente se programa

para que al término de la reacción se mantenga a 4º C).

20

3RA. SESIÓN

Análisis de los productos de PCR mediante electroforesis en agarosa.

Preparar un gel de agarosa al 2.5 % (usar amortiguador TAE 1X como disolvente).

Mezclar 4 µl de cada muestra con 1-2 µl de regulador para corrimiento.

Depositar cada muestra en un carril, incluir un marcador de peso molecular (para este caso específico

usar 1 µl de una escalera de 100 pb).

Correr la electroforesis a 100 Volts durante aproximadamente 50 min.

Teñir el gel mediante una tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) durante 30 min o con el colorante

Sybr Green (Invitrogen Cat. S33102) durante 3 h (diluido 1X).

Fotografiar el gel con una cámara digital inmediatamente y luego de exponer brevemente el gel a la

luz UV en un transiluminador.

Interpretar con base a lo reportado por Cerna et al. (2003).

Desechar el gel y todo lo que haya estado en contacto con el BrEt en una bolsa; remitir al almacén de

RPBI o bien descontaminar como se indica en las normas de bioseguridad. a Los iniciadores usados en la práctica se detallan a continuación:

INICIADOR CONCENTRACIÓN VOLUMEN PARA LA MEZCLA

AAPROBE Forward + Reverse

(F-R)

10 µM 500 µl

AggR F-R 10 µM 332 µl

AAP F-R 10 µM 168 µl



Solución de bromuro de etidio

(BrEt)

Descontaminar las soluciones

concentradas de BrEt mediante: i)

añadir suficiente agua para diluir

y reducir la concentración de

BrEt, ii) añadir un volumen de

KMNO4 0.5 M, mezclar y añadir

1 volumen de HCl 2.5 N, mezclar

y dejar en reposo durante 18 h,

iii) añadir 1 volumen de NaOH

2.5 N, mezclar y desechar la

solución.

De plástico con tapa hermética

CUESTIONARIO

1. Investigue como se diseñaron los iniciadores empleados en esta práctica para la PCR.

2. ¿Cuál es la importancia de detectar estos genes en Escherichia coli?

3. Investigue otros genes de virulencia en E. coli que puedan detectarse mediante PCR.

4. Explique cómo puede cuantificarse el ADN de un gen que se amplifica por PCR. Apoyarse en la

lectura de la liga http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3656-polymerase-chain-

reaction

5. ¿Cuáles son las ventajas y/o desventajas de una PCR de punto final vs una PCR multiplex?

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3656-polymerase-chain-reaction

http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3656-polymerase-chain-reaction

21


Arnheim N. 1992. Polymerase chain reaction strategy. Annu. Rev. Biochem. 61:131-156.

Cerna JF, Nataro JP, and Estrada García T. 2003. Multiplex PCR for detection of three plasmid-borne

genes of Enteroaggregative Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 41:2138-2140.

22

PRACTICA No 8 “CÉLULAS MICROBIANAS COMPETENTES”

INTRODUCCION

La capacidad de un microorganismo para unir e incorporar ADN exógeno se denomina competencia. Esta

capacidad puede ser natural o químicamente inducida. El descubrimiento de tal fenómeno fue hecho por Grifith en

1928, con experimentos en los que empleó cepas de neumococo (Stretpcococcus pneumoniae), una bacteria

naturalmente competente. Poco después en 1944, Avery, MacLeod y McCarty demostraron que el factor

transformante estaba constituido de ADN. La adquisición natural entre organismos diferentes ha favorecido la

transferencia horizontal, en tanto que la artificial es una técnica básica en la ingeniería genética.

OBJETIVO

Inducir en la célula bacteriana la capacidad de captar ADN exógeno con la finalidad de que pueda

adquirir elementos genéticos adicionales para su transformación genotípica y fenotípica.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Siembre la cepa de E. coli ATCC 25922 en 3 ml de caldo LB e incubar a 37 ºC durante 16 h a 150

rpm.

2DA. SESIÓN

2. Tomar de dicho cultivo 300 µl e inocularlos en un tubo con 10 ml de caldo LB, incubar bajo las

mismas condiciones durante 90 min (fase log tardía. Opcionalmente se distribuyen los 10 ml del

cultivo en sendos tubos eppendorf de 1.5 ml (aprox 7 tubos).

3. Centrifugar los tubos a 7000 rpm durante 10 min a 4º C, decantar el sobrenadante y resuspender la

pastilla obtenida en 4 ml (400 µl) de MgCl2 0.1 M frío. Mantener los tubos en hielo durante 10 min.

4. Centrifugar bajo las condiciones citadas arriba, decantar el sobrenadante y resuspender en 4 ml (400

µl) de CaCl2 0.1 M frío, dejar reposar los tubos en hielo durante 1 h.

5. Centrifugar nuevamente en las mismas condiciones, desechar y resuspender con 4 ml (400 µl) de

CaCl2. Las células obtenidas en este paso se denominan “competentes” y se distribuyen en alícuotas

de 100 µl en tubos eppendorf de 1.5 ml (estériles). Si se desea preservar dichas células, se agrega

glicerol al 20% y se conservan a –70 ºC hasta su uso.





docente


laboratorio

23

CUESTIONARIO

1. ¿Qué características tiene las cepas microbianas destinadas para la competencia bacteriana?

2. Mencione ejemplos de microorganismos que son competentes naturales.

3. ¿Qué mecanismos emplean bacterias competentes para incorporar ADN exógeno?

4. Explique el fundamento de la técnica empleada para obtener células competentes.

5. ¿Qué factores pueden afectar la competencia hecha en el laboratorio?



Dragui, J.A.and P.E. Turner. 2007. DNA secretion and gene-level selection in bacteria. Microbiology.

152:2683-88.

Sambrook, J., MacCallum, P., and D. Russell. 2006. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed.

CSHL Press.

24

PRACTICA No 9 “TRANSFORMACIÓN BACTERIANA”

INTRODUCCION

Algunas células microbianas son susceptibles de la adquisición de material genético adicional a su carga génica;

tales eventos pueden ser mediante transformación, mediante el cual se capta ADN del ambiente, transducción, en el

que participan virus como agentes que “inyectan” el material genético y la conjugación, proceso que implica la

interacción entre dos células microbianas para la transferencia de material genético. Tales eventos pueden

efectuarse de forma in vitro, y el desarrollo de ellas han sentado las bases de la tecnología de ADN recombinante y

poder obtener vacunas, fármacos (insulina, somatotropina).

OBJETIVO

Aprender el fundamento y un método de transformación artificial para introducir material genético y como se altera

el fenotipo de una población bacteriana.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Descongelar un vial de células competentes en hielo

2. En condiciones asépticas, añadir de 1-10 ng (aprox. de 2-3 l) del ADN plasmídico obtenido en una

práctica anterior.

3. Mezclar suavemente y mantener en hielo durante 40 min.

4. Inducir un choque térmico incubando los tubos a 42 ºC por 90 segundos.

5. Transferir nuevamente al hielo durante 5 min.

6. Añadir 500 µl de caldo LB e incubar a 37º C a 150 rpm por 90 min.

7. Centrifugue a 7000 rpm por 3 min, descarte el sobrenadante, dejando solamente 50 – 100 µl y

resuspenda la pastilla en dicho volumen.

8. Con una varilla de vidrio acodada esterilizada en alcohol, siembre en 1 placa de agar LB con el

antibiótico apropiado.

9. Incube a 37 ºC toda la noche.

2DA: SESIÓN.

10. Registre resultados en cuanto a la capacidad de crecimiento o no del microorganismo en el medio

seleccionado.





docente


laboratorio

25

CUESTIONARIO

1. ¿En qué consiste la electroporación?

2. Explique la estructura de un vector plasmídico y las funciones que codifican dichos genes.

3. ¿En qué consiste la técnica de apareamiento por conjungación y cómo se efectúa in vitro?

4. ¿Qué sucede cuando se introduce al fago lambda (utilizado como vector) en una célula?

5. ¿Cómo se dterminan las placas líticas en una placa de cultivo?



Dragui, J.A.and P.E. Turner. 2007. DNA secretion and gene-level selection in bacteria. Microbiology.

152:2683-88.


. ed.

CSHL Press.

26

PRACTICA No 10 “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”

INTRODUCCION

El estudio de las proteínas constituye una base importante para la comprensión de la forma y función de estructuras

biológicas de naturaleza proteica. En el caso de las proteínas microbianas, su análisis permite la comprensión de la

estructura y función de muchos organelos, además de que su estudio es imperativo para confirmar estudios

genómicos como una secuencia de ADN, la síntesis de péptidos para obtención de anticuerpos específicos, etc. La

cantidad de una proteína puede en general determinarse mediante métodos colorimétricos/espectrofotométricos,

mediante el análisis de sus aminoácidos o bien mediante la comparación de la intensidad del color de bandas

proteicas obtenidas mediante SDS-PAGE.

OBJETIVO

Mediante una técnica colorimétrica, determinar la concentración de proteínas mediante la construcción de una

curva estándar.

NORMAS DE SEGURIDAD


accidente

Ácido fosfórico: corrosivo,

irritación severa, quemaduras

Durante la pesada o manipulación

del reactivo, usar guantes de látex,

bata y mandil, lentes de seguridad

y campana de ventilación.

Si se ingirió, NO provoque el

vómito. Si está consciente, déle

agua, leche o leche de magnesia.

Si se inhaló, sacarlo al aire fresco.

Si no respira, administre

respiración artificial. Si le cuesta

trabajo respirar, administre

oxígeno.

Contacto directo: lavar

inmediatamente con abundante

agua por lo menos 15 min,

quitarse la ropa y calzado

contaminado.

PROCEDIMIENTO

A. Preparación del reactivo de Bradford concentrado

1. Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 ml de etanol al 95%. Usar un agitador

magnético.

2. Añadir paulatinamente 100 ml de ácido fosfórico. Mantener cubierto el matraz durante la operación para

proteger el reactivo de la acción de la luz.

3. Mantener en agitación durante toda la noche a 4º C.

4. Transferir la mezcla a un matraz volumétrico de 200 ml y aforar con agua destilada.

5. Almacenar en frasco ámbar o en uno cubierto con papel aluminio y mantener a 4º C (la estabilidad se

mantiene aproximadamente 6 meses).

27

B. Determinación de proteínas en una muestra

1. Preparar una curva estándar partiendo de una muestra que contenga 1 mg/ml de una proteína como la

albúmina sérica bovina.

2. Hacer diluciones seriadas dobles de tal manera que el volumen final en cada dilución sea de 100 l. Diluir

con PBS.

3. Para las determinaciones, diluir el reactivo de Bradford de trabajo 1:5 con agua destilada. Filtrar el

colorante si se observa una formación de precipitado.

4. Añadir a los tubos 5 ml del reactivo de Bradford de trabajo (diluído). Permitir el desarrollo de color

durante 5 min pero no más de 30 min. Al tubo usado como blanco añadir 100 l de regulador salino de

fosfatos (PBS). El colorante rojo se tornará azul luego de la unión a la proteína presente en la muestra.

5. Determinar la absorbancia a 595 nm.

6. Construir la curva de calibración graficando en el eje de las abscisas la concentración de BSA y en las

ordenadas la absorbancia a 595 nm.

7. Obtener la concentración de proteína presentes en muestras desconocidas mediante la ecuación de

regresión lineal y con ayuda del programa Excel.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros métodos existen para determinar proteínas en una muestra?

2. En el método de Bradford ¿Porqué no se deben considerar lecturas de absorbancia luego de 30 min de la

interacción colorante – proteína?

3. ¿Cómo verificaría si una proteína está purificada?

4. ¿Cómo se determina la secuencia de aminoácidos en una proteína?

5. Investigue ejemplos de proteínas que se obtienen mediante la tecnología de ADN recombinante.


Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-54.

Scopes, R.K., and J.A. Smith. 1998. Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons.

U.S.A.

Stryer, L. 1995. Bioquímica. Vol. 1. 4ª ed. Editorial Reverté. Barcelona, España. 440 pp.

28

PRACTICA No 11 “ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

BACTERIANAS MEDIANTE ELECTROFORESIS EN

GEL DE POLIACRILAMIDA”

INTRODUCCION

Se llama precipitado a una sustancia sólida que se forma en el interior de una disolución. Existen ciertas proteínas

que cuando se encuentran en un medio ácido se produce su desnaturalización, entonces tiene lugar una reacción

química que altera su estructura, y deja de ser soluble en agua lo que provoca que precipite. Los iones H+ y OH

- del

agua afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Dicha

alteración elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y provocan la precipitación.

OBJETIVO

Obtener un concentrado de proteínas bacterianas excretadas al medio externo mediante la acción precipitante del

ácido tricloroacético

29

NORMAS DE SEGURIDAD


accidente

Ácido tricloroacético: quemadura

en la piel por efecto cáustico

Durante la pesada o manipulación

del reactivo, usar guantes de látex

y cubrebocas. Efectuar la

operación en campana de

extracción

Piel y ojos: lavar con abundante

agua por lo menos 15 min.

Acrilamida: Efecto mutagénico y/o

cancerígeno. No inhalar.

Manipulación del reactivo con

guantes de látex, careta y gafas,

cubrebocas y en campana de

extracción.

Piel y ojos: lavar con abundante

agua por lo menos 15 min.

Desechar ropa y calzado

contaminados.

TEMED: altamente inflamable,

corrosivo. Dañino si se inhala o

por contacto con la piel. Causa

quemaduras. Mantener lejos de

llamas, no fumar.




extracción

Ojos: Enjuagar con abundante

agua por lo menos 15 min. y acudir

al médico. Exhibir la etiqueta del

reactivo.

SDS: irrita la piel, ojos y tracto

respiratorio. Puede causar

reacciones alérgicas. No respirar el

polvo.




extracción.

Si se inhala: sacar al aire fresco, si

no respira, dar respiración

artificial. Si hay contacto con la

piel, lavar el área afectada con

abundante agua y jabón. Remover

ropa y calzado contaminados. Si se

ingiere y está consciente,

administrar agua abundante

Persulfato de amonio: Oxidante

fuerte. El contacto con otros

materiales puede ocasionar fuego.

Causa quemaduras en la piel y

ojos. Irritante del tracto

respiratorio. Puede causar

reacciones alérgicas.




extracción.

Si se ingiere, dar abundante agua,

puede ocurrir el vómito

espontáneamente, no inducirlo. Si

hay contacto con la piel, lavar con

agua abundante y remover ropa y

calzado contaminados. Exhibir la

etiqueta del reactivo.

2-mercaptoetanol: tóxico al

contacto con la piel. Dañino si es

inhalado o ingerido. Se absorbe

rápidamente por la piel.




extracción.

En caso de contacto con piel u

ojos, enjuagar con abundante agua

y llevar al médico. Exhibir la

etiqueta del reactivo.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Sembrar las cepas bacterianas en caldo LB e incubar a 37º C durante 24 h.

2DA. SESIÓN

1. Luego del tiempo de incubación, centrifugar para obtener el sobrenadante conteniendo las proteínas

bacterianas excretadas.

2. Preparar una solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100%. Preparar dicha solución en campana

de extracción debido a la toxicidad del TCA y hacer la pesada con guantes de látex.

30

3. Llevar al 15-20% con el sobrenadante bacteriano a precipitar (200 µl TCA 100%). Por ejemplo,

1350 µl del sobrenadante mas 150 µl de TCA 100%

4. Incubar en hielo de 1- 2 h.

5. En una centrífuga refrigerada, centrifugar a 14,000 rpm a 4º C a por 20 min.

6. Desechar el sobrenadante.

7. Efectuar 2 lavados con acetona fría (500 µl acetona) y centrifugar a 14,000 rpm a 4º C /5 min.

8. Decantar la acetona y dejar secar.

9. Reconstituir la pastilla obtenida con Tris-HCl 1M pH 8.8 (aprox. 25 µl ) y conservar a -20º C hasta su

análisis mediante elecroforesis en poliacrilamida (SDS-PAGE).

10. Añadir 5 µl de buffer de corrida. Si se va a efectuar simultáneamente SDS-PAGE y Western blot,

añadir 50 µl de Tris + 10 µl de buffer de corrida. Tomar 30 µl para el SD-PAGE y 30 µl para el

western blot.

3RA. SESIÓN

1. Analizar el precipitado bacteriano obtenido mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-

PAGE) al 10%. Efectuar el SDS-PAGE de la siguiente manera:

2. Preparar las soluciones necesarias para efectuar la elecroforesis con base al anexo 4ª.

3. Montar la cámara de electroforesis con base en las indicaciones del fabricante (Anexo 4b).

4. Hacer una marca a la altura 1 cm por debajo de donde llegan los bordes del peine que se usa como

molde para hacer los carriles.

5. Verter el gel separador que se prepara de la siguiente manera:

Efectuar la mezcla A*1 (gel separador) para preparar el gel separador a una concentración del 10%:

Gel separador

Reactivo Volumen (ml)

Buffer Tris-Cl/SDS pH 8.8 3.0 Solución de acrilamida-bisacrilamida 3.96 Agua destilada 5.08 TEMED 0.06 Persulfato de amonio al 12.5%

Para preparar el persulfato de amonio (PSA), disolver

18.75 mg en 150 l de agua (1 gel) destilada o 31.25

mg en 250 l de agua destilada (2 geles).

0.12

6. Luego de verter la mezcla A entre los cristales para hacer el gel, completar hasta el borde de los

cristales con agua desionizada y dejar en reposo durante 30 min. Luego de este tiempo, desechar el

agua por inversión y añadir la mezcla B (gel concentrador) la cual se prepara de la siguiente manera: Gel concentrador

Reactivo Volumen (ml)

Amortiguador Tris-Cl/SDS 6.8 1.0

Acrilamida-bisacrilamida 1.5 ml

Agua desionizada 3.0

TEMED 0.04 ml

PSA 0.08 ml

*1 Durante la preparación de este reactivo, mezclar primero el buffer 8.8 + acrilamida + agua; posteriormente añadir el TEMEd y el PSA e inmediatamente verter ya que al añadir los agentes polimerizantes comienza la gelificación

31

7. Llenar con la mezcla del gel concentrador hasta el borde de los cristales e introducir el peine que sirve

de molde para hacer los carriles.

8. Dejar en reposo durante 30 min

9. Añadir a la cámara regulador de corrida 1X (diluir del regulador de corrida 10X).

10. Obtener mediante precipitación con ácido tricloroacético, las proteínas presentes en el sobrenadante

de un cultivo de toda la noche

11. Preparar las muestras mezclando 1 y 2 g de las proteínas bacterianas en sendos tubos eppendorf,

completar a un volumen de 10 l con PBS y añadir 3 l de regulador de corrida con -

mercaptoetanol.

12. Depositar en el carril 1 el marcador de peso molecular y en los carriles siguientes las muestras de

proteínas bacterianas.

13. Cerrar la cámara y conectar a la fuente de poder. Correr 30 minutos a 60 V y posteriormente aumentar

el voltaje a 100 V.

14. Dejar correr hasta que comiencen a salir las muestras y detener el corrimiento.

15. Sacar el gel y teñir con azul de Coomasie durante 20 min.

16. Desteñir con solución de metanol-ácido acético-agua hasta definir las bandas proteicas

17. Documentar en un scanner la imagen del gel colocándolo entre dos acetatos y guardar la imagen

(preferentemente con extensión jpg).



Geles de acrilamida. La

acrilamida gelificada (no en

solución) es inocua.

Depositarlos en un contenedor

como bolsa de plástico

Bolsa de plástico

Puntas de plástico

contaminadas

Depositarlas en un contenedor

adecuado

Recipiente de plástico

CUESTIONARIO

1. ¿Qué peligro conlleva la solución de acrilamida-bisacrilamida?

2. ¿Cuál es la utilidad de los geles de poliacrilamida de doble dimensión?

3. ¿Qué otras técnicas de tinción de proteínas pueden emplearse para teñir las proteínas separadas en

geles de poliacrilamida?

4. ¿Qué otras técnicas existen para precipitar proteínas?

5. ¿Cuál es el efecto del ácido tricloroacético para que puedan precipitar las proteínas bacterianas?


Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage

T4. Nature 227:680-685.


. ed.

CSHL Press.

32

Anexo 4A.

Solución de acrilamida-bisacrilamida

Acrilamida 60 g

Bis-acrilamida 1.74 g

Agua c.b.p. 200 ml

Con guantes de látex y cubrebocas, pesar los reactivos y disolver uno a uno, aforar a 200 ml con agua destilada.

Regulador de corrida 10x, pH 8.3

Glicina 144.1 g

Tris base 30.2 g

SDS grado electroforético 10.0 g

Agua c.b.p. 1000 ml

Pesar los reactivos (usando guantes y cubrebocas), se disuelven teniendo atención especial con el SDS, el cual debe

disolverse agregando poco a poco impidiendo la formación de grumos. Una vez disueltos los reactivos, se agrega el

agua (sin llegar al volumen final) y se ajusta el pH, se afora a 1000 ml ocn agua.

Regulador de muestra

Tris HCl 394 mg

SDS 1 g

Azul de bromofenol 50 mg

Glicerol 6.25 ml

Agua c.b.p. 25 ml

Añadir el Tris HCl en 15 ml de agua destilada y ajustar el pH a 6.8; luego añadir los demás reactivos, aforar a 25

ml con agua destilada. Añadir -mercaptoetanol al 5% justo antes de usarse.

1425 l de regulador + 75 l de -mercaptoetanol

Amortiguador Tris-Cl/SDS 4x, pH 8.8

Tris base 18.165 g

SDS 20% 2 ml o 0.4 g

Agua 100 ml

Teniendo preparado previamente el SDS al 20% (grado electroforético), pesar el Tris base y disolver, agregar el

SDS y ajustar el pH. Aforar a 100 ml con agua y filtrar en millipore (typo GS 0.2 m). Almacenar en refrigeración.

Colorante de Fairbanks

Azul de Coomasie R-250 0.25 g

Isopropanol 125 ml

Ácido acético glacial 50 ml

Agua c.b.p. 500 ml

En la campana extractora y usando guantes de látex, disolver el colorante en isopropanol. Añadir el ácido acético

glacial, aforar a 500 ml con agua y filtrar a través de papel Whatman no. 1. Guardar a temperatura ambiente.

Solución desteñidora

Áciod acético glacial 70 ml

33

Metanol 50 ml

Agua 880 ml

Amortiguador Tris-Cl/SDS 4x, pH 6.8

Tris base 6.055 g

SDS 20% 2 ml o 0.4 g

Agua 100 ml

Se prepara de forma idéntica al regulador de pH 8.8.

Colorante de Fairbanks

Azul de Coomasie R-250 0.25 g

Isopropanol 125 ml

Ácido acético glacial 50 ml

Agua c.b.p. 500 ml

En la campana de extracción y usando guantes de látex, disolver el colorante en isopropanol. Añadir el ácido

acético, aforar a 500 ml con agua y filtrar a través de papel Whatman No. 1. Guardar a temperatura ambiente.

Solución desteñidora

Acido acético glacial (7%) 70 ml

Metanol (5%) 50 ml

Agua (88%) 880 ml

34

Anexo 4b. Montaje de la cámara de electroforesis

Desempaque.

Por favor verifique que la unidad venga completa con los siguientes componentes:

Kit de gel sencillo mini-vertical

Unidad de electroforesis mini-vertical

Cubierta de seguridad con indicadores de poder DC acoplados

ganchos blancos de presión 2ea GPC-0003

ganchos blancos de presión 3ea GPC-0002

cepillo 1ea

1 juego de vidrios

1 juego de espaciadores

1 tira de hule

Kit de gel dual mini-vertical:

Unidad de electroforesis dual mini-vertical

Cubierta de seguridad con indicadores de poder DC acoplados

ganchos blancos de presión, 4ea GPC-0003m

ganchos blancos de presión, 6ea GPC-0002m

cepillo 2ea

2 juegos de vidrios

2 juegos de espaciadores

2 tiras de hule

Cable a la fuente de

poder

Cubierta de seguridad

gancho peine

Placas de vidrio

espaciador

Puerto de salida

para congelante Puerto de entrada para congelante

Unidad de electroforesis

35

Preparación de la unidad mini-vertical

Ponga la unidad mini-vertical sobre una superficie nivelada. Si se necesita la unidad dual mini-vertical y se

requiere usar la opción de enfriamiento interno, inserte el tubo en la entrada (parte alta del puerto) y los puertos de

salida del refrigerante (puerto inferior) a la bomba. Verifique que el peine, el espaciador y el gel tengan el mismo

grosor.

Preparación y limpieza de los vidrios.

Lave ambos vidrios con un detergente como el SDS al 1%, seguido de un enjuague con H2O destilada. Seque al

aire o use un paño libre de impurezas. Rocíe las superficies internas con etanol al 95% de y seque con un paño

limpio.

Ensamble del gel mediante las juntas de hule.

Sostenga la placa de vidrio rectangular (la de esquinas redondeadas en su parte inferior), rodee el borde con el hule.

Nota: Un lado de la “U” de hule es lisa y el otro lado tiene un tubo que actuará como sujetador alrededor de los

espaciadores.

36

1. Cuando fije el hule alrededor de las esquinas redondeadas, asegúrese de que las orillas del

hule estén alineadas con las esquineros redondeados del vidrio. Una vez que el hule se ha

fijado en los bordes inferiores y las esquinas, únicamente manipule el cristal por ese lado.

2. Coloque el vidrio con el hule con el lado del tubo hacia arriba y extienda la base de la placa de

vidrio aproximadamente a ¾ de pulgada. Coloque los sujetadores a sobre el lado interno del

hule, asegúrese de que la parte final de la esquina redondeada de cada espaciador tenga la cara

hacia la base de la placa de vidrio, siguiendo su radio.

37

3. Coloque la otra placa de vidrio (de abajo hacia arriba) y verifique que los bordes del hule

estén alineados. Después, colocar pinzas en la parte inferior y a los costados.

4. Coloque las placas sujetadas sobre la superficie de trabajo, y nivele presionando las placas

hacia abajo hasta topar con la base del gancho. Asegure ambos lados con pinzas y verifique

que el hule se encuentra alineado entre las placas de vidrio para asegurarse de que están

selladas.

5. Efectúe primero una prueba con agua destilada para detectar fugas.

38

6. Añada la solución de acrilamida usando una jeringa o pipeta hasta la 2 cm por debajo de la

marca donde llega el peine. Complete con agua destilada o SDS al 1% hasta el borde para

nivelar la acrilamida. Esperar 30 min para la polimerización.

7. Luego de la polimerización, elimine el agua y agregue el gel concentrador. Inserte el peine y

deje polimerizar aprox. 20 min.

8. Retire con cuidado las pinzas y después la banda selladora de hule sin separar las placas. Si el

gel no se usa de inmediato, conserve a 4°C (el gel es estable aproximadamente un mes).

Corrimiento del gel.

1. Sujete la placa de fijación a la unidad con muescas o revestimientos más pequeños opuestos hacia el

embalse de tope superior. Si usa un gel pre-fabricado almacenado a 4 °C, deje que se alcance la

temperatura ambiente. Use abrazaderas blancas pequeñas para sujetar la placa fijada a la unidad,

sujetando cada uno de los lados del sandwich. Si se usa duplicado, repetir lo anterior.

39

2. Agregue el regulador recién preparado en la parte superior e inferior de la cámara. Usando una pipeta

o una jeringa, llene completamente por fuera de los pozos. Hierva las muestras en baño maría durante

5 min y coloque inmediatamente en hielo. Cargue las muestras. Si los carriles externos no contienen

muestra, es recomendable que se usen marcadores de peso molecular.

3. Coloque la tapa de seguridad.

4. Conecte los cables a la fuente de poder, coincidiendo los colores rojo con rojo y negro con negro.

Comiemce la separación por electroforesis, aplicando 60 V durante 30 min y luego continúe a 100 V

hasta que comience a salir el colorante.

Remoción del gel.

1. Apague la fuente de poder y desconecte los cables. Quite la tapa de seguridad de la unidad, colocando

los pulgares en los postes blancos (al lado de los conectores rojo y negro), empujando hacia abajo

mientras se levanta con los dedos. NO tirar en los cables eléctricos.

2. Quite los cables de cada lado y drene el buffer superior e inferior de la cámara. Quite el gel sandwich

y separe cuidadosamente cerciorándose de que el resto del gel quede unido a una placa. Teñir y fijar

de acuerdo al método requerido.

40

PRACTICA No 12 “BACTERIAS LÁCTICAS”

INTRODUCCION

Las bacterias lácticas se identifican como cocos o bacilos Grampositivos, no esporulados, fermentadoras de

carbohidratos con producción de ácido láctico, tolerante a los ácidos, catalasa y oxidasa negativos y

microaerofílicos. Los géneros Streptococcus, Leuconostoc y Lactobacillus conforman principalmente este grupo

microbiano; este tipo de organismos son nutricionalmente exigentes ya que requieren además de carbohidratos,

aminoácidos y factores de crecimiento. Se pueden aislar de vegetales y de varios alimentos crudos como

procesados. En los humanos estas bacterias colonizan en el intestino, cavidad oral y la vagina.

OBJETIVO

A partir de un alimento procesado, aislar e identificar morfológica y bioquímicamente a las bacterias lácticas

y resaltar su importancia.

PROCEDIMIENTO

1RA. SESIÓN

1. Preparar 4 placas con medio de APN (anexo 13).

2DA. SESIÓN

1. Pesar 10 g de una muestra de queso. Resuspender en 90 ml de agua destilada estéril.

2. Inocular 0.1 ml de la suspensión y sembrar por superficie con varilla de vidrio acodada en el medio APN.

3. Incubar a 30º C durante 72 h en atmósfera parcial de CO2 (usar el método del frasco con vela).

4. Registrar la morfología colonial, y efectuar tinción de Gram, prueba de catalasa y oxidasa a partir de las

colonias aisladas.

5. Esterilizar todo el material en autoclave. Lavar y entregar al laboratorista.





docente


laboratorio

CUESTIONARIO

1. Investigue que otros medios de cultivo se pueden emplear para el aislamiento y estudio de bacterias

lácticas.

2. ¿Cuáles son los aspectos benéficos de la utilización de estos microorganismos para la elaboración de

productos como el yogurt, queso madurado, etc.?

3. ¿Qué efectos benéficos tienen estos organismos a nivel intestinal?

4. Esquematice las vías metabólicas que estos organismos utilizan para fermentar los carbohidratos.

5. ¿Qué medidas de control existen para evitar la alteración en la composición de los alimentos por este tipo

de microorganismos?


Amador López, R., Fernández Rendón, E., y R. Rodríguez Montaño. 1993. Manual de laboratorio de

microbiología sanitaria. 2da. Ed. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico

Nacional. México, D.F.

41

Fernández Escartín, E. 1981. Microbiología sanitaria. Agua y alimentos. Vol. 1. Universidad de

Guadalajara. ANUIES-SEP. México.

Pham M., Lemberg, DA., and AS Day. 2008. Probiotics: sorting the evidence from the myths. Med. J.

Aust. 188:304-8.

Anexo.

Medio de APN

Peptona 10.0 g

Leche peptonizada 10.0 g

Extracto de levadura 10.0 g

Glucosa 7.5 g

MgSO4 7 H2O 0.575 g

MnSO4 4 H2O 0.05 g

Tween 80 1.0 g

Agar 15.0 g

Disolver los ingredientes en agua destilada a 50º C y ajustar el pH a 5.5 y completar el volumen a 570

ml con agua destilada. Distribuir en volúmenes de 97 ml y esterilizar en autoclave. Dejar enfriar a 50º

C y añadir a cada matraz 1 ml de cada una de las siguientes soluciones: nitrito de sodio al 6% recién

preparada y esterilizada por filtración; actidiona al 0.1% y sulfato de polimixina B al 0.03%. Mezclar

bien y utilizar.

Manual micro avanzada 2012

Education

Transcript of Manual micro avanzada 2012