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RQ-CMV_manual_s20130109

Manual de Usuario

REALQUALITY RQ-CMV

v.2.1 Referencia RQ-S09

Kit para la detección y cuantificación del Citomegalovirus (CMV) mediante

PCR a tiempo real

0123

RQ-CMV_manual_s20130109 1

1 INFORMACIÓN DEL PRODUCTO 3

1.1 Interés del test 3

2 CONTENIDO DEL KIT 4

3 ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS 5

4 PRECAUCIONES DE USO 6

5 NORMAS DE SEGURIDAD 8

5.1 Normas generales de seguridad 8

5.2 Normas de seguridad relacionadas con el kit 8

6 MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO 9

6.1 Reactivos 9

6.2 Equipos 9

6.3 Material desechable 10

7 INTRODUCCION 11

8 PRINCIPIO DEL TEST 13

9 DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO 15

10 OBTENCIÓN, MANIPULACIÓN Y PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS 16

10.1 Muestras Citológicas 16

10.2 Líquido seminal 16

10.3 Orina 17

10.4 LCR (Líquido cefaloraquideo) 17

10.5 Sangre 17


11 PROTOCOLO 19

11.1 Extracción ADN 19

11.2 Control Interno 19

11.3 Programación del Instrumento 20

11.3.1 Programa de Amplificación y lectura de fluorescencia 20

11.3.2 Programación de muestras y controles 21

11.4 Preparación de la Mezcla de Reacción 22

11.5 Análisisde resultados 23

11.5.1 Verificar el ensayo 23

11.5.2 Interpretación de los resultados 25

11.6 Problemas y soluciones 27

12 LIMITACIONES DEL DISPOSITIVO 29

13 RENDIMIENTO DEL DISPOSITIVO 29

13.1 Especificidad Analítica 29

13.2 Sensibilidad Analítica: límite de detección 29

13.3 Sensibilidad Analítica: rango de linealidad 30

13.4 Reproducibilidad 30

13.5 Especificidad diagnóstica 31

13.6 Sensibilidad diagnóstica 31

13.7 Precisión 31

14 BIBLIOGRAFIA 32

14.1 Páginas Web 32

15 PRODUCTOS RELACCIONADOS 33


1 INFORMACIÓN DEL PRODUCTO

1.1 Interés del test

El kit REALQUALITY RQ-CMV es un kit IVD para la detección del ADN del Citomegalovirus (CMV). Si se usa junto al kit REALQUALITY RQ-CMV STANDARD, referencia RQ-10-ST, permite cuantificar el ADN viral presente en la muestra. El test se basa en la amplificación mediante PCR a tiempo real del ADN extraído de muestras clínicas humanas. Este test para diagnostico in vitro para la detección y cuantificación de CMV es una herramienta auxiliar para el diagnóstico y la monitorización de infecciones por CMV. Se recomienda el uso del kit según las instrucciones incluidas en el mismo. Este manual se refiere al siguiente producto: REALQUALITY RQ-CMV Kit para la detección y cuantificación de Citomegalovirus (CMV) mediante PCR en tiempo real.

Este producto está en conformidad con la Directiva 98/79/CE (Anexo II Lista B) en el diagnóstico in vitro médico (marcado CE).

Contiene todos los reactivos necesarios para la PCR en tiempo real. Referencia Producto PKG RQ-S09-48 REALQUALITY RQ-CMV 48 tests RQ-S09-96 REALQUALITY RQ-CMV 96 tests


2 CONTENIDO DEL KIT

BOX RG ALMACENAR ENTRE -30 °C Y -20 °C

DESCRIPCION CONTENIDO

TUBO (T) o COLOR

DEL TAPON

24 tests 48 tests 96 tests

Mastermix conteniendo reactivos de PCR

CMV Real time mix

Violeta 1 × 540 µL 2 × 540 µL 4 × 540 µL

BOX PC ALMACENAR ENTRE -30 °C Y -20 °C

DESCRIPCION CONTENIDO

TUBO (T) o COLOR

DEL TAPON

24 tests 48 tests 96 tests

Positive control CMV (fragmentos de ADN del genoma de CMV)

PC CMV

Violeta 1 × 50 µL 1 × 50 µL 2 × 50 µL

Positive control BG (fragmentos del ADN del gen de laβ-globina)

PC BG

Azul 1 × 50 µL 1 × 50 µL 2 × 50 µL

Internal control (fragmentos del ADN del gen de la β-globina)

IC 2 × 125 µL 4 × 125 µL 8 × 125 µL


3 ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS

Cada componente del kit debe almacenarse según las condiciones que se indican en la etiqueta de cada caja:

Box (caja) RG Almacenar entre -30 °C y -20 °C Box (caja) PC Almacenar entre -30 °C y -20 °C

Si se almacenan a la temperaturarecomendada, los reactivos son estables hasta la fecha que se indica en la caja. Evitar la degradación de la mezcla de reacción de CMV! La mezclaNO debe someterse a más de dos ciclos de descongelación / congelación. Si se realizan ensayos con un bajo número de muestras, se recomienda alicuotar el reactivo de antemano. La mezcla de reacción de CMV contiene moléculas fluorescentes y se debe conservar protegido de la luz directa. Con el fin de evitar la degradación de los controles positivo y del control interno NO dejar que pasen por más de tres ciclos de descongelación / congelación. Si se realizan ensayos con un bajo número de muestras, se recomienda alicuotar los controles de antemano.


4 PRECAUCIONES DE USO

� El kit debe ser utilizado sólo como ensayo IVD y ser manejado por técnicos cualificados que hayan sido entrenados en técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico.

� Antes de utilizar el kit lea el manual de usuario detenidamente y por completo.

� Mantenga el kit protegido del calor.

� Por favor, preste especial atención a la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de cada caja. No utilice ninguna parte del kit pasada la fecha de caducidad.

� Los reactivos presentes en el kit deben ser considerados como una unidad indivisible. No los use por separado o en combinación con reactivos de otros kits o lotes.

� La mezcla de reacción del CMV debe descongelarse a temperatura ambiente antes de su uso. Mezclar la solución invirtiendo el tubo varias veces, después centrifugar brevemente. NO USAR VORTEX!

� Los controles positivos y el control interno deben descongelarse a temperatura ambiente antes de su uso. A continuación, centrifugar brevemente.

� Trabajar con rapidez, especialmente si se preparan las reacciones a temperatura ambiente. Si es posible, trabajar en hielo o en un bloque de refrigeración.

En caso de cualquier duda sobre las condiciones de almacenamiento, la integridad de la caja o la aplicación del método, por favor póngase en contacto con el equipo de soporte técnico de AB ANALITICA:

[email protected] Para la amplificación de ácido nucleico, el usuario debe tomar las siguientes precauciones: � El uso de puntas de pipeta con filtro.

� Con el fin de evitar la contaminación, almacenar las muestras biológicas, el ADN extraído, los productos de amplificación, los controles internos y positivos incluidos en el kit, por separado de la mezcla de reacción de CMV. Establecer áreas de pre-y post-PCR. No comparta los instrumentos o consumibles (pipetas, puntas, tubos, etc.) entre esas áreas.


� Cambie los guantes con frecuencia.

� Lavar las superficies de trabajo con hipoclorito de sodio al 5%.


5 NORMAS DE SEGURIDAD

5.1 Normas generales de seguridad

� Use guantes desechables al manipular los reactivos y muestras clínicas. Lavarse las manos después del procedimiento.

� No pipetear con la boca.

� No hay ningún método conocido de diagnóstico que pueda garantizar la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, trate todas las muestras clínicas como potencialmente infecciosas y actúe en consecuencia.

� Todos los dispositivos que entran en contacto con las muestras clínicas deben ser considerados contaminados y eliminarse como tal. En caso de derrame accidental de muestras, limpiar con hipoclorito de sodio al 10%.

El material que se utiliza para limpiar, deben eliminarse en contenedores especiales para los productos contaminados.

� Las muestras clínicas, materiales y productos contaminados deberán ser descontaminados antes de su eliminación.

Se recomienda utilizar uno de los siguientes métodos de descontaminación:

a) inmersión durante 30 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 5 % (1 volumen de solución de hipoclorito de sodio al 5 % en 10 volúmenes de fluido contaminado).

b) autoclavar a 121 ° C durante al menos 2 horas (ATENCIÓN, no autoclavar soluciones que contengan hipoclorito de sodio!).

5.2 Normas de seguridad relacionadas con el kit

Los riesgos en la utilización de este kit están relacionados con los componentes individuales.

Componentes peligrosos: ninguno.

La ficha de seguridad (MSDS) de este dispositivo está disponible a petición.


6 MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO

6.1 Reactivos

� Reactivos para la extracción de ADN

� Agua estéril libre de ADNasa- y RNAsas

� Para análisis cuantitativo: REALQUALITY RQ-CMV STANDARD, referencia RQ-10-ST

6.2 Equipos

� Cabinas de flujo laminar

Usar durante la preparación de la mezcla de amplificación con el fin de evitar la contaminación. Se recomienda el uso de una cámara de flujo laminar diferente cuando se añade el ADN extraído y los controles positivos / estándares de cuantificación.

� Micropipetas (rango: 0,5 - 10 µL; 2 - 20 µL; 10 - 100 µL; 20 - 200 µL; 100 - 1000 µL);

� Microcentrífuga (máx. 12.000 - 14.000 rpm)

� Centrífuga de placas (opcional)

� Instrumento de PCR en tiempo real

Este kit ha sido validado para usar en:

� Applied Biosystems 7500 Fast/7500 Fast Dx Real-Time PCR System (ABI 7500 Fast/Fast Dx – Applied Biosystems)

� Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (ABI 7300 – Applied

Biosystems)

� Applied Biosystems StepOne/StepOnePlus™ Real-Time PCR System (ABI StepOne/StepOnePlus – Applied Biosystems)

� LightCycler® 480 Real-Time PCR System version II (LC 480 – Roche)

� LightCycler® 2.0 Real-Time PCR System (LC 2.0 – Roche)

� Dx Real-Time System (Bio-Rad Dx – Bio-Rad)

� CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad CFX96 – Bio-Rad)


El kit se puede utilizar en instrumentos que permiten 25 µl de volumen de reacción y que pueden leer la fluorescencia en fluoróforos FAM y JOE. La fluorescencia JOE también se pueden leer en los canales designados para CY3, HEX, etc. La compatibilidad del kit con otros instrumentos disponibles en el mercado se ha afirmado. Para más información sobre la compatibilidad de kit, póngase en contacto con el equipo de soporte técnico de AB ANALITICA.

6.3 Material desechable

� Guantes sin talco desechables

� Puntas de pipeta con filtro estériles y desechables (rango: 0,5 - 10 µL; 2 - 20 µL; 10 - 100 µL; 20 - 200 µL; 100 - 1000 µL);

� Placas de 96 pocillos para PCR en tiempo real con una película adhesiva óptica, tubos de 0,1 - 0,2 mL con tapones ópticos o capilares de vidrio.


7 INTRODUCCION

La comprensión de la biología y la patogénesis de infecciones por citomegalovirus (CMV) han crecido rápidamente en los últimos años, debido al desarrollo de técnicas de cultivo celular y las técnicas de la biología molecular. Se ha observado que la presencia de la infección en la población general ha sido constantemente alta (40 - 100 %), mientras que el número y la variedad de infecciones sintomáticamente evidentes (enfermedad por citomegalovirus) han mostrado un aumento reciente y significativo. Esto se debe a un aumento en el número de sujetos inmunocomprometidos o inmuno-inmaduros(recién nacidos prematuros o pacientes con trasplantes, tumores malignos, esplenectomía, transfusiones, infecciones por VIH, y las personas de edad avanzada) (Vancikova Z. y P Dvorak. 2001). En sujetos sanos, la infección por CMV suele ser asintomática. El citomegalovirus es un virus perteneciente a la familia Herpesviridae. Es ubicuo. Aunque el CMV infecta a varias especies, es altamente específico en humanos. El virus tiene un ciclo de replicación muy lento y produce cuerpos de inclusión nucleares y citoplasmáticas. Su genoma es bicatenario, lineal y mide alrededor de 240 kb. Durante el proceso de infección, una ADN polimerasa específica de alfavirus que está asociada con una proteína altamente inmunogénica con actividad exonucleasa 3'-5’, se sintetiza en la célula huésped. El genoma de CMV puede sobrevivir en la célula huésped en una etapa latente (con posibilidad de ser reactivado más tarde) o induce una infección persistente o un ciclo lítico. Durante una infección productiva la expresión secuencial del genoma viral se mide por los genes de tres categorías diferentes: genes inmediato temprano (IE o alfa), genes tempranos (E o beta) y genes tardíos (L o gamma) (Mocarski ES, 1996). En los pacientes infectados por CMV el virus se replica en diversos órganos: pulmón, hígado, riñón y tracto gastrointestinal. Durante la replicación se excreta continuamente a través de la saliva, leche materna, esperma, orina, secreciones cervicales y vaginales, lágrimas, sangre y heces. Las áreas / órganos que se ven afectados depende del origen de la inmunodeficiencia (Tab. 1). CMV tiene efecto citopático: causa daños del tejido con formación de células citomegálicas que contienen inclusiones intranucleares.


Tab. 1: Enfermedad por CMV en pacientes inmunocomprometidos (Razonable and Emery, 2004)

Síntomas Recién Nacido

SOT HSCT SIDA

Fiebre o hepatitis + ++ + + Síntomas gastrointestinales + ++ + Retinitis + + + ++ Neumonia + ++ Encefalopatia ++ + Sordera ++ Poliradiculopatia + Síntomas de la enfermedad de Adison

+

Rechazo a trasplante + Aterosclerosis + Muerte + + +

SOT: Trasplante Órgano Solido; HSCT: Trasplante Células Madre Hematopoyéticas; SIDA: Síndrome Inmunodeficiencia Adquirida.

En el pasado, los métodos estándar de diagnóstico de CMV incluían diversas técnicas de cultivo celular para el aislamiento del virus y para la detección del antígeno pp65 en leucocitos de sangre periférica (Razonable et al., 2002a). Desde que la terapia se volvió fundamental pare prevenir la reactivación de la enfermedad en determinados sujetos, el uso de métodos más sensibles y reproducibles, como las técnicas moleculares, se volvió necesario. Las técnicas cuantitativas basadas en PCR en tiempo real están reemplazando las técnicas de PCR estándar. En el contexto clínico se emplean para:

� Identificación de pacientes con el riesgo de desarrollar la enfermedad por citomegalovirus (Emery et al, 2000;.. Humar et al, 1999)

� Diagnóstico rápido de los pacientes con la enfermedad por citomegalovirus

� Monitorización de la terapia antiviral (Roberts et al, 1998.)

� Determinar el riesgo de recaída de la enfermedad (Sia et al., 2000)

Además, algunos estudios han demostrado que un aumento en la carga viral puede ser un marcador temprano de resistencia a los fármacos antivirales (Emery y Griffiths, 2000).


8 PRINCIPIO DEL TEST

El método de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) fue el primer método de amplificación de ADN descrito en la literatura (Saiki RK et al., 1985). Se puede definir como una reacción de amplificación in vitro de una parte específica de ADN (secuencia diana) por una ADN polimerasa termoestable. Esta técnica ha demostrado ser un instrumento valioso y versátil de la biología molecular: su aplicación contribuyó a un estudio más eficiente de los nuevos genes y su expresión y ha revolucionado, por ejemplo, los campos del diagnóstico de laboratorio y de la medicina forense. La PCR en tiempo real representa un avance de esta tecnología de investigación básica, proporcionando la posibilidad de determinar el número de moléculas de ADN amplificados (amplicones) durante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el sistema manual, el seguimiento de los amplicones se basa en los cebadores/sondas marcadas con moléculas fluorescentes. Estas sondas contienen un fluoróforo “reporter” y una molécula (“quencher”) que bloquea la fluorescencia específica del “report”. La emisión fluorescente del “report” se determina por su distancia al “quencher”. Mientras una sonda no estéunida a la secuencia diana, el“report” y el “quencher” están muy próximos y la fluorescencia del “report” está bloqueada. Tras la unión a una secuencia diana, el “report” y el “quencher” se separan y el “report” puede emitir luz fluorescente que a su vez puede ser detectada. Normalmente, una reacción de PCR en tiempo real consta de 30 a 50 ciclos de amplificación. Un termociclador equipado con el correspondiente detector puede registrar la fluorescencia en cada ciclo, por lo tanto monitorizar la reacción en "tiempo real". El ciclo en el cual la fluorescencia del amplicón se vuelve claramente distinguible del fondo es específico para cada reacción y se correlaciona con la concentración inicial de la secuencia diana. Este ciclo se denomina ciclo umbral (Ct). El valor Ct se utiliza para determinar la concentración de la molécula diana con la ayuda de una curva estándar. Tal curva estándar se crea amplificando soluciones con concentraciones conocidas de la secuencia diana (Figura 1).


Fig. 1: Curva estándar creada a partir de estándares de concentración conocida.

La principal ventaja de la PCR en tiempo real en comparación con las técnicas convencionales de amplificación es la posibilidad de realizar una amplificación semi-automatizada. Esto significa que se puede evitar pasos adicionales necesarios para visualizar el producto de amplificación y se reduce el riesgo de contaminación por manipulación posterior a la PCR.


9 DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO

El kit REALQUALITY RQ-CMV kit, referencia RQ-S09, es un ensayo IVD para la detección de citomegalovirus (CMV) por la amplificación de la región del gen UL122 (IE2, el exón 4).

Si se usa en combinación con el producto REALQUALITY RQ-CMV STANDARD, referencia RQ-10-ST, permite la cuantificación de moléculas de ADN viral en la muestra por medio de una curva estándar de cuatro puntos (102 a 105 copias de ADN viral por reacción).

Los controles positivos proporcionados en este kit contienen fragmentos de ADN que corresponden a la región del gen amplificado. Como tal, estos controles no son perjudiciales para el usuario.

El kit está diseñado para utilizar un control interno que permite detectar la inhibición de la reacción de PCR, controlar el proceso de extracción, así como identificar muestras falsos negativos. El control interno (el gen de la β-globina) se amplifica en multiplex con el patógeno diana. En las muestras celulares se amplifica la β-globina humana endógena. Para las muestras acelulares el control interno se añade como ADN recombinante que contiene la respectiva región del gen de la β-globina.

El kit incluye una mezcla de reacción lista para usar que contiene todos los reactivos necesarios para la PCR así como los componentes enumerados a continuación.

� ROX ™ es un colorante inerte que exhibe propiedades fluorescentes estables a lo largo de todos los ciclos de amplificación. En algunos instrumentos Real-Time PCR (Applied Biosystems, Stratagene etc) se utiliza para la normalización, con el fin de compensar las diferencias entre las muestras debido a los errores de pipeteo o limitaciones del instrumento.

� El sistema dUTP / UNG previene la contaminación de amplificaciones anteriores. Los dUTPs se utilizan para incorporar residuos de uracilo en el producto de amplificación durante la sesión de amplificación. Al principio de cada nuevo test, la enzima UNG degrada cualquier cadena de ADN simple o doble que contenga uracilo. De esta manera se eliminan todos los productos de amplificación de reacciones anteriores.


10 OBTENCIÓN, MANIPULACIÓN Y PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

El ADN de CMV puede ser extraído directamente de diversos fluidos biológicos, tales como líquido seminal, leche materna, secreciones vaginales y cervicales, saliva, suero, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR), etc que deben ser centrifugadas de antemano con el fin de obtener un pelletcon gran contenido en células. En algunos casos, el sobrenadante se almacena y se prueba también. Las muestras de PBL (leucocitos de sangre periférica) o PBMC (células mononucleares sanguíneas periféricas) requieren el aislamiento de leucocitos utilizando Ficoll o una lisis de los glóbulos rojos antes de la extracción de ADN. El ADN de sangre total o plasma se puede extraer sin tratamiento previo. El dispositivo in vitro fue probado en ADN extraído de sangre total, plasma, pellets de linfocitos, LCR, orina, frotis vaginales y cervicales, esputo, suero, capa leucocitaria y cultivo celular.

10.1 Muestras Citológicas

Las muestras cervicales y vaginales se obtuvieron usando un hisopo pequeño o cepillo estéril (cytobrush). El hisopo con las células recogidas ha de ser depositado en un recipiente estéril con un medio de transporte adecuado (por ejemplo, 1X PBS, solución fisiológica/isotónica). Conservar la muestra a +2 °C y +8 °C y extraer los ácidos nucleicos dentro de las 48 horas. Si la extracción no es factible dentro de 48 horas almacenar las muestras entre -30 °C y -20 °C. En caso de que el número de células en una muestra seademasiado bajo, se centrifuga repetidamente antes de iniciar la extracción. Después de cada etapa de la centrifugación el pellet se resuspende en PBS estéril. Los ciclos de centrifugación/resuspensión también se pueden utilizar para eliminar el moco y las células rojas de la sangre.

10.2 Líquido seminal

El fluido seminal se recoge en un recipiente estéril y puede ser almacenado entre +2 °C y +8 °C durante varias horas (máximo durante la noche). Alternativamente, se puede congelar la muestra (s) después de la adición de


un medio compatible con el método de extracción de ácido nucleico que se va a utilizar.

10.3 Orina

La orina (min. 10 mL) debe ser recogida en un contenedor estéril y almacenada entre +2 °C y +8 °C por un max. de 24 horas antes de ser procesada.

10.4 LCR (Líquido cefaloraquideo)

El uso de diagnóstico molecular ha conducido a mejorar la caracterización y el diagnóstico de síndromes clínicos del sistema nervioso central asociados con una infección de CMV. En tal caso, el material de elección es el fluido cerebroespinal (CSF o líquido).

10.5 Sangre

La cuestión de si la sangre es la muestra más adecuada para el análisis de CMV es una cuestión de debate desde hace mucho tiempo. En 2002, se realizó un estudio (Razonable et al., 2002b) donde compararon 4 tipos de sangre (sangre total, plasma, PBL, PBMC) de 17 pacientes SOT (Trasplante de Órganos Sólidos) y pacientes TPH (trasplante de células madre hematopoyéticas). En este estudio, aunque todos los tipos de muestra se encontraron adecuados para el análisis de CMV, así como para el monitoreo de la terapia, el uso de muestras de sangre total aumentó la sensibilidad de la detección de CMV, en particular si el virus estaba presente en un bajo número de copias. Más tarde otras publicaciones confirmaron estos hallazgos (Weinberg et al., 2002, Cortez et al., 2003, Mengelle et al., 2003). Los IHMF (International Herpes Management Forum) recomiendan utilizar muestras de sangre total para la detección de CMV de pacientes trasplantados (Razonable y Emery, 2004). La toma de muestras debe seguir la rutina común, respetando todas las precauciones de esterilidad habituales (por ejemplo, transporte en cajas estériles sin medio de transporte). La sangre debe ser tratada con EDTA. Otros agentes anticoagulantes, como heparina, son fuertes inhibidores de la Taq polimerasa y puede perjudicar la PCR.


Guarde la sangre fresca entre +2 °C y +8 °C y extraer los ácidos nucleicos dentro de las 4 horas siguientes. Si la extracción no es factible dentro de 4 horas siguientes, almacenar las muestras entre-30 °C y-20 °C. Si el análisis se va a realizar en un pellet de leucocitos, utilizar la separación por gradiente de densidad (por ejemplo Ficoll-Hypaque) o lisis de los eritrocitos para aislar los leucocitos. Alternativamente, una capa leucocitaria puede prepararse directamente por centrifugación de la sangre a 3000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se pueden distinguirtres capas: la clara superior que es el plasma, la intermedia que es la capa leucocitaria y contiene los leucocitos concentrados y la capa inferior que contiene los eritrocitos.


11 PROTOCOLO

11.1 Extracción ADN

Para la extracción de ADN AB ANALITICA recomienda el kit QIAamp ADN Mini Kit y para la sangre total, el QIAamp ADN Blood Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). Consulte el manual del fabricante para obtener las instrucciones y los protocolos para los diferentes tipos de muestra. Este dispositivo IVD se pueden utilizar con el ADN extraído por métodos manuales y métodos automatizados de extracción. Para obtener más información acerca de la compatibilidad del kit con diferentes métodos de extracción por favor póngase en contacto con el servicio técnico de AB ANALITICA.

11.2 Control Interno

El kit incluye un control interno que consiste en un fragmento de ADN recombinante del gen de la β-globina (BG). El uso de este control se recomienda para el análisis de muestras acelulares. Permite verificar sea el procedimiento de extracción que una eventuale inhibición de la reacción de amplificación. Las pruebas de estandarización del control interno se realizó añadiendo 10 µL de control interno a la muestra y eluyendo en un volumen de 60 µL. Si el sistema de extracción utiliza un volumen de elución final diferente, ajustar el volumen de control interno que se añade a la muestra, en consecuencia. Para el correcto uso del control interno siga las instrucciones proporcionadas por el fabricante del sistema de extracción. Para cualquier información adicional, por favor póngase en contacto con el servicio técnico de AB ANALITICA.


11.3 Programación del Instrumento

11.3.1 Programa de Amplificación y lectura de fluorescencia

Utilice el siguiente programa de amplificación en su instrumento:

Step Repeats Time (°C)

UNG Activation 1 1 02:00 50.0

Taq Activation 2 1 10:00 95.0

Amplification cycles 3 45

00:15 95.0

01:00 60.0 *

* Paso de detección de fluorescencia

Los fluoróforos que se leerán son:

� FAM para CMV

� JOE para BG

Seleccionar los dos canales de detección en el termociclador de PCR a tiempo real:

ABI 7500 Fast/7500 Fast Dx* ABI 7300* ABI StepOne/StepOnePlus*

Name Reporter Dye Quencher Dye

CMV FAM None

BG (Control Interno) JOE None

LC 480

Name Fluorophore Filter

CMV FAM 465 - 510

BG (Control Interno) JOE 533 - 580

LC 2.0

Name Fluorophore Channel

CMV FAM 530

BG (Control Interno) JOE 560

Bio-Rad Dx Bio-Rad CFX96

Name Fluorophore

CMV FAM

BG (Control Interno) JOE

* Para instrumentos que requieran una referencia pasiva (e.j. Applied Biosystems, Stratagene) aseguresé de seleccionar ROX para todos los pocillos que se van a usar.

Seleccionar el volumen final de reacción.


11.3.2 Programación de muestras y controles

Configurar las muestras, control (es) y estándares (si es necesario) en el software del instrumento. Nombre cada muestra, control y estándar en consecuencia.

Tenga cuidado en utilizar la misma posición/orden para sus muestras, controles y estandándaresque para sus muestras reales.

Si desea realizar un análisis cuantitativo, introducir las concentraciones de los estándares de CMV (102, 103, 104 y 105 copias del genoma viral / reacción [c/rx]).

Si prefiere obtener resultados de la cuantificación encopias del genoma viral por ml de muestra clínica (c/mL) necesita calcular e introducir las concentraciones delosestándares en función de los parámetros de su extracción. Consulte la tabla siguiente para ver ejemplos.

STANDARD

Parámetros de Extracción

Ejemplo 1 Vi = 200 µL Ve = 50 µL



STANDARD 1 102 c/rx 5 × 103 c/mL 6 × 103 c/mL 104 c/mL




Vi = Volumen inicial (volumen de la muestra utilizada para la extracción) Ve = Volumen de elución


11.4 Preparación de la Mezcla de Reacción

Descongele la mezcla de reacción de CMV. Después de la descongelación homogeneizar la mezcla invirtiendo el tubo varias veces. NO USAR VORTEX! Centrifugar brevemente.

Trabaje con rapidez. Si es posible trabaje en hielo o en un bloque de refrigeración y en una zona protegida de la luz directa.

Nota: Un análisis cuantitativo exige el kit REALQUALITY RQ-CMV, referencia RQ-10-ST.

Pipetear 20 µL de la mezcla de reacción de CMV en las posiciones correspondientes (pocillos de la placa de PCR, tubos, capilares, etc.) Asegúrese de preparar posiciones suficientes para todas las muestras, los controles positivos / estándares de cuantificación, así como el control negativo.

Pipetear 5 µL de ADN extraído, de control negativo (H2O estéril) o de los controles positivos / estándares de cuantificación en las posiciones correspondientes.

Nota: Descongelar, mezclar y centrifugar los controles/estándares antes de su uso.

Asegúrese de que no queden burbujas de aire en el pocillo / tubos / capilares y centrifugar a 4000 rpm durante 1 minuto.

Cargar las muestras en el instrumento asegurandose de que carga la placa / tubos / capilares correctamente.


11.5 Análisisde resultados

Después de la finalización de la PCR, ver el gráfico de análisis en escala logarítmica. Analizar los resultados de la amplificación por separado para CMV y el gen de β-globina (BG). Proceda de la siguiente manera:

11.5.1 Verificar el ensayo

Antes de interpretar los resultados de las muestras clínicas, es necesario verificar el ensayo de PCR. Evaluar los controles y / o la curva estándar de acuerdo con las siguientes tablas:

A. ANÁLISIS CUALITATIVO: Evaluando los controles

RESULTADOS INTERPRETACION

Control Positivo BG

Señal de amplificación en JOE

Control / PCR ha funcionado correctamente

No hay señal de amplificación en JOE

No hay amplificación del gen deBG Repetir el ensayo

Control Positivo

Señal de amplificación en FAM

Control / PCR ha funcionado correctamente

No hay señal de amplificación en FAM

No hay amplificación del AND de CMV Repetir el ensayo

CMV

Señal de amplificación en FAM y/o JOE

Contaminación Repetir el análisis

No hay señal de amplificación en ningún

canal Control / PCR ha funcionado correctamente

Solamente si todos los controles funcionan correctamente, el ensayo es adecuado para el análisis.


B. ANALISIS CUANTITATIVO: Evaluando los controles y la curva estándar

RESULT INTERPRETATION

Control Positivo BG

Señal de amplificación en JOE

Controles y PCR funcionan perfectamente

No hay señal de amplificación en JOE

No hay amplificación del gen de BG Repetir el ensayo

Control negativo

Señal de amplificación en FAM y/o JOE

Contaminación Repetir el análisis

No hay señal de amplificación en ningún

canal

Controles y PCR funcionan perfectamente

INSTRUMENTO PARAMETROS DE LA CURVA ESTANDAR

ABI 7300 ABI 7500 Fast/7500 Fast Dx ABI StepOne/StepOnePlus

Bio-Rad Dx Bio-Rad CFX96

-3,60 < slope < -3,10 R2 > 0,99

LC 480 -3,60 < slope < -3,10

LC 2.0 1,8 < Efficiency < 2,1

El ensayo puede analizarse y validarse si todos los controles funcionan correctamente y los parámetros de la curva estándar cumplen los rangos definidos.


11.5.2 Interpretación de los resultados

Si los controles cumplen los resultados esperados, continúe con la interpretación de los resultados de la muestra. Véase la tabla siguiente.

Diana BG

Diana CMV

INTERPRETACION

Ct (de amplificación) < 34 (para sangre total: Ct < 32) §

Señal de amplificación

Positivo para CMV

No hay señal de amplificación

Negativo para CMV

No hay señal de amplificación o Ct (de amplificación) > 34

(para sangre total: Ct > 32) §

Señal de amplificación

* Positivo para CMV

No hay señal de amplificación

No es adecuado para el análisis Repita la extracción de ADN

§ Estos valores de Ct se refieren a una extracción de ADN a partir de 200 µl de muestra clínica y un volumen de elución final de 50 µL.\

* ATENCIÓN! Este ensayo ha sido optimizado para favorecer la amplificación del ADN del patógeno. Por lo tanto, la señal de amplificación del gen de control (β-globina, JOE fluorescencia) puede ser retardada o ausente en las muestras positivas para el CMV.

Si los estándares de cuantificación se incluyeron en el ensayo de amplificación, se puede determinar el número absoluto de copias del genoma de CMV en las muestras.

El número exacto de copias de genoma viral puede ser determinado únicamente por los resultados que se encuentran en el rango lineal del dispositivo. Consulte la tabla siguiente para una correcta interpretación:

Resultados de cuantificación CMV

INTERPRETACION (copias del genoma viral / reacción)

Resultados de cuantificación > 107 copias/reacción

Más de 107

10 < resultados de cuantificación < 107 copias/reacción

Cantidad = resultados de cuantificación

Resultados de cuantificación < 10 copias/reacción

Menos de 10


La carga del virus puede ser calculada como copias de genoma / mL de

muestra clínica, si los parámetros de extracción específicos se incluyen en el cálculo. Consulte la tabla siguiente para ver ejemplos

Parámetros de

extracción

Resultados de cuantificación CMV

INTERPRETACION (copias genoma viral / mL

de la muestra clínica)


Resultados de cuantificación > 5 × 108 copias/mL

Más de 5 × 108

500 < Resultados de cuantificación < 5 × 108 copias/mL

Cantidad = resultado de la cuantificación

Resultados de cuantificación < 500 copias/mL

Menos de500


Resultados de cuantificación > 6 × 108 copias/mL

Más de 6 × 108

600 < Resultados de cuantificación < 6 × 108 copias/mL

Cantidad = resultado de la cuantificación


Menos de600


Resultados de cuantificación > 109 copias/mL

Más de 109

1000 < Resultados de cuantificación < 109 copias/mL

Cantidad = resultado de lacuantificación


Menos de1000

Vi = Volumen inicial (volumen de la muestra utilizada para la extracción) Ve = Volumen de elución


11.6 Problemas y soluciones

No hay señales de amplificación para los controles positivos / estándares y muestras

� El instrumento no se ha programado correctamente

� Repita la amplificación prestando especial atención a la programación del instrumento, en modo particular al ciclo termico, fluoroforos seleccionados y a la configuración de las posiciones de las muestras / controles /

estándares.

� La mezcla de reacción no funciona correctamente

� Asegúrese de guardar la mezcla de reacción de CMV entre -30 °C y -20 °C. Evite ciclos innecesarios de congelación / descongelación. Guarde la mezcla protegido de la luz.

� No utilice el producto después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

Señal de amplificación muy débil para los controles positivos / estándares

� Los controles positivos / estándares no se han almacenado correctamente

y se han degradado

� Asegúrese de guardar los controles positivos /estándares entre -30 °C y -20 °C y no deje que se sometan a más de tres ciclos de descongelación/congelación.

� No utilice el producto después de la fecha de caducidad.


La señal de amplificación de la β-globina está muy retrasada o ausente en la muestra extraída (negativos para CMV)

� El ADN extraído no era adecuado para la PCR y la reacción fue inhibida

� Asegúrese de extraer los ácidos nucleicos correctamente. � Si utiliza un método de extracción con pasos de lavado con soluciones

que contienen etanol, asegúrese de que no queden .. � Utilice los sistemas de extracción recomendadas en el apartado 11.1.

� La muestra clínica no es adecuada para el análisis

� Asegúrese de que el almacenamiento y tratamiento previo de la muestra clínica es correcto antes de realizar el análisis.

En caso de tener problemas, por favor contacte con el departamento técnico de AB ANALITICA.

[email protected]

fax (+39) 049-8709510

tel. (+39) 049-761698


12 LIMITACIONES DEL DISPOSITIVO

El kit puede reducir su rendimiento si: � La muestra clínica no es adecuada para este análisis,

� El ADN no es adecuado para PCR (debido a la presencia de inhibidores de PCR o por el uso de un método de extracción no apropiado),

� El kit no se ha almacenado correctamente.

13 RENDIMIENTO DEL DISPOSITIVO

La información que se muestra a continuación ha sido verificada en todos los instrumentos en los cuales el kit ha sido validado.. Para más información póngase en contacto con el equipo de soporte técnico de AB ANALITICA.

13.1 Especificidad Analítica

La especificidad del kit REALQUALITY RQ-CMV, referencia RQ-S09, está garantizada por una selección precisa y específica de los cebadores y la sonda y por el uso de condiciones de amplificación estrictas. La alineación de cebadores y la sonda en las bases de datos más importantes no mostró apareamiento no específico. Con el fin de analizar las posibles reacciones cruzadas de este ensayo, las muestras positivas para patógenos que potencialmente presentaban reacción cruzada se probaron con este kit. Ninguno de los patógenos probados dio un resultado positivo.

13.2 Sensibilidad Analítica: límite de detección

Diluciones seriadas de un estándar de cuantificación, que van desde 1,5 hasta 0,1 copias de genoma viral / µl, se probaron en tres experimentos consecutivos. Cinco microlitros (5 µl) de cada dilución se amplifica en ocho réplicas por carrera y en multiplex con el control interno. Los resultados se analizaron mediante un análisis Probit, como se ilustra en la figura. 2. El límite desensibilidad analítica para el kit REALQUALITY RQ-CMV (p = 0,05) en el ABI 7500 Fast sistema Dx es 0,6 copias de genoma viral/ µl de ADN extraído.


Fig. 2: Análisis Probit para la determinación de la sensibilidad analítica del kit REALQUALITY RQ-CMV (Applied Biosystens 7500 Fast Dx Real-Time PCR). Se muestra como copias genoma viral / reacción.

13.3 Sensibilidad Analítica: rango de linealidad

El intervalo lineal de este ensayo se determinó utilizando un panel de diluciones de los estándares de cuantificación. El análisis se realizó utilizando regresión lineal. El intervalo lineal del kit REALQUALITY RQ-CMV en el ABI 7500 Fast Dx System es de 10 a 107 copias de genoma viral / reacción.

13.4 Reproducibilidad

Con el fin de determinar la variabilidad intra-ensayo (variabilidad en una sesión de análisis entre las repeticiones de la misma muestra) una dilución de 50 copias de genoma viral / µL del estándar de cuantificación (correspondiente a una cantidad final de 250 copias/reacción) se amplificó en ocho réplicas en un ensayo. El coeficiente de variabilidad intra-ensayo del método sobre el valor de ciclo umbral (Ct) es 0,199 % en el ABI 7500 Fast Dx System.


Con el fin de determinar la variabilidad inter-ensayo (variabilidad en sesiones de análisis diferentes de repeticiones de la misma muestra) al menos el estándar de cuantificación concentrado (20 copias de genoma viral / µL) se amplificó por duplicado en tres carreras consecutivas. Para cada ensayo, el coeficiente de variabilidad se calculó a partir de la Ct de las muestras. El coeficiente de variabilidad inter-ensayo se calculó como la media de los coeficientes de variabilidad para cada ensayo. El coeficiente de variabilidad inter-ensayo en el ABI 7500 Fast Dx System es 0,893 %.

13.5 Especificidad diagnóstica

Un número estadísticamente significativo de muestras negativas para CMV se probaron simultáneamente con el kit REALQUALITY RQ-CMV y otro dispositivo CE IVD o un método de referencia. De los resultados obtenidos se calculó la especificidad diagnóstica. La especificidad diagnóstica de este kit es del 96 %.

13.6 Sensibilidad diagnóstica

Un número estadísticamente significativo de muestras positivas para CMV se probaron simultáneamente con el kit REALQUALITY RQ-CMVy otro dispositivo CE IVD o un método de referencia. De los resultados obtenidos se calculó la sensibilidad diagnóstica. La sensibilidad diagnóstica de este kit es del 100 %.

13.7 Precisión

La exactitud se calculó como el cociente entre el número de resultados correctos y el número total de pruebas ejecutadas. La precisión del kit REALQUALITY RQ-CMV es del 97,4 %.


14 BIBLIOGRAFIA

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Razonable RR, Brown RA, Wilson J et al. Transplantation 73, 968-973, 2002b.

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Roberts TC, Brennan DC, Buller RS et al. J Infect Dis 178(3), 626-635, 1998.

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Vancikova Z and Dvorak P. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 1, 179-187, 2001.

Weinberg A, Schissel D, Giller R. J Clin Microbiol 40, 4203-4206, 2002.

14.1 Páginas Web

http://www.ihmf.org/ (International Herpes Management Forum)


15 PRODUCTOS RELACCIONADOS

REALQUALITY RQ-CMV STANDARD Estándares de cuantificación listos para usar en la cuantificación de Citomegalovirus (CMV).

Este producto está en conformidad con la Directiva 98/79/CE (Anexo II Lista B) en el diagnóstico in vitro médico (marcado CE).

Referencia Producto PKG RQ-10-ST REALQUALITY RQ-CMV STANDARD 4 × 60 µL

AB ANALITICA srl Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: [email protected]

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