Manual de prácticas Inmuno2 mod 17082010

Manual de Prácticas de Inmunología 2 Dr. López-Moreno HS

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS / UAS 1

D i r e c t o r i o

Dr. Víctor Antonio Corrales Burgueño Rector

Dr. José Alfredo Leal Orduño

Secretario General

Dr. Juan Ignacio Velázquez Dimas Director de Servicios Escolares

Dr. José de Jesús Zazueta Morales

Director FCQB

M en C. María Luisa Torres Duarte Secretaria Académica FCQB

QFB. José Luis Meza Arana

Secretario Administrativo FCQB

Dr. Héctor Samuel López Moreno Jefa de Carrera de QFB

Dr. Misael Odín Vega García

Jefe de Carrera de IBQ

Dra. Ana María López Beltrán Jefe de Carrera de IQ

Dr. Héctor Samuel López-Moreno Autor



C O N T E N I D O

Pág.

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 3REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2 ........................... 4NORMAS DE SEGURIDAD EN EL ............................................................................ 5LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2 ................................................................... 5

Inmuno2– 01. Uso de micropipetas ....................................................................................... 6Inmuno2– 02. Preparación de extractos antigénicos ......................................................... 10Inmuno2– 03. Inmunización de animales de experimentación ......................................... 13Inmuno2–04. Reacción Antígeno-Anticuerpo: Determinación de los Grupos Sanguíneos ABO y Rh. .............................................................................................................................. 16Inmuno2– 05. Técnicas Avanzadas: ELISA ....................................................................... 19Inmuno2– 06. Obtención de Anticuerpos Policlonales ...................................................... 23Inmuno2– 07. Técnicas Avanzadas: Western blot ............................................................. 26

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 30ANEXOS ....................................................................................................................... 31

A1. Protocolos para la preparación de reactivos para la SDS-PAGE (Laemmli) ........... 31A2. Formulación de geles ..................................................................................................... 32A3. Protocolos para la preparación de reactivos para Western blot (Towbin) ............... 33



INTRODUCCIÓN

La realización de prácticas de laboratorio representa un aspecto fundamental en el proceso de formación de recursos humanos con un sólido perfil en la licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo porque permite al alumno fortalecer los conocimientos teóricos adquiridos en el aula mediante la realización de experimentos que verifican tales conocimientos. El laboratorio de Inmunología 2 de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas que es producto del esfuerzo de alumnos, maestros, trabajadores y autoridades, pretende cumplir con el cometido de integrar el binomio teoría-práctica y sembrar en el estudiante la inquietud por la experimentación y la investigación. El laboratorio se encuentra dividido en las áreas de técnicas inmunológicas básicas y avanzadas con aplicabilidad diagnóstica y de investigación sobre enfermedades donde la respuesta inmune tiene una participación fundamental. Deseamos que el alumno obtenga el máximo provecho de estas prácticas, que pretendemos mejorar en cada ciclo escolar con las sugerencias e indicaciones que tengan a bien hacernos llegar.



REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2 Disposiciones generales:

1) Toda persona que se encuentre dentro del área del laboratorio quedará sujeta al presente reglamento, sin excepción alguna.

2) Dentro del laboratorio únicamente se admitirá a aquellas personas que tengan alguna tarea o

asunto relacionado con el mismo.

3) Toda persona que se encuentre dentro del laboratorio deberá seguir estrictamente las normas de seguridad, que se anexan al presente reglamento.

4) Toda persona que requiera un servicio, material bibliográfico o instrumental deberá

presentar una solicitud por escrito al jefe del laboratorio.

A los alumnos:

5) Tendrán derecho a realizar prácticas en el laboratorio de Inmunología 2 aquellos alumnos que están inscritos en el grado correspondiente a la materia.

6) El número de integrantes por equipo estará sujeto al número total de alumnos, no debiendo

exceder de 5 integrantes por equipo.

7) Todo alumno que no se presente en la fecha y hora correspondiente no tendrá derecho a realizar la práctica.

8) En caso de que se prevea la imposibilidad para asistir a la realización de alguna práctica,

deberá avisarse con un día de anticipación al profesor correspondiente para la asignación de otra fecha.

9) Todo alumno dispone de una semana a partir de la realización de la práctica, para hacer

entrega de su reporte. De no cumplir se le dará de baja en dicha práctica.

10) El área de trabajo deberá permanecer libre de objetos personales, alimentos, etc., permitiéndose únicamente el uso del material necesario para el registro de los datos obtenidos.

11) El orden y la disciplina dentro del laboratorio están confiados al alumno, que de no ser

satisfactorio podrá ser acreedor a sanciones por parte del encargado del laboratorio.

12) Los alumnos que se encuentren realizando prácticas son responsables del equipo y material de laboratorio de que hagan uso.

13) Los usuarios del laboratorio son responsables de la limpieza del área de trabajo y equipos

utilizados.

14) No se permitirá la realización de la práctica a aquellos alumnos que no hagan uso de la bata de laboratorio.

15) Ningún experimento debe ser iniciado hasta que se haya completado la planeación del

mismo y se cuente con la aprobación del profesor.

16) Ningún equipo deberá ser operado parcial o totalmente hasta que se tenga la autorización del profesor.



17) Se deberá permanecer en la práctica mientras ésta no se concluya a menos que se obtenga la autorización del profesor.

18) Ningún equipo puede ser desarmado parcial o totalmente o trasladado de su posición sin la

autorización del profesor.

19) El deterioro o fallas del equipo deben ser reportadas de inmediato ante el profesor o jefe del laboratorio.

20) Tendrán derecho a recibir comprobante de realización de prácticas, aquellos alumnos que

hayan cumplido mínimamente con el 90% de las mismas.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL

LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA 2

1) Abstenerse de fumar en el interior del laboratorio. 2) No introducir ni consumir alimentos dentro del laboratorio 3) Conservar limpia su área de trabajo. 4) Use la bata de laboratorio abotonada. 5) Utilice para sus prácticas el área de trabajo asignado. 6) No opere ningún equipo si no tiene la autorización y supervisión del profesor. 7) Utilice la herramienta o instrumento adecuado a cada trabajo. 8) No traslade ni realice modificaciones a ningún equipo ó instrumento si no tiene autorización

para ello. 9) Mantenga el orden y disciplina dentro del laboratorio.

10) Verifique que en su área de trabajo existan condiciones adecuadas (luz, ventilación, etc.).



Universidad Autónoma de Sinaloa Facultad de Ciencias Químico Biológicas

Inmuno2– 01. Uso de micropipetas 1.0 Objetivo 1.1 El alumno comprenderá los aspectos básicos en el uso y manejo de micropipetas automáticas.

2.0 Introducción En las prácticas de Inmunología los volúmenes de las soluciones que se necesitan medir son del orden de microlitros (10-6 L o µL). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se emplean las micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable.

Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones generales:

• La pipeta debe de mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posición vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido succionado.

• Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un único volumen. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. En éstas, no se deben ajustar volúmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta.

• Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 µL usan puntas amarillas, y las micropipetas que toman volúmenes superiores a 200 µL hasta 1 mL usan puntas azules. Las pipetas que toman volúmenes por encima de 1 mL y algunos modelos que toman volúmenes de 0,5 y 10 µL, pueden usar otro tipo de puntas específicas.

• La pipeta se sujeta como un puñal. La empuñadura debe de reposar sobre su dedo índice.

Todas las pipetas tienen dos topes. Para el pipeteo de rutina se utiliza el modo directo, consistente:

1) Presión hasta el primer tope para tomar el volumen calibrado.

2) Presión hasta el segundo tope para expulsar el volumen tomado.

Figura 1

• Existen otros modos de pipeteo que se utilizan para soluciones muy viscosas o cuando se tenga que pipetear repetidamente una solución.

• Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la



pipeta, que alterarían las medidas.

• También se pueden formar burbujas si la punta no está bien ajustada a la pipeta. La solución es ajustarla mejor

3.0 Material y equipo - Vaso de precipitados de 500mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Tubos eppendorf o de ensayo. - Solución problema. 4.0 Técnica

Las etapas pueden ser las siguientes:

• Se selecciona la pipeta adecuada para medir el volumen, de manera que esté dentro del rango especificado para la pipeta

• Se fija el volumen deseado en la pipeta mediante el giro del émbolo (Figura 2)

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Se coloca una punta desechable en el vástago de la pipeta (Figura 3). Se asegura que está bien sujeta ejerciendo un ligero movimiento de torsión.

• Se presiona suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope.

• Se introduce la punta de la micropipeta en la muestra no más de 3 mm de la superficie de líquido, manteniendo la pipeta en posición vertical (Figura 4).

• Se succiona el líquido, relajando suavemente la presión del dedo pulgar sobre el émbolo, sin permitir que el émbolo suba por sí solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el líquido.

• Se retira la punta de la muestra.

• Se introduce la punta de la pipeta en el tubo adecuado, colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solución.



• Se aprieta el émbolo lentamente hasta el primer tope.

• Se espera un par de segundos y se aprieta el émbolo hasta el segundo tope para eliminar el posible líquido que quede en la punta.

• Con el émbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.

• Se relaja la presión del pulgar para que el émbolo vuelva a la posición normal.

• Se elimina la punta por presión del expulsor de puntas o tirando de ella, para evitar contaminaciones (Figura 5).

Figura 5 7.0 Bibliografía http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropipetas.htm�




REPORTE DE LA PRÁCTICA INMUNO2– 01

Nombre de la práctica: Uso de micropipetas

Nombre del alumno: Fecha:

Grupo: Grado: Equipo: Carrera:

5.0 Observaciones y Resultados a) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica

(indicando cada uno de los pasos).

b) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

c) Cite tres ejemplos de aplicaciones específicas del uso de micropipetas y explique el mecanismo de funcionamiento de una micropipeta

6.0 Conclusiones y comentarios

¿Alcanzaron los objetivos? Sí ____ No___

Nombre del Instructor: Dr. Héctor Samuel López Moreno

Firma Sello




Inmuno2– 02. Preparación de extractos antigénicos 1.0 Objetivo 1.1 El alumno obtendrá extractos antigénicos de patógenos de importancia médica.

2.0 Introducción Un aspecto crítico en la realización de un gran número de metodologías inmunológicas radica en disponer de lotes antígeno que garanticen un abasto suficiente para el diagnóstico de enfermedades o bien, para la reproducibilidad de los experimentos en la investigación, por ello, la obtención de preparaciones antigénicas homogéneas debe realizarse de forma sistemática. 3.0 Material y equipo - Centrífuga para tubos falcon de 15 o 50mL. - Vaso de precipitados de 500mL, tripié o soporte universal y rejilla con asbesto alternativamente use una parrilla de calentamiento. - Tubos falcon para centrífuga de 15 o 50mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Amortiguador de lisis de Harlow o BRH. - Tubos eppendorf. - Solución de inhibidores de proteasas. 4.0 Técnica A partir de un cultivo celular de Leishmania mexicana se procederá a la obtención de la biomasa de donde se obtendrá un extracto antigénico. 1. Colectar el contenido del cultivo en tubos falcon de 15 o 50mL. 2. Centrifugar durante 20min a 5,000rpm. 3. Decantar el sobrenadante en un recipiente con cloro y conservar la biomasa. 4. Lavar el botón celular (“pellet”), con 5mL de amortiguador salino de fosfatos pH 7.2-7.4 (PBS) centrifugándolo durante 5min a 3,000rpm.

5. Resuspender el pellet en 500µL o en 1mL de Amortiguador de Harlow o BRH. 6. Adicionar inhibidores de proteasas para preservar la preparación antigénica. 7. Incubar en hielo o a 4ºC durante 30 min, puede sonicar la muestra durante 90 seg.

8. Centrifugar durante 10 min a máxima velocidad, conservar el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo. 9. Determinar la concentración proteica del extracto

5.0 Resultados

a. Registrar la concentración proteica del extracto antigénico. b. Contestar las preguntas del cuestionario (en hojas blancas)

7.0 Bibliografía Números 1, 2 y 3 de la sección de bibliografía de este manual.





Nombre de la práctica: Preparación de extractos antigénicos

Nombre del alumno: Fecha:


6.0 Observaciones y Resultados

d) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

e) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

f) Dar tres ejemplos de aplicaciones de la preparación de extractos antigénicos.

g) Contestar las preguntas del cuestionario # 1 (en hojas blancas)

1. Defina antígeno, inmunógeno, epitopo y paratopo 2. Describa las características morfológicas (haga esquemas señalando sus partes),

clasificación por sus especies, métodos para su diagnóstico y cultivo del protozoario parásito Leishmania mexicana

3. Describa las características morfológicas (haga esquemas señalando sus partes),



clasificación por su patogenesis, métodos para su diagnóstico, cultivo del protozoario parásito Giardia lamblia.

4. Describa brevemente dos métodos para la cuantificación de proteínas. 5. ¿Cuál fue la concentración antigénica obtenida?




Firma Sello




Inmuno2– 03. Inmunización de animales de experimentación 1.0 Objetivos 1.1 El alumno identificará las diferentes vías de inmunización para la generación de anticuerpos policlonales. 1.2 El alumno elaborará emulsiones antigénicas. 1.3 El alumno conocerá los fundamentos para el manejo de animales de experimentación. 1.4 El alumno realizará un protocolo de inmunización de un animal de experimentación. 2.0 Introducción Una de las herramientas biológicas de mayor aplicación en la inmunología y otras disciplinas relacionadas son los anticuerpos. Mismos que permiten el diagnóstico de enfermedades, la identificación de celular, aislamiento de moléculas de interés biomédico, terapéutica, entre muchas otras aplicaciones, de ahí la importancia de la manipulación de animales de experimentación para la generación de anticuerpos policlonales o monoclonales. 3.0 Material, reactivos y equipo - Microcentrífuga para tubos eppendorf. - Gradilla para tubos eppendorf. - Tubos eppendorf de 1.5 o 2.0mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Cepo para conejos. - PBS pH 7.2. - Jeringas hipodérmicas de 3.0 o 5.0mL. - Adyuvante incompleto de Freund (aceite mineral). - Algodón. - Etanol 70% v/v. - Marcador de punto fino de tinta permanente.

4.0 Técnica Se procederá a la sangría de los conejos para su posterior inmunización con una emulsión antigénica elaborada con un extracto antigénico de Salmonella tiphymurium o del protozoario parásito Giardia lamblia. Pasos: 1. Realizar una emulsión antigénica con PBS (c.b.p. 250µL), 300µg del extracto antigénico y 250µL de adyuvante incompleto de Freund (aceite mineral). 2. Colocar el conejo en el cepo para sangrarlo por goteo en la vena exterior de la oreja. 3. Colocar el tubo eppendorf bien rotulado en la gradilla y dejar que la sangre coagule para posteriormente separar el suero por centrifugación a 3000 r.p.m. durante 5m decantar el suero en otro eppendorf perfectamente rotulado para su almacenaje a -20°C hasta su uso. 4. Inocular la emulsión antigénica al conejo por vía subcutánea en el lomo del animal.

5. Inocular el conejo por vía subcutánea 3 veces más dejando un periodo de 10 días entre cada inmunización. 6. Haga un calendario de inmunización para definir las fechas de reestimulación del conejo.




Nombre de la práctica: Inmunización de Animales de Experimentación

Nombre de los alumnos:

Fecha:


Observaciones y Resultados

h) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

i) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

j) Dar tres ejemplos de aplicaciones de los anticuerpos policlonales o antisueros.

k) Contestar las preguntas del cuestionario # 2 (en hojas blancas)




1. Haga un esquema detallando los componentes estructurales de un anticuerpo. 2. Defina que es un antisuero policlonal y cite sus características. 3. Cite los componentes antigénicos más prominentes de S. tiphymurium y G. lamblia. 4. ¿Cuál es la utilidad de sangrar al conejo antes de su inmunización? 5. ¿Qué es un adyuvante y cuál es su utilidad? 6. Cite al menos 3 tipos de adyuvantes empleados en inmunología.




Firma Sello




Inmuno2–04. Reacción Antígeno-Anticuerpo: Determinación de los Grupos Sanguíneos ABO y Rh. 1.0 Objetivos 1.1 El alumno conocerá el fundamento de una reacción antígeno-anticuerpo. 1.2 El alumno será capaz de identificar los grupos sanguíneos ABO y Rh humanos.

2.0 Introducción Los eritrocitos o hematíes son células sanguíneas encargadas del transporte gaseoso (oxígeno y dióxido de carbono), en nuestro organismo. Estas células enucleadas poseen en su membrana antígenos que permiten han permitido su clasificación en grupos sanguíneos siendo los más importantes el ABO y el Rh. El sistema ABO está integrado por glicoproteínas formadas por la presencia o ausencia (tipo O) de oligosacáridos llamados A y B unidos a una proteína o antígeno H diferenciadas por el carbohidrato más distal, el tipo A, por N-Acetilglucosamina y el tipo B, por Galactosa. Existen individuos que poseen ambos tipos denominados AB. El sistema Rh está formado por varias glicoproteínas que fueron identificadas inicialmente en eritrocitos del Macacus rhesus y de allí su nombre de Rh. Actualmente, podemos definir el tipo sanguíneo de un individuo mediante reacciones de antígeno-anticuerpo basadas en la aglutinación de sus eritrocitos con sueros hemoclasificadores específicos. 3.0 Material, reactivos y equipo - Lancetas estériles. - Placa de vidrio o porcelana con áreas circulares delimitadas. - Torundas. - Aplicadores de madera. - Etanol al 70%. - Sueros hemoclasificadores: Anti-A, Anti-B y Anti-D (Rh). 4.0 Técnica

1. Con la torunda desinfectar la yema del dedo medio o anular. 2. Pinchar con la lanceta la yema del dedo seleccionado. 3. Colocar tres gotas de sangre cada una de ellas en el área correspondiente sobre la

placa de vidrio o porcelana. 4. Colocar sobre la muestra de sangre de la izquierda una gota del suero

hemoclasificador anti-A, en la del medio una gota de anti-B y en la muestra de la derecha una gota de suero anti-D (anti-Rh).

5. Mezclar cada gota de sangre con su suero hemoclasificador correspondiente con la ayuda de un aplicador de madera evitando el contacto entre ellas.

6. Se toma la placa y se hace rotar suavemente para observar más fácilmente la aglutinación.

7. Observar si existe aglutinación macroscópica en el lapso de un minuto. Generalmente los resultados son muy evidentes, sin embargo, si existiera duda sobre el mismo se puede observar la muestra en el microscopio de luz con el objetivo seco débil (10X).





Nombre de la práctica: Reacción Antígeno-Anticuerpo: Determinación de los Grupos Sanguíneos ABO y Rh.

Nombre de los

alumnos:

Fecha:


Observaciones y Resultados Interpretación de los resultados:

• Los eritrocitos pertenecientes al tipo A, son aglutinados con el suero anti-A pero no con él anti-B.

• Los eritrocitos pertenecientes al tipo B, son aglutinados con el suero anti-B pero no con él anti-A.

• Los eritrocitos pertenecientes al tipo O, no son aglutinados por ninguno de los sueros hemoclasificadores.

• Los eritrocitos pertenecientes al grupo Rh, son aglutinados con el suero anti-D.

l) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

m) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

n) De él resultado obtenido en la hemoclasificación del grupo sanguíneo del individuo en estudio.



o) Contestar las preguntas del cuestionario # (en hojas blancas)

1. Explique el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo por aglutinación. 2. Defina otros métodos para evidenciar reacciones antígeno-anticuerpo. 3. Explique la utilidad de la definición del tipo sanguíneo. 4. Cite otros tipos, sistemas o grupos sanguíneos. 5. Dentro del sistema ABO como se define genotípica y fenotípicamente un individuo

del grupo Bombay. 6. ¿Contra cuál tipo sanguíneo tiene anticuerpos un individuo O Rh (-)?




Firma Sello




Inmuno2– 05. Técnicas Avanzadas: ELISA 1.0 Objetivos 1.1 El alumno conocerá el fundamento del ELISA. 1.2 El alumno realizará una aplicación diagnóstica del ELISA. 1.3 El alumno conocerá las variantes metodológicas de un ELISA. 1.4 El alumno conocerá las diferentes aplicaciones del ELISA. 2.0 Introducción Una de las técnicas más empleadas en el campo de la inmunología con fines diagnósticos y de investigación lo constituye el ELISA (del inglés “Enzyme Linked Immunosorb Assay”). Esta técnica nos permite evidenciar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra biológica mediante una reacción Ag-Ac sobre un soporte sólido de poliestireno (placa de microtitulación), puesta en evidencia mediante la actividad de una enzima sobre su sustrato. 3.0 Material, reactivos y equipo - Microcentrífuga para tubos eppendorf. - Gradilla para tubos eppendorf. - Tubos eppendorf de 1.5 o 2.0mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Tubos vacutainer de tapón color rojo, verde o lila. - PBS pH 7.2-7.4. - Agujas para vacutainer o jeringas hipodérmicas de 3.0 o 5.0mL. - Tubos de ensayo de 5mL. - Torundas. - Torniquete. - Microplacas de poliestireno para ELISA de fondo plano o en forma de “U” - Tween 20. - Amortiguador de carbonatos 0.2M pH 9.5. - Amortiguador de citratos 0.1M pH 5.6. - o-fenilendiamina. - H2O2 al 3% o agua oxigenada. - H2SO4 2.5M. - Balanza analítica. - Anti-IgG anti-IgM de humano (o de conejo) conjugada a peroxidasa. - Micropipeta multicanal de volumen variable. - Minitarjas. - Leche descremada Svelty. - Ag de interés. - Papel parafilm. - Papel aluminio. 4.0 Técnica De acuerdo a protocolos estándar. Preparación de reactivos:

a) PBS-T 0.1%: Para cada placa de prueba diluir 1mL de Tween 20 en PBS hasta obtener 1000mL. Este reactivo será usado como solución de lavado y como disolvente de varios reactivos.



b) Solución bloqueadora: Pesar 5g de leche Svelty y disolverlo en c.b.p, 100mL de PBS-T. c) Muestra: La cantidad de muestra antigénica que se emplea para sensibilizar una placa de

ELISA generalmente oscila entre 100 a 500µg/mL, disueltos en 10mL de amortiguador de carbonatos pH 9.5.

d) Solución de cromógeno (SC): Para cada placa, preparar 10mL de SC, pesar 4mg de o-fenilendiamina y mezclar con 30µL de agua oxigenada previamente disuelta en 10mL de amortiguador de citratos. MUY IMPORTANTE: Este reactivo se prepara unos 10min antes de revelar la reacción.

Pasos: 1. Diseño del experimento: Diseñar la distribución de las muestras y testigos de referencia (si los hubiere) antes de iniciar. 2. Sensibilización de las placas: En cada uno de los pozos o pocillos donde colocará el antígeno para sensibilizar la placa, colocar 100µL de la muestra/pozo. 3. Incubación de las muestras: Cubrir las placas de prueba con papel parafilm e incubar a 37°C durante 40’. 4. Lavado: Decantar el contenido en la tarja y colocar en cada pozo aproximadamente 300µL de PBS-T, repetir este proceso 2 veces más.

5. Bloqueo: Colocar en cada pocillo 200µL de la solución de bloqueo si la placa es de fondo plano o 150µL si es de fondo en “U”. 6. Incubación con el bloqueador: Incubar las muestras como en el paso 3. 7. Lavado: Lavar como en el paso 4. 8. Distribución del suero problema: Agregar a cada pocillo 100µL de diluciones séricas (humanas o de conejo) disueltas en PBS-T, con base en el diseño. 9. Incubación con los sueros problemas: Incubar las muestras como en el paso 3 10. Lavado: Lavar como en el paso 4. 11. Distribución del conjugado: Siguiendo el diseño experimental, colocar en cada pozo 100µL de la solución del conjugado (anti-IgG o anti-IgM de humano o de conejo, conjugada a peroxidasa de rábano picante) a la dilución sugerida por el fabricante. 11. Incubación con el conjugado: Incubar las muestras como en el paso 3. 12. Lavado: Lavar como en el paso 4. 13. Distribución del cromógeno: Colocar en cada pozo 100µL de SC. 14. Incubación del sustrato: Cubrir la placa de prueba con papel aluminio durante 10 o 15’ al abrigo de la luz. 15. Detener la reacción: Descubrir la placa de prueba y agregar 50µL de H2SO4 a 2M. Mantener el mismo ritmo y distribución que para la distribución del sustrato.





Nombre de la práctica: Técnicas Avanzadas: ELISA.

Nombre de los

alumnos:

Fecha:



p) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

q) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

r) Dar al menos seis ejemplos de aplicaciones del ELISA.



s) Contestar las preguntas del cuestionario # 3 (en hojas blancas)

1. Describa la importancia diagnóstica del virus del Dengue. 2. Explique por qué es útil realizar la búsqueda de anticuerpos IgM anti-DENV. 3. Describa el cuadro clínico del Dengue (FD). 4. Cite otros métodos empleados en el diagnóstico del Dengue. 5. Describa la respuesta inmune que se evoca contra el virus del Dengue.




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Inmuno2– 06. Obtención de Anticuerpos Policlonales 1.0 Objetivos 1.1 El alumno conocerá el fundamento de la generación de anticuerpos policlonales. 1.2 El alumno obtendrá anticuerpos policlonales a partir de un animal de experimentación previamente inmunizado. 2.0 Introducción Un paso fundamental para la realización de las técnicas serodiagnósticas radica en la obtención de una muestra sérica de los pacientes o bien de animales de experimentación previamente inmunizados a fin de poder evaluar la respuesta de anticuerpos que ha sido evocada contra el antígeno o el patógeno a investigar. En dicha porción sérica podemos encontrar una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de diferentes clonas de linfocitos B que han reconocido a diferentes determinantes antigénicos de un mismo antígeno o patógeno produciendo una mezcla heterogénea de anticuerpos específicos conocida como suero policlonal o anticuerpos policlonales. 3.0 Material, reactivos y equipo - Microcentrífuga refrigerada para tubos eppendorf. - Gradilla para tubos eppendorf. - Tubos eppendorf de 1.5 o 2.0mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Agujas para jeringa estériles de 22mm. - Torundas. - Aplicadores de madera. - Etanol al 70%. 4.0 Técnica Pasos:

8. Colocar al conejo en un cepo fijándolo por el cuello y sujetándole por la parte posterior de tal manera que no se mueva para prevenir que se lastime el cuello.

9. Limpiar con una torunda el área posterior de una de las orejas identificando la vena más prominente de la parte media o exterior de la oreja.

10. Introducir cuidadosamente la aguja con el bisel hacia arriba a la vena seleccionada. 11. Colectar por goteo aproximadamente 1mL de sangre en un tubo eppendorf de 1.5 o

2.0mL. 12. Liberar al conejo del cepo y colocarlo en su jaula de transporte. 13. Permitir que se forme el coagulo de sangre en el tubo de colecta dejándolo reposar

durante unos 15 o 20min a temperatura ambiente en una gradilla. 14. Remover el coagulo con un aplicador de madera. 15. Centrifugar la muestra durante 10min a 3000 rpm a 4°C. 16. Transferir el suero a un nuevo tubo eppendorf perfectamente rotulado. 17. Almacenar el suero a -20°C hasta su uso.





Nombre de la práctica: Obtención de Anticuerpos Policlonales.

Nombre de los

alumnos:

Fecha:



t) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

u) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

v) Dar al menos seis ejemplos de aplicaciones de los anticuerpos policlonales.



w) Contestar las preguntas del cuestionario # 3 (en hojas blancas)

1. Haga un esquema detallando los eventos involucrados en la generación de anticuerpos policlonales contra un antígeno.

2. Defina que son los anticuerpos policlonales y cite sus características. 3. Prediga: ¿Cuál sería el tipo de inmunoglobulina que se encontraría principalmente

en el suero policlonal del conejo inmunizado? 4. Fundamente la respuesta de la pregunta anterior




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Inmuno2– 07. Técnicas Avanzadas: Western blot 1.0 Objetivos 1.1 El alumno conocerá el fundamento del Western blot. 1.2 El alumno realizará una aplicación diagnóstica del Western blot. 1.3 El alumno conocerá las diferentes aplicaciones del Western blot. 2.0 Introducción Dentro de las técnicas más poderosas que se emplean en la inmunología con fines diagnósticos y de investigación encontramos al Western blot conocido también como Inmunoblot o Inmunoelectrotransferencia. Esta técnica nos permite evidenciar por una parte, la presencia de anticuerpos en una muestra biológica mediante una reacción Ag-Ac sobre un soporte sólido generalmente de nitrocelulosa o PVDF, puesta en evidencia mediante la actividad de una enzima sobre su sustrato; y por otra parte, el tamaño del antígeno identificado. 3.0 Material, reactivos y equipo - Minicámara de electroforesis vertical. - Fuente de poder. - Minicámara de transferencia vertical. - Tubos eppendorf de 1.5 o 2.0mL. - Micropipetas de diferentes volúmenes y puntillas adecuadas. - Amortiguador desnaturalizante de muestra (ver anexo A3). - Reactivos para geles de poliacrilamida (ver anexo A2). - Amortiguador de Laemmli para electroforesis (ver anexo A3). - Isopropanol. - Muestras. - Marcadores estándar de proteínas de amplio rango de peso molecular. - Papel de nitrocelulosa o de PVDF de 0.22µm del tamaño adecuado para el gel. - Recipiente de plástico del tamaño apropiado para la colocación de los “cassettes”. - Amortiguador de Towbin para la electrotransferencia. - Amortiguador de fosfatos salino pH 7.2-7.4. - Leche descremada Svelty. - Tween 20. - Diaminobencidina (DAB). - Peróxido de hidrógeno. - Suero problema. - Anti-IgG especie, conjugado a peroxidasa.

4.0 Técnica 1. Realice el diseño de la distribución de las muestras y verifique que cuenta con todos los reactivos y equipos necesarios. 2. Prepare el molde con los cristales donde se colocará la mezcla para hacer el gel de poliacrilamida (ver Anexo 4). 3. Coloque la mezcla del gel separador hasta ¾ partes del tamaño de los cristales, antes de que polimerice la acrilamida adicione aproximadamente 200µL de isopropanol para eliminar las burbujas generadas por el SDS y eliminar las irregularidades de la superficie del gel y dejarlo “plano”. 4. Una vez que el gel ha polimerizado, retire el isopropanol por decantamiento, lave con agua desionizada y coloque el “peine” analítico o preparativo, llene completamente el



espacio libre con la mezcla para el gel concentrador. 5. Después de que el gel separador ha polimerizado retire el peine y coloque los cristales con el gel en el soporte con el electrodo e introdúzcalos en el minitanque. 6. Mezcle las muestras 1:1 con el amortiguador de muestras de Laemmli y hiérvalas durante 5 minutos a ebullición. 7. Retire las muestras y colóquelas en los pocillos correspondientes. 8. Coloque 5µL del marcador de peso molecular en el pocillo correspondiente. 9. Agregue aproximadamente 500mL de amortiguador de “corrida” de Laemmli. 10. Tape el minitanque y conecte los electrodos a la fuente de poder y “corra” el gel a 30mA o 100V. 11. Mientras que las proteínas se separan electroforéticamente en el gel, humedezca un trozo de nitrocelulosa aproximadamente del mismo tamaño del gel separador en amortiguador de transferencia de Towbin, junto con las fibras y el papel filtro. 12. Cuando haya concluido la electroforesis retire el gel del minitanque. 13. Proceda a ensamblar el casete de transferencia manteniéndolo sumergido en amortiguador de Towbin colocando sobre el lado oscuro del casete los materiales en el siguiente orden: la fibra, el papel filtro, el gel, el papel de nitrocelulosa o PVDF, el papel filtro y la fibra. 14. Cierre el casete e introdúzcalo en la cámara de transferencia. 15. Coloque la unidad de enfriamiento dentro de la cámara de transferencia. 16. Coloque la tapa del minitanque de transferencia y conecte los electrodos a la fuente de poder. 17. Haga la transferencia aplicando una corriente eléctrica de 100V durante 1h. 18. Finalizada la transferencia retire la membrana, márquela y colóquela durante 1h a 37°C en amortiguador de bloqueo hecho con 5% de leche descremada Svelty disuelta en PBS conteniendo Tween 20 al 0.1% v/v (PBS-T). 19. Corte la membrana si realizó un gel preparativo en tiras de aproximadamente 0.3cm a todo lo largo de la membrana. 20. Lave las tiras 3 veces con PBS-T e incúbelas con el suero problema diluido 1:100, durante 1h en una base especial para ello. 21. Lave las tiras tres veces con PBS-T e incúbelas con el anti-IgG especie peroxidasa. 22. Lave las tiras tres veces con PBS-T y dos veces con PBS solo. 23. Prepare la solución de revelado con 3x10-4 % v/v de peróxido de hidrógeno al 30% en PBS conteniendo 350µM de diaminobencidina. 24. Detenga la reacción con agua de la llave. 25. Interprete los resultados.





Nombre de la práctica: Técnicas Avanzadas: Western blot.

Nombre de los

alumnos:

Fecha:



x) Haga un esquema de la metodología que fue empleada en la realización de esta práctica (indicando cada uno de los pasos).

y) Explique el fundamento de la metodología empleada en esta práctica.

z) Dar al menos seis ejemplos de aplicaciones del Western blot



aa) Contestar las preguntas del siguiente cuestionario (en hojas blancas)

1. Indique las diferencias fundamentales en cuanto al resultado entre el ELISA y el Westenr blot.

2. Cite dos ejemplos alternativos para revelar una reacción Ag-Ac mediante un Western blot además del empleo de diaminobencidina o 4-1 cloronaftol.

3. ¿Cuál es la utilidad de emplear marcadores de peso molecular? 4. ¿Cuál es la diferencia básica entre un Western blot y un Southern blot? 5. ¿Cuál es la función del agente bloqueador?




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BIBLIOGRAFÍA 1. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA y Kuby J. Inmunología. 6a edición, McGraw Hill 2007, México. 2. Abbas AK, Litchman AH. Immunología Celular y Molecular. 7a edicion, Elsevier 2008, USA. 3. Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM. Inmunología Fundamentos. 11a edición, Panamericana 2006, México. 4. Brostoff J, Male D, Roitt IM. Immunology. 7th edition, Mosby 2007, UK.



ANEXOS

A1. Protocolos para la preparación de reactivos para la SDS-PAGE (Laemmli) 1. Acrilamida/Bis (30% T, 2.67% C) Acrilamida 29.2 g N’N’-bis-metilenacrilamida 0.8 g Disuelva en 90 mL de agua desionizada y afore a 100mL, filtre y almacene a 4 °C en la oscuridad durante un mes como máximo. 2. SDS 10% (p/v) Disuelva 10g de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) en 90 mL de agua desionizada con agitación suave (agitador magnético). Una vez disuelto afore a 100 mL con agua desionizada. Evite la congelación del reactivo refrigerándolo. 3. Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8 Tris Base 18.15 g Agua desionizada 80 mL Disuelva el Tris en el agua y ajuste a pH 8.8 con HCl 6N. Afore a 100 mL con agua desionizada y almacene a 4 °C. 4. Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 Tris Base 6 g Agua desionizada 60 mL Disuelva el Tris en el agua y Ajuste a pH 6.8 con HCl 6N. Afore a 100 mL con agua desionizada y almacene a 4 °C. 5. Amortiguador de muestra

Agua desionizada 3.55 mL Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 1.25 mL Glicerol 2.5 mL SDS 10% (p/v) 2.0 mL Azul de bromofenol 0.5% (p/v) 200 µL Volumen total 9.5 mL

Almacene a temperatura ambiente. Uso: Adicione 50 µL de ∃-Mercaptoetanol a 950 µL de amortiguador de muestra previo a su uso. Diluya la muestra al menos 1:2 con amortiguador de muestra y hierva a 95-100 °C por 4 minutos. 6. Amortiguador de Laemmli (A. de corrida), pH 8.3 (10X)

Tris base 30.3 g Glicina 144.0 g SDS 10 g

Disuelva y afore a 1 L con agua desionizada. No ajuste el pH con ácido o base. Almacene a 4 °C. Si la solución presenta precipitados colóquela a temperatura ambiente antes de su uso. 7. APS 10% (p/v) Persulfato de amonio (APS) 100 mg Disuelva en 1 mL de agua desionizada. Prepárelo el día de su uso.



A2. Formulación de geles 1. Prepare la solución monomérica del gel mezclando todos los reactivos excepto el APS 10% y el TEMED. Desgasifique durante 10 minutos. GEL SEPARADOR (10 mL)

Reactivos en mL 5% 10% 12% 15% Agua desionizada 5.7 4.1 3.4 2.4 Acrilamida/Bis 1.7 3.3 4.0 5.0 Tris-HCl 1.5M, pH 8.8 2.5 2.5 2.5 2.5 SDS 10% (p/v) 0.1 0.1 0.1 0.1 APS 10% (p/v) 0.05 0.05 0.05 0.05 TEMED 0.005 0.005 0.005 0.005

GEL CONCENTRADOR (5 mL)

Reactivos en mL 5% 10% 12% 15% Agua desionizada 2.9 2.05 3.4 2.4 Acrilamida/Bis 0.85 1.65 2.0 2.5 Tris-HCl 0.5M, pH 6.8 1.25 1.25 1.25 1.25 SDS 10% (p/v) 0.05 0.05 0.05 0.05 APS 10% (p/v) 0.05 0.05 0.05 0.05 TEMED 0.010 0.010 0.010 0.010



A3. Protocolos para la preparación de reactivos para Western blot (Towbin) 1. Amortiguador de Towbin (A. de transferencia), 1X

Tris base 25 mM 3.02 g Glicina 193 mM 14.48 g Metanol 20% v/v 200 mL

Disuelva el Tris base y la Glicina, mezcle con el metanol y afore a 1 L con agua desionizada. No ajuste el pH con ácido o base. Almacene a 4 °C. 2. Amortiguador de Fosfatos Salino 10 X

(PBS, pH 7.2-7.4)

Na2HPO4 10 mM 14.2 g NaH2PO4 10 mM 13.7 g NaCl 150 mM 87.6 g KCl 2.7 mM 2.0 g

Disuelva en 900 mL de agua desionizada todas las sales y posteriormente ajuste el pH a 7.2-7.4 y afore a 1L esterilice por filtración a 0.22 µm y almacene a temperatura ambiente hasta su uso. Alternativamente puede esterilizar el PBS en autoclave, sin embargo si se excede el tiempo de 20 min pueden generarse precipitados. 3. Solución de lavado (PBS-T) Amortiguador salino de fosfatos (PBS 1X), pH 7.2-7.4 Tween-20 0.05% v/v Agregue 500 µL de Tween-20 por cada litro de PBS, mezcle perfectamente. 4. Solución de bloqueo Leche descremada (Svelty) 5 g PBS, pH 7.2-7.4 suplementado con Tween-20 al 0.05% v/v 90 mL Disuelva la leche Svelty en 90 mL de PBS-Tween-20 y afore a 100 mL. Prepare la solución bloqueadora el día en que la utilizará 5. Solución cromogénica PBS, pH 7.2-7.4 10 mL Diaminobenzidina (DAB) 50 mg Peróxido de hidrógeno (H2O2) 0.001% v/v Disuelva la DAB en el PBS, adicione el peróxido y mezcle la solución. Prepare la solución cromogénica en el momento en que la utilizará



A4. Figuras para el ensamblado de las cámaras de electroforesis y de transferencia basados en los modelos BIO-RAD A. Componentes y armado de la cámara de electroforesis



B. Componentes y armado de la cámara de transferencia

Manual de prácticas Inmuno2 mod 17082010

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