Manual de Practicas de Microbiología Ambiental

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DEPARTAMENTO DE DEPARTAMENTO DE DEPARTAMENTO DE DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA IIMICROBIOLOGÍA IIMICROBIOLOGÍA IIMICROBIOLOGÍA II

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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II - FACULTAD DE FARMACIA - UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

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ÍNDICE

CALENDARIO DE PRÁCTICAS.................................................................. 2 PRÁCTICA 1.- MICROBIOLOGÍA DEL SUELO................................................................ 5

1.1.- Preparación de la diluciones.................................................................................. 5 1.2.- Recuento de microorganismos aerobios viables................................................... 6

1.2.1.- Siembra en medio sólido ................................................................................. 6 1.3.- Ciclo del nitrógeno ................................................................................................. 6

1.3.1.- Recuento de microorganismos proteolíticos .................................................. 6 1.3.2.- Recuento de microorganismos amonif icantes:............................................... 6 1.3.3.- Recuento de microorganismos nitrif icantes.................................................... 7

1.4.- Ciclo del carbono:.................................................................................................. 8 1.4.1.- Recuento de microorganismos amilolíticos: .................................................... 8 1.4.2.- Recuento de microorganismos celulolíticos:................................................... 8

PRÁCTICA 2. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE.............................................. 11

2.1.- Métodos de recuento........................................................................................... 12 2.1.1. Método de la gravedad................................................................................... 12 2.1.1. Método de impacto. ........................................................................................ 12

2.2.- Identif icación de las colonias............................................................................... 12 PRÁCTICA 3. INVESTIGACIÓN DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUAS............. 13

3.1.Método de enriquecimiento .................................................................................... 13 3.2. Método de f iltración (método alternativo)............................................................. 15

PRÁCTICA 4. INVESTIGACIÓN DE Staphylococcus aureus EN AGUAS.................. 17

4.1.- Técnica:............................................................................................................... 18 PRÁCTICA 5. INVESTIGACIÓN DE Legionella EN EL AMBIENTE.............................. 19

5.1.- Toma de muestras ............................................................................................... 19 5.1.1. Agua de abastecimiento:................................................................................ 20 5.1.2. Torres de refrigeración y depósitos: ............................................................. 20

5.2.- Tratamiento de la muestra ................................................................................... 20 5.2.1. Concentración................................................................................................ 20 5.2.2. Tratamiento..................................................................................................... 20

5.3.Técnica .................................................................................................................. 20 PRÁCTICA 6. RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS EN AGUAS POR EPIFLUORESCENCIA...................................................................................................... 23

6.1.- Técnica:............................................................................................................... 23 6.1.1. Tratamiento de los f iltros................................................................................ 23 6.1.2. Tinción............................................................................................................ 23 6.1.3. Filtración......................................................................................................... 23 6.1.4. Montaje del f iltro. ............................................................................................ 23 6.1.5. Interpretación de la observación al microscopio:........................................... 23

6.2.- Lectura. ............................................................................................................... 24


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CALENDARIO DE PRÁCTICAS

Lunes: Práctica 1.- Microbiología del suelo.

- Preparación de la muestra y de las diluciones. - Recuento de microorganismos aerobios viables. Siembra en placas. - Recuento de microorganismos proteolíticos. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos amonif icantes. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos nitrif icantes. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos amilolíticos. Siembra por el NMP - Recuento de microorganismos celulolíticos. Siembra por el NMP

Práctica 2.- Control microbiológico del aire

- Método de gravedad - Método de impacto

Martes: Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa en aguas

- Método de enriquecimiento. Siembra en caldo lactosado - Método de f iltración. Siembra en agar cetrimida

Práctica 4.- Investigación de Staphylococcus aureus en aguas

- Siembra en caldo triptona-soja Práctica 5.- Investigación de Legionella en el ambiente

- Tratamiento de la muestra - Siembrar en agar BCYE

Miércoles: Práctica 6.- Recuento directo de microorganismos en aguas por epifluorescencia

- Resultados. Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa en aguas.

- Método de enriquecimiento. Siembra en agar cetrimida - Método de f iltración:

. Siembra en agar F y P

. Tinción de Gram

. Prueba de la oxidasa - Práctica 4.- Investigación de Staphylococcus aureus en aguas.

- Siembra en agar Baird-Parker - Práctica 5.- Investigación de Legionella en el ambiente

- Siembra en agar sangre


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Viernes: Práctica 1.- Microbiología del suelo.

- Lectura del recuento de bacterias aerobias - Lectura del recuento de microorganismos proteolíticos - Lectura del recuento de microorganismos amonif icantes - Lectura del recuento de microorganismos nitrif icantes - Lectura del recuento de microorganismos amiliolíticos - Lectura del recuento de microorganismos celulolíticos - Resultados

Práctica 2.- Control microbiológico del aire

- Lectura: recuentos de bacterias y hongos - Tinción de colonias - Resultados

Práctica 3.- Investigación de Pseudomonas aeruginosa

- Extracción de piocianina - Resultados

Práctica 4.- Investigación de Staphylococus aureus en aguas.

- Lectura agar Baird-Parker - Catalasa, tinción de Gram - Aglutinación - Resultados

Práctica 5.- Investigación de Legionella en el ambiente

- Lectura agar sangre - Resultados


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PRÁCTICA 1.- MICROBIOLOGÍA DEL SUELO Fundamento: El suelo contiene una gran población de microorganismos, (bacterias, hongos, algas y protozoos), cuyas actividades tienen una gran importancia en la fertilidad del suelo. Intervienen en los ciclos de la materia (N2, C, S, P), mineralizando la materia orgánica convirtiéndola en nutrientes asimilables por las plantas y transformando compuestos de importancia geológica (carbón, petróleo, azufre) y ambientales (pesticidas). El estudio de los microorganismos del suelo y su actividad es complejo, nosotros exponemos un conjunto de técnicas básicas, aplicables a la mayoría de los suelos, que nos permitan conocer cuantitativamente la biodiversidad de este hábitat y algunas de las principales actividades de los diferentes grupos f isiológicos que intervienen en los ciclos del carbono y el nitrógeno. Material necesario:

- Muestra de suelo - 1 matraz con 90 ml de agua destilada estéril - 1 bolsa estéril con f iltro - 9 tubos con 9 ml de agua destilada estéril - 6 tubos con agar extracto de tierra - 6 placas de Petri - 24 tubos con medio de gelatina - 24 tubos en medio de asparragina - 18 tubos con medio de sulfato amónico - 24 tubos con medio de almidón - 12 tubos con medio de celulosa - Estufa de incubación 28 ± 2º C - Pipetas de 1 ml - Tubos de hemólisis - Reactivo de Nessler - Reactivo de difenilamina sulfúrica - Lugol

1.1.- Preparación de la diluciones

Pesar 10 g de suelo tamizado y homogeneizado. Añadir 90 ml de agua destilada estéril y triturar en una bolsa estéril con f iltro en un “Stomacher” durante 1 minuto. Recoger el f iltrado en un matraz estéril. Si fuera necesario f iltrar por papel de f iltro estéril.Así obtenemos la dilución 10-1. Para obtener las siguientes diluciones, agitar vigorosamente el matraz y tomar 1 ml de la 10-1 y transferirlo a un tubo con 9 ml de agua destilada estéril, completando la agitación por aspiración con ayuda de una pipeta. Así tenemos la dilución 10-2.Seguir la misma técnica cambiando la pipeta en cada paso, preparando a partir de cada dilución la siguiente hasta la 10-10.


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1.2.- Recuento de microorganismos aerobios viables Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio de cultivo apto para el desarrollo de la mayoría de los microorganismos. 1.2.1.- Siembra en medio sólido

Medio de cultivo: Extracto de tierra solidif icado con 15g de agar por litro . Repartir en tubos gruesos a razón de 20 ml por tubo. Esterilizar a 121 ºC, 15 minutos. Método: Sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-5 a 10-7, dos placas de cada dilución. Añadir 20 ml del medio fundido y a temperatura de 50º C. Se incuban en la estufa a 28º C en ambiente húmedo. A los 5 días aparecerán colonias sobre las placas, procediéndose al recuento de las mismas. Hacer la media de cada dilución y expresar el número de microorganismos viables en ufc/g de suelo.

1.3.- Ciclo del nitrógeno 1.3.1.- Recuento de microorganismos proteolíticos Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio que contiene gelatina como fuente de proteínas y observar su liquefacción. Medio de cultivo:

Solución salina de Winogradsky 50 ml Gelatina 30 g Solución de oligoelementos 1 ml Agua destilada, hasta completar 1.000 ml

Fundir la gelatina en el medio y repartir en caliente en tubos a razón de 9 ml por tubo. Esterilizar a 110º C durante 20 minutos. Método: Sembrar de las diluciones 10-3 a 10-10 a razón de 1 ml por tubo y tres tubos para cada dilución. Se incuban a 28º C durante 15 días, observando diariamente. Como a esa temperatura la gelatina está líquida, para hacer las lecturas y poder apreciar la liquefacción, se introducen los tubos una hora en la nevera. Los tubos positivos, presentan la gelatina liquida. Determinar el Número Más Probable (NMP) por g de suelo , consultando las tablas de Mc Crady, contando para cada dilución, el número de tubos positivos. 1.3.2.- Recuento de microorganismos amonif icantes: Fundamento: Sembrar las diluciones del suelo en un medio líquido que contiene asparragina como fuente de carbono y nitrógeno, detectando el amoníaco producido por la acción de las bacterias amonif icantes mediante el reactivo Nessler.


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Medio de cultivo:

Solución salina de Winogradsky 50 ml Asparragina 0,2 g Solución de oligoelementos 1,0 ml Agua destilada, hasta completar 1.000 ml

Repartir en tubos a razón de 9 ml por tubo y esterilizar a 110º Cdurante 20 minutos. Método: Sembrar las diluciones 10-2 a 10-9 poniendo 1 ml en cada tubo y tres tubos por cada dilución. Incubar en la estufa a 28º C durante 15 días. Investigación del amoníaco por el método de Nessler. El reactivo Nessler se compone de dos soluciones:

Solución 1: Yoduro mercúrico 50 g Yoduro potásico 36,5 g Se trituran en mortero, añadiendo poco a poco 1.000 ml de agua destilada. Solución 2. Hidróxido potásico puro 150 g Agua destilada q.s.p. 1.000 ml

El ensayo se hace en tubos de Kahn o hemólisis. Con una pipeta estéril se toma 1 ml de la dilución problema y a este se le añade una gota de cada solución del reactivo Nessler. Los tubos positivos dan un precipitado anaranjado y los negativos amarillos. Determinar el NMP/g de suelo. 1.3.3.- Recuento de microorganismos nitrif icantes Recuento de bacterias nitrosas. Fundamento: Estas bacterias transforman los compuestos nitrogenados en nitritos. Para su estudio se siembran las diluciones del suelo en un medio que contiene sulfato amónico, que las bacterias nitrosas deben transformar en nitritos, los cuales se detectan con el reactivo de la difenilamina sulfúrica. Medio de cultivo:

Solución salina de Winogradsky 50ml Sulfato amónico 0,5 g Carbonato cálcico 1 ml Agua destilada, hasta completar 1.000 ml Repartir 9 ml en cada tubo y esterilizar a 110º C durante 20 minutos.


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Método: Sembrar de las diluciones 10-1 a 10-6 con 1 ml en cada tubo y tres tubos por dilución. Se incuban a 28º C, durante 15 días. La producción de nitritos se investiga con el reactivo de la difenilamina sulfúrica.

Preparación del reactivo: Difenilamina 1 g Ácido sulfúrico 100 ml Disolver la difenilamina en el ácido sulfúrico y verter la mezcla sobre 20 ml de agua destilada. Se hace una única lectura a los 16 días de cultivo. Para ello a cada tubo se le incorporan 10 gotas de ácido sulfúrico y otras 10 gotas del reactivo. La presencia de nitritos viene dada por una intensa coloración azul. Determinar el NMP/g de suelo.

1.4.- Ciclo del carbono: 1.4.1.- Recuento de microorganismos amilolíticos: Fundamento: Detectar la presencia de microorganismos que degradan el almidón sembrando las diluciones del suelo en un medio liquido que lo contenga como fuente de carbono, demostrando su degradación por el reactivo yodo-yodurado (Lugol). Medio de cultivo:

Solución salina de Winogradsky 50 ml Extracto de tierra 10 ml Almidón 1,5 g Nitrato amónico 1 g Solución de oligoelementos 1 ml Agua destilada, hasta completa 1.000 ml Repartir 9 ml por tubo y esterilizar 20 minutos a 110º C.

Método: Sembrar 1 ml de las diluciones 10-3a 10-10 y tres tubos para cada dilución. Incubar a 28º C, durante 15 días. La hidrólisis del almidón se investiga, tomando con una pipeta estéril 1 ml de cada tubo y añadiendo a esta muestra una gota del reactivo. El color violeta indica resultado negativo. Los tubos positivos toman el color del reactivo (ligeramente amarillo).Determinar el NMP/g de suelo. 1.4.2.- Recuento de microorganismos celulolíticos: Medio de cultivo:

Solución salina de Winogradsky 50 ml Extracto de tierra 20 ml Nitrato amónico 1 g Carbonato cálcico 3 g Agua destilada, hasta completar 1.000 ml

Se reparte en tubos a razón de 9 ml por tubo. Se pone una tira de papel de f iltro en cada tubo y se esterilizan a 110º C durante 20 minutos.


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Método: Sembrar con las diluciones del suelo los tubos a razón de 1 ml por tubo empleando de 10-1 a 10-4 y 3 tubos por cada dilución. Incubar a 28º C durante 15 días. Los tubos positivos presentan envejecimiento, manchas y destrucción del papel. Determinar el NMP/g de suelo. TABLA DE Mc CRADY. (3 tubos por dilución )

Número caracte- rístico

Número de microbios

Número caracte- ristico

Número de

microbios

Número caracte- rístico

Número de

microbios

000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200

0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9

201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0

302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333

6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0

RESULTADOS Recuentos de microorganismos:

Aerobios variables: ufc/g Proteolíticos: NMP/g Amonif icantes: NMP/g Nitrif icantes: NMP/g Amilolíticos: NMP/g

Celulolíticos: NMP/g


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PRÁCTICA 2. CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE. Fundamento: El examen microbiológico del aire es del gran interés en el ambiente exterior y en los recintos cerrados como locales públicos, hospitales y en determinadas zonas de las industrias alimentarias y farmacéuticas. La presencia en el aire de microorganimso patógenos y saprofitos puede causar infecciones en la población y contaminar diversos productos originando su alteración. Material necesario:

- Placa Petri con agar caseína-soja - Placa Petri con agar Sabouraud - Aparato muestreador Biotest - Tiras con agar triptona-soja - Estufas de incubación a 30º C y 22º C

Medios de cultivo:

- Agar caseína-soja: Digerido pancreático de caseína 15 g Digerido papaínico de harina de soja 5 g Cloruro sódico 5 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml Disolver todos los componentes con ayuda del calor. Ajustar el pH a 7± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 20 minutos.

- Agar Sabouraud: Glucosa 40 g Peptona 10 g Agar 15 g Agua destilada 1000 ml

Disolver todos los componentes con calor. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Esterilizar a 121º C durante 20 minutos.


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2.1.- Métodos de recuento 2.1.1. Método de la gravedad 2.1.1. Método de impacto. 2.2.- Identificación de las colonias.


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PRÁCTICA 3. INVESTIGACIÓN DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUAS.

Fundamento: Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que cuando encuentra condiciones favorables puede ocasionar infecciones graves. Su hábitat es el suelo, aguas, plantas y también se puede encontrar en las heces. Es un microorganismo extraordinariamente adaptable porque puede utilizar un gran número de compuestos orgánicos diferentes y además es resistente a muchos de los agentes antimicrobianos. Su presencia en las aguas de bebida envasadas se considera un índice de contaminación. También se investiga en las aguas de recreo como índice de calidad, por su resistencia al cloro. 3.1.Método de enriquecimiento Material necesario:

- Muestra de agua. - 1 matraz con 100 ml de caldo lactosado con magnesio a concentración doble. - 1 placa de agar cetrimida. - 1 placa de agar F. - 1 placa de agar P. - Reactivo de la oxidasa - Cloroformo - Estufas de incubación a 37ºC y 42 ºC.

Medios de cultivo:

- Caldo lactosado con magnesio: Extracto de carne 6 g Peptona 10 g Lactosa 10 g Sulfato magnésico 1 g Agua destilada 1.000 ml Ajustar el pH a 6,9-72. Envasar asépticamente en matraces a razón de 100 ml. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

- Agar cetrimida: Peptona 20 g Cloruro magnésico 1,4 g Sulfato potásico 10 g Cetrimida 0,5 g Agar 14 g Agua 1.000 ml Añadir 10 ml de glicerol. Ajustar el pH a 7. Envasar en tubos a razón de 15 ml (para placas). Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos


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- Agar F: (medio King A) Peptona 20 g Glicerol 10 g Fosfato potásico 1,5 g Sulfato magnésico 1,5 g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml

Disolver los componentes. Ajustar el pH a 7,2. Esterilizar a 121º C durante 15 minutos. Tender placas. - Agar P: (medio King B) Peptona 20 g Glicerol 10 g Sulfato potásico 1,4 g Agar 15 g Agua destilada 1.000 ml Disolver los componentes. Ajustar el pH a 7,2. Esterilizar a 121 º C durante 15 minutos. Tender placas.

Técnica: - Cultivo y aislamiento: - Sembrar 100 ml del agua problema en un matraz que contiene 100 ml de caldo lactosado con magnesio a concentración doble. Incubar a 37º C durante 24-48 horas. - Después de la incubación se examina el crecimiento del medio que se manif iesta como un enturbiamiento. Sembrar de este cultivo, con asa, una placa de agar cetrimida. Incubar a 42 º C durante 24 horas. Si las colonias desarrolladas en este medio son verdosas y f luorescentes se procede a su identif icación. - Identificación: Sembrar una placa de agar F y otra de agar P (haciendo rayas paralelas), a partir de una colonia de agar cetrimida. Incubar a 42º C durante 24 horas.

- Morfología y tinción: A partir de una colonia de los medios agar F o agar P, hacer un frotis sobre un portaobjetos y teñir por tinción de Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, bacilos f inos Gram negativos (0,3 X 3 micras). - Prueba de la Oxidasa: Se trazan rayas con una varilla de vidrio cargada de bacterias sobre tiras de papel impregnadas en solución acuosa al 1% de tetrametil-para fenilenodiamina. En caso positivo las colonias cambian de color, pasando a púrpura y negro.


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- Producción de los pigmentos fluoresceina y piocianina: La presencia de P. aeruginosa sobre la placa de agar F se manif iesta por la aparición de un pigmento amarillo f luorescente (f luoresceina) difusible en el medio, y sobre la placa de agar P aparece un pigmento azul (piocianina). A partir de la placa de agar P, añadir unos milílitros de cloroformo para extraer el pigmento piocianina y recoger en un tubo. En caso positivo el cloroformo tomará color azul. P. fluorescens solo tiene el pigmento f luoresceina.

3.2. Método de filtración (método alternativo) Fundamento: Investigar la presencia de P. aeruginosa mediante f iltración a través de membrana de un volumen de agua y posteriormente incubar el f iltro sobre medio de cultivo selectivo. Material necesario:

Aparato de f iltración estéril Filtros de membrana de 0,45 µm estériles Pinzas Bomba de vacío 1 placa con agar cetrimida 1 matraz con 30 ml de agua destilada estéril

Técnica: Colocar el f iltro sobre el soporte de f iltración con las pinzas estériles. Adaptar el embudo. Filtrar 100 ml ó 250 ml del agua; previamente homogenizada, efectuando el vacío. Lavar el f iltro con agua destilada estéril. Mediante las pinzas estériles transferir el f iltro sobre el medio agar cetrimida de modo que la superficie de f iltración quede hacia arriba. Incubar a 42ºC durante 24 horas. Con una colonia característica proceder a su identif icación como en el método de preenriquecimiento con caldo lactosado RESULTADOS


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PRÁCTICA 4. INVESTIGACIÓN DE Staphylococcus aureus EN AGUAS

Fundamento S. aureus es un microorganismo patógeno capaz de producir una gran diversidad de síndromes clínicos. Posee enzimas que hidrolizan un amplio espectro de sustratos y produce diversas toxinas: hemolisinas, exfoliatina y enterotoxinas. La presencia de cepas toxigénicas en aguas envasadas y de recreo puede ser causa de infecciones. Material necesario

- 1 matraz con 100 ml de caseína-soja a concentración doble - 1 placa de agar Baird - Parker - Agua oxigenada de 30 volúmenes - Reactivos para técnica de aglutinación

Medios de cultivo

-Caldo caseína-soja Digerido pancreático de caseína17 g Digerido papaínico de harina de soja 3 g Cloruro sódico 5 g Fosfato dipotásico 2,5 g Glucosa monohidrato 2,5 g Agua destilada 1000 ml Disolver los componentes con ayuda del calor.Ajustar el pH a 7 y esterilizar a 121ºC durante 20 min. -Agar Baird-Parker Digerido pancreático de caseína 10 g Extracto de carne 5 g Extracto de levadura 1 g Cloruro de litio 5 g Agar 20 g Glicina 12 g Piruvato sódico 10 g Agua destilada 1000 ml Disolver los componentes con ayuda del calor. Ajustar el pH a 6,8 y esterilizar a 121ºC durante 20 min. Enfriar a 45-50º C y añadir 50 ml de emulsión de yema de huevo y 10 ml de solución estéril de telurito potásico (1 %). Mezclar y verter en placas.


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4.1.- Técnica: - Cultivo y aislamiento En el matraz con 100 ml de caldo caseína-soja se siembran 100 ml del agua. Incubar a 35-37ºC durante 24-48 horas. Después de la incubación se observa el crecimiento por la turbidez. Para confirmar la presencia de S. aureus sembrar con el cultivo anterior las placas de agar Baird-Parker sobre la superficie con el asa bacteriológica. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas. Las colonias de S. aureus son muy típicas, negras brillantes, rodeadas de un halo opaco. Con las colonias que presentan estas características realiza las pruebas de identif icación. - Identificación

- Morfología y tinción: A partir de una colonia característica hacer un frotis sobre un portaobjetos y teñir por tinción de Gram. Observar al microscopio con objetivo de inmersión, cocos Gram positivos agrupados en parejas y masas semejantes a racimos. - Catalasa: Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30 volúmenes e introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden burbujas. - Identificación por aglutinación: Poner en un portaobjetos limpio una gota de suspensión de hematíes de cordero sensibilizados con f ibrinógeno y estabilizados y una gota de suspensión de hematíes testigo. En cada una de las gotas dispersar con cuidado una o dos colonias sospechosas con pipeta Pasteur o con asa de platino. Dar al portaobjetos un ligero movimiento de rotación. Una aglutinación masiva que aparezca en 15 segundos en la suspensión de hematíes sensibilizados indica que la cepa problema pertenece a la especie S. aureus. Una aglutinación con los hematíes testigos hace que la reacción sea no interpretable.

RESULTADOS:


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PRÁCTICA 5. INVESTIGACIÓN DE Legionella EN EL AMBIENTE Fundamento Legionella es una bacteria que se encuentra en ambientes acuáticos naturales y desde ellos puede acceder a instalaciones como los sistemas de agua de abastecimiento, piscinas, riego y climatización, donde se multiplica hasta concentraciones infectantes para el hombre. A partir de esos lugares, la bacteria puede alcanzar aparatos productores de aerosoles (duchas, torres de refrigeración) que puedan penetrar por vía respiratoria produciendo la legionelosis o “enfermedad del legionario”. Legionella pneumophila es la especie que produce la mayoría de los casos de legionelosis y la que se aísla con mayor frecuencia en muestras ambientales. Su investigación en este tipo de muestras es fundamental para determinar el origen de un brote epidémico y poder controlarlo. Material necesario:

- Muestra de agua - Centrifuga a 4.000 rv - Baño de agua a 58º ± 2ºC - Tampón pH 2,2 - 2 placas de Agar BCYEα - 1 placa de agar sangre - Estufa de incubación a 35º ± 2ºC

Medio de cultivo:

Agar BCYEα = (buffered - charcoal - yeast extract - α-ketoglutarate) Tampón ACES 10 g Hidróxido potásico 2,8 g Carbón activado 1,5 g Extracto de levadura 10 g Agar 17 g α - cetoglutarato monopotasico 1 g Agua 1 l Esterilizar a 120º C, 20 minutos. Enfriar a 50º C. Añadir 10 ml de una solución esterilizada por f iltración de cloruro de L-cisteina (4%) y 10 ml de pirofosfato férrico (2,5%). Repartir en placas de Petri.

5.1.- Toma de muestras Las muestras deben recogerse en frascos estériles con cierrre hermético y transportados a temperaturas de refrigeración.


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5.1.1. Agua de abastecimiento: Tomar el agua caliente, abriendo el grifo o ducha suavemente y recogiendo los primeros 100 ml. Rascar el interior del grifo o la alcachofa de la ducha con una torunda de algodón y arrastrar los residuos con una pequeña cantidad de agua. 5.1.2. Torres de refrigeración y depósitos: Tomar la muestra de la parte baja junto con restos de lodo, rascando posibles incrustaciones de la pared. Recoger un litro. 5.2.- Tratamiento de la muestra 5.2.1. Concentración. Concentrar la muestra 100 veces centrifugando a 4.000 rv durante 10 minutos, o f iltrando a través de f iltros de 0,22 µm. Resuspender el concentrado en 1 - 2 ml del agua en estudio. 5.2.2. Tratamiento.

- Por calor: Incubar 1 ml del concentrado a 60º C, durante 3 minutos o, a 58º C durante 5 minutos en un baño de agua. - Con ácido: Mezclar 0,1 ml del concentrado con 0,9 ml de tampón HCI / KCI (pH = 2,2), durante 5 minutos.

5.3.Técnica Cultivo y aislamiento Sembrar por estría 0,1 ml de la muestra concentrada y tratada tanto por calor como por ácido en placas de Petri con medio BCYEα. Incubar a 35ºC hasta 10 días. Las colonias aparecen a las 48 horas, pero para considerar un cultivo negativo debe mantenerse 15 días. Las colonias son de borde entero, brillantes de color gris azulado con aspecto opalino. Identificación Legionella pneumophila es un bacilo Gram negativo, móvil oxidasa posiitvo. Se tiñe mal por la tinción de Gram por lo que se emplean otras tinciones (Gimenez, f luorescencia). Para una identif icación presuntiva sembrar las colonias típicas obtenida en BCYEα. en agar sangre. Incubar a 35 ºC, 48 horas. No debe obtenerse crecimiento, ya que esta bacteria no crece en agar sangre. La prueba confirmativa se realiza por inmunofluorescencia o aglutinación empleando anticuerpos específ icos.


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RESULTADOS:


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PRÁCTICA 6. RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS EN AGUAS POR EPIFLUORESCENCIA

Material necesario:

- Muestra de agua - Microscopio con lámpara de epif luorescencia - Solución de Irgalan Black al 0,2% en ácido acético al 2% - Filtros Nucleopore de 0,20µm - Aceite de vaselina - Agua estéril - Porta y cubreobjetos - Pipetas estériles - Pinzas - Aceite de inmersión

6.1.- Técnica: 6.1.1. Tratamiento de los f iltros.

Para evitar la autófluorescencia y aumentar el contraste, se tiñen los f iltros durante varias horas (24 h) con un colorante negro (Irgalan Black); antes de su utilización se lavan dos veces con agua destilada estéril.

6.1.2. Tinción.

- Se toman 2 ml del agua problema y se tiñen con el colorante f luorescente naranja de acridina (0,2 ml) durante 5 minutos.

6.1.3. Filtración.

- Se f iltra a través de f iltros Nucleopore de 0,20 µm de poro y de 25 mm de diámetro. - Lavar 2 veces con 2 ml de agua destilada estéril y f iltrada.

6.1.4. Montaje del f iltro.

Se coloca el f iltro en un portaobjetos y encima se deposita una gota de aceite de vaselina, se coloca el cubreobjetos, se pone el aceite de inmersión y se observa al microscopio de epif luorescencia.

6.1.5. Interpretación de la observación al microscopio:

Los microorganismos activos se observan con una coloración rojo-naranja, las células lisadas y detritus en naranja y los micoorganismos vivos inactivos en verde.


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6.2.- Lectura. Contar las bacterias f luorescentes presentes en 25-50 campos elegidos al azar. Calcular la media aritmética (X) y expresar por ml de muestra, multiplicando por un factor F, según la superficie del f iltro y la cantidad f iltrada. • F = para f iltros de 25 mm de diámetro

RESULTADOS

219,511.25

filtrados ml de Nºfiltro el en campos de Nº ==F

FXml por ismosmicroorgan de Número ×=

Manual de Practicas de Microbiología Ambiental

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