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Materiales y cepas de referencia en laboratorios de Microbiología Ambiental

Buenos Aires, Argentina 22-26 de septiembre, 2008

Dr.C. María Isabel González GonzálezInvestigador Titular/ Profesor AuxiliarLaboratorio de Microbiología de AguasINHEM, CubaEmail: isa@inhem.sld.cu , mariaisa@infomed.sld.cu

Patrón:Medida materializada, instrumento de medida, material de referencia o sistema de medida destinado a definir, realizar, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia.

Patrón primario: Patrón que es designado o ampliamente reconocido como poseedor de las más altas cualidades metrológicas y cuyo valor se acepta sin referirse a otros patrones de la misma magnitud.

Patrón secundario: Patrón cuyo valor se establece por comparación con un patrón primario de la misma magnitud.

La mayor parte de los materiales de referencia certificados se encuentran dentro de esta categoría puesto que la certificación de los valores de la propiedad está usualmente realizada por un procedimientoque es trazable a patrones primarios.

Definiciones necesarias para considerar:

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Patrón de referencia:Patrón, en general de la más alta calidad metrológica disponible en un lugar o en una organización determinada, del cual se derivan lasmediciones realizadas en dicho lugar.

Material de referencia (MR):Material o sustancia en la cual uno o más valores de sus propiedades son suficientemente homogéneos y están bien definidos para permitir utilizarlos para la calibración de un instrumento, la evaluación de un método de medición, o la asignación de valores a los materiales.

Definiciones necesarias para considerar:

Material de referencia certificado (MRC): Material de referencia, acompañado de un certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades están certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad con una realización exacta de la unidad en la que se expresan los valores de la propiedad y para la cual cada valor certificado se acompaña de una incertidumbre con la indicación de un nivel de confianza.

Material de referencia interno: Es aquel preparado por un laboratorio para su propio uso.

Definiciones necesarias para considerar:

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�Físicos, como pueden ser de masa (pesas), longitud de onda, temperatura y otras propiedades físicas.

�Sustancias puras, soluciones y mezclas de alta pureza, utilizadas para la calibración en procedimientos de análisis.

�MR matriciales, materiales naturales y/o materiales naturales adicionados usados para la verificación de procedimientos analíticos y en casos específicos para la calibración de instrumentos de medida.

Tipos de materiales de referencia

Cuáles son las Exigencias de los Usuarios de Materiales de Referencia?

Un proveedor de material de referencia (MR) debe brindar información a través de un certificado que acompañe al material.

Y además deberá demostrar su competencia

en la producción del MR.

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Gestión de materiales de referencia:

El laboratorio debe disponer de procedimientos para la selección, adquisición, recepción, registro, almacenamiento y utilización de los materiales de referencia, del mismo modo que para el resto de reactivos y materiales consumibles utilizados en los ensayos y calibraciones.

USOS del Material de Referencia (MR)?

General�Calibración de equipos o aparatos.�Validación de métodos de medición.�Intercomparaciones�Control de calidad interno

Microbiología�Sensibilidad de medios de cultivo.�Controles ambientales.�Evaluación de procesos de esterilización.

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Qué características debe reunir un MR?

�Estable�Homogéneo�Con valores asignados a algunas de sus propiedades�Con incertidumbre asignada a esos valores

Para su selección:

�es necesario tener en cuenta el propósito al cual será destinado

Criterios de selección:

1. Identificar las especificaciones requeridas con las de los MRC disponibles en el mercado.

2. Consultar la información disponible: catálogos de fabricantes, bancos de datos, publicaciones, recomendaciones, Guía ISO 34:2000, etc.

3. Asegurar que el MRC seleccionado está certificado para la medida o propiedad de interés y no es un valor meramente indicativo, y que su procedimiento de certificación tiene un nivel de confianza apropiado y está suficientemente documentado.

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Cultivos de referencia:

�La acreditación de un método de ensayo en microbiol ogía requierecultivos de referencia.

�El número y la elección del género y especie de las mismas dependerá de los ensayos que se efectúan y las nece sidades particulares de estos últimos.

�Son necesarios para demostrar la trazabilidad.

�Se debe elaborar e implementar un procedimientodocumentado para el uso y manejo de cultivos de referencia.

�En microbiología es necesario demostrar la trazabilidad de los cultivos.

Agar Chromocult (Merck) Citrobacter freundii ATCC8090

¿ Para qué se emplean los cultivos de referencia en microbiología?

� Evaluación de la calidad de los medios de cultivo.� Realizar controles de calidad interno durante la ej ecución de los ensayos.� Realizar controles de calidad de los reactivos.� Pruebas confirmatorias.� Validar métodos.

Citrobacter freundii ATCC 8090E. coli ATCC 11775

Agar Chromocult ES (Merck)

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Los cultivos (cepas) de referencia pueden ser:

� Cepas de referencia: Microorganismos obtenidos de una colección nacional o internacional reconocida.

�Cepas de trabajo: Cepas obtenidas a partir del cultivo de una cepa de referencia preparada y conservada por un laborat orio.

�Cepas de reserva: Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir de las cepas de referencia para ser utilizad os en los ensayos que lo precisen.

.

Salmonella typhimurium ATCC 14028Agar Verde Brillante (Merck)

Las cepas de referencia deben tener:

VIABILIDAD: Las colecciones de cultivo reconocidas deben presen tar un instructivo para su resucitación.

PUREZA: Se debe garantizar que el cultivo sea puro.

ESTABILIDAD: deben mantener las características fenotípicas y genotípicas originales.

.

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Esquema de cultivos de referencia:

CEPA DE REFERENCIA

CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS

(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

CEPAS DE TRABAJO(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y

CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

*

Reconstitución(Sólo se acepta un único repique)

*

Descongelación / reconstitución

*

Subcultivo

una sola vez.

( * ) Deben realizarse los controles de pureza y prueba s bioquímicas de la cepa.

La manipulación y modo de conservación de los cultivos de referencia deben evitar:

� El deterioro de las cepas.� La contaminación cruzada.� Mutaciones, deterioro o alteración de las característicastípicas de las cepas.

Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada medio en el que se utiliza como cepa control.

Bacillus cereus ATCC11778Agar Sangre No.2

Con el objetivo de evitar cambios en las caracterís ticas de los cultivos de referencia, el número de repiqu es

a partir de la cepa de referencia, debe ser limitad o (en general es aceptado hasta 5 repiques

a partir de la cepa de referencia)

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Los cultivos de referencia deben ser obtenidos de una colección de cultivos nacional o internacional de reconocido prestigio para demostrar su trazabilidad.

Son microorganismos definidos:• Por lo menos a nivel de género y especie• catalogados.•muy caracterizados.•de origen conocido.• se comercializan liofilizados.

Bacillus cereus ATCC11778Agar Sangre No.2 (Merck)

Los cultivos de referencia deben ser obtenidos de una colección de cultivos nacional o internacional de reconocido prestigio para demostrar su trazabilidad.

Son microorganismos definidos:• Por lo menos a nivel de género y especie• catalogados.•muy caracterizados.•de origen conocido.• se comercializan liofilizados.

Bacillus cereus ATCC11778Agar Sangre No.2 (Merck)

Si una cepa se adquiere por cualquier víaque no sea la propia colección, NO se puede mencion ar

utilizando el número que tienen en esa colección, sino solamente como derivada de la cepa de colecció n.

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Adquisición de Cepas de referencia:

1 ra. opción: Obtención directa a partir de una colección nacional e internacional reconocida.

Proveedores de cepas de referencia:

Ejemplos:• ATCC (American Type Culture Collection).• SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection)• CECT (Colección española de cultivos tipos).• CNCM (Collection Nationale Cultures Microorganismes)lnst.Pasteur, Fance• NCCB (The Netherlands Culture Collection of Bacteria, Holanda).• NRRL: (ARS Culture Collection, USA).• UKNCC: (United Kingdom National Culture Collections, (Reino Unido).

Adquisición de Cepas de referencia:

2 da. opción : Proveedores comerciales certificados por ISO 9001.•Comercializan repiques de cepas de referencia adqui ridas en una colección reconocida. •Generalmente el 3er o 4 repique.•Deben mantener sus recipientes originales.•Requerimiento en la recepción (compra de insumo): c ertificado de origen donde conste el número de repique y el origen entre otro.

Proveedores de cepas de referencia:

Ejemplos:Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan rep iques a partir cepas adquiridas en la colección reconocida.Oxoid Companie

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El certificado del cultivo de referencia debe poseer:

� Nombre y dirección del organismo de certificación

� Título del documento.� Condiciones del certificado (provisorio)� Nombre del material� Número de muestra (Nº del lote puntual)� Fecha de certificación� Disponibilidad de otras formas y tamaño del

MR� Fuente del MR� Proveedor del MR� Preparador del MR� Descripción del MR

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� Destino.� Almacenamiento.� Instrucciones para el uso correcto del MR.� Método de preparación del MR.� Determinación de homogeneidad.� (descripción de los ensayos realizados).� Valores obtenidos para una determinada

propiedad y sus límites de confianza.� Valores asignados pueden ser generados por

un laboratorios o un grupo de laboratorio.� Incertidumbre.

El certificado del cultivo de referencia debe poseer:

Cepas de Referencia y de Reserva

� Pueden ser subcultivadas una sola vez para obtener cepas de reserva

� De las cepas de reserva se obtendrán las cepas de trabajo

� Las cepas de reserva se deben conservar utilizando técnicas que mantengan las características deseadas de la cepa de referencia (liofilización, ultracongelación, conservación en nitrógeno líquido)

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Cepas de Reserva

� La técnica de conservación depende de:

� Tipo de microorganismo� Disponibilidad de equipos del laboratorio� Frecuencia de uso� Medidas de bioseguridad� Método de distribución dentro del laboratorio� La técnica elegida debe asegurar el mínimo

número de repiques de la cepa original� Si se congela, una vez descongelada no se

puede volver a congelar

El registro de las cepas de reserva debe tener:

Identificación de la cepa.Género y especie del microorganismo.

Tipo y Nº de la colección.Nº de lote cepa de referencia.

Nº de criovial o vial.Fecha de reconstitución de la cepa referencia.

Nº de repique.Frasco en uso.

Fecha de baja criovial.Ubicación de almacenamiento.

Observaciones

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LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA es de notable importancia:

�Un buen método de conservación de modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la cepa microbiana original.

�Tener los conocimientos básicos de Microbiología (ej. tipo de microorganismo, crecimiento, etc.).

�Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de microorganismo.

�Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.

Yo no quisiera ser una muestra de referencia!

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GRACIAS POR SU ATENCION