José Luis González-Andújar Instituto de Agricultura Sostenible Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España) Albert Jean Fischer University of California-Davis Departament of Plant Sciences José Vicente Lazo Ariza Universidad Central de Venezuela Facultad de Agronomía Bernal E. Valverde Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical, S. A. (Costa Rica) Faculty of Life Sciences, The University of Copenhagen (Denmark) Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3 1Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. 2Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral (INSAI)-Trujillo. 3Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA)-Miranda. Jesús Caripe Syngenta Crop Protection S.A. Venezuela José Alfredo Muñoz AGROISLEÑA Sucesora de Enrique Fraga Afonso C.A. Departamento Técnico Cástor Zambrano Universidad Central de Venezuela Facultad de Agronomía Pablo Manuel Rodríguez González Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” Decanato de Agronomía

Autores

Lluvia desemillas

Adultos

Plántulas

Banco desemillas

f

s

g

sb

Capítulo 1 ESTIMACIÓN DE PARÁMETROS EN DEMOGRAFÍA DE MALEZAS

José Luis González Andújar

Instituto de Agricultura Sostenible (CSIC, España) Introducción Necesitamos ser capaces de identificar y conocer los factores biológicos y ecológicos que determinan la evolución de las poblaciones de malezas. Dichos conocimientos son vitales para desarrollar métodos predictivos y de manejo más efectivos de la flora arvense. Las poblaciones de malezas están formadas por individuos que varían en su estado funcional (semilla, plántula, planta adulta,…). Un conocimiento mas profundo de dichas poblaciones y su evolución implica la cuantificación de los procesos demográficos que ligan los distintos estados funcionales. Por ello, la estructura de la población, es decir, del número de individuos presente en los diferentes estados en un momento determinado, es el punto de partida para el estudio de cualquier proceso demográfico. Los estudios demográficos en malezología han demostrado tener una gran utilidad práctica y en general se basan en la división del ciclo biológico de la planta en diferentes estados funcionales, por ejemplo, los estudios mas simples, dividen el ciclo de vida de las malezas en cuatro fases: banco de semillas, plántulas, plantas adultas y lluvia de semillas, cada fase está unida a otra a través de los procesos demográficos: germinación (g), supervivencia (o longevidad) del banco de semillas (sb), supervivencia de las plántulas (s) y fecundidad (f) (Fig. 1). Figura. 1. Modelo demográfico básico de una maleza. Emergencia (g), supervivencia del banco de semillas (sb), supervivencia de las plántulas (s) y fecundidad (f)

La estimación de los parámetros que representan los procesos demográficos nos permiten poder desarrollar modelos poblacionales y predecir la dinámica poblacional de la maleza y su evolución bajo diferentes escenarios de manejo. Estimación de los parámetros demográficos Supervivencia del banco de semillas La presencia de una determinada población dentro de una zona se debe, habitualmente, a la existencia de una reserva de semillas (o de propágulos de otro tipo) enterrada en ese suelo. Estos bancos de semillas suelen ser el origen principal de las infestaciones de malas hierbas. La mayoría de los suelos agrícolas contienen una enorme reserva de semillas y propágulos diversos, denominada banco de semillas. Algunos estudios en campos agrícolas han llegado a cuantificar hasta 39000 semillas m-2. El banco de semillas sufre un proceso de pérdidas debido a diferentes factores de mortalidad. Entre los principales motivos de pérdida de semillas y propágulos (bulbos, rizomas, etc.) se pueden citar las técnicas de laboreo, depredación, parásitos o los eventos de germinación. Generalmente, todos esos factores de mortalidad son cuantificados conjuntamente para estimar la tasa de supervivencia del banco de semillas (sb; Fig. 1). La cuantificación de sb se puede realizar por diferentes métodos. Aquí explicaremos uno de los métodos más sencillos para establecer la supervivencia de semillas (sb) en el banco de semillas. En primer lugar tenemos que considerar el período de tiempo (anual, mensual, etc.) en el cual queremos evaluar la supervivencia. Una vez hayamos establecido dicho período de tiempo, pasaremos a evaluar el banco de semillas de la especie considerada en el tiempo 1 y en un tiempo posterior 2 (siempre antes de la reproducción de la planta). Para ellos tomaremos en ambos períodos de tiempo muestras del suelo. Una descripción mas detallada de la cuantificación del banco de semillas se puede encontrar en otro capítulo del presente libro Por lo general el banco de semillas está confinado a los 10 cm superiores, siendo esa la profundidad a que deberemos extraer las muestras. En relación con el número de muestras a extraer, dicho número lo podemos establecer a partir de la Tabla 1, considerando una estima del banco de semillas que vamos a encontrar y el nivel de precisión que deseamos alcanzar. Si bien los bancos de semillas varían ampliamente en densidad, el valor medio para los cultivos de campo en Andalucía (España), es de cerca de 1000 semillas/m2 en cultivos cerealistas. La estimación de esta densidad podría requerir 21 muestras para un nivel de precisión recomendada de 0,3 de acuerdo con la Tabla 1. Claramente, las especies con densidades muy bajas (<100 semillas/m2) podrían requerir tantas muestras de suelo que una determinación precisa de sus bancos de semillas no es práctica. En cuanto al diámetro que deberá tener el barreno para extraer las semillas, nuestra experiencia indica que las muestras de 5 cm. de diámetro son una solución adecuada (Fig. 2). Esta medida de la muestra es lo suficientemente grande como para detectar semillas y lo suficientemente pequeña para no recargar al investigador con un exceso de materiales.

Tabla 1. Número de muestras de suelo (diámetro 5 cm.) necesarias para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseados de precisión suponiendo varias densidades de semillas.

-------------Nivel de precisión ------------ Banco de semillas

(semillas/m2) 0,2 0,3 0,4 0,5

10 716 318 179 115 50 277 123 69 44 100 184 82 46 29 500 71 32 18 11

1000 47 21 12 8 5000 18 8 5 3 10000 12 5 3 2

Figura 2. Toma de muestras de banco de semilla Una vez se han extraído las muestras en los períodos considerados y contadas las semillas de la especie de interés, la tasa de supervivencia se obtendrá de la siguiente forma: sb= nº semillas período 2/ nº semillas período 1 (1) siendo el valor obtenido ≤ 1.

Emergencia de plántulas Las semillas de muchas malezas anuales de verano están latentes cuando ellas se desprenden de sus plantas progenitoras. Aun semillas más viejas en el banco de semillas pueden estar en estado de latencia al final del verano. A veces, durante el siguiente otoño, invierno y/o al comienzo de la primavera, una proporción de estas semillas se capacita para su germinación. En este momento ellas tienen un máximo “potencial de emergencia”. Los potenciales máximos de emergencia de algunas especies, son por ejemplo: Abutilon theophrasti 54%, Avena sterilis 37%, Polygonum pensylvanicum 49%, Amaranthus spp. 13% y Chenopodium album 10% , si bien dichos porcentajes pueden variar bastante en función de la localidad y factores ambientales. La tasa de emergencia (g) se calcula de la siguiente manera. Se colocan 10 marcos fijos de 0,50 x 0,50 cm al azar en el campo de cultivo. Semanalmente desde la siembra hasta la recolección se cuentan las emergencias que aparezcan de la especie estudiada. Después de los conteos, las plántulas se marcan, por ejemplo con un anillo de plástico semirrigido, para evitar volver a contarlas. Una vez tengamos el total de plántulas emergidas y basándonos en el banco de semillas estimado anteriormente, podemos establecer de una forma sencilla la estima de la tasa de emergencia,

g= nº de plántulas /nº de semillas período 1 (2) siendo el valor obtenido ≤ 1. Supervivencia de las plántulas No todas las plántulas emergidas van a poder convertirse en plántulas adultas. Las plántulas van a sufrir un proceso de mortalidad debido a diferentes factores, como por ejemplo, herbívoros, competencia inter e intraespecifica, enfermedades, etc. En el experimento para cuantificar las emergencias, las plántulas emergidas son marcadas con algún distintivo (e. j. anillos de plástico semirrigido), de esa manera podemos seguir la evolución vital de la planta hasta convertirse en planta adulta. Al final del período se realiza un muestreo final donde se cuantificará el nº plántulas y el nº total de las emergidas a través del nº total de anillos de plástico (o cualquier otro método de marcaje considerado). La tasa de supervivencia se cuantificará como,

s= nº de plantas supervivientes/ nº total de plántulas emergidas (3) siendo el valor obtenido ≤ 1. Fecundidad La capacidad de producción de propágulos es muy variable (por ejemplo, Avena sterilis produce 100 semillas/ planta, mientras que Salsola kali produce unas 200 mil/ planta), y depende tanto de la especie en sí, como de los factores ambientales que le afectan. En general, las especies de semillas más pequeñas son más prolíficas que las de semillas mayores (Salsola o Amaranthus > Avena o Galium aparine). La tabla 2 nos ilustra del poder de producción de semillas de las malezas

Tabla 2. Ejemplos de la capacidad reproductiva de algunas malezas

Planta Número de semillas/planta Amapola (Papaver rhoeas) 50-60.000 Matricaria spp. 45.000 Zanahorias silvestres (Daucus carota) 1.200-11.000 Jaramago (Sinapis spp.) 1.200-4.000

La estimación de la fecundidad la llevaremos a cabo recolectando las semillas de un mínimo de 10 plantas adultas, y estimándola de la siguiente manera,

f= nº semillas total/ nº plantas adultas (4) en este caso el nº de plantas sería 10. Desarrollando un modelo de dinámica de poblaciones Un sencillo modelo multiestados funcionales es el modelo conceptual representado por la Fig. 1 que puede ser transformado matemáticamente en las siguientes ecuaciones utilizando los parámetros demográficos ya definidos

P = BSt * g (6) donde P representa el número de plántulas producida por el Banco de semillas (BS). En este punto podemos introducir las medidas de control introducidas por el ser humano (e. j. herbicidas), modificando la ecuación 6 de la siguiente manera,

P = BSt * g (1-c) (7) siendo c el porcentaje de las semillas emergidas que van a sufrir el proceso de mortalidad. El valor del parámetro c se puede obtener de ensayos de herbicidas. Del total de plántulas emergidas únicamente una proporción s se va a convertir en plantas adultas (PA)

PA = P * s (8) Las plantas adultas tienen una tasa de fecundidad f , cuyo producto va a dar lugar a la lluvia de semillas (LLS, semillas/ m2),

LLS = PA * f (9) Finalmente, el banco de semillas que inicia la siguiente campaña agrícola (BSt+1) vendrá dado por,

BSt+1=LLS+ BSt (1-g-sb) (10) que representa la nuevas semillas que se incorporan (LLS) mas las semillas que han sobrevivido en el suelo durante el período de tiempo considerado. Es decir las semillas en suelo que iniciaron la campaña agrícola BSt se han visto mermadas por las semillas que han emergido (g) y la mortalidad que han experimentado en el suelo (1-sb). Sustituyendo los parámetros demográficos por sus estimas, siguiendo la metodología expuesta, podemos simular el modelo por un período de, digamos, 5 años y tendremos una gráfica como la representada en la Fig. 3. En dicha gráfica se han considerado dos escenarios: El primer escenario consiste en no aplicar ninguna medida de control, observando que la población del banco de semillas crece exponencialmente. En el segundo escenario se ha

considerado un control anual del 90% (c= 0,9 en ecuación 7), con el cual la población decrece llegándose a la extinción de la misma a los 5 años (Fig. 3). Figura 3. Simulación de la evolución en el tiempo del Banco de semillas de una maleza. ● (sin medidas de control). ■ (aplicación de un control del 90%) Los modelos de dinámica de poblaciones son herramientas muy útiles para evaluar diferentes escenarios de control a medio y largo plazo y, de esa forma, ayudar a los productores en la toma de decisiones. Lecturas para profundizar Cousens, R. and Mortimer, A. M. (1995). Dynamics of weed populations. Cambridge :

Cambridge: Cambridge University Press. Fernandez-Quintanilla, C. (1988). Studying the population dynamics of weeds. Weed

Research 28, 443-441. Gonzalez-Andujar, J. L. (2008) Weed Control Models. Population Dynamics. Vol. [5] of

Encyclopedia of Ecology, 5 vols. (Eds. Sven Erik Jørgensen and Brian D. Fath), pp.3776-3780. Oxford: Elsevier.ISBN: 0-444-52033-3.

Gonzalez-Andujar, J. L. and Fernandez-Quintanilla, C. (2004). Modeling the population dynamics of annual ryegrass (Lolium rigidum) under various weed management systems. Crop Protection 23, 723-729.

Radosevich, S. R., Holt J. S. and Ghersa C. M. (2007). Ecology of Weeds and Invasive Plants: Relationship to Agriculture and Natural Resource Management, 3rd Edition. John Wiley & Sons, Inc.

Swanton, C. J., Booth, B. and Murphy, S. D. (2003) Weed ecology in Natural and agricultural systems. Wallingford, Oxfordshire, U.K.: CABI Publishing.

Torra, J; Gonzalez-Andujar, J. L and Recasens, J (2008). Modelling the long term population dynamics of poppy (Papaver rhoeas) under various weed management systems. Weed Research. 48:136-146.

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2)

Capítulo 2LA INTERFERENCIA MALEZAS-CULTIVOS: ALGUNAS TÉCNICAS PARA SUINVESTIGACIÓN

Albert FischerUniversidad de California-Davis (USA)

Introducción

Programas de manejo económico de malezas que contemplen reducciones en el empleo deherbicidas deben ser capaces de predecir los impactos potenciales de las malezas sobre lasespecies de interés. Estimaciones de las pérdidas de productividad basadas en la evaluacióntemprana de los niveles de infestación de malezas a fin de poder realizar evaluaciones decosto y beneficio que sirvan de guía para las tome de decisiones en control de malezas.Factores tales como la densidad de la maleza y el cultivo, las proporciones relativas de lasespecies presentes, y el arreglo geométrico de las plantas en el terreno son relevantes endeterminar el resultado de las interacciones de interferencia entre especies.

Una comprensión de los procesos involucrados en las interacciones de interferencia esesencial para conceptualizar tácticas y estrategias exitosas en el manejo de las malezas.Presentamos aquí algunas técnicas experimentales básicas que pueden aplicarse en el estudiode la interferencia de las malezas con las especies de interés tomando ejemplo de diversassituaciones. Estas técnicas son la plataforma basal sobre la que un investigador puedemontar estudios más elaborados; se basan muchas veces en conceptos desarrollados hace yamucho tiempo, pero representan hoy en día una selección de ciertas herramientasfundamentales para un investigador moderno en la ciencia de las malezas.

Interferencia, competencia y recursos

Cuando las plantas crecen en proximidad, su crecimiento se altera con respecto al queexhiben cuando crecen en ausencia de plantas vecinas. El crecimiento en comunidad esreflejo de las interacciones que ocurren entre las plantas. Así, el crecimiento de una plantaindividual puede ser estimulado, deprimido o permanecer inalterado. El términointerferencia negativa se refiere a las alteraciones estimuladoras, inhibidoras o neutrales delcrecimiento que resultan de la proximidad de otras plantas (Donald 1963; Harper 1977;Radosevich et al. 2007). Las formas de interferencia entre plantas son diversas. Ésta puederesultar del consumo de recursos cuyo suministro por el ambiente es limitado, de laliberación de toxinas o estimulantes al sustrato de crecimiento, de efectos protectores o deacciones de depredación y parasitismo (Harper 1977; Radosevich et al. 2007). Competencia(alelospolía) y amensalismo son ejemplos de interferencia negativa. La competencia serelaciona con los recursos de crecimiento que una planta consume: principalmente luz, agua,nutrientes, oxígeno y dióxido de carbono. El sumninistro de estos recursos por el ambientesuele ser limitado y la presencia de vecinos agrava la situación (Radosevich et al. 2007).Competencia (alelospolía es un término que también se usa en la literatura para referirse aesta interacción) es el efecto adverso expresado por aquellas plantas de una comunidad quedeben sostenerse con recursos limitados. Amensalismo puede ocurrir cuando sólo se afecta elcrecimiento de una especie mientras que el de otra especie coexistente no es alterado. Un

caso particular de amensalismo es la alelopatía que ocurre cuando ha existido una liberaciónde cierta sustancia tóxica por parte de la especie no afectada (Radosevich et al. 2007). Laalelopatía puede inhibir a ambas especies si las dos producen sustancias tóxicas resultando enmutuo antagonismo. Existen también casos de interferencia neutral y positiva que notrataremos aquí, aunque algunos autores sostienen que el término interferencia solamente serefiere a las interacciones negativas (Silvertown 1987).

Relación productividad vs. densidad en monocultivo

Monocultivo se refiere a comunidades monoespecíficas donde la densidad (número deplantas por unidad de área) puede ser variable. Cuando la densidad de individuos de ciertaespecie se incrementa, también lo hace la competencia intraespecífica entre esos individuos amedida que los recursos ambientales para el crecimiento se vuelven cada vez más limitados.Una respuesta plástica al aumento de densidad es la reducción del crecimiento individual amedida que la productividad total de biomasa por área se incrementa (Harper 1977). Amedida que las plantas crecen con el tiempo, se alcanzará en algún momento la capacidad decarga del ambiente. Esta capacidad de carga será alcanzada en primer lugar por lasdensidades más elevadas. Para que el crecimiento individual o la densidad puedaincrementarse aún más al aproximares la capacidad de carga de cierto ambiente, es necesarioque ocurra mortalidad de ciertas plantas y que se liberen los recursos necesarios parasostener ese crecimiento individual adicional (Silvertown 1987). El resultado de estasituación se muestra en la Figura 1 donde la productividad total de biomasa por área semantiene constante independientemente de la densidad una vez que se ha alcanzado lacapacidad de carga debido a la compensación por la reducción del crecimiento individual y lamortalidad. Este balance da lugar a lo que se conoce como ley del rendimiento finalconstante (Harper 1977; Radosevich et al. 2007) donde la relación entre el peso promediode la biomasa individual por planta (w) y la densidad (d) está dada por la expresión siguiente:

w= kd-1 [1]

tal que log w = log k – log d [2]

ahora, si la productividad total por área (Y) se expresa como:

Y = wd, [3]

Entonces Y = d(kd-1), para k = constante (Silvertown 1987). [4]

Así, una población no muy densa cesará su crecimiento de biomasa total con el tiempo unavez que alcance la capacidad de carga de ese determinado ambiente. Cualquier incrementoadicional en el crecimiento medio individual de cada planta ocurrirá a expensas de unareducción exactamente proporcional de la densidad como resultado de mortalidad y secumplirá con la relación de la ecuación [2]. Una gráfica de log (w) vs. log(d) para unapoblación no muy densa mostrará una línea de pendiente = -1 (Figura 2). En poblacionesmuy densas, las pequeñas plantas también incrementarán su peso con el tiempo, peroenfrentarán mortalidad antes de que la productividad total haya alcanzado la capacidad decarga y antes de que el crecimiento total de biomasa de la población haya cesado (Silvertown

1987). Empíricamente se ha comprobado que poblaciones densas que hayan alcanzado eltamaño para el cual ocurre mortalidad muestran una relación entre log(w) y log(d) cuyapendiente generalmente se aproxima a -3/2 (Figura 2) (Westoby 1981). Entonces a elevadasdensidades:

W = kd-3/2 [5]

tal que log w = log k – 3/2 log d [6]

Cuando se alcanza la capacidad de carga, la producción de biomasa total por área (w × d) nose incrementa con el tiempo. Pero mientras las poblaciones densas están aún bajo auto-raleo-3/2 (Radosevich et al. 2007; Silvertown 1987) antes de alcanzar la capacidad de carga, laproducción de biomasa individual se incrementa con el tiempo a razón de 3 unidades porcada dos unidades de reducción de densidad y la biomasa total de la población crece con eltiempo (Silvertown 1987). Una vez que la densidad se haya reducido lo suficiente por esteproceso de auto-raleo, la población se comportará según la ecuación [1] y la biomasa total seequilibrará como en el “plateau” de la Figura 1.

Si en lugar de considerar a la productividad como biomasa total como en el caso de la Figura1, la consideramos en términos de rendimiento reproductivo (semilla o grano), su relacióncon la densidad generalmente muestra la respuesta parabólica de la Figura 3 (Donald 1963;Silvertown 1987). Esto puede deberse a factores dependientes de la densidad incremental,también llamados factores densodependientes, como mortalidad antes de la floración,incremento en la esterilidad, o reducción en el número de semillas producidas por planta(Sivertown 1982). En el caso del maíz, la esterilidad suele ocurrir con el incremento delsombreo a elevadas densidades (Duncan 1969). Esas plantas estériles utilizarán recursosambientales para el crecimiento sin contribuir al rendimiento. Es por esa razón que cuandose trata de maximizar el rendimiento reproductivo con un cultivo, se hace necesario hallaruna densidad óptima; mientras que cuando se trata de maximizar el rendimiento de unforraje, las densidades pueden ubicarse dentro del rango de horizontalidad de la curva en laFigura 1 (Donald 1963), lo cual hacen muchos agricultores para favorecer la competencia delforraje con las malezas. Si bien es bien sabido que incrementos en la densidad de un cultivosuelen aumentar su capacidad para competir con y suprimir malezas (Medd et al. 1985;Ghafar & Watson 1983; Walker & Buchanan 1982), la densidad de un cultivo de grano librede malezas no puede incrementarse más allá de un óptimo si se mantiene un mismo arregloespacial de plantío.

Captura de espacio y distancias entre plantas

“Espacio” es un concepto que integra al conjunto de recursos ambientales que una plantarequiere para vivir. Según De Wit (1960) cada planta ocupa un “espacio” que es reflejo delsuministro limitado de recursos ambientales consumibles (luz, agua, nutrientes, oxígeno yCO2). La presencia de vecinos requiriendo los mismos recursos resultará en competencia por“espacio” (Radosevich et al. 2007). Asir este espacio mediante la apropiación de recursos eslo que se conoce como captura de espacio. La captura de espacio ocurre temprano en la vidade las plantas y aquellas que emerjan tarde dentro de una comunidad crecerán muy poco pueslas plantas de aparición temprana ya se habrán apropiado de la mayoría de los recursos

disponibles (Fischer & Miles 1973; Radosevich & holt 1984). En ciertos casos un reajuste delas distancias de plantío permite incrementar la captura de espacio de un cultivo y asíincrementar su capacidad de competir con malezas u otra especie asociada. Para una mismadensidad, el empleo de un arreglo equidistante (equilateral o hexagonal) de plantío reduce lacompetencia intraspecífica entre plantas del cultivo en comparación con un arreglorectangular (cultivo en hileras con plantas más próximas entre sí dentro de la hilera). Lasplantas individuales pueden así desarrollarse mejor, lo cual a menudo incrementa sucapacidad para capturar espacio y su competitividad interespecífica para competir conmalezas u otra especie asociada (Fischer & Miles 1973; Spitters 1983; Altieri & Liebmann1986; Walker & Buchanan 1982; Fischer & Burrill 1993). Según Fischer & Miles (1973),reducir la distancia entre hileras en un cultivo bajo una misma densidad (incrementando así ladistancia entre plantas dentro de la fila) suele tener un mayor efecto supresor de la malezaque un incremento en la densidad. Una desventaja que puede tener el arreglo equilateral deplantío es que, al favorecer un mayor desarrollo temprano del dosel, se puede hacer unconsumo prematuro de agua almacenada en el suelo y en años secos causar estrés hídrico acultivos pluviales (Taylor 1980). Bajo condiciones de humedad adecuada, Wiese et al.(1964) obtuvieron mejores rendimientos de sorgo bajo arreglo equidistante que en hilerasamplias.

Algunas técnicas experimentales para estudiar interferencia entre especies

La competencia entre plantas involucra relaciones complejas, donde diferentes especiesinteractúan por recursos ambientales. La capacidad de apropiarse de esos recursos suelediferir entre las especies (Roush & Radosevich 1985; Vengris et al. 1955) y estácondicionada por el ambiente. Según Caldwell et al. (1985), la competencia entre plantas seestudia mediante experimentos que manipulan el escenario de la competencia de diferentesformas como por ejemplo, eliminando o adicionando individuos vecinos o variando losniveles de disponibilidad de recursos para el crecimiento. Limitando experimentalmente elsuministro de ciertos recursos a una comunidad de plantas, puede generarse informaciónsobre las relaciones y jerarquías competitivas entre las especies involucradas frente arecursos específicos. La complejidad de esas interacciones y de las asociaciones entreplantas ha llevado al desarrollo de ciertas técnicas experimentales para estudiar interferenciaque al agrónomo se le hacen muchas veces extrañas. Algunas de estas técnicas discutiremosa continuación dado que permiten examinar la naturaleza de los recurso por los cuales seestablece la competencia, los niveles intra- e interespecíficos de la interferencia, la respuestasdensodependientes de las plantas, los efectos de proporciones variables entre las especies quecomponen una comunidad, y el efecto de la distribución geométrica de las especies en elterreno sobre las consecuencias finales de la interferencia. Siempre nos manejaremos en elmarco conceptual de la interferencia, pero siempre que hacemos referencia a la manipulacióny captura de recursos, nos estaremos refiriendo implícitamente a interacciones decompetencia.

Parcelas apareadas

Una forma inicial de estudiar el impacto de las malezas sobre los cultivos de una regiónpuede ser el de instalar parcelas apareadas en campos de productor. Una parcela permanecedesmalezada y otra representa las prácticas usuales de desmalezado del agricultor. Esta es

una excelente forma de evaluar la eficiencia del control de malezas que practica el agricultor.Una tercera parcela, enmalezada, puede incluirse en campos con enmalezamientoheterogéneo para percibir cómo varían los rendimientos con diferentes niveles de infestación.Los predios a evaluar deberán agruparse por tipo de cultivo y manejo. Se registrará elrendimiento del cultivo y el nivel de infestación por especie de malezas en cada parcela. Elnivel de enmalezamiento puede evaluarse midiendo su biomasa en un área de muestreo,haciendo conteos, o mediante una evaluación visual de cobertura y vigor sobre el área totalde las parcelas. Las dos (tres) parcelas deben instalarse como un grupo, una junto a la otra, yse pueden ubicar varios grupos de parcelas dentro de un mismo predio.

Experimentos aditivos

En los experimentos aditivos una especie (frecuentemente un cultivo) se planta a densidadconstante y la especie competidora se asocia a esta bajo diferentes densidades (Silvertown1987). Esto permite comparar la agresividad de diferentes competidores contra una especiede interés. En general la relación densidad-productividad (o rendimiento de un cultivo) siguela ley de las ganancias decrecientes, pudiendo incluso llegar a la pérdida de producción total(Radosevich & holt 1984). Esencialmente estos diseños se han usado para averiguar cuántorendimiento comercial se pierde por la presencia de malezas. Los diseños aditivos se hanempleado también para establecer umbrales de densidad de infestación de malezas; nivelesde infestación menores a las densidades umbral no resultarían en daño físico o económico(Schweitzer & Bridge 1982). Los datos usualmente se someten al análisis de varianza y deregresión con modelos lineares y, más frecuentemente, no lineares.

Sistemas expertos computarizados basados en análisis económico a corto y largo plazo hansido desarrollados para diversos cultivosa fin de asistir en decisiones sobre control demalezas (Coble & Mortensen 1992; Lybecker et al. 1991; Wilkerson et al. 1991; Kwon et al.1995). Tales programas deben basarse en ecuaciones precisas capaces de predecir pérdidasde rendimiento causadas por la competencia de malezas. Esos modelos simples y empíricospueden tener mejor adopción por los usuarios que los más complejos modelos ecofisiológicos(Kropff 1993) que resultan extremadamente laboriosos de parametrizar (Kropff 1993; Kropff& Spitters 1991) y suelen más adecuados para la investigación que para el uso práctico. Ensu lugar, se han utilizado ampliamente diversas funciones hiperbólicas rectangulares, las queson más fáciles de estimar, a fin de predecir los efectos de la densidad de infestaciones demalezas sobre el rendimiento de cultivos (Cousens 1985a, 1985b; Kropff & Lotz 1993; Coble& Mortensen 1992). La Figura 4 muestra una relación densidad-pérdida de rendimientohiperbólica descripta por una hipérbola rectangular usando la fórmula de Cousens (1985a):

RP = iD/[1 + (iD/a)] [7]

Donde: RP es porcentaje del rendimiento perdido, D es densidad de maleza, i es el porcentajedel rendimiento perdido con cada planta de maleza adicional cuando D es cercana a cero, y aes una asíntota que corresponde a la pérdida máxima de rendimiento cuando D tiende alinfinito.El período comprendido entre la emergencia del cultivo y la maleza afectan la jerarquíacompetitiva entre ambos, y puede ser un factor más critico aún que la densidad de la malezaen determinar la necesidad de la aplicación de medidas de control de malezas (Knezevic et

al.1993; Kropff 1988). El uso de modelos de simulación también ha demostrado quediferencias en las fechas relativas de emergencia entre malezas y cultivo suelen serresponsables por gran parte de la variación estacional que ocurre en los niveles de pérdida derendimiento por competencia de malezas (Kropff & Lotz 1993). A fin de contabilizar esteefecto fueron introducidas ciertas modificaciones al modelo hiperbólico básico de Cousens(1985a):

RP = bD/[ect + (bD/a)] [8]

Donde: t es el tiempo relativo de emergencia entre la maleza y el cultivo, b es el valor de i(Ec. [7] cuando t tiende a cero, y c es la tasa a la cual i decrece cuando t se incrementa haciael infinito (Cousens et al. 1987). Otro modelo propuesto también por Cousens (1985b)intenta contabilizar el efecto de las densidades de amos, la maleza y el cultivo:

RP = gfD/(1 + dC + fD) [9]

Donde C es la densidad del cultivo, y d, f, y g son parámetros empíricos no lineares. Lasrelaciones para predecir pérdidas de rendimiento causadas por la competencia de malezas hana menudo considerado a una sola especie que emerge de una sola vez en una poblaciónuniforme de plantas cultivadas(Smith 1988; Dieleman et al. 1995; Van Devender et al. 1997).En las condiciones reales de campo, las infestaciones de malezas usualmente consisten dediversas especies presentes en diferentes densidades y emergiendo en momentos diferentes.Por lo tanto, una función para predecir pérdidas de rendimiento por malezas debe estarbasadas en variables independientes que sean capaces de expresar la competitividad de unainfestación multiespecífica de malezas dentro de poblaciones de un cultivo que pueden no serdemasiado uniformes come resulta de las siembras al voleo donde las semillas son enterradascon pases de rastras.

Relaciones densidad-pérdida de rendimiento basadas en conteos del número de plantas porárea tienen el inconveniente de asignar el mismo valor a las plantas grandes que a las plantaspequeñas o a plantas de formas muy diferentes, sin tener en cuenta las diferencias encompetitividad que eso puede implicar. Coble y Mortensen (1992) intentaron compensar estalimitación ponderando las densidades de las especies individuales en una infestación mixtade malezas por un factor que expresaba su competitividad relativa. Este factor (el i de lafórmula de Cousens [7], por ejemplo) se obtenía de experimentos aditivos con especies demaleza individuales. Un enfoque similar fue utilizado por Fischer & Ramírez (1993) conarroz de riego. Simulaciones conducidas con un modelo ecofisiológico demuestran quecuando los niveles de infestación se cuantifican como área foliar relativa de las malezas(áerea foliar de la maleza/área foliar cultivo+maleza) determinada al momento de la clausuratotal del dosel cultivo + maleza (cuando el índice de área foliar total es aproximadamente =1) se relacionan mucho mejor con las pérdidas de rendimiento correspondientes que cuandolas infestaciones se expresan en base a simples conteos de densidad (Kropff & Spitters 1991).Por lo que el área foliar relativa puede ser un mejor descriptor de la presión competitiva deuna infestación que la densidad. El área foliar relativa representa la captura relativa quehacen el cultivo y la maleza del recurso luz, que en la mayoría de los casos es un factorprimordial determinante del resultado de la competencia. Kropff y Lotz (1993) propusieronotro modelo hiperbólico basado en área foliar relativa:

RP = qL/[1 + [(q/a)- 1]L [10]

Donde la variable independiente L es el área foliar relativa de la maleza como fracción delárea foliar total (cultivo+maleza), q es la pendiente de la hipérbola o el coeficiente relativo dedaño que puede usarse como índice de competitividad relativa de esas especie de maleza conel cultivo (Kropff & Spitters 1991), a es la asíntota para la pérdida máxima de rendimiento.

Florez et al. (1999) hicieron un estudio en arroz donde poblaciones heterogéneas demalezas emergieron a los 15 y 30 días posteriores a la emergencia del cultivo. Usando losmodelos [7], [9] y [10] concluyeron que con el modelo [10] y el área foliar relativa seobtenían mejores ajustes que con los otros modelos y la variable independiente (D) expresadacomo densidad, biomasa, o área foliar. La predicción con el modelo [10] era incluso mejor sila variable dependiente usada era una estimación visual de cobertura foliar relativa. Unavariante del modelo [10] es un modelo similar donde se asume que a densidades de malezarealmente alta la pérdida de rendimiento del cultivo es total:

RP = qL/[1 +(q-1)L [11]

Florez et al. (1999) describieron adecuadamente niveles de infestación de mezclas de malezasde varias especies (mezcla multiespecífica) usando el área foliar relativa o la cobertura foliarrelativa. Pero un tratamiento más adecuado y que dio una mayor precisión en la predicciónde pérdidas de rendimiento se obtuvo al considerar el efecto de cada especie por separado yluego agregar todas las respuestas de forma aditiva en un solo modelo como había sidosugerido por Fischer & Ramírez (1993); Kropff & Lotz 1993; Parker & Murdoch 1996):

RP = ∑{ inLn/[1 + (inLn/an)]} [12]

Donde el subíndice n corresponde al efecto de la enésima especie de maleza y L es área foliarrelativa o cualquier otra variable que exprese el nivel de infestación (densidad, biomasa porárea, etc.). Kropff & Lotz (1992) proponen el siguiente y similar modelo cuando se usa áreafoliar relativa como variable para mantener coherencia con la derivación de su modeloanterior [10]:

RP = ∑qnLn/[1 + ∑ (qn-1)Ln] [13]

En la práctica nosotros no encontramos ninguna diferencia al usar cualquiera de los dosmodelos [12] o [13] así como cuando se usaron los modelos [7] y [10] con área foliar relativa(Florez et al. 1999). Los modelos hiperbólicos de pérdida de rendimiento empleandovariables que sean buenos descriptores de la competitividad de una mezcla multiespecífica demalezas permiten el análisis económico de opciones de manejo y control de malezas alpermitir confrontar costos con el valor de las pérdidas potenciales.

El empleo de estos modelos para definir umbrales económicos de infestación siempre se hacriticado pues los efectos a largo plazo de no controlar malezas cuando las infestaciones soninferiores a los niveles de umbral puede conducir al incremento del reservorio de malezas enel suelo y a mayores niveles de infestación futuros (Bauer & Mortensen 1992) o a lapropagación de biotipos de malezas resistentes a herbicidas. También Norris (1982) señala

que densidades de malezas mucho menores de las que usualmente aöarecen en los cultivos yason capaces de causar cuantiosas pérdidas de productividad. Sin embargo, la utilidad de lapredicción de pérdidas de rendimiento como componente de sistemas expertos de decisión vamás allá de la simple decisión de si se aplica herbicida (u otra forma de control) o no. Enrealidad, este enfoque de predicción empírica de pérdidas debe usarse para la selección dealternativas económicas de control mediante la confrontación de costos y potencialesbeneficios como se mencionó anteriormente. Debido a la variabilidad que existe entre unsitio y otro, la predicción de pérdidas de rendimiento basada en modelos matemáticosempíricos no puede extrapolarse con liberalidad de una localidad a otra. De forma que estasecuaciones presentadas y discutidas aquí sugieren que su rango de aplicación puedeexpandirse cuando se detectan y se incorporan al algoritmo de predicción de pérdidas fuentesclave de variación entre localidades o estaciones de crecimiento. No obstante estasposibilidades, la extrapolabilidad de los modelos empíricos es limitada (Wagner et al. 2009;Spitters & van den Bergh 1982; Moechnig et al. 2003) y conviene restringirla a condicionessimilares bien caracterizadas. Es necesario anotar también que las malezas no infestan uncampo de forma uniforme, sino que las comunidades pueden variar de un lado a otro de uncampo y presentarse en forma de parches heterogéneos. Esto causa dispersión de lasobservaciones alrededor de la curva predicha con la ecuación que ilustra la relativa bajaprecisión de esta técnica para decidir si uno controla malezas o no en un sitio específico(Figura 5). Este ruido puede limitarse si las evaluaciones se estratifican en sectores de uncampo que sean más o menos uniformes dentro de sí.

Para que las predicciones de pérdidas puedan usarse con fines de toma de decisión esnecesario que los niveles de infestación en un cultivo se cuantifique lo más temprano posible.Por ejemplo, en el caso del trabajo presentado en la Figura 5 las evaluaciones se hicieron dossemanas después de que las malezas comenzaron a emerger. Pero cuando se usa el área foliarrelativa como variable debemos recordar que los modelos de Kropff están basados endeterminaciones hechas al momento del “cerrado” del dosel, es decir cuando se sabe cuálserá la partición efectiva del recurso luz entre el cultivo y la maleza. Para poder hacerpredicciones tempranas basadas en esta variable se hace necesario modelar o tener algunarelación empírica que permita simular el crecimiento del área foliar de cada especie de formaque, basándose en una determinación temprana de área foliar, se pueda predecir cuál será elárea foliar de cada especie al momento de la intercepción completa del dosel (índice de árreafoliar ~ 1) (Kropff 1993). Es posible hacer esto en una hoja electrónica tipo Excel, asignandoun porcentaje constante de incremento de área foliar diario (o según tiempo térmico =grados-día) basados en estudios previos de crecimiento temprano (el cual en esas etapasiniciales se aproxima bastante a la linearidad). Esto explica porqué los modelos que usansimples medidas de densidad han sido más más populares por ser más fáciles deparametrizar.

El diseño aditivo permite establecer el perjuicio económico de un control de malezasincompleto (Spitters & van den Bergh 1982). Simula la situación donde un cultivo esplantado en una densidad normal o deseada y sufre la infestación de un rango al azar dedensidades de malezas (Silvertown 1987). Sin embargo, el arreglo topológico o geométricode las plantas en el terreno así como las proporciones entre especies no son controladas poreste diseño. Otra desventaja es que este tipo de diseño es inapropiado para determinar losniveles de interferencia intra- e interespecífica y tampoco permite establecer cuál de las

especies que compiten (mezcla de dos especies) es más competitiva que la otra (Radosevichet al. 2007; Silvertown 1987).

Es difícil ubicar en el campo parcelas experimentales con densidades perfectamentecontroladas y repetidas dentro de un diseño experimental convencional para medir su efectosobre el rendimiento de un cultivo. Por esto se suelen definir en el campo aéreas con manejoy condiciones de crecimiento uniformes en donde se ubica un número abundante de parcelasde tamaño tal que permitan tener dentro de ellas una infestación de densidad uniforme (locual es fácil cuando se trabaja con relativamente pocas especies pero bastante máscomplicado si se quieren estudiar muchas especies). Las parcelas se marcan en el campo enlugares de infestación diferente de modo de tener al final un amplio rango de infestaciones,incluyendo áreas sin malezas (o desmalezadas experimentalmente). Se hace unadeterminación temprana de las infestaciones uy luego a la madurez del cultivo se cosecha elgrano en cada parcela. Naturalmente si se dispone de la mano de obra necesaria, puedenestablecerse experimentos con densidades controladas de malezas mediante raleo depoblaciones naturales dentro de parcelas experimentales en diseños completamentealeatorizados o de bloques al azar, los que también pueden someterse al análisis porregresión. También es frecuente sembrar parcelas con densidades específicas y controladasde una o varias especies si se dispone de semilla de maleza de germinación confiable y/o siuno también está en condiciones de efectuar luego raleos de uniformización (Moechnig et al.2003). Es frecuente ver experimentos parcelarios convencionales con arreglos factoriales dediversos niveles de fertilidad combinados con densidades de siembra u otra variable demanejo y dentro de cada parcela se definen luego sub parcelas donde se ubican densidades deinfestación homogéneas y se mide el rendimiento a cosecha del cultivo como se mencionóanteriormente.

Series de reemplazo o diseños sustitutivos

El diseño de series de reemplazo fue introducido para superar algunas de las limitaciones deldiseño aditivo. Las series de reemplazo toman cuenta de los efectos de diferentesproporciones en una mezcla de especies y este diseño puede resultar muy informativo sobreel proceso de interacción entre dos especies. Consiste en hacer variar la proporción de dosespecies, A y B, en una mezcla desde 0 a 100% mientras que la densidad total (A + B) semantiene constante (Harper 1977) (Figura 6). La densidad total debe establecerse losuficientemente elevada para asegurar que existe competencia entre las plantas. SegúnRadosevich et al. (2007) la densidad total debería corresponder al plarteau de la curva derendimientos independientes del nivel de densidad de la figura 1. Sin embargo, Spitters(1980) propone que para trabajar con cultivos asociados (“intercropping”) la densidad totalde ambas especies debería ser equivalente a aquella que usan los agricultores con esoscultivos; quizás porque estas densidades pueden representar, o estar cercanas, a la capacidadde carga del ambiente. Según Harper (1977) y De Wit (1960), cuatro diferentes modelos odiagramas de reemplazo ilustran los posibles resultados de la interferencia que puedeestablecerse en un experimento de series de reemplazo (Figura 7) . Estos modelos permitenidentificar diversas interacciones tales como la competencia por los mismos recursos,diferenciación de nicho, antagonismo y otras. Experimentos con series de reemplazo se hanempleado para estudiar el efecto de diversas condiciones de crecimiento sobre el resultado dela competencia entre dos especies (Patterson & Highsmith 1989; Wall 1993; Fischer et al.

2000). Conjuntamente con los diagramas de reemplazo los rendimientos relativos (RY) y elRendimiento relativo total (RYT) representan índices útiles para examinar los datos queprovienen de tal tipo de experimentos, y pueden ayudarnos a identificar los recursos por loscuales las especies pueden estar compitiendo (Hall 1974). La productividad para unadeterminada mezcla de especies (cada una a cierta proporción) puede expresarse comocrecimiento relativo (RRA = biomasa por área de la especie A en la mezcla expresada comoporcentaje de la biomasa por área de esa misma especie A en monocultivo). Para unadeterminada mezcla , los rendimientos relativos totales (RRT) se calculan como:

RRT = RYA + RRB (Harper 1977) [14]

Los diagramas de reemplazo de la Figura 7 resultan de graficar las proporciones de loscomponentes de las mezclas (A o B) vs. el RR de cada especie. El RYT aparece como lalínea trasversal superior de cada diagrama. Cuando RYT = 100 significa que las especiesestán compitiendo por los mismos recursos cuyo suministro es limitado (Fig. 7, Modelos IIay IIb); RRT > 100 significa que más biomasa es producida cuando las especies crecen enmezclas de diversas proporciones que cuando crecen en monocultivo (proporción = 100%),sugiriendo que las especies están recurriendo a recursos diferentes, evitan total oparcialmente la competencia, o que mantienen una relación simbiótica (Harper 1977)(Figura7, Modelo IV). Evasión de la competencia puede ocurrir cuando las especies demandanrecursos diferentes del ambiente o cuando la adquisición de recursos está separadaen elespacio o en el tiempo; esto se conoce bajo el término de diferenciación de nicho (Spitters1983). Los Modelos IIa y IIb de la Figura 7 representan dos posibles alternativas de unainteracción competitiva donde el crecimiento de una especie se deprime en la misma medidaen que el crecimiento del competidor superior se incrementa por encima de la línea diagonal(punteada) de referencia. Si los recursos son limitados y las especies compiten por ellos,forzosamente lo que “gana” un componente de la mezcla lo “pierde” el otro. Las líneasdiagonales de referencia indican que la competitividad de ambas especies es equivalente, esdecir, nada cambia al sustituir una planta de una especie por una planta de la otra (Modelo I).Cuando resulta un diagrama como el del Modelo I, las especies pueden ser decompetitividad equivalente, o bien puede ocurrir que la densidad total es demasiado baja ylas especies no alcanzar a entablar competencia por ningún recurso (Harper 1977). En elcaso del Modelo III el crecimiento de ambas especies se deprime cuando crecen en mezcla;nadie gana: ambas pierden. Esto es un efecto antagónico mutuo, tal como podría ocurrir sicada especie liberara una sustancia alelopática que resulta nociva al crecimiento de la otra.

Otro índice de competencia útil es el Coeficiente Relativo de Aglomeración (CRA), el cualpuede derivarse de los datos de un experimento de series de reemplazo a fin de cuantificar laagresividad relativa de una especie sobre la otra (Harper 1977). Así el CRA de la especie Avs. la especie B está dado por:

CRAA vs. B =

productividadmedia por planta de la especie A en

mezcla

productividad media por planta de la especie B

en mezcla

productividad media por planta de la especie A

en monocultivo

productividad media por planta de la especie B

en monocultivo

[15]

Cuando organismos en una mezcla de dos especies compiten por recursos limitados, aquellaespecie que tenga el mayor valor de CRA será el competidor superior. La Figura 8 representaun ejemplo de cómo puede usarse este diseño para investigar la mecánica de la interacciónentre dos especies que crecen asociadas.

Fischer et al. (2000) condujeron experimentos en cámaras de crecimiento para estudiar cómolas temperaturas ambientales en el estado de Dakota del Norte afectarían la interaccióncompetitiva entre el cultivo de trigo (una especie tipo C3) y una maleza muy importante deeste cultivo, Kochia scoparia (L.) Schrad. (una especie tipo C4). Se condujeron dos series dereemplazo simultáneamente en cámaras separadas y los experimentos se repitieroncambiando de cámara para minimizar efectos que no fueran exclusivamente las diferenciasde temperatura (indicadas en la Figura 8). Las proporciones de reemplazo en las mezclasfueron 100/0, 75/25, 50/50, 25/75, y 0/100 para el trigo y la kochia, respectivamente. El pesoindividual de plantas para las tres mezclas interespecíficas se sometió al análisis de varianza(ANOVA); el tratamiento mezcla fue considerado como factor principal y la especie comotratamiento de subparcela. Se calcularon los rendimientos relativos y los valores de RRTcorrespondientes, así como valores de CRA para trigo y kochia; datos de CRA fuerontambién sometidos al ANOVA. El efecto mezcla y la interacción mezcla × especie resultaronsignificativos (P < 0.01) lo cual indica la presencia de efectos de competencia. En el régimenmás frío, el trigo produjo más biomasa que la kochia (datos no mostrados), y ambas especiescompitieron por recursos limitados (RRT = 100) y el trigo resultó más competitivo que lakochia (CRAtrigo = 4.1 vs. CRAkochia = 0.3). Esto último se ve claramente en el diagramaizquierdo de la Figura 8 donde la curva de rendimiento de kochia está deprimida y la deltrigo es convexa con respecto a las diagonales imaginarias. Temperaturas más cálidasresultaron más favorables a la kochia (su curva de RR ya no está por debajo de la diagonalimaginaria, si bien ambos cultivos no difirieron en sus CRA (1.1 para la kochia y el trigo).Bajo las temperaturas cálidas se obtuvieron RRT > 100 para todas las mezclas, lo cualsugiere que estas especies evitaban parcialmente la competencia, en particular en las mezclasde 25/75 y 50/50 kochia/trigo. Bajo temperaturas frescas los mayores costos energéticos delsistema fotosintético C4 (Hatch 1970) determinaron menores tasas fotosintéticas (datos nomostrados) reduciendo la producción de biomasa y la competitividad de la kochia. Losvalores de RRT > 100 sugieren que, bajo esas condiciones, la interferencia en las mezclas fuemenor que cuando cada especie creció en monocultivo debido a la presencia de rutas

alternativas de adquisición de recursos resultante de diferencias en las estructuras de laplantas de kochia y el cereal o de diferencias en la forma de explotar los recursos decrecimiento (Trenbath 1976). La existencia de efectos simbióticos también es posible cuandoaparecen valores RRT >100, pero en este caso eso fue descartado dado los fuertes efectoscompetitivos (RRT = 100) observados a las bajas temperaturas. Este estudio de series dereemplazo permitió concluir que la intercepción de luz (las plantas estaban abundantementefertilizadas y regadas)por un cultivo frondoso y tolerante al frío que se siembra temprano enla primavera, bajo condiciones frías, puede suprimir el establecimiento o la competenciatemprana de la kochia.

Biomasa total

por unidad de

área

Número de plantas sembradas por

unidad de área

Figura 1. Relación entre densidad y producción de biomasa de una especie (adaptado de Radosevich et al.

2007).

A la capacidad de carga

(producción final constante)

Antes de alcanzar la

capacidad de carga

Figura 2. Efecto de la densidad (d) sobre el peso de una planta individual (w); sindo k = constante (adaptado de

Silvertown 1987).

Densidad (no. plantas m-2)

Rendimientoperdido(RP, %)

RP = i x D

a

i x Di x Da1 +

RP =

Figura 4. Relación hiperbólica entre la pérdida de rendimiento por competencia y la densidad de

malezas ; donde: RP es porcentaje del rendimiento perdido, D es densidad de maleza, i es el porcentaje

del rendimiento perdido con cada planta de maleza adicional cuando D es cercana a cero, y a es una

asíntota que corresponde a la pérdida máxima de rendimiento cuando D tiende al infinito.

Pérdidaderendimientodearroz(%)

Peso de biomasa aérea de malezas (g m-2)

Figura 5. Rendimiento de arroz afectado por la competencia de malezas que emergieron a los 15 (círculos negros) y

30 (círculos blancos) días posteriores a la emergencia del arroz predichos por un modelo hiperbólico (Cousens

1985a).

Figura 6. Proporción variable de dos especies en una serie de reemplazo (adaptado de Roush &Radosevich 1985)

Modelo I Modelo IIa Modelo IIb

Modelo III Modelo IV

ProductividaddelaespecieA

Productividad

Figura 7. Posibles modelos resultantes de experimentos de serie de reemplazo. En el eje vertical se grafica

alguna medida de productividad (biomasa, rendimiento de grano, etc.); si esta productividad fuera expresada

como rendimiento relativo (RY), el máximo en cada eje sería de 100% para ambas especies. El eje horizontal

represent a las proporciones (de 0 a 100%) de ambas especies en mezcla. (adaptado de Radosevich et al. 2007).

ProductividaddelaespecieB

ProductividaddelaespecieA

ProductividaddelaespecieB

Proporción de Kochia scoparia (%)

Rendimientorelativo(%)

Figura 8. Rendimientos relativos y rendimientos relativos totales (RYT) (triángulos blancos) de trigo (círculosnegros) y Kochia scoparia (triángulos blancos) creciendo bajo dos regímenes día/noche de temperaturas enexperimentos de series de reemplazo (adaptado de fischer et al. 1999).

Trigo

Kochia

Trigo

Kochia

Experimentos sistemáticos

En este tipo de experimentos la densidad de plantas es incrementada sistemáticamentedentro de un arreglo espacial o geométrico constante. Los diseños originales fueronpropuestos por Nelder (1962) y por Bleasdale (1967), y básicamente consistían en ubicalplantas a lo largo de rayos que emanaban desde el centro de una “rueda”(o “abanico”, cuandosólo se consideran secciones o “tajadas” de esa rueda). La geometría del área alrededor decada planta (definida por la posición de sus vecinos) puede ser determinada según losobjetivos experimentales (Nelder 1962; Bleasdale 1967; Assemat 1986). Estos diseños sehan usado mayormente para determinar el efecto de la densidad sobre la competenciaintraespecífica y para determinar las densidades más apropiadas para un cultivo. Sinembargo, uno puede sobre imponer este diseño a una cobertura o stand uniforme de otraespecie (maleza) y averiguar así la densidad y el arreglo de plantío de un cultivo que mejorsuprime a la maleza. Estos experimentos pueden ubicarse en distintos lugares y los datos sontípicamente analizados por regresión (Mead & Stern 1980). Las curvas provenientes de losdiferentes experimentos (localidades) pueden compararse con pruebas normalmente usadasen la comparación de regresiones lineales o no-lineales (Chow 1960; Seefeldt et al. 1995).No obstante hay quienes además usan ANOVA para comparar tratamientos (localidades,espaciamientos, especies) . En ese caso, se ha considerado al experimento como equivalentea un diseño en bloques al azar con bloques divididos, dado que según Nelder (1962) elmuestreo de los “rayos” de las posiciones dentro de ellos puede ser tratado como unprocedimiento realizado al azar (Sanderson & Elwinger 2002). Con experimentos endiferentes localidades los bloques (considerados como efecto al azar) irían anidados dentrode localidades. En el diseño tipo “rueda” de Nelder (1962), las densidades efectivas (A) encada arco (n) pueden calcularse según Asiwe et al. (2005) como:

An = (Xn+1 – Xn-1)/2b [15]

Donde b es el número de plantas por arco y X la distancia del arco al centro de origen.

Una variante del diseño de Nelder (1962) fue propuesta por Freyman & Dolman (1976), lacual permite el uso de hileras de plantación paralelas espaciadas a una distancia fija, tal comoocurre en cultivos en hileras de maíz, frijol, y muchos otros que por razones agronómicasdeban plantarse de esa forma. En todas las diversas variantes de los experimentossistemáticos, la superficie de terreno que le corresponde a cada planta individual cambiasistemáticamente a lo largo de cada radio o hilera dentro del rango de densidades deplantación ensayadas. La forma del arreglo espacial se mantiene siempre el mismo paratodas las plantas. A menudo la variación sistemática del espacio por planta es sólo uno de losdiversos factores que se pueden combinar en estos experimentos (arreglo geométrico,genotipos, fertilización o nivel de recursos, y otros). Estos experimentos pueden sobreimponerse a otros experimentos con parcelas demasiado pequeñas para permitir susubdivisión en un gran número de densidades.

Fischer & Burrill (1993) utilizaron diseños sistemáticos con maíz para comparar la respuestaa la densidad para un espaciamiento equidistante (Nelder 1962) y otro rectangular (hilerasfijas separadas a 76 cm; Freyman & Dolman 1971) entre plantas a fin de hallar una combinación de espaciamiento y densidad que rindiera más y que pudiera ser más competitiva

con un tapiz subyacente de trébol blanco (Figura 9). El experimento fue analizado usandoregresión y demostró que cuando el maíz había sido plantado sobre un mulch suprimido detrébol blanco, rendía más en un arreglo de plantación equidistante que en siembras en hilerasfijas distanciadas para un amplio rango de densidades de siembra. Esto se debía a que eldesarrollo individual de las plantas equidistantemente separadas era mejor; la distribuciónequidistante había disminuido la competencia intraespecífica entre plantas de maíz y permitíala mejor competencia interespecíficas de éstas con la cobertura asociada de trébol blanco(Fischer & Burrill 1993). Estos diseños son muy útiles cuando se carece de informaciónprevia, por lo que representan una forma eficiente de obtener información preliminar. Sepuede explorar un número elevado de densidades en un espacio pequeño. Se los ha utilizadomucho en ciencias forestales, y para el manejo de especies cultivadas asociadas y losdistintos trabajos muestran la introducción de ciertas variantes a los diseños originales segúnlas necesidades y la imaginación del investigador.

Figura 9a. Diseño sistemático de densidad con un arreglo de plantación aproximadamentecuadrado (solamente se han representado ocho arcos de lo que en el terreno constituyó una ruedaentera tipo Nelder (1962)). Adaptado de Fischer & Burrill (1993).

Figura 9b. Diseño sistemático de densidad con un arreglo de plantación rectangular con hileras(horizontales) de espaciamiento fijo según Freyman & Dolman (1971). Adaptado de Fischer &Burrill (1993).

Peso fresco de mazorcas (Tons ha-1)

Plantas por hectárera (x1000)

Arreglo equidistante (cuadrado) Hileras separadas a 76 cm

Figura 10. Rend imiento de mazorcas de maíz dulce cuando el cultivo se plantó a d iferentesdensidades en un arreglo aproximadamente equid istante o en hileras fijas (arreglo rectangular)separadas a 76 cm. Las regresiones son estad ísticamente d iferentes (P < 0.01) según una prueba Fcomparando todos los coeficientes de ambas ecuaciones.

Como desventajas de los diseños sistemáticos presentados puede comentarse el hecho de queen las “ruedas”de Nelder las plantas quedan en el centro de un área trapezoidal que puede noreflejar la situación real en el campo; las relaciones espaciales no son un factor que puedemanipularse dentro de un experimento determinado (Radosevich 1987). Frecuentemente esdifícil introducir una adecuada aleatorización en estos diseños lo que es ciertamente unalimitante para el análisis de los datos.

Series de adición

Los experimentos en series de adición han sido propuestos por Spitters (1983a, 1983b) y hansido ya bien descriptos y discutidos por varios autores (Radosevich 1987; Rejmanek et al.1989; Roush et al. 1989) . Estos modelos son una variante de los experimentos sistemáticosy se basan en la ley de los rendimientos inversos según la cual resulta el concepto derendimiento final constante planteado en la ecuación [1]. Esta ley plantea que el pesoindividual de una planta decrece hiperbólicamente con el incremento de su densidad:

w-p = a + kd [16]

Donde al igual que en [1], w es el peso individual por planta, d es la densidad, a es unintercepto (que se incorpora ahora en esta relación empírica) y k es otra constante. El

exponente p representa la relación hiperbólica entre w y n la que en genera,l se aproxima a 1(Figura 11). La relación en general puede linearizarse mediante la expresión:

1/w = a + kd [17]

Spitters (1983) planteó que si los efectos de la competencia intra- e interespecífica eranaditivos, entonces los modelos de densidad-productividad podrían expandirse para considerarlas mezclas de especies. La expansión del modelo de rendimiento inverso tomaba la forma:

1/w1 = a1,0 + b1,1d1 + b1,2d2 [18]

1/w2 = a2,0 + b2,2d2 + b2.1d1 [19]

Donde cada subscripto en cada término representa a la especie cuya biomasa estárepresentada como variable dependiente y el segundo suscripto se refiere a la especieasociada. Los coeficientes b1,1 y b2,2 cuantifican los efectos de la competenciaintraespecífica y los coeficientes b1,2d2 y b2.1d1 representan la magnitud de la competenciainterespecífica de la especie 2 sobre la especie 1 y de la especie 1 sobre la 2, respectivamente.Estas ecuaciones permiten una representación gráfica de superficie de respuesta que permitevisualizar bien los efectos de competencia intra- e interspecífica en una y otra especie quecomponen la mezcla (Figura 12) (Rejmánek 1989):

De la Figura 12a se deduce claramente que el tomate es muy poco competitivo con laEchinochloa y que el crecimiento de esta es más afectado por la presencia de plantas de supropia especie; la competencia en este caso es fundamentalmente intraspecífica. En cambioel tomate crece mejor en presencia de vecinos de su propia especie que en competenciainterespecífica con Echinochloa (Figura 12b). El gran valor de los experimentos de series deadición es que esta es pues la primera vez que tenemos un modelo conceptual y matemáticopara poder contabilizar por separado ambos tipos de efectos competitivos. Más especiespueden incorporarse de la misma forma al modelo. Por otra parte este enfoque permitetrabajar con regresiones lineales sencillas para obtener información bastante mecanísticasobre la interferencia entre las especies. Por ejemplo, las ecuaciones [18] y [19] permitencalcular índices para caracterizar la competitividad relativa de cada especie (Spitters 1983a y1983b). Así (b1,2/b1,1) y (b2,1/b2,2) serían las competitividades relativas de la especie 1 y de laespecie 2, respectivamente, cuando ambas crecen en mezcla y cuando se considera para cadaespecie su capacidad el crecimiento de otra a la vez que su propia capacidad de afectarse a símisma. Conceptualmente ambos componentes podrían ser afectados de forma separada porfactores ambientales (o de manejo agronómico) y resultar en consecuencias competitivasdiferentes. Por lo que estos índices pueden resultar muy útiles para caracterizar los efectos

del manejo agronómico de las malezas o las variaciones del ambiente sobre sus efectos hacialos cultivos. De forma similar se puede estimar el grado de diferenciación de nicho. Si elcociente (b1,1/b1,2)/(b2,1/b2,2) resulta mayor que uno, es porque existe diferenciación de nichoy el RRT > 1, indicando que la mezcla total captura más recurso que los monocultivos(Spitters 1983a y 1983b). Lo que suele ocurrir cuando las especies difieren en suprofundidad radical explotando diferentes zonas del suelo, o cuando una leguminosa que fijanitrógeno del aire crece asociada con una gramínea que esencialmente debe usar nitrógenodel suelo (Kropff & Lotz 1993).En el caso de dos especies, el procedimiento experimental consiste en variarsistemáticamente la densidad y proporción de las especies en la mezcla como se ilustra lalsiguiente matriz (Radosevich 1987):

Donde la densidad de cada especie (A o B) va desde 0 a 16 plantas por unidad experimentalen monocultivo y de 2 a 32 plantas por unidad experimental en mezcla, o sea (1+1) a(16+16), respectivamente. La disposición parcelaria de una serie de adición con tres especiesy cuatro densidades tendría la forma presentada en al Figura 13. Esta disposición debealeatorizarse y si se desea poblar de puntos a las regresiones todo el esquema deberíarepetirse un cierto número de veces.

Naturalmente que el diseño de series aditivas puede analizarse usando regresión no linear condiversos modelos hiperbólicos, los que pueden ser simples hipérbolas tipo [7] o más simples(Daugovish et al. 2003), o realmente complejos incorporando una multiplicidad decoeficientes usando sofisticados procedimientos para el diseño de los modelos como elAkaike’s Information Criterion (AIC) , el Bayesian Information Criterion (BIC), o elInformation Complexity Criterion (ICOMP) (Jasieniuk et al. 2008) que reemplazan laselección tradicionales de modelos alternativos empleando hipótesis nulas ( Jasieniuk et al.2001). Por ejemplo, con la nube de puntos generados con muchos experimentos, uno de esosmodelos seleccionados por esos criterios de información teórica mencionados, incorpora a ladensidad del cultivo (Dc) la densidad de la maleza (Dw), el tiempo de emergencia del cultivoprevio a la de la maleza (T), a la tasa de crecimiento intrínseca del cultivo (Rc), la tasa a lacual i (coeficiente visto en el modelo [7]) decrece hacia cero a medida que T se vuelve grande(c), coeficiente de competitividad interespecífica de la maleza (aw), y al coeficiente decompetitividad intraespecífica de la maleza (b) en un mismo modelo con el fin de hacerpredicciones para el manejo de una maleza en un cereal de invierno (Jasieniuk et al. 2008):

[20]El enfoque es complejo pero interesante; sin embargo, subsiste el problema que habíamosdiscutido antes, de la variabilidad de los coeficientes cuando los modelos intentan hacer

predicciones en rangos ambientales muy amplios. Esto ha llevado a cuestionar la insistenciade usar modelos matemáticos para hacer predicciones de vocación universal, cuando losdatos empíricos de campo consistentemente sugieren que esto no sería lo más indicado. Estocontrasta con la inteligente elegancia y sencillez de los modelos de Spitters, los que fueronexitosamente empleados recientemente por Vasquez et al. (2008) para demostrar quemodificando los niveles de nutrientes en el suelo se puede manipular la competitividad intra-e interespecífica de Bromus tectorum, a fin de favorecer a las comunidades de gramíneasnativas en pasturas naturales del oeste americano.

Período crítico de control de malezas

Esta es quizás una de las técnicas más viejas y utilizadas en el estudio de la competenciaentre las malezas y las especies de interés, especialmente aquellas de interés agrícola (Nietoet al. 1968). Es una técnica que ha sido de enorme utilidad en la definición de estrategias demanejo económico de malezas con el concomitante potencial para reducir el impactoambiental del sobreuso de herbicidas. En teoría controlar malezas antes o después delperíodo crítico de control no redunda en beneficio económico o tiene efecto en evitarpérdidas de rendimiento por la competencia de las malezas. Existe en la literatura unainfinidad de trabajos de determinación del período crítico con malezas en todo tipo decultivos y por todo el mundo.

En muchos casos se observa que ciertos cultivos toleran la presencia de malezas en ciertosmomentos y no en otros, de manera tal que hay momentos en que el desmalezado no seríanecesario (Radosevich et al. 2007). El objetivo aquí es determinar en qué momento del ciclode crecimiento de un cultivo es necesario ubicar el desmalezado a fin de prevenir pérdidasfísicas y/o económicas de rendimiento. Para esto se emplea un diseño clásico (Figura 13)que consiste en una serie de tratamientos en los que el cultivo crece enmalezado desde suemergencia por períodos progresivamente más largos, al final de los cuales las malezas sequitan y el cultivo se mantiene desmalezado hasta la cosecha (Fischer et al. 1988). En otraserie de tratamientos complementaria, el cultivo se mantiene libre de malezas duranteperíodos progresivamente más prolongados desde la emergencia, al final de los cuales sepermite el enmalezamiento (o incluso se siembran malezas) incontrolado hasta a cosecha.Con los rendimientos del cultivo a cosecha se grafican los datos tal como se muestra en laFigura 14. De esta forma se determinan comparativamente los efectos de las malezas queemergen temprano y los de las que emergen tarde y en diferentes momentos.

El período crítico de control se inicia en el momento en que la presencia de malezas queemergen desde el inicio causa pérdidas de rendimiento físicas o económicas. Esto a vecesdefine que haya un cierto período inicial de tolerancia durante el cual las malezas son muypequeñas y su competencia con el cultivo es negligible (Figura 14A). Frecuentemente elperíodo crítico de control se inicia cuando los doseles de las malezas comienzan a interceptaral del cultivo dando inicio a la competencia por luz (Fischer et al. 1988). En otros casos, noexiste tolerancia inicial y los rendimientos se afectan por más breve que sea el período deenmalezamiento inicial, lo cual suele ocurrir cuando las plantas compiten activamente porrecursos del suelo (agua y nutrientes); ésta es la situación típica para justificar tratamientoscon herbicidas de preemergencia. Lo importante es poder ubicar el manejo que permite queen determinado momento el cultivo sea capaz de maximizar la captura de espacio y suprimir

el posterior establecimiento de nuevas cohortes de malezas. Este punto marca el fin delperíodo crítico, y es el punto donde la curva de rendimientos en la Figura 14B se estabiliza,lo cual es importante pues indica que a partir de ese momento ya no es necesario continuardesmalezando al cultivo pues éste se encarga por sí mismo de suprimir malezas a partir deentonces. Esto no siempre ocurre y es importante optimizar el manejo del cultivo a fin delograr un período crítico lo más breve posible. El fin del período crítico de control a menudoes determinado por la máxima captura de luz y ocurre cuando el dosel del cultivo se cierrasobre el terreno y logra una completa intercepción de luz (Gibson et al. 2002; Teasdale1998). Por esta razón es útil efectuar mediciones secuenciadas de irradianción debajo deldosel con un fotómetro para determinar el momento en que se logra una intercepción de luztal que maximiza la dominancia competitiva del cultivo (Evans et al. 2003; Norsworthy &Oliveira 2004).

Este es un tipo de experimento sumamente útil que debe ser parte de los primeros pasos detodo programa de manejo de malezas para un cultivo. Naturalmente, los resultados sondenso-dependientes y lo mejor sería conducir el experimento bajo diferentes niveles deinfestación. En general, lo que se hace es (a) conducirlo bajo infestaciones típicas de camposde producción o (b) buscar elevadas infestaciones que nos sitúen en el plateau asintótico delas pérdidas de rendimiento (Figura 4), donde variaciones en la densidad causan poco cambioen los niveles de pérdida. Los límites del período crítico (Figura 14C) dependen mucho delas especies involucradas y de su momento relativo de emergencia. El crecimiento de lasmalezas y del cultivo es afectado por las fluctuaciones en la disponibilidad ambiental derecursos y por los efectos que sobre ésta tienen las prácticas culturales (Hall et al. 1992). Losresultados de estos experimentos pueden variar de un año para el otro (Gibson et al. 2002) yes importante cuantificar variables ambientales asociadas que puedan relacionarse convariaciones en la ubicación en el tiempo del período crítico, lo que puede señalaroportunidades para el manejo agronómico (Evans et al. 2003; Northsworthy & Oliveira2004). Por esta razón estos experimentos deben repetirse para cubrir un rango adecuado devariaciones ambientales típicas para una región. También resulta una buena idea conducireste tipo de experimento incorporando diferentes alternativas de manejo buscando identificarlas situaciones que permiten reducir este período crítico. La emergencia, composiciónbotánica y uniformidad de la distribución espacial de las malezas suele ser inconsistente yconstituyen fuentes de variabilidad que pueden comprometer la exactitud de la ubicación delperíodo crítico. Es común sembrar malezas a fin de garantizar infestaciones uniformes através de toda la superficie del experimento. Otra fuente de inexactitud de los resultados es elhecho de que los extremos (principio y final) del período crítico se definen a partir de doscomponentes distintos y medidos de forma separada (la serie de enmalezado inicial y la seriecomplementaria de desmalezado inicial). Sin embaro, el período crítico está definido comoun único espacio de tiempo donde el inicio y el final se dan en la misma situación (Figura14C), cosa que en general nunca se verifica y puede ser una fuente de error en lasestimaciones (Weaver 1984).

Es importante evaluar los niveles de infestación a fin de poder establecer en qué momento ycon qué nivel de severidad es que la supresión de malezas impacta positivamente losrendimientos y qué nivel de supresión es necesario para que los rendimientos se estabilicen.Para esto suelen hacerse evaluaciones (mediante conteos, estimaciones de cobertura,mediciones de biomasa u otros) en las parcelas según cada serie de tratamientos. Así, en la

serie donde el enhierbado se permite que ocurra (o deliberadamente se inicia mediante lasiembra de malezas) luego de distintos momentos iniciales de desmalezado, el muestreo sehace hacia finales del ciclo del cultivo. Mientras que en la serie donde el cultivo crece conmalezas durante diversos períodos posteriores a su emergencia, el muestreo se hace justoantes de desmalezar la parcela. Los resultados pueden graficarse como en la Figura 15. Esútil también efectuar secuencialmente conteos de emergencia de malezas en las parcelas a finde determinar en qué momento emergen las maleas responsables por las pérdidas derendimiento observadas. Deberán registrarse las especies presentes y sus respectivos nivelesde infestación.

Los datos de rendimiento del cultivo pueden expresarse en términos físicos (kg ha-1) o entérminos económicos lo que permite definir al período crítico en términos de umbraleconómico para decidir, en base a la relación costo-beneficio, el momento económicamenteadecuado para desmalezar (Fischer et al. 1993). La amplitud del período crítico y/o laduración de los tratamientos de en- y desmalezado suele medirse en unidades de tiempo(días, semanas), pero es mucho más probable que la duración del período crítico se relacionemás con las etapas fenológicas del cultivo que con el tiempo cronológico (Radosevich ert al.2007). Por esta razón frecuentemente se definen los tratamientos en base a etapasfenológicas o al tiempo térmico (grados de crecimiento/día), el que normalmente conduce laprogresión fenológica (Webster et al. 2009) Figura 14).

Los experimentos de período crítico de control son usualmente implementados a campo y sudiseño ese convencional, con tratamientos generalmente ubicados en bloques al azar conrepeticiones. Frecuentemente el diseño es de parcelas divididas con cada serie (en- odesmalezamiento inicial) ubicada en las parcelas mayores y los períodos en las subparcelas(Kenezevic et al 2002). Los datos se someten a ANOVA y pruebas de separación de mediaspueden usarse para comparar diferencias estadísticas entre tratamientos (Knake et al. 1974).Sin embargo, como la presencia de malezas en el cultivo está considerada a distintosintervalos de tiempo y ésto constituye una variable incremental continua, el método deanálisis de datos más adecuado es el de la regresión (Cousens 1988). Diversos modelos deregresión pueden ajustarse a los datos; desde simples modelos empíricos de regresiónmúltiple a modelos asintóticos más elaborados tales como funciones de Gomperz, logística, ohipérbolas rectangulares (Gibson et al. 2002; Hall et al. 1992; Cousens 1988). En general, laescogencia del modelo es empírica, basada en la forma de la curva, y luego se busca aquélque proporcione el mejor ajuste. Estos modelos no lineales suelen tener dos o trescoeficientes por lo que es aconsejable que el número de intervalos (tratamientos de des- oenmalezado inicial) sea por lo menos cuatro a fin de poder ajustar adecuadamente una curvalos puntos; lo ideal sería usar seis o más intervalos para ganar precisión en la estimación ycomparación de coeficientes (Knezevic et al. 2002). Los siguientes son ejemplos de modelosfrecuentemente usados (Cousens 1988; Hall et al. 1992; Gibson et al. 2002; Knezevic et al.2002):

Y = [(1/{exp[c × (T – d)] + f} + [(f – 1)/f]] × 100 [21]

Este es un modelo logístico modificado usado frecuentemente para describir la respuesta aperíodos de enmalezamiento inicial creciente (curva descendiente), donde Y es el rendimientoexpresado como porcentaje de un testigo desmalezado, T es la variable independiente (tiempo

expresado en grados de crecimiento/día o en días después de la emergencia), d es el punto deinflexión de la curva (unidades de tiempo), c y f son coeficientes estimados (Hall et al. 1992).

Y = a exp(- b exp(- kT)) [22]

Este otro [22] es un modelo de Gomperz frecuentemente usado para describir la respuesta aperíodos progresivamente más largos sin malezas desde la emergencia (curva derendimientos crecientes) (Hall et al. 1992); donde Y es el rendimiento expresado comoporcentaje del testigo libre de malezas todo el ciclo, a es la asíntota para el máximorendimiento, b y k son constantes (coeficientes) estimadas por la regresión, y T es la variableindependiente (tiempo expresado en grados de crecimiento/día o en días después de laemergencia). Para esta misma situación de rendimientos crecientes en respuesta a undesmalezamiento progresivamente más largo, Cousens (1988) propuso esta fórmula:

Y = a + b/(1+cx) [23]

Donde a, b y c son coeficientes de regresión estimados. Naturalmente se observarán en laliteratura diversas variantes de todos estos modelos.

Período con control de malezas

Período sin control de malezas

Semanas posteriores a la emergencia del cultivo

Númerodeltratamiento

Figura 13. conceptualización gráfica de las serie de tratamientos utilizados en experiments para determinar elperíodo crítico de control de malezas en un cultivo.

Figura 15. biomassa de malezas a la cosecha del arroz cuando dos variedades crecieron libres de malezas duranteciertos períodos posteriores a la cosecha, al fin de los cuales se permitió que las malezas crecieran libremente con elcultivo hasta la cosecha del mismo. En este caso el final del período crítico de control de malezas evaluado paraambas variedades se ubicaba en los 60 días posteriores a la emergencia del arroz. Adaptado de Fischer et al. (1993).

Días libres de malezas posteriores a la emergencia del arroz

Biomasaaéreasecademalezas(gm

-2)

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Capítulo 3TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA ALELOPATÍA ENTRE MALEZAS YCULTIVOS

José Vicente LazoUniversidad Central de Venezuela

Introducción

Durante la evolución, las plantas, debido a su condición de ser organismos sésiles, handesarrollado un conjunto de mecanismos de defensa ante los factores bióticos y abióticos delmedio ambiente. Estos mecanismos, “grosso modo”, son de naturaleza física, fenológica yquímicos, y una característica muy particular es que todos esos mecanismos de defensaoperan en forma sinergística, lo cual confiere a las plantas una extraordinaria capacidad deadaptación para un amplio rango de condiciones ecológicas.

El tema de esta conferencia se refiere precisamente al mecanismo de defensa química queposeen las plantas, el cual tiene su origen en los llamados metabolitos secundarios. Como sunombre lo indica, estas sustancias son sintetizadas a través de la ruta del metabolismosecundario, también llamada ruta del ácido shikimico. Los metabolitos secundarios no soloparticipan en la defensa química de la planta, sino que además constituyen un mecanismo decomunicación química, tanto endógeno como exógeno. O sea que vienen a funcionar comoun tipo de “lenguaje químico” por medio del cual las plantas se comunican con su medioambiente biótico y abiótico. Las interacciones entre plantas, y entre las plantas y susenemigos y/o amigos naturales (herbívoros, insectos, nematodos, microorganismos, etc.) sonbásicamente mediadas por metabolitos secundarios.

Las defensas químicas de la planta pueden ser constitutivas o inducidas. En el primer casoson sintetizadas aun cuando aparentemente no exista un factor estimulante o estresante delmedio, mientras que en las segundas, su síntesis es estimulada ante la presencia de un factorestresante del medio, como sería por ejemplo la presencia de insectos entomófagos,microorganismos, herbívoros, o plantas de diferentes especies que alcancen nivelespoblaciones críticos para el uso de recursos comunes.

Para describir las interacciones químicas entre plantas, se utiliza el término alelopatía (delgriego allelon = uno al otro, del griego pathos = sufrir; efecto desfavorable de uno sobreotro) el cual fue utilizado por primera vez por el botánico austriaco Hans Molisch (1937) paradescribir los efectos perjudiciales o benéficos que de manera directa o indirecta ejercen unasplantas sobre otras (incluyendo microorganismos), mediante la acción de compuestosquímicos que son liberados al medio ambiente. De hecho, Molisch definió la alelopatia como“Interacciones Bioquímicas entre todos los tipos de plantas incluyendo microorganismos”. Seha sugerido que es un factor importante en la regulación de la estructura de las comunidadesvegetales y en la velocidad de crecimiento de las plantas, y ha sido atribuida a flavonoides,estructuras fenólicas y terpenoides. En todo proceso alelopático existe una planta (donadora)que libera al medio ambiente (por lixiviación, descomposición de residuos, lavado de hojas,etc.) compuestos químicos los cuales al ser incorporados por otra planta (receptora) provocan

un efecto perjudicial o benéfico sobre la germinación, crecimiento o desarrollo de estaúltima.

Los compuestos que desencadenan el proceso se denominan aleloquímicos o sustanciasalelopáticas. Es importante enfatizar que la definición de Molisch incluye tanto los efectosperjudiciales como benéficos e incorpora a hongos y otros microorganismos además de lasplantas superiores. Sin embargo, en función de los objetivos de la presente conferencia,usaremos el concepto expresado por Müller, quien utiliza el término alelopatía para referirsea los efectos nocivos de un compuesto químico producido por una planta superior sobreotra planta superior.

El otro aspecto que es muy importante tener en cuenta cuando se estudian las interaccionesentre plantas superiores, es diferenciar la alelopatía de la competencia. Esta última implicala reducción en la disponibilidad de algún recurso del entorno, debido a su utilización por unindividuo vegetal, que es requerido también por otra planta que comparte el mismo hábitat,por ejemplo, el agua, los nutrientes minerales y la luz; mientras que la alelopatía implica laliberación al entorno por parte de una planta de un compuesto químico que ocasiona unefecto sobre otra.

En otras palabras, el efecto negativo sobre el crecimiento y desarrollo causado por lacompetencia, se debe a la reducción en la disponibilidad de recursos comunes, mientras queen la alelopatía tiene su origen en compuestos químicos liberados por una planta que afectana otra. También pudiéramos decir que alelopatía es interferencia química, mientras quecompetencia es interferencia física. La respuesta a la competencia es por lo general una

reducción en el crecimiento de la planta, mientras que la respuesta a la alelopatía esestimulación a baja concentración e inhibición a medida que la concentración delaleloquímico aumenta. Como podemos ver, estos conceptos son diferentes entre sí, pero silos enfocamos con un criterio ecofisiológico nos daremos cuenta de que ambos procesos nosolamente son interdependientes, sino que son complementarios en su efecto. En este sentido,si queremos describir cuales son los efectos totales de una plantas sobre otras en unacomunidad vegetal monoespecífica o multiespecífica, utilizaremos el término interferenciael cual viene a ser la resultante de la sumatoria de los efectos causados por la alelopatía y lacompetencia o alelospolía de manera simultánea o secuencial.

El otro término que es importante conocer y que muchos autores han considerado como uncaso especial de alelopatía, es la autotoxicidad; la cual ocurre cuando la planta donadora y laplanta receptora del agente alelopático, son de la misma especie.

También vale la pena mencionar, aún cuando no sea objeto de esta conferencia, laimportancia de los metabolitos secundarios de las plantas en la medicina humana.Aproximadamente el 25% de los fármacos que se venden con prescripción médica hoy endía, se derivan de plantas medicinales tradicionales. Por ejemplo, en los EEUU losmedicamentos naturales derivados de las especies Echinacea spp (St. John`s wort) yHypericum perforatum, representan casi el 19% del consumo en medicina natural alternativa.En el año 2002, este mismo país importó mas de 200 millones de Kg., de productosbotánicos crudos de plantas medicinales por un valor de unos $ USA 332 millones. Estamisma tendencia se ha observado en otros países desarrollados, como el caso de AlemaniaOccidental donde un 56% de la población usa remedios naturales provenientes de plantasmedicinales para la cura de un amplio rango de enfermedades comunes como gripe, úlcerasestomacales, bronquitis, etc.

Metodología de la investigación en alelopatía

Uno de los grandes retos de la investigación en alelopatía es poder separar el efectoalelopático del efecto competitivo, de manera que podamos determinar cuantitativamente lacontribución relativa de la alelopatía y la competencia al efecto de interferencia como untodo. En consecuencia, cuando se diseña un experimento en alelopatía hay que tener encuenta que se deben tomar todas las previsiones para tratar de separar el efecto alelopáticodel efecto competitivo, o sea medir alelopatía en ausencia de competencia.

La investigación de un fenómeno alelopático es complicada, porque aún cuandometodológicamente logremos separar el efecto alelopático del efecto competitivo, existenotros factores que hay que tomar en cuenta; por ejemplo, una vez que el metabolitosecundario es liberado al medio ambiente, este puede experimentar transformaciones queaumenten o disminuyan su actividad antes de llegar a establecer contacto con la especiereceptora. Si el metabolito secundario llega al suelo, por exudación radical o por lavadofoliar, muy probablemente va a ser metabolizado y transformado por la microflora del suelo,lo que puede ocasionar que el verdadero efecto aleloquímico sea expresado por esta sustanciaproveniente de la actividad microbiana del suelo y no por el metabolito secundariooriginalmente producido por la planta. En este caso particular hay que tomar en cuentaademás que la actividad transformadora de la microbiota del suelo sobre el metabolito

secundario, va a depender en gran parte de la magnitud y calidad de la población microbiana,la cual a su vez está sometida y depende de la acción de factores abióticos (humedad ytemperatura del suelo, contenido de materia orgánica del suelo, textura del suelo, etc.).

Muchos autores han cuestionado la forma en que se realiza la investigación de la alelopatía yhan llegado a la conclusión de que “demostrar la alelopatía es extremadamente difícil; eslógicamente imposible probar que no existe y casi imposible probar que existe” pero lomismo podría decirse acerca de la existencia de la competencia; dos especies puedencompetir si hay una limitada suplencia de recursos que son requeridos por ambas, pero lacompetencia también puede existir aun cuando los recursos no tengan suplencia limitada yaque dos especies pueden interferirse en el uso de esos recursos.

El otro aspecto mencionado por algunos autores es que los bioensayos de laboratorio parademostrar la alelopatía se han conducido sin tomar en cuenta el contexto evolutivo delorganismo. Es muy difícil concluir mediante bioensayos de laboratorio que la aleopatía es ono es, uno de los factores fundamentales que influyen en la competencia en los ecosistemasnaturales. La simple presencia de compuestos alelopáticos en órganos de la planta nodemuestran la alelopatía, como es el caso de algunos compuestos fenólicos (ácidos vanílico,4-hidroxibenzoicos, etc.) muy comunes en el reino vegetal, los cuales al ser extraídos de lostejidos de la planta ejercen efecto alelopático en la cápsula de Petri, pero no así en el campo.

No obstante las críticas que se le puedan hacer a los bioensayos en los estudios de alelopatía,en el sentido de que estos no demuestran consistentemente la interferencia química entreplantas en los ecosistemas naturales, es importante reconocer su importancia metodológica,por lo cual se ha insistido mucho en tratar de mejorar los protocolos de investigación de losbioensayos para tratar de simular tanto como sea posible, las complejas situaciones que sepresentan en condiciones de campo, ya que las mayores críticas a los bioensayos se hanenfocado precisamente en su artificialidad y poca correspondencia con lo que realmenteocurre en las interacciones entre plantas en el campo. Los compuestos alelopáticos sonliberados a la rizosfera, directa o indirectamente, mediante lavado, incorporación ydescomposición de residuos, volatilización, o por exudados radicales; esto implica quecuando realizamos bioensayos con extractos de plantas la relevancia ecológica de dichosresultados es muy limitada. Algunos autores opinan que es muy fácil, pero no conclusivo,demostrar el potencial alelopático de cualquier especie vegetal mediante algún bioensayo,porque casi todas las especies de plantas pueden, mediante una digestión apropiada,extracción y concentración, producir un potencial efecto tóxico sobre una planta receptora,por esta razón lo recomendable es evitar el uso de lavados y de extractos comoprocedimientos para demostrar alelopatía en los bioensayos de laboratorio.

En forma general la investigación en alelopatía comprende 2 etapas:1. Fase biológica – ecológica.2. Fase química – analítica.

Fase biológica – ecológica:

Esta fase se inicia cuando por simple observación percibimos en condiciones de campo unaaparente interacción negativa severa entre plantas. Esta puede visualizarse, por ejemplo,

como zonas de suelo desnudo alrededor de vegetación arbustiva, cobertura vegetal rala bajoun grupo de árboles, persistencia de un estado particular dentro de la sucesión vegetal oimpedimento del desarrollo o reducción del rendimiento en un cultivo infestado con unamaleza agresiva en particular.

El siguiente paso es determinar si competencia, alelopatía u otro proceso (un patógenovegetal, una plaga, etc.) es responsable de la reducción de crecimiento observada en laespecie afectada. Normalmente si el efecto observado no puede atribuirse a variables físicasambientales (pH, temperatura, nutrientes minerales y contenido de agua), ni a los procesosindicados anteriormente, se considera que la alelopatía es la causa.

A continuación, debe determinarse el mecanismo de liberación y el camino por el cual semueve el supuesto aleloquímico en el medio. Los métodos de extracción deben tratar desimular las rutas de entrada de las sustancias tóxicas al entorno natural. No es recomendableusar procedimientos de extracción que involucren el uso de solventes orgánicos o agua enebullición, porque pueden llevar a la detección de fitotoxinas que en condiciones naturalesestán física o químicamente unidas de tal forma que no podrían actuar en la inhibición decrecimiento vegetal.

Los aleloquímicos, después de entrar al medio ambiente de la planta receptora pueden ejercerun efecto directo (rápido) o un efecto indirecto (retardado). Los efectos directos van adepender fundamentalmente de su concentración bioactiva, y de su destino y tiempo deresidencia en el suelo; mientras que los efectos indirectos pueden ser causados pordegradación y / o transformación del aleloquímico liberado, a través de reacciones bióticas oabióticas del suelo. Por ejemplo, tanto las arcillas minerales del suelo (abiótico) como

enzimas del suelo (biótico) han sido reportados como catalizadores de reacciones deoxidación de compuestos fenólicos en el suelo. De igual manera, se han reportado evidenciasde que los elementos polivalentes Cu2+, Mn2+ y Fe3+ facilitan la transformación decompuestos fenólicos en el suelo. Los efectos retardados de los aleloquímicos podríantambién estar relacionados con sus efectos sobre la biota del suelo y con las característicasfisicoquímicas del suelo.

Representación esquemática del efecto del medio hospedero (suelo) en la disponibilidad delos aleloquímicos. Tomado de Inderjit y K.M.M. Dakshini

BioensayosPara el estudio de una alelopatía en particular debe establecerse un bioensayo estándarseleccionando especies blanco (target o indicadoras) convenientes y se bioensayan loscompuestos colectados anteriormente evaluando cambios en tamaño y peso en los órganos deéstas. Son frecuentes los bioensayos de germinación de semillas y crecimiento de plántulas.También se han diseñado bioensayos con plantas enteras (por ejemplo. Lemna minor). Lasespecies blanco o indicadoras se seleccionan de acuerdo al objetivo que se persigue (porejemplo, corroborar la sensibilidad a un aleloquímico de una supuesta especie receptora quese observó en campo). Es aconsejable seleccionar especies que presenten germinaciónuniforme, sensibilidad a gran variedad de aleloquímicos especialmente a bajasconcentraciones de los mismos y crecimiento rápido. De esta manera en el análisis estadísticode la información se pueden obtener bajos coeficientes de variación y la más altasignificación para los parámetros de crecimiento mensurables (por ejemplo. longitud de raízy vástago).

Los métodos más frecuentes utilizados en bioensayos son:a) Para Extractos vegetales; Caja de Petri, Suelo y Arena.b) Para estudios de interacción entre plantas intactas; Suelo, Arena y Agarc) Para material vegetal; Esponja de celulosa, Suelo, Arena

Los ensayos de germinación y los de crecimiento de plántulas son ampliamente utilizadosdebido a que son sencillos y permiten una evaluación rápida de la respuesta de una especievegetal a un agente presuntamente alelopático. Como especie receptora o indicadora, sepuede utilizar cualquier maleza o cultivo. Algunas de las especies más comúnmenteutilizadas son: Lepidium sativum L. (Berro), Lactuca sativa L. (lechuga), Lycopersicumesculentum L. (Tomate), Daucus carota L. (Zanahoria), Allium cepa (Cebolla), Triticumaestivum L. (Trigo), Hordeum vulgare L. (Cebada) y Zea mays L. (Maíz).

Las pruebas de germinación se conducen en cajas de Petri de 9 cm de diámetro conteniendodiscos de papel de filtro completamente humedecidos con un volumen constante (4 a 8 ml)de la solución de prueba. Previo al estudio de germinación las semillas de la plantaindicadora deben ser esterilizadas para evitar contaminación con microorganismos, medianteinmersión de las semillas con burbujeo de aire en una solución 2% (peso/volumen) dehipoclorito de sodio durante 15 minutos y luego enjuagar cuatro veces con agua destilada.Otro método empleado para la desinfección de semillas, tanto de la especie donadora comode la receptora, consiste en sumergir las semillas en etanol (70% por 2,5 min.), seguido de 4enjuagues con agua destilada estéril; luego son sumergidas en hipoclorito de sodio (2,5% por15 min.), seguido de 5 enjuagues con agua destilada estéril.

Por lo general se colocan 50 semillas de cada especie indicadora, en cada caja de Petri, conpapel de filtro o papel toalla. El criterio de germinación es cuando hay emergencia de laradícula. Debido a la solubilidad limitada en agua de algunos aleloquímicos, y para facilitarla penetración del aleloquímico en la semilla se ha sugerido la disolución de cantidadesadecuadas de estas sustancias inicialmente en Dimetilsulfóxido (DMSO) y luego diluir enagua a la concentración deseada. Contenidos de 0,05% (v/v) de DMSO no tendrían efectosobre la germinación. Los tratamientos testigos deben contener igual concentración deDMSO para evitar falsos resultados. Se sugieren concentraciones de 5 x 10-3 M, 1 x 10 -3 M,1 x 10-4 M y 1 x 10-5 M. Posibles efectos aditivos o sinergismos pueden evaluarse usandocombinaciones de varios de estos aleloquímicos. Entre cuatro a seis cajas de petri, cada unaconteniendo 50 semillas, deberían ser usadas para cada concentración (tratamiento) de losagentes alelopáticos. Las cajas de Petri conteniendo las diluciones de prueba y las semillasdeberían ser incubadas, preferiblemente en un germinador o una cámara de crecimiento concondiciones controladas de temperatura, humedad relativa, intensidad de luz y horas de luz.

Las lecturas de germinación, crecimiento radicular, del coleoptilo, etc., se realizan adeterminados intervalos de tiempo después de haberse colocado la semilla en contacto con lasolución potencialmente alelopática; por ejemplo, a los 2, 4, 6, días. Debe compararse lagerminación de cada una de las soluciones de prueba contra la del control. El diseñoestadístico más apropiado en estos estudios es el arreglo completamente aleatorizado de lasunidades experimentales pero también se puede emplear el diseño de bloques al azar.

Con la información obtenida se construyen las correspondientes curvas de porcentaje degerminación en función de los días para cada concentración de aleloquímico, para losdiferentes agentes alelopáticos y especies receptoras. Comparar la respuesta de las diferentesespecies a las sustancias ensayadas. Estos resultados dan una idea del potencial alelopático dela especie donadora, pero no se pueden extrapolar a campo, dado que las concentracionesproducidas de los metabolitos se desconocen, así como también se desconoce que ocurre con

los mismos una vez puestos en contacto con el sustrato, debido al pH, a la humedad, a lamicrobiota, etc.

Efecto de los extractos de hoja (H) y raíz (R) Rumex crispus sobre el crecimiento de laradícula y el vástago de varias especies indicadoras. Tomado de Gómez C et al. Algunosestudios de alelopatía de Rumex crispus y Polygonum cegetus HBK en Colombia.

Es muy importante, antes de realizarse los bioensayos, medir los potenciales osmóticos de lassoluciones contentivas de los potenciales compuestos alelopaticos, para estar seguros de queel efecto sobre la germinación y sobre el crecimiento de la radícula o de la plántulaindicadora, se debe a un potencial efecto alelopatico y no a un efecto osmótico. La existenciade potenciales osmóticos muy elevados en las soluciones de extractos a ser evaluados inhibela germinación y crecimiento de muchas especies. El instrumento idóneo para medir elpotencial osmótico de una solución es el osmómetro.

En caso de no disponerse de un osmómetro, se pueden usar soluciones de manitol o D-sorbitol, en orden creciente de concentraciones conocidas y potenciales osmóticos conocidosy se realizan bioensayos con estas soluciones de manitol para ver en que concentración orango de concentraciones, se ve afectada la germinación de la planta indicadora. Paraexplicar el procedimiento de elaboración de curvas de calibración de potenciales osmóticos,usaremos un ejemplo obtenido del trabajo de Maestría del Ing. Zambrano C, realizado en elLaboratorio de Fisiología y Metabolismo Vegetal de Cultivos y malezas Tropicales, FAGRO,UCV. En este trabajo se elaboraron curvas de calibración para evaluar el efecto de laconcentración osmótica de los eluatos y extractos de la especie donadora sobre la altura delas plantas indicadoras de las especies Echinochloa colona, Ischaemum rugosum, Lactucasativa y Oryza sativa. Las soluciones utilizadas estuvieron entre 10 y 25mg diluidas en 50 mlde agua destilada, siendo la solución testigo agua destilada pura. El potencial osmótico decada una de las concentraciones de D-sorbitol se midió en un Osmómetro, Osmette 5002 ycon estos valores se construyó una curva de los valores de altura de plántula (Y) versus lospotenciales osmóticos (X).

Curvas de calibración de potencial osmótico de las especies indicadoras utilizando la alturade planta como variable respuesta.

La metodología, sin lugar a dudas, es uno de los aspectos fundamentales para el estudio de laalelopatía. Por esta razón, muchos investigadores han considerado como prioritarioestandarizar los métodos de estudio, lo cual ha llevado recientemente al desarrollo delMétodo de Análisis de Laboratorio ECAM (Equal-Compartment- Agar-Method), que permitesimular la liberación natural de aleloquímicos desde plantas vivas donantes hacia un mediode cultivo estéril y sin nutrientes, evitando el efecto de microorganismos y la competenciapor nutrientes, agua y luz entre las especies vegetales evaluadas. En este método, las etapasen órden de ejecución son: a) desinfección de las semillas de las especies donantes yreceptoras; b) Pregerminación en cámara de crecimiento con condiciones controladas de luz,temperatura, HR, etc. c) Colocación de las semillas pregerminadas (donante y receptoras) enel medio de cultivo (agar esterilizado)

Fase química-analítica:Si un efecto fitotóxico puede demostrarse a través de los bioensayos, se procede alaislamiento e identificación de los aleloquímicos potencialmente responsables. Mediante la

utilización de técnicas como las cromatografías en capa fina, en papel, líquida de alta presión(HPLC) y gaseosa acoplada a espectrómetro de masas, se pueden identificar la mayoría delos compuestos aislados.

Una vez identificado el agente alelopático, debe detectarse su presencia en la parte delentorno (aire, suelo, solución del suelo) a través de la cual estaría ejerciendo su acción, en laconcentración adecuada, para causar la inhibición de la planta receptora. Esto no es fácil,porqué los compuestos biológicamente activos frecuentemente se encuentran enconcentraciones muy bajas en el suelo, lo cual dificulta la extracción y detección de losmismos.

Muchos autores enfatizan que no se puede emplear una sola técnica para probar la presenciao no de un fenómeno alelopático. Los criterios expresados anteriormente, considerados enconjunto, pueden ser muy útiles en la evaluación de la naturaleza de un fenómeno deinterferencia en particular.

Uso potencial de la alelopatía en la agricultura moderna.La agricultura moderna a fin de satisfacer la enorme demanda de alimentos impulsada poruna población mundial en continuo crecimiento, tiene como piedra angular para alcanzar losniveles de productividad necesarios para satisfacer dicha demanda, el uso extensivo eintensivo de agroquímicos, los cuales cuando son utilizados de manera racional y como partede un sistema de agricultura sostenible dentro de programas de control integrado de plagas yenfermedades, cumplen su cometido sin afectar drásticamente al medio ambiente. Dentro deestos agroquímicos, los herbicidas ocupan el primer lugar de importancia, ya que entre losfactores bióticos limitantes de la productividad agrícola, la flora maleza es considerada elfactor mas relevante y es aquí precisamente donde las investigaciones en alelopatía pudieranaportar un elemento complementario, mas no alternativo, en el enriquecimiento de lasestrategias de manejo de malezas en los agroecosistemas, dentro de programas integrados,orientados a una mayor sustentabilidad de los sistemas de producción agrícola. Para lograruna mejor utilización del fenómeno alelopático es necesario profundizar su estudio, conespecial referencia a su aplicabilidad en sistemas de rotación de cultivos, manejo deresiduos, prácticas de labranza y la búsqueda de nuevas moléculas herbicidas para hacerfrente a la amenaza creciente de especies malezas particularmente problemáticas por haberevolucionado el carácter de resistencia a muchos de los herbicidas de mayor uso eimportancia a nivel mundial. Debido al mejoramiento de las técnicas de aislamiento eidentificación de los aleloquímicos, aunado a nuevos sistemas de cultivo y optimización debioensayos, muchas de las investigaciones actuales en alelopatía están dirigidas a ladeterminación de la naturaleza estructural de los productos naturales que han demostrado supotencial alelopático, con la finalidad de buscar moléculas con actividades biológicasimportantes. Desde este punto de vista, la alelopatía se constituye en una herramienta paraidentificar especies de plantas que puedan presentar efectos fitotóxicos sobre especies demalezas, particularmente aquellas donde se ha encontrado el carácter de resistencia a muchosde los herbicidas de mayor uso a escala mundial. De tal manera que hoy en día, la alelopatíatiene un renovado interés agronómico, ya que la proliferación de malezas que han mostradoresistencia frente a los herbicidas convencionales, hace imperante la necesidad de encontrarnuevos herbicidas, con nuevos mecanismos de acción, cuyas estructuras químicas pudieranestar impresas en muchos compuestos aleloquimicos, esperando ser descubiertos, pero no

como una fuente directa de herbicidas naturales, sino como una fuente de plantillasmoleculares o estructuras bases, a partir de las cuales, mediante modificaciones ytransformaciones sintéticas, se produzcan potenciales herbicidas.

La alelopatía ha sido y puede seguir siendo utilizada en agroecosistemas con fines prácticos:utilización de cultivos de supresión o cubiertas alelopáticas vegetales, rotaciones alelopáticaso cultivos acompañantes, incorporación de residuos de cultivos alelopáticos al suelo y uso deextractos fitotóxicos de plantas alelopáticas. Mas recientemente, se está realizando muchainvestigación en la búsqueda de germoplasma con potencial alelopático para identificarcultivares con alta actividad alelopática y transferir esta característica a cultivarescomerciales. Esta línea de investigación ha permitido conocer la existencia de muchasaccesiones con alto potencial alelopatico en cultivos de arroz, cebada, y trigo.

ConclusionesComo hemos podido observar, el gran reto de la investigación en alelopatia es metodológico.Es necesario continuar trabajando en la optimización de los bioensayos a objeto de que losresultados provenientes de esta herramienta puedan ser utilizados para explicar y demostrar,tanto como sea posible, las complejas situaciones que se presentan en la interferenciaquímica entre plantas en condiciones de campo. En este sentido, la literatura científica en estadisciplina, propone el reforzamiento de las siguientes líneas de investigación:a) Diseño de bioensayos que simulen mejor la alelopatía bajo condiciones naturalesb) Producción y liberación de aleloquímicos en respuesta a estreses bióticos y abióticosc) Influencia de los aleloquímicos en la dinámica de los nutrientes en el suelod) Papel de la ecología de suelo en las transformaciones de los aleloquímicose) Efectos de los herbicidas y otros agroquímicos sobre la acción de los aleloquímicos en el

suelo.f) Uso de aleloquímicos en el biocontrol específico de algunas malezas, especialmente en

áreas cultivadasg) Papel de la alelopatia en la recuperación y mejoramiento de suelos a través de

fitorremediación.h) Evaluación de la especificidad alelopática (donador-receptor) y la influencia moduladora

de las características fisicoquímicas del suelo sobre esta especificidad.i) Papel de la alelopatía en los aspectos evolutivos de donantes y receptoresj) Profundizar el conocimiento de los mecanismos alelopáticos a la luz de la biología

molecular y la biotecnologíak) Profundizar el conocimiento del modo de acción de los aleloquímicos (liberación al

medio ambiente, transformaciones, transporte donador-receptor).

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Capítulo 4BIOANÁLISIS EN LA CIENCIA DE LAS MALEZAS: CONCEPTOSIMPORTANTES Y EXPERIENCIA PRÁCTICA

Bernal E. ValverdeInvestigación y Desarrollo en Agricultura Tropical, S. A.

The University of Copenhagen, Denmark

Introducción

Los herbicidas por su naturaleza biológica se seleccionan buscando una alta eficacia paraeliminar las malezas y el mayor grado posible de selectividad para los cultivos. Varioscompuestos químicos que carecen de selectividad también se han desarrollado ycomercializado, incluido el glifosato que es el herbicida más vendido en el mundo.Tradicionalmente, las compañías productoras de agroquímicos han basado sus programas deescrutinio de herbicidas en la realización de bioanálisis con plantas enteras bajo condicionescontroladas aunque la tendencia en la actualidad es la de trabajar con otros sistemas quepermiten un escrutinio más rápido, automatizado y en gran escala. Los bioanálisis inicialescon plantas enteras se realizan utilizando una o dos dosis elevadas aplicadas sobre variasespecies de monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluidos varios cultivos. Para lograrseleccionar un herbicida con potencial comercial, se requiere probar miles de compuestosquímicos con costos sumamente elevados. En la actualidad, se estima que para llevar unnuevo herbicida al mercado, se debe realizar el escrutinio de unas 100 000 sustancias con unaerogación de 200 millones de dólares. A pesar de todo este esfuerzo, el último modo deacción descubierto que permitió la comercialización de herbicidas novedosos se introdujo en1991 con los inhibidores de la hydroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) entre los que seencuentran la sulcotriona y mesotriona (Ruegg et al. 2007). La inhibición de la enzimaHPPD provoca la pérdida de pigmentos protectores lo que resulta en el blanqueamiento delos tejidos foliares jóvenes y en daño severo por exposición a la luz. En la búsqueda denuevos herbicidas y modos de acción y gracias a los avances tecnológicos que permiten laprueba de muchos compuestos a la vez, se recurre a bioanálisis más elaborados, querequieren menor cantidad de producto para realizarlos y que se completan en muy pocotiempo con la ayuda de procesos automatizados.

En el uso práctico de los herbicidas, los bioanálisis también tienen mucha importancia y seemplean con regularidad en investigación y diagnóstico. En años recientes, los bioanálisis seconvirtieron en una herramienta determinante para corroborar casos de resistencia aherbicidas.

En este capítulo introductorio se presentan conceptos fundamentales acerca del empleo debioanálisis y describe en detalle el cómo realizarlos para determinar la respuesta a herbicidassolos o en interacción con otros productos utilizando plantas enteras. En lo posible, procuroincluir elementos prácticos, muchos de mi propia experiencia, de la realización de bioanálisispara quienes tengan interés o necesidad de realizarlos y no cuenten con informaciónrecopilada al respecto.

Utilidad de los bioanálisis

Los bioanálisis tienen muchos usos como herramienta de investigación y de diagnóstico. Unbioanálisis puede consistir en algo tan sencillo como determinar a nivel práctico y en elcampo, si un herbicida persistente ya ha perdido su actividad en el suelo para permitir lasiembra del cultivo. Esta es una práctica común cuando se emplean herbicidas persistentespara controlar arroz maleza en arroz. Transcurrido un tiempo prudencial, se marcanpequeñas áreas en el campo y se distribuye semilla del cultivo para observar si las plántulasque emergen presentan algún síntoma de toxicidad. Esta operación se repite hasta que lasplántulas muestran desarrollo normal garantizando que puede procederse con la siembracomercial del cultivo. Un enfoque similar puede emplearse con fines experimentales paradeterminar la persistencia de herbicidas y la sensibilidad relativa de posibles cultivos derotación (Smith et al. 2005). En este caso, el bioanálisis de campo brinda informaciónpráctica rápida y confiable que ayuda en la toma de decisiones, especialmente cuando no setiene los recursos económicos o técnicos para un análisis de laboratorio o cuando no hay unmétodo de laboratorio validado para cuantificar los residuos y un procedimiento que permitarelacionarlo con la fitotoxicidad.

Entre los usos importantes de los bioanálisis se incluyen la determinación de residuosbiológicamente activos en suelos y aguas usando la curva de dosis-respuesta como estándarde referencia, la verificación de que un herbicida es causante de un daño al cultivo u otraplanta de interés mediante la reproducción de los síntomas a través de la aplicacióncontrolada del herbicida, la caracterización de la selectividad de los herbicidas y eldiagnóstico de la resistencia a herbicidas. Además, los bioanálisis son muy útiles paraestudiar la interacción entre herbicidas (sinergismo, antagonismo), la interacción entreherbicidas y otros compuestos (otros plaguicidas, coadyuvantes, y antídotos o “safeners”) yla eficacia de distintas formulaciones de un mismo compuesto. Sirven también paradeterminar la posible presencia de sustancias aleloquímicas y son fundamentales paraidentificar sustancias biológicamente activas a través del aislamiento de componentes activosdirigido por bioanálisis. También pueden ayudar a la identificación del modo de acción deuna sustancia. El estudio de las respuestas a un compuesto novedoso mediante bioanálisiscon plantas enteras puede brindar indicios de los procesos fisiológicos que afecta y ayudar adescubrir nuevos modos de acción. Este enfoque es muy útil en especial con sustancias deorigen natural (Dayan et al. 2000). Los bioanálisis tienen la ventaja de ser cuantitativos y deregistrar realmente la actividad biológica de las sustancias.

De acuerdo con los objetivos que se persigan, se puede utilizar diversos organismos comoindicadores del efecto de sustancias químicas mediante bioanálisis, incluidos invertebrados,algas, y plantas superiores. Por ejemplo, las algas se han utilizado como complemento alanálisis químico para determinar el efecto de sustancias tóxicas sobre cuerpos de agua comoresultado de la escorrentía proveniente de áreas agrícolas (Okamura et al. 2002). Daphniamagna es un crustáceo de amplio uso en bioanálisis ecotoxicológicos.

En este trabajo se enfatiza los procedimientos prácticos a considerar en la conducción debioanálisis con plantas enteras, los cuales son también aplicables a pruebas realizadas conotros organismos.

Pruebas con plantas enteras

Los bioanálisis más frecuentes que se realizan a nivel práctico, fuera de los necesarios para eldesarrollo por parte de las compañías de agroquímicos, son los que estudian el efecto de unherbicida sobre alguna especie vegetal con fines de diagnóstico (por ejemplo para tratar dereproducir daños por efecto de residuos del herbicida en el suelo o por deriva), para compararla respuesta diferencial entre especies (selectividad) o entre poblaciones de una mismaespecie (resistencia), o para dilucidar interacciones de herbicidas entre sí o con otroscompuestos. La mayoría de ellos se realizan con plantas enteras y, aunque en general no serequiere de equipo especializado para llevarlos a cabo, si es importante considerar muchosfactores que determinan su éxito. La mayor parte de este trabajo se dedica a tratar loselementos más relevantes en la conducción de bioanálisis con plantas enteras.

Selección del material vegetal

Para lograr los resultados propuestos en un bioanálisis es imperativo contar con materialexperimental adecuado y en cantidad suficiente. En la mayoría de los casos en que se trabajacon plantas enteras, las pruebas se realizan utilizando plantas producidas en condicionescontroladas, por lo común, originadas de semilla. En algunos casos también se recurre amaterial vegetativo como fuente de las plantas a tratar con los herbicidas.

Semilla para los bioanálisis. La calidad y representatividad de la semilla a emplear en losbioanálisis es clave para el éxito de la prueba. La semilla debe de recolectarse o producirseteniendo en mente los objetivos del bioanálisis. Por ejemplo, si lo que se desea es realizar undiagnóstico de la posible resistencia de una maleza, la semilla debe de recolectarse en elcampo siguiendo un patrón que asegure que representa la condición del lote donde sesospecha se tiene una población resistente. Lo más probable es que al realizarse larecolección, la semilla obtenida provenga de las plantas que efectivamente son resistentes yque lograron sobrevivir a la aplicación del herbicida en el campo, así como de otras que pordistintas circunstancias evadieron al herbicida. Esta condición de semilla mezcladaproveniente de individuos resistentes y susceptibles refleja, a pesar de los posibles problemasde evaluación en el invernadero y de interpretación de los resultados, la composición de lapoblación en el campo. Si lo que se desea es realizar estudios más elaborados, por ejemplo,la determinación del posible mecanismo de resistencia, puede requerirse la producción desemilla por varias generaciones específicamente para este fin, mediante la selección deplantas que sobreviven a dosis altas del herbicida (o intermedias, según el objetivo delexperimento y el posible mecanismo de resistencia) después de un bioanálisis preliminar. Encualquier caso, se ahorrará mucho tiempo en la conducción de los experimentos si se cuentacon semilla de calidad, con alto porcentaje de germinación y que produzca plántulasuniformes y vigorosas. En varias publicaciones se dan recomendaciones o se describenprocedimientos útiles sobre la recolección, etiquetado y almacenamiento de la semilla demalezas para el diagnóstico de la resistencia (Bourgeois & Morrison 1997; Moss 1999;Paterson et al. 2002; Valverde et al. 2000). En algunos casos es necesario obtener semilla demalezas de otras fuentes para realizar las pruebas comparativas. Una posibilidad es obtenersemilla de poblaciones previamente caracterizadas por otros investigadores en cuyo caso esimportante seguir los procedimientos legales adecuados para obtenerlas. Además de loscertificados sanitarios y requisitos impuestos por las autoridades locales, es posible que se

deba de firmar un Acuerdo de Transferencia de Materiales en el que se especifique lascondiciones para la entrega la semilla y los usos para los cuales puede destinarse. Tambiénes posible comprar semilla de malezas de empresas comerciales, como por ejemploHerbiSeed del Reino Unido (www.herbiseed.com) y Azlin Seed Service (Leland, MS –EE.UU).

En algunas especies predomina la reproducción vegetativa y se requiere establecer laspoblaciones a tratar en el bioanálisis mediante la siembra de rizomas, culmos o tallosenraizados, u otros órganos. En estos casos, el enraizamiento y brotación pueden serdisparejos por lo que es mejor hacer brotar o crecer el material en bandejas por separado paraluego transplantar a las macetas definitivas. La reproducción de hijos en gramíneas puede serprovechosa para tratar “la misma” planta con herbicidas diferentes. Si, por ejemplo, sesospecha de resistencia múltiple a herbicidas en una población se puede tomar una planta enel campo, separarle sus hijos y sembrarlos por separado para luego tratarlos con diferentesherbicidas para determinar la respuesta de la misma planta a varios productos aplicados demanera independiente. De la misma forma, plantas que crecen en el invernadero, porejemplo las que sobreviven a dosis elevadas, pueden subdividirse en sus respectivos hijos ysembrarse por aparte para tratamientos adicionales o incrementar la recolección de semilla.

Preparación del material vegetal. La mayoría de los bioanálisis convencionales se hacencon plantas enteras en macetas. También se pueden hacer con plántulas recién emergidas encajas de petri o en medio de cultivo sólido o líquido. Para la conducción de los bioanálisis esimperativo contar con suficientes plantas en el estado de crecimiento adecuado y con lamayor uniformidad posible. Desafortunadamente, producto de su variabilidad intrínseca, lassemillas de las malezas no germinan de manera uniforme, en muchos casos producto de sulatencia diferencial o del efecto de las condiciones de crecimiento de la plantas madre.Dependiendo de la especie, es muy probable que se requiera dar a la semilla algúntratamiento para romper la latencia. Lo más recomendable es buscar literatura pertinente yhacer una prueba de germinación antes de iniciar los bioanálisis. El tiempo que de se demorarealizando estas pruebas se recupera con creces en la realización de los estudios querealmente son críticos. Una fuente primaria de información sobre cómo hacer germinar lassemillas de las malezas es la “Guía de Andersen” (Buhler & Hoffman 1999).

De acuerdo con mi experiencia de muchos años de realizar bioanálisis en invernadero conplantas enteras prefiero germinar la semilla en condiciones controladas y transplantar lasplántulas recién emergidas a las macetas definitivas. Esta práctica me ofrece muchasventajas, entre las que se puede citar:

Ahorro en la cantidad de semilla utilizada para la conducción de un bioanálisis Obtención de plántulas requeridas en un espacio limitado Selección de plántulas uniformes que pueden transplantarse de manera simultánea

para lograr mayor uniformidad de crecimiento Garantía de que sólo se incorpora al suelo semilla germinada. Esto es muy

importante por cuanto si se siembra la semilla directamente en la maceta definitiva, laque no germine no puede eliminarse del suelo o medio de crecimiento con total

certeza antes de desecharlo. Si trabajamos con especies perniciosas, esto nos da latranquilidad de no estarlas diseminando a sitios no deseados.

La germinación, en la mayoría de los casos, la realizo en cajas de petri con papel de filtro ode germinación. De rutina, siempre humedezco el papel con una solución de nitrato depotasio al 0.2% (p/v) para mejorar la germinación y dejo la semilla embeberse así por 24horas. Luego procedo a lavarla con agua del tubo utilizando una piseta y la mantengo en losplatos con humedad suficiente hasta que germine. Las cajas de petri pueden cerrarse con“parafilm” para evitar la desecación. Algunas especies tienen un crecimiento inicial muylento en condiciones controladas. Si se siembra todo el material en las macetas definitivasocupará espacio por mucho tiempo. En estos casos, puede transplantarse las plántulas enbandejas y luego hacer un segundo transplante a las macetas definitivas. Estas plantas delento crecimiento, por ejemplo Paspalum paniculatum también tienden a crecer muydesuniformes por lo que el segundo transplante se puede aprovechar para escoger el materialdefinitivo o agrupar por tamaño las plantas en las macetas para luego seleccionarlas porbloques.

Llegado el momento de la aplicación, se procede a preparar las macetas para el tratamiento.Debe escogerse el material más uniforme. Muchos bioanálisis se realizan empleando unarreglo irrestrictamente al azar por lo que la uniformidad del material es muy importante.También es de todos sabido que dependiendo del estado de crecimiento las plantas puedenvariar en su respuesta al herbicida. Me sorprendería mucho que al momento de preparar elmaterial para tratarlo, todas las plantas sean uniformes. Por el contrario, prácticamente entodos los casos, resulta necesario hacer algún tipo de clasificación (por altura, si todas lasplantas tienen el mismo estado de crecimiento, o por estado de crecimiento propiamentedicho). Aún cuando el análisis de los datos se haga por regresión, esta clasificación enbloques es muy deseable, sobre todo para la evaluación visual y para poder valorar si lostratamientos testigo se comportaron de acuerdo con lo previsto. Recordemos que el efecto delos herbicidas lo medimos en relación con el comportamiento de plantas sin tratar. Si lostestigos no crecen de la manera adecuada podemos perder por completo el bioanálisis o sacarconclusiones erradas.

Es importante tener un procedimiento sistemático de etiquetado, sobre todo cuando serealizan bioanálisis de forma rutinaria. Cada investigador puede diseñar su propio esquemade etiquetado. En mi caso particular, empleo tres dígitos para identificar el material vegetal:(biotipo o población), repetición y dosis. Por ejemplo, una maceta cuyo código es 314corresponde al tercer biotipo, primera repetición y la cuarta dosis. Cuando los bioanálisisrequieren mucho material, recurro a etiquetar con paletas plásticas de diferente color (porejemplo, uso colores diferentes para herbicidas distintos, manteniendo la numeraciónanterior).

Selección del ámbito de dosis

Selección del ámbito de dosis adecuado. La respuesta típica de las plantas a dosis crecientesde herbicidas tiene forma sigmoidea (Figura 1) de modo que para lograr un ajuste adecuadodel modelo es importante seleccionar un ámbito de dosis apropiado.

Figura 1. Relación de la respuesta de las plantas al incremento de la dosis deherbicida (en escala logarítmica). Cuatro parámetros definen la curva: D es el nivelsuperior, C es el nivel inferior, b es la pendiente y ED50 es la dosis que inhibe lavariable de respuesta medida en un 50% (ver sección sobre Análisis de los datos ypresentación de los resultados para mayores detalles).

Antes de realizar los bioanálisis detallados es conveniente hacer una prueba preliminar.Puede aprovecharse las pruebas de germinación de semilla para obtener plantas suficientespara el experimento preliminar en el que sólo se consideran unas pocas dosis (dos o tres) nomayores de la comercial. Si se observa respuesta diferencial entre las poblaciones tratadas,se puede hacer el ajuste correspondiente en el ámbito de dosis definitivo. Uno de los erroresmás frecuentes en la conducción de bioanálisis de respuesta a dosis crecientes en las que secompara especies o biotipos con respuesta diferencial a herbicidas es la escogencia deámbitos de dosis inadecuados. Por sencillez, en el diagnóstico de la resistencia, muchasveces se una ámbitos comunes para las plantas resistentes y susceptibles. Las consecuenciasson lamentables pues de desaprovecha la oportunidad de obtener información valiosa yconfiable. Como regla general, se debe de tener ámbitos diferentes para las poblacionessusceptibles y resistentes, de modo que se pueda ajustar los modelos de regresión y obtenerlos valores de inhibición media con intervalos de confianza adecuados para poder calcularíndices de resistencia y comparar dichas poblaciones. Las dosis deben seleccionarse enprogresión geométrica, es decir, las dosis aumentan con base en una tasa común. Lo máscomún es que las dosis se dupliquen conforme se avanza en la progresión, aunque se puedeutilizar otras tasas incrementales. En la Figura 2 se ilustra la importancia de seleccionar demanera apropiada los ámbitos de dosis.

Figura 2. Selección de ámbitos de dosis. Curvas de dosis-respuesta provienen de bioanálisis preliminares paradeterminar la respuesta a imazapir en biotipos de arroz maleza (Oryza sativa). Ámbitos adecuados paraidentificar un biotipo resistente por flujo de genes de variedades de arroz resistentes a imidazolinonas (A) y unosusceptible (B). Nótese la diferencia en la escala de las dosis. (C) Ámbito inadecuado (por escogencia de dosismuy elevadas) para identificar un biotipo susceptible. (D) Ámbito inadecuado (por selección de dosis muybajas) para identificar un biotipo resistente.

Para poder ajustar un modelo de dosis-respuesta es necesario incluir al menos cuatro dosis(mínimo requerido por el modelo). Sin embargo, lo más deseable es incluir seis o más. Yoregularmente empleo ocho dosis más dos testigos sin tratar (por repetición). El número derepeticiones afecta la precisión con que se determina los parámetros. Debe de usarse tres omás repeticiones (mi preferencia es de cuatro a seis). Si el material vegetal es limitante, debede hacerse un balance entre el número de dosis y el de repeticiones tratando de optimizar elanálisis considerando los grados de libertad asociados con el modelo estadístico.

Es importante tener presente que la respuesta de las plantas a los herbicidas varía con elestado de crecimiento, lo cual puede hacer necesario realizar ajustes en los ámbitos de dosis aprobar. Pero también puede darse el caso de que la expresión de mecanismos de resistenciadependa del estado de crecimiento. Este tipo de variaciones en la respuesta a los herbicidas

está documentado en la literatura, por ejemplo, las plantas de E. colona resistentes a propaniltienen niveles de resistencia superiores conforme se desarrollan más que no se explican porvariaciones en la actividad de la arilacilamidasa responsable de la resistencia (pormetabolismo acelerado del herbicida), lo cual sugiere que otros mecanismos coadyuvan a laresistencia cuando las plantas están más desarrolladas (Leah et al. 1995). Un caso másdramático se observó con Conyza canadensis resistente a glifosato (Dinelli et al. 2006).

Cuando las plantas se trataron con glifosato en dosis crecientes en el estado de dos hojas, nose observó diferencia alguna en la respuesta al herbicida entre las plantas supuestamenteresistentes y las susceptibles. Si los autores se hubieran conformado con estos resultadoshabrían concluido que C. canadensis no había evolucionado resistencia al glifosato. Sinembargo, cuando el glifosato se aplicó a plantas en el estado de roseta, los biotipos resistentesrequirieron tres veces más glifosato que los susceptibles para inhibir su crecimiento en un50% (Figura 3).

Aplicación de los tratamientos y conducción del bioanálisis

Equipo de aplicación y su calibración. Si la calibración del equipo es importante en lasaplicaciones comerciales en el campo, con mayor razón es fundamental en la ejecución de losbioanálisis. Lo ideal es aplicar los tratamientos con un equipo diseñado para este propósitode modo que se garantice que la presión, el volumen y la velocidad de aplicación seanconstantes. En el mercado puede obtenerse cámaras de aspersión de herbicidas condiferentes niveles de automatización (Figura 4). Algunas de las compañías que ofrecen estetipo de equipo son Devries Manufacturing (http://www.devriesmfg.com) y su distribuidorR&D Sprayers (http://www.co2sprayers.com) y Engineering and Design Associates, Inc.(http://www.eda-inc.net). También se las puede construir según las especificacionesdeseadas. En ausencia de una cámara de aspersión, la siguiente mejor opción es un equipo deaplicación portátil accionado por CO2 que garantiza una presión constante. R&D Sprayerstiene varios modelos disponibles. Herbiseed tiene un modelo construido en fibra de carbonoque lo hace muy liviano. Si del todo no se cuenta con equipo especializado, los tratamientosse pueden aplicar con una bomba de mochila procurando el mayor control de las variablesantes mencionadas (presión, volumen de aplicación y velocidad). Cualquiera que sea elequipo que se utilice, debe de calibrarse antes de realizar la aplicación. También es unabuena práctica corroborar frecuentemente que la presión no varíe. La calibración se realizacon agua y la mezcla de herbicida a aplicar contiene el herbicida y los demás componentesque se estén evaluando. No está de más comprobar que la descarga no varía por efecto de ladensidad del material.

Figura 3. Supervivencia de biotipos de Conyza canadensis resistentes [AR (○), DE ( ), OH ( ), yVA (□)] y susceptibles a glifosato [RE (•), WA ( )] tratados con dosis crecientes de glifosato enel estado de dos hojas (A) y de roseta (B). Las líneas describen las respuestas (de supervivencia)predichas de acuerdo con un modelo sigmoideo. Los datos corresponden a los promedios ± EE detres repeticiones en las cuales se trató 25 plantas de cada biotipo con cada dosis. En los recuadrosse indica los valores de ED50 (g ea ha−1) e índice de resistencia (IR, valor de ED50 del biotipo de C.canadensis dividido por el valor de ED50 del biotipo susceptible RE). Tomado y traducidolibremente al español de (Dinelli et al. 2006).

Figura 4. Cámara de aspersión fabricada por Devries Manufacturing.

Preparación de las diluciones. Si se trabaja con productos formulados, es importanteasegurarse que se cuenta con los instrumentos básicos de medición de pesos y volúmenes.Las cantidades de mezcla que se preparan para la aspersión de los tratamientos son bajas (de50 a 500 mL) por lo que las cantidades del herbicida formulado que se adicionan también sonbajas (en el orden de microlitros o microgramos). Si las concentraciones a asperjar son muybajas puede ser necesario recurrir a la preparación de soluciones madre. Es de vitalimportancia verificar muy bien los cálculos puesto que un error en la preparación de dichasolución afectará todas las dosis aplicadas. Cuando el herbicida se formula como gránulosdispersables en agua es conveniente trabajar con soluciones madres. Si el tratamientorequiere la adición de un coadyuvante también es conveniente hacer una solución madreconcentrada puesto que resulta muy difícil medir volúmenes bajos del coadyuvante en virtudde su viscosidad. Si el herbicida que se va a utilizar es un estándar analítico, verifique con elproveedor el procedimiento para diluirlo y asegúrese de tener los testigos o tratamientos enblanco necesarios. Es posible que el herbicida deba disolverse en un solvente orgánico comola acetona antes de prepararlo en agua para su aspersión.

Aspersión del herbicida y manejo de las plantas recién tratadas. Cuando se aplica un mismoherbicida en dosis crecientes, lo más conveniente es aplicar las dosis en orden ascendentepara evitar el lavado del equipo después de cada tratamiento. Si los herbicidas a probartienen diferentes formulaciones, es preferible aplicar de primero los que se formulan comosoluciones acuosas concentradas o polvos solubles. Los polvos mojables deben dejarse deúltimo y asegurarse de verificar frecuentemente de que los filtros de las boquillas esténlimpios para garantizar que se asperja el volumen deseado. Aplicado el herbicida, concedatiempo suficiente a las plantas para que la aspersión se seque antes de trasladarlas al sitiodefinitivo y asegúrese de regarlas de la manera apropiada para evitar el lavado del producto

desde el follaje o la contaminación del follaje de plantas adyacentes por efecto del salpiquedel agua de riego que se posa sobre las hojas recién tratadas.

Es importante asegurarse que las plantas se colocan en condiciones lo más homogéneasposibles. Preferiblemente, las macetas deben colocarse al azar, sin seguir un patrón definido.En la práctica, es conveniente dejar una repetición con las macetas ordenadas por dosiscreciente de modo que sea más fácil darle seguimiento al desarrollo de los síntomas. Proveariego a la base de las plantas, preferiblemente con un sistema de goteo, y evite el riego poraspersión. El lavado del herbicida desde las hojas puede hacer que el producto entre encontacto con plantas vecinas causándoles efectos no deseados. Es recomendable no haceraplicaciones de insecticidas o fungicidas inmediatamente después de la aplicación de losherbicidas. Espere al menos dos días. De la misma forma, es mejor no aplicar estosproductos antes de tratar las plantas con el herbicida para evitar el riesgo de que ocurraninteracciones entre ellos.

Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos

Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos. En el momento oportuno seprocede a hacer la evaluación del material y recolectar los datos. ¿Pero cuándo es elmomento oportuno? No es posible definir a priori cuándo realizar la evaluación. Mirecomendación es que observe las plantas regularmente y tome la decisión conformeevolucione el desarrollo de los síntomas. Uno de los problemas en la evaluación de losbioanálisis es su naturaleza comparativa en relación con un testigo sin tratar. Si la evaluaciónse realiza muy pronto, es posible que las plantas no hayan desarrollado los síntomascompletamente y que se subvalore el efecto del herbicida. Si la evaluación se demoramucho, las plantas testigos pueden crecer demasiado por lo que el efecto del herbicida sesobredimensiona. El conocimiento del material experimental y del efecto del herbicidaayuda mucho a determinar el mejor momento para realizar la evaluación. Los herbicidas quetienen efecto de contacto, pueden evaluarse pocos días después de su aplicación. Porejemplo, el efecto del propanil puede evaluarse entre 5 y 7 días después del tratamiento. Losherbicidas sistémicos son más lentos en ejercer su acción y requieren que transcurra mayortiempo antes de que pueda evaluarse su efecto. Un buen indicador de que se ha llegado almomento de hacer la evaluación es cuando los tejidos de las plantas tratadas con el herbicidaen sus dosis más altas se tornan necróticos y las plantas mueren. La tardanza en laevaluación, sin embargo, puede dar oportunidad a que plantas que sufren de un dañomoderado se recuperen. Las condiciones ambientales (temperatura y luminosidad) afectan eltiempo necesario para el desarrollo de síntomas lo que obliga a justes en cuanto al tiempo deevaluación y cosecha.

Es importante tener una mentalidad abierta y valorar modificaciones en la conducción yevaluación de los bioanálisis cuando sea necesario, a pesar de que se tenga ampliaexperiencia y que supuestamente se conozca el material experimental. Por ejemplo, en unestudio del autor todavía en ejecución, la evaluación preliminar de la respuesta depoblaciones de P. paniculatum supuestamente resistentes a glifosato arrojó resultadosinconsistentes y resultó muy difícil corroborar la resistencia, a pesar de que las poblacionesmuestreadas no se lograban controlar en el campo con dicho herbicida. Parte de lasdificultades para obtener datos confiables y reproducibles puede achacarse a la posible falta

de uniformidad intrínseca de las plantas al momento de tratarlas a pesar de los esfuerzos porseleccionar material semejante, mezcla de individuos susceptibles y resistentes en la muestra,y al nivel bajo de resistencia al herbicida y lento desarrollo de síntomas producto de unprobable mecanismo de resistencia no asociado con una modificación en el sitio de accióndel herbicida. Las evaluaciones visuales y por peso fresco no mostraron mayor diferenciaentre las poblaciones supuestamente resistentes y las susceptibles de referencia. Sinembardo, una espera mayor para realizar la evaluación permitió verificar que las plantasresistentes tenían la capacidad de rebrotar aun cuando en la evaluación visual aparentaranestar completamente muertas (Figura 5).

Figura 5. Evolución de síntomas de toxicidad en un biotipo de Paspalum paniculatumresistente a glifosato. (A) Síntomas iniciales observados a los 5 días después de la aplicación(DDA) del herbicida en dosis crecientes (ámbito parcial); (B) Síntomas avanzados a los 35DDA; (C) Detalle de síntomas a los 35 DDA en planta tratada con la dosis más elevada (enesta fecha la planta se transfiere a maceta de mayor tamaño para darle seguimiento); (D)Rebrote de la planta tratada con la dosis más alta a los 77 DDA; (E) Crecimiento de la plantatratada con la dosis más alta a los 150 DDA.

Otra decisión que enfrentamos es definir cómo realizar la evaluación. Las compañías deagroquímicos cuando realizan escrutinios de productos en gran escala usando plantas enteras,evalúan el efecto de los productos mediante una valoración visual del daño. La evaluaciónvisual también es muy utilizada en el diagnóstico de la resistencia. Este tipo de evaluaciónpor ser subjetiva depende de la agudeza visual y experiencia del evaluador. Un evaluadorbien entrenado puede apreciar diferencias y plasmarlas en un set de datos confiables. La

escala utilizada más frecuentemente es la que asigna porcentajes de daño (grado deafectación de los tejidos) en comparación con el tratamiento testigo, cuyas plantas no hansufrido daño alguno.

Una valoración cuantitativa se obtiene mediante el peso (fresco o seco) de las plantas. Si elmaterial tratado fue bien seleccionado en cuanto a uniformidad en el estado de crecimiento ycondición de las plantas, los resultados de peso fresco y seco son fundamentalmenteequivalentes, con algunas excepciones. Plantas tratadas con los herbicidas hormonales quetienen un crecimiento anormal por la obstrucción que dichos herbicidas causan al sistemavascular y las deformaciones que producen en los tejidos pueden acumular mucha agua ypeso fresco a pesar de estar severamente afectadas en su crecimiento y desarrollo. En estecaso particular, la evaluación visual puede ser incluso más informativa que la de peso fresco.El peso fresco puede ser más válido que el peso seco porque plantas que se han necrosado omuerto recientemente pueden tener el mismo peso seco que plantas que se notan verdes ysaludables (Santelmann 1977).

Por razones de conveniencia, espacio y costo energético, yo me inclino en mis bioanálisis porel peso fresco (casi siempre basta evaluar en peso del follaje y no el del sistema radical).Antes de cosechar las plantas, procedo a hacer una evaluación visual detallada y adocumentar fotográficamente las respuestas observadas. Confío más en estas herramientasque en mi memoria. Estas observaciones son muy útiles cuando se analiza los datos. Laevaluación visual se puede detectar claramente valores atípicos (los denominados “outliers”)y proporcionar un criterio menos sesgado en caso de que se deba de eliminar el dato delanálisis. También es oportuna por cuanto en algunas ocasiones las plantas en alguno de lostratamientos testigo crecen de manera anormal y se debe considerar su eliminación del set dedatos a analizar (por eso la conveniencia de incluir dos testigos en cada repetición). Porúltimo, no escapa a la realidad el hecho de que alguna planta sufra daño mecánico o que ladevore un insecto. En la evaluación visual se constata la situación y se procede, sin pérdidade rigor científico, a eliminar el dato. Un asistente de investigación o estudiante bienentrenado detecta este tipo de problemas y consulta; un ayudante que diligentemente sigue ladirectriz de cosechar y pesar, recolecta un dato incierto y con él genera incertidumbre en todala repetición o en el bioanálisis.

Algunos autores prefieren evaluar el efecto de los tratamientos determinando la mortalidadde las plantas. La validez de este tipo de evaluación depende del número de individuos quecomponen cada tratamiento. En el sentido estricto, una planta puede estar viva o muerta, nomedio muerta ni medio viva. En mi experiencia la respuesta de las plantas a las dosiscrecientes de herbicidas no está definida en blanco y negro sino en tonos de gris. Por ello, leveo mucha ventaja a la determinación de peso fresco. Además, el peso es una variablecontinua, mientras que la mortalidad (o supervivencia) corresponde a una variable derespuesta binomial, la cual debe ser sujeto de un análisis de probits.El efecto de los herbicidas se puede valorar utilizando otras mediciones, dependiendo de losobjetivos del experimento y del equipo y recursos disponibles. Entre ellas incluye altura deplanta, longitud de raíz, área foliar (o índice de área foliar), rendimiento en grano o fruto, tasade crecimiento relativo, tasa de asimilación neta, tasa fotosintética, fluorescencia de laclorofila, producción de algún metabolito específico. Se puede medir el consumo diario de

agua por las plantas como un indicador del efecto del herbicida siempre y cuando lascondiciones ambientales sean homogéneas para todas las plantas (Santelmann et al. 1971).

Aunque resulte obvio, es importante registrar los datos y almacenarlos de manera segura. Sise registran en papel, hágalo con lápiz, no con bolígrafo. En caso de que el papel sehumedezca, los registros no se dañarán. Con los medios disponibles en la actualidad, cadavez es más común el registro electrónico de los datos. No olvide realizar los respaldosnecesarios.

Análisis de los datos y presentación de los resultados

Análisis preliminar de los datos y ajuste de un modelo estadístico. Una vez obtenidos losdatos, debe de procederse a su análisis, el cual, idealmente, debió haber sido planeado desdeque se diseñó el experimento para así garantizar que se logrará cumplir con sus objetivos.Me gusta recordar a mis estudiantes que la estadística es una herramienta y no la razón de serdel bioanálisis. Sin embargo, un buen set de datos mal analizado priva al investigador y allector de información útil. Con este criterio, mi primer encuentro con los datos recolectadossiempre es la elaboración de un gráfico con los datos “crudos” de peso fresco (o la variablemedida) vs dosis. La dispersión de los datos y la forma en que se distribuyen me dan unaprimera impresión de la calidad del bioanálisis. Este ejercicio puede hacerse en una hoja deExcel o cualquier programa similar. Procuro ser el crítico más riguroso de mí mismo. Sonmuchas las ocasiones en que al llegar a este punto confirmo que el estudio fue un fracaso yque lo único que puede hacerse es repetir el experimento. Si hay valores atípicos (“outliers”),este es el momento de valorarlos y de tomar decisiones respecto de ellos. La gráfica tambiénes útil para proporcionar los valores estimados de los parámetros del modelo de regresión querequiere la mayoría de los programas de cómputo para iniciar sus iteraciones para el ajustedefinitivo del modelo. El módulo “drc” (dose response curve) empleado con el programa deuso libre “R” (http://www.r-project.org) preparado por Streibig (www.bioassay.dk) norequiere proporcionar tales estimados para iniciar el análisis.

El análisis de la respuesta a dosis crecientes de herbicidas requiere ajustar un modeloadecuado y que tenga significado biológico. Las respuestas obtenidas con plantas tratadascon dosis crecientes de herbicidas son de tipo sigmoideo. No tiene sentido alguno tratar deajustar un modelo polinomial de quinto orden que puede ajustarse muy bien a los datos si susparámetros no tienen el mínimo sentido biológico. También carece de sentido cuando sedetermina la respuesta de plantas a dosis crecientes de herbicidas hacer comparaciones demedias empleando pruebas de rango múltiple como las de Duncan, Tukey o DMS. Laintención al momento de diseñar el experimento no era la de comparar el efecto de dosisdiscretas del producto sino el comportamiento de las plantas conforme aumenta la dosis delherbicida. Tampoco es de interés presentar ambos análisis (el de regresión y el de rangomúltiple).

Conforme lo mencionado anteriormente, cuando se grafica el peso de las plantas u otravariable de respuesta contra el logaritmo de la dosis de herbicida, se obtiene una relaciónsigmoidea (en forma de “S”), similar a la observada en la Figura 1. Esta respuesta estádescrita por un modelo logístico:

Y = C + {D – C / 1 + exp[b(log x – log ED50)]}

Como se observa, el modelo está definido por cuatro parámetros, donde

Y denota la respuesta de crecimiento (peso, longitud de la raíz o del tallo, tasafotosintética) a la concentración x del herbicida:

D corresponde al límite superior, es decir, representa la respuesta del testigo sin tratar C denota el límite inferior, el cual, se aproxima a cero cuando las dosis del herbicida

son muy altas (o el peso de las plantas al momento de ser tratadas). b es la pendiente de la curva cerca de la ED50. Cuanto mayor sea el valor de b, más

pronunciada es la pendiente ED50 es la dosis del herbicida que reduce el crecimiento (o el valor de la variable de

respuesta) en un 50%.

Una vez ajustado el modelo, fácilmente puede obtenerse el valor de respuesta a otro nivel,por ejemplo la ED25 o ED75, con base en la siguiente expresión dada en función de losparámetros, b y ED50:

ED50 = EDx / (x / 100 –x)1/b

donde x es cualquier nivel de respuesta. De tal forma, si se desea calcular la ED25, entoncesel valor de x es 25.

Comparación de respuestas. Cuando comparamos la respuesta de biotipos a un mismoherbicida para determinar si son resistentes o susceptibles, en realidad estamos determinandocuál dosis del herbicida tiene el mismo efecto sobre las poblaciones, es decir, se hace unacomparación de tipo horizontal, que contesta la pregunta ¿Cuánto herbicida se requiere parainhibir el crecimiento en un 50% (o en otra magnitud previamente definida)? En sentidobiológico, esto equivale a una comparación de tasas de cambio a niveles de respuestapredeterminados (Streibig 1988). La comparación más rigurosa se hace cuando las doscurvas de respuesta son similares en todos sus parámetros, excepto la ED50, en cuyo caso sepueden definir como paralelas (Figura 6). La magnitud del desplazamiento de estas curvasen el sentido horizontal está dada por un factor constante que se denomina la “potenciarelativa” (Seefeldt et al. 1995) y que corresponde con el índice de resistencia. Cuando setiene curvas paralelas la potencia relativa es independiente del nivel de respuesta que seseleccione (ED10, ED50, ED90 o cualquier otro) para hacer la comparación. La comparaciónde los valores de ED50 se realiza con un procedimiento que es básicamente una prueba de t:se verifica que no haya traslape en los intervalos de confianza de las dos curvas que secomparan a un nivel de probabilidad previamente establecido.

Figura 6. Comparación horizontal (A) y vertical (B) de curvas dosis-respuesta de dosherbicidas. Adaptado de (Streibig 1988).

Desafortunadamente, las curvas de dosis-respuesta rara vez son paralelas o muy similares.Esto obliga a que los modelos de dosis-respuesta deban probarse estadísticamente paradeterminar si son similares antes de poder hacer las comparaciones de potencia relativa (Ritzet al. 2006). Estos análisis (como el de la prueba de F por falta de ajuste o “lack of fit”),aunque son complicados desde el punto de vista estadístico y metodológico, se convierten enrutina porque están contemplados en los programas estadísticos de uso común. Si la pruebade F para falta de ajuste es no-significativa, puede inferirse que el modelo se ajusta demanera aceptable.

El otro tipo de comparación de curvas de respuesta es la vertical, es decir, se compara larespuesta de las plantas o poblaciones a dosis preseleccionadas del herbicida (Figura 6). Enla representación gráfica es muy evidente que cuando las comparaciones se hacen cerca dellímite inferior o superior, las diferencias por efecto del tratamiento son mucho menores que sise hacen cerca del punto medio (cercano al valor de ED50). En otras palabras, los herbicidasafectan a las plantas de manera diferente conforme se varía la dosis. Por este motivo, cuandose hace un análisis de varianza se revela que existe una interacción significativa.

Al comparar la respuesta de poblaciones o biotipos a herbicidas, es importante usarconsistentemente una misma metodología. Los datos pueden no ser comparables si seemplean métodos diferentes. Por ejemplo, en principio no debe de compararse los resultadosobtenidos con una prueba realizada en papel de filtro con otra hecha en medio de cultivopreparado con agar. Si alguno de los métodos se va a emplear como herramienta dediagnóstico es aconsejable relacionar los resultados obtenidos con los de bioanálisis conplantas enteras (Cutulle et al. 2009; Yang et al. 2007).

Desigualdad de límites superiores e inferiores entre curvas a comparar. Como se mencionópreviamente, las plantas a veces crecen de manera diferente, sin razón aparente, en un mismo

bioanálisis. Por esta razón es posible que el límite superior o inferior o ambos de los curvas acomparar sean distintos (de ahí la tendencia a expresar los datos como porcentaje). En estoscasos, la potencia relativa no es constante a través de todos los niveles de respuesta y latransformación a porcentaje del testigo puede inducir a error por cuanto permite lacomparación como si las curvas fueran paralelas. En este caso, lo más prudente es hacer lascomparaciones a un nivel de respuesta que sí sea respaldado por los datos experimentales yutilizando las curvas ajustadas a los datos de peso (no porcentuales) originales de modo quese obtengan errores estándar válidos (Knezevic et al. 2007; Ritz and Streibig 2005). Para lapresentación gráfica, se puede usar el valor relativo de biomasa (o de la variable derespuesta) en relación con el testigo para facilitarle al lector la comprensión del mensaje.

Es posible que al planear y realizar un bioanálisis que incluye a varias especies o biotipos, losámbitos de dosis escogidos no nos permitan obtener curvas de respuesta completas. Si algúnmaterial es muy tolerante o resistente, la dosis mayor incluida en el ámbito puede serinsuficiente para poder estimar el límite inferior C (Figura 7). En este caso, el modelo decuatro parámetros debe de modificarse para eliminar el parámetro C, por lo que la respuestadebe ahora ser ajustada con el modelo:

Y = D / 1 + exp[b(log x – log ED50)]

Puesto que, en la mayoría de los casos de nuestro interés realizamos comparaciones de ED50slos valores estimados con el modelo de tres parámetros pueden compararse con los obtenidospara las otras plantas o biotipos que sí permitieron la estimación de todos los parámetros,siempre teniendo en consideración los correspondientes intervalos de confianza asociadoscon los valores de ED50. Si la comparación de interés fuera a niveles mucho mayores, porejemplo ED90, no sería posible realizarla a no ser que se repitiera el experimento.

Figura 7. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando un ámbito de dosis insuficiente paraalcanzar el límite inferior.

Hormesis. Con alguna frecuencia y dependiendo del ámbito de dosis empleado, puedeobservarse un aumento en la respuesta medida (crecimiento) cuando las plantas se tratan condosis muy bajas (Figura 8). A este estímulo del crecimiento se le denomina hormesis y seobserva no sólo con herbicidas en plantas sino con gran cantidad de compuestos tóxicos enmuchas especies (Calabrese & Blain 2009). Se presenta con herbicidas de distintos modos deacción y se ha tratado de explicar en relación con los efectos filológicos de cada producto.Cuando hay hormesis, la relación sigmoidea se altera. Si el objetivo del bioanálisis no es elestudio de los efectos subtóxicos del herbicida se puede obviar esta parte de la curva y ajustarel modelo simétrico de curva sigmoidea (Streibig 1988). Si hay interés en estudiar el efectode dosis subletales, existen modelos apropiados que consideran la hormesis (Brain &Cousens 1989; Cedergreen et al. 2005).

Comparación de múltiples curvas de respuesta obtenidas en bioanálisis independientes.Cuando se tiene muchas poblaciones o especies a comparar en estudios de dosis-respuesta noes posible ejecutar todos los bioanálisis en forma simultánea. Sin embargo, el objetivo finales poder diferenciar entre todas ellas la manera en que responden al herbicida (por ejemplo,cuáles poblaciones son resistentes). La pregunta que salta a la vista es ¿puedo hacer unacomparación de todas las curvas a pesar de que se generaran en distintos momentos? En lapráctica, hay dos aspectos que son de interés. El primero es cuán confiables desde el puntode vista biológico pueden ser las comparaciones, especialmente si los experimentos serealizan en condiciones donde no hay control de las variables ambientales, las cuales sonhomogéneas dentro de cada grupo de bioanálisis pero heterogéneas entre grupos. Meenfrento con esta encrucijada con mucha frecuencia. Para mi propia tranquilidad, recurro auna herramienta sencilla que me da la suficiente confianza en mis datos. Cada vez que hagolos bioanálisis, incluyo un biotipo bien caracterizado que considero de referencia (porejemplo, el susceptible en las pruebas de diagnóstico de resistencia).

Figura 8. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando en la que se nota la hormesis(estimulo del crecimiento cuando las plantas se tratan con dosis muy bajas).

El otro aspecto relevante, es cómo realizar la comparación estadística de modo que tengavalidez. Una forma de proceder en estos casos es hacer los análisis estadísticos conforme sevan completando los bioanálisis, lo cual de por sí es una práctica deseable para conocermejor el material y poder determinar si hay problemas con los datos y deba repetirse algúnexperimento. De esta manera se obtienen los modelos de dosis-respuesta y sus parámetroscon sus respectivos errores estándar e intervalos de confianza. Acumular datos y tratar decorrer todos los análisis de regresión de una sola vez es contraproducente. Un númeroelevado de curvas para ajustarse de una sola vez no permite aplicar un modelo no-linealmixto pues el número de parámetros sería tan grande que limitaría la convergencia delproceso. Si algunos los bioanálisis no aportan respuestas adecuadas, la comparación puedearrojar resultados incongruentes. Una vez obtenidos los parámetros de las regresiones dentrode cada grupo, se puede realizar una comparación de las ED50s utilizando un modelo linealmixto balanceado en el cual la variación entre las corridas de bioanálisis (grupos)corresponde con un efecto aleatorio. Las desviaciones estándar de los distintos parámetros deregresión analizados se emplearan como balance del análisis de varianza (J.C. Streibig, 2009.Universidad de Copenhague, comunicación personal).

Procedimientos estadísticos en mayor detalle. El fundamento teórico y los procedimientosespecíficos para realizar los análisis estadísticos de los datos obtenidos en los bioanálisisrebasan el objetivo de este trabajo. Quienes tengan interés en ahondar más en este temapueden referirse diversas publicaciones especializadas (Brain & Cousens 1989; Cedergreenet al. 2005; Knezevic et al. 2007; Nielsen et al. 2004; Ritz et al. 2006; Ritz & Streibig 2005;Seefeldt et al. 1995; Streibig 1988; Streibig & Kudsk 1993).

Presentación de resultados. La forma más ilustrativa de presentar los datos es mediantegráficos que reflejen la respuesta del material evaluado. En el gráfico debe de incluirse losdatos originales y la curva ajustada. De esta manera, el lector puede valorar la calidad denuestro experimento. En un cuadro por separado, debe de proporcionarse los parámetros delmodelo con sus respectivos intervalos de confianza. Si hay diferencias en el crecimiento delos biotipos o poblaciones (límite superior e inferior) los gráficos pueden resultar pocoatractivos a la vista. En lugar de hacer una transformación a porcentaje del testigo, la cual esinadecuada (ver (Ritz et al. 2006) para detalles específicos), es preferible ajustar el gráfico demodo que el peso de los testigos sin tratar (límite superior) corresponda visualmente. Lainformación relevante estará de todos modos en el cuadro que acompaña al gráfico.Proporcionar la información completa sobre la ecuación de regresión también permite allector calcular otros valores de inhibición que pueden ser de su interés (Ej. ED10).

La presentación de los datos provenientes de una curva-respuesta basada en una progresióngeométrica usando una escala lineal provoca que los datos se agrupen hacia el extremoinferior del gráfico lo que dificulta visualizar el valor de la ED50 y tener una idea clara de laforma en que la planta responde al herbicida (Figura 9).

Pruebas rápidas

La conducción de bioanálisis con plantas enteras requiere de mucho tiempo, sobre todo si setoma en cuenta la recolección y preparación de la semilla y crecer las plantas hasta el estado

adecuado para someterlas a los tratamientos. Cuando es necesario tener información en pocotiempo, puede recurrirse a pruebas rápidas diseñadas según el objetivo perseguido.

En la determinación de residuos de un herbicida en el agua, puede hacerse una prueba conLemna spp. que permite obtener resultados en cinco o siete días. Si se desea corroborar laresistencia de una maleza a un herbicida, puede recolectarse plántulas en el campo y tratarlasen medio adecuado para caracterizarlas en un período de horas o unos pocos días, como en elcaso de la respuesta de E. colona a propanil y otros herbicidas (Kim et al. 2000). De manerasimilar, se ha desarrollado pruebas con plántulas para diagnosticar resistencia a herbicidasinhibidores de ACCasa mediante la medición de la longitud del coleoptilo de Sorghumhalepense (Burke et al. 2006).

0

10

20

30

40

50

0 50 100 150 200 250 300

A

Fluazifop-p-butilo (g e.a. ha-1)

Peso

fres

co e

n gr

amos

0

10

20

30

40

50

0.1 1 10 100 1000Testigo

B

Fluazifop-p-butilo (g e.a. ha-1)

Peso

fres

co e

n gr

amos

Figura 9. Respuesta de un biotipo de Eleusine indica proveniente de Malasia(MY21A) al herbicida fluazifop-p-butilo. Se compara la presentación de los datosutilizando una escala lineal (A) y logarítmica (B) para las dosis del herbicida.Parámetros (valor [intervalo de confianza]) de la ecuación (según modelo logístico):D = 30.27 [23.93 - 36.62], C = 1.75 [1.37 - 2.13], b = 1.56 [1.12 - 2.01], ED50 = 5,05[2,96 - 7,14]. Bioanálisis realizado por IDEA Tropical, S. A. en Costa Rica. Datosno publicados previamente.

También es posible realizar bioanálisis no destructivos empleando partes de órganos otejidos. Koger et al. (2005) desarrollaron métodos simples para diferenciar biotipos de C.canadensis resistentes y susceptibles a glifosato. Uno de los métodos consiste en sumergirhojas en diluciones del herbicida por tres días y evaluar el daño visualmente. El otro, enincubar discos de hojas en diluciones del herbicida por 16 horas y medir los niveles deshikimato en un espectrofotómetro. La acumulación de shikimato dependiente de la dosis deglifosato en plantas susceptibles al herbicida es un método estándar para diferenciarlas de lasresistentes (por sitio de acción) en las cuales no se acumula el shikimato.

Determinación de la presencia y comportamiento de herbicidas en el suelo

Los bioanálisis pueden ser muy útiles para estudiar el comportamiento de los herbicidas en elsuelo o sustratos de siembra. La presencia de residuos de triasulfurón y sulfosulfurón en elsuelo fue determinada experimentalmente midiendo la longitud de la raíz de plantas degirasol con precisión de partes por millardo (Hernandez-Sevillano et al. 2001). Elmovimiento del herbicida pendimetalina a través de una capa de corteza de pino utilizadacomo medio de cultivo en viveros se cuantificó utilizando Digitaria sanguinalis como plantaindicadora (Simmons & Derr 2007). La presencia de residuos de un herbicida auxínico(clopiralid) en composta fue analizada empleando arvejas y trébol como plantas indicadoras.El nivel de salinidad del medio afectó los resultados impidiendo la detección del herbicida aniveles bajos cuando la salinidad fue muy elevada (Brinton et al. 2006).

Los bioanálisis pueden ayudar a identificar una sustancia que causa un daño fitotóxico a unaplanta de importancia comercial. Por ejemplo, es posible que se atienda un caso en el que sesupone que se aplicó un herbicida no selectivo por error, que el agua empleada en el riegovenía contaminada con un herbicida, o que productos persistentes empleados en el pasadotengan actividad biológica y afecten negativamente al cultivo sembrado. En estos casos, elbioanálisis pretende reproducir los síntomas de toxicidad. Para ello, pueden tratarse plantascon los herbicidas sospechosos de causar el daño en dosis que asemejen las que pudieronemplearse por error o presentes en el agua de riego para reproducir los síntomas y determinarcuál herbicida produjo el daño. También puede hacerse crecer plantas sensibles en suelocontaminado y comparar sus respuestas con las de plantas sembradas en suelo sin residuos ocon contenidos conocidos del contaminante de interés. En este tipo de estudios hay dospremisas claves: la especie indicadora mostrará una respuesta que es proporcional a laconcentración del herbicida y que las respuestas obtenidas sean reproducibles (Santelmann1977).

Mediante el empleo de plantas indicadoras se puede determinar la movilidad de losherbicidas en asocio con experimentos en los que columnas de suelo se tratan con cantidadesconocidas de un herbicida en forma superficial y se agrega cantidades conocidas de agua parapropiciar su lixiviación. El movimiento del herbicida se determina sembrando plantas muysensibles (indicadoras) y comparando el daño contra una curva estándar preparada con baseen dosis conocidas del producto (Van Wyk & Reinhardt 2001).

Aislamiento de componentes activos dirigido por bioanálisis

Los bioanálisis sirven como un complemento indispensable para el descubrimiento desustancias activas, principalmente de origen natural, bajo un esquema de aislamiento dirigidopor bioanálisis. Este es un proceso iterativo en el que los compuestos de un organismo seseparan en distintas fracciones, las cuales se someten a un bioanálisis para determinar laactividad biológica de interés. Las fracciones que muestran actividad se fraccionan aun másy se prueban nuevamente en los bioanálisis hasta que se encuentra y purifica el compuestobiológicamente activo. Este esquema de determinación de las sustancias activas se facilitamucho cuando se puede emplear bioanálisis rápidos en miniatura (Dayan & Duke 2006).

Interacción de herbicidas entre sí y con otras sustancias

Las aplicaciones de herbicidas en el campo muy frecuentemente incluyen dos o másingredientes activos en mezcla. En la mayoría de los casos el objetivo de realizar estasmezclas es el de ampliar el espectro de acción sobre las malezas, aunque también puedeprocurarse aprovechar posibles sinergismos (o antagonismos) entre los componentes de lamezcla. Los bioanálisis ayudan a determinar los tipos de interacciones que puedenpresentarse y a identificar los posibles mecanismos de tales interacciones.

Aunque el tema excede los objetivos de este trabajo, es importante indicar muy brevementealgunos aspectos que deben considerarse en el diseño y ejecución de pruebas de interaccionesde herbicidas entre sí o con otros compuestos. Estos temas son tratados en amplio detalle enpublicaciones especializadas (Streibig et al. 1998; Streibig & Kudsk 1993).

Existen dos modelos de referencia principales para estudiar la acción conjunta de herbicidas(u otras sustancias químicas con acción biocida). El modelo de dosis aditivas (MDA) suponeque los dos compuestos en interacción tienen modos de acción similares en la planta tratada yque pueden sustituirse el uno por el otro sobre la base de su potencia relativa (término que sedefinió en la sección sobre comparación de respuestas). Las desviaciones que se presentande este modelo se caracterizan como sinergismo o antagonismo, cuando el efecto de lamezcla es superior o inferior al del herbicida individual, respectivamente (Streibig et al.1998). Si determinamos experimentalmente que el herbicida A en una dosis de 600 g ha-1

proporciona un control del 50% y que del herbicida B se requiere 10 g ha-1 para lograr elmismo efecto; entonces la potencia relativa es de (600/10) = 60. Si quisiéramos por algunarazón agronómica o económica usar solo 400 g ha-1 del herbicida A, entonces requeriríamosadicionar 3,33 g ha-1 del herbicida B para alcanzar el 50% de control. Es decir, aplicando untotal de 403,33 g de la mezcla según el modelo, permitiría lograr un control del 50%.

El modelo de supervivencia multiplicativa (MSM) que supone que las dos sustancias ejercensu efecto independientemente en la planta. Este modelo es el que sirve de base a lascomparaciones según el criterio de Colby (Colby 1967) que son muy populares en la cienciade las malezas por su simpleza, facilidad de cálculo e interpretación. Para una prueba deColby basta con aplicar cada uno de los herbicidas por separado y luego en mezcla a lasmismas dosis que los tratamientos individuales para determinar el tipo de interacción. Elsiguiente ejemplo ilustrativo puede aclarar conceptos. Para determinar la interacción entrelos herbicidas glifosato o glufosinato con MSMA se realizó un experimento de campo en elque se aplicaron los herbicidas solos y en mezcla sobre varias malezas, entre ellas Sesbaniaexaltata (hoja ancha) y Sorghum halepense (gramínea) proveniente de semilla (Koger et al.

2007). Las dosis a que se aplicaron los herbicidas y los resultados de la evaluación visual dedaño se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Control visual (observado y esperado) de Sesbania exaltata (SEBEX) y Sorghumhalepense (SORHA) dos semanas después del tratamiento con glifosato, glufosinato, yMSMA en mezcla de tanque (Adaptado de (Koger et al. 2007)).

Herbicida DosisSEBEX SORHA

Observado (Esperado) Observado (Esperado)

Glifosato 0,84 kg e.a. ha-1 41 99Glufosinato 0,5 kg i.a. ha-1 95 92MSMA 2,2 kg i.a. ha-1 21 68Glifosato + MSMA 0,84 + 2,2 47 (56)1 95 (99)Glufosinato + MSMA 0,5 + 2,2 92 (99) 91 (97)DMS (0,05)2 6 5

1Valores esperados calculados por autores originales de acuerdo con Colby (1967).2Diferencia mínima significativa.

El glifosato solo a la dosis empleada controló al S. halepense en un 99% y a S. exaltata en un41%. Estos valores provienen de evaluaciones visuales realizadas en cuatro repeticiones dossemanas después de la aplicación en una de las dos localidades (Louisiana, EE.UU.) donde serealizaron los experimentos. La valoración visual se basó en una escala de 0% (ausencia decontrol) a 100% (muerte de la planta) considerando, de acuerdo con los autores, clorosis,necrosis y reducción del crecimiento. El MSMA también fue más eficaz para controlar S.halepense que S. exaltata. Cuando se aplicaron en mezcla de tanque, se consideró que elMSMA actuó como un antagonista del glifosato (comparar los valores de control esperados yobservados). El valor esperado para la mezcla de glifosato más MSMA en S. exaltatacorresponde a E = 41 + [(100 - 41)*0,21)] = 53,4% y en S. halepense a E = 99 + [(100-99)*0,68] = 99.7%(autores indican 56% y 99%, respectivamente, posiblemente por efecto deredondeo). Una situación similar se presentó con el glufosinato, aunque este herbicidaaplicado solo igualmente controló ambas especies. Si los valores esperados se calculan de lamisma manera se obtiene 96.1% y 97.4%, respectivamente (no es posible saber si lasdiferencias se pueden atribuir a errores de cálculo o redondeo). En este caso, se estácomparando herbicidas en mezcla que tienen modos de acción diferentes. En el caso delglifosato, la dosis es lo suficientemente elevada como para llevar la respuesta de la planta asu límite inferior en la curva dosis-respuesta dejando “poco margen” para que el herbicidacomplementario ejerza su efecto. En la publicación no se da intervalos de confianza para losvalores observados y el lector puede preguntarse cuál es la diferencia en una evaluaciónvisual entre 100% y 99% como promedios de daño.

De acuerdo con lo que se ha discutido, sin embargo, es más adecuado planificar y evaluar elexperimento haciendo las mezclas con base en la potencia de cada herbicida aplicadoindividualmente y decidiendo cuál modelo usar con base en nuestro conocimiento sobre elmodo de acción de los herbicidas. Inderjit et al. (2002) presentan un ejemplo de cómo se

calcularon las dosis para probar mezclas en un experimento de isobolas con compuestosfenólicos de naturaleza alelopática.

Los resultados de los experimentos de mezclas por lo general se presentan gráficamente deforma de isobolas (líneas de igual efecto) con base en un nivel de efecto preseleccionado(casi siempre la ED50). En este gráfico las desviaciones que muestren los valoresexperimentales obtenidos con las muestras que indiquen un efecto superior al de la isobola dereferencia designan como sinérgicos; en el caso opuesto, representan una mezcla antagónica.En la Figura 10 se ilustran las posibles isobolas.

Figura 10. Ilustración del modelo de isobolas. La línea recta corresponde al modelo de dosisaditivas y las líneas punteadas al antagonismo y sinergismo.

Existen procedimientos estadísticos para determinar si la isobola correspondiente a lasmezclas se ajusta a los datos experimentales así como para determinar la significancia de ladesviación, es decir, para respaldar estadísticamente si en efecto existe el sinergismo oantagonismo (Kudsk & Streibig 1993).

El mismo concepto de isobolas se puede emplear para estudiar el efecto de sustanciasbiológicamente inactivas sobre la acción del un herbicida. Tal es el caso del efecto decoadyuvantes o “surfactantes” que, en principio, en las dosis de uso normal no afectan elcrecimiento de las plantas. Las isobolas de referencia para estos casos se ilustran en la Figura11.

Figura 11. Ilustración esquemática de las tres posibles situaciones que pueden presentarsecuando se incrementa la dosis de un coadyuvante en interacción con un herbicida. I denotaaditividad, II antagonismo, y III sinergismo. Adaptado de (Kudsk & Streibig 1993)

Si la curva de dosis-respuesta del herbicida no es alterada por la adición del coadyuvante, laisobola tendrá la forma lineal (I) de la Figura 11, es decir, la adición del coadyuvante no variala dosis del herbicida necesaria para lograr producir un efecto determinado. Si elcoadyuvante reduce la eficacia del herbicida, la isobola correspondiente se elevará como enII porque ocurre un antagonismo. La otra posibilidad (III) es que el adyuvante mejore laeficacia por lo que la dosis necesaria del herbicida para lograr el mismo efecto se reduce, esdecir, se presenta sinergismo.

Comentarios finales

Los bioanálisis constituyen una herramienta muy valiosa en el diagnóstico fitosanitario y enla investigación sobre la acción de los herbicidas. La gama de posibilidades de utilizarorganismos vivos para detectar la presencia y concentración de herbicidas en el ambiente opara evaluar la respuesta biológica y fisiológica de las plantas a estos productos es muyamplia y permite adaptar métodos y técnicas según sean los objetivos perseguidos. En estetrabajo se describe algunas de las oportunidades que ofrecen los bioanálisis así como losprocedimientos fundamentales que deben de tomarse en cuenta en su planeamiento,ejecución e interpretación. Se ha puesto énfasis en los estudios que utilizan plantas enteraspero los fundamentos discutidos tienen aplicación independientemente del organismoindicador que se emplee. En la medida de lo posible, la información se ha presentado de lamanera más sencilla y con el objetivo de ayudar a quienes requieren realizar bioanálisis en supráctica profesional, aportando experiencia propia y referencias selectas de la literaturacientífica. Por su naturaleza introductoria, se espera que este trabajo estimule al lector aahondar más en el tema y le sirva como base para planear trabajos que requieran el empleo debioanálisis.

Literatura Citada

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Capítulo 5MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZASEN EL SUELO

Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3.1Universidad Central de Venezuela.

2Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral3Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas

INTRODUCCIÓNLas malezas causan cuantiosas pérdidas a los cultivos en el mundo. Los agricultores gastanalrededor entre 15 a 30% de los costos de producción en el control de malezas. Lasinfestaciones de malezas están relacionadas con el cultivo y su manejo, principalmente con lapreparación del suelo y los sistemas de siembras, ellos condicionan la emergencia de pocasespecies del total que se encuentran en el banco de semilla del suelo, en una situaciónagrícola en particular.

Cuando se estima acertadamente el tamaño de los bancos de semillas viables de malezas delsuelo, esto puede ser de mucha utilidad para planificar con antelación el manejo integrado delas mismas.

El propósito de este trabajo es proporcionar a técnicos, investigadores, estudiantes yproductores agrícolas una metodología de evaluación del banco de semillas de malezas en elsuelo.

BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELOEl banco de malezas del suelo es una reserva viable de semillas no germinadas en un hábitatdeterminado (Basking y Basking, 2001). La mayoría de los bancos de semillas del sueloconsisten en semillas enterradas (Grime, 1979). El banco de semilla de malezas del suelo estáconstituido por semillas vivas y muertas. Las semillas vivas del banco puedan estar en estadoquiescente y latente (Bigwood e Inouye, 1988). Se considera que una semilla está quiescentecuando alguno de los factores que controlan la germinación, tales como: contenido dehumedad, temperatura, oxígeno y luz, no están en el estado óptimo requerido por la especieen particular. Cuando se restituye el nivel de exigencia de estos factores ocurre lagerminación. En contraste, la semilla latente es aquella que está viva pero no germina a pesarde tener óptimos los factores que afectan la germinación (Besnier, 1989).

El banco de semilla de malezas del suelo se enriquece periódicamente (Figura 1), según lascircunstancias preexistente del sitio, con las nuevas producto de la lluvia de semillas desdelas plantas madres o progenitoras que tras su dispersión llegan y se incorporan al suelo;también se empobrece gradualmente con las semillas que desaparecen, mueren o germinan(Besnier, 1989).

Haciendo una analogía con un banco comercial, las semillas latentes estarían en una cuentade ahorro y las quiescentes en una cuenta corriente, tal manera que se establece un flujobidireccional entre éstas y proveen la dinámica de emergencia en de malezas en los suelosagrícolas (Harper, 1977). Este flujo está controlado por interacciones de los factoresabióticos del ambiente del suelo (Figura 1). Por ejemplo, los cambios de la temperatura del

suelo y la humedad, el fotoperíodo y los rayos rojos/infrarrojos han sido implicados en elcontrol del flujo de la latencia (Karssen 1981; Baskin y Baskin 1989).Figura 1. Modelo de un banco de semilla de malezas del suelo

El desgrane de las semillas a medida que maduran es un mecanismo importante para sudispersión y distribución en el campo, asegurando que buena parte de las semillas caídas sedistribuyan sobre la superficie del suelo donde pueden ser esparcidas por el viento y el agua(Delouche et al., 2007).

La latencia de las semillas es un mecanismo efectivo de sobrevivencia para las especiessilvestres, nativas y las malezas anuales/perennes propagadas por semillas, debido a quesatisface varias condiciones críticas tales como: (a) bloquea la germinación de modo que laespecie sobrevive bajo la forma de semilla hasta que las condiciones son nuevamentefavorables para crecer y desarrollarse como plantas; (b) la intensidad o grados de latenciavaría entre todas las semillas de una población de, modo de distribuir la germinación en eltiempo y aumentar la posibilidad de que algunas semillas germinen cuando las condicionessean favorables; (c) La latencia inhibe los procesos fisiológicos de deterioro de modo que lassemillas retienen su viabilidad; (d) la ruptura de latencia ocurre bajo determinadascondiciones, el más común es el tiempo pero también la luz, bajas o altas temperaturas, laacidez o los nitratos del suelo y otros elementos pueden liberarla (Delouche et al., 2007).

El modelo espacial de las semillas de malezas en el banco del suelo en campos agrícolas, porlo general siguen un patrón de dispersión agregada y pueden ser descrito matemáticamentepor una distribución binomial negativa (Chauvel et al., 1989; Wiles y Schweizer, 1999;Navarro y Pérez, 2002; Forcella et al., 2003). Desde un punto de vista práctico esto significaque muchas muestras representativas de suelo de un banco de semillas para una especie

particular pudieran no contener semillas, mientras que unas pocas muestras podrían contenerun alto número de semillas. Quizás la forma de distribución agregada podría ser el resultadode una dispersión limitada desde las plantas madres o también cuando el hombre ayuda a sudiseminación con las prácticas culturales aplicadas durante el proceso de producción de loscultivos, por ejemplo, utilización de semilla, uso de la cosechadora, preparación del suelo,entre otras (Forcella et al., 2003).

La composición y densidad de las semillas de malezas en el suelo varían grandemente y estánmuy relacionadas con la historia de los cultivos y la preparación del suelo. La composiciónestá influenciada por las prácticas agronómicas y varía de campo en campo, incluso entreáreas de un mismo campo. Reportes del tamaño del banco de semilla del suelo van desdecero a más de 1 millón semillas.m-2 (Buhler et al., 1997).

Generalmente el banco de semillas está compuesto por muchas especies, con pocas quecomprenden el 70 a 90 % del total de malezas. Estas especies son las primeras plagas en elsistema agronómico porque resisten las medidas de control y están adaptadas al sistema decultivo. Un segundo grupo comprende un 10 a 20% del banco de semilla, son generalmenteadaptadas a estas áreas geográficas pero no a las prácticas de producción de cultivos.También hay un pequeño grupo de semillas recalcitrantes de previos bancos de semillas;especies nuevas introducidas y semillas de anteriores cultivo. Estos grupos cambianconstantemente debido a la dispersión por humanos, otros animales, maquinarias, viento yagua (Wilson et al., 1985).

En teoría eliminar un banco de semillas en el suelo es relativamente fácil si se para laproducción de semilla de las malas hierbas y se dan las condiciones óptimas para lagerminación y emergencia, sin embargo, en la práctica el manejo de los bancos de semilla esmás complejo debido a que es difícil prevenir la producción e introducción de semillas, asícomo la persistencia de pequeños porcentajes de semillas en el banco y la alta producciónpotencial de algunas especies de malezas (Buhler et al., 1997).

La periodicidad de la emergencia de diferentes especies es también un aspecto importante delmanejo de las malezas. Conociendo cuando las diferentes especies son la principales enemerger es importante para la planificación de un programa efectivo de control de malezas(Ogg y Dawson, 1984). El uso de la información sobre el banco de semilla de malezas delsuelo sirve para usar modelos bioeconómicos y predecir la emergencia dentro del proceso detoma de decisiones (Swinton y King, 1994 citado por Buhler et al., 1997).

MÉTODOS DE ESTIMACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DELSUELO

Muestreo del suelo

No existe un protocolo universal para el muestreo de banco de semillas de malezas del suelo,cada investigador debe adecuarse a sus objetivos, tiempo, equipo disponible y limitaciones(Forcella et al., 2003). Por lo general se usan barrenos de muestrear suelo con fines edáficos,con orificio circulares siendo el más común el de 5 cm de diámetro y 10 cm de profundidadque se adapta muy bien a la detección de semillas pequeña, sin embargo para especies de

semillas más grandes como el arroz rojo no es muy eficiente. En el caso de los estudios dearroz rojo se ha diseñado un toma de muestras más grande haciéndolo como una caja demetal sin dos paredes, con dimensiones de 13 cm de ancho; 17 cm de largo y 10 cm deprofundidad. Este toma de muestra se introduce en una de las paredes de una trincheraexcavada previamente y cuidadosamente se sacan las muestras de suelo usando un machete,ver Figura 2 (Ortiz, 2005). El promedio de peso de cada muestra estuvo en el orden de 1,8 a 2kg (Abreu y Solórzano, 2006).

Figura 2. Modelo del toma muestra de suelo y cómo muestrear el suelo para ladeterminación del banco de malezas haciendo énfasis en el arroz rojo.

Número de muestrasEn la determinación del número de muestras a tomar para estimar el banco de semilla demalezas del suelo en un campo, Forcella et al, 2003, recomienda utilizar la ecuacióndiseñada por Dessaint et al. (1996):

259.045.0 )509/(10 DmN

donde, N es el número estimado de muestras necesarias para representar adecuadamente unbanco de semillas (muestras de suelo recogidas con un barreno de 5 cm de diámetro) y Drepresenta el nivel deseado de precisión. D es definido como el error estándar de la mediadividido entre la media (SEm.m-1). El valor de m es dividido entre 509 para convertir el áreade una muestra de 5 cm de diámetro a 1 m2. Se indica que un valor de D = 0,3 tiene un nivelpráctico de precisión para los estudios sobre bancos de semillas (Cuadro 1). Se deben hacermuestreos pilotos previos para conocer el tamaño del banco de semillas de malezas y luegoajustar esa densidad a la ecuación indicada.

Cuadro 1. Número de muestras de suelo tomadas con un barreno de diámetro 5 cm senecesitan para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseadosde precisión suponiendo varias densidades de semillas.m-2

Banco de semillas Nivel de precisión (D)semillas.m-2 0,2 0,3 0,4 0,5

10 716 318 179 11550 277 123 69 44

100 184 82 46 29500 71 32 18 11

1 000 47 21 12 85 000 18 8 5 3

10 000 12 5 3 2Fuente: Forcella et al, 2003

Profundidad de muestreoLa profundidad a que se deberían tomar las muestras depende completamente de losobjetivos de la investigación. Tal como se ha dicho en la descripción del banco de malezasdel suelo realizada arriba, la mayoría de las semillas se encuentran en los primeros 10 cm deprofundidad (Forcella et al., 2003; Venegas, 1994; Ferrero et al., 1996; Abreu y Solórzano,2006). En el caso de la estimación del banco de semilla de arroz rojo del suelo la profundidadde 0-10 cm es suficiente para estimar su tamaño (Figura 3).

Tipo de muestreo en campoExisten varios modelos de muestreo horizontal en campo para estimar el banco de semilla demalezas del suelo que proporcionaban resultados equivalentes, siendo el de diagonal doble elde uso más simple y fácil de ejecutar, ver Figura 4 (Ortiz, 2005). Cualquier diseño demuestreo es aceptable siempre que abarque el largo y el ancho del campo (Colbach et al.,2000).

Figura 4. Metodología de muestreo en diagonal doble usado para detectar arroz rojo

Si el objetivo de la investigación es relacionar los bancos de semillas con la vegetación queemerge sobre el suelo, los bancos de semillas deberían ser muestreados inmediatamentedespués de la dispersión de las semillas pero antes de su germinación. El muestreo de losbancos de semillas después de la emergencia de las plántulas tiene poco valor, tanto en lateoría como en la práctica (Forcella et al., 2003).

Si el objetivo de la investigación es usar la información del banco de semillas para contribuira hacer recomendaciones para los tratamientos de manejo de malezas, entonces lainformación deberá estar disponible en el momento en que se deban realizar los tratamientos(Schweizer et al., 1997).

Una vez que se han extraído las muestras del suelo hay dos técnicas básicas para enumerar elnúmero de semillas en las mismas; estos son (1) Extracción de semilla directa (Malone,1967) y (2) método de la emergencia (germinación). Los dos métodos han dado resultadosdiferentes pero ellos están generalmente correlacionados entre sí (Ball y Miller, 1989;Bàrberi et al., 1998; Forcella, 1992).

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE SEMILLALas muestras de suelo son colocadas en una solución con sustancias dispersantes como elhexametafosfato de sodio que ayudará a separar la arcilla y el limo de las semillas (Malone,1967), se ha usado cloruro de sodio (sal común) con el mismo fin (Ortiz y González; Abreu ySolórzano, 2006). Posteriormente la solución, las partículas disgregadas y las semillas sepasan por tamices con diferentes diámetros de los orificios (Figura 5)

El tamaño de los tamices es un factor fundamental para determinar la eficiencia de laseparación de las semillas (Malone, 1967).

La etapa siguiente incluye la remoción de la arcilla, el limo y las partículas pequeñas de arenade la muestra; esto se hace habitualmente sacudiendo la muestra colocada en un cedazo opasando un chorro de agua sobre la misma. Los sopladores con aire a presión también puedenser usados para separar los restos orgánicos de las semillas en las muestras secas (Forcella etal. 2003).

Figura 5. Extracción de semillas de malezas provenientes del banco de semilla del suelo.

Se pueden utilizar equipos para lavar las muestras tales como los levigadores que son unasmáquinas que ejecutan los mismos procedimientos manuales para la separación de lassemillas del suelo (Gross y Renner, 1989). Los levigadores tienen la ventaja de poderprocesar varias muestras simultáneamente.

Todos los métodos de extracción directa de las semillas proporcionan estimaciones de ladensidad total del banco de semillas, incluyendo las semillas muertas. Por ello, esta técnica esespecialmente valiosa para los estudios que involucran la dinámica de la población de lasmalezas, sin embargo, a veces no siempre es la apropiada para la correlación de los bancos desemillas con las poblaciones de plántulas ya que se podría confundir semillas muertas,latentes y no latentes (Forcella et al, 2003), especialmente en semillas muy pequeñas, no esel caso del arroz rojo ya que en ella se pueden detectar estos estados de la semilla confacilidad (Abreu y Solórzano, 2006).

Una vez que las semillas han sido aisladas por el método de extracción directa, deben seridentificadas (Figura 6). La parte que requiere más tiempo en este método es laidentificación de las semillas bajo una lupa estereoscópica. El evaluador debe tenerexperiencia en la identificación morfológica de las semillas, cuando no tiene la experticianecesaria, entonces puede hacer uso de catálogos con imágenes de las semillas de las malezas

comunes en su región (Forcella et al., 2003). También puede acudir a expertos para que losayuden a clasificar las semillas de las malezas.

Otros investigadores identifican las semillas aisladas a través de programas computarizados(Benoit et al., 1992; Buhler y Maxwell, 1993). Cuando no es posible identificar la especie sepuede recurrir al uso de marcadores moleculares de ADN (Fennimore et al., 1999; Joel et al.,1998; Mucher 2000). También se pueden hacer germinar las semillas y verificar la especiecuando exprese los rasgos que la identifican.

Las semillas que se separan por medio del método de extracción directa pueden ser viables oestar muertas. Estas semillas deben ser sometidas a la prueba de la viabilidad. En primerlugar se separan las semillas llenas de las vana simplemente apretándolas con una pinza fina.Se eliminan las semillas vanas (muertas) y se ponen a germinar las llenas. El número desemillas que germina proporciona una estimación de la densidad de las semillas quiescentes,sin embargo, no estima la cantidad de semillas latentes.

La determinación de las semillas latente en el banco de malezas se realiza usando la pruebade tetrazolio, la cual se basa en el cloruro de tetrazolio. Las semillas grandes o medianas secortan longitudinalmente o se puyan a la altura del embrión las pequeñas, las mitades secolocan en unos recipientes donde se ha colocado previamente una solución de tetrazolio al0,1-0,2 %, el tiempo de incubación y temperatura depende de la especie, la cual varía desdeunas pocas horas hasta una semana, a 10-30°C. El hidrógeno liberado por la reacción de ladehidrogenasa en los tejidos vivos se combina con el TZ para formar un pigmento rojo. Porlo tanto, si las semillas expuestas al TZ se vuelven rojas o rosadas, contienen tejidos vivosmientras que aquellas que no se tiñen se consideran muertas (ISTA, 1993). En la Figura 6 semuestra como se realiza la prueba de tetrazolio en el caso del arroz rojo.

Figura 6. Etapas de la prueba de viabilidad de las semillas de arroz rojo y arroz voluntario

El método de extracción directa de semillas del banco de malezas del suelo es laborioso ypoco práctico para caracterizar la composición de las especies en el banco de semillas(Forcella et al., 2003).

MÉTODO DE EMERGENCIA

El método de la emergencia (germinación) es usado normalmente para determinar el tamañodel banco de semillas quiescentes. En este caso cada muestra de suelo se coloca en bandejasplásticas bajo condiciones de invernadero o umbráculos, cercano a fuente de agua para elriego (Figura 7).

Figura 7. Técnicas consideradas para la estimación del banco quiescente o activo de arrozrojo del suelo

La profundidad del suelo en las bandejas no debería ser mayor de la profundidad en que seespera normalmente que germinen las especies, por lo general menor o igual a 10 cm.Cuando no se observa más emergencia de malezas, el suelo se mezcla y se hace un nuevociclo de conteo. El número de ciclos varía según los objetivos de la investigación.

Muchos investigadores prefieren los métodos de emergencia en comparación con el métodode la extracción directa de semillas, porque el último presenta varias limitaciones. Los

métodos de emergencia son relativamente menos laboriosos pero requieren de varios mesesantes de obtener datos, lo que hace que este método no sea práctico para predecir el potencialde las poblaciones de malezas que crecen en un determinado ciclo y el evaluador necesitatener conocimiento en la identificación de plántulas. Adicionalmente, el método deemergencia no estima el tamaño del banco de semilla latente (pasivo) importante para lasimplementar programas de manejos al largo plazo (Forcella et al., 2003)

ESTUDIO DE CASO: Estimación del banco de semillas de malezas en el suelo en un lotede una finca de arroz en el Estado Portuguesa con énfasis en el arroz maleza/rojo.

Los resultados revelaron que a través del método de extracción de semillas se detectaron 15malezas en un lote de la Finca Soledad de Armo en Portuguesa, de ellas tan solo cinco(Cyperus iria; arroz rojo; Cyperus sp; Ammania latifolia y arroz voluntario) tuvieron el 95%del total de semillas.m-2, mientras que las otras 10 especies representan el 5 %, a ambasprofundidades de muestreo. No obstante, por el método de emergencia 10 malezasrepresentaron el 95% del banco de semilla del suelo y seis el 5 %. Las malezas con mayordensidad de semillas en el banco activo de malezas del suelo fueron Sphenoclea zeylanica;Ammania latifolia y Cyperus iria (Cuadro 1,2, 3 y 4).

Estos resultados arrojaron diferencias entre el banco pasivo y activo de malezas en el ordende importancia de las malezas detectadas, pero se pudo corroborar que ambos métodos fueronefectivos para detectar arroz rojo. Por ejemplo Sphenoclea zeylanica que tuvo menorimportancia en el método de semilla (70,14 semillas.m-2) fue la que tuvo mayor relevanciapor la técnica de la emergencia (786,10 plántulas.m-2); también se observó que las malezasacuáticas no fueron detectadas por el método de semillas pero si con el de emergencia. Estoscasos, quizás signifiquen que las semillas de las especies en cuestión fueron difíciles deextraer de las muestras, a lo mejor los tamices tenían los orificios muy grandes y ellas fuerondescardas al momento de la separación. De cualquier manera estos estudios podrían ayudaral evaluador a tomar decisiones acertadas sobre el manejo de las malezas que aparecerán enel campo en el ciclo siguiente a la evaluación, principalmente a programar el control de arrozrojo (203,62 plántulas.m-2) el cual podría requerir hasta tres prácticas de falsa siembra conglifosato y/o batido antes de sembrar el arroz cultivado.

Cuadro 1. Número de semillas de malezas por m-2 en el banco de semilla del suelo a laprofundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

Cuadro 2. Número de plántulas de malezas por m-2 en el banco del suelo a la profundidad de0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

En general la proporción de malezas detectadas fue mayor a la profundidad 0-10 cm que a10-20 cm con ambos métodos de conteo de semilla y plántulas. Algunas excepcionesocurrieron como el caso de Ipomoea grandifolia que solamente se encontró en el muestreosuperficial y Cyperus odoratus en el profundo. Otros casos que ameritan su mención sonlos de Leptpchloa virgata; Ischaemum rugosum que se encontraron en mayor cantidad a los10-20 cm de profundidad por el método de la emergencia (Figura 8).

Figura 8. Comparación de la detección de malezas por dos métodos, uno por la extraccióndirecta de semillas (a) y otro por emergencia en bandejas (b)

El método de extracción directa de semillas permitió conocer como estaba la estructurapoblacional de semillas de arroz rojo en el suelo, mostrando que el 73 % de la semilla delbanco de semillas del suelo estaba viva, con más de 80% de latencia (Figura 9).En el cuadro 3 se observa que se encontró una gran cantidad de semillas de arroz rojo viable,con una media de 595,02 semillas.m-2, considerada como infestación intensa que amerita laimplementación de un manejo integrado al largo plazo con énfasis en el uso de semilla

0-10 cm

Melgas Total sem illas Sem . Muertas Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación

1 760,18 190,05 570,14 515,84 54,30 90,48 9,52

2 515,84 108,60 407,24 334,84 72,40 82,22 17,78

3 823,53 262,44 561,09 488,69 72,40 87,10 12,90

4 941,18 361,99 579,19 452,49 126,70 78,13 21,88

5 1113,12 497,74 615,38 542,99 72,40 88,24 11,76

6 696,83 117,65 579,19 506,79 72,40 87,50 12,50

7 742,08 153,85 588,24 524,89 63,35 89,23 10,77

8 895,93 36,20 859,73 533,94 325,79 62,11 37,89

Media 811,09 216,06 595,02 487,56 107,47 83,12 16,88Desv 178,52 151,62 124,25 67,97 90,81 9,41 9,41

10-20 cm

Melgas Total sem illas Sem . Muertas Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación

1 488,69 190,05 298,64 289,59 9,05 96,97 3,03

2 470,59 144,80 325,79 307,69 18,10 94,44 5,56

3 696,83 126,70 570,14 461,54 108,60 80,95 19,05

4 850,68 343,89 506,79 443,44 63,35 87,50 12,50

5 742,08 244,34 497,74 461,54 36,20 92,73 7,27

6 832,58 27,15 805,43 696,83 108,60 86,52 13,48

7 398,19 54,30 343,89 316,74 27,15 92,11 7,89

8 561,09 27,15 533,94 398,19 135,75 74,58 25,42

X 630,09 144,80 485,29 421,95 63,35 88,22 11,78Desv 173,47 111,99 166,02 131,67 48,37 7,49 7,49

certificada libre de arroz rojo, falsa siembra, limpieza de maquinaria y equipos, control deagua de riego; entre otras.

Cuadro 3. Número de semillas totales, viables, latentes y germinadas de arroz rojo yporcentaje de latencia y germinación del arroz rojo del banco de semillas del suelo en ochomelgas de un lote de siembra de arroz en la Finca Soledad de Armo, estado Portuguesa.

Figura 9. Número de semillas.m-2 de arroz rojo totales, vivas, muertas, latentes y germinadas.Porcentaje de latencia y germinación de las semillas viables de arroz rojo.

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Capítulo 5MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZASEN EL SUELO

Aída Ortiz1, Alexis Abreu2 y Euval Solórzano3.1Universidad Central de Venezuela.

2Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral3Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas

INTRODUCCIÓNLas malezas causan cuantiosas pérdidas a los cultivos en el mundo. Los agricultores gastanalrededor entre 15 a 30% de los costos de producción en el control de malezas. Lasinfestaciones de malezas están relacionadas con el cultivo y su manejo, principalmente con lapreparación del suelo y los sistemas de siembras, ellos condicionan la emergencia de pocasespecies del total que se encuentran en el banco de semilla del suelo, en una situaciónagrícola en particular.

Cuando se estima acertadamente el tamaño de los bancos de semillas viables de malezas delsuelo, esto puede ser de mucha utilidad para planificar con antelación el manejo integrado delas mismas.

El propósito de este trabajo es proporcionar a técnicos, investigadores, estudiantes yproductores agrícolas una metodología de evaluación del banco de semillas de malezas en elsuelo.

BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DEL SUELOEl banco de malezas del suelo es una reserva viable de semillas no germinadas en un hábitatdeterminado (Basking y Basking, 2001). La mayoría de los bancos de semillas del sueloconsisten en semillas enterradas (Grime, 1979). El banco de semilla de malezas del suelo estáconstituido por semillas vivas y muertas. Las semillas vivas del banco puedan estar en estadoquiescente y latente (Bigwood e Inouye, 1988). Se considera que una semilla está quiescentecuando alguno de los factores que controlan la germinación, tales como: contenido dehumedad, temperatura, oxígeno y luz, no están en el estado óptimo requerido por la especieen particular. Cuando se restituye el nivel de exigencia de estos factores ocurre lagerminación. En contraste, la semilla latente es aquella que está viva pero no germina a pesarde tener óptimos los factores que afectan la germinación (Besnier, 1989).

El banco de semilla de malezas del suelo se enriquece periódicamente (Figura 1), según lascircunstancias preexistente del sitio, con las nuevas producto de la lluvia de semillas desdelas plantas madres o progenitoras que tras su dispersión llegan y se incorporan al suelo;también se empobrece gradualmente con las semillas que desaparecen, mueren o germinan(Besnier, 1989).

Haciendo una analogía con un banco comercial, las semillas latentes estarían en una cuentade ahorro y las quiescentes en una cuenta corriente, tal manera que se establece un flujobidireccional entre éstas y proveen la dinámica de emergencia en de malezas en los suelosagrícolas (Harper, 1977). Este flujo está controlado por interacciones de los factoresabióticos del ambiente del suelo (Figura 1). Por ejemplo, los cambios de la temperatura del

suelo y la humedad, el fotoperíodo y los rayos rojos/infrarrojos han sido implicados en elcontrol del flujo de la latencia (Karssen 1981; Baskin y Baskin 1989).Figura 1. Modelo de un banco de semilla de malezas del suelo

El desgrane de las semillas a medida que maduran es un mecanismo importante para sudispersión y distribución en el campo, asegurando que buena parte de las semillas caídas sedistribuyan sobre la superficie del suelo donde pueden ser esparcidas por el viento y el agua(Delouche et al., 2007).

La latencia de las semillas es un mecanismo efectivo de sobrevivencia para las especiessilvestres, nativas y las malezas anuales/perennes propagadas por semillas, debido a quesatisface varias condiciones críticas tales como: (a) bloquea la germinación de modo que laespecie sobrevive bajo la forma de semilla hasta que las condiciones son nuevamentefavorables para crecer y desarrollarse como plantas; (b) la intensidad o grados de latenciavaría entre todas las semillas de una población de, modo de distribuir la germinación en eltiempo y aumentar la posibilidad de que algunas semillas germinen cuando las condicionessean favorables; (c) La latencia inhibe los procesos fisiológicos de deterioro de modo que lassemillas retienen su viabilidad; (d) la ruptura de latencia ocurre bajo determinadascondiciones, el más común es el tiempo pero también la luz, bajas o altas temperaturas, laacidez o los nitratos del suelo y otros elementos pueden liberarla (Delouche et al., 2007).

El modelo espacial de las semillas de malezas en el banco del suelo en campos agrícolas, porlo general siguen un patrón de dispersión agregada y pueden ser descrito matemáticamentepor una distribución binomial negativa (Chauvel et al., 1989; Wiles y Schweizer, 1999;Navarro y Pérez, 2002; Forcella et al., 2003). Desde un punto de vista práctico esto significaque muchas muestras representativas de suelo de un banco de semillas para una especie

particular pudieran no contener semillas, mientras que unas pocas muestras podrían contenerun alto número de semillas. Quizás la forma de distribución agregada podría ser el resultadode una dispersión limitada desde las plantas madres o también cuando el hombre ayuda a sudiseminación con las prácticas culturales aplicadas durante el proceso de producción de loscultivos, por ejemplo, utilización de semilla, uso de la cosechadora, preparación del suelo,entre otras (Forcella et al., 2003).

La composición y densidad de las semillas de malezas en el suelo varían grandemente y estánmuy relacionadas con la historia de los cultivos y la preparación del suelo. La composiciónestá influenciada por las prácticas agronómicas y varía de campo en campo, incluso entreáreas de un mismo campo. Reportes del tamaño del banco de semilla del suelo van desdecero a más de 1 millón semillas.m-2 (Buhler et al., 1997).

Generalmente el banco de semillas está compuesto por muchas especies, con pocas quecomprenden el 70 a 90 % del total de malezas. Estas especies son las primeras plagas en elsistema agronómico porque resisten las medidas de control y están adaptadas al sistema decultivo. Un segundo grupo comprende un 10 a 20% del banco de semilla, son generalmenteadaptadas a estas áreas geográficas pero no a las prácticas de producción de cultivos.También hay un pequeño grupo de semillas recalcitrantes de previos bancos de semillas;especies nuevas introducidas y semillas de anteriores cultivo. Estos grupos cambianconstantemente debido a la dispersión por humanos, otros animales, maquinarias, viento yagua (Wilson et al., 1985).

En teoría eliminar un banco de semillas en el suelo es relativamente fácil si se para laproducción de semilla de las malas hierbas y se dan las condiciones óptimas para lagerminación y emergencia, sin embargo, en la práctica el manejo de los bancos de semilla esmás complejo debido a que es difícil prevenir la producción e introducción de semillas, asícomo la persistencia de pequeños porcentajes de semillas en el banco y la alta producciónpotencial de algunas especies de malezas (Buhler et al., 1997).

La periodicidad de la emergencia de diferentes especies es también un aspecto importante delmanejo de las malezas. Conociendo cuando las diferentes especies son la principales enemerger es importante para la planificación de un programa efectivo de control de malezas(Ogg y Dawson, 1984). El uso de la información sobre el banco de semilla de malezas delsuelo sirve para usar modelos bioeconómicos y predecir la emergencia dentro del proceso detoma de decisiones (Swinton y King, 1994 citado por Buhler et al., 1997).

MÉTODOS DE ESTIMACIÓN DEL BANCO DE SEMILLAS DE MALEZAS DELSUELO

Muestreo del suelo

No existe un protocolo universal para el muestreo de banco de semillas de malezas del suelo,cada investigador debe adecuarse a sus objetivos, tiempo, equipo disponible y limitaciones(Forcella et al., 2003). Por lo general se usan barrenos de muestrear suelo con fines edáficos,con orificio circulares siendo el más común el de 5 cm de diámetro y 10 cm de profundidadque se adapta muy bien a la detección de semillas pequeña, sin embargo para especies de

semillas más grandes como el arroz rojo no es muy eficiente. En el caso de los estudios dearroz rojo se ha diseñado un toma de muestras más grande haciéndolo como una caja demetal sin dos paredes, con dimensiones de 13 cm de ancho; 17 cm de largo y 10 cm deprofundidad. Este toma de muestra se introduce en una de las paredes de una trincheraexcavada previamente y cuidadosamente se sacan las muestras de suelo usando un machete,ver Figura 2 (Ortiz, 2005). El promedio de peso de cada muestra estuvo en el orden de 1,8 a 2kg (Abreu y Solórzano, 2006).

Figura 2. Modelo del toma muestra de suelo y cómo muestrear el suelo para ladeterminación del banco de malezas haciendo énfasis en el arroz rojo.

Número de muestrasEn la determinación del número de muestras a tomar para estimar el banco de semilla demalezas del suelo en un campo, Forcella et al, 2003, recomienda utilizar la ecuacióndiseñada por Dessaint et al. (1996):

259.045.0 )509/(10 DmN

donde, N es el número estimado de muestras necesarias para representar adecuadamente unbanco de semillas (muestras de suelo recogidas con un barreno de 5 cm de diámetro) y Drepresenta el nivel deseado de precisión. D es definido como el error estándar de la mediadividido entre la media (SEm.m-1). El valor de m es dividido entre 509 para convertir el áreade una muestra de 5 cm de diámetro a 1 m2. Se indica que un valor de D = 0,3 tiene un nivelpráctico de precisión para los estudios sobre bancos de semillas (Cuadro 1). Se deben hacermuestreos pilotos previos para conocer el tamaño del banco de semillas de malezas y luegoajustar esa densidad a la ecuación indicada.

Cuadro 1. Número de muestras de suelo tomadas con un barreno de diámetro 5 cm senecesitan para determinar las densidades de los bancos de semillas en cuatro niveles deseadosde precisión suponiendo varias densidades de semillas.m-2

Banco de semillas Nivel de precisión (D)semillas.m-2 0,2 0,3 0,4 0,5

10 716 318 179 11550 277 123 69 44

100 184 82 46 29500 71 32 18 11

1 000 47 21 12 85 000 18 8 5 3

10 000 12 5 3 2Fuente: Forcella et al, 2003

Profundidad de muestreoLa profundidad a que se deberían tomar las muestras depende completamente de losobjetivos de la investigación. Tal como se ha dicho en la descripción del banco de malezasdel suelo realizada arriba, la mayoría de las semillas se encuentran en los primeros 10 cm deprofundidad (Forcella et al., 2003; Venegas, 1994; Ferrero et al., 1996; Abreu y Solórzano,2006). En el caso de la estimación del banco de semilla de arroz rojo del suelo la profundidadde 0-10 cm es suficiente para estimar su tamaño (Figura 3).

Tipo de muestreo en campoExisten varios modelos de muestreo horizontal en campo para estimar el banco de semilla demalezas del suelo que proporcionaban resultados equivalentes, siendo el de diagonal doble elde uso más simple y fácil de ejecutar, ver Figura 4 (Ortiz, 2005). Cualquier diseño demuestreo es aceptable siempre que abarque el largo y el ancho del campo (Colbach et al.,2000).

Figura 4. Metodología de muestreo en diagonal doble usado para detectar arroz rojo

Si el objetivo de la investigación es relacionar los bancos de semillas con la vegetación queemerge sobre el suelo, los bancos de semillas deberían ser muestreados inmediatamentedespués de la dispersión de las semillas pero antes de su germinación. El muestreo de losbancos de semillas después de la emergencia de las plántulas tiene poco valor, tanto en lateoría como en la práctica (Forcella et al., 2003).

Si el objetivo de la investigación es usar la información del banco de semillas para contribuira hacer recomendaciones para los tratamientos de manejo de malezas, entonces lainformación deberá estar disponible en el momento en que se deban realizar los tratamientos(Schweizer et al., 1997).

Una vez que se han extraído las muestras del suelo hay dos técnicas básicas para enumerar elnúmero de semillas en las mismas; estos son (1) Extracción de semilla directa (Malone,1967) y (2) método de la emergencia (germinación). Los dos métodos han dado resultadosdiferentes pero ellos están generalmente correlacionados entre sí (Ball y Miller, 1989;Bàrberi et al., 1998; Forcella, 1992).

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE SEMILLALas muestras de suelo son colocadas en una solución con sustancias dispersantes como elhexametafosfato de sodio que ayudará a separar la arcilla y el limo de las semillas (Malone,1967), se ha usado cloruro de sodio (sal común) con el mismo fin (Ortiz y González; Abreu ySolórzano, 2006). Posteriormente la solución, las partículas disgregadas y las semillas sepasan por tamices con diferentes diámetros de los orificios (Figura 5)

El tamaño de los tamices es un factor fundamental para determinar la eficiencia de laseparación de las semillas (Malone, 1967).

La etapa siguiente incluye la remoción de la arcilla, el limo y las partículas pequeñas de arenade la muestra; esto se hace habitualmente sacudiendo la muestra colocada en un cedazo opasando un chorro de agua sobre la misma. Los sopladores con aire a presión también puedenser usados para separar los restos orgánicos de las semillas en las muestras secas (Forcella etal. 2003).

Figura 5. Extracción de semillas de malezas provenientes del banco de semilla del suelo.

Se pueden utilizar equipos para lavar las muestras tales como los levigadores que son unasmáquinas que ejecutan los mismos procedimientos manuales para la separación de lassemillas del suelo (Gross y Renner, 1989). Los levigadores tienen la ventaja de poderprocesar varias muestras simultáneamente.

Todos los métodos de extracción directa de las semillas proporcionan estimaciones de ladensidad total del banco de semillas, incluyendo las semillas muertas. Por ello, esta técnica esespecialmente valiosa para los estudios que involucran la dinámica de la población de lasmalezas, sin embargo, a veces no siempre es la apropiada para la correlación de los bancos desemillas con las poblaciones de plántulas ya que se podría confundir semillas muertas,latentes y no latentes (Forcella et al, 2003), especialmente en semillas muy pequeñas, no esel caso del arroz rojo ya que en ella se pueden detectar estos estados de la semilla confacilidad (Abreu y Solórzano, 2006).

Una vez que las semillas han sido aisladas por el método de extracción directa, deben seridentificadas (Figura 6). La parte que requiere más tiempo en este método es laidentificación de las semillas bajo una lupa estereoscópica. El evaluador debe tenerexperiencia en la identificación morfológica de las semillas, cuando no tiene la experticianecesaria, entonces puede hacer uso de catálogos con imágenes de las semillas de las malezas

comunes en su región (Forcella et al., 2003). También puede acudir a expertos para que losayuden a clasificar las semillas de las malezas.

Otros investigadores identifican las semillas aisladas a través de programas computarizados(Benoit et al., 1992; Buhler y Maxwell, 1993). Cuando no es posible identificar la especie sepuede recurrir al uso de marcadores moleculares de ADN (Fennimore et al., 1999; Joel et al.,1998; Mucher 2000). También se pueden hacer germinar las semillas y verificar la especiecuando exprese los rasgos que la identifican.

Las semillas que se separan por medio del método de extracción directa pueden ser viables oestar muertas. Estas semillas deben ser sometidas a la prueba de la viabilidad. En primerlugar se separan las semillas llenas de las vana simplemente apretándolas con una pinza fina.Se eliminan las semillas vanas (muertas) y se ponen a germinar las llenas. El número desemillas que germina proporciona una estimación de la densidad de las semillas quiescentes,sin embargo, no estima la cantidad de semillas latentes.

La determinación de las semillas latente en el banco de malezas se realiza usando la pruebade tetrazolio, la cual se basa en el cloruro de tetrazolio. Las semillas grandes o medianas secortan longitudinalmente o se puyan a la altura del embrión las pequeñas, las mitades secolocan en unos recipientes donde se ha colocado previamente una solución de tetrazolio al0,1-0,2 %, el tiempo de incubación y temperatura depende de la especie, la cual varía desdeunas pocas horas hasta una semana, a 10-30°C. El hidrógeno liberado por la reacción de ladehidrogenasa en los tejidos vivos se combina con el TZ para formar un pigmento rojo. Porlo tanto, si las semillas expuestas al TZ se vuelven rojas o rosadas, contienen tejidos vivosmientras que aquellas que no se tiñen se consideran muertas (ISTA, 1993). En la Figura 6 semuestra como se realiza la prueba de tetrazolio en el caso del arroz rojo.

Figura 6. Etapas de la prueba de viabilidad de las semillas de arroz rojo y arroz voluntario

El método de extracción directa de semillas del banco de malezas del suelo es laborioso ypoco práctico para caracterizar la composición de las especies en el banco de semillas(Forcella et al., 2003).

MÉTODO DE EMERGENCIA

El método de la emergencia (germinación) es usado normalmente para determinar el tamañodel banco de semillas quiescentes. En este caso cada muestra de suelo se coloca en bandejasplásticas bajo condiciones de invernadero o umbráculos, cercano a fuente de agua para elriego (Figura 7).

Figura 7. Técnicas consideradas para la estimación del banco quiescente o activo de arrozrojo del suelo

La profundidad del suelo en las bandejas no debería ser mayor de la profundidad en que seespera normalmente que germinen las especies, por lo general menor o igual a 10 cm.Cuando no se observa más emergencia de malezas, el suelo se mezcla y se hace un nuevociclo de conteo. El número de ciclos varía según los objetivos de la investigación.

Muchos investigadores prefieren los métodos de emergencia en comparación con el métodode la extracción directa de semillas, porque el último presenta varias limitaciones. Los

métodos de emergencia son relativamente menos laboriosos pero requieren de varios mesesantes de obtener datos, lo que hace que este método no sea práctico para predecir el potencialde las poblaciones de malezas que crecen en un determinado ciclo y el evaluador necesitatener conocimiento en la identificación de plántulas. Adicionalmente, el método deemergencia no estima el tamaño del banco de semilla latente (pasivo) importante para lasimplementar programas de manejos al largo plazo (Forcella et al., 2003)

ESTUDIO DE CASO: Estimación del banco de semillas de malezas en el suelo en un lotede una finca de arroz en el Estado Portuguesa con énfasis en el arroz maleza/rojo.

Los resultados revelaron que a través del método de extracción de semillas se detectaron 15malezas en un lote de la Finca Soledad de Armo en Portuguesa, de ellas tan solo cinco(Cyperus iria; arroz rojo; Cyperus sp; Ammania latifolia y arroz voluntario) tuvieron el 95%del total de semillas.m-2, mientras que las otras 10 especies representan el 5 %, a ambasprofundidades de muestreo. No obstante, por el método de emergencia 10 malezasrepresentaron el 95% del banco de semilla del suelo y seis el 5 %. Las malezas con mayordensidad de semillas en el banco activo de malezas del suelo fueron Sphenoclea zeylanica;Ammania latifolia y Cyperus iria (Cuadro 1,2, 3 y 4).

Estos resultados arrojaron diferencias entre el banco pasivo y activo de malezas en el ordende importancia de las malezas detectadas, pero se pudo corroborar que ambos métodos fueronefectivos para detectar arroz rojo. Por ejemplo Sphenoclea zeylanica que tuvo menorimportancia en el método de semilla (70,14 semillas.m-2) fue la que tuvo mayor relevanciapor la técnica de la emergencia (786,10 plántulas.m-2); también se observó que las malezasacuáticas no fueron detectadas por el método de semillas pero si con el de emergencia. Estoscasos, quizás signifiquen que las semillas de las especies en cuestión fueron difíciles deextraer de las muestras, a lo mejor los tamices tenían los orificios muy grandes y ellas fuerondescardas al momento de la separación. De cualquier manera estos estudios podrían ayudaral evaluador a tomar decisiones acertadas sobre el manejo de las malezas que aparecerán enel campo en el ciclo siguiente a la evaluación, principalmente a programar el control de arrozrojo (203,62 plántulas.m-2) el cual podría requerir hasta tres prácticas de falsa siembra conglifosato y/o batido antes de sembrar el arroz cultivado.

Cuadro 1. Número de semillas de malezas por m-2 en el banco de semilla del suelo a laprofundidad de 0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

Cuadro 2. Número de plántulas de malezas por m-2 en el banco del suelo a la profundidad de0 a 10 cm en la Finca Soledad de Armo. Potrero de Armo. Portuguesa.

En general la proporción de malezas detectadas fue mayor a la profundidad 0-10 cm que a10-20 cm con ambos métodos de conteo de semilla y plántulas. Algunas excepcionesocurrieron como el caso de Ipomoea grandifolia que solamente se encontró en el muestreosuperficial y Cyperus odoratus en el profundo. Otros casos que ameritan su mención sonlos de Leptpchloa virgata; Ischaemum rugosum que se encontraron en mayor cantidad a los10-20 cm de profundidad por el método de la emergencia (Figura 8).

Figura 8. Comparación de la detección de malezas por dos métodos, uno por la extraccióndirecta de semillas (a) y otro por emergencia en bandejas (b)

El método de extracción directa de semillas permitió conocer como estaba la estructurapoblacional de semillas de arroz rojo en el suelo, mostrando que el 73 % de la semilla delbanco de semillas del suelo estaba viva, con más de 80% de latencia (Figura 9).En el cuadro 3 se observa que se encontró una gran cantidad de semillas de arroz rojo viable,con una media de 595,02 semillas.m-2, considerada como infestación intensa que amerita laimplementación de un manejo integrado al largo plazo con énfasis en el uso de semilla

0-10 cm

Melgas Total sem illas Sem . Muertas Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación

1 760,18 190,05 570,14 515,84 54,30 90,48 9,52

2 515,84 108,60 407,24 334,84 72,40 82,22 17,78

3 823,53 262,44 561,09 488,69 72,40 87,10 12,90

4 941,18 361,99 579,19 452,49 126,70 78,13 21,88

5 1113,12 497,74 615,38 542,99 72,40 88,24 11,76

6 696,83 117,65 579,19 506,79 72,40 87,50 12,50

7 742,08 153,85 588,24 524,89 63,35 89,23 10,77

8 895,93 36,20 859,73 533,94 325,79 62,11 37,89

Media 811,09 216,06 595,02 487,56 107,47 83,12 16,88Desv 178,52 151,62 124,25 67,97 90,81 9,41 9,41

10-20 cm

Melgas Total sem illas Sem . Muertas Sem. Vivas Sem. Latentes Sem Germinadas % Latencia %Germinación

1 488,69 190,05 298,64 289,59 9,05 96,97 3,03

2 470,59 144,80 325,79 307,69 18,10 94,44 5,56

3 696,83 126,70 570,14 461,54 108,60 80,95 19,05

4 850,68 343,89 506,79 443,44 63,35 87,50 12,50

5 742,08 244,34 497,74 461,54 36,20 92,73 7,27

6 832,58 27,15 805,43 696,83 108,60 86,52 13,48

7 398,19 54,30 343,89 316,74 27,15 92,11 7,89

8 561,09 27,15 533,94 398,19 135,75 74,58 25,42

X 630,09 144,80 485,29 421,95 63,35 88,22 11,78Desv 173,47 111,99 166,02 131,67 48,37 7,49 7,49

certificada libre de arroz rojo, falsa siembra, limpieza de maquinaria y equipos, control deagua de riego; entre otras.

Cuadro 3. Número de semillas totales, viables, latentes y germinadas de arroz rojo yporcentaje de latencia y germinación del arroz rojo del banco de semillas del suelo en ochomelgas de un lote de siembra de arroz en la Finca Soledad de Armo, estado Portuguesa.

Figura 9. Número de semillas.m-2 de arroz rojo totales, vivas, muertas, latentes y germinadas.Porcentaje de latencia y germinación de las semillas viables de arroz rojo.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS

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Capítulo 4EVALUACIÓN DE LA EFICACIA DE HERBICIDAS

Jesús CaripeSyngenta Crop Protection S.A.

Problemas y objetivos:Las especies de malezas son plantas que crecen en lugares no deseados y por lo tantocausan más daños que beneficios, ellas juegan un rol dominante ya que muchas veces sonmás numerosas que los cultivos y afectan en gran medida a la producción agrícola delmundo. En muchas regiones las medidas para el control de malezas son imperativas y tomanuna alta prioridad; el principal propósito en el control de malezas es: Liberar al cultivo de competencia por nutrientes, agua, luz y espacio para así poder tener

oportunidad de obtener el mejor rendimiento posible. Para liberar la interferencia al momento de la cosecha de los cultivos y poder así mejorar

la calidad de la cosecha. Minimizar por largo tiempo la proliferación de malezas en áreas cultivadas.

El principal objetivo de los ensayos de campo con herbicidas es poder determinar el efectode los herbicidas sobre los diferentes tipos y especies de malezas, así como la tolerancia ofitotoxicidad que pueda estar generando sobre los cultivos. Para poder alcanzar estosobjetivos el fin es definir: La dosis requerida o necesaria para lograr el control eficaz de las malezas. La tolerancia al cultivo, sin disminuir el potencial genético de los mismos. Lograr un amplio espectro de control entre los diferentes tipos de malezas. Regulación y flexibilidad en la forma de aplicación de los herbicidas. La duración de la actividad del herbicida en el medio ambiente. Comportamiento de los herbicidas en diferentes suelos. Comportamiento en condiciones meteorológicas diversas. Comportamiento de las diferentes formulaciones disponibles. Comparación con los estándares comerciales presente en el mercado. Detección del modo de acción de los herbicidas. Adaptación al manejo agronómico de los cultivos. Estudios de los efectos prorrogados de los herbicidas sobre los cultivos.

Diseño de experimentos con herbicidas:

Selección del lugar: Es un componente crítico para el caso de los ensayos de herbicidas, hay que darle un

cuidado en particular al tipo de suelo, condiciones y la distribución de las especies demalezas en el campo. El suelo debe ser de naturaleza uniforme y tener característicasadecuadas para el tipo de ensayo planeado, esto se debe de confirmar antes de la ejecucióndel ensayo.

Una completa descripción de las características de los suelos, las cuales son relevantespara los ensayos de herbicidas.

El sitio puede ser seleccionado en base a la uniformidad del cultivo, las malezas y lascondiciones del campo para cumplir el objetivo del ensayo. Es responsabilidad delensayista seleccionar el sitio para poder así maximizar los cambios o sucesos que ocurranen los ensayos para lograr los objetivos planteados. En necesario chequear varias veces elcampo, con la finalidad de estar seguro que tenemos la uniformidad conforme con lobuscado en el ensayo.

El sitio debe ser lo suficientemente grande para garantizar que entre el número definido derepeticiones o réplicas de cada uno de los tratamientos, pero esto debe ser lo más justoposible para evitar aumentar la variabilidad del ensayo.

El sitio debe de ser identificado y ubicado en todos los sitios del ensayo con coordenadasde GPS, la latitud y longitud de la cuadrícula del ensayo junto con la orientación del norte,identificando cuidadosamente la ubicación del ensayo de una manera referencial.

La geo-referencia es una herramienta útil para el mapeo de malezas, especialmente paralos ensayos de herbicidas pre-emergentes, pudiendo localizar las poblaciones de malezasen los cultivos.

Población de malezas y cultivos:En las pruebas de eficacia los bloques de los diseños estadísticos pueden representarpoblaciones uniformes y típicas de malezas, las cuales podrían corresponder a las buscadasen el espectro de control de malezas de los productos que se están probando. Sin embargo, lapresión excesiva de malezas podría evitarse si el ensayista lo decide así.

En las pruebas de tolerancia o fitotoxicidad, las parcelas deben estar libres de malezas paraeliminar efecto de competencia de las malezas sobre el cultivo y no sean las malezas las queafecten al cultivo.

El ensayo debe tener condiciones uniforme en los siguientes puntos: Se debe cultivar el mismo material vegetal, variedad o hibrido. Los estados de desarrollo deben de ser lo más uniforme posible (plantas de la misma

edad). Deben tener la misma densidad de siembra y una buena uniformidad. La infestación de las malezas en el ensayo debe ser uniforme. La infestación de malezas debe sobrepasar el umbral económico. Tipo de suelo, estructura, condiciones de humedad y topografía. Manejo agronómico se debe hacer en su totalidad en el ensayo. Se debe de llevar un historial del lote donde se realiza el ensayo.

Evaluaciones:Los ensayos debe de estar localizados en zonas de fácil acceso o razonables, que garantice laseguridad del o los ensayistas, lo cual nos permitirá la evaluación eficiente y la cosecha delensayo. Además, deben estar localizados en áreas donde se minimice el riesgo de errores enlas aplicaciones por deriva.

Los ensayos deben de estar etiquetados siguiendo la dirección de las hileras del cultivo, estohace el acceso más fácil para las evaluaciones de malezas en las parcelas de cada uno de lasrepeticiones

Cuando los ensayos están ubicados en sitios aledaños a vías o carreteras, se debe de guardaruna gran cantidad de hileras de borduras para tratar de aislar el ensayo. No se debenseleccionar sitios donde se encuentren árboles grandes, vías o carreteras, aeropuertosagrícolas, edificios etc. Los drenajes del terreno deben de evitarse dentro del ensayo, asícomo los gradientes excesivos.

Evitar usar poblaciones de malezas resistentes o que se sospeche de ello, a menos que seespecifique en el protocolo. Las parcelas de los testigos absolutos deben ser seleccionadaspara determinar poblaciones de malezas y distribución del cultivo.

La selección del tipo o diseño del ensayo, número de ensayo, número de repeticiones,tratamientos y tamaño de las parcelas:En general la selección del diseño estadístico esta definido por la etapa de desarrollo delproducto, desde pequeñas parcelas hasta llegar a grandes parcelas de validación.

Los ensayos se pueden clasificar en las siguientes categorías:

Tipo de ensayo Objetivo

Estado dedesarrollo

delproducto

Númerode

dosis

Númerode

tratamientos

Númerode

repeticiones

Tamañode la

parcela(m2)

Sin repeticiones

Con repeticiones

Eficacia/Tolerancia

Eficacia/Tolerancia/Rendimiento

Desarrollo

DesarrolloRegistro

4-8

2-52-3

20 -50

10-206-12

1-2

3-44-5

4-10

7.5-3010-30

Demostraciones Eficacia/Tolerancia/Rendimiento

Antes dellanzamiento

1-2 2-6 1-2 >100

Ensayos de residuos:El objetivo de estos ensayos es proveer de información acerca de la cantidad de residuos deherbicidas que puedan estar presentes en los cultivos donde se han utilizado estos productos,así como también en suelos, agua y varias plantas no objetivo y animales.

Estas pruebas son diseñadas para casos hipotéticos o considerando el peor escenario ydependerán del riesgo del uso del producto en cuanto a: Su máxima dosis de aplicación en función del ingrediente activo propuesto. Por el máximo número de aplicaciones propuesta. El mínimo intervalo entre las aplicaciones.

Ensayos de compatibilidad:El objetivo de estos ensayos es visualizar la compatibilidad entre las diferentes mezclas deherbicidas o solo. Estos ensayos son llevados a cabo para establecer los siguientes puntos:

Evaluar los efectos fitotóxicos. Evaluar la posibilidad de haber sinergismo o antagonismo. Evaluar la posibilidad de haber potenciación y/o aditividad.

Cuando en el sitio se encuentren las especies de malezas objetivos para evaluar el efecto defitotoxicidad, no es importante para el control de esta, sino lo que pueda estar causando dichamezcla al cultivo. Para el resto de las evaluaciones si es importante tomar en cuenta el controlde las especies de malezas y el efecto sobre el cultivo.

Ensayos de desecantes:Los herbicidas desecantes son utilizados para facilitar o mejorar las labores de cosecha de loscultivos; además, puede mejorar la calidad de la misma, principalmente a través de laspromociones de pérdida de humedad del tejido de la planta.

Estas actividades pueden ayudar a mejora las cosechas, por ejemplo como la desecación delas partes vegetales de las plantas de papa, con el objetivo de limpiar mejor los tubérculos ymantener una uniformidad en el tamaño de los mismos

Los ensayos de desecación se pueden enfocarse en síntomas de calidad de las cosechas talescomo: Aumento del rendimiento de la cosecha en tiempo. Uniformidad de la cosecha. Menor cantidad de materia inerte. Menor pérdida de la cosecha en el campo.

Los desecantes también son usados para eliminar la variación en la maduración de algunoscereales o leguminosas y así poder reducir el costo de secado en la post cosecha en algodóny oleaginosas.

Ensayos de pérdidas por lluvias:La eficacia de un herbicida se puede ver severamente afectada o reducida si es sometida auna lluvia después de la aplicación; la determinación de este período es importante parapoder publicarla en la etiqueta del herbicida.

Para determinar el período de riesgo de lavado del herbicida por la lluvia, los tratamientosquímicos son aplicados bajo condiciones normales y la lluvia es aplicada artificialmente através de equipos de irrigación agrícola a varios intervalos de tiempo; por ejemplo: Inmediatamente después de los tratamientos con herbicidas. Una hora después de los tratamientos con herbicidas. Tres horas después de los tratamientos. Veinticuatro horas después de los tratamientos.

La intensidad y duración de la lluvia artificial pueden variar para imitarla, en fuerte o suaveslluvias. Las evaluaciones se hacen para comparar el control de malezas entre los bloques, loscuales han recibido lluvia y en aquellos que permanecen secos.

Requerimiento general para los ensayos:El número de ensayos que serán necesarios por serie para cumplir un objetivo, depende demuchos diferentes factores; los más importantes son: Objetivo de los ensayos seriados. Estado del conocimiento. Soporte del proyecto. Extender hasta donde se pueda, para generalizar las conclusiones. La variabilidad natural de los individuos en diferentes suelos y condiciones ambientales,

ensayos, cultivos y factores limitantes Extender hasta tanto los tratamientos pueden interactuar con los diferentes ambientes. Poder de decisión para poder detectar cierto nivel de diferenciación entre los tratamientos. El número de repeticiones en ensayos individuales. Disponibilidad de recursos técnicos y financieros. Los testigos o controles deben de ser incluidos en cada ensayo, debido a que las

evaluaciones de la acción de los herbicidas está basado en la comparación entre losbloques tratados y no tratados; de hecho, de haber la posibilidad de tener dos testigos ocontroles se garantiza la mejor representación posible de las condiciones de suelo yambientales, así como de las especies de malezas.

Los compuestos estándares deberían ser incluidos a las dosis recomendadas para lalocalidad o cultivo.

Para determinar el límite de tolerancia del cultivo o para chequear la tolerancia del cultivo,hay que incluir el doble de la dosis a probar.

Los ensayos planeados pueden que no se lleven todos a cabo satisfactoriamente paraproveer información útil, por ejemplo debido a las condiciones climáticas desfavorablesen los ensayos.

Aplicaciones de los herbicidas

Tiempo de las aplicaciones: La definición del tiempo de aplicación se refiere al estado delcultivo y los momentos ideales de la aplicación

Métodos de aplicación de los herbicidas:1. Aplicaciones superficiales, es tratado todo el bloque con cada uno de los tratamientos.2. Aplicaciones en bandas, el herbicida solo se aplica en bandas, cubriendo al cultivo para

protegerlo de la aplicación.3. Aplicaciones post-dirigida, el herbicida es aplicado entre las hileras del cultivo o entre el

cultivo, sin tocar las hojas del mismo.4. Aplicaciones en manchas, el herbicida es aplicado en algunas partes del campo solamente,

para controlar zonas o especies especificas de malezas.

Parámetros importantes para la realizar de las aplicaciones: Para la propia interpretación de los resultados de los ensayos de campo, la colección

cuidadosa de los datos y el reporte de la información básica en el tiempo de la aplicaciónes muy importante.

Parámetros relacionados al cultivo y a las malezas:

Se debe de llevar registro o estimación de la cobertura del suelo por el cultivo; además, sedebe establecer rangos que puedan indicar dichas coberturas, también se debe reportar lafase de crecimiento, por ejemplo: número de hojas, longitud de las plantas y por últimocomentar el vigor y la sanidad del cultivo.

Las especies de malezas se deben levantar estimando su número por especies, haciendo asíun registro por malezas objetivo. El registro detallado de las especies de malezas presentesen el momento de la aplicación, incluso aquellas que se encuentre en menor número esespecialmente importante.

Cuando sea posible, evaluar las malezas en una fase de crecimiento muy temprano yestados posteriores, cuestión muy importante para poder así interpretar cualquier resultado

Estimar y establecer el registro de la cobertura de las malezas en el suelo, de maneraindividual, establecer un rango si es posible e indicar la fase de crecimiento.

Para la descripción de los estados de crecimientos puede ser utilizada la escala BBCH. Si hay distintas poblaciones de malezas, estas deben separarse para poder realizar el

reporte final.

Parámetros relacionados a las condiciones ambientales: Temperatura del suelo y aire. Humedad del suelo y del aire. Condiciones del suelo. Velocidad del viento y dirección. Presencia de lluvias después de la aplicación.

Para ensayos relacionados con las características del suelo y la acción de los herbicidasresiduales, los resultados pueden variar principalmente con la adsorción, contenido de M.O. ypH del suelo, por lo que una descripción precisa de las características del suelo es sumamenteimportante. El suelo es frecuentemente descrito como liviano, medio o pesado; sin embargo,esta señalamiento no es adecuado, ya que carece de precisión.

Evaluación de los ensayos de herbicidas

Evaluación de la acción de los herbicidas en el control de malezas:Debemos de tomar en cuenta los siguientes puntos:1. Siempre seguir los lineamientos del protocolo.2. Para un tiempo de evaluación, debe existir un mínimo de 3 evaluaciones y deben

realizarse durante la duración del ensayo.3. El reporte y evaluación de la tasa de daño al cultivo se debe expresar en porcentaje de

fitotoxicidad, que a su vez es capaz de combinar todos los síntomas, por ejemplo:reducción de la biomasa, quemado, decoloración, deformación etc., Una escala deporcentaje (%) donde el 0% es igual al testigo y el 100% es la planta completamentemuerta es muy utilizada. Para la evaluación de la fitotoxicidad siempre debe hacerse unacomparación con el testigo no tratado.

4. Pueden realizarse evaluaciones para los síntomas individuales, por ejemplo: porcentaje denecrosis o porcentaje de clorosis; esto se requiere cuando las especies de malezas exhibandaños que excedan el 10% o que sea inaceptable bajo las condiciones de la prueba. Lostratamiento sin ningún daño son igual a cero

5. Para cada especie de maleza la evaluación y reporte se debe hacer por prueba de eficaciasobre todo (% de control de malezas), ya que es la que combina todos los síntomas, comopor ejemplo: clorosis, necrosis y inhibición del crecimiento.

6. Las escala a utilizar en él % de control de malezas es el siguiente: 0 % control, testigo ono tratado y 100 % completamente muerto, en comparación con un bloque no tratado.

Si la cuantificación es hecha para determinar el control de las malezas, el área y el número demuestra por cada bloque debe ser reportada en la evaluación descrita. Los ensayosdesarrollados para malezas perennes, donde las plantas necesitan crecer para ser evaluadas,necesitan de muchas más evaluaciones. La caracterización del cultivo y flora de malezas(composición y grado de infestación) en un área no tratada y representativa del ensayosiempre es necesaria. Las condiciones ambientales deben ser reportadas durante la duracióndel ensayo, estos comentarios son extremadamente útiles, ya que al final de las evaluacioneshay que hacer un breve resumen de cualquier factor el cual puede haber afectado losresultados de los ensayos.

La consolidación final de los datos de campo es muy importante, sin esto no es posible llegara una buena conclusión; marcar los datos perdidos es una buena práctica. Las fotografíasfrecuentemente proveen una ayuda útil para describir los efectos vistos en el ensayo

Ejemplo típicos de evaluaciones usadas en ensayos de herbicidas:

Parámetro Tipo de evaluaciónControl % de control de malezas: debe incluir todos los síntomas característicos de daño

del herbicidaFitotoxicidad % de fitotoxicidad general: síntomas típicos; decoloración, detección del

crecimiento etc.Clorosis % del área o del tejido cloróticoDecoloración % del cambio de color (púrpura, blanco)Inhibición Se deben establecer escalas para hacer las evaluaciones, éstas pueden ir desde 0%

daño hasta 100 % de dañoDeformación Se debe reportar el número de plantas que presenten deformaciones. Esto aplica

para cultivosDefoliación % de defoliación en comparación con el testigoCobertura del suelo % cobertura de cultivo o de las malezas cuando se ve directamente desde arribaEmergencia % de emergencia de las plántulas en comparación con el testigoAltura Mediciones de la alturaFloración % de floración de las plantas en comparación con el testigoBiomasa fresca Peso de las plantas vivas en comparación con el testigoBiomasa seca Peso de las plantas secas en comparación con el testigoHumedad % de humedad de las semillas en comparación con el testigoPeso de granos Peso de 1000 semillas

Capítulo 7EVALUACIÓN DE MEZCLAS DE HERBICIDAS

Albert FischerUniversidad de California-Davis (USA)

IntroducciónLas mezclas de herbicidas son de uso común como herramientas para el manejo de malezas.Estas mezclas se pueden obtener como productos formulados o pueden ser hechas por losmismos productores. Las razones por las que las mezclas pueden ser utilizadas son variadas,pero entre ellas destacan el aumento del espectro de acción del control químico aplicado, elmanejo de casos de resistencia o, simplemente, el ahorro que supone la aplicación de más deun producto fitosanitario en una misma labor.

Las ventajas de la mezcla de herbicidas son evidentes, pero esta práctica debe ser evaluada,ya que pueden suceder (y suceden) interacciones entre los herbicidas que se mezclan quepueden traer como consecuencia el desmejoramiento de la acción fitotóxica de alguno de losherbicidas mezclado, lo que redunda en pérdidas económicas y un deficiente nivel de controlde las malezas. Por el contrario, también suele ocurrir que mezclas de herbicidas o de unherbicida con otro producto pueden resultar sinérgicas y con ello incrementar la eficiencia delcontrol y constituir una valiosa herramienta para el manejo de la resistencia a herbicidas. Espor ello que en este capítulo se desarrollarán las ideas básicas de los aspectos que sonnecesarios para evaluar una mezcla de herbicidas, y se hará énfasis en la utilidad que tieneesta técnica para el combate de los problemas de malezas resistentes a herbicidas.

Conceptos básicosCuando se mezclan dos o más ingredientes activos herbicidas o un herbicida con otrocompuesto (el cual puede por sí sólo no tener ningún efecto aparente sobre la planta), puedesuceder una de tres tipos de interacciones:1. La acción herbicida es menor de lo esperada ≈ ANTAGONISMO2. La acción herbicida es similar a lo esperada ≈ SIN INTERACCIÓN, ADITIVIDAD3. La acción herbicida es mayor a lo esperada ≈ SINERGISMOSi bien los efectos parecen claros, la interpretación matemática complica las definiciones.

AntagonismoEl antagonismo entre herbicidas sucede cuando el efecto es menor de lo esperado o cuandosucede un menor control que con el mejor componente de forma individual. El antagonismopuede suceder no sólo cuando se mezclan dos herbicidas, sino cuando mezclamos herbicidascon otros productos fitosanitarios, como fertilizantes foliares, insecticidas, hormonas decrecimiento, etc.

El antagonismo puede expresarse como una pérdida en la capacidad de control de una ovarias especies de uno o ambos componentes de la mezcla, pero también puede suceder quela mezcla de dos o más herbicidas produzca la pérdida de la selectividad de uno de suscomponentes, observándose un daño directo sobre el cultivo. Esta pérdida de la selectividadtambién puede suceder por antagonismo con otros productos fitosanitarios que se agreguen ala mezcla. Por todo ello, es necesario conocer las posibilidades de mezcla que poseen los

herbicidas; en la mayoría de los casos, los antagonismos conocidos se registran en lasetiquetas o materiales técnicos del herbicida, pero hay que considerar que todas lasposibilidades de mezcla no son evaluadas, por lo que la acción de mezcla no reportadas conanterioridad deben ser evaluadas antes de su uso. El antagonismo puede darse comoincompatibilidad química entre los herbicidas y/o las formulaciones y causar precipitadosinsolubles en el tanque de la asperjadora, por lo cual es aconsejable hacer una mezcla previade esos herbicidas, a las mismas diluciones de uso, en una botella y observar si existennotorias incompatibilidades antes de vertirlos al tanque. Por otra parte es importantemantener el orden de mezclado de diferentes formulaciones que indica la etiqueta de eseproducto. A menudo se recomienda que el orden de agregado de formulaciones a mezclar enel tanque sea:1. Agregar y agitar agua a ¾ del volumen del tanque de la aspersora.2. Productos dispersibles en agua (flowables, polvos mojables, concentrados en suspensión,

o suspo-emulsiones).3. Productos solubles en agua.4. Concetrados emulsionables.5. Surfactantes y otros aditivos solubles en agua.6. Completar el volumen de agua.

En este trabajo nos referiremos más bien a las interacciones entre ingredientes activos dentrode las plantas. El principio general en todo esto de las interacciones es de que uno no debieramezclar productos sin antes haberlos probado en un experimento en el campo contemplando:a) los herbicidas por separado y a las mismas dosis en que se usarán en la mezcla; b) juntos yen mezcla a esas mismas dosis, y c) con un cierto número de repeticiones.

Tal como se comentó, uno de los usos más comunes de las mezclas de herbicidas en laactualidad tiene como objetivo retardar la aparición de biotipos resistentes. Este uso estalimitado a mezclas de herbicidas que posean las siguientes características: Los herbicidas deben afectar sitios de acción diferentes (Ejemplo: inhibidores de la ALS e

inhibidores del Fotosistema II) o se fijan en a regiones diferentes si comparten el mismositio de acción (Ejemplo: Inhibidores del Fotosistema II, donde existen dos grupos segúnregión de unión: triazinas y el resto de herbicidas con este mecanismo de acción [ej.derivados de urea]).

Los herbicidas de las mezclas no deben ser degradados por la misma ruta metabólica. Controlan a la misma especie de maleza(s) con la misma eficacia. Tienen similar persistencia.

Los componentes ideales además tendrían que exhibir resistencia cruzada negativa ypresentar sinergismo.

SinergismoEl sinergismo sucede cuando el efecto de los herbicidas mezclados es mayor que la suma delos efectos individuales de cada componente. Este fenómeno puede ser utilizado paraincrementar la eficacia en el control, reducir dosis, mayor economía, etc. Lo importante aquíno es solamente contemplar el grado de control de la maleza, sino también ver si se mantieneo se afecta el nivel de selectividad deseado hacia el cultivo. El sinergismo no resulta en

perdida de selectividad si uno o ambos de los componentes de la mezcla sinérgica puede serdetoxificado por el cultivo y no por la maleza (bispiribac-tiobencarbo en arroz), cuando uncomponente bloquea a una isoenzima detoxificadora en la maleza y no en el cultivo (casos enEchinochloa y arroz), o cuando el sinergista forma inhibidores estables en la maleza y no enel cultivo (caso de tridifane y atrazina en maíz vs. Setaria spp.). El sinergismo entreherbicidas puede suceder cuando: Los componentes de mezcla de amplio espectro coinciden en actividad sobre ciertas

especies. Los componentes poseen diferentes sitios de acción en la misma planta y pueden activar

complejas redes de efectos secundarios. Un componente interfiere con la detoxificación del otro.

Sin embargo, a menudo resulta difícil hallar una explicación mecanística para un efectosinérgico.

Por su parte, el uso del sinergismo en el manejo de resistencia es importante sí es capaz de“quebrar” la resistencia de un biotipo o se reduce la dosis para el control de la especie y asídisminuye la presión de selección.

¿Cómo de determina el sinergismo?Existen tres metodologías para la determinación del sinergismo. Ellas son: Detectar ycuantificar modificaciones en la I50 (o GR50, LD50, etc.) usando curvas de respuesta a dosis,Análisis de isóbolas, y la comparación con efectos “esperados” predichos por el modelo deColby.

1. Modificaciones en la I50:En este manual se describe en detalle la forma como se determina la I50 (capítulos 4 y 10),que no es más que la dosis de un herbicida que reduce en un 50% una variable de control,que normalmente está asociada al crecimiento (peso, por ejemplo). Es importante resaltar queun sinergista puede no tener efecto herbicida, actuando sólo en la prevención del catabolismodel herbicida (o de sus metabolitos tóxicos) o simplemente facilitando la absorción otranslocación del herbicida.

En la Figura 1 se puede observar como la reducción del I50 lograda al mezclar dos herbicidases indicativo de sinergismo. Esto se detecta por un cambio significativo en el coeficiente dependiente de la curva de regresión ajustada a los datos; el valor de la I50 concomitantementese reduce.

Figura 1. Detección de sinergismo entre herbicidas por medio del estudio de la I50.

2. Análisis de isóbolas:Las isóbolas son líneas que unen puntos de igual efecto. Por ejemplo la isóbola para el 50%de efecto es aquella línea que une los puntos para los cuales herbicidas individuales o enmezcla tienen un efecto del 50% sobre la especie en estudio. La Figura 2 muestra isóbolaspara inhibición de crecimiento del 50% donde cada punto (azul) es el efecto en la planta queresulta de mezclar los herbicidas A y B a una serie de dosis cuya combinación resulta en elefecto inhibitorio del 50% tal como lo muestran las flechas de línea punteada.

Figura 2. Diagrama isobólico para 50% de inhibición con mezclas de dos herbicidas. Lalínea que une los puntos y se ubica por debajo de la diagonal punteada (no interacción oefecto aditivo) sugiere que las mezclas tienen efecto sinérgico

Puede establecerse como referencia una línea (línea diagonal punteada) donde los efectos delas combinaciones tiene efecto aditivo (no hay interacción; el efecto de una dosis de A sesuma al de la dosis complementaria de B para obtener un 50% de inhibición). Si los efectosson sinérgicos (o mejores de lo esperado), las respuestas de las mezclas (o de algunas deellas) se encuentran por debajo de la línea punteada. Lo opuesto ocurriría si los efectos sonantagónicos: las respuestas se encuentran por encima de la línea de aditividad (Figura 3).

Figura 3. Representación esquemática de efectos de mezclas de herbicidas (A) o de unherbicida y un coadyuvante inerte (B) empleando isóbolas (Adaptado de Streibig, et al.1993).

Los puntos isobólicos pueden unirse por una línea de regresión empírica, pero es posible quela línea isobólica adquiera una forma irregular o asimétrica donde, por ejemplo, hayaaditividad en una porción y sinergismo en otra porción de la respuesta. El empleo de isóbolases bastante adecuado para describir la sustitución de dos herbicidas en mezcla, peropresupone la confección de experimentos de dosis de respuesta para obtener la matriz deefectos isobólicos (I50, I90, etc.). Los modelos presentados aquí asumen que los herbicidaspueden sustituirse el uno por el otro a dosis biológicamente equivalentes, es decir que se tratade un modelo aditivo. Esto puede ocurrir con herbicidas que tengan el mismo modo deacción, aunque en la realidad esto también se observa con diversos herbicidas y modos deacción. Bajo el modelo aditivo y para un determinado nivel de respuesta, es válida lasiguiente expresión:

(za/Za) + (zb/Zb) = 1 [1]

Donde za y zb son las dosis de los herbicidas usadas en mezcla y Za y Zb son las dosis deellos empleadas en aplicaciones independientes (Finney 1971; Streibig et al. 1993). Elempleo de la I50 con respuesta es estadísticamente lo más adecuado pues representa el puntode inflexión de la curva de respuesta a dosis que es donde se obtiene la mayor sensibilidad enla estimación de efectos. Pero a nivel de campo los efectos a nivel de la I90 pueden resultar

más relevantes. La consideración de efectos aditivos facilita el tratamiento estadísticoconvencional de los datos.

Es posible, sin embargo, que el efecto de los herbicidas sea multiplicativo. Esto ocurrecuando ejercen su efecto sobre la planta de forma independiente y donde las respuestas sepueden expresar como porcentaje de una respuesta máxima. El modelo multiplicativo puedeformularse en términos de porcentaje de control mediante la conocida fórmula de Colby(1967):

E= X+Y – XY/100 [2]

Donde E es el efecto esperado de la mezcla expresado como porcentaje de control, X es elporcentaje de control obtenido con el herbicida X la dosis x e Y es el porcentaje de controlobtenido con el herbicida Y a la dosis y. La Figura 4 representa lo que serían efectosmultiplicativos; en ese caso el herbicida B controla un 50% de ese 30% que el A no controló.El modelo multiplicativo supone que los herbicidas actúan de forma independiente y ensecuencia, lo que es naturalmente válido con herbicidas que tienen diferente modo de acción,aunque en la práctica el análisis según supuestos multiplicativos pueda emplearse con unagran diversidad de herbicidas que puedan o no diferir en modo de acción. Si se dispone dedosis de respuesta el modelo multiplicativo puede representarse como isóbolas; en este casola curva de no interacción ya no es una diagonal, sino que adopta forma curvilínea. Para unadiscusión más amplia de modelos aditivos y multiplicativos se puede consultar a Streibig etal (1993) y a Streibig & Jensen (2000).

3. El método de ColbyEs más frecuente ver el análisis multiplicativo efectuado según Colby (1967) en base a pocasdosis en lugar del empleo de curvas de respuesta a muchas dosis.

Figura 4. Representación esquemática de efectos multiplicativos en la mezcla de herbicidas.

En base a experimentos con replicaciones donde los herbicidas se emplean a las mismasdosis por separado y en mezclas pueden obtenerse los datos para implementar la fórmula de

Colby. Muchas veces el porcentaje de control se obtiene directamente por estimación visual.También puede evaluarse la biomasa y expresar el porcentaje control como:

(100 – Biomasa tratada/Biomasa testigo sin herbicida x 100).

Aplicando esta fórmula, si:E < % control observado: los efectos son mayores a lo esperado (sinergismo)E = % de control observado: no hay interacciónE > % de control observado: el efecto es menos de lo esperado (antagonismo)

Dado que los efectos multiplicativos no satisfacen los requisitos de aditividad y los valoresexpresados como porcentaje no conforman distribuciones normales, estos datos no sonteóricamente adecuados para los análisis estadísticos basados en esos supuestos y Flint et al.(1988) y Blouin et al. (2004) ofrecen elaboraciones matemáticas para subsanar algunas deesas dificultades. No obstante, es frecuente ver comparaciones de valores observados yesperados (E) mediante pruebas t a una cola o usando ANOVA y diferencia mínimasignificativa con datos provenientes de experimentos con replicaciones, previatransformación angular (arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción de control) de losdatos de porcentaje a fin de aproximar la distribución binomial a la normal (Fischer et al.2004; Lanclos et al. 2002). En definitiva el análisis de Colby es muy usado, es fácil de usar ysu fundamento es válido. Simplemente alcanza con probar las mismas dosis individuales yen mezclas y se pueden probar varias dosis en un diseño factorial. A menudo se hace elanálisis si la prueba de ANOVA muestra efecto significativo de la interacción (enexperimento factorial).

Conclusiones: Los componentes de una mezcla de herbicidas deben: (1) carecer de antagonismo; los

cuáles suelen superarse elevando dosis: pero se incrementa la presión de selección; (2)diferir en el mecanismo de acción; (3) tener rutas de degradación diferentes y (4) si esposible exhibir resistencia cruzada negativa.

Se deben combinar herbicidas de diferentes mecanismo de acción, pero cuyo espectro,eficacia y residualidad no difieran.

Diferencias de residualidad son problemáticas con malezas de germinación escalonadapues las malezas de germinación tardía quedarán expuestas a la presión de selección deuno sólo de los componentes. Mutantes con resistencia a este componente no podrán sereliminados por el otro herbicida de la mezcla si su efecto ya se ha disipado al tiempo enque emergen esas malezas tardías.

La resistencia evolucionará rápidamente si la especie ya es resistente a uno de loscomponentes.

Al mezclar es posible encontrar casos de potenciación. Los sinergistas son útiles para “romper” resistencias no conferidas por un sitio de acción

alterado. Podemos también considerar sinergizar los herbicidas alternativos para el manejo de una

especie resistente (especialmente con inhibidores de ALS o ACCasa). Los efectos de sinergismo suelen ser especie-dependientes.

Las aplicaciones secuenciales con herbicidas de diferente Modo de Acción y/o rutametabólica cumplen un papel similar al de las mezclas y poseen como ventaja que elúltimo herbicida contribuye a evitar la producción de semillas. Sin embargo, no estáprotegido y selecciona por resistencia, por lo que debe rotarse de herbicidas en el ciclosiguiente.

Bibliografía recomendadaColby, S.R. 1967. Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide mixtures.

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stimulation of growth at low doses. Weed Research 29:93-96.Finney, D.J. 1971. Probit Analysis, #rd ed.Charles Griffin: London.Flint, J.L., P.L. Cornelius, and M. Barrett. 1988. Analyzing herbicide interactions: a

statistical treatment of Colby's Method. Weed Technology 2:304-309.Blouin, D.C., E.C. Wbster, and W. Zhang. 2004. analysis of synergistic and antagonistic

effects of herbicides using nonlinear mixed-model methodology. Weed Technol18:464-472.

Fischer, A.J., D.P. Cheetham, and R. De Prado. 2004. Enhanced effect of thiobencarb onbispyribac-sodium control of E. phyllopogon (Stapf) Koss in California rice (Oryzasativa L.). Weed Biology and Management 4:206-212.

Gressel, J. 1990. Synergizing herbicides. Rev. Weed Sci. 5:49-82.Gressel, J. 2000. Molecular biology of weed control. Transgenic Research 9:355-382.Lanclos, D.Y., E.P. Webster, and W. Zhang. 2002. Glufosinate tank-mix combinations in

glufosinate-resistant rice (oryza sativa). Weed Technology 16:659-663.Limpel, L.E., P.H. Schuldt, and D. Lamont. 1962. Weed control by dimethyl

tetrachloroterephthalate alone and in certain combinations. Proc. Northeastern WeedControl conference. 16:48-53.

Schabenberger O & Birch J. 2001. Statistical dose-response models with hormetic effects.Human and Ecological Risk Assessment, 7, 891-908.

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Streibig J, Rudemo M & Jensen J. 1993. Dose-response curves and statistical models. In:Herbicide Bioassays. pp. 30-55: CRC Press, Boca Raton, FL.

Capítulo 8FORMULACIONES DE HERBICIDAS: CRITERIOS PARA SU SELECCIÓN

José Alfredo MuñozAGROISLEÑA C.A.

I. Introducción.

Los plaguicidas constituyen un extenso y complejo grupo de sustancias, dentro de las cualesse encuentran los herbicidas. Dichos productos pueden destruir toda la vegetación sobre laque se aplican o actuar selectivamente contra determinadas especies, bien por contacto o porvía sistémica. Se pueden aplicar en presiembra, como preemergentes a la maleza y/o elcultivo o en post-emergencia total (cultivo y maleza), o de forma dirigida a las malezas.

Debido a su alta concentración, la mayoría de los principios o ingredientes activos (i.a), nopueden usarse tal como se obtienen de los procesos de extracción o síntesis. Por tal razón,deben prepararse o acondicionarse en mezclas denominadas FORMULACIONES. Estas seobtienen al mezclarse el ingrediente activo con las llamadas sustancias auxiliares (inertes ocoadyuvantes), para así facilitar la aplicación de concentraciones de i.a. adecuadas de manerahomogénea y, en algunos casos, para aumentar su eficacia. Este hecho reviste especialimportancia en la actualidad, cuando las dosis de los herbicidas,- referidas al productocomercial-, se han reducido significativamente como consecuencia de la mayor actividadbiológica de los nuevos grupos químicos sintetizados.

II. Formulación. Concepto. Características.

Se entiende por “Formulación”, la adecuada preparación de un ingrediente activo (i.a.) paradarle un uso práctico; es decir, alcanzar el objetivo, interactuar con él y llegar al sitio dondeejercerá su acción. Para lograrlo, es imprescindible que la formulación no se degrade. Parauna mejor comprensión del concepto, se podría sintetizar de la manera siguiente:

Formulación = i.a. + sustancias auxiliares (inertes y coadyuvantes).

En la formulación de un herbicida se deben considerar los siguientes aspectos: Facilidad de aplicación Distribución homogénea del i.a., tanto en la formulación como en las mezclas a aplicar,

especialmente las líquidas. Eficacia biológica con la menor cantidad posible de i.a. Estabilidad en las diferentes condiciones de almacenamiento. Facilidad de manipulación y transporte. Reducción de riesgos toxicológicos al usuario, en su manipulación y / o aplicación. Reducción de riesgos de contaminación ambiental. Facilidad de descontaminar los cultivos tratados o acelerar la descomposición del i.a., una

vez cumplida la acción. Costos de formulación. Compatibilidad con otros productos.

Reducción de posibles problemas de contaminación que pueden derivar del desecho deempaques o envases, una vez utilizados.

Seleccionando adecuadamente las sustancias auxiliares y la formulación apropiada, se logracompensar, en cierta medida, las propiedades colaterales indeseables de algunos ingredientesactivos.

III. Componentes principales de una formulación.

a) Ingredientes activos:

Generalmente, se obtienen con diversas calidades de pureza, cuales son:

Purísima o proanálisis: con un porcentaje mínimo o en los límites de detección deimpurezas. Se usa en determinaciones analíticas y en la preparación de patrones,especialmente en análisis de residuos.

Pura o de Uso químico: tiene mayor porcentaje de impurezas que la anterior. Se usa en lapreparación de muestras para ensayos de eficacia en condiciones ambientales controladas.

Técnica o Industrial: con porcentaje de pureza inferior a las anteriores. Se usa en lapreparación de formulaciones comerciales.

b) Sustancias auxiliares:

Son de origen orgánico o mineral, empleadas para adecuar los i.a. a las concentracionesnecesarias y condiciones óptimas para su aplicación.

Dentro de las sustancias auxiliares destacan dos grandes grupos:

1.- Vehículos inertes:

Los más usados en el mercado son los de consistencia sólida y líquida, siendo clasificadosambos de acuerdo con la función que deben cumplir.

1.1.- Vehículos sólidos:

- Portadores (carriers): o acondicionadores de la preparación inicial. En este caso, el i.a. seincorpora a cada partícula del portador, el cual tiene capacidad de absorción rápida por eldiámetro de sus partículas y su porosidad interna. Así, a menor diámetro y mayorporosidad, mas elevado será el contenido de i.a. por unidad de peso.

- Acompañantes: sirven para asegurar la distribución adecuada de la aplicación. Son de bajopoder absorbente, gran densidad volumétrica y buen poder de soltura.

Los vehículos inertes sólidos pueden ser de origen vegetal (harina, partes molidas de estos) ominerales, agrupados en óxidos (tripolitas, óxidos de calcio o magnesio), carbonatos (calcita,dolomita), sulfatos (sulfato de calcio o yeso), silicatos (micas, vermiculitas, pirofilitas) ofosfatos (apatitas).

1.2.- Vehículos líquidos:

Pueden ser, al igual que los sólidos, portadores o acompañantes (disolventes). El principalgrupo de disolventes empleados en las formulaciones líquidas, lo constituyen algunosderivados de petróleo, dentro de los cuales existen distintos tipos o clases según el contenidode hidrocarburos parafínicos tipo hexano normal, anillos naftenos tipo ciclohexano y anillosaromáticos tipo benzol y xilol.

Entre los grupos mas importantes destacan:

- Destilados con reducido contenido de hidrocarburos parafínicos y nafténicos y elevadocontenido de aromáticos (benceno, tolueno, xileno). Por su costo, se limitan a lapreparación de Concentrados Emulsionables.

- Fracción de destilados de petróleo con 20 – 50 % de aromáticos. Se usa en la formulaciónde Soluciones Concentradas y Emulsiones Concentradas.

Lo cierto es que no se dispone de disolventes que reúnan todas las características deseables(capacidad disolvente, volatilidad, viscosidad) para los distintos tipos de i.a. y maneras deaplicación, de tal manera que lo que suele hacerse son mezclas de ellos.

2.- Coadyuvantes:

Son sustancias que contribuyen a mejorar la eficacia y estabilidad del producto formulado.Son especialmente importantes para la aplicación de productos de baja solubilidad o que seaplican sobre superficies poco permeables, como follaje con cutícula cerosa o pubescente.

Los coadyuvantes más importantes son:

- Acidificantes: mejoran el contacto con la superficie así como la calidad de la mezcla;reducen el pH de la solución y demoran la degradación de los i.a.

- Activadores: reducen la tensión superficial y aumentan el contacto entre el herbicida y lamaleza a controlar.

- Adherentes: mejoran la adherencia y persistencia del herbicida sobre la superficie;impiden o disminuyen las pérdidas de los depósitos del producto sobre la superficie,causadas por el viento, lluvias o los riegos por aspersión; disminuyen el proceso defotodegradación y la volatilización.

- Agentes de compatibilidad: mejoran la compatibilidad entre las sustancias que componenel caldo a aplicar, reduciendo el riesgo de floculación o precipitación.

- Antiespumantes: impiden la formación de espuma en los tanques de los equipos depreparación y aplicación.

- Tampones (buffers): estabilizan el pH de la solución; demoran la degradación delherbicida; mejoran la calidad de la mezcla a utilizar.

- Dispersantes: mantienen la estabilidad de las suspensiones de polvos mojables, evitandola floculación y sedimentación; reducen la tensión superficial; ayudan al herbicida apenetrar por pequeños espacios; mejoran el contacto del mismo con la superficie de laplanta tratada. Entre los más comunes, destacan los polímeros de alquil-aril-sulfonatos ylas ligninas sulfonadas de sal sódica.

- Emulgentes: favorecen la mezcla de dos sustancias líquidas insolubles. Se utilizan en lapreparación de formulaciones emulsionables, ya que son compuestos tensoactivosconstituidos por moléculas que contienen grupos de carácter hidrofílico (polares) ylipofílico (no polares). Se sitúan en la interfase de los líquidos emulsionados, de tal formaque la parte hidrofilica queda orientada hacia el agua y la lipofilica, hacia la sustanciaemulsionable.

- Espesantes: dificultan la volatilización; reducen la deriva; aumentan la viscosidad de lasolución; aumentan el tamaño, peso y velocidad de caída de las gotas, mejorando lapenetración y cobertura. Destacan los derivados de algina, la hidroxietil celulosa y lapoliacrilamida aniónica.

- Humectantes: logran un buen mojado sobre la superficie de aplicación; evitan que el polvoflote; favorecen la penetración del i.a. por los estomas.

- Penetrantes: maximizan la acción del herbicida al facilitar su paso a través de la cutícula.

- Surfactantes: reducen la tensión superficial de los líquidos; ayudan al herbicida en supenetración y contacto; impiden el lavado y abrasión; dificultan la volatilización. Puedenser de dos tipos: iónicos y no iónicos.

La elección de los coadyuvantes más adecuados se debe considerar cuidadosamente en cadacaso, teniéndose en cuenta:

Las características fisicoquímicas del i.a. de los herbicidas. La naturaleza del portador y del diluyente usado en la formulación. El tamaño de gota que ha de producir la asperjadora. El volumen de líquido por unidad de superficie. Las características de las superficies a tratar (Ej: cutículas foliares).

IV. Tipos de formulaciones:

a) Formulaciones líquidas:

1) Concentrados emulsionables: son diluciones de i.a. en disolventes orgánicos. Soninsolubles en agua pero, agregando los emulgentes adecuados, esas disoluciones puedenmezclarse con agua, convirtiéndose en una emulsión blanquecina y lechosa; es decir,tienen la propiedad de formar una emulsión cuando se mezcla con agua.

De fácil producción y manejo. Pueden medirse y dosificarse fácilmente con un vaso graduado. Emulsifican espontáneamente, formando una emulsión estable. Tienen efecto coadyuvante del disolvente. Mejoran la penetración por la cutícula. Mayor resistencia al lavado. Envases vacíos fáciles de lavar. Estabilidad depende del pH, dureza del agua, temperatura y condiciones de

almacenamiento.

Es fundamental que la emulsión por aplicar se mantenga estable; sin embargo, en caso de quese separen los componentes, la homogeneidad se restablece mediante agitación.

Ejemplos: 2,4-D éster butílico, clefoxydim (Aura), butaclor (Crusher), S-metolacloro (DualGold), oxifluorfen (Goal, Koltar), fluazifop-p-butil (Hache Uno 2000), propanil (Propanol),pendimetalin (Prowl 400), acetocloro (Zulú).

2) Concentrados solubles en agua: Consisten en concentrados del i.a. o sus sales, disueltosen agua o en disolventes miscibles con agua. Ello significa que los i.a. deben tenersuficiente solubilidad en agua, facultad que solo la poseen pocas sustancias en laactualidad. Llevan tres componentes básicos: Ingrediente activo, solvente y coadyuvante. No requieren de mayor agitación en el tanque. No requieren de premezcla. Poco inflamables. Reaccionan con aguas duras. Buena penetración foliar (sistémicos/contacto). Mayor riesgo de lixiviación.

Ejemplos: ácido 2,4-D (2,4-D Amina), naptalam (Alanap), dicamba + 2,4.D (Banvel D-Banvel S), paraquat + diquat (Doblete 200), picloram + 2.4-D (Huracán 40 SC, Potreron),imazetapyr (Brioso 10 SL), clomazone (Command 4), MSMA (Initox, Daconate), glifosato(Candela Super, Glyfosan), paraquat (Gramoxone).

3) Suspensiones concentradas: consisten en una suspensión de partículas finas del materialtécnico en una fase acuosa e ingredientes adicionales de la formulación.Se presentan enforma cremosa y lista para ser mezclada con agua. No desprenden polvos ni contienen solventes orgánicos. Se pueden medir y dosificar fácilmente. Pueden descomponerse durante el almacenamiento. Fabricación costosa.

Ejemplos: quinclorac (Celtic 25 SC, Facet 250 SC), bispiribac sodio (Designee 40 SC),glifosato + 2,4-D (Faiter), alaclor (Gramisso), diuron (Hierbatox), linuron (Linurex 50),hexazinona (Velpar L), atrazina (Triazol Suspensión).

4) Microemulsiones: Formulación estable. Gotas muy pequeñas. Disminuyen el número de aplicaciones. Mayor absorción. Reducen mermas del i.a. por evaporación. Aumentan la eficacia del i.a.

Ejemplos: picloram + fluroxypir (Centella ME).

b) Formulaciones sólidas:

1) Gránulos dispersables en agua: son una mezcla homogénea de los materiales técnicos,inertes y adicionales de la formulación. Tienen forma granular, que se aplica luego de ladesintegración y dispersión en el agua. Son secos y libres de grumos y están sustituyendo a los polvos mojables y polvos

solubles. Dan mayor seguridad al usuario. No desprenden polvo. Se pueden medir con un vaso graduado. Los envases se pueden vaciar con facilidad. Formulación costosa. Pueden aplicarse al follaje o al suelo.

Ejemplos: sulfonilureas (Accent, Ally), ametrina (Ametrol Fácil), atrazina (Limpiamaíz FácilGD 90), diuron + ametrina (Dimetrin Fácil 80 GD), metribuzina (Hexone Fácil 80 GD),ciclosulfamuron (Invest GD).

2) Polvos mojables: Son una mezcla homogénea de los productos técnicos con las sustanciasauxiliares apropiadas. Se presentan en forma de polvo fino y se aplican comosuspensiones después de su dispersión en el agua. Las partículas sólidas, pueden formaruna suspensión en el agua. El polvo es capaz de mojarse y mantenerse en suspensión en el agua. El producto es seco y libre de gránulos. Alta concentración del i.a. Fáciles de empacar y formular. Más económicos. Precipitan. Pueden aglomerarse durante el almacenamiento. Pueden ser abrasivos, causando mayor desgaste de las boquillas.

Ejemplos: atrazina (Limpiamaíz 80 PM), ametrina (Ametrol 80 PM), diuron (Hierbatox 80),pirazosulfuron etil (Fortius), metribuzina (Hexone 70 PM).

3) Polvos solubles: se aplican como una dilución verdadera del i.a. después de su dilución enel agua. Actualmente son muy pocos los existentes en el mercado. Solubles en agua.

Alta concentración del i.a. No requieren de agitación en el tanque. Higroscópicos. Pueden reaccionar con aguas duras. Lixiviables.

Ejemplos: algunas formulaciones de diuron y triazinas.

c) Formulaciones mixtas:

Algunos productos pueden formularse en varias presentaciones, tanto líquidas como sólidas,dependiendo del ingrediente activo, como por ejemplo:

Atrazina, ametrina Gránulos dispersables en agua, Suspensión concentrada, Polvomojable, Polvo soluble.

Glifosato Gránulos dispersables en agua, Concentrado soluble.Metribuzina Gránulos dispersables en agua, Polvo mojable.

V. Factores que afectan la eficacia de los herbicidas.

Existen tres elementos a considerar a la hora de aplicar un tratamiento herbicida, cuales son:

Las malezas: especie (gramíneas o poáceas, de hojas anchas, ciperáceas), tipo (herbáceas,arbustivas, leñosas), reproducción (semillas, vegetativa), tamaño, condición al momento de laaplicación (vigor, agotamiento, turgencia, estado nutricional, etc), estado de desarrollo(germinación, fase de plántula, floración, etc).

Las condiciones ambientales: precipitación, temperatura ambiental, humedad relativa,insolación, evaporación, suelo (humedad, temperatura, contenido de materia orgánica y sales,textura, etc).

El herbicida a aplicar: selección y uso correcto, proporción adecuada del material aplicadopor unidad de área (dosis), cobertura apropiada (humedecimiento, penetración), frecuencia deaplicación, pH de la superficie foliar, mezclas apropiadas y procedimientos de mezclacorrectos (compatibilidad, orden de mezcla), calidad del agua, conductividad, pH,temperatura, equipos a emplear.

VI. Selección de la formulación.

Usualmente, la selección de la formulación se decide tomando en cuenta tres factores: precio,disponibilidad en el mercado y conveniencia del usuario, con base en la disponibilidad deequipos.

Como ejemplo, las formulaciones de polvos mojables contienen las mayores cantidades dei.a. por peso unitario y son las menos costosas; sin embargo, al estimar los costos totales, es

necesario considerar también la técnica de aplicación, ya que puede aumentar la necesidad demano de obra, equipo y tiempo de aplicación.

Años atrás, la acción biológica y la forma de aplicación jugaron un papel importante en laelección de las diferentes formulaciones en tanto que, hoy en día, son determinantes laseguridad para el usuario y la compatibilidad con el ambiente. Además de la acciónbiológica, las formulaciones de herbicidas deben satisfacer otros requisitos como: fácildosificación, escaso desprendimiento de polvo y posibilidades de vaciar bien el empaque oenvase utilizado. Esto significa una tendencia a reemplazar los productos en polvo porsuspensiones concentradas o gránulos dispersables en agua. Así mismo, dada la influenciademostrada por las sustancias auxiliares sobre el efecto biológico de los i.a. y su eficacia,éstas cobrarán más importancia en el futuro, conllevando ello a reducir aún mas las dosisnecesarias de los ingredientes activos.

VII. Glosario

A los fines de entender un poco mejor los términos y conceptos antes expresados, se presentaa continuación, un breve glosario de términos relacionados con el tema: Absorción: proceso por el cual un herbicida pasa de un sistema para otro; es decir, de la

solución del suelo para las células de las raíces de las plantas (absorción radicular) o de lasuperficie de la hoja para las células (absorción foliar).

Acrópeta: translocación del producto dentro de la planta, de los órganos inferiores paralos superiores.

Adyuvante: material sin propiedades herbicidas que, cuando es adicionado a un productoformulado o a la mezcla a aplicar, le aumenta su actividad o sus características.(sinónimo:coadyuvante).

Agua dura: aquélla que contiene de 6 a 9 mg/l equivalente de carbonato de calcio. Antagonismo: interacción entre dos o mas productos químicos cuyos efectos, cuando

combinados, son inferiores a lo previsible, basado en la actividad de cada uno, porseparado.

Apoplásto: conjunto de todas las partes continuas, no vivas, de la planta, tales como lasparedes celulares, espacios intercelulares y los vasos del xilema.

Activación: proceso por el cual un herbicida aplicado en la superficie del suelo, se tornafitotóxico después de un riego o lluvia. Resulta del movimiento del herbicida en el suelodonde puede ser absorbido por las semillas, plántulas o plantas y no por modificaciónquímica del ingrediente activo.

Basípeta: translocación del producto dentro de la planta, desde los órganos superioreshasta los inferiores.

Caldo: dilución del herbicida en un líquido, normalmente agua, cuando va a ser aplicado. Compatibilidad: capacidad de unirse dos o más formulaciones de herbicidas sin que sean

perjudicadas sus características o efecto de sus componentes. Concentración: cantidad de ingrediente activo o su equivalente ácido en una solución. Se

expresa en g / l ó g / k. Corrosividad: acción de dañar o destruir materiales metálicos. Degradación: proceso por el cual un producto altera sus propiedades físicas o químicas. Densidad: relación entre la masa y el volumen de un cuerpo.

Deriva: movimiento de las gotas de la aspersión fuera del área deseada. Deriva de vapor: movimiento de vapores químicos de los herbicidas desde el área de

aplicación hasta áreas circunvecinas. Algunos herbicidas, aplicados a las dosis ytemperaturas normales, tienen presión de vapor suficientemente alta para evaporarse yprovocar fitotoxicidad en plantas susceptibles , fuera del área de aplicación.

Diluyente: cualquier material gaseoso, líquido o sólido, usado para reducir laconcentración del ingrediente activo en una formulación.

Dosis: cantidad de producto aplicado por unidad de área o por planta. Puede ser expresadaen ingrediente activo, equivalente ácido o producto formulado.

Emulsión: mezcla en la cual las gotas de un líquido se encuentran en suspensión en otrolíquido, normalmente aceite o agua.

Emulsión invertida: es la emulsión de agua en aceite. Emulsificante: producto usado en las formulaciones para reducir la tensión interfacial

permitiendo la formación la emulsión de un líquido neutro. Equivalente ácido: cantidad de ingrediente activo expresado en términos del ácido de que

es derivado el producto. Floema: conjunto de tubos cribosos o liberianos por los que se realiza el transporte de la

savia elaborada. Ingrediente activo: componente de la formulación del cual es obtenida su eficacia. Ingrediente inerte: fracción no activa de los productos técnicos o sustancias utilizadas en

la formulación como diluyentes o como vehículos. Kd: coeficiente de adsorción en el suelo. Es la relación entre el producto adsorbido y el

disociado en la solución del suelo. KOC: coeficiente de adsorción de carbono orgánico: es la relación entre el Kd y el peso de

la fracción de carbono orgánico presente en el suelo. Se expresa en ml/g de suelo. KOW: coeficiente de partición o distribución entre octanol y agua. Lixiviación: proceso por el cual la solución se infiltra en el suelo, pasando por horizontes

donde no hay presencia de raíces. Mezcla en tanque: mezcla de dos o más productos en el tanque de la asperjadora, antes de

usarse. Orden de mezcla: los productos que se mezclan pueden encontrarse en formulaciones

muy variadas. Esto puede acarrear problemas de incompatibilidades físicas (grumos,flóculos, precipitaciones, sedimentación, etc.) que provocan que el caldo de aspersión nose forme bien, los productos pierdan eficacia, que las boquillas se taponen y que seocasione fitotoxicidad al cultivo. El orden de mezcla correcto es: primero los sólidos yluego los líquidos. Ejemplo: Polvo Mojable - Polvo Soluble - Gránulos Dispersables enagua - Suspensión Concentrada - Concentrado Emulsionable- Líquido Soluble oConcentrado Acuoso - Abonos Foliares - Coadyuvantes.

Persistencia en el medio ambiente: período durante el cual una sustancia permanece enel ambiente: puede ser: corta (vida media hasta 90 días en el suelo), media (vida mediaentre 91 y 180 días en el suelo) y larga (vida media por encima de 180 días en el suelo).

Pka: -log10 de la constante de disociación de ácido. Presión de vapor: presión ejercida por una molécula gaseosa que está en equilibrio con

las moléculas de sólido o líquido del cual se deriva. Se expresa en mm de Mercurio o enPascal.

Producto técnico: sustancia obtenida directamente de la síntesis de materias primas, cuyacomposición contiene un porcentaje definido de ingrediente activo.

Simplasto: masa viva total de células de la planta, ligadas unas a otras por losplasmodesmos.

Solubilidad: cantidad máxima de una molécula que se disuelve en agua pura a unadeterminada temperatura. Se expresa en: mg/l; g/l; mg/ml.

Surfactante: sustancia que afecta las propiedades físicas de la superficie de los líquidos,aumentando las características humidificantes de las gotitas asperjadas.

Suspensión: mezcla que contiene partículas finamente divididas, dispersas en un sólido,líquido o gas.

Textura: referida a suelos. Arenosa: suelos con menos de 15% de arcilla; Arcillosa:suelos con más de 35% de arcilla y franco entre 15% y 35% de arcilla.

Vida media: tiempo necesario para que un producto, después de aplicado, alcance ymantenga la mitad de la concentración original.

Volumen de caldo: cantidad de líquido que contiene al herbicida aplicado por unidad deárea:

Alto volumen: superior a 600 litros por ha.Medio volumen: entre 200 y 600 litros por ha.Bajo volumen: entre 50 y 200 l/ha.Muy bajo volumen: entre 10 y 50 l/ha.Ultra bajo volumen: entre 1 y 10 l/ha.

VIII. Bibliografía Consultada.

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Capítulo 9EVALUACIÓN DE TÉCNICAS PARA LA APLICACIÓN DE HERBICIDAS

Pablo RodríguezUniversidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”

IntroducciónEl manejo de las diferentes plagas, malezas y enfermedades requiere de un conjunto deconocimientos y procedimientos que deben ser aplicados de forma correcta para alcanzar losobjetivos propuestos. Entre estos aspectos se encuentra la tecnología de aplicación de losdiferentes productos, como una parte del manejo integrado de estos problemas.

Cuando se realiza la aplicación de un producto fitosanitario, generalmente se le da muchaimportancia al producto a utilizar (argumento que no está de más) y se desestiman losequipos con los que se va e realizar esa aplicación. Al momento de aplicar un producto sedeben usar equipos de buena calidad y que tengan condiciones de funcionamiento yseguridad apropiadas; con esto se logra una buena eficiencia en el tratamiento, así comodisminuir los daños al cultivo y los riesgos de contaminación ambiental.

La ineficiencia de algunas aplicaciones de productos se debe, en un número importante decasos, a problemas que presentan los equipos pulverizadores, bien sea en el adecuadofuncionamiento de cada uno de sus componentes o en la calibración de estos equipos. Estosinconvenientes pueden traer como consecuencia sobredosificaciones, subdosificaciones y/oriesgo de deriva en las aplicaciones; aumentando los costos, las posibilidades de un manejopoco eficiente, afectación a cultivos cercanos y contaminación ambiental.

La aplicación en forma líquida es la más usada. En una pulverización existen factores nocontrolables, como el clima, y otros controlables entre los que tenemos los equipos depulverización. Aspectos como manómetros y reguladores de presión en mal estado, filtrostapados, boquillas no apropiadas o desgastadas, mala agitación de la mezcla, inestabilidad delas barras portaboquillas, velocidad de trabajo inadecuada, entre muchos otros, puedenocasionar deficiencias marcadas en las pulverizaciones de los productos fitosanitarios.

El conocimiento de una serie de aspectos técnicos, de las condiciones climáticas y lacalibración de equipos, son fundamentales a la hora de realizar una aplicación en unescenario de campo.

Formas de aplicación de los productosCualquiera que sea la técnica de aplicación de un producto fitosanitario debe garantizarutilizar una materia activa en su dosis mínima efectiva, aplicación en el momento oportuno,con una distribución homogénea sobre el objetivo y sin causar efectos negativos sobre elresto de los elementos del ecosistema.

Los productos fitosanitarios pueden aplicarse en forma sólida, líquida o gaseosa. Lasaplicaciones sólidas y gaseosas han venido decayendo en los últimos años, por el contrariolas aplicaciones líquidas se han incrementado notablemente. Esta situación se debe alconsiderable desarrollo que han experimentado los equipos para la aplicación en forma

líquida de los diferentes productos fitosanitarios y a formulaciones adaptadas a este tipo deaplicación.

La pulverización, fraccionamiento de un líquido en pequeñas gotas, es un método sencillo yeficaz que permite lograr los objetivos de la aplicación de un producto fitosanitario. Losequipos utilizados han avanzado marcadamente en los sistemas de control, en la calidad delos materiales y medidas de seguridad tanto para el operario como para el medio ambiente.

Factores a considerar para las aplicaciones en forma líquida.Existen una serie de factores que deben ser tomados en cuenta a la hora de realizar unaaplicación de un producto fitosanitario en forma líquida, diluido en agua.

Volumen de aplicación:Es la cantidad de mezcla (producto(s) más agua) a aplicar por unidad de superficie, expresadaen litros por hectárea (L/ha). El volumen a aplicar va depender de la recomendación técnicaque indique el producto, su clasificación se puede apreciar en la tabla 1. Los equiposutilizados pueden variar según el volumen de mezcla que se necesite aplicar.

Tabla 1. Denominación de las pulverizaciones según el volumen de mezcla a aplicar.Denominación Volumen (L/ha)

Ultrabajo volumen < 5Muy bajo volumen 5 – 50

Bajo volumen 50 – 100Volumen reducido 100 – 200

Volumen medio 200 – 500Alto volumen > 500

Tamaño de las gotas:En los equipos de aplicación de líquidos las gotas se forman gracias a la energía hidráulica ola neumática. La más usada es la hidráulica donde el líquido sometido a presión es obligado asalir por un pequeño orificio (boquilla pulverizadora) el cual posee una forma determinada;este líquido se separa en pequeños ligamentos y luego en pequeñas gotas debido a ladiferencia de presiones. Cada modelo de boquilla genera un rango de tamaños y un patrón dedistribución de estas gotas. En la tabla 2 se observan los diferentes rangos de tamaño de gota,el tamaño de la gota está representado por su diámetro y se expresa en micrómetros (µm).

Tabla 2. Clasificación del tamaño de las gotas.

Categoría (símbolo) Rango aproximadoDV0,5 o VMD (µm) Código Color

Aerosol (A) < 50 RosadoMuy fina (MF) 50 – 145 Rojo

Fina (F) 145 – 225 NaranjaMedia (M) 226 – 325 AmarilloGruesa (G) 326 – 400 Azul

Muy gruesa (MG) 401 – 500 VerdeExtremadamente gruesa (EG) > 500 Blanco

Fuente: ISO, ASABE S572, Universidad de Virginia. * (1 µm equivale a 0,001 mm)

El color indicado para cada tamaño de gota debe ser señalado en las tablas que caracterizanlas diferentes boquillas trabajando a determinadas presiones, junto con la abreviatura osímbolo de cada categoría.

El tamaño de las gotas es un aspecto difícil de determinar. Actualmente laboratoriosespecializados utilizan equipos sofisticados como la fotografía de alta velocidad, analizadoresdigitales de imágenes, analizador láser por difracción (figura 1), sondas de matriz óptica yanalizador de fase Doppler. El análisis de estos equipos para una misma muestra puedediferir entre ellos. El alto costo de estos equipos, el manejo complicado y la variabilidad delos resultados, según el analizador utilizado, hacen muy complicado la determinación deltamaño de las gotas.

Figura 1. Analizador láser por difracción para determinar el tamaño de gotas pulverizadas(Spraying Systems Co.).

Por esta razón es muy importante y obligatorio que los fabricantes indiquen en los manualesde sus productos el rango de tamaño de gotas que generan las boquillas a presiones de trabajopreestablecidas.

A nivel de campo esta determinación se complica aún más, ya que las condiciones de trabajoa la intemperie agregan más dificultad. Para obtener una aproximación del tamaño de gotaque se está aplicando se pueden usar los objetivos artificiales como el papel hidrosensible;láminas de plástico, cápsulas de Petri o trozos de cristal con silicona; uso de colorantes; papeladhesivo; entre otros. Para medir el tamaño de las gotas se utilizan la observación con lupa omicroscopio (comparando contra patrones establecidos o con cristales reticulados a unadistancia determinada) o el análisis digital de imágenes.

Una limitante muy importante de estos métodos de campo es la tendencia de la gota aexpandirse, distorsionando el diámetro real de esta. Los fabricantes de papel hidrosensibleproporcionan un factor para corregir este error en función del diámetro medido, latemperatura y la humedad. Otro problema que puede presentarse es el ángulo de impacto dela gota o la colocación de los objetivos artificiales, los cuales pueden ocasionar una distorsiónimportante en las gotas como puede observarse en la figura 2.

Figura 2. Distorsión de las gotas pulverizadas por inclinación del objetivo artificial.

La condición ideal sería que las boquillas de los pulverizadores generarán gotas de un mismotamaño, pero esto no sucede, las gotas producidas se encuentran en un rango determinado.Además, el tamaño de estas está muy influenciado por la presión generada en el sistema(figura 3).

Figura 3. Gotas generadas por las boquillas e influencia de la presión de trabajo en el tamañode estas.

El tamaño promedio de las gotas producido por las boquillas viene expresado por el diámetromedio volumétrico (DV0,5 o VMD por sus siglas en inglés), expresa el tamaño en función delvolumen pulverizado, 50% del volumen pulverizado proviene de gotas más pequeñas y 50%de gotas más grandes que el valor medio (figura 4).

Figura 4. Representación gráfica del diámetro medio volumétrico (DV0,5)

Otros términos usados en cuanto al tamaño de gotas son:

DV0,1: Valor del diámetro donde el 10% del total del líquido pulverizado está formado porgotas más pequeñas o iguales a este valor. Este valor es adecuado para evaluar el potencial dederiva de gotas individuales.

DV0,9: Valor del diámetro donde el 90% del total del líquido pulverizado está formado porgotas más pequeñas o iguales a este valor.RSF: Factor de homogeneidad relativo (Relative span factor, RSF), es una medidaadimensional indicativa de la uniformidad del tamaño de las gotas, cuanto más cercano a unomás uniformes son las gotas producidas, viene dado por la siguiente expresión:

RSF = (DV0,9 - DV0,1 ) / DV0,5

Cobertura de las gotas:El porcentaje de cobertura viene dado por el tamaño de las gotas y el número de impactos porcentímetro cuadrado. Para estimar este valor indicativo de la calidad de la pulverización, sepueden utilizar los objetivos artificiales colocados para valorar el tamaño de las gotas. En lafiguras 5 y 6 se pueden apreciar un patrón de comparación para estimar el número deimpactos/cm2 y el tamaño de gotas de una aplicación.

Figura 5. Patrones de comparación para estimar el número de impactos / cm2 (SprayingSystems Co.).

Figura 6. Patrón de comparación para estimar el tamaño de las gotas. (Hardy)

Existen recomendaciones técnicas sobre el número de impactos / cm2 según el tipo deproducto a aplicar, deberían indicarse en la etiqueta del producto. En la tabla 3 se presentanalgunas recomendaciones al respecto.

Tabla 3. Impactos / cm2 y tamaños de gotas según el producto a aplicar.*Cobertura gotas / cm2 Rango aproximado

DV0,5 o VMD (µm)Categoría gota

HerbicidasPre emergentes 20 – 30 >226 M – G – EGSistémicos 30 – 40 226 – 400 M – GContacto 40 – 50 150 – 300 F – MFungicidasSistémicos 30 – 40 226 – 400 M – GContacto 50 – 70 150 – 300 F – MInsecticidasSistémico 30 – 40 226 – 400 M – GContacto 50 – 70 150 – 300 F – M

Fuente: Kuhn, Teejet, Universidad de Virginia. *Consultar recomendación fabricante

Condiciones climáticas:Las condiciones climáticas son factores muy importantes a tomar en cuenta a la hora derealizar una aplicación, principalmente la temperatura, la humedad relativa y el viento.

El viento excesivo influye negativamente sobre la calidad de la distribución de la aplicación,además de aumentar el riesgo de deriva. No se deben realizar aplicaciones con vientossuperiores a 7 km/h.

La temperatura y la humedad relativa tienen una marcada influencia sobre la vida de la gota,tiempo que transcurre desde la formación de la gota hasta que se evapora. Temperaturaselevadas y baja humedad relativa reducen considerablemente la vida de las gotas,disminuyendo la posibilidad de penetración en el objetivo o inclusive que se evaporetotalmente antes de alcanzarlo; se deben evitar las horas del día donde se presenten estascondiciones.

Valores altos de humedad relativa favorecen la penetración de los ingredientes activos, perosi son excesivos pueden propiciar el escurrimiento y la dilución excesiva de la mezcla, lo queaumenta las pérdidas del producto y desfavorece la penetración.

Deriva:Es el término usado para definir el movimiento de las gotas de la mezcla pulverizada a travésdel aire fuera del área objetivo. Las gotas más propensas a deriva son aquellas con diámetroinferior a 150 µm. Se deben tomar en cuenta los siguientes aspectos para minimizar la deriva:1. La velocidad del viento tiene un gran influencia en la deriva, no realizar la aplicación en

condiciones de viento elevadas. Evitar pulverizaciones con vientos superiores a 7 km/h amenos que se disponga de mecanismos antideriva.

2. Ajustar la distancia de la boquilla al objetivo, bajar en lo posible sin comprometer elpatrón de distribución.

3. Regular la velocidad de trabajo para evitar la generación de turbulencia.4. Evitar las aplicaciones con altas temperaturas y baja humedad relativa.

5. Disminuir la proporción de gotas pequeñas (boquillas de mas caudal, con inducción deaire, disminuir presión) manteniendo cobertura y volumen a aplicar.

6. Usar mecanismos antideriva (cortinas de aire).

Calidad del agua:Este es un factor que influye en el éxito de una aplicación y que es ignorado en muchasoportunidades, se debe tener en cuenta su pH, presencia de materia orgánica y partículas desuelo.

El agua utilizada para realizar la mezcla puede tener un pH no adecuado para el ingredienteactivo que se va a utilizar, pudiendo modificarlo o inactivarlo, lo que reduciría de formaelevada su efectividad.

Las partículas de suelo pueden inmovilizar algunos ingredientes activos, producir desgaste enciertos elementos del equipo, tapar filtros y boquillas; la materia orgánica también puedeocasionar el taponamiento de estos últimos.

Equipos utilizados para la aplicación de líquidos.Para la aplicación de productos en forma líquida existen una gran variedad de equipos.Generalmente se usan los acoplados al tractor (suspendidos o de arrastre), los manuales (deespalda o barra portaboquillas) y los centrífugos.

Los diferentes equipos de pulverización deben estar conformados por un conjunto deelementos, los cuales cumplen una función específica, que garantizan la calidad de laaplicación. Entre ellas tenemos el depósito, la bomba, sistema de filtrado, regulador depresión, manómetro, boquillas, líneas de conducción, barras portaboquillas.

El depósito o tanque:Reservorio donde se coloca el producto con el agua, debe ser de un material adecuado, fácilde recargar, de buena capacidad para mejorar la eficiencia, con un sistema de agitación quemantenga la mezcla homogénea, fácil de limpiar.

La bomba:Elemento fundamental ya que es la que genera el caudal que se transforma en presión a travésdel confinamiento del líquido en los componentes del equipo. Debe impulsar suficientecaudal para mantener el flujo de retorno y mantener la presión en todas las boquillas,inclusive al cambiarlas por unas de más caudal.

Filtros:Componente que cumple la importante función de retener las impurezas a lo largo delrecorrido del líquido a través del equipo hasta llegar a las boquillas. Debería existir unfiltrado en secuencia desde el llenado del tanque, pasando por la aspiración de la bomba,luego entre la bomba y la barra portaboquillas (impulsión) y por último el filtro de lasboquillas. La forma de catalogar los filtros es por el número de mesh, lo que define sucapacidad de filtrar partículas de diferente tamaño. En la tabla 4 se puede apreciar unarecomendación de las medidas de los filtros en sus diferentes ubicaciones en el equipo. En laboca de llenado del depósito debe existir un filtro que tenga orificios de 1 mm.

Tabla 4. Tamaño de los filtros (mesh) en las etapas de filtrado según caudal de las boquillas*Caudal boquillas

(L/min)Aspiración Impulsión Boquilla

<0,2 50 100 2000,2 - 0,4 50 100 120

0,40 - 0,80 50 100 1000,75 – 1,25 30 80 80

>1,25 30 50 50*Valores aproximados, consultar tablas de recomendación del fabricante.

Regulador de presión y manómetro:El regulador permite adecuar la presión a las necesidades específicas de la aplicación. Elmanómetro indica la presión a la que está trabajando el equipo, debe ser de buena calidad,con una escala que permita la regulación exacta de la presión a la que se necesita trabajar. Enla tabla 5 se presentan las equivalencias entre las diferentes unidades de presión.

Tabla 5. Equivalencias entre las unidades de presiónUnidad Equivalencia

1 kg/cm2 14,2 lb/pulg2

1 bar 14,5 lb/pulg2

1 atm 14,7 lb/pulg2

1 Kpa 0,01 kg/cm2

Boquillas:Son las encargadas de pulverizar el líquido a aplicar, además determinan el tamaño de lasgotas (junto con la presión de trabajo), la forma y tamaño del chorro, entregan un caudaldeterminado a una presión establecida. En la figura 7 se pueden observar los tipos depatrones más comunes generados por las boquillas.

Figura 7. Tipos de patrones generados por las boquillas de pulverización.

Las boquillas están clasificadas de acuerdo a las normas ISO por un código de colores quedefine el caudal que entregan a una presión determinada (3 bar) y un número que indica elángulo de pulverización.

El fabricante debe indicar en sus manuales el código ISO de colores, tipo de boquilla, ángulode pulverización, tamaño de gotas generado a diferentes presiones de trabajo. A continuación

se presentan una serie de tablas (tablas 4, 5, 6, 7) con diferentes tipos de boquillas según lacodificación ISO 10.625.

Tabla 4. Boquillas de abanico Tabla 5. Boquillas deflectorasCódigo F(Abanico)

Caudal(L/min)

Color Código D(Deflector)

Caudal(L/min)

Color

0,05 0,2 Violeta - - -0,1 0,4 Naranja 0,5 0,4 Naranja

0,15 0,6 Verde 0,75 0,6 Verde0,2 0,8 Amarillo 1,0 0,8 Amarillo

0,25 1,0 Turquesa - - -0,3 1,2 Azul 1,5 1,2 Azul0,4 1,6 Rojo 2,0 1,6 Rojo0,5 2,0 Marrón 2,5 2,0 Marrón0,6 2,4 Gris 3,0 2,4 Gris0,8 3,2 Blanco 4,0 3,2 Blanco10 4,0 Azul claro 5,0 4,0 Azul claro15 6,0 Verde claro 7,5 6,0 Verde claro

Tabla 6. Boquillas cono hueco baja descarga Tabla 7. Boquillas cono hueco alta descargaCódigo H

(Cono hueco)Caudal(L/min)

Color Código H(Cono hueco)

Caudal(L/min)

Color

0,015 0,06 Verde claro 0,1 0,4 Naranja0,025 0,10 Azul claro 0,15 0,6 Verde0,037 0,15 Gris claro 0,2 0,8 Amarillo0,050 0,20 Violeta 0,25 1,0 Turquesa0,067 0,27 Negro 0,3 1,2 Azul0,075 0,30 Rosado 0,4 1,6 Rojo0,088 0,35 Beige 0,5 2,0 Marrón

0,6 2,4 Gris

Existen otros tipos de boquillas, destaca entre ellas la de inducción de aire. Esta tiene unorificio por donde el aire es succionado y mezclado con el líquido, formado gotas grandescon burbujas internas que al llegar al objetivo se rompen en gotas más pequeñas, mejorandola cobertura y reduciendo la posibilidad de deriva.

Las boquillas tienen un tiempo de vida útil, luego del cual deben ser reemplazadas, ya quepierden la forma del orificio, deformando el patrón original y entregando un caudal diferenteal nominal. Las de cerámica son las más duraderas, le siguen las de polímeros, las de aceroinoxidable y por último las de latón.

De forma general se usan boquillas deflectoras y de abanico para productos pre emergentes,abanico y de inducción de aire para los sistémicos, y cónicas y de abanico para los decontacto. Se debe consultar el catálogo del fabricante para una recomendación más precisa.

Calibración y evaluación de los equiposEs necesario realizar una revisión general de todos los elementos que componen los equiposde aplicación de líquidos antes de realizar cualquier pulverización. Los diferentesprocedimientos de prueba señalados a continuación se realizarán con agua limpia. En el casode los equipos montados al tractor se deben hacer los ajustes necesarios en sus acoples altractor.

Funcionamiento del manómetro:Se debe comprobar el funcionamiento del manómetro a diferentes presiones, con otro deprueba cerca del sitio donde va colocado. Además, se debe chequear la presión en la barraportaboquillas, en los extremos y en el centro de cada sección (figura 8), tan cerca de laboquilla como sea posible.

Para el caso de los pulverizadores de espalda se debe comprobar la presión en la punta de lalanza cerca de la boquilla (figura 8).

Figura 8. Puntos de comprobación de presión.

Uniformidad de las boquillas:Las boquillas deben entregar un caudal determinado a una presión establecida. Paracomprobar este parámetro se realiza el siguiente procedimiento de prueba (Márquez, 1998;FAO, 2001):1. Se llena el depósito con agua.2. Ajustar la presión a la recomendada. La prueba debe realizarse a las siguientes presiones:

máxima, mínima y recomendada de trabajo.3. Se deja trabajar el equipo por unos instantes para que se carguen todos los elementos y se

estabilice la presión.4. Luego de estabilizada la presión, recoger y medir el líquido pulverizado por cada una de

las boquillas en un tiempo determinado (caudal en L/min). Se deben realizar 5 medicionespor cada boquilla y registrar la media para realizar la comparación.

5. Comparar los datos recolectados para cada una de las boquillas con el valor nominal deesta (valor de fábrica).

6. Las boquillas cuyo valor medido se desvíe en un 10% por exceso o por defecto deben serreemplazas o chequeadas.

Boquillas con valores superiores pueden ser originados por desgaste del orificio o la boquillapuede ser de mayor caudal que la recomendada. Boquillas con valores inferiores pueden seroriginados por taponamiento de esta o de su filtro o la boquilla puede ser de menor caudalque la recomendada.

Patrón de distribución de las boquillas:Para realizar este procedimiento de prueba se utiliza un perfilómetro o banco de distribución(FAO, 2001), con columnas seleccionadoras separadas 100 mm como se observa en lafiguras 9 y 10; los pasos son los siguientes:1. Se llena el depósito con agua.2. Tomar datos a 2, 3 y 4 bar de presión. Ajustar la presión establecida.3. Se deja trabajar el equipo por unos instantes para que se carguen todos los elementos y se

estabilice la presión.4. La altura de la boquilla sobre el banco de distribución debería cumplir con las

recomendaciones del fabricante relativas a la altura de la boquilla sobre el objetivo. Si nohay recomendación de realizarán las pruebas a 300, 400 y 500 mm de altura parapulverizadores de espalda y a 400, 500, 600 y 700 mm para los acoplados al tractor,medidos desde el borde del banco de distribución hasta el orificio de la boquilla. Realizartres repeticiones por cada presión y altura seleccionada.

5. Luego de estabilizada la presión y seleccionada la altura, recoger el líquido pulverizadopor un minuto o hasta que alguno de los recipientes alcance un 90% de su capacidad.

6. Se calcula el coeficiente de variación de las medidas, el cual no debe ser mayor a un 10%.Es conveniente realizar un gráfico de los valores para observar en que sector de la barrapuede haber problemas de distribución.

Figura 9. Banco de distribución portátil para observar el patrón de distribución del líquidopulverizado.

Figura 10. Patrón de distribución de una barra portaboquillas mostrando el solape (s)necesario entre las boquillas.

En el caso que el coeficiente de variación supere el 10%, se deben realizar los ajustesnecesarios para mejorar la distribución, como por ejemplo: estado de las boquillas, distanciaentre boquillas, altura de pulverización, horizontalidad de la barra y del banco dedistribución.

Volumen a aplicar:El volumen a aplicar es la mezcla del producto diluido con el agua el cual será distribuido enuna superficie determinada.

Para pulverizadores montados al tractor, el volumen a aplicar se puede calcular con lasiguiente fórmula:

Dboq(m)V(KPH)600)Qboq(L/min(L/ha)Vol.Aplic.

donde,(L/ha)Vol.Aplic. : volumen a aplicar en litro por hectárea.

)Qboq(L/min : caudal de la boquilla en litros por minuto.V(KPH) : velocidad en kilómetros por hora.Dboq(m) : distancia entre boquillas en metros.600 : factor de conversión.

Verificación de la velocidad de trabajo.La velocidad de trabajo del conjunto tractor-pulverizador tiene influencia directa sobre elvolumen a aplicar, inclusive en algunos equipos con asistencia electrónica; por lo tanto, sedebe determinar la velocidad de trabajo. Un método sencillo y preciso es el siguiente:1. Acoplar el pulverizador al tractor y llenar el depósito con agua hasta la mitad de su

capacidad.2. Medir una distancia de 50 a 100 m en un terreno similar al que se va a aplicar el

tratamiento.3. Ajuste las revoluciones de trabajo del motor y seleccione la velocidad en la caja de

transmisión, recuerde que las revoluciones de la toma de fuerza deben ser 540 RPM (valormás común para la mayoría de los implementos en Venezuela, verificar).

4. Recorra la distancia marcada, registrando el tiempo en segundos que tarda en recorrerla,debe comenzar el recorrido unos metros antes de la marca inicial de forma que el tractorhaya estabilizado la velocidad.

5. Repita la operación 3 veces y calcule la media.6. Determine la velocidad con la fórmula:

6,3(seg)tiempo

(m)distancia(km/h)Velocidad

7. Realice los ajustes necesarios a la velocidad de trabajo.

Área efectiva de aplicación.Es el área cubierta por el conjunto tractor-pulverizador, ancho de trabajo (At) multiplicadopor la distancia recorrida (Dr). Para el caso de aplicación total el At es el número de boquillasmultiplicado por su separación (figura 11); en el caso de aplicación en bandas el At es el

ancho de cada banda. Para el caso de los pulverizadores de espalda hay que tomar en cuentaque al variar la altura de aplicación varía el At.

Volumen aplicado.Conocido el tiempo que tarda el tractor en recorrer la distancia establecida, se procede arecoger la cantidad de líquido aplicado en ese mismo tiempo, en por lo menos 5 de lasboquillas de la barra. Las boquillas deben haber sido chequeadas previamente (procedimientode prueba de uniformidad boquillas). Repetir el procedimiento 3 veces, obtener el promedio ymultiplicar por el número total de boquillas, consiguiendo el volumen total aplicado. Si es elcaso de una sola boquilla (pulverizadores de espalda), este será el volumen aplicado o sepuede medir el volumen gastado en el depósito del pulverizador.

Volumen aplicado por hectárea.Se relaciona el volumen aplicado en el área efectiva de aplicación con una superficie de unahectárea y se compara con el volumen a aplicar recomendado.

Figura 11. Área efectiva de aplicación para el cálculo del volumen a aplicar, pulverizadormontado en el tractor y de espalda.

Para efectuar correcciones al volumen a aplicar se puede variar la velocidad de trabajo,aumentar o disminuir la presión y/o cambiar las boquillas. Se debe hacer la modificación deun parámetro a la vez y verificar nuevamente el volumen de aplicación hasta llegar alrecomendado.

Distribución de la aplicación:Para la evaluación de la calidad de la distribución de la aplicación de un producto se utilizandiferentes métodos o combinación de estos, entre ellos tenemos: Trazadores fluorescentes: son aplicados sobre los objetivos y luego medidos por

fluorometría, son susceptibles a la degradación por la radiación solar.

Trazadores metálicos: no son susceptibles a la degradación por la radiación solar, paracuantificarlos se hacen lavados de las hojas o de los objetivos artificiales y se determinanlas cantidades de producto por unidad de superficie a través de la conductividad eléctrica.

Micronutrientes marcados: se han utilizado zinc, manganeso, cobre, entre otros, lascantidades depositadas sobre los objetivos son lavadas y determinadas por espectrometríay colorimetría.

Colorantes: se usan colorantes solubles en agua que son aplicados sobre los objetivos yluego analizados ópticamente.

Objetivos artificiales: se han utilizado papel hidrosensible, papel sensible al aceite,láminas de plástico con vaselina o rociadas de silicona, trozos de cristal o de espejo,cápsulas de Petri, papel adhesivo, entre otros. Generalmente son analizados ópticamente através de fotografías o escáner, para luego estudiar la distribución de la aplicación conlupas, microscopios o programas de análisis digital de imágenes.

El uso de trazadores fluorescentes, metálicos y micronutrientes es costoso y requiere deequipos de laboratorio de cierta magnitud. Para el uso de los objetivos artificiales se requierede la colocación de estos según sea el equipo y el objetivo a alcanzar (figuras 12, 13, 14, 15).

Figura 12. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores montados al tractor yaplicación al suelo u objetivos sobre el suelo.

Figura 13. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores de espalda o centrífugos yaplicación al suelo u objetivos sobre el suelo.

Figura 14. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores montados al tractor yaplicación a objetivos sobre plantas arbóreas.

Figura 15. Ubicación objetivos artificiales con pulverizadores aéreos.

Es conveniente enumerar los objetivos artificiales de manera de identificar su posición yrealizar un correcto análisis de la distribución de la aplicación. Los objetivos artificialespueden ser colocados sobre soportes rígidos, horizontal o verticalmente tomando en cuenta elposible desplazamiento de las gotas por la inclinación de este.

Para el caso de papel hidrosensible, no deberá ser colocado sobre soportes mojados ohúmedos, se deben recoger inmediatamente después que las gotas hayan secado.

Existe la posibilidad de plantear la comparación de tratamientos (diferentes equipos,boquillas, volúmenes de aplicación, entre otros) para observar como es la distribución de unapulverización (tamaño de gota, gotas/cm2, alcance de la distribución, sobredosificaciones,subdosificaciones) se deberá realizar el análisis estadístico de los datos de distribución de laaplicación en dependencia del diseño experimental seleccionado, completamente al azar,bloques al azar, parcelas divididas, entre otros.

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Capítulo 10TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE RESISTENCIA A HERBICIDAS

Cástor ZambranoUniversidad Central de Venezuela

Introducción

La confirmación de casos de resistencia con el uso de metodologías científicamenteaceptadas es un paso inicial y fundamental para afrontar el problema de resistencia; puesproducto de ésta se podrán idear estrategias de manejo aplicables en los campos de losagricultores.

En la literatura es posible encontrar variada información sobre los modelos estadísticos y lascurvas de dosis-respuesta, además de una nutrida cantidad de publicaciones de alto niveldonde se aplican los principios teóricos enmarcados en la comparación de poblacionessusceptibles contra poblaciones “posiblemente resistentes” sometidas a dosis crecientes deherbicidas, y de allí la estimación de un índice de resistencia Pero los casos de resistenciacrecientes en forma exponencial demandan a nivel mundial, regional y local, la incorporaciónde nuevos talentos que comienzan a aplicar, algunos en forma errada, diversas metodologías,muchas veces por falta de experiencia e información sobre consideraciones y herramientasprácticas, las cuales deben ser tomadas en cuenta para garantizar resultados confiables.

El propósito de este capítulo es ofrecer una serie de consideraciones prácticas y herramientasmetodológicas a investigadores que recién se inician en esta área, con la finalidad de unificarcriterios en las diferentes etapas que deben cumplirse en la evaluación de la resistencia demalezas a herbicidas; entre ellas se encuentran: colección de semillas en campo y manejo enel laboratorio; diseño, instalación y manejo de los ensayos de dosis-respuesta, análisisestadístico, etc.

Consideraciones al momento de colectar las semillas en campo:

- Nivel de control de las plantas de malezas, debe considerarse que en la medida en que latasa de mortalidad de malezas sea mayor, igualmente mayor es la presión de selección queejerce el herbicida.

- La presencia de malezas solas al lado de plantas muertas podría indicar la presencia deindividuos R (resistentes).

- Historial de los lotes: esta información es fundamental para tener una idea inicial sobre laexistencia, naturaleza y magnitud del problema; por tanto se recomienda hacer unapequeña encuesta que en términos generales incluya las siguientes preguntas:

¿cuál herbicida aplicó? ¿se aplicó la dosis correcta del herbicida? ¿lo hizo en el momento adecuado? ¿las condiciones antes y después de las aplicaciones eran “ideales”? ¿por cuántos años o ciclos de cultivo ha usado el herbicida?

2

¿lleva registros del manejo de cada uno de sus campos? ¿éste herbicida se aplica para controlar esta especie y/o además para controlar otras

especies? ¿las controló o no? ¿los campos están nivelados? ¿cuenta con la cantidad de agua suficiente para irrigar a tiempo sus campos? ¿qué fuente de agua usa?

Debe tenerse en cuenta que herbicidas con mecanismos de acción muy específicos, amplioespectro de control, dosis bajas y altamente eficaces, son productos que tienden a generarresistencia más rápido.

- Manchas en el campo podrían indicar poblaciones R, normalmente cuando se alcanza unaproporción de aproximadamente un 30 % de los individuos resistentes, es cuando elproductor se percata de la falla en el control (manchones y/o escapes); quiere decir que elproceso está bastante avanzado (Fischer, com. per)1.

- Recolección de semillas:a. Madurez fisiológica: en la mayoría de los casos un buen indicativo de madurez

fisiológica, consiste en que las semillas puedan desprenderse con cierta facilidad de laestructura que las une a la planta.

b. Selección del área para la recolección: se recomienda iniciar la recolección en losmanchones y/o escapes de malezas, siempre tratando de ir del centro hacia los bordes;y evitando aquellos manchones ubicados en sitios donde el campo presente unacondición particular que lo haga diferente al resto del mismo (algún bajío, una loma,una escape en franja típico de un error de aplicación, etc.).

c. Cantidad de semilla: se recomienda recolectar la mayor cantidad posible; comoreferencia, Martinez (com per)2 señala que 1000 semillas de Sorghum halepensepesan unos 3,6 g. Por otra parte Blanco (com per)3 afirma que 1000 semillas deIschaemum rugosum pesan unos 7,5 g., y que para un bioensayo de dosis-respuestacon la misma especie con 8 dosis, 10 repeticiones y 6 – 8 plantas por recipiente, senecesitan unas 1520 semillas (11,4 g) con un 50% de germinación.

d. Evite cosechar semillas húmedas: si no tiene otra alternativa, luego de la recoleccióncoloque un ventilador (soplador de aire) frente a las semillas al menos 24-48 horas.

e. No almacenar en bolsas plásticas: aún cuando las semillas estén lo suficientementesecas; recuerde que la semillas son una estructura viva que respira y, por ende, elmaterial plástico atenta contra la calidad de las semillas.

f. Rotule adecuada y oportunamente las bolsas: errores relacionados a confusión debolsas luego de la recolección generan dudas y finalmente los resultados no seránconfiables.

g. Secar con aire natural tan pronto sea posible.

1Albert Fischer; PhD. Profesor Asociado, Universidad de California-Davis, USA.2 Mariano Martínez; Estudiante Tesista, Laboratorio de Malezas, Facultad de Agronomía. Universidad Centralde Venezuela.3 Solsiré Blanco; Estudiante Tesista, Laboratorio de Malezas, Facultad de Agronomía. Universidad Central deVenezuela.

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h. Limpiar las semillas.i. Punto de georeferencia (coordenadas): esta consideración es muy importante, pues

con ello se ubica en un mapa y por consiguiente se le puede hacer seguimiento en eltiempo.

Instalación de ensayos para la detección de poblaciones resistentes a herbicidas:

- Sitio y condiciones donde se llevará a cabo el bioensayo:

Un aspecto fundamental en cuanto al establecimiento de un bioensayo para el estudio deresistencia, es garantizar sobre todo la radiación, temperatura, fuente de agua de calidad ysubstrato apropiados.

Particularmente la radiación debe ser monitoreada durante el desarrollo del bioensayo, másaún si se están utilizando moléculas inhibidoras de la ALS (AHAS) como por ejemplo lassulfonilúreas. Probablemente si se realiza una corrida de dosis-respuesta en el períodolluvioso (días nublados con limitada radiación), con toda seguridad obtendrá resultados muydiferentes a los que obtendría en durante el período seco (días con escasa nubosidad).

La temperatura afecta notablemente los procesos metabólicos de la planta; además, ennuestro caso por encima de 50C, se pudiese estar agregando un factor estresante adicional alque se plantea considerar con las diferentes dosis.

En el caso del agua, la presencia de carbonatos y restos de materia orgánica, por ejemplo,podrían estar afectando la eficacia de la molécula objeto a estudio; por lo tanto se recomiendarealizar un análisis de calidad de agua para descartar esta fuente de variación.

El substrato debe tomarse en consideración sobre todo en función de su naturaleza: suelo,substrato sintético. Por ende, si se usa suelo, un análisis de macro y micro nutrimentos esimportante sobre todo para descartar sales y/o realizar las respectivas correcciones deposibles deficiencias nutricionales que pudiesen generar cierto grado de estrés en la maleza.Si es el caso del uso de un substrato de origen sintético, debe considerar lavarlo consuficiente agua antes de realizar la siembra o trasplante del material vegetal; yobligatoriamente debe considerar el suministro de nutrimentos bien sea por fertirriganción oaplicaciones constantes de soluciones nutritivas tipo Hogland.

- Métodos utilizados para la ruptura de latencia y producción de plántulas uniformes:

Un componente importante del control local en este tipo de experimentos, además delambiente bajo el cual se desarrolle el bioensayo, consiste en garantizar plántulas lo mashomogéneas posibles, situación de la cual depende en alto grado la confiabilidad de susresultados. En algunos casos, como los planteados por Pérez (2009) y Fardella (2008) se hatenido que plantular malezas tal y como se hace en los sistemas de producción forzada dehortalizas, y en otros se han aplicado técnicas de escarificación mecánica usando papel lija,inmersión de semillas en fiolas con constante suministro de oxígeno, uso de soluciones ricasen KNO3, temperaturas variables, escarificación química con H2SO4, y escarificación manual

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e, incluso, en la mayoría de los casos el objetivo se cumple combinando alguno de losmétodos citados anteriormente.

Otra razón importante por la cual conocer particularmente el mejor método o la combinaciónde los mismos para la ruptura de la latencia, es la economía de las semillas de biotipos opoblaciones, que en algunos casos puede llegar a ser un factor limitante.

A continuación se citan algunos ejemplos relacionados con la aplicación de algunos métodosde ruptura de latencia en biotipos asociados a la detección de resistencia:

Espinoza (2004) trabajando con biotipos R de Echinochloa colonum aplicó en primerainstancia la escarificación mecánica con un envase de vidrio de 0,5 litros en la cual la parteinterior del envase se forró con papel de lija número 120, se introdujeron las semillas y seprocedió a un movimiento circular manual. Después de este tratamiento, las semillas secolocaron en unas fiolas de 250 ml con agua, las cuales tenían un sistema de aireación(motores para peceras con mangueras que finalizaban con una aguja de inyectadota o piedraporosa), con la finalidad de oxigenar el agua y, con la presión generada, permitirle unmovimiento continuo a las semillas durante tres días para remover posibles sustanciasinhibidoras de la germinación; posteriormente se colocaron las semillas sobre papel húmedoen bandejas dentro de una estufa y se usaron diferentes temperaturas por tres días (primer díaa 55 °C, el segundo a 32 °C y el tercero por 6 horas a 28 °C), aplicando agua continuamente;posteriormente estas semillas germinadas fueron colocadas en la cámara de germinación paraque recibieran luz artificial.

Por su parte, Delgado (2004) y Delgado et al. (2008) al evaluar la resistencia de biotipos deRottboellia cochinchinensis, separaron manualmente la semilla del artículo de todas lapoblaciones que utilizaron.

Fardella (2008) y Araujo (2008) al trabajar con semillas de diferentes biotipos de Ischaemumrugosum, en primera instancia utilizaron la escarificación mecánica igual a la previamentedescrita para E. colona, se oxigenaron, posteriormente se lavaron las sustancias inhibidorasde germinación del material sometiéndolas a una corriente de aire con agua destilada y unasolución de KNO3 al 2% durante 2 días (tiempo que tarda la radícula en aparecer),cambiando el agua de las fiolas cada 24 horas. Una vez germinadas fueron colocadas enbandejas de germinación con sustrato inerte en la cámara de germinación durante dos (2) díasa una temperatura de 30º C.

Pérez (2009), Zambrano y Medina (2006) utilizaron una metodología similar a Espinoza(2004)en semillas de poblaciones de Echinochloa colonum, pero una vez germinadas lassemillas se colocaron en las bandejas de germinación para su plantulación tal y como lorealizó Fardella (2008). Por su parte, Ortíz (com. per.)4 de acuerdo a la ISTA (2004), altrabajar con poblaciones de Echinochloa oryzoides utilizó ácido sulfúrico puro (95-98%) por20 minutos, luego eliminó el ácido sulfúrico en un colador de orificios muy pequeñoslavando cuidadosamente con agua y al final se pasaron por una solución al 2% de carbonatode calcio por un minuto.

4Aída Ortíz; MSc. Profesora Agregado, Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela.

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Si se cuenta con suficiente número de semillas y la latencia no es tan marcada y/oescalonada, se procede entonces a pre-germinar las semillas y colocar en los recipientesplásticos (materos) en cantidad suficiente para su posterior raleo.

- Consideraciones sobre dosis (S) y (R), número de réplicas y duplicación de bioensayos:

La dosis juega un papel protagónico en este tipo de ensayos, de hecho su nombre esbioensayos dosis-respuesta, por lo tanto, deben seleccionarse cuidadosamente basadas enensayos preliminares, pues el rango de dosis va a depender de cuan susceptible (S) oresistente (R) sea la población objeto a estudio.

Los ensayos preliminares se llevan a cabo con la finalidad de, en primer término, conocer larespuesta de las poblaciones recolectadas a 0X ,½ X y 1X (donde X se considera como ladosis comercial recomendada por el fabricante del herbicida). El testigo 0X se debe aplicarcon agua + el coadyuvante que se va a aplicar con el herbicida. Se pueden “etiquetar” laspoblaciones en posiblemente resistentes (aquellas poblaciones que sobrevivan a la dosiscomercial utilizada) y susceptibles. En este punto se recomienda hacer un análisis de varianza(ANAVAR o ANOVA) y su respectiva prueba de medias, entre los tratamientos para cadauna de las poblaciones seleccionadas. Si estadísticamente no hay diferencias entre lostratamientos, es decir 0X y 1X son iguales, existe alta probabilidad de que dicha poblacióntenga problemas de resistencia.

Un segundo objetivo de los preliminares es la determinación de las dosis que generen unacantidad de puntos suficientes, ubicados de tal forma que permitan hacer un buen análisis delos datos. En este sentido, se considera particularmente importante tener dosis que generenpuntos suficientes en la pendiente de la curva, pues de esto depende que el modelo indique ladosis que reduce en un 50% la variable evaluada (ED50), parámetro con el cual se determinael índice de resistencia (IR). Es importante considerar que el rango de dosis para ambaspoblaciones no siempre es la misma, y es allí donde cobran importancia los ensayospreliminares.

Un análisis confiable depende en gran medida de la población que se use como susceptible“S”. Se recomienda utilizar poblaciones susceptibles provenientes de la misma zonaagroecológica de donde se obtuvieron las poblaciones sospechosas de resistencia. Pero nosiempre eso es posible, entonces el investigador debe prever el desarrollo de una línea purahomocigota susceptible, la cual sea producto de sucesivas autofecundaciones, si la especie lopermite; sino, se genera una población con varias generaciones de endocruza entre unnúmero limitado de individuos. Fischer1 (com. per.) plantea que además esta consideracióndebe tenerse en cuenta incluso para las poblaciones ya determinadas como resistentes, puesse requieren líneas puras homocigotas para estudios metabólicos y moleculares.

Por lo general, se recomienda utilizar un factor de dilución constante, lo cual genera puntosequidistantes en un eje (X) logarítmico (Streibig et al, 1993); aún cuando, dependiendo lanaturaleza de los datos y si así lo estima el conocimiento previo de la población, se puedenagregar dosis para incrementar la potencia del análisis (sobre todo en lo que respecta a lapendiente de la curva), aprovechando el alcance que brinda el modelo de regresión no lineal.

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Un rango de dosis frecuentemente utilizado para poblaciones sospechosas de resistencia es 0x; 1/16x; 1/8x; 1/4x; 1/2x; x; 2 x y 4x; aunque frecuentemente el rango de dosis utilizadopara el susceptible debe ser diferente. En tal sentido, por lo general para la población “S” seusa 0x; 1/64x; 1/32x; 1/16x; 1/8x; 1/4x; 1/2x; x; y 2x.

En la Fig. 1 se observa una respuesta diferencial entre la población control y aquella que fueobjeto de estudio (Guárico). En este caso Fardella (2008) utilizó para la población control elsiguiente rango de dosis: 0X; 1/128X; 1/64X; 1/32X; 1/16X; 1/4X; X; 2,5X y 3,5X; mientrasque para la población Calabozo usó: 0X; 1/32X; 1/16X; 1/4X; X; 2,5X y 3,5X. Además, seobserva que existen puntos que se generaron a partir de dosis a lo largo del trazado de lacurva (incluso en la pendiente), esto producto de 2 ensayos preliminares para ajuste de dosis.

Figura 1. Efecto de dosis crecientes de bispiribac sodio sobre el peso fresco de laspoblaciones control (susceptible) y Guárico (Fardella, 2008).

Si la cantidad semillas de la población objeto a estudio lo permite, es recomendable utilizardoble batería de testigos (0x), pues es el punto inicial de comparación en la respuesta de unamisma población a dosis crecientes de herbicidas (Valverde, com per)5.

Los estadísticos plantean que en la medida en que se aumente el número de replicas el errorexperimental disminuye, lo cual genera entonces la necesidad de trabajar con el mayornúmero posible de las mismas. Bajo condiciones normales de trabajo en cuanto a espacio yrecursos se considera razonable utilizar entre 6 y 9 replicas por tratamiento. Claro está, sise trabaja con poblaciones homocigotas recesivas generadas por el investigador producto deautofecundaciones, donde la variabilidad es relativamente manejable; el número de replicaspuede disminuirse. Normalmente se requiere hacer el análisis directamente a poblacionescolectadas en campo; acá hay una variabilidad enorme, lo cual sugiere que se incrementen almayor número posible las réplicas para poder tomar decisiones con datos que “hagan muchoruido” previos al análisis estadístico. En algunas ocasiones, partiendo del conocimiento de la

5 Bernal Valverde; PhD. Idea Tropical. San José, Costa Rica.

B is p ir ib a c (g . i.a /h a )

0 .0 0 1 0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0

Peso

frec

o (%

de no

trata

do)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

V a lo re s o b s e rv a d o sIs c h a e m u m c o n tro l

V a lo re s o b s e rv a d o sIs c h a e m u m G u á ric o

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o las poblaciones bajo estudio, y bajo ciertas limitantes (espacio, numero de semillas, etc) sepuede pensar incluso en sacrificar repeticiones e incrementar el número de dosis en el ensayo(Valverde, com per)5.

- Consideraciones sobre capacidad de materos, número de plántulas a utilizar por unidadexperimental y estado de desarrollo de las mismas:

Para la evaluación de gramíneas anuales con herbicidas post-emergentes sistémicos se usanfrecuentemente recipientes (materos) de 0,5 a 1 kg de capacidad, en el cual se siembran otrasplantan de 5 a 10 plántulas para dejar finalmente al momento de la aplicación de 1 a 4plántulas por unidad experimental. Es importante considerar que al momento de hacer elraleo, se dejen en la medida de lo posible plantas equidistantes entre sí, para corregir elposible efecto paragua en la aplicación del herbicida que se pudiese generar en aquellosrecipientes con más de una plántula.

Otro factor a considerar es el estado óptimo de desarrollo de las plántulas para la aplicacióndel herbicida; acá, el criterio producto de la experiencia del investigador juega un papelimportante, además de que en muchos casos es necesario hacer un bioensayo preliminar paradeterminar el momento óptimo de aplicación. La información que provee el fabricante puedeusarse como de referencia; aunque generalmente en herbicidas post-emergentes sistémicosgraminicidas el estado óptimo de desarrollo para la aplicación es de 3 a 4 hojas.

- Equipos y metodología de aplicación:

La aplicación de los tratamientos en los bioensayos de dosis-repuesta confiables, deberealizarse garantizando: presión, velocidad, descarga y altura constante. La calibración debehacerse al menos cada vez que se vaya a cambiar de dosis y se sugiere la preparación porseparado de cada una de las soluciones herbicida que represente una réplica o al menos ungrupo de ellas, bien sea mediante el uso de soluciones madres ó directamente conmicropipetas tratando en lo posible minimizar un error al momento de su preparación, puessignificaría un fracaso en el bioensayo. Cuando realice los cálculos, es saludable que tercerosrevisen los mismos; cada dosis debe ir en el recipiente del equipo a la mitad de su valor y almomento de hacer la aplicación considere hacerla de ida y vuelta, para alcanzar laconcentración estimada.

- Variables a evaluar y metodología para la toma de resultados (tiempo):

Para cuantificar el efecto de un herbicida sobre la fisiología de la maleza, debe evaluarse elpeso fresco de la misma; pues si bien puede generar por si misma una variabilidad enorme, esquien refleja en mayor grado el efecto sobre la planta. Lo antes expuesto genera la necesidadde aleatorizar el muestreo para repartir entre todos los tratamientos el error que se generaproducto de su naturaleza.

La evaluación se hace dependiendo de la naturaleza del herbicida y de la especie de malezaobjeto a estudio, aunque para herbicidas post-emergentes sistémicos graminicidas se haestandarizado que 22 días luego de la aplicación es el tiempo necesario para hacer unaapreciación bien ajustada a la realidad. No obstante, hay especies como Eleusine indica en el

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caso de evaluar glifosato o Fimbristylis miliacea en el caso de pirazosulfuron-etil, en lascuales el rebrote de plantas prácticamente muertas debe ser considerado.

Análisis estadístico:

Ensayos de dosis-respuesta: el concepto de dosis-respuesta en la ciencia de la maleza consisteen una cantidad de herbicida que genera un efecto deseable en una población de plantas deinterés (Streibig et al, 1993).

Típicamente la forma de la curva de dosis-respuesta es sigmoidal. Con un límite superiordefinido por la respuesta de las plantas no tratadas (control), o de las plantas tratadas con unadosis muy baja de herbicida, y un límite inferior determinado por la respuesta de una altadosis de herbicida. La dosis correspondiente al punto medio entre el límite superior e inferiores conocido como el ED50 (Streibig, 1988).

El modelo comúnmente usado es el log-logístico de tres y cuatro parámetros. La ecuación decuatro parámetros es la siguiente:

)))log()(log(exp1 exbcdcy

donde, e=ED50, d=límite superior, c=límite inferior y b es la pendiente alrededor de e. Si ces igual a cero, entonces la ecuación se reduce a tres parámetros, y cuya ecuación es lasiguiente:

)))log()(log(exp1 exbdy

Otras ecuaciones utilizadas en este tipo de ensayos son las de Weilbull para cuatro y tresparámetros; la diferencia entre éstas y las anteriormente descritas radica en que el modelo deWeilbull no es simétrico en ningún punto. En tal sentido se muestran a continuación,Weilbull de cuatro parámetros:

exbcdcy (logexpexp)(

Weilbull de tres parámetros: exbdy (logexpexp#

Otro de los modelos utilizados en algunos bioensayos es el de Brian Cousens para el análisisde bioensayos donde ocurre la “Hormesis”, fenómeno donde a dosis bajas existe unincremento en la variable independiente y con el posterior incremento de la dosis, los valoresdecrecen. La modificación se realiza en la ecuación de cuatro parámetros, con la adición deun término “f” en el numerador:

exbcfxdcy loglogexp1/

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Figura 2. Curvas simétricas y asimétricas de dosis-respuesta. Adaptado de Knezevic et al.(2007).

Debido a la naturaleza de estos bioensayos y al exhaustivo control local que debeestablecerse, el diseño comúnmente utilizado por los investigadores es el completamentealeatorizado, el cual es recomendado por los estadísticos para ensayos que se llevan a cabobajo condiciones controladas.

Herramientas disponibles para el análisis de datos:

- SAS®: bajo este software se pueden analizar los datos de un ensayo dosis-respuesta, peroexisten dos limitantes importantes, la primera de ellas la constituye el alto precio delprograma; y en segundo lugar es bastante tedioso el manejo del mismo.

- R®: El programa para análisis estadístico R® (R Development Core Team, 2009) es unalicencia gratuita que ha sido desarrollado con la colaboración de una gran cantidad depersonas que contribuyen en el desarrollo y prueba de diferentes paquetes para diversostipos de análisis. Toda la información necesaria, así como los manuales de uso de estaherramienta estadística puede ser consultada en la web http://www.r-project.org/.

Para el caso particular de el estudio de curvas de dosis respuestas se ha desarrollado elpaquete ´drc´ (dose-response curve), el cual posee una serie de ventajas sobre otrospaquetes estadísticos, ya que ha sido diseñado específicamente para este tipo de análisis yfacilita el cambio de opciones para el estudio del ajuste del modelo a los datosdisponibles; sin embargo, es necesario estudiar a profundidad el lenguaje en el que sedesarrolla R® y las opciones que el mismo posee para realizar el análisis. El programaposee limitaciones en cuanto a su accesibilidad, ya que no es “amigable” para el usuario,pero después de su estudio y utilización constante, el mismo es capaz de generar reportesde análisis sencillos y fáciles de comprender, además de gráficos muy apropiados a este

a) Simétrica

b.2) Asimétricalento descenso

b.3) Asimétricaestimulación inicialdel crecimiento

b.1) Asimétricarápido descenso

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tipo de análisis. Una descripción de las potencialidades de R para el análisis de curvasdosis respuesta puede ser consultado en “Utilizing R software package for dose-responsestudies: The concept and data analysis” (Weed Technology, 2007, 21:840–848), así comoen “Bioassay Analysis using R” (Journal of Statistical Software, January 2005, Volume12, Issue 5 - http://www.jstatsoft.org/).

Como referencia de un modelo de programación para el análisis de una curva de dosisrespuesta se presenta el siguiente:library(drc)library(agricolae)nombre de la curva <-read.csv("ubicación del archivo (.csv) en el computador")nombre de la curva (para verificar que los datos fueron leídos correctamentenombre del modelo <- drm(peso ~ dosis, fct = LL.4(), data = nombre de la curva)summary(nombre del modelo)modelFit(nombre del modelo)plot(nombre del modelo, xlab = "etiqueta de x", ylab = "etiqueta de y")ED(nombre del modelo, c(10, 50, 90))

En este caso se subrayan aquellas líneas en las cuales el operador del programa decide losnombres o valores que desea colocar como referencia de su análisis. Los datos secolocaron en dos columnas, cuya primera fila se corresponde con el nombre de lasvariables; en este caso “peso” y “dosis”; además deben ser guardados bajo el formato .csv(separados por comas). Esta programación esta hecha para el ajuste de los datos a unmodelo de cuatro parámetros [LL.4()], pero puede utilizarse el modelo de preferencia, deacuerdo a los que dispone el paquete `drc`. También se incluyen las instrucciones paragenerar el gráfico correspondiente al modelo generado.

- SigmaPlot®: El primer paso para la corrida de los datos bajo este software es laorganización de los datos, para ello se colocan las columnas Dosis, Peso fresco, % conrespecto al control no tratado, Promedio y Error Estándar. Los datos pueden ser transcritosdirectamente en las celdas del SigmaPlot® o copiados de la hoja de cálculo de Excel.

El objetivo de usar el % con respecto al control no tratado es facilitar la presentacióncomparativa de los datos, aun cuando hay investigadores que prefieren hacer los cálculosde la regresión Log-logística con los datos originales (con la finalidad de preservar laestructura del error) y usar los datos de % solo para presentar los gráficos.

Las barras de error estándar se colocan para dar una idea al lector de cuan variable eranlos datos alrededor de una media para una dosis determinada; aunque Streibig (com. per)6

plantea que el análisis correcto de los datos en una regresión no lineal parte de que elerror estándar debe ser tan bajo que no tiene mucho sentido calcularlo y presentarlo.

Un segundo paso consiste en seleccionar en (Statistics) la opción (Regression Wizard), yluego seleccionar (Four Parameter Logistic Curve) y en la misma ventana debeseleccionarse (Edit Code), al desplegarse esta ventana se deben constatar los siguientesaspectos:

6 Carl Jens Streibig; PhD. Profesor Asociado, Universidad Real de Dinamarca.

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(Equation):f = min + (max-min)/(1+(x/EC50)^Hillslope)fit f to y''fit f to y with weight reciprocal_y''fit f to y with weight reciprocal_ysquare

(Variables):x = col(1)y = col(3)

(Initial parameters):min = min(y) ''Auto {{previous: 10}}max = max(y) ''Auto {{previous:100.0000}} {{previous: 100.726}}EC50 = x50(x,y) ''Auto {{previous: 6.7012}}Hillslope = if((y[1]-y[size(y)])/(x[1]-x[size(x)])>0,-1,1) ''Auto {{previous: 0.709439}}

(Constrains):min>10

(Options):(Iterations): 200(Step Size): 10(Tolerance): 0.000001

Una vez terminado el chequeo se presiona (Run)

Se despliega una ventana de (Regression Wizard), donde es importante chequear que semuestre el aviso siguiente (Converged, tollerance satisfied), luego debe presionarse elcuadro (Next). Posteriormente se despliega una ventana, donde a mano derecha debe estarseleccionada o seleccionar (Create Report) y luego presionar (Next). En la nueva ventanaa mano izquierda aparece un grafico de ejemplo y a mano derecha de todas las opcionesdebe estar seleccionada (Create New Graph) y luego pulse (Next).

Luego se despliega otra ventana titulada (Regression Wizard- Graph data), allí vaya a laventana (Curve Data column) y sobre la opción (X column) mueva el ratón hacia laventana donde se visualizan los datos y seleccione la columna 6, e inmediatamenteobservará que aparece (X column: column 6). Haga la misma operación para (Y column) yseleccione la columna 7. Posteriormente seleccione (Finish).

Inmediatamente se despliega su primer gráfico (figura 3), y a mano izquierda en la páginaprincipal notará que ha desplegado: una ventana de datos (Data 1), el reporte de los datosestadísticos del análisis (Report 1) y el gráfico mencionado anteriormente (Graph 1). Encuanto el reporte allí podrá constatar: R; Rsqr; Adj Rsqr; Standard Error of Estimate , tambiénpodrá ver la probabilidad (significancia) de cada uno de los parámetros de la ecuación:min; max; EC50 y Hill slope, y finalmente el análisis de varianza de la regresión, donde esimportante chequear la probabilidad de la misma Regression 3; así como también algunaspruebas estadísticas conocidas. Del mismo modo al ver en la ventana (Data 1) podrá

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constatar que en la columna 6 y 7 se observan una cantidad grande de datos (producidospor el modelo). En este punto es muy importante que chequee que el primer dato de lacolumna (6 x-column) no sea cero (0), si lo reporta así, cambie ese cero por un valormenor o igual a 0,001, y eso mismo debe hacerlo en la columna de dosis. Esto debido aque posteriormente se va a dar la instrucción al programa que transforme el eje X de lineala logarítmico, y al haber ceros el programa da un error.

2D Graph 1

X Data

0 50 100 150

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

140

x column vs y columnCol 1 vs Col 3

Figura 3. Figura de datos hipotéticos con ejes X y Y lineales

Es importante destacar que el valor de EC50 mostrado en el (Report 1), es el valor de X(la dosis de herbicida) en el punto de inflexión de la curva sigmoidal cuando el valormin: 0 y el max: 100; si estos preceptos se cumplen se puede decir con seguridad que elEC50 es la dosis herbicida que reduce en un 50 % el crecimiento de una población.Ahora si las asíntota son diferentes (min>0), necesariamente debe utilizar un artificiomatemático que le permita obtener el valor de X cuando Y= 50; el cual lo obtiene de laecuación:

f = min + (max-min)/(1+(x/EC50)^Hillslope)

De estos tendría en el (Report 1), min: 0 ; max: 100; Hill slope: ver valor en el Report 1;EC50: ver valor en el Report 1; f: 50 ; y solo restaría despejar X de la ecuación, quedando de laforma siguiente:

La mayoría de los trabajos presentan errores en este sentido, lo cual genera valoreserrados de índice de resistencia (IR).

Otro punto que siempre se debe tener en cuenta es que al chequear las probabilidades delos parámetros antes citados, en algunos casos puede existir cierta anomalía (nosignificancia) en alguno de ellos. Considerando que en la mayoría de los casos se trabajancon poblaciones recolectadas en campo y ensayadas directamente, no es un asunto tangrave (claro está, aquí juega un papel importante la experiencia del investigador, pues al

hillslopef

Ex 1minminmax50

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ver los datos y la curva, se puede tomar la decisión de cuan grave puede ser el detallemencionado anteriormente), lo importante en un caso donde ocurra esto y se decida hacercaso omiso, es hacer mención en los resultados (pues así el lector hará su propio juiciosobre la veracidad de lo publicado).

Una vez chequeados los parámetros antes mencionados con la ventana (Graph 1)desplegada, mueva el ratón a las opciones que se encuentran en la parte superior de lapágina y seleccione (Graph) y una vez desplegada una pequeña ventana seleccione (CreateGraph), en la ventana (Create Graph type) debe seleccionar (Scatter Plot) y luego pulse(Next), en la siguiente ventana seleccione (Multiple Error Bars) y pulse (Next); en lasiguiente ventana en la sección (Symbol values) debe seleccionar (Worksheet Columns) ypulse (Next); en la siguiente ventana seleccione (XY Pairs). Ahora en la ventanadesplegada debe seleccionar en la sección (Selected Columns) (X1:), en ese momentomuévase a la página de los datos y sombree todos los valores colocados en la columna delas dosis; automáticamente queda seleccionada en la ventana pequeña (Y1:), en esemomento seleccione todos los valores colocados en la columna de los promedios; y luegole aparece en la ventana pequeña seleccionada también la opción (Y error 1:) y allísombrea en los datos la columna correpondiente al error estándar; y finalmente seleccione(Finish), produciéndose el siguiente gráfico (figura 4).

2D Graph 4

X Data

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

Col 1 vs Col 4

Figura 4. Errores estándar de valores hipotéticos.

Posteriormente, seleccionando el gráfico de los errores estándar, mueva el ratón a la partesuperior de la página principal y seleccione (Graph) y en esta ventana pulse (add plot),seleccione (line plot) y pulse (next), luego seleccione (Simple straight line) y pulse(next), luego selecciones (XY pair) y pulse (next), y posteriormente colocado sobre (X:)seleccione en la página (Data 1) toda la columna (6-X column), y repita la mismaoperación para (Y:) y selecciones toda la columna (7-Y column) y luego pulse (Finish).Inmediatamente le aparece sobre el gráfico de los errores estándar, un gráfico de líneasque representa los valores modelados (figura 5)

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2D Graph 4

X Data

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

Col 1 vs Col 4x column vs y column

Figura 5. Valores modelados y los respectivos errores estándar de los valores observadoshipotéticos.

Finalmente, seleccione el gráfico mostrado anteriormente y mueva el ratón a la partesuperior de la página principal y pulse (Graph), luego seleccione (Graph Properties) y enla parte superior de la ventana pulse (axes); en la parte superior en (Axis) seleccione (Xdata) y en la parte izquierda pulse (Scaling), inmediatamente vaya a la opción (Scale type)y seleccione (log common) y pulse (apply) y luego seleccione (Ok) (figura 6)

2D Graph 4

X Data

0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000

Y D

ata

0

20

40

60

80

100

120

Col 1 vs Col 4x column vs y column

Figura 6. Curva sigmoide de datos hipotéticos generados por regresión log-logistica decuatro parámetros con datos hipotéticos.

En esa misma ventana de (Graph Properties), se pueden modificar y personalizar todas lasopciones que se requieran.

Si se desean colocar en el mismo gráfico dos poblaciones, luego de graficar una, se repitela misma operación con otra población, considerando de los datos deben colocarse en lamisma hoja de datos y dar las instrucciones respectivas para que el programa pueda leerlas columnas apropiadas para los cálculos y gráficas.

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Referencias Bibliográficas