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Los marcadores moleculares como

herramienta multifuncional en la

conservación de recursos fitogenéticos de

origen silvestre

Departamento de Biología Vegetal. Universidad Politécnica de Madrid. Avda. de la Complutense, s/n. 28040 Madrid, España.

Trabajo financiado por el proyecto “Desarrollo y evaluación de estrategias de conservación de diversidad genética en bancos de germoplasma” Ref: 099/RN08/02.1 del MARM y la red REMEDINAL-2 (S2009/AMB-1783), de la Comunidad de Madrid.

M.L. Rubio Teso, C. Martín Fernández, J.B. Martínez Laborde, D. Draper Munt, M. E. González Benito & M. de la Cruz Rot.

V Congreso Biología de la Conservación de Plantas. 28 de Septiembre – 1 de Octubre de 2011.

Es Mercadal (Menorca)

Los marcadores moleculares como herramienta multifuncional en la conservación de recursos fitogenéticos de origen silvestre

Ø Introducción

Ø Resultados

ØMaterial y métodos

Ø Conclusiones

Índice

Fotografía: Julia Chacón Labella


Introducción

Planes de conservación in situ y ex situ

Biología de la reproducción

Estructura genética de las poblaciones

Garantizar representatividad de la diversidad total en los planes de conservación

Selección de poblaciones para la conservación in situ

Estrategias de recolección de germoplasma de origen silvestre


Introducción

Contrastar la validez de la metodología de recolección usualmente empleada en Bancos de Germoplasma para:

- Garantizar la representatividad de las muestras que se conservan

- Poder diseñar un modelo de muestreo que garantice una alta representatividad de la diversidad genética del material conservado

Objetivos:Objetivos:


Material y métodos

Tres especies silvestres del género Brassica

- B. barrelieri (L.) Janka

- B. oxyrrhina Coss.

- B. tournefortii Gouan.

• Alógama

•Autoincompatible

•2n =20

• Probablemente autógama

• Completamente autocompatible

• 2n = 18

•Probablemente autogama

• Completamente autocompatible

•2n = 20

Fotografía: Julia Chacón Labella

Fotografía: Mª Luisa Rubio Teso


Material y métodos

Toma de muestras

- B. barrelieri (L.) Janka

- B. oxyrrhina Coss.

- B. tournefortii Gouan.

• 11 poblaciones

• 20 individuos

• 10 poblaciones

• 20 individuos

• 9 poblaciones

• 20 individuos

600 individuos estudiados

Fotografía: Mª Luisa Rubio Teso


Material y métodos

- B. oxyrrhina Coss. - B. tournefortii Gouan.- B. barrelieri (L.) Janka

EspecieName population Locality

B. barrelieri BA1 Navalagamella (M)

B. barrelieri BA2 San Lorenzo de El Escorial (M)

B. barrelieri BA4 Colmenarejo (M)

B. barrelieri BA16 San Felices de los Gallegos (Sa)

B. barrelieri BA21 Santa Amalia (Ba)

B. barrelieri BA23 Campanario (Ba)

B. barrelieri BA26 Velada (To)

B. barrelieri BA27 Don Gil (Cc)

B. barrelieri BA29 Palacio de Doñana (Hu)

B. barrelieri BA33 Valdemorillo (M)

EspecieName population Locality

B. oxyrrhina OX1 Toril (Cc)

B. oxyrrhina OX3 La Mazagosa (Cc)

B. oxyrrhina OX5 Velada (To)

B. oxyrrhina OX6 Velada (To)

B. oxyrrhina OX7 Palacio del Acebrón (Hu)

B. oxyrrhina OX10 Simancas (Va)

B. oxyrrhina OX11 Madina del Campo (Va)

B. oxyrrhina OX12 Villanueva del Duero (Va)

B. oxyrrhina OX13 Toro (Za)

B. oxyrrhina OX14 Toro (Za)

Especie Name population Locality

B. tournefortii TF2 Playa de los genoveses. Cabo de gata. (Al)

B. tournefortii TF3 Parque Natural Punta Sabinar (Al)

B. tournefortii TF4 Carretera de Sorbas a Tabernas. Cruce Venta de los Yesos (Al)

B. tournefortii TF5 Cartagena. Salinas del Rassall. Parque Natural de Calblanque. (Mu)

B. tournefortii TF6San Pedro del Pinatar. Parque Natural Salinas de San Pedro del Pinatar (Mu)

B. tournefortii TF7 Laguna de la Mata. Torrevieja (A)

B. tournefortii TF8 La Marina. Santa Pola (A)

B. tournefortii TF9 Matalascañas. Parque Dunar (Hu)

B. tournefortii TF13 Parque Natural de El Saler (V)


Material y métodos

Procesado muestras

- Desecación en gel de sílice

- 20 mg tejido de hoja peso seco

-Conservación – 80 º C


Material y métodos

Caracterización Molecular

- Extracción ADN

- Preparación soluciones de trabajo

- Técnicas basadas en PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Electroforesis en gel de agarosa

- Tinción bromuro de etidio y visualización UV


Material y métodos

Caracterización molecular:

- RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA)

- 11 cebadores

OPA-11 CAATCGCCGT

OPB-07 GGTGACGCAG

OPB-15 GGAGGGTGTT

OPD-11 AGCGCCATTG

OPF-01 ACGGATCCTG

OPF-03 CCTGATCACC

OPF-04 GGTGATCAGG

OPF-10 GGAAGCTTGG

OPO-05 CCCAGTCACT

OPO-07 CAGCACTGAC

OPO-20 ACACACGCTG


Análisis de datos

MATRIZ AUSENCIA/PRESENCIA à para cada especie

Material y métodos


Análisis de datos

• Matriz de similitud à Índice de DICE

Ø Agrupamiento UPGMA

• ESTIMACIÓN DE LA DIVERSIDAD

ØÍndice de Shannon

à Diversidad media INTRA poblacional

à Diversidad total

R (version 2.13.1)

Material y métodos


Resultados y discusión

Análisis de datos

B. barrelieri: 50 marcadores:

4 monomórficos (8%)

46 polimórficos (92%)

B. oxyrrhina: 37 marcadores:



B. tournefortii: 44 marcadores:



ba29

ba29

ba29

ba29

ba29

ba29

ba29

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2ba

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33ba

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23ba

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33ba

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16ba

27

0.2

0.4

0.6

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t



Análisis de datos

ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. barrelieri

BA1

BA2

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BA8

BA16

BA21

BA23

BA26

BA27

BA29

BA33



Análisis de datos

ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. oxyrrhinaO

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40.0

0.1

0.2

0.3

0.4

He

igh

t

OX1

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OX13

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TF

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6T

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TF

6T

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8T

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3T

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F3

TF

3T

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TF

3T

F3

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2T

F2

TF

2T

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TF

2T

F2

TF

2T

F2

TF

2T

F2

TF

2T

F2

TF

2T

F2

TF

3T

F3

TF

3T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

F4

TF

4T

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TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F7

TF

7T

F8

TF

8T

F8

TF

8T

F8

TF

8T

F8

TF

80.0

0.1

0.2

0.3

0.4

He

igh

t



Análisis de datos

ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTO: UPGMA B. tournefortii

TF2

TF3

TF4

TF5

TF6

TF7

TF8

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OX13



Dive

rsid

ad e

stim

ada:

B. b

arre

lieri

Índice de Shannon para cada especie: (Ho= -∑pilog2pi)

BA1 11.934818

BA2 9.142491

BA4 11.537017

BA8 7.987262

BA16 10.070703

BA21 10.747052

BA23 9.178620

BA26 10.935556

BA27 13.199072

BA29 5.984194

BA33 10.673030

OX1 1.951313

OX3 2.866568

OX5 1.005127

OX6 2.693872

OX7 1.238758

OX10 1.658081

OX11 3.958894

OX12 3.042601

OX13 3.541621

OX14 3.295887

TF2 2.1107755

TF3 3.5278684

TF4 5.5214580

TF5 1.3708709

TF6 1.3336613

TF7 0.9636811

TF8 4.0731343

TF9 2.4312890

TF13 1.4709515

Dive

rsid

ad e

stim

ada:

B. o

xyrr

hina

Dive

rsid

ad e

stim

ada:

B. to

urne

fort

ii

Análisis de datos



Análisis de datos

B. barrelieri B. oxyrrhina B. tournefortii

Diversidad media INTRAPOBLACIONAL de las poblaciones (Hpop)

10.1263469 2.3639742 2.3643702

Proporcion de la diversidad INTRA poblacional (Hpop/Hsp)

0.6071024 0.4243881 0.2846649

Proporcion de la diversidad INTER poblacional(Hsp-Hpop)/Hsp

0.3928976 0.5756119 0.7153351

Diversidad total (Hsp)

16.6798018 5.5703115 8.3058015


Conclusiones

1. Los marcadores moleculares de tipo RAPD son adecuados para estudios de estimación de diversidad genética

2. La altísima diversidad hallada en el caso de B. barrelieri difícil su análisis y por ello se sugiere el uso de otro tipo de marcadores más específicos para completar y ampliar los resultados obtenidos

3. Los índices de diversidad hallados para cada especie son elevados, lo cual confirma la utilidad de los marcadores moleculares para el diseño de los planes de conservación, ya sean ex situ o in situ.

4. Los patrones de bandas obtenidos están condicionados por el tipo de reproducción de la especie (alogamia/autogamia), lo cual pone de manifiesto la capacidad de los marcadores moleculares de tipo RAPD para estudiar las estrategias reproductivas de las especies.

GRACIAS POR SU ATENCIÓN

Foto

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Trabajo financiado por el proyecto “Desarrollo y evaluación de estrategias de conservación de diversidad genética en bancos de germoplasma” Ref: 099/RN08/02.1 del MARM y la red REMEDINAL-2 (S2009/AMB-1783), de la Comunidad de Madrid.

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