Los contamienantes emergentes en los sistemas de ... · Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y...

Los contaminantes emergentes en los sistemas

de saneamiento y sus efectos ambientales

Damià Barceló, M. José Lopez de Alda, Mira Petrovic, Silvia Lacorte, Benjamí Piña, M.D. Hernando Department de Quimica Ambiental, IIQAB-CSIC, Barcelona

Antoni Ginebreda Agencia Catalana de l’Agua

Resumen

� Contaminantes emergentes � Clases y compuestos � Disruptores endocrinos (EDCs)

�Integración de análisis químicos y biológicos (RYA) � Ensayo con cepas de levaduras recombinantes � Inducción de la síntesis de vitelogenina en peces

Análisis

�

� Integración del análisis químico de EDCs y de la actividad estrogénica medida por RYA en la cuenca del Llobregat

� Integración del análisis químico de EDCs y de la inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas en los ríos Cardener and Anoia

Aplicación del método

� Conclusiones

Nuevos y más sensibles métodos de análisis químicos y biológicos

Nuevos Contaminantes Orgánicos (Emergentes)

Def.: contaminantes previamente desconocidos o no reconocidos como tales cuya presencia en el medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la

preocupación por las posibles consecuencias de la misma

Línea prioritaria de investigación (OMS, EPA, UE)

Poco o no investigados Escasez/ausencia de datos ambientales

Falta de métodos analíticos

...........No regulados...........

Elevada producción y consumo fi continua introducción en el medio ambiente: no necesitan ser persistentes para ocasionar efectos negativos.

Contaminantes orgánicos emergentes

� Retardantes de llama (difenil éteres polibromados) � Detergentes de tipo alquilfenol etoxilado y derivados

2455/2001/ECParafinas cloradas � Ftalatos

� Compuestos organoestánnicos Subproductos de desinfección del agua potable

� Productos de transformación de pesticidas

Ya legislados Datos nuevos

Metil tert-butil éter y otros aditivos de la gasolina Surfactantes perfluorados (PFOA, PFOS)

� Fármacos Productos para el cuidado y la higiene personal Toxinas de algas

� Bisfenol A

No legislados Datos insuficientes

. . . . � Disruptores endocrinos

*Susan D. Richardson (2004) Anal. Chem. 76, 3337-3364.

:

Compuestos disruptores endocrinos (EDCs)

� Los EDCs son compuestos sintéticos o productos naturales que interfieren en el sistema endocrino (hormonal)

� El Sistema Endocrino produce hormonas que guían el desarrollo, crecimiento, reproducción, y comportamiento de humanos y animales

Mucha documentación de efectos Efectos sospechosos en humanos en organismos del medio natural:

• Malformaciones en recién nacidos • Disminución de la fertilidad y el • Problemas en los testículos

crecimiento • Esperma anormal y pobre • Alteraciones sexuales • Funcionamiento tiroideo anormal • Problemas en las cáscaras de los • Posible cáncer de testículos

huevos • Cáncer de próstata • Funcionamiento tiroideo anormal • Otros efectos

)

Surfactantes de tipo alquilfenol etoxilados

O OH

R n

n=1-20

OH

R

O OH

R

n

n=1-2

n OCH2COOHO

R

Análisis:Análisis: GC-MS-MS (deriv.), LC-MS-MS

Alquilfenol etoxilados (APEOs)

APEOs de cadena corta

Alquilfenoles (APs)

Alquilfenoxi carboxilados

(APECs)

Petrovic M y col. (2003) Environ. Sci. Technol. 37, 4442-4448

- Detergentes en formulaciones industriales (textil, curtidos, papeleras - Coadyuvantes de pesticidas - Ingredientes de pinturas - Agentes humectantes

Productos de degradaciónProductos de degradación aeróbica y anaeróbicaaeróbica y anaeróbica

Niveles enNiveles en - aguas: ng-mg-mg/L - sedimentos: mg/Kg - lodos: mg/Kg - biota: ug/Kg

EfectosEfectos estrogénicosestrogénicos: 1-20 mg/L (NP and NP1EO)

Directiva 2455/2001Directiva 2455/2001 Nonilfenoles; 4-p-Nonifenol Octilfenoles, p-t-Octilfenol

Fármacos en el medio ambiente acuático

Analgésicos/antiinflamatorios: paracetamol, ác. acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenac

Antibióticos: - Macrólidos: claritromicina, dehydroeritromicina, roxitromicina, lincomicina

- Sulfamidas: sulfametoxazol, sulfadimetoxina, sulfametacina, sulfatiazol

- Fluoroquinolonas: ciprofloxacina, norfloxacina, enrofloxacina

- Tetraciclinas: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina

... cloranfenicol, tilosin, trimetoprim Antiepilépticos: carbamazepina, primidona

b-Bloqueantes: metoprolol, propanolol, bisoprolol, betaxolol, nadolol, sotalol

Reguladores de lípidos: ácido clofíbrico, bezafibrato, gemfibrozil, ác. fenofíbrico

Medios de contraste en rayos-X: diatrizoato, iohexol, iopamidol, iopromide, iomeprol

Citostáticos (quimioterapia): ifosfamida, ciclofosfamida

Anticonceptivos orales: etinilestradiol, mestranol Esteroides: coprostanol, estradiol, progesterona, testosterona. Broncodilatadores, tranquilizantes, antihistamínicos, barbitúricos, antidiabéticos...

NIVELES: ng-mg/L; mg-g/Kg Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17.

Fármacos más problemáticos/ menos estudiados1

Antibióticos2: � Resistencia bacteriana - 2/3 en medicina humana: posición 3. - 1/3 en medicina veterinaria: 70%

Citostáticos: � Prop. Carcinogénicas Poca eliminación en STP �niveles, destino, y riesgos

Anticonceptivos orales: � Efectos estrogénicos a ~ 1ng/L �Medio marino, sedimentos y fangos

Medios de contraste en rayos-X: � Persistencia Poca eliminación en STP Aguas subterráneas �Metabolitos

.

U.S. EPA Contaminants Canditate List (CCL)3

Diclofenac (antirreumático) Carbamazepine (antiepiléptico) Análisis: Chloramphenicol (antibiótico) LC-UV-FL

LC-MS fi LC-MS-MS 1Heberer T (2002) Toxicol. Lett. 131, 5-17. 2 Thiele-Bruhn S (2003) J. Plant Nutr. Soil Sci. 166, 145-167. GC-MS fi GC-MS-MS 3 http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html

http://www.epa.gov/OGWDW/ccl/cclfs.html

- -

Environmental samples

Estrogenicity screeningRecombinant yeast assay (RYA)

HPLC fractionation


SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)

Environmental samples



SPE -C18 (aqueous samples)PLE (solid samples)

Procedimiento integrado de análisis químicos y ensayos biológicos

Muestras ambientales Extracción de componentes activos

SPE-C18 (muestras acuosas) PLE (muestras sólidas)

Extractos Medida de la estrogenicidad (vitelogenina)

Ensayo levaduras recombinantes (RYA)

Cor

rela

ción

y c

uant

ifica

ción

de

fact

ores

caus

ativ

os

Análisis de compuestos diana

por LC-MS

Actividad positiva

Fraccionamiento HPLC

Medida de la estrogenicidad (vitelogenina) Ensayo levaduras recombinantes (RYA)

Fracciones activas

Identificación de comp. desconocidos por LC MS MS

Chemical analysis

Muestras agua

Filtración Off-line On-line (steroids)

SPE (ASPEC) LiChrolut RP-18

SPE (PROSPEKT) PLRP-s

N2 evaporación

LC-MS/(MS)

Muestras sólidas (sedimentos/lodos)

LyophilizationLiofilización

Ultrasonic extraction

Rotary evaporation

Extracción con fluídos presurizados

Rotavapor

Purificación (clean-up)

SPE Sep-Pak C18 Plus (esteroides) LiChrolut RP18 (alquilfenoles)

N2N2 evaporación

LC DAD MSLC-MS/(MS)

Análisis químico – compuestos diana

1. etoxilado (OPEO) y sus productos de degradación nonilfenol (NP), octilfenol (OP), y derivados carboxilados (NPEC y OPEC), respectivamente.

2. Bisfenol A (BPA)

3. Ftalatos (DMP- dimetil ftalato; DEP – dietil ftalato, DBP - dibutil ftalato, BBP - butil bencil ftalato, DEHP-di(2-etil-hexil) ftalato)

4. Hormonas sexuales esteroidales naturales y compuestos sintéticos relacionados (E1-Estrona; E2- b-estradiol , E3-Estriol, EE- etinil estradiol, DES-Dietilestilbestrol, PRO-Progesterona, NOR-Noretindrona, LEV-levonorgestrel)

5. Benzotiazoles (HOBT. 2-hidroxibenzotiazol)

Detergentes no iónicos, nonilfenol etoxilado (NPEO), y octilfenol

Ensayo con cepas de levaduras recombinantes (Recombinant Yeast Assay, RYA)

� Basado en una cepa de levadura que expresa el receptor humano de estrógenos (hER) y un gen de ensayo (ßgalactosidasa) cuya expresión depende de la activación del receptor del hER.

� La actividad b-galactosidasa se mide fácilmente con substratos cromogénicos o fluorogénicos y depende de la presencia de ligandos del hER, por lo que puede ser tomada como indicadora de actividad estrogénica.

� Todo el ensayo puede ser llevado a cabo en placas de ensayo de 96 pocillos

Concentration efectiva media (EC50) y factor de estrogenicidad relativa obtenida para diferentes compuestos por RYA

Vitelogenina en plasma: Western blot

Cyprinus carpio

Extracción de sangre: 2 ml jeringa heparinizada + Aprotinina

Obtención plasma: Centrifugaciónn 1,000 g x5’

SDS-PAGE análisis: PAb anti-conejo (Biosense, Norway)

APLICACIONES

Integración de análisis químicos de EDCs y ensayos con cepas de levaduras recombinates para la determinación de actividad estrogénica

Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat

Integración de análisis químicos de EDCs e inducción de la síntesis de vitelogenina en carpas

Análisis de EDCs en estaciones de depuración de aguas residuales (EDAR) catalanas y en los ríos receptores de los efluentes (aguas y sedimentos fluviales).

Area de estudio: Cataluña

Mapa con los puntos de muestreo en la cuenca del Llobregat.

Números 1 al 10 indican los puntos de muestreo de aguas. Letras A a la D corresponden a la localización de las EDAR.

Zonas en gris indican la localización de las poblaciones próximas a las EDAR: A-Manresa; B-Terrassa , C-Igualada; D-Martorell.

-

Puntos Río OP NP BPA NPEO1 NPEO2 DEP DEHP DBP Aguas superficiales

1 Llobregat < 0.09 0.22 0.09 < 0.22 < 0.06 1.45 < 0.20 0.6 2 Llobregat < 0.09 < 0.15 0.09 < 0.22 0.61 1.5 < 0.20 0.34 3 Cardener < 0.09 0.39 < 0.09 3.22 2.53 6.85 < 0.20 0.3 4 Llobregat < 0.09 0.26 < 0.09 1.19 1.2 0.54 < 0.20 0.47

5a Llobregat 0.09 0.5 0.27 < 0.22 0.39 1.26 0.82 1 5b Llobregat < 0.09 0.45 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.05 3.09 1.3

6 Anoia < 0.09 1.23 < 0.09 < 0.22 < 0.06 0.85 0.65 < 0.19 7 Anoia < 0.09 0.53 0.12 < 0.22 1.27 0.58 0.45 < 0.19 8 Llobregat 0.26 2.57 0.11 3.54 1.17 0.46 0.31 < 0.19 9 Rª de Rubí 21.9 37.3 0.85 6.87 3.17 0.4 0.77 < 0.19

10 Llobregat 2.57 13.9 2.97 < 0.22 < 0.06 0.22 < 0.20 < 0.19

Aguas resid. EDAR EDAR A Inf Manresa 0.17 17.1 0.94 19.3 5.56 1.62 3.17 0.07 EDAR A Efl Manresa < 0.09 2.99 0.34 9.53 8.97 0.93 1.34 < 0.19 EDAR B Inf Terrasa 0.08 29.8 < 0.09 < 0.22 < 0.06 12.97 0.26 0.83 EDAR B Efl Terrasa < 0.09 0.8 < 0.09 10.6 9.69 10.21 0.23 < 0.19 EDAR C Inf Igualada 0.24 44.8 6.98 2.37 5.61 3.19 0.82 8.86 EDAR C Efl Igualada < 0.09 1.24 < 0.09 < 0.22 < 0.06 2.25 1.12 < 0.19 EDAR D Inf Martorell 0.18 11.9 < 0.09 3.8 0.82 1.06 1.9 0.35 EDAR D Efl Martorell 0.09 0.89 < 0.09 < 0.22 3.87 0.56 0.33 < 0.19

LOD (mg L-1) 0.09 0.15 0.09 0.22 0.06 0.2 0.2 0.19

Concentraciones en mg/L de diferentes EDCs analizados por LC MS

Cálculo de equivalentes de estradiol a partir de los resultados RYA.

Los círculos negros, los blancos, y los triángulos representan los valores relativos de ß-galactosidasa, obtenidos a diferentes factores de dilución, en el agua residual de entrada de la EDAR de Manresa, en el agua de salida, y en un punto de muestreo próximo a ésta (el 3), respectivamente.

Las funciones sigmoidales se calcularon mediante métodos de regresión no-lineal. Las líneas gruesas continua y discontinua corresponden a las aguas de entrada y de salida de la EDAR de Manresa, y la línea fina discontinua a la muestra de agua en el punto 3.

Valores totales de estrogenicidad en equivalentes de estradiol para muestras de aguas residuales (izquierda) y de aguas de río (derecha).

Correlación entre los valores totales de estrogenicidad (en eq. E2) obtenidos por RYA (eje X) y los estimados a

partir de la composición química de las muestras (eje Y).

APLICACIONES


Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de fármacos en la cuenca del río Llobregat



AreaArea de estudio:de estudio: CataluñaCataluña

DetecciónDetección dede fármacosfármacos

ACIDO CLOFIBRICOACIDO CLOFIBRICO

ACIDO ACETILSALICILICOACIDO ACETILSALICILICO

DICLOFENACDICLOFENAC

EDAR ABRERAEDAR ABRERAEDAR ABRERA LlobregatLlobregat riverriver

CardonaCardona 150150150 ngngng/L/L/LRIO ANOIARIO ANOIA CardenerCardener riverriver 100100100 150150 505050ngng/L/L100100 000

5050

00 ManresaManresa

NN

MediterraneanMediterranean SeaSea

AnoiaAnoia riverriver

(2)(2) LlobregatLlobregat riverriver EDAR RUBIEDAR RUBIEDAR RUBIIgualadaIgualada 111202020000 ngngng/L/L/L

100100100 (4)(4)

505050AbreraAbrera (1)(1) 000MartorellMartorell

RIO LLOBREGATRIO LLOBREGAT

Sant Joan DespíSant Joan Despí 150150150BarcelonaBarcelona ngngng/L/L/L(3)(3) 100100100 505050 000

00 25 km25 km


Concentraciones en ng/L de fármacos

� Octubre 2003 Fármacos

Muestras Diclofenac Ac. clofíbrico

Ac. acetilsalic ílico

Distribució zona Ter - - -MPATSA - 24.5 -EDAR Abrera - 40 31.5 Anoia final - - -Llobregat abans Anoia - 35 -Llobregat després Anoia - 14 -Edar Rubí 1200 107 50 Aigua tractada ETAP Abrera - - -Llobregat captació ETAP SJD - - -Aigua tractada ETAP SJD - - -


Concentraciones en ng/L de fármacos

� Abril 2004

Muestras

ETAP Cardedeu aigua tractada

MPATSA, 28-04-04, 10:00

EDAR de Abrera, 28-04-04, 10:30

Llobregat abans Anoia, 28-04-04, 11:00 Anoia final, 28-04-04, 11:30

EDAR Martorell, 28-04-04, 12:00

ETAP Abrera (aigua tractada), 28-04-04, 12:40 Llobregat després Anoia, 28-04-04, 14:30 Abocament ETAP (SJD), 28-04-04, 15:15

Captació ETAP SJD, 28-04-04, 17:00

Aigua tractada ETAP SJD

Ibuprofen

--

134.30

27.42

127.20

53.70

-

30.50

-

17.46

-

Diclofenac

---

240.68

11.8

31

134

-

14.40

-

-

-

Ácido clofíbrico

----

-

--

-

-

-

-

-

Atenolol

-----

---

-

-

-

-

MAPTSA

3

Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

MUESTRAS pH ACIDO

0

5

10

AIGUA TR

ACTADA ET

AP ABRER

A 3

EDAR SO

RTIDA ABRER

A 3

DISTRIBUC. Z

ONA 3

LLOBREG

AT ABANS A

NOIA 3

ANOIA FI

NAL 3

EDAR RUBI 2

AIGUA TRACTA

DA ETAP S

JA 3

LLOBREG

AT DES

PRES

2 BLANC

BLANC OH-

BLANC H+

UN

IDA

DE

S 1:30

1:90

1:270

1:500

Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de las muestras extra ídas a pH ácido.

Area de estudio: Cataluña – Ensayo RYA

CONTROL POSITIVO

0

500

1000

1500

0 0 0 0

GENIST

EINA 228

ENTE

ROLACTO

NA

UN

IDA

DE

S

1:30

1:90

1:270

1:500

Fig. Gráfico de unidades ß- galactosidasa de control positivo (Genisteína 1.9 mM) y negativos (0). Véase la diferencia de escala con respecto a la anterior figura.

APLICACIONES


Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat Análisis de EDCs en la cuenca del río Llobregat



Mar Mediterráneo

Río Anoia

Río Cardener

Río Llobregat

A1

A2 A3

C1 C2

C3

Barcelona

EDAR1 EDAR2

EDAR3

EDAR4

0 30 60 km

�N

C1-C3

Spain

A1-A3,


Agua Sedimento

Pez (Cyprinus carpio) sangre, hígado, bilis, tejido

(130 machos adultos, 116 hembras de carpas)

SEDIMENT

Variación temporal de las concentraciones de compuestos nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Anoia

50

40 AGUA

30 mg/L

20 NPEO10 NP1EC0 NP

0

200

I III V VII

50 mg/kg 5040400

30 40600 AGUA20 30 800 mg/L10 20

0 10 I III V VII 0

Río Anoia

Río Llobregat

A1 A2 A3 Barcelona

EDAR1 EDAR2

EDAR3

SEDIMENTo mg/L AGUA

I III V VII0 0

200 mg/kg 200

400 mg/kg 400

600 SEDIMENTO 600 SEDIMENTO 800 800

Variación temporal de las concentraciones de compuestos nonilfenólicos en aguas y sedimentos del río Cardener

10

8

6m g/L 4

2

0 I

0

100 mg/kg

200

300

400

400

NPEO NP1EC NP

Río Cardener

Río Llobregat

C1

C2 C3

Barcelona

STP

m

SEDIMENTO

0

100

200

300

g/kg

0 2 4 6 8

10

I III V VII

mg/L

AGUA

0 2 4 6 8

10

I III V

mg/L

AGUA

0

100

200

300

400

mg/kg

SEDIMENTO

AGUA

III V VII

SEDIMENTO

VII

Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y sedimentos del río Anoia

0

5

10

15

20

25

A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3

ng/L

E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO

Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000 0

1

2

3

4

ng/g

E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO22.8

Variación temporal de las concentraciones de esteroides en aguas y sedimentos del río Cardener

0

5

10

15

20

25

30

C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3

ng/L

E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO

71.1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ng/g

E3 E2 EE E1 DES NOR LEV PRO11.8

Enero 2000 Marzo 2000 Mayo 2000 Julio 2000

Niveles de vitelogenina, en mg/mL de plasma, en carpas macho (Cyprinus carpio) del río Anoia

ControlAnoia A1 A2(7:3)

(4)

(6) (4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* * *

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120

VTG

( g/

ml p

lasm

a) A3

Enero Marzo Mayo Julio

Correlación entre la concentración de VTG en plasma y la concentración de NP en agua de río

16

14

12

10

mg NP/L 8

6

4

2

0 0 20 40 60 80

mg VTG/mL plasma

R = 0.82

Anoia

(4)

(7:3)

(6)(4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* **

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120V

TG (

g/m

l pla

sma)

January March May July

A1A2A3

Control

Cromatograma obtenido en el análisis off-line de etinil estradiol por LC-NI-ESI-MS-MS (295>145) en un sedimento tomado en una

zona en donde se observó una alta incidencia de peces intersex y de niveles de vitelogenina.

21 22 23 24 25 26

6500

7000

7500

8000

8500

9000

9500 Etinil estradiol

Tiempo (min)

Abu

ndan

cia 22.8 ng/g sedimento A2

MRM

VTG-Anoia

(4)

(7:3)

(6) (4)

(9) (6) (3)

(6)

x100

* * *

(10:4)

(4) (5)

(6)

0

40

80

120V

TG (

mg/m

l pla

sma)

Enero Marzo Mayo Julio

A1 A2 A3

Control

Conclusiones/propuestas para la mejora de la calidad del agua en Cataluña

- Mejor depuración de las aguas residuales urbanas - Incremento significativo del tratamiento terciario en la depuración de

aguas residuales urbanas - Reutilización creciente de aguas depuradas - Tratamiento separado, y diferenciado desde el origen, de las aguas

de procedencia industrial - Máxima reutilización del agua industrial mediante circuitos cerrados y

autodepurados - Implementar la calidad integral de las aguas promoviendo programas

de vigilancia ambiental para los contaminantes emergentes de forma que se garantice la conservación del medio acuático natural, la gestión integral de los recursos hídricos, la eficacia en el uso del agua y la reutilización de la misma.

AgradecimientosAgradecimientos

Projecto de la UE P-THREE (EVK1-CT-2002-00116) (Removal of Persistent Polar Pollutants Through Improved Treatment of Wastewter Effluents)

Ministerio de Ciencia y Tecnología (PPQ2002-10945-E)

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