Llevats no-Saccharomyces: Noves aplicacions enològiques. AEB Iberica SA

Levaduras no-Saccharomyces : nuevas aplicaciones enológicas

XXVIè Congrés i la nit de l’enologia de l’ACE

Arnes, 17 – 18 Abril 2015

Arnaud DELAHERCHE

1

Ecología de las levaduras no-Saccharomyces

XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona

• Uva : principal contenedor natural de las levaduras

enológicas indígenas.

• Poblaciones elevadas sobre las uvas sobre-maduradas o sobre racimos alterados

por podredumbre (ej : Botrytis) pueden alcanzar 105 et 107 UFC/g (Barata et al., 2008;

Nisiotou & Nychas, 2007).

• Evolución de las poblaciones : - Volumen de la superfície de la baya

- Disponibilidad y contenido de nutrientes

- La concentración en azúcar aumenta y la acidez

disminuye (Cadez et al., 2010; Combina et al., 2005).

• Las especies de levaduras presentes sobre la superície de las bayas son limitadas

en número.

• La densidad de las levaduras evoluciona en el curso de la maduración de la uva.

2



Figura 1: Población de levaduras

totales sobre bayas de uva Merlot y

de Cabernet-Sauvignon en diferentes

estadios fenológicos desde añada

2004 (Renouf, 2006).

Población total de levaduras

Figura 2: Población de levaduras

totales sobre uva tinta (Merlot y

Cabernet-Sauvignon) en función de tres

campañas (Renouf, 2006).

Población total de levaduras

3



• A nivel mundial, las diferentes especies de levaduras no-Saccharomyces aisladas

sobre uva o sobre mosto de uva en función de la variedad que se encontraron :

- 90 especies diferentes con 29 géneros distintos, aisladas a partir de

44 variedades de uva.

- 51 especies de levaduras N-S pertenecientes a 21 géneros distintos,

según (Renouf et al., 2007).

• Las levaduras que se aislaron a partir de uvas o mosto de vino de 6 variedades

diferentes (Merlot, Cabernet-Sauvignon, Cabernet-Franc et Petit Verdot, Sémillon

et Sauvignon Blanc), son :

Aureobasidium, Auriculibuller, Brettanomyces,

Bulleromyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces,

Hanseniaspora, Issatchenka, Kluyveromyces, Lipomyces,

Metschnikowia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula,

Sporidiobolus, Sporobolomyces, Torulaspora, Yarrowia,

Zygoascus, et Zygosaccharomyces.

4

Ecología de las levaduras non-Saccharomyces


• Les especies de levaduras N-S presentes en la superfície de la uva varian

notablemente durante el transcurso de la maduración. Desde el envero a la

maduración se observa: una sucesión de especies de estas levaduras.

• Hanseniaspora uvarum : especie predominante que representa entre el 50-75%

de la población leviforme total sobre uva madura (Pretorius, 2000).

Otras especies pertenecientes a los géneros Candida, Metschnikowia y Pichia

estan presentes en proporciones más bajas (Barata et al., 2012; Pretorius et al., 1999; Fleet,

1998).

• Bayas de uva dañadas : en las que hay un aumento de la concentración de azúcar

en la superfície, favorecen el desarrollo de levaduras Ascomycetos con una

elevada actividad fermentativa como Pichia spp., Candida hellenica y otras

levaduras de contaminación como Zygosaccharomyces spp.

5


Figura 3 : Evolución de las levaduras en el

transcurso de la FA en Blanco (A) y en Tinto (B) (Xufre et al., 2006).

• Sucesión de especies durante los

diferentes estadios de la FA :

Un modelo de evolución similar.

Saccharomyces cerevisiae

se convierte en mayoritario.

Dinámica de las levaduras indígenas durante la FA

6


Dinámica de las levaduras indígenas durante la FA

Maceración pre-fermentativa : Hanseniaspora, Candida, Metschnikowia y Pichia

estan presentes en gran número (Zott et al., 2008).

Figura 4 : Evolución de las levaduras totales y N-S en

maceración pre-fermentativa y durante la FA (Zott et al., 2010).

7

Impacto de las levaduras no-Saccharomyces sobre

las características organolépticas del vino


• Rol potencial sobre la calidad organoléptica, dotándola de más

complejidad aromática (Kim et al., 2008; Viana et al., 2008; Ciani et al., 2010;

Comitini & Ciani, 2011; Medina et al., 2013) = pull de aromas deseable.

• Algunas levaduras pueden ser el orígen de defectos olfactivos producidos

durante la fermentación y/o durante la crianza.

- levaduras de alteración : Pichia membranifaciens,

Candida, Zygosaccharomyces et Brettanomyces, pueden producir

Compuestos como el ácido acético, fenoles, sulfuro de hidrógeno.

(Chatonnet et al., 1995; Dias et al., 2003; Suárez et al., 2007).

Es necesario estudiar y seleccionar las levaduras N-S con

características enológicas positivas.

8

Puesta en marcha de un vasto programa de

selección de levaduras N-S

Ecole doctorale Environnements SantéTESIS DOCTORAL

Discipline : Sciences de l’alimentation

Spécialité : Microbiologie- Œnologie

Presentada por

Mohand SADOUDI

Interés biotecnológico de las levaduras indigènas

no-SaccharomycesLaboratoire d’accueil : Institut Jules Guyot – uB

Direction de Thèse :

R. TOURDOT-MARECHAL, Directrice de thèse -UMR PAM – équipe VAlMis

H. ALEXANDRE, co-encadrant de thèse - UMR PAM – équipe VAlMiS

S. ROUSSEAUX, co-encadrante de thèse - UMR PAM – équipe VAlMiS

XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona 9


Estudio de la biodiversidad y seleccion de levaduras N-S

• El OBJETIVO PRINCIPAL: Encontrar cepas de levaduras N-S con un potencial

enológico.

• Emplazamientos del estudio (Bourgogne) : Nuit Saint-Georges, Vosne Romanée,

Sancerre, Mâcon et Beaune.

Figura 5 : Protocolo de

aislamiento de las

diferentes especies de

levaduras.

10

Estudio de la biodiversidad y seleccion de levaduras N-S


18s 28s 5,8s ITS1 ITS2

ITS1

ITS4

• Identificación genética de las diferentes especies de levaduras aisladas :

- PCR ITS-RFLP

- Amplificación de la región codificante por el ARNr-5,8S-ITS.

• Resultados : - 1028 cepas de levaduras pertenecientes al género

Saccharomyces y N-S fueron aisladas.

- 17 géneros y especies diferentes.

11

Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S


Cepas diferentes aisladas e

identificadas

Numero %

Candida californica 05 0,5

Candida ishiwadae 02 0,2

Candida oleophila 12 1,2

Candida zemplinina 58 5,6

Cryptococcus flavescens 04 0,4

Hanseniaspora uvarum 658 64,0

Kluyveromyces thermotolerans 02 0,2

Metschnikowia aff. fructicola 03 0,3

Metschnikowia pulcherrima 02 0,2

Metschnikowia sp. 93 8,9

Metschnikowia viticola 01 0,1

Pichia fermentans 03 0,3

Pichia fluxuum 04 0,4

Pichia membranifaciens 28 2,7

Rhodotorula fijisanenesis 01 0,1

Torulaspora delbrueckii 07 0,7

Total N-S 883 85,9

Saccharomyces cerevisiae 145 14,1

Total 1028

Tabla 1: Número de cepas en función del género y especie.

12



• Sobre 883 cepas de levaduras no-Saccharomyces aisladas, 46 cepas fueron

escogidas para una caracterización de su potencial enológico.

Cepa a probar numero

Candida californica 02

Candida ishiwadae 02

Candida oleophila 05

Candida zemplinina 10

Hanseniaspora uvarum 01

Kluyveromyces thermotolerans 02

Metschnikowia aff. fructicola 03

Metschnikowia pulcherrima 02

Metschnikowia sp. 10

Metschnikowia. viticola 01

Pichia fermentans 01

Pichia membranifaciens 05

Torulaspora delbrueckii 02

Total 46

Tabla 2 : Número unitario y numero total de cepas

escogidas para una caracterización de su potencial

enológico.13



• Estudios de las características enológicas de las diferentes cepas :

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 S

uc

res

(g

/L)

Po

pu

lati

on

(L

og

ce

llu

les

via

ble

s/m

L)

Temps (jours)

PB2023 Glucose Fructose

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Su

cre

s (

g/L

)

Po

pu

lati

on

(L

og

cell

ule

s v

iab

les/m

L)

Temps (jours)

BBMV 3FA5 glucose fructose

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Su

cre

s (

g/L

)

Po

pu

lati

on

(L

og

ce

llu

les v

iab

les

/mL

)

Temps (jours)

BBMCZ 7FA20 glucose fructose

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Su

cre

s (

g/L

)

Po

pu

lati

on

(L

og

ce

llu

les v

iab

les

/mL

)

Temps (jours)

BA1-11 glucose fructose

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

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5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Su

cre

s (

g/L

)

Po

pu

lati

on

(L

og

ce

llu

les v

iab

les

/mL

)

Temps (jours)

BBS 2-4 glucose fructose

0

20

40

60

80

100

120

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Su

cre

s (

g/L

)

Po

pu

lati

on

(L

og

ce

llu

les v

iab

les

/mL

)

Temps (jours)

RC1-11 glucose fructose

S. cerevisiae T. delbrueckii

K. thermotolerans

P. fermentans

P. membranifaciens H. uvarum

B A

C D

E F

Figura 6 : Seguimiento de las

poblaciones viables y del consumo

de los azúcares a lo largo de la FA

de sus mono-cultivos.

14

XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona

• Estudios de las características enológicas de las diferentes cepas :

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Fruits exotiques

Banane

Pomme verte

Vernis

Pêche

Melon Sucré

Acidité

Amer

Gras/Volume

Complexité

Sc

Mp

Mp-Sc

Td-Sc

a

b

a

a

a,b

a,b,c

b,c

c

a a

a,b

b

a a a,b

b

a, b

a,b

a

b,c b

c

a

a

c

b

b,c

c

d

a

b a, b

b

b b

b

b

d c,d b,c

b,c

b

b

c

**

**

**

**

**

**

**

** **

**

* Figura 7 : Analisis sensorial de los

vinos de Sauvignon Blanc

fermentados por los mono-

cultivos.


15



16



• En conclusión : -Cinética fermentativa monocultivo y co-cultivo con S.cerevisiae.

-Producción de aromas varietales, fermentativos y terpénicos.

-Limitación de la producción de moléculas indeseables :

compuestos azufrados y vinil-fenoles…

-Producción de biomasa.

• Las 3 cepas más adaptadas has sido las seleccionadas :

- klueroveromyces thermotolerans

- Torulaspora delbruecki

- Metschnikowia pulcherrima

• Mezclar en diferentes proporciones con el objetivo de

trabajar sobre la Bio-Protección de la vendimia.

17

Bio-protección de la vendimia

• Sélección espécifica de levaduras no-saccharomyces del viñedo de Bourgogne :

- klueroveromyces thermotolerans

- Torulaspora delbruecki

- Metschnikowia pulcherrima


• Microorganismos destinados implantarse desde los primeros minutos de la

vendimia.

18



• Objetivos técnicos : - Implantarse rapidamente en el medio con levaduras N-S

« seguridad »

- Limitar el uso de SO2 en la vendimia.

- Conservar y favorecer la expresión de la microflora natural.

- Aportar más complejidad y calidad aromática.

- Nula participación en la extracción de amargores, de gustos vegetales

y en el caso de vendimia alterada de gusto de podrido.

ou

19



• Ejemplo de uso : 5 g por 100 kg de uva

- Réhidratar 100 g en 1,5L de agua no-clorada y 0,5L de mosto

a 27°C y esperar 30 minutos.

- Acclimatación : Añadir 8L de mosto (préparacion de 10L en total)

- Repartir uniformemente sobre la uva 0,5 L por 100 kg de vendimia (=5 g/hL)

- Remolque de 2T de uva = 100g de Primaflora

= 10L de pie aclimatado

20


Bio-proteccion de la vendimia

• Objetivos técnicos : Sucesión de 3 fases de trabajo de las levaduras

Favorece la complejidad aromática

La flora nativa Primaflora Levadura

No-saccharomyces Saccharomyces

21



• Objetivos técnicos: No sustituye una siembra clasica con S. cerevisiae

22


• Conclusión : - Imprescindible el uso de levaduras N-S « seleccionadas »

- Ocupación « positiva » del ecosistema

- Limitar el uso de SO2 en vendimia

- Supone una técnica innovadora : enología moderna y en

consonancia con los gustos de los consumidores finales

- Favorece la complejidad y tipicidad aromática (vino limpio y

menos « pesado »)

- Favorece el desarrollo de la FML en vino tinto

23

GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN

24

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