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LÍNEA DE INVESTIGACIÓN

AMBIENTAL

PROYECTO

MICROBIOLOGÍA DE LOS PROCESOS DE REMOCIÓN DE CONTAMINANTES

2005-2008

RESPONSABLE

Dr. Rubén Moreno Terrazas Casildo

Participantes UIA

Quím. Carmen Doria Serrano Ing. Bioq. Lorena Pedraza Segura

M. en C. Margarita Hernández Esparza M. en C. Samuel Macías Bravo

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ANTECEDENTES

Una gran variedad de industrias que llevan a cabo procesos como los

petroquímicos, de polimerización, de producción de pinturas, de barnices, de

elaboración de productos farmacéuticos, de extracción de aceites y grasas entre

otros, descargan una gran variedad de desechos orgánicos en sus efluentes

acuosos, gaseosos y sólidos; algunas sustancias son aromáticas y se consideran

peligrosas a la biota y a los seres humanos. Entre ellos están el fenol, el tolueno y

sus derivados. Otras sustancias como los aceites, las grasas y el metanol son

fácilmente biodegradables pero en altas concentraciones en los residuos

constituyen un problema de contaminación que debe resolverse (Chappe y col.,

1994; Fries y col., 1997; García Garcia y col. 2000; Rogers y Reardon 2000;

Fontoulakis y col. 2002; Jacobs y col., 2004; Sampedro y col., 2004).

Los problemas de contaminación han sido abordados a través de distintas

tecnologías en fase acuosa, gaseosa o sólida por medio de procesos

fisicoquímicos como la coagulación-floculación, precipitación, adsorción en

soportes especiales, oxidación, etc. Estos métodos pueden ser eficientes, pero

generalmente son costosos y/o requieren reactivos químicos para llevarse a cabo.

Otra forma de enfrentar estos problemas es por medio de un tratamiento

biológico, ya que los microorganismos en particular, tienen una gran diversidad y

flexibilidad metabólica para utilizar como fuente de carbono y energía los

contaminantes del medio ambiente mencionados (Collins y Daugilis, 1996;

Feitkenhauer y col., 2001; Kim y col. 2002; Komarkova y col. 2003).

Se han aislado e identificado diversos microorganismos que tienen la

capacidad de utilizar fenol como fuente de carbono y energía, algunos de ellos con

una alta capacidad para hacerlo; entre los microorganismos estudiados se

encuentran bacterias, levaduras y hongos tales como Pseudomonas sp., Bacillus

sterearothermophilus, Burkholderia sp. Geotrichum candidum, Aspergillus terreus,

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Alcaligenes sp., Streptomyces sp. Rhodopseudomonas sp. Candida sp.y

Trichosporon sp., entre otros. Ya que los microorganismos que degradan tolueno

utilizan las mismas vías metabólicas que para el fenol, varios se han utilizado

también para degradar este contaminante.

Han sido diseñados tratamientos aerobios y anaerobios en aguas

residuales y en biofiltros para degradar metanol, algunas especies de

Pseudomonas y Sphingomonas, Candida boidinii, Hansenula polymorpha y

hongos celulolíticos han estado involucrados en esta biorremediación aerobia

(Ramírez-López y col., 2002; Pineda y col. 2004).

En cuanto a los triglicéridos se han desarrollado muchos trabajos para aislar

microorganismos con alta actividad de lipasa a partir de alimentos, de suelos

contaminados con aceites y grasas y de otros orígenes; algunos ejemplos son

Pseudomonas spp., Bacillus spp., Shewanella, Staphyloccoccus spp., Micrococcus

spp., Pantoea aglomerans, Rhizopus spp. entre otros (Chappe y col., 1994; Hita y

col., 1996)

Se ha reportado que la concentración óptima de fenol y de tolueno

para su degradación por bacterias es de de 50-100 mg/L. A concentraciones

mayores, su crecimiento se inhibe debido al efecto tóxico de estos compuestos,

aunque la capacidad para resistir estas sustancias, la forma y el tiempo que tarda

su degradación varía de un organismo a otro. (Hita y col., 1995; Collins y Daugilis,

1996; Feitkenhauer y col., 2001; Bandhyopadhyay y col. 2001; Kim y col. 2002;

Komarkova y col. 2003).

En la naturaleza los microorganismos se adaptan formando poblaciones

mixtas que interactúan en algunos casos para hacer más eficiente la utilización de

nutrimentos disponibles. Estudios recientes resaltan la importancia de entender la

funcionalidad de los microorganismos dentro de su comunidad, ya que muchas

veces diversas poblaciones no pueden mantener una estabilidad adecuada dentro

de su ecosistema de forma aislada. Por ello, al reconocer la diversidad y las

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interacciones de grupos clave dentro de un sistema dado puede mejorar la

estabilidad del proceso (Jiang y col.,2004).

Por ejemplo, Jiang y col., (2004) han aislado, caracterizado e identificado

microorganismos relevantes dentro de una comunidad en gránulos aerobios

agregados que se utilizan en reactores por lote para degradar fenol. De estos

aislados, algunos tuvieron alta capacidad para degradar este contaminante,

mientras que otros tenían la habilidad para autoagregarse y formar los gránulos

aunque degradaban poco fenol; esto ha permitido proponer un modelo de

comunidad que haga más eficiente la remoción de esta sustancia.

Este mismo efecto se ha mencionado en consorcios que se presentan en

lugares contaminados con una mezcla de formaldehído y metanol o bien con

grasas y aceites (Fries y col., 1997; García Garcia y col. 2000; Rogers y Reardon

2000; Fontoulakis y col. 2002; Jacobs y col., 2004; Prado y col. 2004; Sampedro y

col., 2004).

Cuando se presenta un efecto adverso por la exposición a substancias

tóxicas es muy recomendable inmovilizar las células en hidrogeles poliméricos o

en soportes artificiales o naturales. Esta técnica aumenta la capacidad de

degradación por parte de la biomasa. Por ejemplo, diferentes especies de

Pseudomonas y Candida no toleran más de 1500 mg/L de fenol, aunque las

células toleran por periodos cortos concentraciones más elevadas cuando están

inmovilizadas. (Torres y col. 1998; Chung y col. 1998; Chen y col. 2002).

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ORIGINALIDAD

Se espera aislar y caracterizar microorganismos de sustratos naturales no

reportados en la literatura y/o con alta capacidad de remoción de contaminantes

comunes en el aire y en el suelo. Normalmente estos microorganismos se

desarrollan dentro de un consorcio, por lo que no se sabe cuál es su papel como

degradadores en forma individual. De lo anterior surge la posibilidad de establecer

qué microorganismos tienen mayor y mejor capacidad de remover cada

contaminante, conociendo estas características se puede hacer una selección y

combinación ideal de microorganismos que tengan el rendimiento más adecuado

en la degradación de estos contaminantes.

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OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar por técnicas tradicionales y moleculares, microorganismos

aislados de medios naturales con alta capacidad para degradar sustancias que

contaminan el medio ambiente.

Objetivos específicos

Identificar, por técnicas tradicionales, microorganismos que metabolizan

fenol y triglicéridos aislados de medios naturales.

Adecuar técnicas de análisis molecular de los microorganismos, para

identificarlos a nivel de especie.

Caracterizar por técnicas tradicionales y moleculares, microorganismos

aislados de biofiltros con soportes naturales que degraden contaminantes

volátiles como tolueno, metanol y la mezcla de ambos.

Seleccionar entre los microorganismos aislados, los que tengan mayor

tolerancia a concentraciones crecientes de cada uno de los contaminantes.

Determinar la cinética de remoción de fenol, tolueno, metanol y triglicéridos

por parte de los microorganismos seleccionados en reactores por lote a

nivel laboratorio para establecer cuáles son los más eficientes.

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METAS

Científicas

Disponer de un conjunto de bacterias, levaduras y mohos identificados por

métodos tradicionales y moleculares que degraden fenol, tolueno, metanol y

triglicéridos con una alta eficiencia, para la eventual aplicación en su remoción de

en agua y suelos contaminados.

Formación de recursos humanos

Aislamiento e identificación de microorganismos de los diferentes contaminantes 11 alumnos de las licenciaturas de Ingeniería Química y Tecnología de alimentos

de la Universidad Iberoamericana.

1 alumno de doctorado en Ciencias Biológicas por parte de la Universidad

Autónoma de Aguascalientes.

Selección de microorganismos y desarrollo de cinéticas 1 alumno de maestría en Ingeniería Química Universidad Iberoamericana

4 alumnos de las licenciaturas de Ingeniería Química y de Alimentos y de

Tecnología de Alimentos de la Universidad Iberoamericana

La formación de los alumnos de las licenciaturas de Ing Química y de

Alimentos será parte de su formación terminal en el Seminario de Opción

Terminal, los Laboratorios Experimentales, la Estancia Industrial y las Prácticas

Profesionales.

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METODOLOGÍA Obtención del consorcio microbiano con capacidad para degradar fenol a partir de lodos activados Se tomarán muestras de los lodos del reactor aerobio de la planta de

tratamiento de aguas residuales de la UIA., se aclimatarán a fenol como única

fuente de carbono. Se utilizarán concentraciones crecientes de fenol hasta 1.5 g/L

con un medio mineral según la composición y condiciones reportadas por Jacobs y

col. (2004)

Se tomarán muestras comerciales de cecina de tres lugares diferentes de compra

que tengan en su superfiicie una capa de manteca de cerdo.

Una vez que los consorcio se desarrolle se procederá al aislamiento y

purificación utilizando los medios de cultivo apropiados.

Caracterización microbiológica

Cuantificación, aislamiento e identificación tradicional de microorganismos

La cuantificación, el aislamiento, la identificación y la conservación de los

diversos grupos microbianos que constituyan los consorcios, se realizará mediante

técnicas tradicionales. Las determinaciones anteriores se detallan a continuación:

A los microorganismos que se desarrollen en los medios con fenol se les

harán diluciones decimales en serie hasta 10-9. en agua peptonada estéril al 0.1%

y se sembrarán por extensión de superficie (Andrews y Hammack, 2003).

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Bacterias Para la cuantificación y aislamiento de bacterias se utilizará agar soya

tripticaseina. Incubando a 37° C durante 5 días. Se realizará la cuenta de unidades

formadoras de colonias y se seleccionarán todas aquellas con morfología

diferente.

En los aislados seleccionados se observará su morfología celular, se

realizarán pruebas de tinción de Gram, catalasa, oxidasa y de

oxidación/fermentación de glucosa, así como el desarrollo en diferentes medios

selectivos.

Dependiendo del resultado de estas pruebas se seleccionarán los sistemas

de identificación de API (BioMeriux) que existen en el mercado para su

caracterización específica. La caracterización e identificación de las bacterias que

no se logren identificar con los sistemas API se realizará conforme a las

metodologías y claves compiladas en el manual de Bacteriología Sistemática de

Bergey (1992).

Levaduras y mohos

Su cuantificación se hará utilizando las mismas diluciones y la técnica que

para las bacterias: empleando placas de agar rosa de Bengala-dicloran-

cloranfenicol (aRBDC) (Difco) (Mislevic y col., 1992) y de agar extracto de malta

(aEM) acidificado a pH 3.7. A ambos medios de cultivo se adicionarán también los

contaminantes de prueba a las concentraciones ya indicadas (Difco). Las placas

se incubarán a 27°C durante diez días, se cuantificarán las ufc/ml de cada sustrato

(Mislevic y col., 1992), y se aislarán y purificarán las que presenten morfología

colonial diferente (Yarrow, 1998).

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La identificación de las levaduras se hará de acuerdo al esquema de

Yarrow (1998) donde se observarán las características de: reproducción asexual y

sexual, morfología celular y colonial, pruebas fisiológicas y bioquímicas. Con estos

resultados se seguiran las claves y diagnosis de las monografías de Barnett y col,

(2000), Kurtzman y Fell (1998) y la base de datos de la colección CBS

(Centraalbureau voor Schimmelculture, 2004).

Caracterización molecular

Una vez realizada la identificación tradicional de los aislamientos se hará su

caracterización molecular mediante la secuenciación de regiones específicas. En

el caso de bacterias se amplificarán y secuenciarán regiones del gene 16S, y para

levaduras y mohos el dominio D1/D2 del gene 26S del ADNr, o diferentes

regiones ITS.

La extracción del ADN de los diferentes microorganismos se hará a partir de

un cultivo joven y se tomará una porción del cultivo.

Se probarán métodos de extracción y de amplificación de ADN reportados

en la literatura y kits comerciales disponibles en el mercado para elegir el más

adecuado a los microorganismos aislados. En el anexo 1 se mencionan algunas

metodologías iniciales que se probarán para los diferentes grupos de

microorganismos.

Para bacterias se amplificará la subunidad menor del gene 16S del ADNr

usando los primers universales P27f (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) y

P1495r (5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’)

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Los iniciadores universales que se utilizaran serán para levaduras y mohos

serán inicialmente el NL-1 (5’- GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) y el NL-

4 (5’- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G).

Se utilizará un equipo termociclador personal (Eppendorf) y se amplificarán

inicialmente conforme a lo reportado por Baggi y col. (2004) para bacterias y por

Libkind y col. (2003) para levaduras y mohos (anexo No. 1).

El ADN amplificado será purificado con el kit de purificación QIAquick

(QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

El marcaje y secuenciación de las dos hebras complementarias se realizará

con la técnica de Saenger et al. (1977), en un secuenciador automático (Abi-Prism

310, Perkin-Elmer).

La secuencia de datos se alineará visualmente con el programa BioEdit

Programm 7.1 Y se compararán las secuencias alineadas con las depositadas en

el GenBank con el Blast-Program. Todas las secuencias obtenidas se registrarán y

depositarán en el GenBank reportando el número de acceso (Altschul et al. 1997).

Obtención del consorcio microbiano a partir de soportes contenidos en biofiltros degradadores de contaminantes

A nivel de laboratorio, se dejará que se desarrolle el consorcio microbiano

presente en dos diferentes soportes húmedos, semillas de uva y olote. Contenidos

en un sistema de biofiltros tubulares de 1.0 L. de volumen, con alimentación de

gas con flujo descendente. El tiempo de incubación será fijo y permitirá el

desarrollo de los consorcios; cuando estos estén estables se tomará una muestra

de los soportes. Los biofiltros serán desarrollados en la Universidad Autónoma de

Aguascalientes.

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Los biofiltros se trabajarán con alimentación gaseosa de metanol y tolueno

con cada uno de los soportes. La concentración del tolueno será de 1 ppm y la de

metanol de 10 ppm y la mezcla estará en la misma proporción.

El mecanismo para la obtención de cepas puras, así como la identificación

de los microorganismos por pruebas morfofisiológicas y moleculares se realizará

de igual manera que lo indicado anteriormente para las cepas degradadoras de

fenol.

Selección de cepas degradadoras de fenol

Los microorganismos aislados, purificados e identificados, se adaptarán a

desarrollarse en fenol en concentración inicial de adaptación de 1 g/L en un medio

mineral se utilizará un inóculo inicial ajustado a 2 de Macfarland en 10 ml de medio

de inoculación. Para la selección de cepas se utilizarán microorganismos aislados

del consorcio que tengan cuando menos un crecimiento de biomasa mayor a 106

UFC/ml de medio y una resistencia a 2 g/L de fenol.

Selección de cepas degradadoras de tolueno, metanol y triglicéridos

En cuanto a los microorganismos degradadores de tolueno y metanol, a

cada cepa aislada de los dos biofiltros y a las obtenidas para degradación de

triglicéridos se le realizarán las mismas pruebas que para fenol con el objeto de

determinar la capacidad de remover estos compuestos en una solución acuosa a

distintas concentraciones (0.5 a 1.5 g/L). Se elegirán los que tengan una mayor

eficiencia de degradación.

Se probará la capacidad lipolítica de los aislados del alimento adaptándolos

a una mezcla de trioleína como única fuente de carbono con un agente

tensoactivo (Tween 80). Se utilizarán concentraciones crecientes de este

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triglicérido hasta 1.5 g/L en un medio mineral según la composición y condiciones

reportadas por Jacobs y col. (2004)

Los microorganismos seleccionados serán precultivados en el medio basal

anterior adicionados con la concentración más alta de los 2 diferentes

contaminantes (fenol, tolueno, metanol y triglicéridos) previamente a la realización

de la cinética.

Cinética de degradación de contaminantes

Métodos analíticos

La degradación de cada contaminante se medirá por cromatografía de

gases en un cromatógrafo VARIAN MODELO 3800 con detector de Ionización de

flama, la medición se hará a partir de la solución acuosa previamente filtrada en

una membrana de filtración de 0.2 µm con punta Luer de 0.2 µm (Agilent Tech.)

para jeringa, con l filtro resistente a solventes de PTFE 30/20. La cantidad de

muestra que se inyectará será de un microlitro. Con una columna capilar de 30m X

0.32 mm D.I. con 0.5 µm de película DB-WAX marca JW.

Las condiciones de trabajo del cromatógrafo serán:

Temperatura del Inyector 200°C

Temperatura del detector 200°C

Temperatura del horno columna

Inicial 60°C durante 1 min

Con 5°C/min de incremento de temperatura

Hasta una temperatura final de 150°C 1min

La concentración inicial de células será medida por densidad óptica a 600

nm y la concentración de células viables será realizada por cuenta en placa en

AST según la correlación de Rogers y Reardon (2000). La cantidad de inóculo se

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determinará usando una relación inicial de sustrato a biomasa de 300 masa/masa

(Jiang y col. 2004).

Las cepas seleccionadas para la cinética de degradación de cada uno de

los contaminantes se trabajarán por duplicado. Se inocularán en matraces de 500

mL con un medio mineral según la composición reportada por Jacobs y col.

(2004). Se usarán condiciones aerobias con agitación rotatoria a temperatura

ambiente y se dejarán hasta que el contaminante desaparezca.

La concentración inicial de sustrato será calculada tomando como base la

concentración máxima a la que se desarrollen los microorganismos en el proceso

de selección.

Para comprobar que la inmovilización en hidrogeles poliméricos favorece la

degradación se llevarán a cabo las cinéticas con microorganismos suspendidos e

inmovilizados siguiendo la técnica reportada por Hernández y col. (en prensa).

Una vez que se obtengan los datos de las diferentes cinéticas de

degradación se desarrollará el modelo matemático

Para cada contaminante se hará un diseño experimental del número de

cepas seleccionadas contra microorganismos inmovilizados y suspendidos

teniendo como variable de respuesta la degradación del contaminante y el

incremento en el número de ufc/ml.

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Amsterdam. pp 77-110.

18

GRUPO DE TRABAJO

UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA DR. RUBÉN MORENO TERRAZAS C.

MAESTRA CARMEN DORIA SERRANO

MAESTRA MARGARITA HERNÁNDEZ ESPARZA

MAESTRA LORENA PEDRAZA SEGURA

MAESTRO SAMUEL MACIAS BRAVO

ALUMNO DE MAESTRÍA EN INGENIERÍA QUÍMICA

ALUMNOS DE LICENCIATURA DE INGENIERÍA QUÍMICA Y DE ALIMENTOS

Actividades UNAM INSTITUTO DE BIOLOGÍA DRA. PATRICIA LAPPE OLIVERAS

DRA. LAURA MÁRQUEZ D.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE AGUASCALIENTES DRA. MARCELA RAMÍREZ LÓPEZ

MAESTRA DOLORES BARBA (ALUMNA DOCTORADO)

Comentario: Los biofiltros que se utilizarán para la remoción de tolueno, metanol y la

mezcla de ambos se instalarán en Universidad Autónoma de Aguascalientes y su

operación es parte del proyecto doctoral de la alumna doctorado. La directora de

este trabajo será la Dra. Marcela Ramírez colaboradora de este proyecto y el Dr.

Rubén Moreno Terrazas será asesor externo.

La comprobación de la identificación morfofisiológica de levaduras, será

apoyada por la Dra. Patricia Lappe del Instituto de Biología de la UNAM.

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La adaptación de técnicas de extracción de ADN, su purificación y

secuenciación también serán realizadas en el Instituto de Biología de la UNAM

con el apoyo de la Dra. Laura Márquez y de la Dra. Patricia Lappe.

El trabajo experimental de caracterización microbiológica de todos los

microorganismos, incluyendo los aislados en los biofiltros se llevará a cabo en las

instalaciones de la UIA, bajo la supervisión del Dr. Moreno Terrazas y de Ma. Del

Carmen Doria.

La selección de microorganismos y las cinéticas de remoción también se

llevarán a cabo en la UIA y el análisis de resultados se hará con la colaboración de

las otros profesores participantes en el proyecto.

INFRAESTRUCTURA

TERMOCICLADOR PERSONAL

CÁMARA DE ELECTROFORESIS

TRANSILUMNADOR P/OBSERVAR GELES DE ELECTROFORESIS

INCUBADORAS

AUTOCLAVE

CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

BAÑOS DE TEMPERATURA CONTROLADA

REFRIGERADORES

MESA DE AGITACIÓN CONSTANTE

CROMATOGRAFO DE GASES

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CONSISTENCIA CON EL PROGRAMA DE LA UIA

Este proyecto busca mecanismos para la optimización de la remoción de

contaminantes de agua, suelo y aire a través del conocimiento de los

microorganismos involucrados. Consideramos que este objetivo tiene

implicaciones sociales y económicas en nuestro país, ya que queda mucho trabajo

por hacer para disponer de procesos industriales “limpios”.

Por otro lado, promoveremos la formación de alumnos en nivel licenciatura,

maestría y doctorado que interactúen para su capacitación en técnicas modernas

de identificación y uso de microorganismos, así como el intercambio de

experiencias entre los tres niveles de estudio. Además, las metodologías que se

desarrollen se podrán implementar en los diversos laboratorios y talleres de los

curricula de las licenciaturas a cargo de los Departamentos de ICQ y de Salud de

la UIA.

Participarán en el proyecto profesores del Departamento de Ingeniería y

Ciencias Químicas que pertenecen a diferentes áreas del mismo (Química, Ing.

Química e Ing. de Alimentos) y que se integrarán en un objetivo común.

Finalmente, aunado a nuestra experiencia hemos buscado el apoyo de

expertos de otras instituciones académicas de nuestro país para lograr resultados

de excelencia.

RESULTADOS ENTREGABLES 5 artículos en revistas arbitradas

5 presentaciones en congresos internacionales y nacionales

1 tesis de doctorado

1 tesis de maestría

7 reportes finales de las materias de formación terminal de los alumnos de las

licenciaturas involucradas.

21

PROGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROYECTO 2005* 2006 2007 2008

FENOL Aclimatación de lodos activados a fenol (realizado en un proyecto anterior)

X

Aislamiento de microorganismos a partir de un consorcio removedor de fenol X Purificación de levaduras y mohos X Purificación de bacterias X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de levaduras X Adaptación de técnicas para extracción de ADN X Extracción del ADN levaduras para probar las técnicas reportadas X Amplificación y secuenciación de ADN X Identificación de bacterias por métodos morfo-fisiológicos X Extracción de ADN de bacterias X Amplificación y secuenciación de ADN de bacterias. X Identificación molecular de levaduras y bacterias X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TRIGLICÉRIDOS Aislamiento de microorganismos de cecina X Aislamiento de microorganismos X Purificación X Prueba de su capacidad lipolítica X Extracción y amplificación de las levaduras X Extracción y amplificación de las bacterias X Secuenciación y caracterización X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X TOLUENO Y METANOL Instalación y puesta en marcha de biofiltros removedores de tolueno X Aislamiento de microorganismos adsorbidos en el soporte sólido X Purificación de levaduras y mohos X Purificación de bacterias X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de levaduras X Extracción del DNA de levaduras X Amplificación del DNA y sus secuenciación. X Identificación por métodos morfo-fisiológicos de bacterias X Extracción de DNA de las bacterias para probar las técnicas reportadas X Amplificación del DNA de la bacteria y su secuenciación. X Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X FENOL Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento X X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación

X X

Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TRIGLICÉRIDOS Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación

X X

Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X X TOLUENO Y METANOL Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento en tolueno X Selección de levaduras, bacterias mohos de mayor crecimiento en metanol X Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación de tolueno

X X

Pruebas cinéticas de los microorganismos para determinar la velocidad de biodegradación de metanol

X X

Análisis de resultados y elaboración de artículos y documentos de alumnos X * Este proyecto fue aprobado y tuvo asignación de presupuesto por parte de la UIA en 2005

22

ANEXO No. 1

Método mecánico inicial para la extracción de ADN de bacterias

Congelar por 10 min a -80°C

Moler las bacterias con el minipistilo.

Agregar 30 µL de SDS al 10%, 6 µL de proteinasa K (20 mg/mL) y 6 µL de RNAsa (10 mg/mL).

Si es necesario, centrifugar por 10 seg a velocidad máxima (para mezclar perfectamente).

Colocar en baño maría durante 1 h a 37°C.

Agregar 100 µL de NACl 5 M y 80 µL de CTAB/NaCl.

Incubar a 65°C durante 10 min.

Agregar cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) en volumen igual al que se tiene en el tubo (aprox.

700 µL). Mezclar suavemente.

Centrifugar 5 min a 14000 rpm. La fase acuosa (fase superior) se pasa a otro tubo eppendorf de

1.5 mL.

Agregar fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) en volumen igual al que se tiene en el tubo.

Mezclar suavemente.

Centrifugar 5 min a 14000 rpm. El sobrenadante (fase superior) se pasa a otro tubo eppendorf de

1.5 mL.

Agregar isopropanol suficiente para que corresponda al 60% del volumen final total del tubo. Dejar

reposar una noche a -20°C.

Mezclar y centrifugar 5 min a 14000 rpm. Tirar la fase superior y conservar la hojuela del fondo.

A la hojuela se le agrega etanol al 70% a 4°C (mismo volumen agregado de isopropanol). Mezclar

ligeramente.

Centrifugar 5 min a 14000 rpm. Tirar el sobrenadante y repetir el lavado.

Dejar secar a temperatura ambiente. Colocar los tubos abiertos en una caja cerrada.

El ADN obtenido se resuspende con 50 �L de buffer Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.6.

Guardar las muestras a -20°C.

Método mecánico inicial para levaduras y mohos

Congelar la muestra a -80°C por 10 min

Moler con un minipistilo.

Adicionar 1000 µL se solución amortiguadora de SDS al 20% (200 g SDS + 800 mL agua

destilada). Invertir los tubos varias veces con suavidad hasta homogeneizar.

Incubar durante 40 min en baño maría a 37°C, agitando los tubos suavemente cada 15 min.

Retirar los tubos del baño y esperar un minuto a que se refresquen.

Agregar 600 µL de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Agitar suavemente por 5 min.

Centrifugar a 13000 rpm por 10 min.

Transferir el sobrenadante a un tubo de 2 mL y agregar 10 µL de RNAsa (10 mg/mL).

23

Incubar durante 20 min a 37°C.

Adicionar 700 µL de isopropanol previamente enfriado a -20°C. Agitar suavemente hasta

mezclar completamente las dos fases.

Colocar a -80°C por 10 min.

Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante.

Adicionar a la pastilla de ADN 200 µL de etanol al 70% para lavar.

Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. Decantar el sobrenadante.

Dejar secar a temperatura ambiente. Colocar los tubos abiertos en una caja cerrada.

El ADN obtenido se resuspende con 40 µL de buffer Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM, pH 7.6.

Guardar las muestras a -20°C.

Mientras el ADN esté húmedo, se agregarán 100 µl de agua bidestilada estéril, despegando el

ADN del fondo del tubo y se calentará el tubo Eppendorf en baño de agua a 55°C durante 15 min o

hasta que el ADN se disuelva por completo. De esta preparación se obtendrá el stock genómico de

ADN. Se almacenarán las muestras a –20°C hasta que se realice la secuenciación.

Para realizar la reacción de amplificación se diluirá el ADN adicionando a 996 µl de agua

bidestilada estéril 4 µl del “stock”. La dilución del ADN (templado) será utilizada para la

amplificación simétrica. En la Tabla 1 se muestra la cantidad de reactivos de la mezcla maestra

necesaria para una reacción de PCR

Tabla 1. Cantidad de reactivos necesarios en la mezcla maestra para la amplificación de ADN de

los microorganismos de prueba

Reactivos Concentración Inicial Concentración Final Volumen (µl)

H2O estéril (QSP) 28.8

Amortiguador PCR

(KCl 1 M 12.5 ml, Tris-

HCl 1 M pH 8.4 2.5 ml,

MgCl2 1 M, 625 µl

gelatin 2.5 mg, ddH2O

9.37 ml)

10 X 1 X 25

Mezcla de

desoxinucleótidos

(dNTPs)

10 mM/µl 0.2mM/µl 4.0

Iniciador externo 5’

final P27f (bacterias)

bacterias

0.2 µM

2.5

24

y NL1f (levaduras y

mohos)

10 pmol/µl

levaduras y mohos

0.5 pmoles

Iniciador externo 3’

final P1495r

(bacterias)

y NL4r (levaduras y

mohos)

10 pmol/µl

bacterias

0.2 µM

levaduras y mohos

0.5 pmoles

2.5

Taq polimerasa 0.2

Volumen final 49.0

En un tubo del termociclador de 500 µl se transferirán 48 ó 49 µl de la solución de mezcla maestra

y 2 ó 1 µl del templado compensando el volumen final con mayor o menor cantidad de agua

obteniéndose un volumen final de 50 µl, se agitará y centrifugarán por 10 seg a una velocidad de 3

000 rpm.

Los iniciadores universales que se utilizaran serán para levaduras y mohos serán el NL-1 (5’- GCA

TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) y el NL-4 (5’- GGT CCG TGT TTC AAG ACG G) y la

polimerasa fue Gold Taq-polimerasa (Boheringer y QIA DNA minikit QIAGEN).

Para bacterias se amplificará la subunidad menor del gene 16S del ADNr usando los primers

universales P27f (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) y P1495r (5’-CTA CGG CTA CCT TGT

TAC GA-3’)

Para las bacterias las los tubos con las muestras de ADN se colocarán en el equipo termociclador

personal (Eppendorf) y se amplificarán conforme el siguiente programa (Baggi y col., 2003):

Precalentamiento: 95°C 3 min

Desnaturalización: 94°C por 1 min

Alineamiento: 55°C por 1min

35 ciclos Extensión: 72°C por 2 min

Extensión final: 72°C 15 min

Para las levaduras y los mohos los tubos con las muestras se colocarán en el mismo equipo y se

amplificarán conforme el siguiente programa (Libkind y col., 2003):

25

Precalentamiento: 95°C 12 min

Desnaturalización: 95°C por 1 min

Alineamiento: 52°C por 55 seg

40 ciclos Extensión: 72°C por 2 min

Extensión final: 72°C 8 min

Una vez que terminen los ciclos el termociclador se mantendrá 4°C, hasta que la muestra sea

retirada. Se verificará la calidad del producto de PCR por electroforesis en un gel de agarosa (1%)

con una solución amortiguador TAE 1X Los pozos del gel se cargará n con una mezcla con 4 µl del

producto de PCR y 2µl de la mezcla de tinción. La electroforesis se correrá durante 15-20 min a

120 volts. El gel se observará y fotografiará en un transiluminador UV (Libkind y col 2003; Baggi y

col. 2004).