LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO
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TRANSPORTE DE NANOMATERIALES EN MEDIOS COMPLEJOS LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENT DE INGENIERIA QUIMICA BOGOTA D.C 2013
Transcript of LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO
TRANSPORTE DE NANOMATERIALES EN MEDIOS COMPLEJOS
LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENT DE INGENIERIA QUIMICA
BOGOTA D.C
2013
TRANSPORTE DE NANOMATERIALES EN MEDIOS COMPLEJOS
LINA ANGELICA UBAQUE BUITRAGO
Trabajo de grado para optar al título de Master en Ingeniería Química
Director
PhD WATSON LAWRENCE VARGAS
Ingeniero Químico
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA
BOGOTA D.C
2013
iii
A mis padres Bertulfo y Graciela por el apoyo y la confianza depositada,
A mi hermano Julián por guiarme y aconsejarme,
A mi tía Esperanza por siempre estar ahí en los momentos que más la necesite,
A ti amor por tu compañía y apoyo incondicional,
y a mis amigos por ofrecerme una amistad sincera.
Gracias Totales
iv
RESUMEN
Los potenciales beneficios de la nanotecnología son inmensos, como también lo son
sus peligros. Los nanomateriales se desarrollan por sus propiedades radicalmente
nuevas que conllevan resultados completamente novedosos y algunas veces
impensados. Mientras existe un amplio consenso de que la nanotecnología alberga
una promesa en cuanto a su aplicación en materiales, medicina y energía, también
hay grandes dudas sobre las implicaciones biológicas, medioambientales y de
seguridad. Se han determinado algunos vacíos de conocimiento que deben de
abordarse como determinar la cinética y mecanismo de transporte de las
nanopartículas en el cuerpo humano y caracterización, así como la estandarización de
los procesos de síntesis de las nanopartículas y protocolos de las pruebas de
transporte. El objetivo principal de este trabajo consiste en exponer lo avances
realizados en cuanto al diseño de equipos para difusión de nanomateriales en medios
biológicos, diseño de cámaras de decelularización de órganos y tejidos, así como
también protocolos para el estudio del transporte de nanomateriales en medios
biológicos. En este trabajo se presentan pruebas de difusión de nanopartículas de
SiO2 en piel normal y decelularizada, donde se observa una mayor difusión en tejidos
decelularizados que en tejidos sin decelularizar. Para determinar la presencia de las
nanopartículas en el tejido, se sintetizaron exitosamente nanopartículas de SiO2 con
tamaños de 45nm y378 nm marcadas con un fluorocromo, para su detección por
microscopía confocal.
Se presenta la penetración en piel de cerdo de nanopartículas de SiO2 funcionalizadas
con fluoresceína sódica con diámetro de 45nm. Se determina que aproximadamente
una concentración de 0,68 ppm de nanopartículas de 45nm de SiO2 atravesó piel
normal a las 48h, mientras que a las 6h se determina una concentración de 5,97 ppm
de nanopartículas de SiO2 en piel de cerdo decelularizada. De igual forma se presenta
penetración de NPs de SiO2 de 378 nm en piel de cerdo normal pero en el transcurso
de 200 h no se determinó presencia de nanopartículas en el recipiente receptor. En
cuanto a las pruebas de penetración de NPs realizadas en membrana de agar con los
dos tamaños (45nm y 378nm) las nanopartículas de menor tamaño atraviesan la
membrana más rápido que las nanopartículas grandes, ya que se encuentra una
v
concentración apreciable de 6,43 ppm en el recipiente receptor a las 3 horas, mientras
que con las nanopartículas de mayor tamaño se determina una concentración de 0,62
ppm hasta las 8 horas.
vi
OBJETIVOS
General.
Estudiar el fenómeno de transporte de nano-partículas en medios
complejos prototipo y tejidos decelularizados mediante ensayos
experimentales in vitro.
Específicos.
Síntesis y caracterización de nanopartículas modificadas con marcadores
fluorescentes.
Implementación y estandarización del protocolo para decelularización de
tejidos.
Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas
en tejidos artificiales prototipo.
Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas
en tejidos biológicos decelularizados.
Realizar pruebas in vitro para observar el transporte de las nanopartículas
en tejidos biológicos.
vii
AGRADECIMIENTOS
Mis más completos agradecimientos a mi asesor de tesis PhD Watson L. Vargas, al
grupo de microelectrónica de la Universidad de los Andes CMUA que facilitó las
instalaciones de Sala limpia y capacitación para el manejo de los equipos, al profesor
PhD Federico Brown y a su grupo de investigación EVODEVO en Ciencias Biológicas
por la facilitación de sus equipos y laboratorio para los análisis de histología.
viii
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS .......................................................................... 3
1.1. NANOMATERIALES .................................................................................. 4
1.1.1. Nanopartículas. .................................................................................... 4
1.1.2. Nanotubos de Carbono. ....................................................................... 4
1.1.3. Fullerenos. ........................................................................................... 5
1.2. NANOMEDICINA ....................................................................................... 6
1.3. RIESGOS POTENCIALES DE LOS NANOMATERIALES ......................... 6
1.4. MECANISMOS DE TRANSPORTE DE NANOMATERIALES ................... 7
1.5. EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO
9
1.6. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR CONTACTO DERMICO .... 11
1.7. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR INGESTION: ..................... 15
1.8. MODELOS UTILIZADOS EN EL TRANSPORTE DE NANOPARTÍCULAS:
18
1.8.1. Distribución de agentes anti cancerígenos. ....................................... 18
1.8.2. Modelamiento de la distribución de nanopartículas en esferas
tumorales multicelulares................................................................................. 19
1.8.3. Transporte de nanopartículas de oro en piel e intestinos de ratas. ... 21
3. TEORIA, DISEÑO, METODOLOGÍA Y PROTOCOLOS DE
EXPERIMENTACION ............................................................................................ 29
3.1. TEORIA DE EXPERIMENTACION .......................................................... 29
3.1.1. Decelularización .................................................................................... 29
3.1.1.1. Métodos de Decelularización ............................................................. 29
3.1.1.1.1. Métodos Físicos: ............................................................................ 30
ix
3.1.1.1.2. Métodos Enzimáticos ..................................................................... 31
3.1.1.1.3. Métodos Químicos ......................................................................... 32
3.1.1.2. Antibióticos para preservación de la matriz extracelular .................... 33
3.1.2. Tipo de estudios toxicológicos .............................................................. 33
3.1.2.1. In vivo: ............................................................................................... 33
3.1.2.2. In vitro: ............................................................................................... 35
3.1.2.3. Celda de difusión de Franz ................................................................ 36
3.2. DISEÑO DE EQUIPOS ............................................................................ 37
3.2.1. Diseño de Celda de Difusión ................................................................. 37
3.2.2. Diseño de Mini-Celdas de Difusión. ...................................................... 39
3.2.3. Diseño de Sistema para decelularización de tejidos ............................. 40
3.3. PROTOCOLOS DE EXPERIMENTACIÓN .............................................. 42
3.3.1. Protocolo para pruebas en Celda de Difusión de Franz ....................... 42
3.3.2. Protocolo para decelularización de órganos ......................................... 43
3.3.3. Protocolo para decelularización de piel................................................. 44
3.3.4. Protocolo para histología de los tejidos ................................................ 46
3.3.5. Protocolo para fabricación de láminas de histología ............................. 49
3.3.6. Protocolo elaboración de membranas en agar ..................................... 50
3.4. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS CON MARCADORES
FLUORESCENTES. .......................................................................................... 50
3.5. CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTICULAS ....................................... 51
3.6. ELABORACION DE CURVA DE CALIBRACION PARA DETERMINACION
DE CONCENTRACION DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 52
3.7. FABRICACIÓN DE SISTEMA MICROFLUÍDICO QUE MIMETIZA LA
INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR. ................................................................... 53
3.7.1. Diseño de las máscaras. ....................................................................... 54
x
3.7.2. Fabricación de los moldes. ................................................................... 55
3.7.3. Soft Lithography .................................................................................... 56
3.7.4. Fabricación de la Membrana Porosa. ................................................... 57
4. RESULTADOS ............................................................................................... 58
4.1. DECELULARIZACIÓN DE CORAZÓN. ................................................... 58
4.2. DECELULARIZACIÓN DE PIEL .............................................................. 63
4.3. SINTESIS DE NANOPARTICULAS ......................................................... 65
4.4. PENETRACION DE NANOPARTICULAS EN TEJIDOS .......................... 70
4.4.1. Curva de calibración de nanopartículas ................................................ 70
4.4.2. Penetración de Nanopartículas en medio prototipo (Agar). .................. 72
4.4.3. Penetración de Nanopartículas en piel de cerdo. ................................. 75
4.4.4. Penetración de nanopartículas en piel de cerdo decelularizada y piel
normal 75
4.5. FABRICACIÓNSISTEMA MICROFLUIDICO QUE SIMULA LA
INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR .................................................................... 79
4.5.1. Caracterización Óptica .......................................................................... 79
4.5.2. Caracterización Morfológica por perfilometría. ...................................... 80
5. CONCLUSIONES .......................................................................................... 84
PERSPECTIVAS ................................................................................................... 86
REFERENCIAS ..................................................................................................... 87
xi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Agentes activos de protección solar que se encuentran en tres diferentes
productos comerciales de protección solar. .......................................................... 11
Tabla 2. Nanoalimentos registrados en U.S.A....................................................... 16
Tabla 3. Soluciones de NPs para calibración. ....................................................... 53
Tabla 4. Composición porcentual de las nanopartículas. ...................................... 68
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Áreas de aplicación de la nanotecnología.. ............................................... 3
Figura 2. Estructura del Nanotubo de carbono. ....................................................... 4
Figura 3. . Estructura del Fullereno. ........................................................................ 5
Figura 4. Proceso ADME de las nanopartículas en el cuerpo. ................................ 8
Figura 5. Deposición de Partículas inhaladas en diferentes partes del sistema
respiratorio. ............................................................................................................. 9
Figura 6. Deposición de partículas en diferentes regiones del sistema respiratorio.
.............................................................................................................................. 10
Figura 7. Representación esquemática de la toxicidad inducida por nanopartículas
de ZnO.. ................................................................................................................ 12
Figura 8. Posibles mecanismos de toxicidad inducidos por nanopartículas de Plata
. ............................................................................................................................. 15
Figura 9. Nanomateriales usados en productos de consumo................................ 18
Figura 10. Proceso de decelularización de un hígado de rata. ............................. 29
Figura 11. Métodos de Decelularización de Órganos y Tejidos. ........................... 30
Figura 12. Imágenes de un ensayo en vivo en una rata. ....................................... 34
Figura 13. Celda de Difusión de Franz Estática .................................................... 36
Figura 14. Celda de Difusión de Franz de Flujo. .................................................. 37
Figura 15. Celda de difusión de Franz diseñada ................................................... 38
Figura 16. Celda de difusión fabricada. ................................................................. 39
Figura 17. Mini-celda de difusión. .......................................................................... 39
Figura 18. Componentes de sistema de decelularización. .................................... 40
Figura 19. Sistema de decelularización utilizado. .................................................. 41
Figura 20. Cámara de decelularización. ................................................................ 41
Figura 21. Montaje Celda de Difusión. .................................................................. 43
Figura 22. Separación de la dermis. ..................................................................... 45
Figura 23. Decelularización de Piel en el Shaker. ................................................. 45
Figura 24. Deshidrataciones sucesivas en Etanol. ................................................ 46
Figura 25. Impregnación del tejido en Xileno. ....................................................... 46
xiii
Figura 26. Tejidos embebidos en parafina ............................................................ 47
Figura 27. Microtomo Leica ................................................................................... 47
Figura 28. Estante para portaobjetos. ................................................................... 49
Figura 29. Baño de portaobjetos en solución adhesiva. ........................................ 49
Figura 30. Membrana en agar. .............................................................................. 50
Figura 31. Montaje para síntesis de nanopartículas de SiO2 ................................. 51
Figura 32. Sistema microfluídico diseñado. ........................................................... 54
Figura 33. Máscaras sistema microfluídico. .......................................................... 54
Figura 34. Láminas después de ataque con FeCl3 ................................................ 56
Figura 35. Laminillas después del ataque con HF ................................................. 56
Figura 36. Fabricación de membrana porosa suspendida. ................................... 57
Figura 37. Decelularización de corazón de Gallina. .............................................. 58
Figura 38. Corazón de gallina decelularizado. ...................................................... 59
Figura 39. Lote de 6 corazones decelularizados. .................................................. 59
Figura 40. Corte Longitudinal de un corazón nativo 10X. ...................................... 60
Figura 41. Corte Longitudinal de un corazón nativo 40X. ...................................... 61
Figura 42. H&E Corte transversal de corazón nativo 10X. .................................... 61
Figura 43. Corte transversal de corazón nativo 40X. ............................................ 62
Figura 44. H&E Corte longitudinal de corazón decelularizado 40X. ..................... 62
Figura 45. H&E Corte transversal de corazón decelularizado. 40X ....................... 63
Figura 46. Proceso de decelularización ................................................................ 63
Figura 47. Piel de cerdo nativa 10X. ..................................................................... 64
Figura 48. Piel de cerdo nativa 40X. ..................................................................... 64
Figura 49. Piel de cerdo decelularizada 40X. ........................................................ 65
Figura 50. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas, diámetro aprox 45,3 nm.
.............................................................................................................................. 65
Figura 51. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas, diámetro aprox 378 nm
.............................................................................................................................. 66
Figura 52. EDX que registra presencia de Silicio y Oxígeno en las nanopartículas
sintetizadas. .......................................................................................................... 67
Figura 53. Emisión de Fluorescencia de las nanopartículas expuestas a luz UV.. 68
xiv
Figura 54. Aglomeraciones de NP´s acumuladas en la membrana de agar. ........ 73
Figura 55. Imagen de microscopia confocal donde se evidencia acumulación de
NP´s en células epiteliales. ................................................................................... 76
Figura 56. Imagen de microscopía confocal después de exposición a NP´s . ...... 77
Figura 57. Imagen de microscopia confocal de piel decelularizada. ..................... 77
Figura 58. Imágenes de penetración de NP´s de 378 nm. .................................... 78
Figura 59. Imágenes de Microscopía Óptica de los moldes en vidrio para el
sistema microfluídico. ............................................................................................ 79
Figura 60. Imágenes de Microscopía Óptica de los canales en PDMS del sistema
microfluídico. ......................................................................................................... 80
Figura 61.Láminas a) superior y b) inferior. ........................................................... 80
Figura 62. Membrana porosa fabricada. ............................................................... 82
Figura 63. Imagen de microscopia óptica de la membrana fabricada. .................. 82
Figura 64. Ensamble sistema microfluidico. .......................................................... 83
xv
LISTA DE GRAFICAS
Gráfica 1. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro
promedio de 45,3 nm. ........................................................................................... 66
Gráfica 2. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro
promedio de 378 nm. ............................................................................................ 67
Gráfica 3. Espectros de absorción de las nanopartículas. .................................... 69
Gráfica 4. Distribución de tamaño de la solución de NPs (43,5nm). ..................... 69
Gráfica 5. Distribución de tamaño de la solución de NPs (378 nm) ...................... 70
Gráfica 6. Espectros de absorción a diferentes concentraciones de NPs ............. 71
Gráfica 7. Curva calibración NPs 43nm ................................................................ 71
Gráfica 8. Curva Calibración NPs 378 nm. ............................................................ 72
Gráfica 9. Perfil de concentración de NP de SiO2 (43,5nm) en la solución receptora
a lo largo del tiempo. ............................................................................................. 73
Gráfica 10. Perfil de concentración de NP de SiO2 (378 nm) en la solución
receptora a lo largo del tiempo. ............................................................................. 74
Gráfica 11. Perfil de concentración de NPs de 45 nm (azul) y 378nm (rojo). ........ 74
Gráfica 12. Perfil de concentración de NP de SiO2 (43,5 nm) en la solución
receptora a lo largo del tiempo. ............................................................................. 75
Gráfica 13. Perfil de concentración de NPs de 45,3nm en piel decelularizada y
normal. .................................................................................................................. 76
Gráfica 14. Perfil Canal Superior. .......................................................................... 81
Gráfica 15. Perfil Canal Inferior. ............................................................................ 81
Gráfica 16. Perfil membrana porosa. ..................................................................... 82
1
1. INTRODUCCIÓN
La nanotecnología, es un campo relativamente nuevo de investigación y
elaboración de materiales industriales con base en la creación de nuevas clases
de estructuras moleculares originales, muestra rápidos avances que prometen
cambiar radicalmente o afectar muchas áreas de la ciencia y la tecnología.
Además, ofrece innumerables posibilidades para el progreso humano, mediante la
creación de varios tipos de nanomateriales aplicables en revolucionarios
tratamientos médicos [1-4], en la investigación agrícola [5] y métodos de
diagnóstico de inocuidad alimentaria [5-8], en procedimientos de restauración
ambiental [9, 10], aplicaciones energéticas como el revestimiento de células
solares [11, 12], incluso en productos cotidianos de gran volumen como los
cosméticos [13, 14], tejidos repelentes de la suciedad [15] y pintura auto-lavable
[15]. No obstante, es esencial y urgente evaluar no sólo los beneficios, sino
también los posibles riesgos que plantean las nanopartículas y acordar medidas
efectivas mediante criterios reguladores adecuados.
Debido a esto muchos investigadores [6, 13, 16-32] han analizado la citotoxicidad
de micro y nanopartículas en los sistemas biológicos, observando grandes daños
en la mayoría de los órganos del cuerpo humano, esto debido a su facilidad para
transportarse hacia el cuerpo mediante cuatro diferentes mecanismos (inhalación,
ingestión, contacto dérmico y exposición iatrogénica por inyección de
nanomateriales), a su reactividad , tamaño y propiedades novedosas diferentes a
las de sus macromoléculas, a su facilidad de translación a todo el cuerpo humano
mediante el sistema circulatorio y linfático[33-37].
Algunos estudios realizados [16-26, 36, 38-42] respecto al efecto de las
nanopartículas en el cuerpo mostraron efectos como estrés oxidativo, generación
de especies reactivas de oxígeno, aumento de la concentración de Ca+ en la
célula, peroxidación lipídica, daño de la función mitocondrial, daño en la
membrana celular y daño en el ADN generando finalmente muerte celular. Todos
estos estudios se han realizado experimentalmente mediantes ensayos in vitro e in
vivo.
2
El Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks
(SCENIHR) con el fin de evaluar los riesgos potenciales de los nanomateriales
para la salud humana identificó algunos vacíos de conocimiento que deben de
abordarse, algunas de sus recomendaciones son: determinar la cinética y
mecanismo de transporte de las nanopartículas y su caracterización,
estandarización de los procesos de síntesis de las nanopartículas analizadas y
evaluación de la medida en que se pueden extrapolar los datos de toxicología de
estudios in vitro a estudios in vivo[34].
En este trabajo se presentan diseños de sistemas, equipos y protocolos
necesarios para realizar estudios del transporte de nanomateriales en medios
biológicos, esto incluye diseño de celda de difusión para efectuar pruebas de
penetración dérmica de nanomateriales, así como el protocolo para la realización
de pruebas en esta, diseño de un sistema de decelularización de órganos y su
protocolo; este sistema se utilizara para realizar el transporte de nanomateriales
en órganos decelularizados mediante perfusión, también se presenta el diseño de
un sistema microfluídico que simula la interface alveolo-capilar para realizar
transporte de nanopartículas tanto por vía respiratoria tanto como por vía
circulatoria. Este último dispositivo se diseña con el ánimo de realizar pruebas en
un dispositivo que pueda simular condiciones de ensayos in vivo sin realizar
experimentaciones en animales.
3
2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
La nanotecnología se considera como una nueva tecnología que involucra la
manipulación de materiales a nivel molecular o de una escala de
aproximadamente 1 a 100 nanómetros[33, 34, 43] (milésimas de millón de metro),
para crear nuevas estructuras moleculares conocidas como nanomateriales, las
cuales poseen características únicas y nuevas diferentes a las de los materiales
originales de las que se derivan[35].
La nanotecnología ofrece inconmensurables posibilidades para el desarrollo
humano mediante la creación de gran variedad de nanomateriales aplicables en
revolucionarios tratamientos médicos[1-4, 44], aplicaciones energéticas en la
elaboración de celdas solares[11, 12, 45], productos cosméticos[13, 14, 26],
alimenticios[5, 7],electrónicos[15, 35], industria agrícola[5, 44], de comunicaciones
y en purificación de agua[9, 10], etc. En la Figura 1 podemos observar algunas de
las áreas de aplicación de los nanomateriales.
Figura 1Áreas de aplicación de la nanotecnología. Fuente: Nanoposts (2007). Government Policy and Innitiatives in Nanotechnology Worldwide 2007. Canadá.
4
Debido al amplio rango de aplicaciones, es de gran importancia evaluar no solo los
beneficios, sino también los riesgos potenciales que pueden presentar los
nanomateriales.
1.1. NANOMATERIALES
1.1.1. Nanopartículas.
Una nanopartícula se considera como una partícula que cuenta con una o más de
sus dimensiones en el rango de 100 nm o menos y un rango de átomos entre 102
y 108[46, 47].
1.1.2. Nanotubos de Carbono.
Los nanotubos de carbono son láminas de grafito enrolladas en forma de cilindro,
cerrados en sus extremos con anillos pentagonales, los nanotubos de carbono
poseen diámetros de aproximadamente 1 a 2 nm y longitud que puede oscilar
hasta centímetros, lo que los hace efectivamente una estructura unidimensional
llamados nanocables [48-51]. Los nanotubos se consideran también una forma
alotrópica del carbono, donde sus carbonos se encuentran unidos de forma
covalente.
Figura 2. Estructura del Nanotubo de carbono. Fuente: Handbook of Nanoscience, Engineering, and Technology.
5
1.1.3. Fullerenos.
Los fullerenos son nanoestructuras compuestas por carbono que presentan
organización estructural esférica, con un diámetro de 1 a 2 nm [51]. El fullereno
más conocido es el buckminsterfulereno, el cual está compuesto por 60 átomos de
carbono con una conformación esférica similar a la de un balón de fútbol,
constituido por 20 hexágonos y 12 pentágonos[52]. En cada intersección del
fullereno se encuentra un átomo de carbono, estos átomos se encuentran
interconectados formando una molécula cíclica unida por débiles fuerzas de
Vander Waals.
Figura 3. . Estructura del Fullereno. Fuente: Shatkin, Jo. Nanotechnology: Health and Environmental Risks.
Las nanopartículas muestran gran diversidad estructural, cada estructura exhiben
sus propias características individuales, tales como tubos, puntos, hilos, fibras y
cápsulas[1, 53, 54]. Todos estos materiales a nanoescala tienen propiedades
físicas, químicas, ópticas, eléctricas, catalíticas y mecánicas sustancialmente
diferentes a las de sus contrapartes correspondientes de tamaño macro [16]. En
consecuencia, es razonable suponer que estas desviaciones en las propiedades
también pueden conducir a un comportamiento diferente en el cuerpo. Además, no
sólo la dosis expresada como masa, sino también el tamaño de partícula, número
de partículas, superficie y otras características (como la carga, forma, etc.)
determinan las interacciones biológicas de estas nanopartículas. De hecho, varios
estudios sugieren que estas nanopartículas tienen perfil de toxicidad diferente en
comparación con las partículas más grandes [17, 38].
6
1.2. NANOMEDICINA
La nanomedicina consiste en la aplicación de la nanotecnología para el
diagnóstico, prevención y tratamiento de afecciones de la salud. Gran parte de los
desarrollos en nanomedicina se encuentran enfocados a enfermedades de mayor
intensidad en países desarrollados, como son enfermedades cardiovasculares, el
cáncer y el VIH.
1.3. RIESGOS POTENCIALES DE LOS NANOMATERIALES
Los potenciales beneficios de la nanotecnología son inmensos, como también lo
son sus peligros. Los nanomateriales se desarrollan por sus propiedades
radicalmente nuevas que conllevan resultados completamente novedosos y
algunas veces impensados. Mientras existe un amplio consenso de que la
nanotecnología alberga una promesa en cuanto a su aplicación en materiales,
medicina y energía, también hay grandes dudas sobre las implicancias biológicas,
medioambientales y de seguridad.
Las preocupaciones por los efectos nocivos de las nanopartículas y los
nanomateriales se deben principalmente a[33]:
El transporte de nanomateriales al medio ambiente se facilita, debido
a su gran área superficial, estructura cristalina, y reactividad. Al
ingresar en los sistemas de los seres vivos, las nanopartículas son
difíciles de controlar y pueden causar daños al interferir en sus
procesos biológicos.
Las partículas ultrafinas presentan un comportamiento biológico y
movilidad diferente a las macromoléculas, a primera vista se puede
apreciar que es más probable que las nanopartículas sean
absorbidas y llevados hacia el interior de las células más fácilmente
que partículas más grandes, esto debido a su pequeño tamaño.
7
Debido al tamaño casi invisible de las nanopartículas, estas pueden
ser distribuidas accidentalmente a los seres vivos a través del aire, el
suelo y el agua, causando daños en un principio a plantas y
animales, mientras que con el transcurso del tiempo se convierten en
un peligro para los seres humanos. También debido al amplio uso de
los nanomateriales en productos comerciales es más difícil contener
y controlar a las nanopartículas de su propagación en el medio.
1.4. MECANISMOS DE TRANSPORTE DE NANOMATERIALES
Para entender los efectos tóxicos potenciales que pueden presentar los
nanomateriales es de gran importancia conocer las diferentes rutas de exposición
mediante las cuales estos pueden ingresar a los seres vivos. Los nanomateriales
pueden ingresar por cuatro diferentes mecanismos como son: inhalación a través
del tracto respiratorio, ingestión a través del tracto digestivo, por la piel a través del
contacto dérmico y exposición iatrogénica por inyección de nanomateriales en la
corriente sanguínea[33-37].
Una vez en el cuerpo los nanomateriales se pueden redistribuir a organismos y
tejidos a través de la circulación sanguínea o por la migración de células. Este
desplazamiento se debe a la posibilidad que tiene las nanopartículas de
incorporarse en las células, cruzar sus membranas celulares y a moverse dentro
de éstas. En algunos estudios [18] se ha observado el traspaso de los
nanomateriales a través de la barrera hemato-encefálica, lo cual puede abrir
grandes posibilidades terapéuticas, pero al mismo tiempo implica mayores
preocupaciones debido a que se puede presentar con mayor facilidad el traspaso
de sustancias tóxicas de la sangre directamente a los tejidos del cerebro. Así
mismo también se ha determinado que nanopartículas ultrafinas pueden ingresar
al cerebro por medio del Nervus Olfactorius[19] después de la deposición en la
mucosa olfativa de la nariz, seguido de inhalación.
8
Figura 4. Proceso ADME de las nanopartículas en el cuerpo. Las líneas de color negro representan rutas
confirmadas de las nanopartículas, las líneas discontinuas representan las rutas hipotéticas.Fuente: Werner I. Hagens, et al. What do we (need to) know about the kinetic properties of nanoparticles in the body?
En la Figura. 4, se observa de forma esquemática el ciclo de vida potencial de las
nanopartículas en el cuerpo humano. Esta figura muestra una visión general de
los procesos ADME (adsorción, distribución, metabolismo y excreción) en el
cuerpo. En este esquema se puede observar que las nanopartículas pueden ser
distribuidas a un mismo órgano por varias rutas de exposición. Por ejemplo, las
nanopartículas que se encuentran en el tracto gastrointestinal pudieron ingresar
mediante productos ingeridos, pero por otro lado, también pueden llegar al tracto
gastrointestinal a través de una ruta indirecta, como el ingreso de las
nanopartículas a través las vías respiratorias o la piel, donde posteriormente estas
son absorbidas por el sistema circulatorio. A partir de ahí, las partículas pueden
ser distribuidas en el hígado, tomada por los hepatocitos y excretadas en la bilis
hacia al tracto gastrointestinal.
Los órganos principales de exposición a nanomateriales se pueden describir
como[37]:
Órganos de recepción: piel, tracto gastro-intestinal y el tracto respiratorio.
Órganos secundarios: Sistema nerviosos central, sistema cardiovascular, sistema
inmune, hígado, riñones, placenta.
9
1.5. EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO
La presencia de nanopartículas en los pulmones puede llegar a causar
neumoconiosis (inflamación pulmonar) que es una enfermedad pulmonar causada
por la exposición a partículas de polvo con dimensiones nanométricas de
diámetro, un tipo de neumoconiosis causada por la exposición e inhalación de
nanopartículas de SiO2 es la silicosis, la cual es caracterizada por una fibrosis
progresiva de los pulmones. En algunos estudios realizados se observó que las
nanopartículas podían atravesar las paredes alveolares ingresando de estar forma
en la corriente sanguínea y ser transportada a los demás órganos del cuerpo.
También se observan daños en los vasos sanguíneos y producción de coágulos
de sangre [20, 21]. Otros nanomateriales como los nanotubos de carbono pueden
generar cáncer de pulmón o mesioteloma similar a la producida por los asbestos.
En pruebas realizadas a ratas y ratones sometidas a nanotubos de carbono de
una sola pared se presentaron granulomas epiteloidales e inflamaciones
intersticiales [39, 40].
Uno de los mecanismos de mayor importancia de ingreso de las nanopartículas al
cuerpo humano es mediante los pulmones, donde la deposición de partículas
inhaladas es determinada por procesos de difusión, la deposición de las
nanopartículas se puede presentar en tres diferentes zonas: zona naso-faríngea,
la zona traqueo-bronquial y la zona alveolar.
Figura 5. Deposición de Partículas inhaladas en diferentes partes del sistema respiratorio. Fuente: Nanoparticle Tecnology Handbook.
10
En la Figura 5 se observa que cerca del 90% de partículas inhalas de dimensión
de 1 nm se depositan en la zona naso-faríngea , un 10% en la zona traqueo
bronquial y ninguna en la zona alveolar; mientras que, partículas de dimensiones
entre 5-10 nm se depositan en las tres zonas con porcentajes entre 20 y 30%,
partículas con dimensiones de 20 nm se depositan un 50% en la región alveolar y
un 10 a 20% en la regiones naso-faríngeas y traqueo-bronquial respectivamente.
Como se pudo observar en la gráfica dependiendo del tamaño de la partícula la
deposición toma lugar en diferentes partes del tracto respiratorio, Schmid [37] nos
presenta la distribución de las nanopartículas en el sistema respiratorio, esta se
puede observar en la Figura 6.
Figura 6. Deposición de partículas en diferentes regiones del sistema respiratorio. Fuente: G. Schmid. Nanotechnology: Assessment and Perspectives.
En el 2004, Lam et al [22] reporto que una suspensión de nanotubos de carbono
causa lesiones inusuales en pulmones de ratones interfiriendo con la absorción de
oxígeno, este hallazgo fue confirmado por Warheit [40] en el mismo año quien
descubrió que las células inmunes se acumulan alrededor de los nanotubos,
generando el bloqueo los bronquios en los pulmones de los roedores y haciendo
que se sofoquen. Posteriormente Oberdörster [19] encontró que las nanopartículas
se acumulan en las fosas nasales, pulmones y cerebro de las ratas. También
11
documento el fenómeno de stress oxidativo que se presentó en el cerebro de un
pez expuesto a nanopartículas por 48 horas [23].
1.6. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR CONTACTO DERMICO
En la actualidad, más de 20 países en todo el mundo fabrican y comercializan
diferentes variedades de productos de consumo basados en nanotecnología de
cosméticos, los cuales forman una las categorías más grandes. Debido al tamaño
extremadamente pequeño de las nanopartículas (generalmente inferior a 50nm)
que se utilizan existe la preocupación de que estas puedan interactuar
directamente con macromoléculas como el ADN.
Nanopartículas como ZnO y TiO2 son utilizadas ampliamente en bloqueadores
solares (Ver Tabla 1 [35]) y cosméticos como sombras, polvos y labiales.
Tabla 1. Agentes activos de protección solar que se encuentran en tres diferentes productos comerciales de protección solar.
Bloqueador Solar 1 Bloqueador Solar 2 Bloqueador Solar 3
4-Mebenzylidinecamphor, 6% 4-Mebenzylidinecamphor, 6% Octylmethoxycinnamate (OMC), 7.5%
Parsol 1789, 2% Parsol 1789, 2% Oxybenzone, 5%
Mexoryl SX, 1% Mexoryl SX, 2% 2-PBSA, 2.3%
Titanium dioxide, 3.2% Titanium dioxide, 5% Titanium dioxide, 4.5%
Pure melanin
Vegetable Extracts
Fuente: Serpone et al. Inorganic and organic UV filters: Their role and efficacy insunscreens and suncare products.
Las nanopartículas utilizadas para bloqueadores solares se han revestido con
otros materiales como siliconas, ácidos grasos o circonio para facilitar la
dispersión de las nanopartículas y evitar su aglomeración. La presencia de estas
capas, hace que las células y los tejidos estén expuestos principalmente a las
moléculas orgánicas del exterior en lugar de los núcleos de ZnO y TiO2. La
presencia y la naturaleza de los revestimientos (que no son fácilmente
identificables en las formulaciones de los productos comerciales debido a la
necesidad de mantener los secretos comerciales) pueden afectar la manera en
12
que las nanopartículas reaccionan con la piel. Las preguntas han surgido
recientemente si el pequeño tamaño de ZnO o nanopartículas de TiO2 utilizados
en cremas solares les permitirá penetrar accidentalmente en la piel generando
daños a las células y finalmente al ADN.
Sin embargo, el trabajo realizado por Sharma et al[24], en el cual células
epidérmicas humanas A431 se sometieron a nanopartículas de ZnO, se determinó
que nanopartículas de ZnO incluso a bajas concentraciones poseen un potencial
genotóxico en las células epidérmicas, el cual pude ser medido a través de la
peroxidación lipídica y el stress oxidativo (Figura 7).
Debido al fenómeno de stress oxidativo generado por las nanopartículas que
alteran el entorno reductor presente en la célula, se genera el desbalance de su
estado normal redox causando efectos tóxicos por la producción de peróxidos y
radicales libres, que dañan a todos los componentes de la célula, incluyendo
proteínas, lípidos y el ADN.
Figura 7. Representación esquemática de la toxicidad inducida por nanopartículas de ZnO. Fuente: Sharma et al. DNA damaging potential of zinc oxide nanoparticles in human epidermal cells.
13
Otros trabajos realizados de gran importancia es el de Dunford et al [25] donde
demostró que cuando una plásmido de ADN fue expuesto a estimulación por luz
solar, los rayos UVA y UVB en presencia de nanopartículas de TiO2, se presenta
la generación de radicales hidroxilo acelerando así la ruptura de cadenas de ADN.
Serpone et al [26] también describe los efectos nocivos de TiO2 en el ADN. Ellos
han probado la formación de radicales hidroxilo producidos por la irradiación de
nanopartículas de TiO2 extraído de productos de protección solar, estos estudios
se realizaron tanto in vitro e in vivo. Los autores verificaron al TiO2 como el
iniciador de las reacciones nocivas, como las rupturas de cadenas de ADN a
través de la generación de radicales libres. Sin embargo, la metodología del
estudio no está descrita, y por lo tanto los resultados no pueden ser reproducidos
o analizados.
En 2002, Uchino et al [41] examinó la generación de radicales hidroxilo por los
rayos UVA en distintas estructuras de TiO2. Ellos encontraron que la irradiación
UVA en TiO2 anatasa (estructura octaédrica) se genera gran cantidad de radicales
hidroxilo, mientras que la forma de rutilo (estructura tetraédrica) presenta una
menor generación de estos. La evaluación de la citotoxicidad del radical hidroxilo
se puso a prueba en células de ovario de hámster chino, donde se observó la
sensibilidad de estas células a la cantidad de radicales hidroxilos formados en el
primer experimento.
Recientemente Hidaka et al [42] estudió el daño al ADN producido por TiO2 y ZnO
después de la exposición a rayos UV. Los autores observaron como el radical
hidroxilo ataca a la ribosa, la desoxiadenosina, guanosina, citidina y nucleótidos
después de 30 minutos de irradiación. Esta reacción resulta en la rápida
degeneración del componente de los nucleótidos del ADN-desoxiadenosina '5'-
monofosfato, monofosfato de guanosina, citidina monofosfato y en presencia de
TiO2 y ZnO UV irradiados.
14
A pesar de los estudios realizados en los que se observa que nanopartículas de
TiO2 y ZnO son potencialmente tóxicas para el ADN por la formación de ROS
(especies de oxígeno reactivo), muchos investigadores creen que esto sólo debe
ser visto como una preocupación legítima de toxicidad si se presentan indicios de
que nanopartículas de TiO2 y ZnO son capaces de penetrar la epidermis. Si las
partículas nanométricas utilizadas en los protectores solares aplicados en la piel
llegan a penetran en la dermis, se puede presentar la absorción sistémica de estas
partículas con potenciales efectos inflamatorios y cancerígenos. Varios autores
han propuesto que las nanopartículas de aplicación tópica puede llegar a la dermis
y, finalmente, incorporarse sistemáticamente [55].
Aunque se han presentado estudios como el de Tan et al [13] donde se mostró un
aumento del nivel de titanio en la epidermis y la dermis después del uso de
protectores solares, otros estudios realizados como los de Schulz et al [27] y
Gamer et al [28] han demostrado que nanopartículas de TiO2 y ZnO son incapaces
de penetrar en la epidermis Estos experimentos no tuvieron en cuenta el
movimiento de la piel, la carga de la partícula, las aberturas foliculares y la edad
de la piel analizada.
Tinkle et al[56] mostró que la penetración de micropartículas (500-1000 nm) a
través de la epidermis se produjo después de la aplicación de un movimiento de
flexión. Otros estudios realizados por Rouse et al[57] y Oberdörster [23]
mostraron la penetración del fullereno C60 a través de la piel después de flexión
mecánica. Esto llega a sugerir que se presenta mayor absorción de las
nanopartículas en pliegues de la piel mientras se presenta movimiento podría que
en el de una piel plana.
Kohli y Alpar [58] han informado de la penetración de partículas de látex con carga
negativa (50 y 500 nm), mientras que partículas con carga positiva o neutras no
fueron capaces de penetrar la epidermis.
15
Debido a esto se llegó a la conclusión de que también la carga de las
nanopartículas es uno de los factores importantes en el proceso de absorción
transdérmica. Esto nos lleva a concluir que la piel es permeable a los
nanomateriales que presentan diferentes propiedades físico-químicas (tamaño,
forma, carga, materiales).
Otro tipo de nanopartículas usadas ampliamente son las nanopartículas de plata,
las cuales se utilizan en pinturas, cosméticos, bloqueadores solares y aplicaciones
médicas. En un estudio realizado por Ahamed et al[29] se pudo observar la
citotoxicidad de las nanopartículas donde se presenta la generación de ROS,
estrés oxidativo, daño en el ADN y apoptosis; estos efectos se pueden observar
en la Figura 8. En otro estudio in vitro realizado por Larese et al [30] se muestra la
absorción de las nanopartículas de plata en piel dañada y piel sana, donde se
presenta una absorción baja pero detectable en el estudio realizado.
Figura 8. Posibles mecanismos de toxicidad inducidos por nanopartículas de Plata Fuente: Ahamed, Silver nanoparticle applications and human health.
1.7. EFECTO DE LAS NANOPARTICULAS POR INGESTION:
El tracto gastro-intestinal representa un importante punto de ingreso de las
nanopartículas al cuerpo, debido a que algunos productos alimenticios llegan a
contener nanopartículas [6]. Por ejemplo, en el sector de la alimentación hay
16
múltiples aplicaciones potenciales (Tabla 2), en la agricultura (utilización de
nanosensores para la detección de patógenos en animales y vegetales), en el
procesamiento de alimentos (en nanocápsulas para mejorar el sabor), en el
envase de alimentos (nanoarcillas y nanopelículas usados como
barreras materiales para prevenir su deterioro y la absorción de oxígeno) y los
suplementos dietéticos (nanoencapsulación de nutrientes para mejorar la
absorción, la estabilidad o la ejecución selectiva)[5, 7].
Tabla 2. Nanoalimentos registrados en U.S.A
Producto Canola
Active Oil®
Nanotea™ Nanoceuticals™ Slim
Shake Chocolate
Maternal Water Nanosupplements
Detalles Nanomicelas
con
fitosteroles
para inhibir
la adsorción
del
colesterol.
Nanotecnologia de
ball-milling para
mayor liberaciónde
fitonutrientes y
selenio.
Cocoa
nanoencapsulado el
cual saboriza sin
aportar exceso de
azucar
Plata
nanocoloidal
51 diferentes
nanosuplementos
(nanominerales,
nanospray de
vitamina B12, omega
3 nanoencapsulado,
etc.
Compañía Shemen
Industries
Ltd.
Shenzhen Become
Industry & Trade
Co., Ltd.
RBC Life Sciences®,
Inc
La Posta del
Águila®,
Varias
País de
elaboración
Israel China USA Argentina USA
Fuente: The Project on Emerging Nanotechnologies which was established in April 2005 as a partnership between the Woodrow Wilson International Center for Scholars and the Pew Charitable Trusts. Fuente: www.nanotechproject.org/inventories/consumer.
El ingreso de las nanopartículas al tracto gastro-intestinal puede presentarse por
una vía diferente a la ingestión, a través del sistema respiratorio debido a que las
partículas inhaladas son excretadas mediante la escalera mucociliar e ingeridas
posteriormente en el tracto gastrointestinal, esta vía se observa en la Figura 4.
En un estudio realizado por Sonavane et al [31] se analizó la permeabilidad de
nanopartículas de oro a través de piel e intestino de ratas, donde se observó una
mayor permeabilidad en el intestino que en la piel de las ratas; demostrado que las
nanopartículas de oro puede ser utilizadas como un medio eficaz de transporte por
vía transdérmica y administración oral de fármacos y vacunas.
17
Las nanopartículas que se encuentran en el tracto digestivo se pueden distribuir al
sistema linfático y al sistema circulatorio por un proceso llamado persorción[59].
Otros estudios realizados en ratas han permitido confirmar que las nanopartículas
se absorben principalmente en las placas de Peyer del intestino delgado y también
a través de los enterocitos intestinales [18, 32, 60]. También en algunos estudios
se ha logrado determinar que la carga de las partículas es un factor determinante
para su absorción, ya que partículas positivas son absorbidas con mayor eficacia
en el tracto gastrointestinal a diferencia de las partículas neutras o negativas [61].
Otro factor determinante en la absorción es el tamaño de las nanopartículas el
cual se observa en el trabajo realizado por Jani et al[62] donde se encontró que
nanopartículas de poli estireno de 50 y 100 nm se absorbieron en un 34% y 26%,
respectivamente.
Las nanopartículas al ser adsorbidas y distribuidas al sistema linfático y circular,
pueden dispersarse por todos los órganos del cuerpo humano generando
posiblemente estrés oxidativo, generación de especies reactivas de oxígeno o
reacciones inesperadas del sistema inmune[8]. Si la presencia de una
nanopartícula en la corriente sanguínea no genera un efecto citotóxico directo
(muerte celular) las nanopartículas pueden inducir una respuesta inesperada del
huésped, como la secreción de citoxinas inflamatorias y metaloproteinasas las que
juegan un papel importante en la destrucción de tejidos [63]. Otro posible daño
que se pude presentar en el sistema circulatorio por la presencia de
nanopartículas se genera debido a que las proteínas presentes en la sangre se
pueden adherir a la superficie de la nanopartícula, cambiando la forma de la
proteína, así como su función; estos cambios producidos en las proteínas podrían
provocar efectos no deseados y peligrosos, tales como la coagulación
sanguínea[64]. Otro importante efecto que se puede generar es la alteración
intracelular de la concentración de calcio en las células lo que causa la creación
de especies reactivas de oxígeno, generando inflamación en la célula [37].
18
En la Figura 9 se observa el porcentaje de participación de los elementos
utilizados en aplicaciones nanotecnológicas, en este gráfico podemos observar
que todas las nanopartículas que se aplican para productos de consumo son las
que han arrojado resultados preocupantes en los estudios realizados por los
diferentes investigadores nombrados anteriormente, por esta razón es de gran
importancia analizar el transporte de nanopartículas y sus efectos en el cuerpo
humano.
Figura 9. Nanomateriales usados en productos de consumo (2006). Fuente: Maynard, Andrew (2006). Nanotechnology: A Research Strategy for Addressing Risk. Woodrow Wilson International Center for Scholars. US.
1.8. MODELOS UTILIZADOS EN EL TRANSPORTE DE NANOPARTÍCULAS:
En esta sección observaremos algunos de los modelos matemáticos realizados
por algunos investigadores de la distribución de drogas transportadas por
nanopartículas en el cuerpo Humano.
1.8.1. Distribución de agentes anti cancerígenos.
Modelo de difusión:
La liberación de un fármaco a partir de una matriz polimérica generalmente sigue
la segunda ley de Fick[2]. Donde el gradiente de concentración de las partículas
esféricas está dada por:
[Ec-1]
Donde c es la concentración local de la droga en el tiempo t y a la distancia r del
34%
30%
17%
9% 9%
1%Carbono
Plata
Sílice
Titanio (incluido óxido)
Zinc (incluido óxido)
Oxido de Cerio
19
centro de la partícula y D es el coeficiente de difusión del fármaco en la matriz
polimérica.
Por lo tanto,
[Ec-2]
α=V/(VsKp) donde V es el volumen del líquido del medio circundante, Vs es el
volumen total de las partículas qn = λR, donde λ es el valor Eigen y R es el radio
de las partículas.
1.8.2. Modelamiento de la distribución de nanopartículas en esferas
tumorales multicelulares
En el estudio realizado por Goodman et al [65], se desarrolló un modelo
matemático de la penetración de nanopartículas en esferas multicelulares
mostrando la dependencia de los cambios de distancia radial de la arquitectura del
tumor, representado por la fracción de volumen de tejido accesible a la difusión de
las nanopartículas. El modelo utilizado fue desarrollado teniendo en cuenta la no
uniformidad estructural de las esferas en la dirección radial y la internalización de
las partículas en las esferas multicelulares:
[Ec-3]
[Ec-4]
[Ec-6]
Donde r es la coordenada radial (r = 0 es el centro de la esfera y r = R es su borde
exterior), t es la variable tiempo, ε es la porosidad volumétrica de las esferas
(fracción del volumen de las esfera accesible a las partículas), C es la
concentración molar de partículas libres en el volumen de la esfera (C / ε es la
concentración de partículas no ligadas en el volumen intracelular), Cb es la
20
concentración de partículas ligadas, Cbs es la concentración de sitios de enlace
disponibles en la superficie celular, Ci es la concentración de partículas
interiorizadas, D es el coeficiente de difusión efectiva, ka es el coeficiente de
velocidad de asociación, kd es el coeficiente de velocidad de disociación, y ki es el
coeficiente de velocidad de internalización. Las condiciones iniciales y límites
utilizados para la difusiónson:
[Ec-7]
Donde C0 es la concentración de partículas fuera de las esferas, la cual está
definida por condiciones experimentales. El coeficiente de difusión efectivo, la
porosidad volumétrica, y la concentración inicial de sitios de unión son funciones
de la coordenada radial.
Utilizando un simple modelo de poros paralelos para medios porosos, la
concentración inicial molar de los sitios de enlace en el interior de la esfera puede
ser relacionada con la estructura esférica y la cantidad de sitios de unión sobre la
superficie de las células.
[Ec-10]
Donde a es el radio de las partículas, rp es el radio de poro efectivo, NA es el
número de Avogadro, y β es el coeficiente adimensional que caracteriza la
densidad de sitios de enlace disponibles sobre la superficie celular. El coeficiente
kβ cuantifica la diferencia de densidad en los sitios de enlace de las superficies de
las células con configuración en monocapa en comparación con las células de
esféricas.
21
El coeficiente de difusión puede ser modelado como una de las formas sugeridas
por Fournier y Saltzman para espacios intercelulares y porosos en
biomateriales[66, 67].
El modelo para el coeficiente de difusión se define como sigue:
[Ec-13]
[Ec-14]
Donde D0 es el coeficiente de difusión en medio líquido, kB es la constante de
Boltzmann, T es la temperatura absoluta, µ es la viscosidad del líquido, L (λ) es el
factor responsablede la reducción de hidrodinámica y estérica del coeficiente de
difusión en el poro, τ (ε) es la tortuosidad causada por el aumento de la longitud de
difusión en la esfera, y F> 1 es el factor de forma cuantifica la obstaculización en
los poros de la esfera.
1.8.3. Transporte de nanopartículas de oro en piel e intestinos de
ratas.
Para el modelo del transporte de las nanopartículas de oro en la piel de ratas e
intestino realizado por Sonavane et al[31] se utilizó lo siguiente:
La ley de Fick de difusión en estado estacionario se establece mediante la
siguiente ecuación:
Ec-15
Donde J es el flujo de difusión (mol /cm2 s), D es el coeficiente de difusión (cm2 /s),
C es la concentración (mol/cm3) y x es la longitud (cm).
Modificando la Ec-9 obtenemos:
Ec-16
22
Ec-17
Donde V1 y V2 representan el volumen de la suspensión de oro nanoparticulada y
la solución tampón fosfato en las fases de los donantes y receptores,
respectivamente. C1 (t) y C2 (t) denota la densidad del número de nanopartículas
de oro en las fases respectivas según lo indicado por los subíndices 1 y 2. P es el
coeficiente de permeabilidad (cm / s) y A es el área de superficie de la membrana
(cm2), es decir, la piel de rata o el intestino.
Inicialmente, en el tiempo t = 0, las condiciones son las siguientes:
Donde,
Ec-18
Teniendo en cuenta que la concentración de coloides de oro en el interior de la
membrana es muy baja, reordenando la ecuación (Ec-18), obtenemos:
Ec-19
Sustituyendo la Ec-18 en la Ec-16 obtenemos,
Ec-20
Ec-21
Sustituyendo Ec-21 en Ec-20
Ec-22
Ec-23
Y
Ec-24
Donde
Ec-25
23
El coeficiente de difusión teórico se calculó usando la ecuación de Stokes-
Einstein:
Ec-26
Donde D (T) es el coeficiente de difusión, T es la temperatura, µ es la viscosidad
del medio y a es el radio de las nanopartículas de oro.
El coeficiente de permeabilidad teórico [P (T)] se calculó mediante la ecuación
siguiente:
Ec-27
Donde d es el espesor de la membrana.
En el artículo realizado por Siepmann et al[68] se observa un modelo matemático
realizado por Saltzman y Radomsky (1991) donde se tiene en cuenta la difusión
de las drogas en los sistemas de administración intercraneal, así como la
eliminación de las drogas.
La teoría se basa en los siguientes supuestos:
(i) En la superficie de los sistemas de dosificación de la concentración de la
droga es constante.
(ii) La eliminación del fármaco sigue una cinética de primer orden (la
velocidad de eliminación del fármaco es proporcional a su
concentración).
(iii) La difusión es isotrópica (no dependiente de una dirección espacial).
(iv) Los procesos de convección son insignificantes.
(v) La liberación del fármaco desde los dispositivos cilíndricos se produce
sólo en la dirección axial.
Este modelo se basa en la segunda ley de Fick de difusión (teniendo en cuenta
una dimensión), eliminando el término de primer orden.
Ec-28
24
Donde c es la concentración del fármaco en el tejido cerebral, t es el tiempo (t = 0
en el momento de la administración de dispositivos), D representa el coeficiente de
difusión aparente del fármaco en el cerebro, x es la coordenada espacial (distancia
de la interfaz de sistema de administración al tejido del cerebro"), y k es la tasa de
eliminación constante de primer orden de la droga administrada.
Las siguientes condiciones iniciales y de contorno se consideraron:
Donde a es la mitad de espesor de la forma de administración cilíndrica y c0 la
concentración de fármaco (constante) en la superficie del dispositivo. La Ec-24
indica que el tejido cerebral está libre de drogas antes de la administración de la
forma farmacéutica. La Ec-25 establece la concentración constante de droga en la
interfaz sistema de administración-tejido cerebral es independiente del tiempo, y la
Ec-26 expresa el hecho de que la concentración de la droga disminuye a cero a
grandes distancias del cilindro.
En condiciones de estado estable, cuando la concentración del fármaco en el
tejido cerebral no varía con el tiempo, sólo con la posición, este conjunto de
ecuaciones se puede resolver para dar:
Ec-29
Por otra parte, teniendo en cuenta las condiciones de estado no estable (en el que
la concentración de la droga varía con el tiempo y la posición), la siguiente
solución puede obtenerse:
Ec-30
Ambas ecuaciones permiten encontrar la concentración de la droga a cualquier
distancia axial de la superficie para las formas de administración cilíndrica.
25
Otro modelo propuesto por Saltzman y sus colegas [69] considera la liberación de
fármacos a partir de formas de administración esféricas, la difusión de las drogas,
la eliminación y la convección dentro del cerebro. La teoría asume que el cerebro
está libre de drogas antes de la administración de dispositivos, que la
concentración de fármaco en la interfaz "vía administración-tejido cerebral" es
constante y que la concentración de fármaco a distancias muy lejanas del sitio de
administración es insignificante. De estas condiciones, se derivó la siguiente
ecuación:
Ec-31
En este caso, c es la concentración de la droga, estando en función del tiempo y la
distancia radial desde el centro de la vía de dosificación r; c0 denota la
concentración de fármaco en la interfaz "vía de administración-tejido cerebral", a
es el radio del dispositivo esférico, v es la velocidad radial aparente en el espacio
extracelular, y D representa la difusividad aparente de la droga en el cerebro.
Raman et al[70] propuso un interesante modelo matemático de la cuantificación de
la liberación de fármaco de micropartículas esféricas de PLGA. La teoría considera
la difusión de la droga, la degradación del polímero y la distribución no homogénea
de los medicamentos en el sistema en t=0 La ecuación básica es la segunda Ley
de Fick de difusión para geometría esférica:
Ec-32
Donde c es la concentración de la droga, t es el tiempo, r la coordenada radial y
D(Mw) denota la dependencia de la difusividad de la droga del peso molecular del
polímero.
Para el peroxican cargado en las micropartículas de PLGA, se encontró la
siguiente dependencia empírica del coeficiente de difusión D sobre el peso
molecular promedio del polímero:
26
Ec-33
Las condiciones iniciales y condiciones límites considerados fueron:
Donde R es el radio de las microesferas. La distribución inicial de la droga f(r) se
determinó por micrografía confocal.
Sólo algunas pocas teorías matemáticas han sido reportadas en la literatura para
la descripción del mecanismo de transporte de masa en el control de liberación de
fármacos basados en lípidos. Recientemente Guse et al[71], propuso la siguiente
solución analítica de la segunda ley de Fick de difusión para cuantificar la
liberación de proteínas de los cilindros constituidos por triglicéridos.
Ec-34
Donde Mt y M∞, representan las cantidades acumuladas absolutas de la proteína
liberada en el tiempo t y en el tiempo infinito, respectivamente, qn son las raíces
de la función de Bessel de primer tipo de orden cero (J0 (qn) = 0), y Rc y H denota
el radio y la altura del cilindro.
Observando todos estos modelos desarrollados para la descripción del fenómeno
de transporte de las nanopartículas en medios biológicos, se puede detallar que
todos se derivan de la segunda ley de Fick, lo que conlleva a inferir que estos
modelos no describen de buena manera el fenómeno de transporte ocurrido
debido a que la ecuación de Fick tiene ciertas restricciones como la suposición de
que el gradiente de concentración varía en forma constante, se considera
transporte unidireccional y además se ignoran los efectos convección; es por esto
27
que es necesario implementar un modelo teórico que describa con una mayor
aproximación lo que sucede en el ámbito del transporte, sin ignorar algunos
parámetros que pueden modificar sustancialmente el transporte de los
nanomateriales en estos medios complejos.
Difusión Anómala:
Una consecuencia de la teoría cinéticaesla ecuación de difusión, que describe las
fluctuaciones de la densidad en un material a lo largo del tiempo. La ecuación
usualmente se escribe como:
Ec- 35
Donde φ(r, t) es la densidad del material que se está difundiendo en un punto r del
espacio y al tiempo t, D es el coeficiente de difusión que se supone constante.
En su importante trabajo de 1905 Einstein presentó una nueva derivación de la
ecuación de difusión. En esta derivación hay dos clases de distribuciones. Una es
la probabilidad f(x, t)dx de encontrar una partícula Browniana en un intervalo [x, x
+ dx], al tiempo t, y otra es la densidad de probabilidad φ(Δ), para un
desplazamiento Δ de la partícula dentro de un sólo paso en el tiempo discreto. La
ecuación básica de evolución es la siguiente:
Ec-36
donde φ(Δ) satisface la condición φ(Δ) = φ(−Δ). Es claro que esta ecuación es
consistente con condiciones de normalización sobre f(x, t) y φ(Δ). Suponiendo
analiticidad de f(x, t), Einstein derivó la ecuación de difusión ∂f/∂t = D∂2f/∂x2donde
la constante de difusión está dada por
Ec-37
Y como mencionábamos antes, el desplazamiento medio crece en el tiempo como:
28
Ec-38
Donde los paréntesis representanvalor de expectacióncon respecto a f(x, t).
Ahora, en muchos sistemas naturales encontramos con frecuencia procesos de
difusión que no satisfacen la ecuación anterior sino que el ancho de la distribución
crece como t α con un exponente α diferente de 1/2 .Uno se refiere a los
fenómenos con α = 1/2 como ―difusión anómala‖ y existen varios ejemplos en la
naturaleza que exhiben difusión anómala.
29
3. TEORIA, DISEÑO, METODOLOGÍA Y PROTOCOLOS DE EXPERIMENTACION
3.1. TEORIA DE EXPERIMENTACION
3.1.1. Decelularización
Es un proceso el cual consiste en extraer todas las células de un órgano de un
individuo muerto dejando tan solo su andamiaje de tejidos internos (matriz de
colágeno) [72], preservando así la estructura tridimensional, la resistencia
mecánica y la estructura básica de la matriz extracelular como las estructuras de
colágeno, las fibras de elastina y algunos glicosaminoglicanos [73].
El proceso de decelularización ha sido ampliamente utilizado en diferentes tipos
de tejidos y órganos como válvulas cardiacas [74, 75], vasos sanguíneos [76, 77],
piel [78], nervios [79], tendones [80], vejiga[81], tráquea[82], intestinos [83],
hígado[84, 85], corazón [86, 87] y pulmones [88, 89] , utilizados para la ingeniería
de tejidos y en medicina regenerativa. En la Figura 10 se presentan las imágenes
del proceso de decelularización de un hígado.
Figura 10. Proceso de decelularización de un hígado de rata. Fuente: Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix
Debido a la variabilidad de masa de tejido, tipo de tejido, función, estructura y
características biomecánicas, cada tejido u órgano requiere un manejo y
procesamiento de decelularización específico.
3.1.1.1. Métodos de Decelularización
Los métodos que comúnmente se utilizan para la decelularización de tejidos y
órganos incluyen una combinación de tratamientos físicos y químicos. Los
tratamientos físicos pueden incluir agitación o sonicación, masaje mecánico, o
proceso de congelación/descongelación. Estos métodos se caracterizan por
romper la membrana celular, liberar el contenido celular, y facilitar la eliminación
30
de los restos celulares de la matriz extracelular. Estos tratamientos físicos son
generalmente insuficientes para lograr una decelularización completa y deben ser
combinados con tratamientos químicos o enzimáticos. En los tratamientos
enzimáticos se utiliza normalmente tripsina, dispasa o endonucleasas, y en los
tratamientos químicos, se utilizan soluciones detergentes iónicas, no iónicas,
detergentes zwitterionicos soluciones hipotónicas e hipertónicas y agentes
quelantes; todas estas para romper las membranas celulares y los enlaces
responsables de las conexiones intercelulares y extracelulares (Ver Figura 11).
Figura 11. Métodos de Decelularización de Órganos y Tejidos.
3.1.1.1.1. Métodos Físicos:
Los métodos físicos que se pueden utilizar para facilitar la decelularización de
tejidos incluyen: congelamiento/descongelamiento, presión directa, sonicación y
agitación. El método de congelación se utiliza frecuentemente para tejidos
tendinosos o ligamentosos y tejidos nerviosos. Al congelar rápidamente un tejido
se forman cristales de hielo intracelulares, los cuales rompen las membranas
31
celulares causando lisis celular. El proceso de congelación puede ser un método
eficaz de lisis celular pero aun así este debe ser seguido por otros procesos para
eliminar el material celular del tejido.
De igual forma las células también pueden ser lisadas mediante la aplicación de
presión directa al tejido, aunque este método es eficaz para tejidos u órganos que
no se caractericen por tener una matriz extracelular densamente organizados (por
ejemplo hígado, pulmón). La agitación mecánica y sonicación se utilizan
simultáneamente con los tratamientos químicos para ayudar en la lisis celular y en
la eliminación de desechos celulares. La agitación mecánica puede ser aplicada
mediante el uso de una plancha de agitación magnética o un shaker. Por el
momento, aun no se presentan estudios que determinen la magnitud o frecuencia
óptima de sonicación para generar el rompimiento de células pero un sonicador
ultrasónico puede ser tan eficaz en la decelularización de un tejido como un
shaker.
3.1.1.1.2. Métodos Enzimáticos
Las enzimas pueden proporcionar una alta especificidad para la eliminación de
residuos celulares u otros componentes no deseados en la matriz extracelular.
Algunas de las enzimas normalmente reportadas en protocolos de
decelularización incluyen: nucleasas, tripsina, colagenasa, lipasa, dispasa, termo
lisina y α-galactosidasa. La tripsina es una de las enzimas proteolíticas más
utilizadas en los protocolos de decelularización, esta enzima es muy específica ya
que rompe los enlaces peptídicos en el lado del carbón contiguo a la arginina y a
la lisina si el siguiente residuo no es prolina. Las nucleasas tales como las
endonucleasas catalizan la hidrolisis de los enlaces al interior de las cadenas de
ribo nucleótidos o desoxirribonucleótidos, mientras que las exonucleasas catalizan
la hidrólisis de los enlaces terminales de los desoxirribonucleótidos o ribo
nucleótidos, lo que conlleva a la degradación del ARN y el ADN.
Sin embargo la eliminación completa de células utilizando solo este tratamiento
enzimático es difícil debido a que los residuos de la enzima pueden afectar la
recelularización de los tejidos o provocar una respuesta inmune adversa.
32
3.1.1.1.3. Métodos Químicos
3.1.1.1.4. Ácidos y Bases: Los tratamientos alcalinos y ácidos se
utilizan en los protocolos de decelularización para solubilizar
el componente citoplasmático de las células, así como para
eliminar los ácidos nucleicos tales como ADN y ARN. Por
ejemplo el ácido acético, ácido paracético, ácido clorhídrico,
ácido sulfúrico e hidróxido de amonio pueden efectivamente
romper membranas celulares y organelos intracelulares.
3.1.1.1.5. Soluciones Hipertónicas o Hipotónicas: Las soluciones
salinas hipertónicas disocian el DNA de las proteínas,
mientras que las soluciones hipotónicas pueden causar
fácilmente la lisis por simples efectos osmóticos. Para un
mayor efecto osmótico en los tejidos comúnmente se
sumerge alternadamente en soluciones hiper e hipotónicas
por varios ciclos.
3.1.1.1.6. Detergentes No iónicos: Los detergentes no iónicos se
han usado ampliamente en los protocolos de decelularización
a causa de sus efectos relativamente leves en la estructura
del tejido, el detergente más usado es: Tritón X-100.
3.1.1.1.7. Detergentes iónicos: Los detergentes iónicos son
eficaces para solubilizar las membranas celulares tanto
citoplasmáticas como nucleares, y además tienden a
desnaturalizar las proteínas mediante la interrupción de las
interacciones proteína-proteína. Los detergentes iónicos más
utilizados son Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), Desoxicolato
de Sodio y Tritón X-200.
33
3.1.1.1.8. Detergentes Zwitterionicos: Los detergentes
zwitteriónicos muestran las propiedades de los detergentes
no iónicos e iónicos. Los detergentes zwitteriónicos tienen
una mayor tendencia a desnaturalizar las proteínas que los
detergentes no iónicos. Los detergentes utilizados
comúnmente son: CHAPS y Sulfobetaína- 10.
3.1.1.1.9. Solventes: Alcoholes y otros solventes como acetona y
fosfato de tributilo (TBP) son usados ampliamente para
causar lisis celular por deshidratación, además de solubilizar
y remover lípidos, el TBP rompe las interacciones proteína.
Proteína.
3.1.1.2. Antibióticos para preservación de la matriz extracelular
Debido a que los métodos de decelularización de algunos órganos alcanzan a
extenderse por días, se puede generar la presencia de bacterias u hongos que
podrían comprometer la matriz extracelular, por tal razón, se utilizan algunas
soluciones de antibióticos como: Penicilina, Estreptomicina o Anfotericina B.
3.1.2. Tipo de estudios toxicológicos
Los estudios toxicológicos que se realizan común mente en nanomateriales son
los siguientes[52]:
3.1.2.1. In vivo:
En los estudios en vivo, se utilizan animales completos para estudiar los efectos
de la exposición a los nanomateriales (Figura 12). Un modelo es la instilación
intra-traqueal, en la que se inyecta un nanomaterial (suspendido en un líquido)
directamente en la tráquea y los pulmones de un animal anestesiado. Un problema
que presenta este modelo es la administración única de la sustancia como un
material concentrado, en contraste con el modo de inhalación natural de las
34
nanopartículas, en el que pequeñas cantidades de un material ingresan a los
pulmones con cada respiración. Mientras que el otro método de ingreso, por
aspiración faríngea es un enfoque que presenta de un modo más natural el
ingreso de los nanomateriales en los pulmones, en el que una pequeña cantidad
de la solución de los nanomateriales se coloca en la parte posterior de la lengua
de un animal anestesiado, así con cada aspiración el animal ingresa los
nanomateriales en sus pulmones.
Otro método de exposición en vivo es el uso de cámaras de inhalación, en la que
los animales de experimentación son expuestos a una concentración dada de un
nanomaterial en aerosol durante un período de exposición especificado. Este
método puede ser muy costoso debido a que se requiere una gran cantidad de
nanomaterial para generar el aerosol de nanopartículas. Además, las propiedades
físico-químicas de los nanomateriales pueden complicar la generación del
aerosol, así como el mantenimiento de las características de estos en la cámara,
debido a la tendencia que tienen los nanomateriales para aglomerarse debido a
las fuerzas estáticas.
Figura 12. Imágenes de un ensayo en vivo en una rata. Inyección de Quantum Dots fluorescentes en la piel traslucida del pie de la rata.
35
3.1.2.2. In vitro:
En los enfoques in vitro se realiza el estudio de los mecanismos de acción y
efectos biológicos de los nanomateriales en las células y tejidos bajo condiciones
controladas. Estos estudios pueden incluir el uso de células derivadas de una
variedad de fuentes, como el pulmón o la piel, que han sido cultivadas en tubos de
ensayo, en la que los nanomateriales pueden ser agregados para su análisis.
Otros tipo de exposición usado en los sistemas in vitro es la utilización de
secciones de tejidos procedentes de animales o seres humanos.
Una de las desventajas de los sistemas in vitro, es que la interpretación de los
resultados obtenidos son difíciles de comparar con los posibles efectos que
pueden ocurrir en la naturaleza más compleja de los sistemas in vivo. Todo esto
debido a que los sistemas in vivo tienen activos sus sistemas de defensa y
respuesta inmune para hacer frente a sustancias extrañas en el cuerpo. Además,
en sistemas in vitro no se presenta el mecanismo de disolución que normalmente
operan en sistemas in vivo, lo que puede reducir la cantidad de los nanomateriales
en el sistema analizado y los efectos observados. Por estas razones se complica
la extrapolación de los efectos de una dosis de prueba entregados in vitro a una
dosis de exposición in vivo.
Otro factor que complica la interpretación actual de los resultados de tanto in vivo
e in vitro es la falta de un estándar de referencia para los nanomateriales. Por
ejemplo una muestra de nanotubos de carbono puede contener cantidades
variables de metales contaminantes procedentes de su proceso de fabricación. La
presencia de estos metales puede afectar las respuestas de las células o los
tejidos debido a los efectos tóxicos atribuibles que pueden tener estos metales. La
falta de estándares de referencia de nanomateriales puede confundir la
comparación de resultados de los estudios toxicológicos reportados por diferentes
investigadores con el mismo tipo de nanomateriales, pero que se han fabricado de
forma diferente y con una composición diferente.
36
3.1.2.3. Celda de difusión de Franz
En 1975 Franz desarrolló una celda de difusión estática (Figura 13), la cual
actualmente es uno de los sistemas más ampliamente utilizados en la
investigación in vitro de penetración transdérmica [90]. En la celda de difusión se
utiliza tanto piel humana como animal, este tejido es ubicado entre el
compartimento receptor y donador, los cuales son ajustados con una abrazadera
metálica. El tejido o membrana es ubicado de tal manera que el estrato corneo
quede hacia el compartimento dador y la dermis hacia el líquido del compartimento
receptor. El compartimento receptor de la celda se encuentra conectado con un
baño de circulación de agua a una temperatura de 37 º C, manteniendo la
temperatura de la superficie de la piel aproximadamente a 32 º imitando las
condiciones reales de la piel. En el fluido receptor se mantiene tanto la
concentracióncomo la temperatura homogénea utilizando una barra de agitación
magnética.
Figura 13. Celda de Difusión de Franz Estática
En el compartimiento dador, se coloca una muestra representativa de la
formulación en estudio en este caso las nanopartículas, y en el receptor, una
solución que permita solubilizar la sustancia que difunde. Posteriormente se toman
alícuotas a diferentes tiempos durante un período establecido, y a continuación se
mide el principio activo mediante el método analítico adecuado. De esta manera
se obtienen cinéticas de difusión, a partir de las cuales se puede predecir la
velocidad de cesión del activo de las distintas formulaciones.
37
Otro tipo de celda de difusión utilizada es la celda de difusión de Franz de flujo
continuo (Figura 14), en la cual el fluido receptor es continuamente remplazado y
recolectado cada hora para imitar de esta forma condiciones in vivo, ya que
constantemente el sistema circulatorio elimina sustancias ingresadas por
permeación transdérmica. Debido a esto esta celda de difusión cuenta con una
entrada y salida de flujo del compartimento receptor para simular condiciones in
vivo.
Figura 14. Celda de Difusión de Franz de Flujo.
3.2. DISEÑO DE EQUIPOS
3.2.1. Diseño de Celda de Difusión
Para la realización del diseño de la celda de difusión se tomaron en cuenta los
modelos utilizados por algunos investigadores como Gamer [28], Sonavane [31] y
Estévez [91]. Los modelos desarrollados por estos investigadores consistían en
celdas de difusión de Franz estáticas, esto implica que estas celdas no tienen
puertos de entrada y salida de flujo para realizar recirculación del medio receptor
y/o donador. Pensando en requerimientos futuros la celda de difusión se diseñó
con puertos de flujo en los dos recipientes donador y receptor, por tal razón la
38
celda presenta funcionalidad como celda de flujo y si se desea como celda
estática colocando tapones en los extremos de los puertos de flujo (Figura 15).
Figura 15. Celda de difusión de Franz diseñada
La celda de difusión diseñada estáconstruida en vidrio borosilicato, el
compartimento receptor posee un volumen de aproximadamente 32.7 mL y un
área de exposición de 3.8cm2. La celda se revistió con una chaqueta externa a
través de la cual recircula el agua a 37 ºC para mantener constante la temperatura
del medio. En el interior del compartimento receptor se colocará un pequeño
agitador magnético para mantener homogénea la solución.
Además también se diseñó una abrazadera en acero inoxidable con cuatro
tornillos para acoplar los dos recipientes con la membrana, y para asegurar un
buen sellado se colocó un o-ring en la boca del recipiente receptor. El diseño y la
elaboración de los planos de la celda de difusión se realizaron con la ayuda del
software Solid Edge®. En la Figura 16 se puede observar la celda de difusión
después de su construcción.
39
Figura 16. Celda de difusión fabricada.
3.2.2. Diseño de Mini-Celdas de Difusión.
Debido a un requerimiento de datos de penetración de nanopartículas en piel a
tiempos de 84h, 72h, 48h, 24 h, 18 h, 12 h, 6 h y 2 h y con el objetivo de
transportar todas las muestras a análisis en microscopio confocalOlympus IX81,
las pruebas se llevaron a cabo en paralelo. Por esta razón se fabricaron 16mini-
celdas de difusión de Franz adicionales (Figura 17), 8para difusión en piel normal
y 8 para difusión en piel decelularizada. Para esto se utilizaron viales de 9ml, y
abrazaderas de 26cm.
En las celdas se posiciona piel de cerdo de un mismo corte a los diferentes
tiempos nombrados anteriormente, posteriormente se retiran las pieles de cerdo
de los dispositivos y se realizan cortes transversales a la muestras para
observarlos mediante microscopia confocal.
Figura 17. Mini-celda de difusión.
40
Para finalizar se realiza espectrofotometría con el espectrofotómetro HR4000CG
UV-NIR a la solución del líquido receptor para determinar la concentración de
nanopartículas que atravesaron la piel.
3.2.3. Diseño de Sistema para decelularización de tejidos
El proceso de decelularización consiste básicamente en extraer todas las células
de un órgano mientras que se trata de preservar la matriz extracelular y el lecho
vascular dejando tan solo su andamiaje de tejidos internos.
Para realizar la decelularización de tejidos se debe de utilizar: un sistema de
perfusión para ingresar soluciones de detergentes que generen la lisis celular en el
órgano, una cámara de decelularización donde se ubicará el órgano a
decelularizar, una bomba peristáltica para remover la solución de decelularización
utilizada y un recipiente para almacenarla (Figura 18).
Figura 18. Componentes de sistema de decelularización.
Se utilizó un sistema de perfusión por macro goteo con un catéter endovenoso
16Ga (1.7 x 30mm) mediante el cual se cateterizó al corazón por la vena cava
superior con la ayuda de un hilo de sutura. Para la cámara de decelularización se
adaptó un reactor enchaquetado de tres bocas, a este se conectó un chiller para
mantener la temperatura de la chaqueta en 7°C (Figura 19).
41
Figura 19. Sistema de decelularización utilizado.
La cámara de decelularización cuenta con cinco líneas: la entrada de la solución
de decelularización, dos líneas con filtros de venteo (se utilizaron filtros jeringa
PTFE de 0,5µm), un puerto jeringa para la adición de los antibióticos y anti
fúngicos, y una línea de salida de solución de perfusión. Para extraer la solución
de decelularización usada se utiliza una bomba peristáltica (Figura 20).
Figura 20. Cámara de decelularización.
42
3.3. PROTOCOLOS DE EXPERIMENTACIÓN
3.3.1. Protocolo para pruebas en Celda de Difusión de Franz
El protocolo definido para la realización de estudios en la celda de difusión es el
siguiente:
i. Se utilizará como solución receptora buffer fosfato PBS 1X con pH de 7.4,
además se le adicionara un grupo de antibióticos como Gentamicina,
Penicilina y un antimicótico (Fluconazol) para evitar el crecimiento de
microrganismos en la membrana y en las soluciones.
ii. La chaqueta de calentamiento debe manejar una temperatura de 37°C que es
la temperatura corporal promedio del ser humano.
iii. La solución del medio receptor se debe de mantener homogenizada con la
ayuda de un agitador magnético a 600 rpm.
iv. Se tapa el tubo colector de muestras con parafilm.
v. Se ubica la membrana de tal manera que el estrato corneo quede hacia el
compartimento dador y la dermis hacia el compartimento receptor.
vi. Se ajustan los dos compartimentos con ayuda de la abrazadera metálica.
vii. Se espera un tiempo de 30 minutos para que se estabilice la celda de difusión.
viii. Se procede a colocar 2 ml de la solución con nanopartículas en el recipiente
dador.
ix. Se toman alícuotas de 1ml a tiempos determinados.
x. Inmediatamente después de la recolección de cada alícuota se agrega 1 ml de
solución buffer en el medio receptor.
xi. Se determina la concentración de nanopartículas en las alícuotas mediante
espectrofotometría utilizando espectrofotómetro 4000CG UV-NIR de Ocean
Optics.
Para definir este protocolo se basó en los diferentes procedimientos seguidos por
los investigadores que trabajaron en celdas de Franz para determinar la difusión
de los nanomateriales en estos tejidos[92-100]. El montaje se presenta en la
Figura 21.
43
Figura 21. Montaje Celda de Difusión.
3.3.2. Protocolo para decelularización de órganos
Como solución de perfusión para decelularización típicamente se utilizan agentes
detergentes para producir la lisis celular. Se utilizan detergentes iónicos como el
SDS, no iónicos como el Tritón X-100, detergentes zwiterionicos como CHAPS;
aunque también se pueden utilizar ácidos, bases, soluciones hipertónicas,
soluciones hipotónicas como agentes decelularizantes [101].
Para el protocolo de decelularización de órganos se utilizan dos técnicas para el
ingreso de los agentes decelularizantes: por perfusión y por agitación mecánica.
El protocolo elaborado para la decelularización del corazón fue el siguiente:
i. Cateterización del corazón con el catéter 16 Ga.
ii. Perfusión con solución PBS 1X pH 7.4 con SNP (Sodio Nitroprusiato) por
una hora a 1ml/min (20 gotas/min).
iii. Perfusión son PBS 1X pH 7.4 por 12 horas.
iv. Perfusión con SDS al 0,01% por 5 minutos.
v. Perfusión con PBS por 1 hora.
vi. Perfusión con SDS al 0,01% por 10 minutos.
vii. Perfusión con PBS por 1 hora.
viii. Perfusión con SDS al 0,01% por 15 minutos.
ix. Perfusión con PBS por 1 hora.
44
x. Perfusión con SDS al 0,01% por 20 minutos.
xi. Perfusión con PBS por 1 hora.
xii. Perfusión con SDS al 0,01% por 24 horas.
xiii. Perfusión con SDS al 0,1% por 24 horas.
xiv. Perfusión con SDS al 0,2% por 24 horas.
xv. Perfusión con SDS al 0,5% por 24 horas.
xvi. Perfusión con SDS al 1% por 12 horas.
xvii. Perfusión con Tritón X-100 al 1% por 12 horas.
xviii. Perfusión con EDTA y NaCl en solución buffer pH de 7.4 por 12 horas.
xix. Agitación en shaker con solución decelularizante (1% SDS, 1% Tritón X-100
y 1mM EDTA) por 12 horas.
xx. Agitación en shaker con solución decelularizante (2% SDS, 1% Tritón X-100
y 1mM EDTA) por 12 horas.
xxi. Agitación en shaker con PBS 1X pH 7.4 por 12 horas.
xxii. Conservación a 4°C en solución PBS.
Periódicamente se adiciona Gentamicina de 120mg/1,5ml (Genfar) y Penicilina de
1000000 U.I (Genfar) por el puerto jeringa de la cámara de decelularización para
evitar el crecimiento de microrganismos en el corazón y el medio.
Para definir este protocolo de decelularización se basó principalmente en los
realizados por Calle et al [102], Uygun et al[84, 103], Elder et al [104], Chen et al
[78] y Ott et al [86].
3.3.3. Protocolo para decelularización de piel.
El procedimiento para decelularización de piel se realiza utilizando la técnica por
agitación mecánica.
i. La piel de cerdo se lava con solución buffer 1X pH 7.4.
ii. Se elimina el tejido graso subcutáneo de las capas externas de la piel
mediante un escalpelo. (Figura 22)
iii. Se separa la epidermis y la dermis utilizando tratamiento térmico (piel de
cerdo sumergida en agua a 60°C) y la ayuda de un escalpelo.
45
Figura 22. Separación de la dermis.
iv. Se realiza un segundo lavado de la dermis en PBS 1X.
v. Se toma la dermis y se transfiere a un Erlenmeyer de 500ml con
solución decelularizante (1% SDS, 1% Tritón X-100 y 1mM EDTA).
vi. Se ubica el Erlenmeyer en un shaker a 250 rpm por 24 horas.
Figura 23. Decelularización de Piel en el Shaker.
vii. Se renueva la solución decelularizante anterior y se ubica en el shaker
por otras 24 horas.
viii. Se renueva la solución decelularizante aumentando la concentración de
SDS (2% SDS, 1% Tritón X-100 y 1mM EDTA y se ubica en el shaker
por otras 24 horas.
ix. Se realiza lavado del tejido decelularizado con PBS 1X en el shaker a
200 rpm.
x. Conservación a 4°C en solución PBS y antibióticos.
46
3.3.4. Protocolo para histología de los tejidos
Para la obtención de las imágenes histológicas de los tejidos biológicos se sigue
un protocolo de preparación de los tejidos para que puedan ser observados por
microscopia el cual se presenta a continuación:
i. Se realizó el corte de pequeños pedazos de tejidos de aprox 5 mm x 5
mm.
ii. Se fijaron las muestras con formaldehido al 4%.
iii. Se realizaron deshidrataciones sucesivas de la muestra utilizando
concentraciones de etanol al 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96% y 100%,
se sumergieron por 20 minutos en cada concentración de etanol.
Figura 24. Deshidrataciones sucesivas en Etanol.
iv. Se realiza un embebido de la muestra sumergiéndola en Xilol por 20
minutos.
Figura 25. Impregnación del tejido en Xileno.
47
v. Se sumerge la muestra en una solución 50% xilol-50% parafina
histológica a 56°C por 1 hora.
vi. Se sumerge la muestra en parafina histológica 100% a 56°C por 24
horas.
vii. Se ubica la muestra o tejido en un molde histológico y se vierte parafina
sobre este.
viii. Se deja enfriar el cubo con el tejido por aproximadamente 4 horas.
Figura 26. Tejidos embebidos en parafina
ix. Se desmolda el cubo de parafina.
x. Se procede a obtener los cortes histológicos de los tejidos en el
micrótomo Leica 2135 tipo Minot, se obtienen secciones delgadas del
orden de 5 µm de espesor.
Figura 27. Micrótomo Leica
48
xi. Los cortes obtenidos se depositan en un baño de agua con temperatura
entre los 40 y 45°C; esto permite extender estirar los cortes realizados.
xii. Posteriormente los cortes son recogidos del baño de agua utilizando un
portaobjetos el cual tiene una película que se encarga de adherir el
tejido para que este no se desprenda del portaobjetos con los siguientes
procedimientos.
xiii. Se procede a ubicar los portaobjetos en una plancha de calentamiento a
50°C para evaporar el líquido sobrante y activar la sustancia adhesiva
que unirá el corte al portaobjetos.
xiv. Se realiza la desparafinación de los cortes sumergiendo el portaobjetos
con el tejido en xilol por 10 minutos.
xv. Se realiza la hidratación de los cortes en baños decrecientes de etanol al
100%, 96%, 80%, 70%, 50% por 3 minutos cada uno y por 6 minutos en
agua destilada.
xvi. Se realiza la coloración con hematoxilina de Harris (Tinción nuclear) por
7 minutos.
xvii. Se realiza baño en agua destilada hasta que se presente un
desprendimiento total del color.
xviii. Se realiza la coloración con eosina (tinción citoplasmática) por 20
segundos.
xix. Se realiza un lavado en agua destilada.
xx. Para montar la muestra se realiza una nueva deshidratación con baños
crecientes de etanol al 50%, 70%, 90%, 96% y 100%.
xxi. Se aclara con xilol por 3 minutos.
xxii. Se deposita una gota de resina sobre el tejido y encima de este se ubica
una laminilla cubre objetos.
xxiii. Se ubica el portaobjetos sobre una plancha de calentamiento a 45°C por
24 horas.
xxiv. Se observan los tejidos en el microscopio.
49
3.3.5. Protocolo para fabricación de láminas de histología
Para la fabricación de las láminas o portaobjetos para histología, se procede a
depositar una película de una sustancia adherente para que se fije el tejido al
portaobjetos, el protocolo seguido es el siguiente:
i. Se realiza la solución adhesiva utilizando 10 gr de gelatina y 2 gr de
Cromo Alumbre en 2 L de agua desionizada a 42°C.
ii. Se lavaron los portaobjetos y se secaron a 60°C en un horno.
Figura 28. Estante para portaobjetos.
iii. Se ubican los portaobjetos en un holder y se sumergen en agua
desionizada a 60°C.
iv. Se sumergen los portaobjetos en la solución adhesiva a 42°C.
Figura 29. Baño de portaobjetos en solución adhesiva.
v. Se dejan secar por 6 horas.
vi. Se guardan y se almacenan a 4°C
50
3.3.6. Protocolo elaboración de membranas en agar
Para la preparación de las membranas de agar se realiza una solución al 4% en
peso de agar. Esto se realiza agregando 50 ml de agua destilada, 2,08 g de agar
junto con dos gotas de formaldehido al 37%, a un frasco tapa azul de 50ml. Se
esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 115°C junto con los moldes a emplear.
Se vierte la solución en el molde caliente para asegurar la formación de una
membrana uniforme durante la gelificación. La altura de la membrana 2 mm (Figura
30).
Figura 30. Membrana en agar.
3.4. SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS CON MARCADORES
FLUORESCENTES.
Para la síntesis de las nanopartículas de SiO2 se utilizó el procedimiento realizado
por Stöber et al [105] con algunas modificaciones. Esta técnica consiste en utilizar
como precursor alcóxidos de silicio, disuelto en alcoholes de cadena corta en
presencia de amoniaco. La formación de nanopartículas de SiO2 se presenta por
dos tipos de reacciones: hidrólisis en la que se forman los grupos silanol y
condensación en la que se forman los puentes siloxanos por polimerización.
La temperatura utilizada para la síntesis de las nanopartículas fue de 60°C, para la
agitación se utilizó un agitador magnético de teflón a una velocidad de agitación de
450 rpm, y el tiempo de reacción de 10 horas. Para brindar fluorescencia a las
51
nanopartículas se incorporan tintes fluorescentes conocidos como fluorocromos,
los fluorocromos utilizados para dopar las nanopartículas fueron Rodamina y
Fluoresceína sódica. Para adherir el fluorocromo a la nanopartícula se utilizó
APES y posteriormente se encapsulo de nuevo agregando más TEOS a la
solución. El montaje se presenta en la Figura 31.
Al finalizar la reacción se procede a una evaporación directa donde se obtiene un
polvo fino, posteriormente se dispersa en etanol y se realizan lavados con ayuda
del ultrasonificador Branson 2510 para eliminar aglomeraciones y remover
impurezas tales como reactivos sin reaccionar. Se realizaron exhaustivos lavados
para remover el material en exceso mediante cuatro ciclos de lavado mediante
centrifugación (30 minutos cada uno a 7000 rpm)
Figura 31. Montaje para síntesis de nanopartículasde SiO2
3.5. CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTICULAS
Para la caracterización morfológica de las nanopartículas de SiO2 se utilizó el
microscopio de barrido electrónico JEOL JSM-6490LV de la Universidad de los
Andes, empleando un voltaje de aceleración de 20KV y 30 KV. Las nanopartículas
se depositaron en portamuestras de Aluminio por evaporación directa de la
solución utilizando una plancha de calentamiento. Posteriormente se numeraron y
52
se colocaron todas las muestras en el portamuestras del SEM, y se procedió a
realizar la metalización en oro en el equipo Dentom Vacuum Desk IV.
Las imágenes obtenidas por SEM se procesaron mediante el software Image J,
para obtener una mejor calidad de imagen, eliminando ruidos, mejorando brillo y
contrastes. En el software Image J se tomaron las medidas de las nanopartículas
presentes en las imágenes de SEM para realizar un estudio estadístico y
determinar la distribución de tamaño de las nanopartículas obtenidas.
Para la caracterización espectrofotométrica se utilizó el Espectrofotómetro
4000CG VIS-NIR de Ocean Optics, y se realizó un barrido entre 200 a 1100nm.
Para la determinación del tamaño de las nanopartículas se utilizó el equipo Master
Sizer. Para la utilización de este equipo se requerían los datos de absorbancia de
la solución de nanopartículas a 633 nm e índice de refracción. Para la
determinación de la absorbancia se utilizó el Espectrofotómetro 4000CG VIS-NIR
de Ocean Optics y para el índice de refracción se utilizó el refractómetro digital
Mettler Toledo.
3.6. ELABORACION DE CURVA DE CALIBRACION PARA
DETERMINACION DE CONCENTRACION DE NANOPARTÍCULAS
Para poder analizar las muestras obtenidas del estudio de difusión de
nanopartículas en tejidos es necesario también determinar una curva de
calibración que relacione la absorbancia de las soluciones de nanopartículas de
Dióxido de Silicio con concentraciones determinadas de estas.
Para realizar la curva de calibración se prepara una solución madre de las NP en la
solución salina buffer con una concentración de 1000 ppm la cual es la base para
realizar la calibración. Esta solución se sonica por 1 hora empleando el baño sónico
Branson 2510, hasta que no se presenten aglomeraciones o precipitaciones. Esta
53
solución se mantiene con agitación magnética constante durante la preparación de las
soluciones para calibración.
Utilizando micropipetas se miden los volúmenes de solución de madre de NP y de
buffer especificados en la Tabla 3 y se diluyen hasta alcanzar un volumen total de
3000 µL.
Volumen Solución
NPs (µL)
Volumen Solución
Buffer (µL)
Concentración (ppm)
1500 1500 500
900 2100 300
600 2400 200
300 2700 100
270 2730 90
240 2760 80
180 2820 60
120 2880 40
60 2940 20
30 2970 10
24 2976 8
18 2982 6
Tabla 3. Soluciones de NPs para calibración.
Posteriormente se realizan mediciones de absorbancia de cada solución elaborada en
el espectrofotómetro Ocean Optics con un barrido de 200nm a 1120nm.
3.7. FABRICACIÓN DE SISTEMA MICROFLUÍDICO QUE MIMETIZA LA
INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR.
Para el diseño del sistema microfluídico se tomó como base algunos realizados
por Huh [106, 107]y Nalayanda[108, 109]. En los diseños se muestra laelaboración
de tres canales, en el canal intermedio se localizará la interface alveolo capilar, y
los canales laterales se utilizaran para generar el movimiento natural de
respiración mediante la inyección de vacío y el retiro de este, lo cual deformará las
paredes del canal central y a su vez la membrana. Los canales de lalámina inferior
54
y superior presentan las mismas medidas, pero las entradas tienen orientaciones
diferentes como se puede observar en la Figura 32; estos canales se elaborarán
en PDMS por Soft Photolithography. El canal central tiene un ancho de 400 µm,
los canales laterales tienen un ancho de 200 µm y la separación entre estos es de
45 µm, la longitud total del dispositivo es aproximadamente 1,8 cm.
Figura 32. Sistema microfluídico diseñado.
3.7.1. Diseño de las máscaras.
Para la elaboración del microdispositivo fue necesario realizar las máscaras que
se utilizan para hacer la exposición con luz UV en el SF-100, la tecnología
utilizada es de 15µm, esto se refiere a que 1 pixel es igual a 15 µm. El programa
utilizado para realizar las máscaras fue Paint y las imágenes de guardaron en
formato de mapa de bits monocromático (.bmp).
Figura 33. Máscaras sistema microfluídico. a) Canales inferiores, b) Canales superiores, c) membrana porosa
55
En la Figura 33 se presentan las máscaras generadas para las tres diferentes
láminas. La máscarapara la membrana tiene poros de 90 µm de diámetro y
separación entre estos de 40 µm. Debido a que las máscaras presentaban un
tamaño superior a 1024 x 768 pixeles, se debe de utilizar el SF-100 con múltiples
exposiciones.
3.7.2. Fabricación de los moldes.
Para la fabricación de los moldes se utilizan portaobjetos de vidrio con un tamaño
de 76 x 26 mm. Los portaobjetos son limpiados con ayuda de nitrógeno,
posteriormente se procede a colocarlos en el evaporador Edwards Auto 306 y se
depositan capas de cobre con espesores entre los 300 y 320 nm. A continuación
se procede a depositar una capa de photoresist positivo SC 1827 el cual es un
polímero sensible a la luz ultravioleta, y se considera positivo ya que en las zonas
donde es expuesto a luz UV se degrada. Para depositar el photoresist se utiliza un
spiner referencia spin 150 con 5000 rpm por 60 segundos. Seguido a esto se
realiza un curado a 100°C por 50 segundos. Ahora para realizar la exposición a luz
UV y grabar selectivamente la geometría micrométrica sobre el sustrato de vidrio
se utiliza el equipo SF-100 el cual es un sistema de exposición de luz ultravioleta
para procesos de fotolitografía óptica que utiliza máscaras digitales en formato
bmp de 1024 x 768 pixeles.
Debido a que las máscaras realizadas tenían un tamaño superior se debió de
realizar múltiples exposiciones para lo que se utilizó una base motorizada
controlada por computador. Algunos de los parámetros importantes que se
debieron de tener en cuenta para las múltiples exposiciones fueron el
desplazamiento de la base en x y el sobreposicionamiento de la imagen. Para este
equipo también es necesario configurar el punto focal y el tiempo de exposición; el
tiempo utilizado fue de 56 segundos.
Seguido a la exposición de luz UV en el SF-100 sigue el proceso de revelado para
lo cual el sustrato de vidrio es sumergido por dos minutos en revelador MF-319, el
56
primer minuto se mantiene estático y en el segundo se agita levemente para
remover el photoresist degradado por la exposición UV, posteriormente se lava
con agua y se seca con Nitrógeno. Se realiza curado a 100°C en plancha de
calentamiento por 30 minutos.
A continuación se procede a realizar ataque con FeCl3 para atacar el cobre; para
esto se sumerge el sustrato en FeCl3 al 52% por aproximadamente 20 segundos,
luego se limpia la muestra con abundante agua y se seca utilizando nitrógeno. En
la Figura 34 se muestran las láminas después del ataque con FeCl3.
Figura 34. Láminas después de ataque con FeCl3
Para el ataque al vidrio se utiliza HF al 40%, para lo cual se sumerge el sustrato
de vidrio en HF por 4 minutos para obtener una profundidad de 60 µm, se limpia la
muestra con abundante agua y se seca utilizando nitrógeno. Los moldes en vidrio
con el grabado obtenido se muestran en laFigura 35.
Figura 35. Laminillas después del ataque con HF
3.7.3. Soft Lithography
Después de obtener los moldes en vidrio se procede a realizar un proceso de
evaporación de aceite de linaza, colocando una cantidad aproximada de 80 ml de
aceite de linaza en un beaker a una temperatura de 280°C, en la parte
inmediatamente superior del beaker se coloca el sustrato de vidrio con la ayuda de
una pinza en un soporte universal, este proceso de evaporación se realiza por
cinco minutos para cada lado de la lámina. Este procedimiento se realiza para
57
facilitar el posterior desmolde del PDMS (Sylgard 184 de Dawn Corning) que se va
a depositar sobre los moldes.
Los moldes de vidrio se colocan en cajas de petri cubiertas con papel aluminio,
esto para proteger las cajas y también para facilitar el desmolde.
Se procede a preparar el PDMS (Sylgard 184) para lo cual se debe de mezclar en
proporción 10:1, lo cual implica 10 partes de base por 1 parte de agente curador.
Para esto se pesaron 40g de base y 4 gramos de agente curador, se mezclaron
por aproximadamente 5 minutos; a continuación se procede a verter la mezcla
sobre los moldes de vidrio y se colocan en un desecador conectado a línea de
vacío por 30 minutos, esto para reducir las burbujas que se formaron en el PDMS.
Después de eliminar las burbujas del PDMS se procede a colocar las cajas de
petri a curar por dos horas a 70°C se deja enfriar y luego se procede al corte y
desmolde. Para abrir los orificios de entrada y salida se utiliza un puncher.
3.7.4. Fabricación de la Membrana Porosa.
Para la fabricación de la membrana porosa se utilizaron dos láminas de acetato
con orificio rectangular del tamaño de la membrana de 0,5 cm x 3 cm, en la mitad
de estas dos láminas se ubicó una cinta de cobre, posteriormente se procedió a
depositar el photoresist, y a realizar exposición con el SF-100. Se realiza ataque
con FeCl3 y se deposita PDMS con el spinner a 5000 rpm por 1 minuto para
obtener un grosor de 20 µm. Después se lleva a la plancha de calentamiento a
70°C por dos horas para el curado del PDMS. Después de este proceso se realiza
ataque con FeCl3 por el otro lado de la membrana, para de esta manera obtener
una membrana de PDMS suspendida con poros de 90 µm.
Figura 36. Fabricación de membrana porosa suspendida.
58
4. RESULTADOS
4.1. DECELULARIZACIÓN DE CORAZÓN.
En la Figura 37 se presentan las imágenes macroscópicas del corazón antes del
proceso de decelularización y los progresos de este a través de los diferentes
pasos de decelularización. El protocolo de decelularización consistió en ingresar
los agentes decelularizantes mediante perfusión y agitación mecánica. En el
primer proceso se realizaron lavados con solución buffer y perfusión con agentes
detergentes como SDS utilizando con concentraciones del 0,01% al 1%,
prosiguiendo con Tritón X-100 al 1% y soluciones isotónicas de EDTA y NaCl. En
el segundo proceso se utilizó agitación mecánica con soluciones decelularizantes
compuestas (2% SDS, 1% Tritón X-100 y 1mM EDTA), para finalizar se realizó un
lavado con solución buffer y preservación del órgano decelularizado a 4°C. Para
asegurar una perfusión óptima del corazón se le administró nitroprusiato de sodio
el cual es un potente vasodilatador venoso y arterial (vasodilatador mixto).
Figura 37. Decelularización de corazón de Gallina. (a-f) Imágenes representativas del corazón durante el proceso de decelularización a 0h (a), 24h (b), 96h (c), 144h (d), 180h (e), 228h (f)
En la Figura 37 se observa un notorio cambio de color del corazón a un color
blanco lo cual refleja la remoción de los constituyentes celulares del órgano. Esta
pérdida de células se presenta debido a la acción lítica de los agentes detergentes
utilizados.
El detergente no iónico Tritón X-100 rompe las interacciones lípido-lípido, lípido-
proteína y DNA-proteína pero deja las interacciones proteína-proteína intactas. El
detergente SDS es un detergente iónico el cual solubiliza la membrana celular y la
59
membrana citoplasmática, también denatura proteínas mediante el rompimiento de
las interacciones proteína-proteína, por esta razón se propone en el protocolo de
decelularización la utilización de estos dos detergentes. Otro agente de
decelularización utilizado es un agente quelante EDTA el cual enlaza átomos
metálicos de Ca2+ y Mg2+los cuales son necesarios para la adhesión de las células
a la matriz de colágeno, esto genera la debilitación de la adhesión lo que genera
una fácil remoción de las células.
La Figura 38 muestra un corazón traslucido (matriz extracelular) conservando las
características anatómicas del corazón; en detalle en esta imagen se observa la
preservación de la estructura microvascular (venas y capilares).
Figura 38. Corazón de gallinadecelularizado.
Mediante este procedimiento de decelularización se obtuvieron 6 matrices
extracelulares de corazones que se presentan en la Figura 39.
Figura 39. Lote de 6 corazones decelularizados.
60
Se realizaron estudios histológicos utilizando tinción con Hematoxilina y Eosina
con una sección del ventrículo izquierdo de un corazón control (sin decelularizar) y
con un corazón decelularizado.
En la Figura 40 se presenta el corte longitudinal del corazón nativo
correspondiente al miocardio donde se observa la presencia de células cardiacas
(cardiocitos), estas células presentan forma cilíndrica ramificada con citoplasma
acidófilo y estrías, su núcleo es ovoide, central y basófilo.
Figura 40. Corte Longitudinal de un corazón nativo 10X.
En la Figura 41 se presenta un corte longitudinal con un objetivo de 40X, los
pequeños espacios blancos corresponden al tejido conectivo que rodea a las
fibras musculares (endomisio). Los núcleos de las células musculares
corresponden a los pequeños puntos en color púrpura, mientras que las células
musculares son las fibras que observan en color fucsia.
61
Figura 41. Corte Longitudinal de un corazón nativo 40X.
En la Figura 42 se presenta un corte transversal del miocardio del corazón con un
objetivo de 10 X, en esta imagen se observan células de forma poliédrica con
citoplasma acidófilo, su núcleo redondo, central y basófilo.
Figura 42. H&E Corte transversal de corazón nativo 10X.
En la Figura 43 se puede apreciar los núcleos de las células en color púrpura y las
células en color fucsia, también observamos el perimisio (espacios blancos
grandes) que se introduce en el tejido formado el endomisio.
62
Figura 43. Corte transversal de corazón nativo 40X.
De igual manera se realizaron los cortes histológicos para el miocardio del corazón
decelularizado, de igual forma se utilizó tinción con Hematoxilina y Eosina para
determinar si había presencia de células.
En las figuras 44 y 45 se presentan los cortes histológicos con tinción de H&E con
un objetivo de 40X, esta evaluación histológica revela que no se presentan células
intactas ni núcleos en el tejido, se puede apreciar las fibras de colágeno.
Figura 44. H&E Corte longitudinal de corazón decelularizado 40X.
63
Figura 45. H&E Corte transversal de corazón decelularizado. 40X
4.2. DECELULARIZACIÓN DE PIEL
En la Figura 46 se presentan las imágenes macroscópicas de la piel de cerdo en
a) piel de cerdo nativa y en b) piel de cerdo decelularizada. El protocolo de
decelularización utilizado empleo decelularización por método físico (agitación
mecánica) y por método químico (detergentes iónicos, noiónicos y soluciones
hipotónicas).
Figura 46. Proceso de decelularización a) Piel de cerdo nativa. b) Piel de cerdo decelularizada.
64
De igual manera se realizaron evaluaciones histológicas de la piel de cerdo nativa
y de la piel de cerdo decelularizada utilizando tinción con Hematoxilina y Eosina.
Figura 47. Piel de cerdo nativa 10X.
Figura 48. Piel de cerdo nativa 40X.
En las Figuras 47 y 48 se presentan los cortes histológicos de piel de cerdo, en
estas dos imágenes se pueden apreciar claramente la presencia de los núcleos de
las células en color púrpura y material citoplasmáticos en color fucsia.
65
Figura 49. Piel de cerdo decelularizada 40X.
En la Figura 49 se presenta el corte histológico de piel de cerdo decelularizada,
donde no se detecta la presencia de núcleos, se observa un corte transversal de
fibras de colágeno.
4.3. SINTESIS DE NANOPARTICULAS
Para la caracterización morfológica de las nanopartículas de SiO2 se utilizó el
microscopio de barrido electrónico JEOL JSM-6490LV de la Universidad de los
Andes, empleando un voltaje de aceleración de 20KV y 30 KV. En las imágenes
se observan partículas esféricas de tamaño nanométrico (Figura 50).
Figura 50. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas, diámetro aprox 45,3 nm.
66
En estas imágenes se puede apreciar aglomerados, los cuales están compuestos
por nanopartículas de Dióxido de Silicio. En el software Image J se procedió a
medir el diámetro de 45 partículas las cuales presentan un rango de tamaño entre
35-53 nm aproximadamente, se obtuvo un diámetro promedio de 45,3 nm con una
varianza de 18,2. Ver distribución de tamaño en la Gráfica 1.
Gráfica 1. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro promedio de 45,3 nm.
Utilizando otra proporción diferente de reactivos se sintetizaron nanopartículas de
aproximadamente 370 nm, las imágenes SEM de estas nanopartículas se
presenta en la Figura 51.
Figura 51. Imágenes SEM de nanopartículas sintetizadas. Diámetro aprox 378 nm
En el software Image J se procedió a medir el diámetro de 14 partículas las
cuales presentan un rango de tamaño entre 342-404 nm aproximadamente, se
obtuvo un diámetro promedio de 378 nm. Ver distribución de tamaños en Gráfica
2.
67
Gráfica 2. Histograma distribución de tamaño de nanopartículas con diámetro promedio de 378 nm.
Para la determinación de los elementos presentes en las nanopartículas se realizó
la caracterización por EDX, la cual se encuentra incluida en el SEM. Este tipo de
caracterización determina la estructura electrónica de los materiales presentes
mediante la excitación por Rayos X.
El espectro que muestra los picos que identifican cada elemento presente en las
nanopartículas se presenta en la Figura 52. Las composiciones porcentuales de
Silicio y Oxígeno presentes se muestran en la Tabla 4.
Figura 52. EDX que registra presencia de Silicio y Oxígeno en las nanopartículas sintetizadas.
0
1
2
3
4
340-350 350-360 360-370 370-380 380-390 390-400 400-410
Fre
cue
nci
a
Rango de Diametros (nm)
Distribución de Tamaño
68
Element Weigh % Atomic%
O K
53.84
67.19
Si K
46.16
32.81
Totals 100.00
Tabla 4. Composición porcentual de las nanopartículas.
Para poder identificar la presencia de nanopartículas en tejidos es fundamental la
presencia de algún fluorocromo, el cual es un componente o grupo de átomos de
una especie química que hace que esta sea fluorescente. Estas moléculas
absorben energía de una longitud de onda específica y la volverá a emitir a otra
longitud de onda mayor. La solución de nanopartículas se expuso en un reactor de
lámparas UV donde se observó una fluorescencia apreciable (Figura 53).
Figura 53. Emisión de Fluorescencia de las nanopartículas expuestas a luz UV.
Se realizó caracterización por espectrofotometría a la solución de nanopartículas
dopadas con Rodamina y Fluoresceína Sódica donde se encontraron absorciones
máximas en longitudes de onda de 540 nm y 490 nm respectivamente (Gráfica 3).
Estas longitudes de onda corresponden a la máxima absorción de estos
fluorocromos utilizados para marcar las nanopartículas.
69
Gráfica 3. Espectros de absorción de las nanopartículas.
Se realiza caracterización de las nanopartículas utilizando el Master-Sizer, el cual
determina diámetro hidrodinámico promedio. Las distribuciones de tamaño de las
nanopartículas en la solución se ilustran en la Gráfica 4.
Gráfica 4. Distribución de tamaño de la solución de NPs (43,5nm).
En la Gráfica 4 se presenta las distribución de tamaño en la solución de
nanopartículas que se esperan con un diámetro de 45 nm, en esta grafica podemos
ver que las nanopartículas se encuentran agregadas, y los tamaños que está
determinando son aglomeraciones de las nanopartículas. Estas aglomeraciones se
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000
De
nsi
dad
Vo
lum
étr
ica
(%)
Clases de tamaño (um)
70
presentan debido a grandes fuerzas de Van Der Waals originadas por el pequeño
tamaño que exhiben las nanopartículas.
En la Gráfica 5 se presenta la distribución de tamaño de la solución de NPs de un
tamaño mayor. El reporte del master sizer reporta con diámetro hidrodinámico de
aprox 0,357 μm. Este tamaño es cercano al reportado por el SEM (378nm).
Gráfica 5. Distribución de tamaño de la solución de NPs (378 nm)
4.4. PENETRACION DE NANOPARTICULAS EN TEJIDOS
4.4.1. Curva de calibración de nanopartículas
Se preparan 12 soluciones de NPs diluidas para la elaboración de la curva de
calibración variando la concentración de 500 ppm hasta 6 ppm. Empleando el
espectrofotómetro se realizan barridos de 200nm a 1120nm.
Los reportes de absorbancia para cada uno de las concentraciones de NPs se
presentan en la Gráfica 6, con las absorbancias máximas a 490 nm se procedió a
construir la curva de calibración donde la concentración es directamente proporcional
a la absorbancia (Gráfica 7 y 8).
0
2
4
6
8
10
12
0,01 0,1 1 10 100 1000 10000
De
nsi
dad
Vo
lum
etr
ica
(%)
Clases de Tamaño (um)
71
Gráfica 6. Espectros de absorción a diferentes concentraciones de NPs
Aunque la Ley de Beer indica que la relación de la concentración con la absorbancia
es lineal, las absorbancias obtenidas no se ajustan perfectamente a una recta. Esto se
debe a las características de las suspensiones en donde se pueden presentar
dispersiones de partícula no homogéneas o aglomeraciones imperceptibles
visualmente, que afecten las mediciones con el espectrofotómetro.
Gráfica 7. Curva calibración NPs 43nm
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
200 400 600 800 1000
Ab
sorb
anci
a
Longitud de Onda
500ppm
300ppm
200ppm
100ppm
90ppm
80ppm
60ppm
40ppm
20ppm
10ppm
8ppm
y = 0,004x + 0,086R² = 0,994
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 100 200 300 400 500 600
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
72
De la misma manera se realizaron soluciones con concentraciones entre 500 ppm y 6
ppm de nanopartículas con tamaño de 378 nm y se realizó la curva respectiva que se
muestra en la Gráfica 8.
Gráfica 8. Curva Calibración NPs 378 nm.
4.4.2. Penetración de Nanopartículas en medio prototipo (Agar).
Se realizaron pruebas de penetración de nanopartículas en membrana de agar
utilizando la celda de difusión de Franz, se tomaron alícuotas de la solución
receptora cada 3h, 5h, 7h, 12h, 20h, 22h, 23h, 24h y 26 h. Las alícuotas fueron
analizadas en el espectrofotómetro, se determinó absorbancia y mediante la curva
de calibración se determinó la concentración en cada una de estas muestras, el
perfil de concentración con el tiempo se presenta en el Gráfico 9.
y = 0,005x + 0,466R² = 0,976
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 100 200 300 400 500
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
73
Gráfica 9. Perfil de concentración de NP de SiO2(43,5nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo.
Al finalizar el tiempo de la prueba se procedió realizar una revisión de la
membrana de agar con el microscopio donde se observaron aglomeraciones de
nanopartículas que quedaron entre la membrana de agar (Ver Figura 54).
Figura 54. Aglomeraciones de NPs acumuladas en la membrana de agar.
De igual forma se realizó el mismo procedimiento en la celda de difusión pero
utilizando la solución con nanopartículas de 378 nm, los tiempos donde se
tomaron muestras para analizarlas con el espectrofotómetro y determinar las
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Tiempo (h)
74
concentraciones fueron 2h, 6h, 8h, 12h, 24h, 26 y 28h. El perfil de concentración
con el tiempo se presenta en el Gráfico 10.
Gráfica 10. Perfil de concentración de NP de SiO2 (378 nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo.
El gráfico comparativo que se ilustra en la Gráfica 11 muestra que las nanopartículas
de menor tamaño 45,3 nm atraviesan la membrana más rápido que las nanopartículas
grandes, ya que se encuentra una concentración apreciable de 6,43 ppm en el
recipiente receptor a las 3 horas, mientras que con las nanopartículas de mayor
tamaño se determina una concentración de 0,62 ppm hasta las 8 horas.
Gráfica 11. Perfil de concentración de NPs de 45 nm (azul) y 378nm (rojo).
01234
56789
10
0 5 10 15 20 25 30
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Tiempo (h)
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Tiempo (h)
NP´s 43,5 nm
NP´s 378 nm
75
4.4.3. Penetración de Nanopartículas en piel de cerdo.
Se realizaron pruebas de penetración de nanopartículas en membrana piel de
cerdo utilizando la celda de difusión de Franz, se tomaron alícuotas de la solución
receptora cada 24h, 30h, 46h, 50h, 70h, 98h, 144h y 200 h. Las alícuotas fueron
analizadas en el espectrofotómetro, se determinó absorbancia y mediante la curva
de calibración se determinó la concentración en cada una de estas muestras, el
perfil de concentración con el tiempo se presenta en el Gráfico 12.
Gráfica 12. Perfil de concentración de NP de SiO2 (43,5 nm) en la solución receptora a lo largo del tiempo.
De igual forma se realizaron pruebas de penetración con nanopartículas de un tamaño
de 378 nm, pero en el transcurso de 200 h no se determinó presencia de
nanopartículas en la solución receptora. Dichos resultados están de acuerdo con
observaciones reportadas en la literatura en el sentido que una piel intacta previene la
penetración de partículas microscópicas de hasta 0,2 micrómetros pero es permeable
a partículas en la escala nanométrica [30].
4.4.4. Penetración de nanopartículas en piel de cerdo decelularizada y
piel normal
Se realizaron pruebas en paralelo de penetración de nanopartículas de 45,3 nm en
piel normal y decelularizada a tiempos de 84h, 72h, 48h, 24 h, 18 h, 12 h, 6 h y 2
h, se analizaron las concentraciones y se obtuvo el perfil de concentración vs
tiempo que se presenta en la Gráfica 13.
En esta gráfica se puede observar que se presenta una mayor difusión de
nanopartículas en la piel decelularizada que en la piel normal, ya que se determina
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
5
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Tiempo (h)
76
concentración de 5,97 ppm a las 6h de exposición en piel decelularizada, y una
concentración de 0,68 ppm a las 48h de exposición en piel normal.
Gráfica 13. Perfil de concentración de NPs de 45,3nm en piel decelularizada y normal.
Esto se presenta debido a la ausencia de células en la piel decelularizada, ya que no
se presentan organelos que puedan generar retención de las nanopartículas, a
diferencia de la acumulación de NPs que se presenta en piel normal, como se puede
ver en la imagen de microscopía confocal de la Figura 55 donde se observa la
retención de nanopartículas en el interior de algunas células epiteliales del tejido.
Figura 55. Imagen de microscopia confocal donde se evidencia acumulación de NPs en células epiteliales.
En la Figura 56 se presenta una imagen de microscopia confocal donde se evidencia
una considerable acumulación de NPs de 45,3nm en la piel después de 72 horas de
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Tiempo (h)
Piel Descelularizada
Piel Normal
77
exposición. La evidencia de penetración de las nanopartículas son los puntos azules
de mayor intensidad que se presentan a lo largo del tejido epitelial, estos se presentan
en las capas superiores e inferiores del tejido, lo cual indica permeabilidad de la piel a
estas nanopartículas. Debido a la retención de las NPs por las células y en los
espacios intercelulares se presentan menor difusión en tejido normal que en tejidos
decelularizados.
Figura 56. Imagen de microscopía confocal después de exposición a NPs por 98 h.
Realizando observación de tejido epitelial decelularizado en microscopia confocal no
se encontró una acumulación apreciable de nanopartículas en el tejido, como se
presentan en la imagen siguiente (Figura 57).
Figura 57. Imagen de microscopia confocal de piel decelularizada.
78
En las pruebas de penetración en piel de cerdo con nanopartículas de un tamaño de
378 nm no se determinó presencia de nanopartículas en la solución receptora en el
transcurso de 200 h, de igual manera se tomaron imágenes de microscopia confocal,
pero para este caso la presencia de NPs a lo largo de las capas de la piel es apenas
notable. Lo que corrobora la ausencia de NPs en la solución receptora y por lo tanto el
efecto que tiene el tamaño de partícula en la difusión en tejidos biológicos.
Figura 58. Imágenes de penetración de NPs de 378 nm.
En la Figura 58 se presenta la penetración de nanopartículas en piel normal, se
observa que hay una penetración muy superficial, mediante Image J se midió la
penetración del cúmulo de NPs del lado derecho de la imagen el cual está a una
profundidad de 6,3 μm.
Los resultados en esta sección indican que: Los Protocolos establecidos son
adecuados y reproducibles. La celda implementada y sus protocolos correspondientes
son apropiados para el estudio del transporte de nanomateriales tanto en tejidos
prototipo como en tejidos nativos. Los resultados obtenidos tanto de perfiles de
penetración como de permeación proveen información útil que puede utilizarse con el
propósito de desarrollar modelos detallados tipo PBPK de transporte en tejidos.
79
4.5. FABRICACIÓNSISTEMA MICROFLUIDICO QUE SIMULA LA
INTERFACE ALVEOLO-CAPILAR
Se realizó la fabricación del sistema microfluídico en Sala Limpia de la
Universidad de los Andes.
4.5.1. Caracterización Óptica
Se realizó caracterización por microscopia óptica de los moldes de vidrio fabricados
para el posterior proceso de Soft Lithography.
Figura 59. Imágenes de Microscopía Óptica de los moldes en vidrio para el sistema microfluídico. a) Lámina superior, b) Canales de las láminas, c) Lámina inferior, d) Puertos de entrada de fluido a los canales.
Después de realizar el proceso de Soft Lithography se obtuvieron las siguientes
imágenes de los canales elaborados en PDMS (Figura 60).
80
Figura 60. Imágenes de Microscopía Óptica de los canales en PDMS del sistema microfluídico. a) y b) Canales superiores, c) y d) Canales inferiores.
En la Figura 61 se presentan unas imágenes macroscópicas de las láminas inferiores
y superiores de PDMS del sistema microfluídico.
Figura 61.Láminas a) superior e b) inferior.
4.5.2. Caracterización Morfológica por perfilometría.
Se realizó caracterización morfológica utilizando el perfilómetro Vektak 3. En las
gráficas 14 y 15 se presentan los perfiles obtenidos de los canales inferiores y
superiores, se observa que se obtiene una profundidad aproximada de 8 μm y se
presenta un ataque homogéneo de HF.
81
Gráfica 14. Perfil Canal Superior.
Gráfica 15. Perfil Canal Inferior.
En el gráfico 16 se presenta el perfil obtenido de la membrana con una mayor
distancia de barrido de 500 μm para presentar que se obtienen pilares homogéneos
con una altura aproximada entre 12 y 11 μm, además se observa que al depositar una
película de PDMS con un grosor de 9 μm se podrían obtener poros de
aproximadamente 40 μm de diámetro.
-80000
-70000
-60000
-50000
-40000
-30000
-20000
-10000
0
10000
0 200 400 600 800 1000 1200A
ltu
ra (
A)
Distancia (um)
-90000
-80000
-70000
-60000
-50000
-40000
-30000
-20000
-10000
0
10000
0 200 400 600 800 1000 1200
Alt
ura
(A
)
Distancia (um)
82
Gráfica 16. Perfil membrana porosa.
En la Figura 62 se muestra la membrana porosa fabricada que se encuentra
suspendida o soportada entre dos láminas de acetato para que sea más fácil su
manipulación y ubicación entre las otras láminas de PDMS del dispositivo. En la
Figura 63 se puede apreciar una imagen de la membrana con mayor acercamiento.
Figura 62. Membrana porosa fabricada.
Figura 63. Imagen de microscopia óptica de la membrana fabricada.
-20000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
0 100 200 300 400 500
Alt
ura
(A
)
Distancia (um)
83
En la Figura 64 se presenta el ensamble del sistema microfluídico, para realizar este
ensamble se utilizó el pegado por Plasma Cleaner.
.
Figura 64. Ensamble sistema microfluídico.
Si bien fue posible desarrollar los diversos componentes para la implementación de un
sistema artificial para simular la interface alveolo-capilar, los resultados preliminares
que aquí se han mostrado indican que dicho proceso tiene los siguientes
inconvenientes: el photoresist utilizado s alcanza profundidades muy pequeñas, al
realizar el enfoque en el SF-100 para realizar exposiciones múltiples se requiere de
extrema precisión para realizar el solapamiento de dos imágenes cuando la máscara
excede de 1024 x 768 pixeles. La fabricación de una membrana porosa con espesor
de 10μmy poros de 40 μm requirió de arduo trabajo debido a la difícil manipulación de
esta; se diseñaron diferentes procesos de fabricación de la membrana hasta encontrar
el que permitiera sintetizar una membrana de las características deseadas y que se
pudiera manipular fácilmente, por esta razón se utilizó un mecanismo de soporte para
tener una membrana suspendida.
Todo el procedimiento de fabricación del dispositivo en PDMS fue desarrollado en el
momento de fabricación de este, ya que en este momento el CMUA no contaba con
protocolos de fabricación de microdipositivos en PDMS. El protocolo de diseño del
microdispositivo fue realizado con la ayuda de asistentes de Sala Limpia.
Y por tanto, es deseable utilizar resinas que permitan mayor profundidad como la
SU8-50, utilizar TBFA (Tetrabutil Amonio Fluoruro) como agente de grabado del
PDMS para disolver la membrana en los canales laterales
84
5. CONCLUSIONES
El diseño realizado para la celda de difusión de Franz cumplió con todos los
requerimientos solicitados, además es una celda que puede ser utilizada como celda
estática y como celda de flujo.
El sistema de decelularización construido permitió realizar el proceso de
decelularización de órganos y tejidos prototipo, así como también se logró controlar
fácilmente algunos parámetros importantes como la temperatura de la solución, el
caudal de perfusión, la adición de los antibióticos y anti fúngicos.
El protocolo de decelularización para órganos y tejidos desarrollados funcionó
perfectamente ya que se obtuvieron corazones de pollo y piel de cerdo
completamente decelularizados, esto se pudo corroborar con los análisis histológicos
de los tejidos y órganos.
Mediante las modificaciones realizadas a la técnica de Stöber se pudieron obtener
nanopartículas de Dióxido de Silicio con tamaños entre 35- 53 nm y entre 340-410 nm.
Las nanopartículas de dióxido de Silicio se doparon exitosamente con los
fluorocromos Rodamina y Fluoresceína sódica.
Se ha logrado un avance importante en la definición de los protocolos de utilización de
la celda de difusión y del protocolo de decelularización, ya que se definió la forma de
trabajo en la celda de difusión y se aseguró que el protocolo de decelularización es
efectivo.
Mediante las pruebas de penetración de nanopartículas en tejidos decelularizados se
observó la influencia de la presencia de células en el transporte de las nanopartículas
debido a que la difusión en los tejidos decelularizados es más rápida que en tejidos
normales. Esto se debe a que en tejidos normales las nanopartículas se retienen o
acumulan en las células y en los espacios intercelulares.
85
La acumulación de nanopartículas de dióxido de silicio en las células es de gran
preocupación, debido a los posibles daños celulares que puede generar como: estrés
oxidativo, peroxidación lipídica, daño en la función mitocondrial, daño en cadenas de
ADN, entre otros.
En cuanto a la fabricación del microdispositivo como valor agregado para la tesis, se
desarrolló todo un proceso de fabricación de un prototipo microfluídico en PDMS que
simula la interface alveolo capilar, para poder realizar en el futuro pruebas de
transporte de nanomateriales que ingresen por vía respiratoria sin tener que realizar
pruebas in vivo.
Se determina que aproximadamente una concentración de 0,68 ppm de
nanopartículas de 45nm de SiO2 atravesó piel de cerdo normal a las 48h, mientras
que a las 6h se determina una concentración de 5,97 ppm de nanopartículas de SiO2
en piel de cerdo decelularizada. De igual forma se presenta penetración superficial de
NPs de SiO2 de 378 nm en piel de cerdo normal pero en el transcurso de 200 h no se
determinó presencia de nanopartículas en el recipiente receptor. En cuanto a las
pruebas de penetración de NPs realizadas en membrana de agar con los dos
tamaños (45nm y 378nm) las nanopartículas de menor tamaño atraviesan la
membrana más rápido que las nanopartículas grandes, ya que se encuentra una
concentración apreciable de 6,43 ppm en el recipiente receptor a las 3 horas, mientras
que con las nanopartículas de mayor tamaño se determina una concentración de 0,62
ppm hasta las 8 horas.
86
PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo son de gran importancia tanto para el campo
de nanotecnología como el de biotecnología e ingeniería biomédica.
En cuanto al trabajo realizado en decelularización de órganos se puede utilizar este
protocolo en ingeniería de tejidos para la elaboración de órganos para trasplante. A un
órgano de donación se le realiza el proceso de decelularización, posteriormente se
realizaría un proceso de re-celularización del órgano con un cultivo de células madres
de la persona receptora, de esta manera es poco probable que el cuerpo presente
rechazo hacia este órgano trasplantado.
En cuanto a la caracterización histológica del corazón decelularizado sería muy
interesante realizar estudios inmuno-histoquimicos para determinar la presencia de
colágeno tipo I y tipo III y de Glucosaaminoglucanos, para determinar el % de
preservación de la matriz de colágeno.
Con el protocolo de trabajo de la celda de difusión se pueden trabajar con otros
diferentes tipos de nanopartículas como Oro, Hierro, Plata, Óxido de zinc, en la celda
de difusión.
Además se realizaron pruebas preliminares de decelularización en otros órganos
como hígado de pollo y de corazón de cerdo, resultados a partir de los cuales se
puede realizar un trabajo de definición de protocolo de decelularización para estos
otros órganos.
87
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