Limitaciones Del Mg y Su Papel Aparente en La Resistencia Al Etanol Durante La Fermentacion Por...

7/27/2019 Limitaciones Del Mg y Su Papel Aparente en La Resistencia Al Etanol Durante La Fermentacion Por Levaduras

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V o l . 5 2 , N o . 5P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , N o v . 1 9 8 6 , P . 9 7 5 - 9 8 10 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 6 / 1 1 0 9 7 5 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

Magnesium L i m i t a t i o n a n d I t s R o l e i n Apparent T o x i c i t y o f E t h a n o ld u r i n g Y e a s t F e r m e n t a t i o n t

K. M. DOMBEK AND L . 0. INGRAM*D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y a n d C e l l S c i e n c e , U n i v e r s i t y o f F l o r i d a , G a i n e s v i l l e , F lo r i d a 3 2 6 1 1R e c e i v e d 1 2 Ma y 1 9 8 6 / A c c e p t e d 1 A u g u s t 1 9 8 6

T h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o n p e r m i l l i g r a m o f c e l l p r o t e i n b e g i n s t o d e c l i n e i n t h e e a r l y s t a g e o f b a t c hf e r m e n t a t i on b e fo r e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l h a v e a c c u m u l a t e d . I n y e a s t e x t r a c t - p e p t o n e medium (20%g l u c o s e ) , t h i s i n i t i a l d e c l i n e a p p e a r s t o b e r e l a t e d t o g r o w t h a n d t o r e s u l t i n p a r t f r o m a n u t r i e n t d e f i c i e n c y . Thea d d i t i o n o f y e a s t e x t r a c t , p e p t o n e , a n d a s h e d p r e p a r a t i o n s o f t h e s e r e s t o r e d t h e a b i l i t y o f g l u c o s e - r e c o n s t i t u t e dm e d i u m ( i n w h i c h c e l l s h a d b e e n p r e v i o u s l y g r o w n ) t o s u p p o r t v i g o r o u s g r o w t h . Magnesium was i d e n t i f i e d a st h e a c t i v e c o m p o n e n t . S u p p l e m e n t i n g f e r m e n t a t i o n s w i t h 0 . 5 mM magnesium p r o l o n g e d e x p o n e n t i a l g r o w t h ,r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d y e a s t c e l l m a s s . T h e a d d i t i o n o f m a g n e s i u m a l s o r e d u c e d t h e d e c l i n e i n f e r m e n t a t i v ea c t i v i t y ( m i c r o m o l e s o f CO2 e v o l v e d p e r h o u r p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n ) d u r i n g t h e c o m p l e t i o n o f b a t c hf e r m e n t a t i o n s . T h e s e t w o e f f e c t s r e d u c e d t h e t i m e r e q u i r e d f o r t h e c o n v e r s i o n o f 2 0 % g l u c o s e i n t o e t h a n o l b yV 3 w i t h no m e a s u r a b l e l o s s i n e t h a n o l y i e l d ( 9 8 % o f t h e o r e t i c a l m ax i m u m y i e l d ) . I t i s p os si b le t h a t some o f t h er e p o r t e d b e n e f i c i a l e f f e c t s o f c o m p l e x n u t r i e n t s ( s o y f l o u r a n d y e a s t e x t r a c t ) f o r e t h a n o l p r o d u c t i o n a l s o r e s u l tf r o m t h e c o r r e c t i o n o f a s i m pl e i n o rg a n i c i o n d e f i c i e n c y , s u c h as m a g n e s i u m .

T h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o n b y S a c c h a r o m y c e s s p p .d e c r e a s e s i n b a t c h f e r m e n t a t i o n s a s a l c o h o l a c c u m u l a t e s i nt h e m e d i u m ( 2 6 , 3 5 , 3 6 ) . T h e o n s e t o f t h i s d e c l i n e i nf e r m e n t a t i v e a c t i v i t y o c c u r s a t v e r y l o w e t ha n o l c o n c e n t r a -t i o n s , o f t e n l e s s t h a n 3% ( v o l / v o l ) . S i n c e e t h an o l h a s b e e ns h o w n t o a c c u m u l a t e t o a l e v e l s u f f i c i e n t t o i n h i b i t f e r m e n -t a t i o n ( 2 , 4 , 1 1 ) , i t h a s b e e n g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t t h i sa c c u m u l a t i o n o f e t h a n o l i s r e s p o n s i b l e f o r t h e p r o g r e s s i v ed e c l i n e i n f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y ( 1 , 9 , 2 3 ) . H o w e v e r , t h ee x t e n t o f i n h i b i t i o n b y e x o g e n o u s l y a d d e d e t h a n o l i s l e s st h a n w o u l d b e p r e d i c t e d b y t h e d e c l i n e i n f e r m e n t a t i o n r a t ew h i c h n o r m a l l y o c c u r s d u r i n g t h e f e r m e n t a t i v e a c c u m u l a t i o no f e t h a n o l ( 3 0 ; Dombek a n d I n g r a m , J . I n d u s t . M i c r o b i o l . , i np r e s s ) .F u r t h e r s t u d i e s h a v e a t t e m p t e d t o d e f i n e t h e m e c h a n i s m ( s )o f e t h a n o l i n h i b i t i o n o f f e r m e n t a t i o n a n d t o r e c o n c i l e t h ef a i l u r e o f a d d e d e t h a n o l t o i n h i b i t f e r m e n t a t i o n t o t h e e x t e n to b s e r v e d d u r i n g t h e f e r m e n t a t i v e a c c u m u l a t i o n o f e t h a n o l .E a r l y s t u d i e s p r o vi d e d e v i d e n c e t h a t t h e i n t r a c e l l u l a r c o n -c e n t r a t i o n o f e t h a n o l w a s much h i g h e r t h a n t h a t o f t h es u r r o u n d i n g m e d i u m d u r i n g f e r m e n t a t i o n ( 2 7 , 2 8 , 3 3 ) , ac o n d i t i o n n o t r e a d i l y d u p l i c a t e d b y t h e e x o g e n o u s a d d i t i o no f e t h a n o l . H o w e v e r , t h e s e e a r l y d a t a c a n b e e x p l a i n e d b yp r o b l e m s i n t h e m e a s u r e m e n t o f i n t e r n a l e t h a n o l c o n c e n t r a -t i o n s ( 7 ) . S e v e r a l r e s e a r c h g r o u p s h a v e d e v e l o p e d i n d e p e n -d e n t m e t h o d s w h i c h d e m o n s t r a t e d t h a t e t h a n o l i s f r e e l yp e r m e a b l e i n S a c c h a r o m y c e s s p p . a n d t h a t t h e i n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o n o f t h i s m e t a b o l i c p r o d u c t i s e s s e n t i a l l y t h es a m e a s t h a t i n t h e s u r r o u n d i n g f e r m e n t a ti o n b r o t h ( 6 , 8 , 1 2 ) .A d d i t i o n a l s t u d i e s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e s e n s i t i v i t y o fg l y c o l y t i c e n z y m e s a n d a l c o h o l o g e n i c e n z y m e s i n v i t r o t oi n h i b i t i o n b y e t h a n o l . M i l l a r e t a l . ( 2 4 ) h a v e s h o w n t h a t t h e s ee n z y m e s a r e s t a b l e i n e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s h i g h e r t h a n20% ( v o l / v o l ) . T h e t w o e n z y m e s m o s t s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o nb y e t h a n o l w e r e p y r u v a t e d e c a r b o x y l a s e a n d p h o s p h o g l y c e r -a t e k i n a s e . B o t h , h o w e v e r , r e t a i n e d 5 0 % o f m a x i m a l a c t i v i t yi n t h e p r e s e n c e o f o v e r 1 2 % ( v o l / v o l ) e t h a n o l , t h e f i n a l

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t F l o r i d a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n p u b l i c a t i o n n o . 7 3 1 6 .

a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n a c h i e v e d b y t h e c o m p l e t e f e r m e n t a -t i o n o f 2 0 0 g o f g l u c o s e p e r l i t e r . S i m i l a r l y , L a r u e e t a l . ( 2 0 )c o n c l u d e d t h a t t h e c e s s a t i o n o f a l c o h o l p r o d u c t i o n d u r i n gs t u c k f e r m e n t a t i o n s w a s n o t d u e t o e t h a n o l i n h i b i t i o n o fa l c o h o l d e h y d r o g e n a s e o r h e x o k i n a s e a c t i v i t i e s .C a s e y e t a l . ( 3 ) h a v e r e p o r t e d t h a t n u t r i e n t l i m i t a t i o n i s am a j o r f a c t o r i n e t h a n o l p r o d u c t i o n d u r i n g h i g h - g r a v i t y f e r -m e n t a t i o n s . A n a e r o b i c a l l y c u l t u r e d y e a s t s a r e known t oh a v e a n u t r i t i o n a l r e q u i r e m e n t f o r e r g o s t e r o l a n d u n s a t u r -a t e d l i p i d s ( 1 4 , 2 9 , 3 4 ) . U n s a t u r a t e d l i p i d s h a v e b e e n s h o w nt o i n c r e a s e c e l l y i e l d , a l c o h o l p r o d u c t i o n , a n d e t h a n o l d u r a -b i l i t y o f y e a s t c e l l s d u r i n g a n a e r o b i c f e r m e n t a t i o n ( 1 5 , 1 6 , 1 9 ,3 7 ) . A v a r i e t y o f l i p i d - p r o t e i n c o m p l e x e s a n d n u t r i e n t s u p -p l e m e n t s , r a n g i n g f r o m a l b u m i n - e r g o s t e r o l - m o n o o l e i n t o s o yf l o u r a n d y e a s t e x t r a c t , h a v e a l s o b e e n s h o w n t o y i e l di n c r e a s e d r a t e s o f a l c o h o l p r o d u c t i o n a n d h i g h e r f i n a l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n s ( 5 , 1 3 , 1 9 , 3 1 ) .R e c e n t s t u d i e s i n o u r l a b o r a t o r y h a v e s h o w n t h a t t h ei n i t i a l d e c l i n e i n f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y d u r i n g b a t c h f e r m e n -t a t i o n i s n o t c a u s e d b y t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l o r b y g r o w t hi n t h e p r e s e n c e o f 5% ( w t / v o l ) e t h a n o l ( D o m b e k a n d I n g r a m ,i n p r e s s ) . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t a c o m p o n e n t ( s ) o fy e a s t e x t r a c t a n d p e p t o n e was l i m i t i n g g r o w t h a n d c o n t r i b -u t i n g t o t h e e a r l y l o s s o f f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y . T h e r e s u l t sp r e s e n t e d i n t h i s a r t i c l e i d e n t i f y m a g n e s i u m a s t h e a c t i v ec o m p o n e n t o f t h e s e c o m p l e x n u t r i e n t s .

MATERIALS AND METH ODSO r g a n i s m a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . T h e p r i n c i p a l o r g a n i s mu s e d i n t h e s e s t u d i e s w a s S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e KD2( 8 ) , a p e t i t e m u t a n t o f s t r a i n CC3 ( G . G . S t e w a r t , L a b a t t sB r e w e r y , L o n d o n , C a n a d a ) . I n a d d i t i o n , S . c e r e v i s i a e C C 3 ,S . c e r e v i s i a e A10 (NRRL Y - 1 2 7 0 7 ) , a n d S . s a k e (NRRLY - 1 1 5 7 2 ) w e r e a l s o u s e d f o r c o m p a r i s o n i n some e x p e r i -m e n t s . The l a t t e r two s t r a i n s were g e n e r o u s l y p r o v i d e d b yN . J . A l e x a n d e r ( N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h C e n t e r , U . S .D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , P e o r i a , I l l . ) . A l l o r g a n i s m s w e r eg r o w n o n YEPD m e d i u m , d e s c r i b e d b y Leo a n d van Uden( 2 2 ) , w h i c h c o n t a i n e d y e a s t e x t r a c t ( 5 g / l i t e r ) , p e p t o n e ( 1 0g / l i t e r ) , a n d g l u c o s e ( 2 0 0 g / l i t e r ) . The medium w a s a d j u s t e d9 7 5


2/7


3/7

M g 2 + LIMITATION DURING FERMENTATION 9 7 7r e s p e c t i v e l y ( T a b l e 1 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i - t h a t n u t r i e n tl i m i t a t i o n r a t h e r t h a n t h e p r e s e n c e o f a n i n h i b i t o r w a sr e s p o n s i b l e f o r t h e i n a b i l i t y o f t h e u s e d m e d i u m t o s u p p o r tf u r t h e r y e a s t g r o w t h . V i t a m i n s u p p l e m e n t s w e r e a l s o t e s t e da n d d i d n o t p r o m o t e g r o w t h i n t h i s g l u c o s e - r e c o n s t i t u t e dm e d i u m ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e o r g a n i c c o m p o n e n t s o f y e a s t e x t r a c t a n d p e p t o n e a r eb o t h d i v e r s e a n d c o m p l e x . B e f o r e e m b a r k i n g o n a f r a c t i o n -a t i o n o f t h e s e , t h e i n o r g a n i c c o n s t i t u e n t s w e r e t e s t e d a f t e ra s h i n g . S u p p l e m e n t a t i o n w i t h a s h e d y e a s t e x t r a c t w a s a se f f e c t i v e a s w i t h w h o l e y e a s t e x t r a c t , w h i l e a s h e d p e p t o n ew as o n l y h a l f a s e f f e c t i v e a s w h o l e p e p t o n e . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t e d t h a t a n i n o r g a n i c c o m p o n e n t o f YEPD m e d i u mw as t h e p r i n c i p a l f a c t o r l i m i t i n g g r o w t h .T h e i n o r g a n i c c o n s t i t u e n t s o f a m i n e r a l - b a s e d m i n i m a lm e d i u m w e r e t e s t e d t o d e t e r m i n e w h i c h i o n s w e r e l i m i t i n g( T a b l e 1 ) . T h e a d d i t i o n o f p o t a s s i u m , a m m o n i u m , s o d i u m ,c a l c i u m , p h o s p h a t e , s u l f a t e , a n d a t r a c e m i n e r a l m i x t u r ed e s c r i b e d b y W i c k e r s h a m ( 4 0 ) d i d n o t p r o m o t e g r o w t h i ng l u c o s e - r e c o n s t i t u t e d m e d i u m . O n l y m a g n e s i u m s a l t s w e r ee f f e c t i v e a s n u t r i e n t s u p p l e m e n t s , a l l o w i n g g r o w t h e q u i v a -l e n t t o 90% o f t h e c o n t r o l i n f r e s h YEPD m e d i u m .T h e d o s e r e s p o n s e o f g r o w t h t o a d d e d m a g n e s i u m , y e a s te x t r a c t , a n d a s h e d y e a s t e x t r a c t i s s h o w n i n F i g . 1 . Y e a s te x t r a c t c o n t a i n e d 2 7 , u m o l o f m a g n e s i u m p e r g . T h i s v a l u ew as u s e d t o c a l c u l a t e t h e a p p r o p r i a t e a m o u n t o f w h o l e a n da s h e d y e a s t e x t r a c t t o b e a d d e d . W h o l e y e a s t e x t r a c t , a s h e dy e a s t e x t r a c t , a n d M g S O 4 g a v e s i m i l a r d o s e r e s p o n s e s .H o w e v e r , a t c o n c e n t r a t i o n s b e l o w 0 . 2 mM, M g S O 4 a p -p e a r e d t o b e a b e t t e r s u p p l e m e n t . M g S O 4 - s u p p l e m e n t e df r e s h YEPD m e d i u m was a l s o p l o t t e d f o r c o m p a r i s o n . M a x -imum g r o w t h o c c u r r e d a t a d d e d m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n s

1 8 0~~~~~

1 ; 6 t0 0I C )

c o 804

2

0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0MAGNESIUM ( m M o l a r )

F I G . 1 . D o s e r e s p o n s e o f c e l l g r o w t h t o a d d e d m a g n e s i u m .M a g n e s i u m v a l u e s r e p r e s e n t t h e a m o u n t o f m a g n e s i u m c o n t a i n e d i nt h e a d d e d n u t r i e n t s u p p l e m e n t . E r r o r b a r s r e p r e s e n t t h e a v e r a g e SDf o r e a c h e x p e r i m e n t . S y m b o l s : * , w h o l e y e a s t e x t r a c t a d d e d t og l u c o s e - r e c o n s t i t u t e d , u s e d m e d i u m ; 0 , a s h e d y e a s t e x t r a c t a d d e dt o g l u c o s e - r e c o n s t i t u t e d , u s e d m e d i u m ; 0 , M g S O 4 a d d e d t o g l u -c o s e - r e c o n s t i t u t e d , u s e d m e d i u m ; 0 , M g S O 4 a d d e d t o f r e s h YEPDb r o t h .

a b o v e 0 . 2 m M . A MgSO4 c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5 mM wasc h o s e n f o r s u b s e q u e n t f e r m e n t a t i o n s t u d i e s b e c a u s e g r o w t ha t t h i s c o n c e n t r a t i o n w a s n o l o n g e r l i m i t e d b y a n i n a d e q u a t es u p p l y o f m a g n e s i u m .To c o n f i r m t h a t m a g n e s i u m was i n d e e d l i m i t i n g i n YEPDm e d i u m , t h e m a g n e s i u m c o n t e n t o f c e l l s a n d t h e s u r r o u n d i n gb r o t h was d e t e r m i n e d a t v a r i o us t i m e s d u r i n g b a t c h f e r m e n -t a t i o n ( F i g . 2 ) . T h e m a g n e s i u m c o n t e n t o f t h e c e l l s r e a c h e d amaximum o f 1 3 0 n m o l / m g o f c e l l p r o t e i n a t 1 2 h , r a p i d l yd e c l i n i n g t o 4 8 n m o l / m g o f c e l l p r o t e i n b y 2 4 h a n d r e m a i n i n ga t t h i s l o w e r l e v e l t h r o u g h o u t t h e f i n a l p e r i o d o f f e r m e n t a -t i o n . I n t h e m e d i u m , t h e m a g n e s i u m c o n t e n t f e l l t o l e s s t h a n0 . 0 5 mM b y 2 4 h a n d r e m a i n e d c o n s t a n t u n t i l f e r m e n t a t i o nh a d b e e n c o m p l e t e d . T h u s , t h e d e c l i n e i n m a g n e s i u m c o n -t e n t p e r m i l l i g r a m o f c e l l p r o t e i n o b s e r v e d a f t e r 1 2 h a p p e a r st o r e s u l t f r o m c o n t i n u e d c e l l g r o w t h a f t e r n e a r d e p l e t i o n o ft h e m a g n e s i u m i n t h e s u r r o u n d i n g b r o t h . S u p p l e m e n t i n g t h eb r ot h w i t h 0 . 5 mM m a g n e s i u m r e s u l t e d i n t h e p e a k a c c u m u -l a t i o n o f h i g h e r l e v e l s o f m a g n e s i u m ( 2 0 0 n m o l / m g o f c e l lp r o t e i n ) a t 1 2 h , f o l l o w e d b y a d e c l i n e t o a b o u t 1 3 0 n m o l o fm a g n e s i u m p e r mg o f c e l l p r o t e i n a f t e r 2 4 h . M a g n e s i u m -s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s m a i n t a i n e d a h i g h e r l e v e l o f c e l l u l a rm a g n e s i u m t h r o u g h o u t f e r m e n t a t i o n t h a n c u l t u r e s g r o w n i nu n s u p p l e m e n t e d YEPD m e d i u m .M a g n e s i u m l i m i t a t i o n o f g r o w t h o f o t h e r s t r a i n s . T h r e eo t h e r s t r a i n s w e r e i n v e s t i g a t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r m a g -n e s i u m a l s o l i m i t e d t h e i r g r o w t h : S . c e r e v i s i a e CC3 ( p a r e n to r g a n i s m ) , S . c e r e v i s i a e A 1 0 , a n d S . s a k e . G l u c o s e -r e c o n s t i t u t e d m e d i u m was p r e p a r e d f r o m e a c h o f t h e s ec u l t u r e s . C u l t u r e s were i n o c u l a t e d i n t o t h e i r r e s p e c t i v eg l u c o s e - r e c o n s t i t u t e d m e d i u m w i t h a n d w i t h o u t a d d e d m a g -n e s i u m ( 0 . 0 5 m M) a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 h o n a r o t a t o r . S .c e r e v i s i a e CC3 a n d t h e s t r a i n o f S . s a k e e x h i b i t e d m a g n e -s i u m -d e pe n d e n t g r o w t h a l m o s t i d e n t i c a l t o t h a t r e p o r t e d f o rs t r a i n KD2. T h e o p t i c a l d e n s i t y a t 5 5 0 n m a f t e r 4 8 h w i t ha d d e d m a g n e s i u m was 8 . 3 t o 9 . 4 , a n d 0 . 5 w i t h o u t . S .c e r e v i s i a e A 1 0 g r e w p o o r l y i n i t s g l u c o s e - r e c o n s t i t u t e d m e -d i u m , w i t h a n o p t i c a l d e n s i t y a t 5 5 0 n m a f t e r 4 8 h o f 1 . 0 t o 1 . 2f o r b o t h t h e c o n t r o l a n d s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s . A l l t h r e es t r a i n s r e a c h e d a s i m i l a r c e l l d e n s i t y i n f r e s h YEPD m e d i u m( o p t i c a l d e n s i t y a t 5 5 0 nm o f 1 4 . 2 t o 1 5 . 2 ) . T h e s e r e s u l t si n d i c a t e t h a t t h e m a g n e s i u m l i m i t a t i o n o b s e r v e d i n s t r a i nKD2 w as n o t c a u s e d b y t h e p e t i t e m u t a t i o n a n d w as n o tl i m i t e d t o s t r a i n CC3 a n d i t s d e r i v a t i v e s . H o w e v e r , a d d i -t i o n a l f a c t o r s w e r e c l e a r l y i n v o l v e d w i t h S . c e r e v i s i a e A 1 0 .E f f e c t o f m a g n e s i u m s u p p l e m e n t a t i o n on b a t c h f e r m e n t a -t i o n . T h e e f f e c t s o f s u p p l e m e n t i n g YEPD m e d i u m w i t h 0 . 5mM MgSO4 o n b a t c h f e r m e n t a t i o n a r e i l l u s t r a t e d i n F i g . 3 .T h e p r o d u c t i o n o f c e l l mass a s m e a s u r e d b y c e l l u l a r p r o t e i ni s s h o w n i n F i g . 3 A . S u p p l e m e n t a t i o n w i t h m a g n e s i u mp r o l o n g e d t h e e x p o n e n t i a l r i s e i n c e l l u l a r p r o t e i n , a l l o w i n g a53 % i n c r e a s e i n c e l l mass o v e r t h a t o f t h e c o n t r o l w i t h i n 1 8h a f t e r i n o c u l a t i o n . T h e a d d i t i o n o f m a g n e s i u m a l s o i n -c r e a s e d t h e r a t e a t w h i c h g l u c o s e w a s c o n s u m e d a n d e t h a n o lw a s p r o d u c e d ( F i g . 3 B a n d C ) . A f t e r 3 0 h o f i n c u b a t i o n ,m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s h a d p r o d u c e d 3 m o r ee t h a n o l t h a n t h e c o n t r o l s . T h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t oe t h a n o l w a s c o m p l e t e a f t e r 4 8 h i n m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e dc u l t u r e s , b u t r e q u i r e d 7 2 h i n c o n t r o l YEPD b r o t h . T h e f i n a ly i e l d o f e t h a n ol w a s e s s e n t i a l l y i d e n t i c a l i n b o t h m a g n e s i u m -s u p p l e m e n t e d a n d c o n t r o l c u l t u r e s , 1 2 . 7 % ( v o l / v o l ) ( 9 8 % o ft h e o r e t i c a l maximum y i e l d ) .E f f e c t o f m a g n e s i u m s u p p l e m e n t a t i o n on r a t e o f f e r m e n t a -t i o n . S a m p l e s were r e m o v e d f r o m m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e da n d c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s a t v a r i o u s t i m e s d u r i n g b a t c hf e r m e n t a t i o n . E t h a n o l c o n c e n t r a t i o n , c e l l p r o t e i n , a n d C O 2

V O L . 5 2 , 1 9 8 6


4/7

9 7 8 DOMBEK AND INGRAM

I . o o l - B

0 . 8 0w

EIm0

: 2Ec o

zcl

0 . 4 0 F

0 . 2 0

00 1 0 2 0 30 40T I M E ( h ) 50 6 0 70

0-a 0

0 1 0 2 0 30 4 0T I M E ( h ) 50 6 0 70F I G . 2 . M a g n e s i u m l e v e l s i n b r o t h a n d c e l l s d u r i n g t h e c o u r s e o f b a t c h f e r m e n t a t i o n . ( A ) I n t r a c e l l u l a r m a g n e s i u m ; ( B ) m a g n e s i u mc o n c e n t r a t i o n i n t h e c u l t u r e b r o t h . R e s u l t s h a v e b e e n p l o t t e d f o r f o u r s e p a r a t e b a t c h f e r m e n t a t i o n s . C l o s e d s y m b o l s r e p r e s e n t f e r m e n t a t i o n ss u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 mM M g S O 4 , a n d o p e n s y m b o l s r e p r e s e n t c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s i n YEPD b r o t h a l o n e .

e v o l u t i o n ( u n w a s h e d ) w e r e m e a s u r e d . F i g u r e 4 s h o w s t h ef e r m e n t a t i o n r a t e ( m i c r o m o l e s o f CO2 e v o l v e d p e r h o u r p e rm i l l i g r a m o f c e l l p r o t e i n ) as a f u n c t i o n o f a c c u m u l a t e de t h a n o l . B o t h c o n t r o l a n d m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d c u l -t u r e s e x h i b i t e d t h e same maximum r a t e o f f e r m e n t a t i o n a ta b o u t 1 % ( v o l / v o l ) e t h a n o l . However, m a g n e s i u m -s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s m a i n t a i n e d a h i g h e r r a t e o f f e r m e n -t a t i o n a s e t h a n o l a c c u m u l a t e d d u r i n g t h e c o m p l e t i o n o f t h eb a t c h f e r m e n t a t i o n . T h i s r a t e was 40% h i g h e r t h a n t h a t o fc o n t r o l c e l l s a f t e r t h e a c c u m u l a t i o n o f 8% ( v o l / v o l ) e t h a n o l .T h e f e r m e n t a t i o n r a t e o f b o t h s u p pl e m e n t e d a n d unsup-

N.I

0-C

p l e m e n t e d c u l t u r e s f e l l p r e c i p i t o u s l y a t a b o u t 1 2 . 5 % e t h a n o l ,c o i n c i d e n t w i t h t h e e x ha u s t i o n o f g l u c o s e .E f f e c t o f m a g n e s i u m a d d i t i o n o n c e l l v i a b i l i t y . The p e r c e n t -a g e o f v i a b l e c e l l s i n b o t h m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d a n du n s u p p l e m e n t e d b a t c h e s r e m a i n e d g r e a t e r t h a n 9 0 % f o r t h ef i r s t 4 8 h o f t h e f e r m e n t a t i o n . G l u c o s e was e x h a u s t e d a t t h i st i m e i n s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s , a n d t h e p e r c e n t a g e o f v i a b l ec e l l s b e g a n t o d e c r e a s e , r e a c h i n g 58% b y 7 2 h . The unsup-p l e m e n t e d b a t c h e s c o n s u m e d g l u c o s e more s l o w l y a n d m a i n -t a i n e d h i g h v i a b i l i t y ( > 9 0 % ) u n t i l b e t w e e n 6 0 a n d 7 0 h , t h et i m e a t w h i c h g l u c o s e was e x h a u s t e d .

1 4 [ C2

1 0

>8

_ j 6z'4L i 4

TIME ( h ) TIME ( h ) 7 0T I M E ( h )F I G . 3 . E f f e c t o f m a g n e s i u m a d d i t i o n on c e l l g r o w t h a n d f e r m e nt a t i o n . R e su l ts h a v e b e e n p l o t t e d f o r f o u r s e p a r a t e b a t c h f e r m e n ta t i o n s.C l o s e d s y m b o l s r e p r e s e n t f e r m e n t a t i o n s s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 mM MgSO4, a n d open s y m b o l s r e p r e s e n t c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s i n YEPDb r o t h a l o n e . ( A ) G r o w t h ; ( B ) g l u c o s e u t i l i z a t i o n ; ( C) e t ha n o l p r od uc t i o n.

- JD 50- J- iL LC )

0

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


5/7

M g 2 + LIMITATION DURING FERMENTATION 9 7 9f e r m e n t a t i o n s w h i c h h a d b e e n a l l o w e d t o a c c u m u l a t e 1 . 2 %( v o l / v o l ) e t h a n o l ( a p p r o x i m a t e l y 1 2 h ) . C e l l s f r o m t h e s es a m p l e s w e r e s t i l l u n d e r g o i n g e x p o n e n t i a l g r o w t h . T h e s e c -o n d s e t o f s a m p l e s was t a k e n f r o m f e r m e n t a t i o n s w h i c h h a db e e n a l l o w e d t o a c c u m u l a t e 5 . 5 % ( v o l / v o l ) e t ha n o l ( a p p r o x -i m a t e l y 2 4 h ) . A t t h i s p o i n t , c e l l s w e r e i n e a r l y s t a t i o n a r yp h a s e .F i g u r e 5A s h o w s t h e d o s e r e s p o n s e o f f e r m e n t a t i v e a c t i v -i t y o f t h e y o u n g e r c e l l s p l o t t e d a s a f u n c t i o n o f t o t a l e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ( e n d o g e n o u s p l u s a d d e d ) . M a g n e s i u m -\ s u p p l e m e n t e d a n d u n s u p pl e m e n t e d c e l l s h a d a s i m i l a r i n i t i a lf e r m e n t a t i o n r a t e , a b o u t 5 7 , u m o l o f CO2 e v o l v e d p e r h p e rm g o f c e l l p r o t e i n , a n d e x h i b i t e d i d e n t i c a l d o s e - r e s p o n s ec u r v e s . A c o n c e n t r a t i o n o f 7 . 6 % ( v o l / v o l ) e t h a n o l r e s u l t e d i n50% i n h i b i t i o n o f f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y .) \ 0 F i g u r e 5 B s h o w s t h e e f f e c t o f e t h a n o l o n t h e f e r m e n t a t i o nr a t e o f t h e o l d e r c e l l s . S u p p l e m e n t e d c e l l s h a d a n i n i t i a lf e r m e n t a t i o n r a t e o f 2 7 . 4 p L m o l o f CO2 e v o l ve d p e r h p e r m g

* a ' a . . o f c e l l p r o t e i n , w i t h a s t a n d a r d d e v i a t i o n ( S D ) o f 0 . 5 , w h i l e0 2 4 6 8 1 0 1 2 u n s u p p l e m e n t e d c e l l s e x h i b i t e d a s i g n i f i c a n t l y l o w e r r a t e ,ETHANOL ( % v / v ) 2 2 . 9 , u m o l o f C O 2 e v o l v e d p e r h p e r m g o f c e l l p r o t e i n w i t hE f f e c t o f a d d e d m a g n e s i u m o n t h e r a t e o f f e r m e n t a t i o n . a n SD o f 1 . 2 . The f e r m e n t a t i o n r a t e o f c e l l s f r o m s u p p l e -r n r a t e s w e r e m e a su r e d b y r e s p i r o m e t r y o f u n w a s h e d m e n t e d c u l t u r e s was a l w a y s h i g h e r t h a n t h a t o f c o n t r o l c e l l s .

l i a t e l y a f t e r s a m p l i n g a n d a r e p l o t t e d a s a f u n c t i o n o f The amount o f e t h a n o l p r e s e n t i n t h e s u p p l e m e n t e d c u l t u r ed e t h a n o l f o r f o u r s e p a r a t e b a t c h f e r m e n t a t i o n s . C l o s e d w as 3 . 0 % ( v o l / v o l ) h i g h e r t h a n i n t h e u n s u p p l e m e n t e d c u l -) r e s e n t c u l t u r e s s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 m M M g S O 4 , a n d t u r e when c o m p a r e d a t e q u a l f e r m e n t a t i o n r a t e s . T h e f e r -l s r e p r e s e n t c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s i n YEPD b r o t h a l o n e . m e n t a t i o n r a t e o f m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d a n d c o n t r o l f e r -m e n t a t i o n s e x h i b i t e d l i n e a r d o s e r e s p o n s e s t o e t h a n o l . Ar e t h a n o l o n t h e f e r m e n t a t i o n r a t e o f m a g n e s i u m - m e a s u r e o f t h e s e n s i t i v i t y o f f e r m e n t a t i o n r a t e t o e t h a n o l i st e d c u l t u r e s . T w o p o i n t s d u ri n g f e r m e n t a t i o n w e r e t h e s l o p e o f t h e d o s e - r e s p o n s e c u r v e . T h e s l o p e f o r s u p p l e -w h i c h t o c o m p a r e c e l l s g r o w n w i t h a n d w i t h o u t m e n t e d b a t c h e s w a s - 0 . 1 7 w i t h a n SD o f 0 . 0 2 , w h i l e t h a t o fg n e s i u m . T h e f i r s t s e t o f s a m p le s w a s t a k e n f r o m t h e c o n t r o l s w a s - 0 . 1 4 w i t h a n SD o f 0 . 0 1 . T h e d i f f e r e n c e s

1 0 0 oA

04. .I -

4 )

._

wI -zwwL L .

0

2 4 6 8 1 0 1 2 1 4ETHANOL ( % v / v )

8 0 1

B

6 0 1 -

4 0 1 -

2 0 1

2 4 6 8 1 0ETHANOL ( % v / v )

1 2 1 4F I G . 5 . E f f e c t o f m a g n e s i u m s u p p l e m e n t a t i o n on t h e i n h i b i t i o n o f f e r m e n t a t i o n r a t e b y a d d e d e t h a n o l . E r r o r b a r s r e p r e s e n t a v e r a g e SD sf o r t h r e e s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . ( A ) S a m p l e s f r o m b a t c h f e r m e n t a t i o n s t h a t h a d a c c u m u l a t e d 1.2% ( v o l / v o l ) e t h a n o l . ( B ) S a m p l e s f rom b a t c hf e r m e n t a t i o n s t h a t h a d a c c u m u l a t e d 5 . 5 % ( v o l / v o l ) e t h a n o l . S y m b o l s : 0 , 0 . 5 mM m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d f e r m e n t a t i o n s ; 0, c o n t r o lf e r m e n t a t i o n s i n YEPD b r o t h a l o n e .

60c0

I-'.c - c m 4 0Z-_ a )

ZNx C ) 2 0wLL-0E

0

F I G . 4 . ]F e r m e n t a t i cc e l l s i m m e ca c c u m u l a t es y m b o l s r e po p e n s y m b c

E f f e c t o fs u p p l e m e nc h o s e n a ta d d e d m a E1 0 0

I -

- , 8060I -' .4 -

6 0

w> 40. 4zwwLL 20

I .

1 -

V O L . 5 2 , 1 9 8 6

I

% f 0


6/7

9 8 0 DOMBEK AND INGRAMi n t h e s e s l o p e s ( F i g . 5 A ) a r e s u g g e s t i v e b u t d o n o t c o n c l u -s i v e l y d e m o n s t r a t e t h a t s u p p l e m e n t a t i o n w i t h m a g n e s i u mr e d u c e d t h e s e n s i t i v i t y o f f e r m e n t a t i o n i n o l d e r c e l l s t oi n h i b i t i o n b y e t h a n o l .

DISCUSSIONT h e d e c l i n e i n f e r m e n t a t i o n r a t e t h a t b e g i n s a t l o w a l c o h o l

c o n c e n t r a t i o n s d o e s n o t seem t o b e c a u se d b y t h e a c u t ep r e s e n c e o f e t h a n o l , b y g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l , o rb y c e l l d e a t h ( D o m b e k a n d I n g r a m , i n p r e s s ) . T h i s d e c l i n ea p p e a r s t o b e r e l a t e d i n p a r t t o a m a g n e s i u m d e f i c i e n c y ,a l t h o u g h o t h e r f a c t o r s a r e a l s o i n v o l v e d . I n y e a s t e x t r a c t -p e p t o n e - b a s e d m e d i u m , a m a g n e s i u m d e f i c i e n c y i s d e v e l -o p e d w h i c h l i m i t s c e l l u l a r g r o w t h a n d t h e r a t e o f c a r b o h y -d r a t e c o n v e r s i o n i n t o e t h a n o l . T h e a d d i t i o n o f m a g n e s i u m t ob a t c h f e r m e n t a t i o n s p r o l o n g e d e x p o n e n t i a l g r o w t h , a l l o w i n gg r e a t e r a c c u m u l a t i o n o f c e l l mass w i t h o u t a f f e c t i n g c e l lv i a b i l i t y . I n a d d i t i o n , c e l l s i n m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d c u l -t u r e s m a i n t a i n e d a h i g h e r f e r m e n t a t i o n r a t e a s e t h a n o l a c c u -m u l a t e d . T h e s e two f a c t o r s , i n c r e a s e d c e l l mass p l u s i n -c r e a s e d f e r m e n t a t i o n r a t e , c o m b i n e d t o r e d u c e t h e t i m er e q u i r e d f o r t h e c o n v e r s i o n o f 2 0 % g l u c o s e t o e t h a n o l b y V 3i n m a g n e s i u m - s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s .D u r i n g b a t c h f e r m e n t a t i o n , y e a s t c e l l s c o n c e n t r a t e d m a g -n e s i u m f r o m t h e m e d i u m . I n u n s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s , m a g -n e s i u m u p t a k e s t o p p e d a t t h e e n d o f e x p o n e n t i a l g r o w t h . A tt h i s p o i n t , t h e c o n c e n t r a t i o n o f m a g n e s i u m i n t h e m e d i u mwas 4 8 , u M , w i t h i n t h e r a n g e o f Km v a l u e s r e p o r t e d f o rm a g n e s i u m t r a n s p o r t b y m i c r o o r g a n i s m s ( 1 7 ) . T h e e n d o fe x p o n e n t i a l g r o w t h a l s o c o i n c i d e d w i t h t h e b e g i n n i n g o f t h ed e c l i n e i n f e r m e n t a t i v e a c t i v i t y . I n m a g n e s i u m - s u p p l e m e n -t e d c u l t u r e s , h i g h e r l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r m a g n e s i u m w er ea c h i e v e d e a r l y i n f e r m e n t a t i o n a n d d e c r e a s e d t o a l e s s e re x t e n t t h a n o b s e r v e d i n u n s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s . M a g n e -s i u m - s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s h a d 6 . 5 t i m e s more m a g n e s i u mi n t h e medium a t t h e e n d o f e x p o n e n t i a l g r o w t h t h a n d i du n s u p p l e m e n t e d c u l t u r e s . T h u s , t h e m a g n e s i u m s u p p l y o ft h e s u p p l e m e n t e d c u l t u r e a p p e a r s t o b e a d e q u a t e f o r g r o w t h ,a n d o t h e r f a c t o r s a r e l i m i t i n g t h e f e r m e n t a t i v e a b i l i t y o ft h e s e y e a s t s u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s .T h e u b i q u i t o u s r o l e o f m a g n e s i u m i n c e l l u l a r p r o c e s s e s i sw e l l d o c u m e n t e d ( 1 7 ) . M a g n e s i u m c o n s t i t u t e s a m a j o r p o r -t i o n o f t h e c e l l u l a r c a t i o n s , m o s t l y b o u n d i n s t r u c t u r e s s u c ha s r i b o s o m e s a n d t h e c e l l e n v e l o p e . T h e f r e e c a t i o n c o n c e n -t r a t i o n , h o w e v e r , m ay p l a y a more d i r e c t r o l e i n r e g u l a t i n go v e r a l l c e l l u l a r m e t a b o l i s m a n d c e l l d i v i s i o n ( 3 9 ) . Many o ft h e e n z y m e s t h a t f u n c t i o n i n DNA r e p l i c a t i o n , t r a n s c r i p t i o n ,a n d t r a n s l a t i o n r e q u i r e m a g n e s i u m f o r a c t i v i t y . I n f e r m e n t a -t i o n p a t h w a y s , m a g n e s i u m i s a r e q u i r e d c o f a c t o r a n d n u c l e -o t i d e c o u n t e r i o n i n many r e a c t i o n s . M a g n e s i u m l e v e l s a r et y p i c a l l y m a i n t a i n e d a t m i l l i m o l a r i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a -t i o n s , a n d i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t t h i s c a t i o n i s a l i m i t i n gn u t r i e n t d u r i n g h i g h - g r a v i t y f e r m e n t a t i o n s .

P r e v i o u s s t u d i e s i n o u r l a b o r a t o r y ( 3 2 ) h a v e d e m o n s t r a t e dt h a t t h e i n h i b i t i o n o f f e r m e n t a t i o n b y a d d e d e t h a n o l i nZymomonas m o b i l i s i s p r i m a r i l y d u e t o e t h a n o l - i n d u c e dl e a k a g e , p a r t i c u l a r l y o f m a g n e s i u m , t h e c a t i o n r e q u i r e d i nt h e a c t i v e f o r m o f t h e n u c l e o t i d e c o f a c t o r s f o r g l y c o l y t i ce n z y m e s . T h e a d d i t i o n o f m a g n e s i u m s a l t s a t 0 . 5 mM s u b -s t a n t i a l l y r e v e r s e d t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f u p t o 1 3 %( v o l / v o l ) e t h a n o l . A l t h o u g h a n a l o g o u s s t u d i e s h a v e n o t b e e np e r f o r m e d w i t h S . c e r e v i s i a e , i t i s l i k e l y t h a t e t h a n o l a l s oi n c r e a s e s t h e l e a k a g e o f s m a l l m o l e c u l e s i n t h i s o r g a n i s m .C a s e y e t a l . ( 3 ) h a v e a l s o r e p o r t e d t h a t n u t r i e n t l i m i t a t i o ni s a n i m p o r t a n t f a c t o r i n f e r m e n t a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o n o f

h i g h - g r a v i t y b r e w i n g w o r t ( c o n t a i n i n g up t o 31 % d i s s o l v e ds o l i d s ) w i t h y e a s t e x t r a c t , e r g o s t e r o l , a n d o l e i c a c i d a l l o w e dt h e p r o d uc t i o n o f 1 6 . 2 % ( v o l / v o l ) e t h a n o l b y b r e w e r s ' y e a s t .H i g h e r r a t e s o f a l c o h o l p r o d u c t i o n r e s u l t e d p r i m a r i l y f r o ma n i n c r e a s e i n c e l l m a s s a s s o c i a t e d w i t h n u t r i e n t -s u p p l e m e n t e d f e r m e n t a t i o n s a n d d i d n o t a p p e a r t o i n c l u d e a ni n c r e a s e i n t h e r e s i s t a n c e o f f e r m e n t a t i o n r a t e t o e t h a n o l .V i e g a s e t a l . ( 3 8 ) r e p o r t e d t h a t n u t r i e n t a d d i t i o n t o a y e a s te x t r a c t - b a s e d medium c o n t a i n i n g 3 0 t o 40% g l u c o s e e n -h a n c e d t h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o n b y S a c c h a r o m y c e sb a y a n u s . T h e i r n u t r i e n t s o u r c e w a s s o y f l o u r , w h i c h h a dp r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o i n c r e a s e t h e f e r m e n t a t i v e p r o d u c -t i v i t y o f S . c e r e v i s i a e ( 5 ) a n d Z . m o b i l i s ( 1 8 ) . A g a i n , s u p p l e -m e n t a t i o n l e d t o a n i n c r e a s e i n c e l l c o n c e n t r a t i o n . V i e g a s e ta l . f u r t h e r d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a q u e o u s f r a c t i o n o f s o yf l o u r r a t h e r t h a n t h e l i p i d f r a c t i o n c o n t a i n e d t h e c o m p o n e n t sb e n e f i c i a l f o r f e r m e n t a t i o n . T h i s a q u e o u s f r a c t i o n w o u l dh a v e i n c l u d e d i n o r g a n i c i o n s s u c h a s m a g n e s i u m . I n d e e d , i ti s p o s s i b l e t h a t many o f t h e c o m p l e x n u t r i e n t a d d i t i v e s u s e dt o i n c r e a s e e t h a n o l p r o d u c t i o n a r e a l s o c o r r e c t i n g a n i n o r -g a n i c - i o n d e f i c i e n c y .T h e c a u s e s o f t h e p r o g r e s s i v e d e c l i n e i n f e r m e n t a t i v ea c t i v i t y w h i c h a r e o b s e r v e d a s e t h a n o l a c c u m u l a t e s d u r i n gb a t c h f e r m e n t a t i o n a p p e a r t o b e much m o r e c o m p l i c a t e dt h a n e x p e c t e d . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t d i r e c t e t h a n o l i n h i -b i t i o n i s o n l y p a r t i a l l y r e s p o n s i b l e . A n u t r i e n t l i m i t a t i o n f o rm a g n e s i u m a l s o a p p e a r s t o b e p a r t l y r e s p o n s i b l e . W i t ha b u n d a n t m a g n e s i u m , o n l y a 50% f u r t he r i n c r e a s e i n c e l lm a s s w a s o b s e r v e d , i n d i c a t i n g t h a t a n o t h e r f a c t o r ( s ) b e -c o m e s l i m i t i n g f o r g r o w t h a n d f e r m e n t a t i o n a t t h i s p o i n t .I n d e e d , a c o m p l e t e u n d e r s t a n d i n g o f t h e b i o c h e m i c a l b a s i sf o r t he d e c li n e i n f e r m e n t a t i o n r a t e i n y e a s t s may r e q u i r ed e t e r m i n a t i o n o f t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r t h e t e r m i n a t i o no f e x p o n e n t i a l g r o w t h a n d t h e a s s o c i a t e d p h y s i o l o g i c a l a n de n z y m a t i c c h a n g e s .

ACKNOWLEDGMENTST h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y a g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l

S c i e n c e F o u n d a t i o n (DMB 8 2 0 4 9 2 8 ) , b y a g r a n t f r o m t h e D e p a r t -m e n t o f E n e r g y , O f f i c e o f B a s i c E n e r g y R e s e a r c h ( D E - F G 0 5 -8 6 E R 1 3 5 7 4 ) , a n d b y t h e F l o r i d a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n .LITERATURE CITED

1 . B a z u a , C . D . , a n d C . R . W i l k e . 1 9 7 7 . E t h a n o l e f f e c t s o n t h ek i n e t i c s o f a c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n w i t h S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e . B i o t e c h n o l . B i o e n g . S y m p . 7 : 1 0 5 - 1 1 8 .2 . B r o w n , S . H . , S . G . O l i v e r , D . E . F . H a r r i s o n , a n d R . C .R i g h e l a t o . 1 9 8 1 . E t h a n o l i n h i b i t i o n o f y e a s t g r o w t h a n d f e r m e n -t a t i o n : d i f f e r e n c e s i n t h e m a g n i t u d e a n d c o m p l e x i t y o f t h e e f f e c t .E u r . J . A p p l . M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 1 1 : 1 5 1 - 1 5 5 .3 . C a s e y , G . P . , C . A . M a g n u s , a n d W. M. I n g l e d e w . 1 9 8 4 .H i g h - g r a v i t y b r e w i n g : e f f e c t s o f n u t r i t i o n o n y e a s t c o m p o s i t i o n ,f e r m e n t a t i v e a b i l i t y , a n d a l c o h o l p r o d u c t i o n . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 4 8 : 6 3 9 - 6 4 6 .4 . C y s e w s k i , G . R . , a n d C . R . W i l k e . 1 9 7 7 . R a p i d e t h a n o l f e r m e n -t a t i o n u s i n g vacuum a n d c e l l r e c y c l e . B i o t e c h n o l . B i o e n g .1 9 : 1 1 2 5 - 1 1 4 3 .5 . D a m i a n o , D . , a n d S . S . W a n g . 1 9 8 5 . I m p r o v e m e n t s i n e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n a n d f e r m e n t o r e t h a n o l p r o d u c t i v i t y i n y e a s t f e r -m e n t a t i o n s u s i n g w h o l e s o y f l o u r i n b a t c h a n d c o n t i n u o u sr e c y c l e s y s t e m s . B i o t e c h n o l . L e t t . 7 : 1 3 5 - 1 4 0 .6 . D a s a r i , G . , E . K e s h a v a r z , M. A . C o n n o r , a n d N . B . P a m m e n t .1 9 8 5 . A r e l i a b l e m e t h o d f o r d e t e c t i n g t h e i n t r a c e l l u l a r a c c u m u -l a t i o n o f f e r m e n t a t i o n p r o d u c t s : a p p l i c a t i o n t o i n t r a c e l l u l a re t h a n o l a n a l y s i s . B i o t e c h n o l . L e t t . 7 : 5 4 1 - 5 4 6 .7 . D a s a r i , G . , F . R o d d i c k , M. A . C o n n o r , a n d N . B . P a m m e n t .1 9 8 3 . F a c t o r s a f f e c t i n g t h e e s t i m a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n s . B i o t e c h n o l . L e t t . 5 : 7 1 5 - 7 2 0 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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M g 2 + LIMITATION DU R ING FER M ENTATI ON 9 8 18 . D o m b e k , K . M . , a n d L . 0 . I n g r a m . 1 9 8 6 . D e t e r m i n a t i o n o f t h ei n t r a c e l l u l a r c o n c e n tr a t io n o f e t ha n ol i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i -s i a e d u r i n g f e r m e n t a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .5 1 : 1 9 7 - 2 0 0 .9 . G h o s e , T . K . , a n d R . D . T y a g i . 1 9 7 9 . R a p i d e t h a n o l f e r m e n t a t i o no f c e l l u l o s e h y d r o l y s a t e . I I . P r o d u c t a n d s u b s t r a t e i n h i b i t i o na n d o p t i m i z a t i o n o f f e r m e n t o r d e s i g n . B i o t e c h n o l . B i o e n g .2 1 : 1 4 0 1 - 1 4 2 0 .1 0 . G o e l , S . C . , a n d N . B . P a m m e n t . 1 9 8 4 . D i r e c t i n j e c t i o n t e c h -

n i q u e f o r g a s c h r o m a t o g r a p h i c d e t e r m i n a t i o n o f e t h a n o l a n do t h e r v o l a t i l e s i n c o n c e n t r a t e d c e l l s u sp e ns i o n s . B i ot e c hn o l.L e t t . 3 : 1 7 7 - 1 8 2 .1 1 . G r a y , W. D . 1 9 4 1 . T h e a l c o h o l t o l e r a n c e o f y e a s t s . J . B a c t e r i o l .4 2 : 5 6 1 - 5 7 4 .1 2 . G u i j a r r o , J . M . , a n d R . L a g u n a s . 1 9 8 4 . S a c c h a r o m y c e s c e r e v i -s i a e d o e s n o t a c c u m u l a t e e t h a n o l a g a i n s t a c o n c e n t r a t i o n g r a d i -e n t . J . B a c t e r i o l . 1 6 0 : 8 7 4 - 8 7 8 .1 3 . H a y a s h i d a , S . , D . D . F e n g , K . O h ta , S . C h a i t i u m v o n g , a n d M.H o n g o . 1 9 7 6 . C o m po s i t i o n s a n d a r o l e o f A s p e r g i l l u s o r y z a ep r o t e o l i p i d a s a h ig h c o n c e n t r a t i on a l c o h o l - p r o d u c i n g f a c t o r .A g r i c . B i o l . C h e m . 4 0 : 7 3 - 7 8 .1 4 . H o s s a c k , J . A . , a n d A . H . R o s e . 1 9 7 6 . F r a g i l i t y o f p l a s m am e m b r a n e s i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e e n r i c he d w i t h d i f -f e r e n t s t e r o l s . J . B a c t e r i o l . 1 2 7 : 6 7 - 7 5 .1 5 . I n g r a m , L . O . , a n d T . M . B u t t k e . 1 9 8 4 . E f f e c t s o f a l c o h o l s o nm i c r o - o r g a n i s m s . A d v . M i c r o b . P h y s i o l . 2 5 : 2 5 3 - 3 0 0 .1 6 . J a n s s e n s , J . H . , N . B u r r i s , A . W o o d w a r d , a n d R . B . B a i l e y . 1 9 8 3 .L i p i d - e n h a n c e d e t h a n o l p r o d u c t i o n b y K l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 5 : 5 9 8 - 6 0 2 .1 7 . J a s p e r , P . , a n d S . S i l v e r . 1 9 7 7 . M a g n e s i u m t r a n s p o r t i n m i c r o -o r g a n i s m s , p . 7 - 4 7 . I n E . D . W e i n b e r g ( e d . ) , M i c r o o r g a n i s m sa n d m i n e r a l s . M a r c e l D e k k e r , I n c . , Ne w Y o r k .1 8 . J u , N . , D . D a m i a n o , C . S . S h i n , N . K i m , a n d S . S . W a n g . 1 9 8 3 .C o n t i n u o u s e t ha n o l f e r m e n ta t i on o f Zymomonas m o b i l i s u s i n gs o y f l o u r a s a p r o t e c t i v e a g e n t . B i o t e c h n o l . L e t t . 5 : 8 3 7 - 8 4 2 .1 9 . L a f o n - L a f o u r c a d e , S . , F . L a r u e , a n d P . R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 7 9 .E v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f " s u r v i v a l f a c t o r s " a s a n e x p l a n a -t i o n f o r s o m e p e c u l i a r i t i e s o f y e a s t g r o w t h , e s p e c i a l l y i n g r a p em u s t o f h i g h s u g a r c o n c e n t r a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 8 : 1 0 6 9 - 1 0 7 3 .2 0 . L a r u e , F . , S . L a f o n - L a f o u r c a d e , a n d P . R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 8 4 .R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e i n h i b i t i o n o f a l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n b yS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a n d t h e a c t i v i t i e s o f h e xo k i n a s e a n d

a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e . B i o t e c h n o l . L e t t . 6 : 6 8 7 - 6 9 2 .2 1 . L a y n e , E . 1 9 5 7 . S p e c t r o p h o t o m e t r i c a n d t u r b i d i m e t r i c m e t h o d sf o r m e a s u r i n g p r o t e i n s . M e t h o d s E n z y m o l . 3 : 4 4 7 - 4 5 4 .2 2 . L e a o , C . , a n d N . v a n U d e n . 1 9 8 2 . E f f e c t s o f e t h a n o l a n d o t h e ra l k a n o l s o n t h e k i n e t i c s a n d t h e a c t i v a t i o n p a r a m e t e r s o f t h e r -m a l d e a t h i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . B i o t e c h n o l . L e t t .2 4 : 1 5 8 1 - 1 5 9 0 .2 3 . L u o n g , J . H . T . 1 9 8 5 . K i n e t i c s o f e t ha n ol i n h i b i t i o n i n a l c o h o l

f e r m e n t a ti o n . B i o t e c hn o l . B i o e n g. 2 7: 2 8 0 -2 8 5.2 4 . M i l l a r , D . G . , K . G r i f f i t h s - S m i t h , E . A l g a r , a n d R . K . S c o p e s .1 9 8 2 . A c t i v i t y a n d s t a b i l i t y o f g l y c o l y t i c e n z y m e s i n t h e p r e s -e n c e o f e t h a n o l . B i o t e c h n o l . L e t t . 9 : 6 0 1 - 6 0 6 .2 5 . M i l l s , D . R . 1 9 4 1 . D i f f e r e n t i a l s t a i n i n g o f l i v i n g a n d d e a d y e a s tc e l l s . F o o d R e s . 6 : 3 6 1 - 3 7 1 .2 6 . M o u l i n , G . , H . B o z e , a n d P . G a l z y . 1 9 8 4 . I n h i b i t i o n o f a l c o h o l i cf e r m e n t a t i o n . B i o t e c h n o l . G e n e t . E n g . R e v. 2 : 3 6 5 - 3 8 2 .2 7 . N a g o d a w i t h a n a , T . W . , a n d K . W. S t e i n k r a u s . 1 9 7 6 . I n f l u e n c e o ft h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o n a n d a c c u m u l a t i o n o n t h e v i a b i l i t yo f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i n " r a p i d f e r me n t a ti o n s. " A p pl .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 1 : 1 5 8 - 1 6 2 .2 8 . N a v a r r o , J . M . , a n d G . D u r a n d . 1 9 7 8 . F e r m e n t a t i o n a l c o o l i q u e :i n f l u e n c e d e l a t e m p e r a t u r e s u r l ' a c c u m u l a t i o n d ' a l c o o l d a n s l e sc e l l u l e s d e l e v u r e . A n n . M ic r o bi o l. 1 2 9 B: 2 1 5 - 22 4 .2 9 . N e s , W. R . , B . C . S e k u l a , W. D . N e s , a n d J . H . A d l e r . 1 9 7 8 . T h ef u n c t i o n a l i m p o r t a n c e o f s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f e r g o s t e r o l i ny e a s t . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 6 2 1 8 - 6 2 2 5 .3 0 . N o v a k , M . , P . S t r e h a i a n o , M. M o r e n o , a n d G . G o m a . 1 9 8 1 .A l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n : o n t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f e t h a n o l .B i o t e c h n o l . B i o e n g . 2 7 : 2 8 0 - 2 8 5 .3 1 . O h t a , K . , a n d S . H a y a s h i d a . 1 9 8 3 . R o l e o f Tween 8 0 a n dm o n o o l e i n i n a l i p i d - s t e r o l - p r o t e i n c o m p l e x w h i c h e n h a n c e se t h a n o l t o l e r a n c e o f s a k e y e a s t s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .4 6 : 8 2 1 - 8 2 5 .3 2 . O s m a n , Y . A . , a n d L . 0 . I n g r a m . 1 9 8 5 . M e c h a n i s m o f e t h a n o li n h i b i t i o n o f f e r m e n t a t i o n i n Zymomonas m o b i l i s C P 4 . J . B a c -t e r i o l . 1 6 4 : 1 7 3 - 1 8 0 .3 3 . P a n c h a l , C . J . , a n d G . G . S t e w a r t . 1 9 8 0 . T h e e f f e c t o f o s m o t i cp r e s s u r e o n t h e p r o d u c t i o n a n d e x c r e t i o n o f e t h a n o l a n d g l y c -e r o l b y a b r e w i n g y e a s t s t r a i n . J . I n s t . B r e w . 8 6 : 2 0 7 - 2 1 0 .3 4 . P r o u d l o c k , J . W . , L . W. W h e e l d o n , D . J . J o l l o w , a n d A . W.L i n n a n e . 1 9 6 8 . R o l e o f s t e r o l s i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e .B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 5 2 : 4 3 4 - 4 3 7 .3 5 . R a h n , 0 . 1 9 2 9 . T h e d e c r e a s i n g r a t e o f f e r m e n t a t i o n . J . B a c t e -r i o l . 1 8 : 2 0 7 - 2 2 6 .3 6 . S t r e h a i a n o , P . , a n d G . Goma. 1 9 8 3 . E f f e c t o f i n i t i a l s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n o n t w o w i n e y e a s t s : r e l a t i o n b e t w e e n g l u c o s es e n s i t i v i t y a n d e t h a n o l i n h i b i t i o n . Am . J . E n o l . V i t i c . 3 4 : 1 - 5 .3 7 . T h o m a s , D . S . , J . A . H o s s a c k , a n d A . H . R o s e . 1 9 7 8 . P l a s m a -m e m b r a n e l i p i d c o m p o s i t i o n a n d e t h a n o l t o l e r a n c e i n S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e . A r c h . M i c r o b i o l . 1 1 7 : 2 3 9 - 2 4 5 .3 8 . V i e g a s , C . A . , I . S a - C o r r e i a , a n d J . M. N o v a i s . 1 9 8 5 . N u t r i e n t -e n h a n c e d p r o d u c t i o n o f r e m a r k a b l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o fe t h a n o l b y S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e t h r o u g h s o y f l o u r s u p p l e -m e n t a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 0 : 1 3 3 3 - 1 3 3 5 .3 9 . W a l k e r , G . M . , a n d J . H . D u f f u s . 1 9 8 0 . M a g n e s i u m i o n s a n d t h ec o n t r o l o f t h e c e l l c y c l e i n y e a s t . J . C e l l . S c i . 4 2 : 3 2 9 - 3 5 6 .4 0 . W i c k e r s h a m , L . J . 1 9 5 1 . T a x o n o m y o f y e a s t s . USDA T e c h n i c a lB u l l e t i n N o . 1 0 2 9 1 - 5 6 . U . S . D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , W a s h -i n g t o n , D . C .

VOL . 5 2 , 1 9 8 6

Limitaciones Del Mg y Su Papel Aparente en La Resistencia Al Etanol Durante La Fermentacion Por...

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