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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS CÁRNICOS PROCESADOS

A lo largo del curso se han estudiado determinaciones específicas aplicables a productos alimenticios, como son las determinaciones de microorganismos indicadores y de los principales patógenos, basadas en las NOM’s para dichas pruebas y aplicables a la mayoría de los alimentos. En este caso, la práctica se refiere a un producto específico: carnes procesadas, e incluye todas las determinaciones necesarias para establecer la calidad sanitaria del alimento; el ejercicio se basa en la NOM-213-SSA1-2002. Productos y Servicios. Productos cárnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Métodos de prueba. Los estudiantes deben consultar esta norma y familiarizarse con su estructura. Verán por ejemplo, que el capítulo 5 Especificaciones Sanitarias incluye:

5.1 Especificaciones sanitarias en proceso, incluyendo: 5.1.1 generales, 5.1.2 del personal y 5.1.3 específicas.

5.2 Especificaciones sanitarias de producto, incluyendo:

5.2.1 Límites máximos para microorganismos y parásitos 5.2.2 Materia extraña y 5.2.3 Aditivos para alimentos. Evidentemente, las especificaciones que competen a esta asignatura son las de microorganismos, que son parte del inciso 5.2 y se establecen en la Tabla 1.

Tabla 1. Especificaciones para microorganismos y parásitos en productos cárnicos procesados

Producto

Mesófilos aerobios ufc/g

Coliformes fecales NMP/g

Salmonella spp. en 25 g

Trichinella spiralis

Cisticercos

Cocidos

100001

600002 < 3 Ausente N.A. N.A.

Crudos

N.A. N.A. Ausente Ausente3 N.A.

Curados

N.A. < 3 Ausente N.A. N.A.

Marinados o en salmuera

N.A. < 3 Ausente N.A. N.A.

Fritos

N.A. N.A. N.A. N.A. Ausente

1 = en planta 2 = en punto de venta

3 = no aplica a madurados crudos

N.A. = No aplica

Fuente: NOM-213-SSA1-2002. Capítulo 5.

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También deben leer con atención el capítulo 7 Métodos de Prueba de la NOM-213-SSA1-2002, que establece las metodologías para determinar los parámetros contenidos en las especificaciones. Dicho capítulo indica lo siguiente:

7.1 Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta Norma, se deben aplicar los métodos de prueba citados en el apartado de referencias. Las referencias están en el capítulo 2 y las aplicables para esta asignatura son: NOM-092-SSA1-1994, cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-114-SSA1-1994, Método para la determinación de Salmonella en alimentos.

7.2 Para la verificación oficial de la especificación de coliformes fecales se aplicará la NOM-112-SSA1-1994, citada en el apartado de referencias.

Por otro lado, según el producto cárnico procesado de que se trate, pueden ser aplicables otras normas, por ejemplo la NOM-130-SSA1-1995, Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Para este ejercicio, haremos el análisis microbiológico de un producto cárnico procesado, cocido, para establecer si cumple las especificaciones microbiológicas de la NOM-213-SSA1-2002, con el siguiente esquema general: ** Esta determinación no está en la NOM-213 ni en el capítulo 2 Referencias.

Mesófilos aerobios, cuenta en placa

Prueba presuntiva NMP

Prueba de coliformes fecales **

RESULTADOS

RESULTADOS

Pesar 10 g y preparar diluciones

Muestra de cárnico procesado

Preenriquecimiento

Enriquecimiento selectivo

Aislamiento diferencial

Purificación

Identificación presuntiva

Identificación completa

RESULTADOS

Pesar 25 g para determinación de Salmonella

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Sin embargo de inmediato enfrentaremos un primer problema: que a pesar de que la NOM-213 incluye coliformes fecales en las especificaciones e indica que debe utilizarse la técnica descrita en la NOM-112 para la determinación de coliformes por el método del NMP, esta NOM no incluye la determinación de coliformes fecales. Así que será necesario apoyarnos en otro método: CCAYAC-M-004. Estimación de la densidad microbiana por el método del número más probable (NMP), Detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por el NMP, publicado por la Secretaría de Salud (DOF; 12 julio de 2006) como método de prueba de un laboratorio “tercero autorizado”.

CCAYAC es la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura de COFEPRIS, dependiente de la Secretaría de Salud y por ello ha desarrollado algunas técnicas necesarias para el control microbiológico. Usaremos el método CCAYAC-M-004/8 para la identificación del origen (fecal o no-fecal) de los coliformes y también para la identificación de Escherichia coli. Ésta es importante porque es el mejor y más específico indicador de contaminación fecal. De hecho, en algunos países existe la tendencia a utilizar a este microorganismo como indicador y omitir los coliformes, en aras de contar con requisitos cada vez más claros, con especificaciones más consistentes y fáciles de aplicar, así como de brindar mayor certeza al consumidor (FDA, 2013). Esta tendencia se ha visto incrementada por que la determinación de E. coli hoy día, gracias a sustratos específicos y cromogénicos y/o a métodos rápidos y/o miniaturizados, es más fácil, rápida y confiable de lo que era antes. Algunos autores están considerando que es preferible una prueba de presencia/ausencia (muestreo de 2 clases) para E. coli, que es inaceptable en alimentos procesados, que una prueba como coliformes, cuyo límite numérico implica la aplicación de un muestreo de 3 clases (ISCFM, 2002). Por eso mismo se considera que las especificaciones obligatorias en algunos países irán cambiando paulatinamente en este sentido. Por ejemplo, Australia considera que es inaceptable la presencia de E. coli en alimentos “Listos para consumo” (LPC o RTE por sus siglas en inglés), pues revela escasa higiene y/o tratamiento térmico inadecuado (FSANZ, 2001). Y es por estas razones que utilizaremos también las placas 3M Petrifilm EC para determinación de Escherichia coli y coliformes. El fundamento de esta placa es un medio similar al ABRV, con lactosa e inhibidores de Grampositivos así como un glucurónido (que es sustrato específico de E. coli) acoplado a un colorante azul. Si hay presencia de E. coli, hidrolizará el glucurónido mediante la glucuronidasa específica del microorganismo y liberará un colorante azul que precipita. Los coliformes fermentan la lactosa, generan colonias rojas y dejan burbujas de gas atrapadas en la película, en tanto que las colonias de Escherichia coli son azules y con gas. Finalmente, haremos también una identificación se Salmonella automatizada, en el Vitek de Biomerieux, equipo basado en método tradicional de cultivo, pero que hace la lectura de resultados mediante un sistema óptico automatizado, acoplado

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a software y a base de datos que facilita una interpretación rápida y confiable. Por ser automatizado permite además, una excelente estandarización. Con el ejercicio completo, se logrará:

establecer claramente si el producto cumple con las especificaciones de ley (NOM-213-SSA1) y

tener un panorama amplio de lo que se puede aplicar para el control microbiológico de alimentos en la industria.

Metodología del ejercicio Completo

Preenriquecimiento

Enriquecimiento selectivo

Aislamiento diferencial

Purificación

Identificación presuntiva

Identificación completa

RESULTADOS

Pesar 25 g para determinación de Salmonella

Aislamiento en EMB

Mesófilos aerobios, cuenta en placa

Prueba presuntiva NMP

Prueba de coliformes fecales

RESULTADOS

RESULTADOS

Pesar 10 g y preparar diluciones

Muestra de cárnico procesado

Petrifilm EC

RESULTADOS

Interpretación

Propagación en BHI

Interpretación

Identificación en Vitek

Purificación en EMB

Propagación en BHI

Indol RM VP Citrato

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Material y equipo Stomacher Balanza granataria mecheros asa bacteriológica

pipeta automática de 1000 L portaobjetos cámara de pruebas serológicas Diluyentes: 1 matraz con 90 mL de agua peptonada 3 tubos con 9.0 mL de agua peptonada Consumibles 2 bolsas estériles para Sotmacher 7 cajas Petri estériles 2 placas Petrifilm EC 1 tarjeta Vitek para Gramnegativos Medios de cultivo: Sesión 1

1 matraz con 130 mL de ATGEL 9 tubos 16x150 con 10 mL de caldo lactosado y campana de Durham 1 matraz de 500 mL con 225 mL de caldo lactosado Sesión 2

9 tubos con 10 mL de caldo EC y campana de Durham 4 cajas de agar EMB o McConkey 2 a 9 tubos con 3 mL de BHI 1 tubo de caldo tetrationato 1 tubo de caldo selenito cistina o de medio Vassiliadis-Rappaport

Sesión 3

1 caja de agar XLD 1 caja de agar SS 1 caja de agar sulfito de bismuto 2 cajas de agar bilis verde brillante 2 cajas de agar entérico de Hektoen 3 tubos con medio SIM 6 tubos con medio MRVP 3 tubos con agar citrato de Simmons 6 tubos de LIA 6 tubos de Kliegler 6 tubos de TSI Sesión 4

3 tubos de caldo urea 3 tubos de caldo malonato rojo fenol 3 tubos de SIM 6 tubos de MRVP 3 tubos de agar citrato de Simmons Sueros antiSalmonella O, Vi,H Reactivos Reactivo de Ehrlich Reactivos de Kovacs Rojo de metilo Colorantes de Gram

Cubiertos estériles Cuentacolonias Microscopio Incubadora a 35 °C Baño de agua de temperatura controlada, 44.5 +0.1°C Identificador de bacterias Vitek

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A. Preparación de la muestra y diluciones. Recuerde que la selección de las diluciones que se vayan a preparar y a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos, la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado y los límites señalados por las normas aplicables.

1. Pesar 10.0 g de la muestra en una caja Petri o bolsa plástica estéril de tamaño adecuado.

2. Adicionar un volumen de 90.0 mL del diluyente, a una temperatura similar a la de la muestra.

3. Homogeneizar en el Stomacher 1 minuto a velocidad media, hasta obtener una suspensión completa y homogénea.

4. Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada (alícuota), tomando ésta de la parte superior de la suspensión.

5. Transferir 1 ml (o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml) de la dilución primaria (10-1) a otro recipiente que contenga 9 veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada. Repetir la operación para tener diluciones hasta 10-3

6. Mezclar cuidadosamente cada tubo o botella de dilución, siempre de la misma manera.

Recuerde utilizar pipetas (o puntas) diferentes para cada dilución; en cuanto tenga la dilución preparada, cambie de punta o pipeta e inocule las cajas correspondientes y después haga la siguiente dilución con la misma punta.

B. Cuenta de Mesófilos aerobios. Recuerde que el tiempo transcurrido desde que se prepara la primera dilución hasta que el medio de cultivo se ha agregado a todas las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

1. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que las operaciones de inoculación, adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas –por duplicado- con los datos pertinentes.

2. Inocular las placas con una pipeta o punta diferente en cuanto haya preparado la dilución correspondiente.

3. Agregar el medio de cultivo estéril, fundido y mantenido a 45°C y mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre la superficie de la mesa, hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; evitar que el medio moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

4. Incubar las cajas invertidas, en las condiciones de tiempo y temperatura indicadas (37°C por 24-48 h).

5. Cálculos: Seleccionar las cajas que tengan entre 25 y 250 ufc, contar todas

las colonias de la placa, incluyendo las puntiformes. Utilizar para el cálculo,

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las diluciones en las cuales al menos una de las placas esté en el intervalo indicado.

Aplicar las reglas para el recuento (selección de cajas, promedios, factor de dilución) y reportar ufc/g de producto.

C. Coliformes fecales por NMP. El método del NMP o de los tubos múltiples

tiene un fundamento estadístico (de ahí su nombre) y es especialmente útil cuando el número esperado de microorganismos es bajo, generalmente <100 /g Recuerde que esta prueba se lleva a cabo en dos etapas, una presuntiva y una confirmativa. Para el caso de coliformes fecales, el método CCYAC-M-004 establece que se puede pasar de la prueba presuntiva a la de coliformes fecales, directamente. Este método se basa en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de lactosa dentro de las 48 horas de incubación a:

o 35 0.5°C (coliformes) y

o 44.5 0.2°C (coliformes fecales y E. coli), para muestras de agua, hielo, agua de mar y moluscos bivalvos.

o 45.5 0.2°C (coliformes fecales y E. coli), para muestras de alimentos diferentes a moluscos bivalvos.

1. Prueba presuntiva: A partir de la primera dilución (10-1) del alimento, inocular 1 mL en cada uno de 3 tubos con caldo lactosado. A continuación, inocular 3 tubos de caldo lactosado con 1.0 mL de la dilución 10-2 y finalmente inocular cada uno de los 3 tubos restantes con 1 mL de la dilución 10-3. De esta manera se tendrán 3 series de 3 tubos cada una, con 0.1g, 0.01g y 0.001 g del alimento, de manera que el resultado se obtiene directamente de la tabla 2. Mezclarlos todos adecuadamente e incubar tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.

2. Prueba Confirmativa para coliformes fecales en muestras de alimentos

(diferentes a moluscos bivalvos): De cada uno de los tubos que muestren formación de gas, tomar una asada y sembrar en un tubo con caldo EC adecuadamente marcado con cantidad de muestra del tubo de origen (0.1, 0.01ó 0.001).

3. Inocular además sendos tubos de caldo EC con un control positivo de Escherichia coli y un control negativo de Enterobacter aerogenes e incubar con las muestras a 45.5 ± 0.2 ºC en baño de agua con recirculación continua durante 24 a 48 horas.

Examinarlos tubos e interpretar como “positivos” aquellos en los cuales hay presencia de gas. Con la combinación de números de tubos positivos obtenidos en las respectivas diluciones, se busca en la tabla 2, el NMP de coliformes (fecales puesto que se seleccionó a estos por temperatura de incubación).

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4. Cálculos: A partir de los tubos positivos de caldo EC, buscar la combinación en la tabla 2 y reportar como Coliformes fecales: ___ NMP/g. Esta tabla se refiere precisamente a tubos inoculados con las cantidades de muestra que se utilizan en este ejercicio, por lo que no es necesario aplicar factor de dilución.

Tabla 2. NMP /g con intervalo de confianza de 95%, para series de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g de muestra en el inóculo.

Tubos positivos

NMP/g

Límites confianza

Tubos positivos

NMP/g

Límites confianza

0.1 0.01 0.001

Inferior Superior 0.1 0.01

0.001

Inferior Superior

0 0 0 <3.0 – 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 –

Fuente: BAM Online, 2001.

En este ejercicio, sólo se utilizan tres diluciones, pero cuando se han probado más de tres diluciones, lo cual es frecuente para muestras desconocidas se deben aplicar las siguientes reglas para seleccionar adecuadamente la combinación de tubos que se busca en la tabla:

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Utilice los tubos de 3 diluciones consecutivas. Busque la mayor dilución que tenga todos los tubos positivos y utilice ésa y las dos siguientes para establecer el NMP.

Si ninguna de las diluciones probadas tiene todos los tubos positivos, entonces utilice las primeras tres diluciones.

El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. El valor del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto.

D. Determinación de Escherichia coli Esta es una prueba optativa de control de calidad para muestras de agua y alimentos. 1. Se eligen los tubos positivos de la prueba confirmativa (sea de coliformes

totales o fecales) y mediante asada, se estrían en agar Mc Conkey o en agar EMB. Incubar a 35± 0.5 ºC por 24 ± 2 horas. Observar las colonias típicas fermentadoras de lactosa:

En McConkey son de color rojo que pueden estar rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares.

En EMB las sospechosas son colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico.

2. Seleccionar 1 o más colonias aisladas con las características anteriores (o lo más parecidas) y llevar a cabo la prueba rápida o la identificación bioquímica. En este ejercicio, haremos la identificación bioquímica.

Prueba rápida: Sembrar cada una de las colonias sospechosas en un tubo de fermentación con caldo lauril triptosa y en un tubo con agar nutritivo inclinado; continuar con la incubación a 35 ± 0.5 ºC. Examinar los tubos a las 24 horas y hacer tinción de Gram a partir del crecimiento en el agar nutritivo para observar morfología microscópica. Interpretación: La formación de gas en los tubos de caldo lauril sulfato dentro de las 48± 2 h y la demostración de bacterias Gram negativas, en forma de bacilos no esporulados constituyen una prueba positiva la presencia del grupo coliforme.

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Se reporta presencia/ausencia de E. coli en la muestra.

E. Determinación de E. coli y coliformes por Petrifilm. Las placas Petrifilm EC

contienen los mismos nutrientes que el agar bilis rojo violeta, un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador de la actividad de glucuronidasa, así como TTC (cloruro de trifenil tetrazolio) que facilita la enumeración de colonias. El gas producido por las bacterias fermentadoras de lactosa queda atrapado entre las dos películas por lo que las burbujas facilitan el recuento de las colonias (3M, 2002). 1. Para inocularlo, se colocan las placas debidamente marcadas sobre la

superficie de la mesa, se levanta la cubierta por la pestaña y se dispensa 1 mL de la dilución 10-1 en el centro de la placa; se baja la cubierta cuidando de no dejar burbujas y se incuban a 35 °C / 24 h (AOAC, método 998.08 para carnes, aves y mariscos). Nota: para algunas determinaciones, las condiciones de incubación pueden cambiar.

2. Interpretación: Cuando el glucurónido es atacado por la glucuronidasa

específica de E. coli, se libera el colorante azul; por ser fermentadoras de lactosa, dichas colonias además producen gas.

Se cuentan como E. coli las colonias azules con gas y como coliformes confirmados todas las colonias con gas, tanto azules como rojas.

Se reportan:

coliformes totales: ufc/g y E.coli: ufc/g

3. Identificación Bioquímica: A partir de las colonias sospechosas aisladas en el agar McConkey o EMB, se hace una prueba de pureza (tinción de Gram y examen microscópico). Se purifica si es necesario, en otra placa de medio selectivo y luego se inocula en BHI o en agar nutritivo.

A partir de este cultivo, se siembran las bioquímicas IMViC en: SIM,

MR-VP y medio de Simmons.

4. Interpretación: Las cepas identificadas se consideran como Escherichia coli si tienen los siguientes resultados:

____________________________ I M Vi C__

Biotipo 1 + + – – Biotipo2 – + – –__

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F. DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. Recuerde que ésta es una prueba de

presencia / ausencia. 1. Preenriquecimiento: pesar asépticamente 25 g de la muestra en bolsa estéril

y agregar 225 mL (o parte) del medio de preenriquecimiento, en este caso caldo lactosado. Homogenizar durante 30 seg a velocidad media y transferir asépticamente la mezcla homogeneizada al matraz de preenriquecimiento. Reposar por 60 min a temperatura ambiente, mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 +0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles. Mezclar e incubar por 24 h a 35°C.

2. Enriquecimiento selectivo: Mezclar suavemente el matraz con el cultivo de preenriquecimiento e inocular 1 mL de éste a los siguientes medios (en tubos con 10 mL):

caldo tetrationato (puede sustituirse por medio Vassiliadis-Rappaport) y caldo selenito cistina

Incubar por 24 h a 35°C (para alimentos fuertemente contaminados conviene incubar a 42°C para dar mayor selectividad a esta etapa).

3. Aislamiento diferencial: mezclar con cuidado los dos cultivos del

enriquecimiento selectivo y estriarlos en los siguientes medios, para aislar colonias:

agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)

agar verde brillante (VB)

cualquiera de los siguientes: agar entérico de Hektoen (Hk), agar sulfito de bismuto (SBi) o agar para Salmonella y Shigella (SS).

Incubar las placas 24 h a 35°C. Examinar las placas para establecer si hay colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las características indicadas en la tabla 3:

Tabla 3. Colonias típicas de Salmonella spp. en medios selectivos.

MEDIO SELECTIVO Color del medio antes

de la inoculación Características coloniales de Salmonella

spp.

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)

Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o

sin centro negro. En algunos casos completamente negras

Agar Verde Brillante (VB)

Oscuro, color marrón Rosas o rojas pueden ser transparentes,

rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas

Agar entérico Hektöen

Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro;

pueden ser completamente negras

Agar Sulfito Bismuto (SB)

Opaco, verde pálido Cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Algunas veces presencia de halo café o negro. Si no hay colonias en 24 h, incubar otras 24 h.

Agar para Salmonella y Shigella (SS)

Claro, color rosa Translúcidas en ocasiones opacas. Algunas con

centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas

Si es necesario repita el aislamiento hasta que tenga colonias puras para las

siguientes etapas

Fuente: Camacho, Giles, Ortegón, Palao, Serrano y Velázquez, 2009.

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4. Identificación bioquímica presuntiva:

La NOM-114-SSA1 para la determinación de Salmonella indica que se deben seleccionar al menos dos colonias típicas, bien aisladas, de cada medio selectivo. Recuerde que la misma NOM indica que se deben identificar 6 colonias por cada 25 g de unidad analítica, seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento (8.3.5). Sembrar primero las bioquímicas presuntivas, tocando levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con Kliegler hierro agar (KIA) (o con triple azúcar hierro (TSI)) y otro con agar hierro lisina (LIA); ambos se siembran por estría en la superficie inclinada y por picadura en el fondo. Incubar por 24+2 h a 35°C. (Almacenar en refrigeración las placas con medios selectivos por si es necesario tomar más colonias. Interpretar los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las reacciones indicadas en la tabla 4:

Tabla 4. Reacciones bioquímicas presuntivas para Salmonella spp.

Fuente: Elaboración de autoras a partir de Camacho, Giles, y cols, 2009.

Recuerde:

Seleccionar todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales.

Probar también las colonias que por las reacciones típicas de LIA puedan ser sospechosas, aunque no cumplan todo el perfil, ya que esto permitirá detectar Salmonella arizonae y cepas atípicas que utilizan lactosa o sacarosa.

Descarte únicamente las colonias que sean atípicas tanto en LIA como en TSI (IKIA)

Medio Prueba Color

original

Vire

Reacción típica

de Salmonella *

Observaciones

KIA

Fermentación glucosa

Naranja

Fondo amarillo y crecimiento +

Fermentación lactosa

Pico amarillo y crecimiento –

La mayoría de cultivos de S. arizona

son +

Producción de H2S Ppdo. negro y crecimiento +

TSI Fermentación de

sacarosa y/o lactosa Naranja

Fondo y pico amarillos

– La mayoría de

cultivos de S. arizona son +

LIA

Lisin- descarboxilasa

Púrpura tenue

Púrpura intenso y crecimiento

+

Fermentación glucosa

Fondo amarillo y crecimiento

+

Producción de H2S Ppdo. negro y crecimiento

+

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5. Continuación de identificación bioquímica: Continuar el análisis a partir de

los tubos de TSI seleccionados. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior (purificar si es necesario) y sembrar las pruebas bioquímicas presuntivas nuevamente. Si el resultado obtenido en TSI (o KIA) y LIA es típico de Salmonella (glu+, lac–, sac–, H2S+ y LDC+) entonces sembrar la prueba de ureasa, incubar e interpretar. Las colonias ureasa + no son del género Salmonella, por lo que implican el final de la prueba. Si no tienen ureasa, se prosigue con la identificación serológica. Sólo si ésta no es clara o concluyente, se siembran las demás bioquímicas indicadas en la tabla 5.

Tabla 5. Reacciones bioquímicas complementarias para Salmonella

V = reacción variable. Fuente: Elaboración de autoras a partir de Camacho, Giles, y cols, 2009.

Medio

Prueba

Color

original

Vire

Reacción típica

de Salmonella *

Observaciones

Surraco

Ureasa

Rosa mexicano

Rosa-violeta y crecimiento

– Sólo si el resultado

es negativo, se continúa con identificación.

Fermentación de sacarosa

Amarillo y crecimiento

–

SIM

Prod. de H2S

Amarillo paja

translúcido

Ppdo. negro y crecim. +

Indol Con react de Ehrlich formación de anillo rojo en superficie

–

Movilidad

Crecimiento en superficie y picadura,

turbiedad fuera de picadura

+

Excepto serovares Pullorum y Gallinarum

de S. entérica y cepas con flagelos

disfuncionales

MR-VP Rojo de metilo Amarillo tenue

translúcido

Con indicador Rojo de metilo, color rojo +

Voges

Proskauer

Con KOH + -naftol, anillo rojizo –

Agar citrato de Simmons

Utilización de citrato

Verde Azul y crecimiento + / V

Caldo malonato

Verde Azul y crecimiento – Para diferenciar S.

arizona

Caldo manitol

rojo fenol

Fermentación de manitol

Rojo Amarillo +

Caldo KCN

Crecimiento en cianuro

Amarillo tenue

translúcido Crecimiento –

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Confirme además la morfología microscópica de Salmonella: bacilos cortos, Gram-negativos, no esporulados.

6. Identificación Serológica:

a. Para determinar los antígenos somáticos de Salmonella, utilice Antisuero polivalente O. Colocar dos gotas separadas de SSI estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.

b. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aprox. un minuto Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

c. Considerar cualquier grado de aglutinación. La prueba se considera positiva cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.

d. Si se obtienen resultados positivos con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos B, C, D y E, que suelen ser los más frecuentes.

e. Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.

Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública.

f. Si fuese necesario, hacer el ensayo para los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35°C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24 h a 35°C (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100) y adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una hora. La prueba es positiva cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación.

15

Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica. Las pruebas serológicas se interpretan de acuerdo con la tabla 6.

Tabla 6. Reacciones serológicas de Salmonella.

Reacciones bioquímicas

Reacciones serológicas Interpretación

Típica Antígeno O, Vi o H Positivo

Cepas consideradas como Salmonella

Típica Todas las reacciones positivas

Puede ser Salmonella Típica No probada

Reacciones atípicas

Antígeno O, Vi o H Positivo

Reacciones atípicas

Todas las reacciones negativas

No debe ser considerada Salmonella

7. Pruebas bioquímicas complementarias: Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación: TSI (oKIA), LIA, nuevamente y además hacer: SIM, agar citrato de Simmons, manitol y MR-VP. Caldo malonato para confirmar la presencia de S. arizonae.

Recuerde que la NOM permite utilizar los kits o sistemas bioquímicos validados.

Por comodidad, se ha agregado en la figura 1, el esquema mejorado de la NOM-114-SSA1-1994 para la determinación de Salmonella en Alimentos.

8. Expresión de resultados. Recuerde que la determinación de Salmonella en

alimentos es una prueba de presencia/ausencia.

Una vez que haya interpretado todos los resultados, incluyendo la observación microscópica y el examen de resultados repetidos, elabore la conclusión sobre el producto y reporte como: Salmonella spp. _________________ en 25 g de muestra

16

Figura 1. NO SI positiva SI negativa NO SI NO

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA DETERMINACIÓN DE Salmonella

Atípicas o no -concluyentes

Preenriquecimiento

Enriquecimiento

Aislamiento diferencial Selección colonias típicas

Bioq. Presuntivas en TSI y LIA

Bioquímicas complementarias

FIN No es Salmonella

Negativa

Positiva

INFORME

Prueba de ureasa

FIN No es Salmonella

Identificación Serológica

FIN

No es Salmonella

Típicas o posible S.arizona

Purificación. ¿típicas en en XLD,Hk o VB ?

FIN No es Salmonella

SI FIN No es Salmonella

¿Es Salmonella?

NO

17

Datos de la muestra:

Mesófilos aerobios Límite NOM-213: 60x103 ufc/g en punto de venta

Dupl 10-1 10-2 10-3 10-4 Resultados

A Mesof. Aerob. a 37°C: ufc /g B

Colif. Fecales Límite NOM-213: <3 NMP/g

Tubos positivos en prueba presuntiva

10-1 10-2 10-3

Cada tubo positivo se resiembra, en EC y se incuban a 45.5 °C

Tubos positivos en prueba confirmativa en EC a 45.5 °C

10-1 10-2 10-3 Resultados

NMP de colif. fecales: /g Lectura en tablas: Factor de dilución:

Presencia Salmonella spp. Especificación NOM-213: Ausente en 25 g

Colonias sospechosas en:

Presuntivas Inter-pret.

Complementarias Inter-pret.

glu lac sac H2S LDC Urea movil indol MR VP Citr malo

1

2

3

4

5

6 Resultados

Serológicas: Antisuero O

Antisuero Vi

Antisuero H

Salmonella: / 25 g

especie(s) identif.

Petrifilm EC

Dupl 10-1 10-2 Resultados

coliformes E. coli coliformes E. coli Coliformes: ufc/g

E. coli: ufc/g

A

B

Identificación de E. coli por IMViC. E. coli es: (Mov+) Ind+ MR+ VP– Cit–

Colonia sospechosa

Movilidad Indol MR VP Citrato E. coli presente?

1

2

3

Identificación de Salmonella en Vitek Resultado Salmonella: en 25 g de muestra

RESULTADOS

18

Reporte

Determinación Mesófilos aerobios

Coliformes fecales Salmonella

en 25 g

Especificación NOM-213-SSA1

60x103ufc/g < 3 NMP / g Ausente

RESULTADOS DE LA MUESTRA

CONCLUSIÓN:

RESULTADOS DE PRUEBAS

ADICIONALES

Coliformes totales por Petrifilm

Presencia de E. coli

Salmonella por Vitek

Tradicional

Petrifilm EC ufc/g

RECOMENDACIONES

Cuestionario. 1. Para cada una de las especificaciones microbiológicas planteadas en la NOM-

213-SSA1, explique qué información proporcionan y cuál es su importancia. 2. Compare las especificaciones microbiológicas de los productos cárnicos

procesados (NOM-213-SSA1) con las de las carnes frescas refrigeradas o congeladas (NOM-034-SSA1).

3. Diga si Vitek y Petrifilm EC tienen validaciones o autorizaciones de

organismos nacionales y/o internacionales y especifique cuáles son. 4. ¿Por qué el único método adecuado para la determinación de coliformes en

análisis de cárnicos procesados con base en la NOM-213-SSA1 es el NMP? 5. Comente la información del muestreo del producto que analizó. 6. ¿Qué alcance tienen sus resultados? Comente por separado sobre la

conclusión respecto al cumplimiento de la NOM y sobre las pruebas adicionales.

7. Comente la importancia que tienen para el producto, los siguientes

microorganismos: Pseudomonas, Alcalígenes, Staphylococcus, Listeria.

19

8. ¿Logró identificar otros géneros por IMViC o Vitek? comente la importancia del hallazgo.

9. Si usted trabajara en la fábrica donde se elabora el producto que analizó

¿haría otros controles microbiológicos? Diga cuáles y justifique. 10. ¿Qué norma hubiese utilizado para carne molida fresca o congelada? ¿Para

pescados y mariscos frescos y congelados? ¿Cuáles son las especificaciones?

Bibliografía: American Public Health Association. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4th edition 2001. Washington DC. American Public Health Associatión. Recommend Procedures for the Examination of Seawater and shellfish. 4th Edition 1970. Washintong DC Bacteriological Analytical Manual, (VERSION EN LINEA Sep. 2011), Chapter 4. FDA, Center of Food Safety & Applied Nutrition. Disponible a través de Internet en: http://www.911emg.com/Ref%20Library%20ERG/FDA%20Bacteriological%20Analysis.pdf Camacho, Giles, Ortegón, Palao, Serrano y Velázquez. 2009. Técnicas para el análisis microbiológico de alimentos. 2ª. ed. Facultad de Química, UNAM. México. CCAYAC-M-004/8. Método de prueba para la estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más probable por la técnica del número más probable (NMP), detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por NMP, publicación del 16-Nov-2011. FDA. 2013. FDA's Standards for High Quality Foods. FDA Consumer Health Information. U.S. Food and Drug Administration. Disponible a través de Internet en: http://www.fda.gov/downloads/ForConsumers/ConsumerUpdates/ucm107017.pdf FSANZ. 2001. Guidelines for the microbiological examination of ready - to - eat food. Food Standards Australia New Zealand. Disponible a través de Internet en: http://www.foodstandards.gov.au/code/microbiollimits/documents/Guidelines%20for%20Micro%20exam.pdf ICMSF (2002) Microrganisms in Foods 7. Microbiological Testing in Food Safety Management. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York,USA. (colocación: QR115 I534. hay 1 en FQ y 2 en FMVZ)

20

SS. 2002. NOM-213-SSA1-2002. Productos y servicios. Productos cárnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Métodos de prueba. Dirección General de Normas, Secretaría de Salud. México. 3M. 2001. Petrifilm™. E. coli/Coliform Count Plate. Microbiology Products. 3M México. Disponible a través de Internet en: http://www.3m.com/intl/kr/microbiology/p_ecoli/use3.pdf

ANEXO 1

Tabla 2. NMP /g con intervalo de confianza de 95%, para series de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g de inóculo.

Tubos positivos

NMP/g

Límites confianza

Tubos positivos

NMP/g

Límites confianza

0.1 0.01 0.001

Inferior Superior 0.1 0.01

0.001

Inferior Superior

0 0 0 <3.0 – 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

21

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 –

Fuente: BAM Online, 2001.